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CN103703130A - 筛选诱导的多能干细胞的方法 - Google Patents

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CN103703130A
CN103703130A CN201280036781.9A CN201280036781A CN103703130A CN 103703130 A CN103703130 A CN 103703130A CN 201280036781 A CN201280036781 A CN 201280036781A CN 103703130 A CN103703130 A CN 103703130A
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lincrna
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reverse strand
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cells
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山中伸弥
高桥和利
小柳三千代
大贯茉里
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Kyoto University NUC
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Abstract

本发明提供使用认定为特异性表达于展现分化抗性的iPS细胞系的lincRNA或mRNA的标志物筛选展现分化抗性的iPS细胞的方法，和这样的标志物。

Description

筛选诱导的多能干细胞的方法
技术领域
本发明涉及筛选诱导的多能干细胞的方法。更特别地，本发明涉及在诱导的多能干细胞中通过确认大的基因间的非编码RNA（large intergenicnon-coding RNA，lincRNA）或mRNA的表达筛选不展现分化抗性的诱导的多能干细胞的方法。
背景技术
近年来，已相继建立了小鼠和人诱导的多能干细胞（iPS细胞）。Yamanaka等人通过将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因导入小鼠来源的成纤维细胞以启用这些基因的强制表达诱导了iPS细胞(WO2007/069666A1和Takahashi,K.和Yamanaka,S.,Cell,126:663-676(2006))。接着，已经表明iPS细胞也能用以上因子的3个来制备（除了c-Myc基因）(Nakagawa，M.等人，Nat.Biotechnol.,26:101-106(2008))。而且，Yamanaka等人通过将以上4个基因导入人皮肤来源的成纤维细胞，成功建立了iPS细胞，与涉及小鼠的情况相似(WO2007/069666A1和Takahashi,K.等人，Cell,131:861-872(2007))。同时，Thomson等人的小组使用Nanog和Lin28代替Klf4和c-Myc制备了人iPS细胞(WO2008/118820A2和Yu,J.等人，Science，318:1917-1920(2007))。iPS细胞能解决生物伦理问题例如胚胎的破坏，能在维持其多能性的同时生长，使得iPS细胞被预期作为再生医学的移植材料。
同时，即使当这样建立的iPS细胞被诱导以分化为特异性的组织细胞时，产生的细胞可能包括具有增殖能力的未分化（或未充分分化的）细胞(Miura K.等人，Nat Biotechnol.,27:743-745(2009))。在这种情况下，有移植后肿瘤发生的顾虑。因此，在这样建立的iPS细胞系中筛选不含有对分化诱导展现抗性的细胞的iPS细胞系的方法是希望得到的。
发明概述
技术问题
本发明的目标是有效地选择适合临床应用的安全的iPS细胞（诱导的多能干细胞）。特别地，本发明的目标是提供筛选不展现分化抗性的细胞系的方法。
问题解决方案
为达到以上目标，本发明人使用展现分化抗性的iPS细胞系和不展现分化抗性的iPS细胞系研究了特异性表达于展现分化抗性的iPS细胞系的RNA或特异性表达于不展现分化抗性的iPS细胞系的RNA。因此确认，由特定基因组区编码的大的基因间的非编码RNA（lincRNA）或mRNA特异性表达于展现分化抗性的iPS细胞系或不展现分化抗性的iPS细胞系中。
基于以上结果，本发明人已经发现，通过使用由特定基因组区编码的大的基因间的非编码RNA（lincRNA）或mRNA作为指示物（标志物）可筛选展现分化抗性的iPS细胞，因此完成了本发明。
特别地，本发明包括下列[1]到[9]。
[1]一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的方法，包含如下步骤：
（i）测定选自A组和/或B组的至少一个大的基因间的非编码RNA（lincRNA）或mRNA的表达，
（ii）选择其中选自A组的lincRNA或mRNA表达或其中选自B组的lincRNA或mRNA不表达的人诱导的多能干细胞系；
A组由以下组成：
(A1)lincRNA:chr1:852245-854050反向链，
(A2)GPR177，
(A3)VTCN1，
(A4)lincRNA:chr1:142803013-142804254反向链，
(A5)APOA2，
(A6)WNT6，
(A7)EPAS1，
(A8)COL3A1，
(A9)SLC40A1，
(A10)S100P，
(A11)HOPX，
(A12)GUCY1A3，
(A13)CDH10，
(A14)HAPLN1，
(A15)PITX1，
(A16)HAND1，
(A17)CGA，
(A18)AQP1，
(A19)DLX6，
(A20)DLX5，
(A21)SOX17，
(A22)FLJ45983，
(A23)PLCE1，
(A24)H19，
(A25)lincRNA:chr11:2016408-2017024反向链，
(A26)lincRNA:chr11:2017517-2017651正向链，
(A27)IGF2，
(A28)P2RY6，
(A29)SLN，
(A30)NNMT，
(A31)APOA1，
(A32)ERP27，
(A33)LUM，
(A34)CCDC92，
(A35)CDX2，
(A36)FLJ41170，
(A37)MEG3，
(A38)lincRNA:chr14:101292469-101299626正向链，
(A39)lincRNA:chr14:101295637-101302637正向链，
(A40)lincRNA:chr14:101296681-101298460正向链，
(A41)lincRNA:chr14:101298129-101300147正向链，
(A42)lincRNA:chr14:101324825-101327247正向链，
(A43)MEG8，
(A44)lincRNA:chr14:101365673-101366049正向链，
(A45)lincRNA:chr14:101396955-101397357正向链，
(A46)lincRNA:chr14:101430757-101433381正向链，
(A47)lincRNA:chr14:101434059-101436282正向链，
(A48)lincRNA:chr14:101472355-101473369正向链，
(A49)DIO3，
(A50)MEIS2，
(A51)PRTG，
(A52)C17orf51，
(A53)lincRNA:chr17:21434064-21435857反向链，
(A54)lincRNA:chr17:21435180-21454915反向链，
(A55)lincRNA:chr17:21435959-21436405反向链，
(A56)CCR7，
(A57)KRT23，
(A58)GREB1L，
(A59)GATA6，
(A60)TTR，
(A61)UCA1，
(A62)FLRT3，
(A63)lincRNA:chrX:73040495-73047819反向链，
(A64)VGLL1，
(A65)RPS4Y1，
(A66)DDX3Y，以及
(A67)RPS4Y2，
B组由以下组成：
(B1)DMRTB1，
(B2)lincRNA:chr1:73430887-73446112反向链，
(B3)lincRNA:chr1:73444697-73444997反向链，
(B4)C4orf51，
(B5)PCDHA1，
(B6)lincRNA:chr6:95250854-95263604反向链，
(B7)lincRNA:chr6:14280358-14285376反向链，
(B8)lincRNA:chr6:14283301-14285685反向链，
(B9)C7orf57，
(B10)lincRNA:chr7:124873114-124899839反向链，
(B11)lincRNA:chr8:129599518-129624118反向链，
(B12)OC90，
(B13)lincRNA:chr8:133071643-133092468反向链，
(B14)lincRNA:chr8:133073732-133075753反向链，
(B15)HHLA1，
(B16)incRNA:chr8:133076031-133093351反向链，
(B17)lincRNA:chr8:133090096-133097869反向链，
(B18)lincRNA:chr8:138387843-138421643反向链，
(B19)lincRNA:chr8:138418343-138425831反向链，
(B20)NDUFA4L2，
(B21)lincRNA:chr13:54698462-54707001反向链，
(B22)ABHD12B，
(B23)lincRNA:chr18:54721302-54731677反向链，
(B24)ZNF208，
(B25)ZNF257，
(B26)ZNF676，
(B27)ZNF541，
(B28)TBX1，
(B29)CXorf61，以及
(B30)DB090170TESTI4人类cDNA克隆TESTI40389975'，mRNA序列[DB090170]。
[2]根据[1]所述的方法，其中选自A组的lincRNA或mRNA选自由以下组成的组中：
(A20)DLX5，
(A50)MEIS2，
(A53)lincRNA:chr17:21434064-21435857反向链，以及
(A58)GREB1L。
[3]根据[1]所述的方法，其中选自B组的lincRNA或mRNA选自由以下组成的组中：
(B4)C4orf51，
(B9)C7orf57，
(B10)lincRNA:chr7:124873114-124899839反向链，
(B12)OC90，
(B13)lincRNA:chr8:133071643-133092468反向链，
(B14)lincRNA:chr8:133073732-133075753反向链，
(B15)HHLA1，
(B16)lincRNA:chr8:133076031-133093351反向链，
(B17)lincRNA:chr8:133090096-133097869反向链，
(B22)ABHD12B，
(B23)lincRNA:chr18:54721302-54731677反向链，
(B27)ZNF541，
(B28)TBX1，
(B29)CXorf61，以及
(B30)DB090170TESTI4人类cDNA克隆TESTI40389975'，mRNA序列[DB090170]。
[4]根据[1]所述的方法，其中选自B组的lincRNA或mRNA选自由以下组成的组中：
(B4)C4orf51，
(B15)HHLA1，以及
(B22)ABHD12B。
[5]一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的方法，包含如下步骤：
（i）测定位于选自由(B4)C4orf51、(B15)HHLA1和(B22)ABHD12B组成的组中至少一个基因中的LTR区或其附近的DNA-甲基化状态，以及
（ii）选择其中LTR7区域处于DNA-甲基化状态的人诱导的多能干细胞系。
[6]一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂，含有具有显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA或lincRNA的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，或与其互补的多核苷酸。
[7]根据[6]所述的试剂，其是通过固定与具有显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA或lincRNA的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸的多核苷酸互补的多核苷酸作为探针制备的微阵列。
[8]一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂，含有识别由显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA编码的蛋白的抗体。
[9]一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂盒，含有根据[6]到[8]的任一项所述的试剂。
本申请要求来自于2011年7月25日提交的美国临时申请号61/511,156的优先权，这些专利申请的内容通过引用并入本文。
发明的有益效果
根据本发明，不展现分化抗性的人iPS细胞可被有效筛选。因此，本发明对于将iPS细胞应用于再生医学是极为有用的。
附图简述
[图1]图1显示使用定量PCR测定展现分化抗性的细胞系（显示为分化抗性）：FB-RV3F-4、CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-4sub2、CB-RV4F-2sub2和DP-EP6F-1，以及不展现分化抗性的细胞系（显示为正常）：H1、FB-RV4F-2、FB-RV3F-1、FB-RV3F-4sub6、CB-RV4F-2sub1和DP-EP6F-1sub5的HHLA1、ABHD12B和C4orf51的表达水平的结果。
[图2]图2是显示C4orf51、HHLA1和ABHD12B中的LTR区的位置的示意图。
[图3]图3显示通过亚硫酸氢盐方法（bisulfite method），位于展现分化抗性的6个细胞系（显示为分化抗性）：FB-RV3F-4、CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-4sub2、CB-RV4F-2sub2和DP-EP6F-1，以及不展现分化抗性的6个细胞系（显示为正常）：H1、FB-RV4F-2、FB-RV3F-1、FB-RV3F-4sub6、CB-RV4F-2sub1和DP-EP6F-1sub5的C4orf51、HHLA1或ABHD12B中的LTR7区中的CG二核苷酸的平均甲基化状态的结果。
实施方案的描述
1.筛选人诱导的多能干细胞（iPS细胞）的方法
本发明的筛选人诱导的多能干细胞（iPS细胞）的方法包含使用显示于下列表1（A组）或表2（B组）的至少一种lincRNA或mRNA作为筛选不展现分化抗性的iPS细胞系的标志物。
[表1]
A组
Figure BDA0000461378700000101
Figure BDA0000461378700000111
Figure BDA0000461378700000121
[表2]
B组
Figure BDA0000461378700000131
本发明中，术语“lincRNA”指的是从基因组转录的不编码基因的长链单链RNA。lincRNA用染色体号、由GenBank数据库中描述的核苷酸编号代表的基因组区和转录方向表示。例如，“chr1:852245-854050反向链”意思是匹配互补于GenBank数据库中染色体1的核苷酸852245到854050的序列的单链RNA。
在本发明中，术语“mRNA”也可指剪接前的前体或剪接后的成熟mRNA。成熟mRNA的序列的例子不仅包括具有对应于表1或表2列出的GenBank的登录号的序列的mRNA，也包括通过选择性剪接制备的异构体。同时在本发明中，来自mRNA的多核苷酸（例如cDNA）或RNA编码的蛋白质也能用作标志物。
而且，在本发明中，术语“iPS细胞”指的是人工来源于体细胞的干细胞，其能通过以DNA或蛋白质的形式将特定重编程因子导入体细胞中来制备，并具有几乎等同于ES细胞的特性，例如基于自我复制的多能性和增殖潜力（K.Takahashi和S.Yamanaka(2006)Cell,126:663-676;K.Takahashi等人(2007),Cell,131:861-872;J.Yu等人(2007),Science,318:1917-1920;Nakagawa,M.等人Nat.Biotechnol.26:101-106(2008);国际公布WO2007/069666）。
在本发明中，能作为标志物被识别的lincRNA或mRNA可以是包含lincRNA或mRNA全长核苷酸序列的多核苷酸，包含与其互补的序列的多核苷酸，或者其片段。在这样的多核苷酸片段的情况下，它优选具有具有lincRNA或mRNA的序列中的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。具有至少15个核苷酸的这样的多核苷酸的特定例子包括具有至少18个连续核苷酸的长度的多核苷酸，具有至少19个连续核苷酸的长度的多核苷酸，具有至少20个连续核苷酸的长度的多核苷酸，具有至少30个连续核苷酸的长度的多核苷酸，具有至少40个连续核苷酸的长度的多核苷酸，具有至少50个连续核苷酸的长度的多核苷酸，具有至少60个连续核苷酸的长度的多核苷酸，具有至少70个连续核苷酸的长度的多核苷酸，以及具有至少100个连续核苷酸的长度的多核苷酸。
在本发明中，不展现分化抗性的iPS细胞系可通过测定以上标志物的表达程度来检测，并因此可筛选iPS细胞系。更特别地，表达表1中列出的A组的标志物的iPS细胞系可作为不展现分化抗性的细胞系来筛选，或者不表达表2中列出的B组的标志物的iPS细胞系可作为不展现分化抗性的细胞系来筛选。
这里，措辞“表达标志物”指的是其中通过任意测定方法检测到标志物的情形，更优选地指这样得到的检测值等于或高于对照检测值的情形。相似地，措辞“不表达标志物”指的是其中通过任意测定方法未检测到标志物的情形，更优选地指这样得到的检测值等于或低于对照检测值的情形。更特异地，当使用A组的标志物时，其中检测值与对照ES细胞系或已知不展现分化抗性的iPS细胞系的检测值相似的情形或其中检测值高于已知展现分化抗性的iPS细胞系的检测值的情形表明A组的标志物被表达。同时，当使用B组的标志物时，其中这样获得的检测值与对照ES细胞系或已知不展现分化抗性的iPS细胞系的检测值相似的情形或其中这样获得的检测值低于已知展现分化抗性的iPS细胞系的检测值的情形表明B组的标志物不被表达。这里，措辞“检测值高（于）”指其中检测值比对照值高1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍的情形，例如，并且更优选地，比对照值高5倍或更多。措辞“检测值低于”指其中检测值是对照值的2/3、1/2、1/3、1/4或1/5（或更少）的情形，例如，并且更优选地，是对照值的1/5（或更少）。
在本发明中，测定标志物的方法的实例包括，但不特定限于，RNA印迹法、原位杂交、RNA酶保护试验、微阵列法、PCR法、实时PCR法、蛋白质印迹法和流式细胞术。
在使用杂交例如RNA印迹法的测定方法的情况下，以上标志物的全长核苷酸序列或与其部分序列互补的多核苷酸能被用作探针。这里，术语“互补多核苷酸（互补链、相反链）”指的是在碱基对关系例如A:T(U)或G:C的基础上根据核苷酸与目标序列为互补关系的多核苷酸。这样的互补链的实例不仅包括与目标正向链的核苷酸序列完全互补的互补序列，也包括具有互补关系使得它能在严格条件下与目标正向链杂交的序列。另外，严格条件可基于与探针结合的核酸的解链温度（Tm）来确定，如Berger和Kimmel（1987，Guide to Molecular Cloning Techniques Methods inEnzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA）所教导的。杂交后的洗涤条件通常是例如大约“1x SSC、0.1%SDS、37℃”的条件。优选地，甚至当在这样的条件下洗涤时，互补链能维持与目标正向链杂交的状态。甚至更严格的杂交条件的实例包括，但不特别限制于，大约“0.5x SSC、0.1%SDS、42℃”的洗涤条件。更严格的杂交条件的实例包括甚至当在大约“0.1xSSC、0.1%SDS、65℃”的洗涤条件下洗涤时，正向链和互补链能维持杂交状态的条件。这样的互补链的特别实例包括由与目标正向链核苷酸序列处于完全互补关系的核苷酸序列组成的链，和由与该链具有至少90%，优选至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列组成的链。探针大小是至少15个连续核苷酸，至少18个连续核苷酸，至少19个连续核苷酸，至少20个连续核苷酸，至少30个连续核苷酸，至少40个连续核苷酸，至少50个连续核苷酸，至少60个连续核苷酸，至少70个连续核苷酸，至少100个连续核苷酸或全长连续核苷酸的长度。这样的探针可用例如放射性同位素（例如，32P和33P）、荧光物质（例如，荧光胺、若丹明、德克萨斯红、丹酰或其衍生物）、化学发光物质或酶标记。
而且，用作以上探针的多（寡）核苷酸优选以多（寡）核苷酸固定在固相支持物（基质）上的微阵列的形式提供。微阵列的固相支持物的实例包括玻璃基质、硅基质、膜和珠，但其材料、大小和形状不受特别限制。形成微阵列的方法不受特别限制，本领域技术人员可使用的任何方法可在此应用。其实例包括涉及在固相支持物的表面直接合成探针的方法和涉及将提前制备的探针结合至固相支持物的表面。当在固相支持物的表面直接合成探针时通常应用的方法包含使用将被光照选择性移除的保护性基团结合光刻法技术和用于半导体生产的固相合成技术在预定的微矩阵区执行寡核苷酸的选择合成。同时，能在此使用的包含提前制备探针然后将之结合至固相支持物表面的方法的实例包括：包含依赖于核酸探针类型或固相支持物类型使用点样仪装置（spotter device）将探针点样至表面已经被多聚阳离子化合物或具有氨基、醛基、环氧基等等的硅烷偶联剂处理的固相支持物表面的方法，和包含以下的方法：合成具有其中导入的反应性基团的探针，将探针点样至提前进行表面处理的固相支持物的表面以引起反应性基团的形成，因此通过共价键合将探针结合和固定至固相支持物的表面。
在另一个实施方案中，当以上标志物被特异性识别并扩增时，含有标志物的核苷酸序列或互补于该核苷酸序列的序列的寡核苷酸能被用作引物。可通过使用例如primer3(http://primer3.sourceforge.net/)或vector NTI(Infomax)基于以上标志物的每个核苷酸序列来设计引物，然后进行合成和纯化来制备引物。设计引物时避免两个引物的互补序列以防止由正义链（5’末端侧）和反义链（3’末端侧）组成的一组或一对引物（2个引物）互相退火；也避免回文结构以防止引物内发夹结构的形成。引物大小未特别限制，只要以上标志物的扩增和检测是可能的，并且是至少15个核苷酸的长度，优选15到50个核苷酸长，更优选20到35个核苷酸长。可使用本领域已知的作为合成寡核苷酸的方法的方法（例如，磷酸三乙酯法和磷酸二酯法）使用通常应用的DNA自动合成仪合成引物。这样的引物可用与以上相似的标记物质标记以促进扩增产物的检测。
在另一项实施方案中，当以上标志物被识别为蛋白质时可使用抗体。
本发明的抗体形式未特别限制，可以是免疫原为表1或表2列出的mRNA编码的蛋白质的多克隆抗体或单克隆单体、或嵌合抗体（例如，人/小鼠嵌合抗体）、人源化抗体、或人类抗体、或这些抗体的片段（例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fv和scFv）或对含有所述蛋白质的氨基酸序列中的至少8个连续氨基酸（例如，10到20个连续氨基酸）的多肽具有抗原结合特性的抗体。
产生以上抗体的方法是已知的，本发明的抗体可根据这些常规方法产生（Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，(1987)JohnWiley and Sons.出版11.12-11.13部分）。
特别地，当本发明的抗体是多克隆抗体时，其可通过以下获得：合成表1或表2列出的mRNA编码的蛋白质，该蛋白质已经根据常规方法使用大肠杆菌（Escherichia coli）或类似物表达和纯化，或者具有其部分氨基酸序列的寡核苷酸，用所得产物免疫非人类动物例如家兔，然后根据常规方法从免疫动物的血清获得抗体。同时，在单克隆抗体的情况下，其可通过将杂交瘤细胞（通过将骨髓瘤细胞与从以上免疫的非人类动物中获得的脾细胞进行细胞融合制备）进行HAT选择并例如使用靶多肽进行亲和力试验获得（Current protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，(1987)JohnWiley and Sons.出版11.4-11.11部分）。这样获得的抗体可用例如荧光物质（例如，荧光胺、若丹明、德克萨斯红、丹酰或其衍生物）、化学发光物质或酶标记。
而且，用于抗体制备的蛋白质可通过，基于来自Genbank数据库的基因序列信息，DNA克隆、构建每个质粒、转染宿主、培养转化物、以及从培养产物收集蛋白来获得。这些程序可根据本领域技术人员已知的方法或例如文献中描述的方法进行（Molecular Cloning，T.Maniatis等人，CSHLaboratory(1983)，DNA Cloning，DM.Glover，IRL PRESS(1985))。特别地，这样的蛋白可通过制备在预期宿主细胞中启用基因表达的重组DNA（表达载体），将DNA导入宿主细胞进行转化，培养转化物，然后从由此获得的培养产物收集靶蛋白来获得。
而且，在本发明中，筛选不展现分化抗性的iPS细胞的方法也可通过测定位于候选基因体（gene body）包括内含子和外显子的LTR区域或其附近（LTR region or neighborhood thereof）的DNA-甲基化状态来进行。这时，LTR意味着来源于逆转录病毒的重复序列。例如，作为LTR亚家族例如LTR1、LTR1B、LTR5、LTR7、LTR8、LTR16A1、LTR16A1、LTR16C、LTR26、LTR26E、MER48和MLT2CB是已知的。本发明中优选的LTR亚家族是人内源逆转录病毒(HERV)-H家族的LTR7。LTR7位于人全基因组的基因体的658个基因座。LTR7的序列显示于SEQ NO:1。本发明中，LTR7的序列包括与该链具有至少90%，优选至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的序列。
候选基因的实例是表2中列出的B组的标志物。这样基因的优选实例选自由C4orf51、HHLA1和ABHD12B组成的组中。在C4orf51、HHLA1和ABHD12B中的LTR区的实例显示于SEQ NO:2、3、4、5、6和7中。
测定DNA-甲基化状态的方法的实例涉及使用亚硫酸氢盐水解未甲基化的胞嘧啶。具体地，方法包括涉及进行亚硫酸氢盐处理、PCR、然后测序的方法，涉及使用甲基化-特异性寡核苷酸（MSO）微阵列的方法，或者涉及引起PCR引物识别亚硫酸氢盐处理前的序列和亚硫酸氢盐处理后的序列的差别并然后基于PCR产物的存在或不存在确定甲基化DNA存在或不存在的甲基化-特异性PCR。除了这些方法以外，通过使用DNA甲基化-特异性抗体的染色体免疫沉淀，可通过在DNA-甲基化区域内提取DNA序列、进行PCR然后进行测序从特定区域检测DNA-甲基化区域。
在筛选不展现分化抗性的iPS细胞时，在其中位于候选基因体的以上LTR区域的DNA甲基化状态是处于DNA甲基化状态的目标iPS细胞能被选作不展现分化抗性的iPS细胞。这里，措辞“DNA-甲基化状态”指的是，例如，在目标区域的检测的甲基化的CpG占所有检测的CpG的50%、60%、70%、80%、90%或更多，优选100%的状态。
作为检测在一个任意选择的细胞的甲基化CpG的百分比的方法的实例是测序。因此，可通过重复测序其PCR产物已经被克隆多次例如2次或更多次，优选5次或更多次，更优选10次或更多次的模板，然后比较测序克隆的数目与DNA甲基化已经被检测的克隆的数目来计算百分比。当应用焦磷酸测序法时，通过测定胞嘧啶或胸腺嘧啶的量也能直接确定百分比（胞嘧啶的量意味着甲基化DNA的量，胸腺嘧啶的量意味着未甲基化DNA的量）。
在使用以上标志物筛选不展现分化抗性的iPS细胞时，将经历筛选的iPS细胞可根据以前建立的方法，通过以DNA或蛋白质的形式将特异性重编程因子导入体细胞来制备。
重编程因子可由ES细胞中特异性表达的基因、其基因产物或非编码RNA、在维持ES细胞的未分化中起重要作用的基因、其基因产物、或非编码RNA或低分子量化合物组成。由重编程因子包含的基因的实例包括Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、Eras、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3和Glis1。这些重编程因子可独立或组合使用。
重编程因子的组合的实例包括如在以下描述的组合：WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395和WO2010/147612，如以下所描述：Huangfu D等人(2008),Nat.Biotechnol.,26:795-797,Shi Y等人(2008),Cell Stem Cell,2:525-528,Eminli S等人(2008),Stem Cells.26:2467-2474,Huangfu D等人(2008),Nat Biotechnol.26:1269-1275,Shi Y等人(2008),Cell Stem Cell,3,568-574,Zhao Y等人(2008),Cell Stem Cell,3:475-479,Marson A,(2008),Cell Stem Cell,3,132-135,Feng B等人(2009),Nat Cell Biol.11:197-203,R.L.Judson等人(2009),Nat.Biotech.,27:459-461,Lyssiotis CA等人(2009),Proc Natl Acad Sci U.S.A.106:8912-8917,Kim JB等人(2009),Nature.461:649-643,Ichida JK等人(2009),Cell Stem Cell.5:491-503,Heng JC等人(2010),Cell Stem Cell.6:167-74,Han J等人(2010),Nature.463:1096-100,Mali P等人(2010),Stem Cells.28:713-720,Maekawa M等人(2011),Nature.474:225-9。
以上重编程因子的实例也包括将用于提高建立的效率的因子，例如组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂{例如，低分子量抑制剂例如丙戊酸（VPA）、曲古抑菌素A、丁酸钠、MC1293和M344，和核酸表达抑制剂例如抗HDAC的siRNA和shRNA（例如，HDAC1siRNA SmartpoolTM（Millipore）及抗HDAC1的HuSH29mer shRNA构建体（OriGene））}，MEK抑制剂（例如，PD184352、PD98059、U0126、SL327和PD0325901），糖原合酶激酶-3抑制剂（如，Bio和CHIR99021），DNA甲基转移酶抑制剂（例如，5-氮杂胞苷），组蛋白甲基转移酶抑制剂（例如，低分子量的抑制剂例如BIX-01294，和核酸表达抑制剂，例如抗Suv39hl、SUV39H2、SetDBl和G9a的siRNA和shRNA），L-钙通道激动剂（例如Bayk8644），丁酸，TGFβ抑制剂或ALK5抑制剂（例如LY364947、SB431542、616453和A-83-01），p53抑制剂（例如，抗p53的siRNA和shRNA），ARID3A抑制剂（例如，抗ARID3A的siRNA和shRNA），miRNA（例如，miR-291-3p，miR-294，miR-295和miR-302），Wnt信号传导（例如，可溶性的Wnt3a），神经肽Y，前列腺素（例如，前列腺素E2和前列腺素J2），hTERT，SV40LT，UTF1，IRX6，GLISl，PITX2和DMRTBl。在说明书中，这些将用于提高建立的效率的因子不与重编程因子特别区分。
当重编程因子是蛋白质的形式时，可通过例如脂质转染法、与细胞膜渗透性肽（例如，HIV-衍生TAT和聚精氨酸）融合或者微注射（microinjection）技术将它导入体细胞。
同时，当重编程因子是以DNA的形式时，可以使用载体例如病毒、质粒、或人工染色体、脂质转染（或脂质体转染）或微注射的技术将它导入体细胞。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体（Cell,126,pp.663-676,2006;Cell,131,pp.861-872,2007;Science,318,pp.1917-1920,2007）、腺病毒载体（Science,322,945-949,2008）、腺伴随病毒载体和仙台病毒载体(WO2010/008054)。而且，人工染色体载体的实例包括人类人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）和细菌人工染色体（BAC或PAC），作为质粒，用于哺乳动物的质粒可被使用（Science,322:949-953,2008）。此处使用的载体可以含有调节序列如启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子和多聚腺苷酸化位点，以使得核重编程物质可表达。此外，如果需要的话，这样的载体可以还包含选择标志物序列，如药物抗性基因（例如，卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和嘌呤霉素抗性基因），胸苷激酶基因，和白喉毒素基因，和报告基因序列例如绿色荧光蛋白（GFP）、β-葡糖苷酸酶（GUS）和FLAG。此外，上述载体可以还在编码重编程因子的基因或连接于启动子的编码重编程因子的基因的5'-端和3'-端含有loxP序列，这使得它能够在导入体细胞后切割基因。
而且，当重编程因子是以RNA的形式时，可使用例如脂质转染或微注射技术将它导入体细胞。为了抑制降解，其中整合5-甲基胞苷和假尿嘧啶的RNA（TriLink Biotechnologies）也可被使用（Warren L,(2010)Cell StemCell,7:618-630)。
用于诱导iPS细胞的培养溶液的实例包括含10％至15％FBS的DMEM、DMEM/F12或DME培养溶液（这些培养溶液可以还适当含有LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇或类似物）或市售的培养溶液{例如，用于培养小鼠ES细胞的培养溶液（TX-WES培养溶液，Thromb-X）、用于培养灵长类ES细胞的培养溶液（灵长类ES/iPS细胞培养溶液，ReproCELL）和无血清培养基（mTeSR，StemcellTechnology）}。
培养方法的实例如下。在37℃并存在5%CO2时，使体细胞与重编程因子在含有10%FBS的DMEM或DMEM/F12培养溶液上接触，并培养大约4到7天。接着，细胞被再次接种到饲养细胞（例如丝裂霉素C处理的STO细胞或SNL细胞）上。在体细胞和重编程因子接触后大约10天，细胞被培养于含有bFGF的用于灵长类ES细胞培养的培养溶液中，在接触后大约30到45天或更久，可形成iPS细胞样集落。
可选地，细胞可在37℃在5%CO2的存在下使用含有10%FBS的DMEM培养溶液（其还可适当含有LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸，β-巯基乙醇等等）培养于饲养细胞（例如丝裂霉素C处理的STO细胞或SNL细胞）上。大约25到30天或更久后，ES样集落可形成。期望的方法的实例包括涉及代替饲养细胞直接使用待重编程的体细胞(Takahashi K,等人，(2009),PLoS One,4:e8067或WO2010/137746)或细胞外基质(例如，层粘连蛋白-5(WO2009/123349)和人工基底膜（matrigel）(BD))的方法。
除了这些实例以外的另一个实例是涉及使用无血清培养基培养的培养方法（Sun N，等人，(2009),Proc Natl Acad Sci U.S.A.,106:15720-15725)。而且，iPS细胞也可在低氧条件下（0.1%或更多，15%或更少氧气浓度）被建立以增加建立的效率（Yoshida Y，等人，(2009),Cell Stem Cell,5:237-241或WO2010/013845）。
在以上培养中，在开始培养后从第2天起每天1次使用新鲜培养溶液交换培养溶液。另外，将用于核重编程的体细胞的数目是不限的，而是分布于每培养皿（100cm2）大约5x103个细胞到大约5x106个细胞。
可根据这样形成的集落的形状来选择iPS细胞。同时，当将连同当体细胞重编程时表达的基因（例如，Oct3/4或Nanog）表达的药物抗性基因导入作为标志物基因时，细胞被培养于含有适当医学剂的培养溶液（选择培养溶液）中，使得这样建立的iPS细胞可被选择。而且，当标志物基因是荧光蛋白基因时，iPS细胞可通过使用荧光显微镜观察来选择，当标志物基因是冷光酶基因时通过加发冷光底物来选择，或者当标志物基因是发色酶基因时通过加发色底物来选择。
这里使用的术语“体细胞”可以指除了胚系细胞（germ-line cell）（例如，卵细胞、卵母细胞和ES细胞）或全能细胞外的所有动物细胞（优选地，包括人类细胞的哺乳动物细胞）。体细胞的实例包括，但不限于，任何胎儿体细胞、新生儿体细胞和成熟的健康或致病性体细胞，或者，任何原代培养细胞、传代细胞和建立的细胞系。体细胞的特定实例包括（1）组织干细胞(体干细胞)如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和牙髓干细胞，(2)组织前体细胞，(3)分化细胞如淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(如，皮肤细胞)、头发细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(如，胰腺外分泌细胞)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞。
2.筛选人诱导的多能干细胞系的试剂和试剂盒
本发明还提供筛选人诱导的多能干细胞系的试剂。本发明的筛选的试剂包含识别以上描述的标志物的至少一种类型的探针、引物或抗体。这样的试剂能被用来与其它试剂或装置组合生产试剂盒。本发明的试剂盒可包含用于RNA提取的试剂、用于基因提取的试剂、用于染色体提取的试剂或类似物。还有，本发明的试剂盒可包含用于区别展现分化抗性的细胞系和不展现分化抗性的细胞系的区别分析的装置（means），例如包含区别分析的程序的文献或说明书、通过计算机实现区别分析的步骤的程序、程序列表、包含记录于其中的程序的记录媒体，该媒体是计算机可读的（例如，软盘、光盘、CD-ROM、CD-R和CD-RW），和实施区别分析的装置或系统（例如，计算机）。
实施例
接下来将通过实施例详细描述本发明，这些实施例不应被理解为限制本发明的范围。
实施例1
1.细胞
作为人ES细胞，使用了KhES1、KhES3(Suemori H，等人，BiochemBiophys Res Commun.345:926-32,2006)和H9(Thomson,J.A.，等人，Science282:1145-1147,1998)。
作为人iPS细胞，使用了通过下列方法制备的9个家族和39个克隆。
（i）六（6）个因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28和p53shRNA）使用附加型载体（Okita K，等人Nat Methods,8:409-12,2011）被导入从脐带血抽提的CD34阳性细胞（WO2010/131747），使得4个CB-EP6F克隆被制备。
（ii）四（4）个因子（OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC）使用逆转录病毒被导入从脐带血抽提的CD34阳性细胞，使得三个CB-RV4F克隆被制备（WO2010/131747）。
（iii）四（4）个因子（OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC）使用仙台病毒(Seki T,等人，Cell Stem Cell,7:11-4,2010)被导入从脐带血抽提的CD34阳性细胞（WO2010/131747），使得五个CB-SV4F克隆被制备。
（iv）六（6）个因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28和p53shRNA）使用附加型载体被导入牙髓干细胞，使得两个DP-EP6F克隆被制备(Okita K，等人，Nat Methods,8:409-12,2011)。
（v）六（6）个因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28和p53shRNA）使用附加型载体被导入成纤维细胞，使得三个FB-EP6F克隆被制备(OkitaK，等人，Nat Methods,8:409-12,2011)。
（vi）三（3）个因子（OCT3/4、SOX2和KLF4）使用逆转录病毒被导入成纤维细胞，使得四个FB-RV3F克隆被制备(Okita K，等人，NatMethods,8:409-12,2011)。
（vii）四（4）个因子（OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC）使用逆转录病毒被导入成纤维细胞，使得11个FB-RV4F克隆被制备(Okita K，等人，Nat Methods,8:409-12,2011)。
（viii）六（6）个因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、L-Myc、LIN28和p53shRNA）使用附加型载体被导入包括在外周血单核细胞(PBMC)中的T细胞(Seki T，等人Cell Stem Cell,7:11-4,2010)，使得四个PM-EP6F克隆被制备(Okita K，等人，Nat Methods,8:409-12,2011)。
（ix）四（4）个因子（OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC）使用仙台病毒被导入包括在外周血单核细胞(PBMC)中的T细胞，使得四个PM-SV4F克隆被制备(Seki T，等人，Cell Stem Cell,7:11-4,2010)。
2.分化抗性的确认
为了确认ES细胞和iPS细胞的分化抗性，前述细胞经历分化诱导以使用包含以下步骤的改良SFEBq方法产生神经细胞。
（1）10微摩尔/升Y27632（WAKO）加入到ES细胞或iPS细胞的培养溶液中，然后将溶液静置3小时。
（2）使用CTK溶液（胶原蛋白酶-胰蛋白酶-KSR）除去饲养细胞，将所得物用Accumax（Innovate cell technologies）处理，然后分解成单个细胞，将所得细胞以9000细胞/150微升/孔铺板于96孔板（Lipidure涂层U96w，NOF Corporation）。
（3）在含有10微摩尔/升Y-27632、2微摩尔/升Dorsomorphin（Sigma）、10微摩尔/升SB431542（Sigma）、5％KSR（Invitrogen）、MEM-非必需氨基酸溶液（Invitrogen）、L-谷氨酰胺（Invitrogen）和2-巯基乙醇（Invitrogen）的DMEM/F12（Invitrogen）中培养细胞。每3天或4天用缺乏Y-27632、Dorsomorphin和SB431542的培养基更换一半培养基，接着培养14天。随后，将由此获得的神经细胞分离，固定在37％福尔马林中，用Alexa Fluor488小鼠抗Oct3/4（BD Pharmingen）染色，然后用流式细胞仪进行分析。在CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-3、FB-RV3F-4、FB-RV4F-5和FB-RV4F-11的情况下，甚至在分化诱导后，含有5％或更高Oct3/4阳性细胞。这些iPS细胞被用作展现分化抗性的细胞系的细胞。其结果示于表3中。
[表3]
在每个iPS细胞系中的Oct3/4阳性细胞的含量
Figure BDA0000461378700000271
Figure BDA0000461378700000281
“O”意思是不展现分化抗性的克隆。
“X”意思是展现分化抗性的克隆。
3.分化抗性标志物的确认
从5个展现分化抗性的iPS细胞系（CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-3、FB-RV3F-4和FB-RV4F-5）和27个不展现分化抗性的iPS细胞系（包括ES细胞）收集RNA。使用微阵列（Human GE G38x60k，Agilent）测定RNA表达。表4显示在不展现分化抗性的细胞系中表达水平比展现分化抗性的细胞系中表达水平高5倍或更多倍的标志物组。相似地，表5显示在不展现分化抗性的细胞系中表达水平比展现分化抗性的细胞系中表达水平低5倍或更多倍的标志物组。这里，从表4确认了四种标志物，其每种通过t检验获得的P值为0.05或更小（DLX5、MEIS2、lincRNA:chr17:21434064-21435857反向链、GREB1L），并从表5确认了12种标志物，其每种通过t检验获得的P值为0.05或更小（C4orf51、C7orf57、lincRNA:chr7:124873114-124899839反向链、OC90、lincRNA:chr8:133071643-133092468反向链、lincRNA:chr8:133076031-133093351反向链、ABHD12B、lincRNA:chr18:54721302-54731677反向链、ZNF541、TBX1、CXorf61、DB090170TESTI4人类cDNA克隆TESTI40389975'，mRNA序列[DB090170])。
[表4-1]
不展现分化抗性的细胞系的标志物
Figure BDA0000461378700000311
[表4-2]
Figure BDA0000461378700000321
[表4-3]
[表4-4]
[表5-1]
展现分化抗性的细胞系的标志物
[表5-2]
Figure BDA0000461378700000361
实施例2
（1）细胞
以上四种展现分化抗性的iPS细胞系（CB-RV4F-2、DP-EP6F-1、FB-RV3F-4和FB-RV4F-5）被接种，然后这样得到的集落被挑起，使得从CB-RV4F-2得到了15个亚克隆，从DP-EP6F-1得到了15个亚克隆，从FB-RV3F-4得到了10个亚克隆，从FB-RV4F-5得到了11个亚克隆。
（2）确认分化抗性
为了确认ES细胞和iPS细胞的分化抗性，使用以上改良的SFEBq法进行了向神经细胞的分化诱导，然后使用流式细胞仪检查了TRA-1-60阳性细胞的含量。结果是，在向神经细胞的细胞分化诱导后，15个CB-RV4F-2亚克隆中的12个含有1%或更多的TRA-1-60阳性细胞（表6）。相似地，15个DP-EP6F-1亚克隆中的12个（表7），10个FB-RV3F-4亚克隆中的8个（表8），11个FB-RV4F-5亚克隆中的3个（表9）含有1%或更多的TRA-1-60阳性细胞。这35个被发现含有1%或更多的TRA-1-60阳性细胞的亚克隆被筛选作为展现分化抗性的iPS细胞系。
[表6]
在CB-RV4F-2亚克隆中的TRA-1-60阳性细胞含量
Figure BDA0000461378700000371
[表7]
在DP-EP6F-1亚克隆中的TRA-1-60阳性细胞含量
亚克隆名称 TRA-1-60阳性细胞(％)
DP-EP6F-1sub1 8.8
DP-EP6F-1sub2 21
DP-EP6F-1sub3 48.3
DP-EP6F-1sub4 11.4
DP-EP6F-1sub5 0.6
DP-EP6F-1sub6 8.1
DP-EP6F-1sub7 43.9
DP-EP6F-1sub8 9.5
DP-EP6F-1sub9 0.2
DP-EP6F-1sub10 22
DP-EP6F-1sub11 0.1
DP-EP6F-1sub12 44.1
DP-EP6F-1sub13 41.3
DP-EP6F-1sub14 10.9
DP-EP6F-1sub15 16.9
DP-EP6F-1 53.5
H9 0.1
khES3 0.1
[表8]
在FB-RV3F-4亚克隆中的TRA-1-60阳性细胞含量
Figure BDA0000461378700000391
[表9]
在FB-RV4F-5亚克隆中的TRA-1-60阳性细胞含量
Figure BDA0000461378700000392
分化抗性标志物的确认
从35个展现分化抗性的亚克隆和16个不展现分化抗性的亚克隆中提取了RNA，这些亚克隆已经通过以上方法筛选，然后使用微阵列检查了每种RNA的表达水平。结果是，如表10所示，lincRNA和mRNA以显著高的水平在展现分化抗性的亚克隆中表达。
[表10]
Figure BDA0000461378700000401
实施例3
使用定量PCR在6个展现分化抗性的克隆和6个不展现分化抗性的克隆中测定了作为展现分化抗性的细胞系的标志物的表5（实施例1）和表10（实施例2）中包含的C4orf51、HHLA1和ABHD12B的RNA表达（图1）。确认这些标志物基因在展现分化抗性的克隆中以与前述结果同样的方式被表达。而且，已知这些基因在它们的基因体中具有LTR7区域（图2）。因此，用焦磷酸测序法测定了LTR7区域或其附近的CpG二核苷酸中甲基化胞嘧啶的百分比（图3）。简单地说，使用用Pyromark Assay DesignSoftware2.0(Qiagen)设计的引物进行了焦磷酸测序。引物序列和LTR7区域中的CpG二核苷酸示于表11和表12。PCR在含有25ng亚硫酸氢盐转化的DNA、1X Pyromark PCR主要混合液（Qiagen）、1X Coral加样浓缩物（Qiagen）和0.3微摩尔/升正向和5'生物素化的反向引物的25微升反应混合物中进行。PCR条件为45个循环的95℃30秒，50℃30秒，72℃30秒。PCR产物结合到链霉亲和素（streptavidin）琼脂糖珠（AmershamBiosciences），然后进行纯化，洗涤，变性，并再次洗涤。然后，0.3μmol/L的焦磷酸测序引物退火到纯化的PCR产物。焦磷酸测序反应在PSQ HS96焦磷酸测序系统进行。甲基化的程度表示为甲基化的胞嘧啶除以甲基化和未甲基化的胞嘧啶的总和的百分比（5mC的百分比）。为了验证PCR焦磷酸测序法，每个CpG二核苷酸位置被一式三份测定，它们的平均值被用于最后的分析中。作为结果，位于C4orf51、HHLA1和ABHD12B基因体的在LTR7区域或其附近的CpG二核苷酸位置的甲基化状态为显著高的水平。
[表11]
Figure BDA0000461378700000421
Figure BDA0000461378700000431
[表12]
Figure BDA0000461378700000432
Figure BDA0000461378700000441
分析了“下划线CG序列”的DNA甲基化状态。
从以上结果中，展现分化抗性的克隆可通过识别C4orf51、HHLA1和ABHD12B的表达而被分选。相似地，展现分化抗性的克隆可通过识别位于C4orf51、HHLA1和ABHD12B基因体的LTR7区域或其附近的DNA甲基化状态而被分选。
此处引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用被完整并入此处。
工业适用性
本申请的发明可用于生产再生医学材料的领域。
Figure IDA0000461378810000011
Figure IDA0000461378810000031
Figure IDA0000461378810000041
Figure IDA0000461378810000051
Figure IDA0000461378810000061
Figure IDA0000461378810000071
Figure IDA0000461378810000081
Figure IDA0000461378810000091
Figure IDA0000461378810000101
Figure IDA0000461378810000111
Figure IDA0000461378810000121
Figure IDA0000461378810000131
Figure IDA0000461378810000141

Claims (9)

1.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的方法，所述方法包含如下步骤：
（i）测定选自A组和/或B组的至少一个大的基因间的非编码RNA（lincRNA）或mRNA的表达，
（ii）选择其中选自A组的所述lincRNA或mRNA表达或其中选自B组的所述lincRNA或mRNA不表达的人诱导的多能干细胞系；
A组由以下组成
(A1)lincRNA:chr1:852245-854050反向链，
(A2)GPR177，
(A3)VTCN1，
(A4)lincRNA:chr1:142803013-142804254反向链，
(A5)APOA2，
(A6)WNT6，
(A7)EPAS1，
(A8)COL3A1，
(A9)SLC40A1，
(A10)S100P，
(A11)HOPX，
(A12)GUCY1A3，
(A13)CDH10，
(A14)HAPLN1，
(A15)PITX1，
(A16)HAND1，
(A17)CGA，
(A18)AQP1，
(A19)DLX6，
(A20)DLX5，
(A21)SOX17，
(A22)FLJ45983，
(A23)PLCE1，
(A24)H19，
(A25)lincRNA:chr11:2016408-2017024反向链，
(A26)lincRNA:chr11:2017517-2017651正向链，
(A27)IGF2，
(A28)P2RY6，
(A29)SLN，
(A30)NNMT，
(A31)APOA1，
(A32)ERP27，
(A33)LUM，
(A34)CCDC92，
(A35)CDX2，
(A36)FLJ41170，
(A37)MEG3，
(A38)lincRNA:chr14:101292469-101299626正向链，
(A39)lincRNA:chr14:101295637-101302637正向链，
(A40)lincRNA:chr14:101296681-101298460正向链，
(A41)lincRNA:chr14:101298129-101300147正向链，
(A42)lincRNA:chr14:101324825-101327247正向链，
(A43)MEG8，
(A44)lincRNA:chr14:101365673-101366049正向链，
(A45)lincRNA:chr14:101396955-101397357正向链，
(A46)lincRNA:chr14:101430757-101433381正向链，
(A47)lincRNA:chr14:101434059-101436282正向链，
(A48)lincRNA:chr14:101472355-101473369正向链，
(A49)DIO3，
(A50)MEIS2，
(A51)PRTG，
(A52)C17orf51，
(A53)lincRNA:chr17:21434064-21435857反向链，
(A54)lincRNA:chr17:21435180-21454915反向链，
(A55)lincRNA:chr17:21435959-21436405反向链，
(A56)CCR7，
(A57)KRT23，
(A58)GREB1L，
(A59)GATA6，
(A60)TTR，
(A61)UCA1，
(A62)FLRT3，
(A63)lincRNA:chrX:73040495-73047819反向链，
(A64)VGLL1，
(A65)RPS4Y1，
(A66)DDX3Y，以及
(A67)RPS4Y2，
B组由以下组成
(B1)DMRTB1，
(B2)lincRNA:chr1:73430887-73446112反向链，
(B3)lincRNA:chr1:73444697-73444997反向链，
(B4)C4orf51，
(B5)PCDHA1，
(B6)lincRNA:chr6:95250854-95263604反向链，
(B7)lincRNA:chr6:14280358-14285376反向链，
(B8)lincRNA:chr6:14283301-14285685反向链，
(B9)C7orf57，
(B10)lincRNA:chr7:124873114-124899839反向链，
(B11)lincRNA:chr8:129599518-129624118反向链，
(B12)OC90，
(B13)lincRNA:chr8:133071643-133092468反向链，
(B14)lincRNA:chr8:133073732-133075753反向链，
(B15)HHLA1，
(B16)incRNA:chr8:133076031-133093351反向链，
(B17)lincRNA:chr8:133090096-133097869反向链，
(B18)lincRNA:chr8:138387843-138421643反向链，
(B19)lincRNA:chr8:138418343-138425831反向链，
(B20)NDUFA4L2，
(B21)lincRNA:chr13:54698462-54707001反向链，
(B22)ABHD12B，
(B23)lincRNA:chr18:54721302-54731677反向链，
(B24)ZNF208，
(B25)ZNF257，
(B26)ZNF676，
(B27)ZNF541，
(B28)TBX1，
(B29)CXorf61，以及
(B30)DB090170TESTI4人类cDNA克隆TESTI40389975'，mRNA序列[DB090170]。
2.根据权利要求1所述的方法，其中选自A组的所述lincRNA或mRNA选自由以下组成的组中：
(A20)DLX5，
(A50)MEIS2，
(A53)lincRNA:chr17:21434064-21435857反向链，以及
(A58)GREB1L。
3.根据权利要求1所述的方法，其中选自B组的所述lincRNA或mRNA选自由以下组成的组中：
(B4)C4orf51，
(B9)C7orf57，
(B10)lincRNA:chr7:124873114-124899839反向链，
(B12)OC90，
(B13)lincRNA:chr8:133071643-133092468反向链，
(B14)lincRNA:chr8:133073732-133075753反向链，
(B15)HHLA1，
(B16)lincRNA:chr8:133076031-133093351反向链，
(B17)lincRNA:chr8:133090096-133097869反向链，
(B22)ABHD12B，
(B23)lincRNA:chr18:54721302-54731677反向链，
(B27)ZNF541，
(B28)TBX1，
(B29)CXorf61，以及
(B30)DB090170TESTI4人类cDNA克隆TESTI40389975'，mRNA序列[DB090170]。
4.根据权利要求1所述的方法，其中选自B组的所述lincRNA或mRNA选自由以下组成的组中；
(B4)C4orf51，
(B15)HHLA1，以及
(B22)ABHD12B。
5.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的方法，所述方法包含如下步骤：
（i）测定位于选自由(B4)C4orf51、(B15)HHLA1和(B22)ABHD12B组成的组中至少一个基因中的LTR区或其附近的DNA-甲基化状态，以及
（ii）选择其中所述LTR7区域处于DNA-甲基化状态的人诱导的多能干细胞系。
6.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂，所述试剂含有具有显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA或lincRNA的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，或与其互补的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的试剂，所述试剂是通过固定与具有显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA或lincRNA的核苷酸序列中的至少15个连续核苷酸的多核苷酸互补的多核苷酸作为探针制备的微阵列。
8.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂，所述试剂含有识别由显示于以上A组或B组中的至少一个mRNA编码的蛋白的抗体。
9.一种筛选不展现分化抗性的人诱导的多能干细胞系的试剂盒，所述试剂盒含有根据权利要求6到8的任一项所述的试剂。
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