[go: up one dir, main page]

JP7162895B2 - Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法 - Google Patents

Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法 Download PDF

Info

Publication number
JP7162895B2
JP7162895B2 JP2019500423A JP2019500423A JP7162895B2 JP 7162895 B2 JP7162895 B2 JP 7162895B2 JP 2019500423 A JP2019500423 A JP 2019500423A JP 2019500423 A JP2019500423 A JP 2019500423A JP 7162895 B2 JP7162895 B2 JP 7162895B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hiv
cells
seq
composition
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019500423A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019525914A5 (ja
JP2019525914A (ja
Inventor
チャールズ デイビッド パウザ，
ハイシャン リ，
テイラー ラフーゼン，
ゲイリー マンスフィールド，
Original Assignee
アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド filed Critical アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド
Publication of JP2019525914A publication Critical patent/JP2019525914A/ja
Publication of JP2019525914A5 publication Critical patent/JP2019525914A5/ja
Priority to JP2022133225A priority Critical patent/JP2022166288A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7162895B2 publication Critical patent/JP7162895B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/46—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/122—Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)

Description

関連出願への相互参照
この出願は、「ＨＩＶ ＰＲＥ－ＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」との表題の２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，１８５号、「ＨＩＶ ＰＲＥ－ＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」との表題の２０１６年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８５，８６４号、「ＨＩＶ ＰＲＥ－ＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」との表題の２０１６年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４０９，２７０号および「ＨＩＶ ＰＲＥ－ＩＭＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」との表題の２０１７年１月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１７／１３０１９号（これらの開示は、参考として本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。
本発明は、概して、ＨＩＶの処置および防止のための免疫化および免疫療法の分野に関する。特に、開示されている方法は、機能的治癒を求めるＨＩＶ＋の個体から白血球を得て処理し、そのようなＨＩＶ＋の個体に注入するのに好適な細胞産物を調製することに関する。
抗レトロウイルス薬併用療法（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）（ｃＡＲＴ）（高活性抗レトロウイルス薬療法（Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ）またはＨＡＡＲＴとしても公知）は、ＨＩＶ－１の複製を制限し、疾患進行を遅延させるが、薬物の毒性および薬物耐性ウイルスの出現が、ＨＩＶ感染者の長期制御における課題である。さらに、伝統的な抗レトロウイルス薬療法は、ＡＩＤＳ発症または死の遅延には成功しているものの、機能的治癒をもたらすには至っていない。代替的な処置戦略が必要である。
免疫系がＨＩＶ複製の制限において通常は不十分であるとはいえ主要な役割を果たすことを示すデータの出現により、ＨＩＶ感染のための免疫療法には強い関心が寄せられている。細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の機能の維持に重要であるウイルス特異的Ｔヘルパー細胞が一定の役割を果たしている可能性が高い。ウイルス血症も中和抗体に影響されるが、これらは概してＨＩＶ感染における重要性が低く、ｉｎ ｖｉｖｏで進化するウイルスバリアントに後れを取る。
まとめると、これらのデータは、ＨＩＶ特異的細胞性免疫応答の強度および幅の増加は、いわゆるＨＩＶ免疫療法による臨床的有用性を有し得ることを示す。いくつかの研究においてＨＩＶに対するワクチンが試験されたが、今日まで十分な成功を収めていない。さらに、遺伝子療法技術を利用することによるＨＩＶ免疫療法の強化に関心が示されているが、他の免疫療法のアプローチと同じく、十分な成功を収めていない。
ウイルスベクターは、特異的なウイルスと宿主細胞の相互作用および治療用遺伝子構築物の発現についての機構のために、標的細胞に遺伝子を形質導入するために使用され得る。結果として、ウイルスベクターは、全Ｔ細胞または他の免疫細胞を含む多くの異なる細胞型、ならびに胚、受精卵、単離組織試料、ｉｎ ｓｉｔｕの組織標的および培養細胞に遺伝子を移入するためのビヒクルとして使用されてきた。外来遺伝子または変更した遺伝子を細胞に導入し発現させる能力は、遺伝子療法、誘導多能性幹細胞の体細胞リプログラミング、および様々なタイプの免疫療法などの治療介入に有用である。
遺伝子療法は、ウイルスベクターの使用を伴い得る新しい治療薬を作り出す可能性のある、生物医学研究の中で最も成熟した分野のうちの１つである。療法に利用可能な多種多様な可能性のある遺伝子を考慮すると、感染性および非感染性疾患を処置する手段としての遺伝子療法の期待に応えるためには、これらの遺伝子を送達する効率的な手段が必要である。マウスのレトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルス）、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスを含むいくつかのウイルス系が、治療用の遺伝子移入ベクターとして提唱されてきた。
ウイルスベクターを開発する際には、組織向性、ウイルス調製物の安定性、発現の安定性および制御、ゲノムのパッケージング容量、構築物依存性ベクター安定性、ならびに所望の結果が宿主ゲノムへの安定な遺伝子組み込みを有するべきかどうかを含め、考慮しなければならない多くの要因がある。加えて、ウイルスベクターのｉｎ ｖｉｖｏでの適用は、ウイルス構造タンパク質および／または形質導入された遺伝子産物に対する宿主免疫応答によって限定されることが多い。
このように、毒性および安全性が、被験体の処置のためにウイルスベクターをｉｎ ｖｉｖｏで使用するために克服しなければならない主なハードルである。ヒトにおける遺伝子療法の適用においては、遺伝子送達ビヒクルまたは治療用遺伝子産物に対する宿主免疫応答に関連する問題に直面した歴史的な例が多数存在する。いくつかのウイルス遺伝子を１つまたは複数の治療用遺伝子と併せて共形質導入（co-transduce）するウイルスベクター（例えば、アデノウイルス）には特に問題がある。
レンチウイルスベクターは概して細胞傷害を誘導せず、強力な宿主免疫応答を誘発しないものの、いくつかの免疫刺激性遺伝子産物をコードするＨＩＶ－１などの一部のレンチウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞傷害をもたらし、強力な免疫応答を誘導する可能性を有する。しかしながら、形質導入後のウイルス遺伝子をコードしないレンチウイルス由来の形質導入ベクターに関しては、これは懸念事項にならない場合がある。当然ながら、これは常に当てはまるとは限らない。というのも、場合により、ベクターの目的は、臨床的に有用な免疫応答を誘起するタンパク質をコードすることであるからである。
レンチウイルスベクターの使用に関する別の重要な問題は、一部の細胞傷害性ウイルスタンパク質に曝露された際の細胞変性の可能性の問題である。ある特定のＨＩＶ－１タンパク質への曝露は、Ｔ細胞の細胞死または機能的無反応性を誘導し得る。同様に、多くの場合、組換えにより複製可能な毒性ウイルスが発生する可能性が懸念される。したがって、改善されたＨＩＶ処置が依然として必要とされている。
一態様では、ＨＩＶに感染した細胞を処置する方法が提供される。本方法は、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる、ＨＩＶに感染した被験体から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を治療有効量の刺激剤と接触させるステップと、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系をＰＢＭＣにｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップと、適度な形質導入を確実にするために十分な期間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップとを様々に含む。諸実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣは約１～約３５日間培養される。諸実施形態では、本方法は、形質導入されたＰＢＭＣを被験体に注入するステップをさらに含む。諸実施形態では、本方法は、ＰＢＭＣからＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性選択する（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）ステップをさらに含む。さらなる実施形態では、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの物理的選択方法を使用して陽性選択される。諸実施形態では、被験体はヒトである。諸実施形態では、刺激剤は、被験体においてＴ細胞応答を刺激するのに好適な任意の薬剤を含む。諸実施形態では、刺激剤は、ペプチドまたはペプチドの混合物であり、また諸実施形態では、ｇａｇペプチドを含む。さらなる実施形態では、刺激剤はワクチンである。諸実施形態では、ワクチンはＨＩＶワクチンであり、諸実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントである。諸実施形態では、ウイルス送達系はレンチウイルス粒子を含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む。ＨＩＶ ＲＮＡ配列は、ウイルス送達系によるターゲティングに好適な任意のＨＩＶ配列を含む。諸実施形態では、ＨＩＶ ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントのうちの１つまたは複数を含む。少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ウイルス送達系により発現させることができる任意の遺伝子エレメントを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含む。
別の態様では、ＨＩＶ＋の個体から末梢血を得るステップと；血液を分画してＰＢＭＣ集団を得るステップと；ＰＢＭＣ集団を精製された抗原提示細胞またはＨＩＶの成分を代表するペプチドもしくはタンパク質と接触させるステップと；接触させたＰＢＭＣ集団を約１～約３５日間培養して抗原特異的Ｔ細胞の数を増加させるステップと；ペプチド刺激に応答する細胞を陽性選択して、濃縮された細胞画分を生成するステップと；本明細書で詳述されるウイルス送達系を濃縮された細胞画分にｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップと、適度な形質導入を確実にするために十分な期間にわたって、形質導入された細胞の画分を培養するステップとを含む方法が開示される。本明細書に開示される方法ステップの順序は変更してよい。非限定的な例として、細胞を陽性選択するステップおよび細胞に形質導入するステップを逆転させてもよく、形質導入効率を改善するためにポリクローナル刺激を追加してもよい。
諸実施形態では、ＰＢＭＣ集団をさらに精製して、ＰＢＭＣの精製画分を生成する。諸実施形態では、ＰＢＭＣのさらに精製した画分を、ＨＩＶの成分を代表するペプチドまたはタンパク質と接触させる。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、
AGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGTAAACTGAGCTTGCTCTACTGTGAAGCCACAGATGGGTAGAGCAAGCACAGTTTACCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTT（配列番号１）
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは配列番号１を含む。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、
CATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGGGATGTGTACTTCTGAACTTGTGTTGAATCTCATGGAGTTCAGAAGAACACATCCGCACTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCA（配列番号２）
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性、または
GGGCCTGGCTCGAGCAGGGGGCGAGGGATTCCGCTTCTTCCTGCCATAGCGTGG
TCCCCTCCCCTATGGCAGGCAGAAGCGGCACCTTCCCTCCCAATGACCGCGTCTTCGTCG（配列番号３）
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、
配列番号２;または配列番号３
を含む。
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
AGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGTAAACTGAGCTTGCTCTACTGTGAAGCCACAGATGGGTAGAGCAAGCACAGTTTACCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTTCCCGGGCATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGGGATGTGTACTTCTGAACTTGTGTTGAATCTCATGGAGTTCAGAAGAACACATCCGCACTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCAGCTAGCGGGCCTGGCTCGAGCAGGGGGCGAGGGATTCCGCTTCTTCCTGCCATAGCGTGGTCCCCTCCCCTATGGCAGGCAGAAGCGGCACCTTCCCTCCCAATGACCGCGTCTTCGTC（配列番号３１）
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む。諸実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３１を含む。
別の態様では、被験体においてＨＩＶ感染を処置する方法が開示される。本方法は、有効量の第１の刺激剤で被験体を免疫化するステップと、被験体から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るステップとを様々に含む。本方法は、ＰＢＭＣを治療有効量の第２の刺激剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させるステップと、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系をＰＢＭＣにｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップと、適度な形質導入を確実にするために十分な期間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップとをさらに含む。諸実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣは約１～約３５日間培養され得る。諸実施形態では、本方法は、ＰＢＭＣからＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性選択するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、少なくとも１つの物理的選択方法を使用して陽性選択される。諸実施形態では、本方法は、形質導入されたＰＢＭＣを被験体に注入するステップをさらに伴う。被験体はヒトであり得る。第１および第２の刺激剤は、同じであっても異なっていてもよい。第１および第２の刺激剤は、ペプチドまたはペプチドの混合物のうちの１つまたは複数を含み得る。諸実施形態では、第１および第２の刺激剤のうちの少なくとも１つが、ｇａｇペプチドを含む。諸実施形態では、第１および第２の刺激剤のうちの少なくとも１つは、ＰＢＭＣ中またはＰＢＭＣの精製画分中に存在する免疫細胞によって認識されるｇａｇペプチドの混合物を含む。第１および第２の刺激剤のうちの少なくとも１つは、ワクチンを含み得る。諸実施形態では、ワクチンはＨＩＶワクチンであり、さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントである。諸実施形態では、ウイルス送達系はレンチウイルス粒子を含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む。ＨＩＶ ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含み得る。少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み得る。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、単一の転写プロモーターの制御下におけるクラスター内のすべてのエレメントの同時発現のためにデザインされた合成マイクロＲＮＡクラスターを含む。諸実施形態では、ＰＢＭＣ集団をさらに精製して、ＰＢＭＣの精製画分を生成する。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、
AGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGTAAACTGAGCTTGCTCTACTGTGAAGCCACAGATGGGTAGAGCAAGCACAGTTTACCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTT（配列番号１）
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１を含む。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、
CATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGGGATGTGTACTTCTGAACTTGTGTTGAATCTCATGGAGTTCAGAAGAACACATCCGCACTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCA（配列番号２）
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性、または
GGGCCTGGCTCGAGCAGGGGGCGAGGGATTCCGCTTCTTCCTGCCATAGCGTGG
TCCCCTCCCCTATGGCAGGCAGAAGCGGCACCTTCCCTCCCAATGACCGCGTCTTCGTCG（配列番号３）
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２;または配列番号３を含む。
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
AGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGTAAACTGAGCTTGCTCTACTGTGAAGCCACAGATGGGTAGAGCAAGCACAGTTTACCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTTCCCGGGCATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGGGATGTGTACTTCTGAACTTGTGTTGAATCTCATGGAGTTCAGAAGAACACATCCGCACTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCAGCTAGCGGGCCTGGCTCGAGCAGGGGGCGAGGGATTCCGCTTCTTCCTGCCATAGCGTGGTCCCCTCCCCTATGGCAGGCAGAAGCGGCACCTTCCCTCCCAATGACCGCGTCTTCGTC（配列番号３１）
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む。諸実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３１を含む。
別の態様では、レンチウイルスベクターが開示される。レンチウイルスベクターは、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントを含み、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡを含む。少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含んでもよい。別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む。ＨＩＶ ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含み得る。少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み得る。少なくとも１つのコードされる遺伝子エレメントは、単一の転写プロモーターの制御下におけるクラスター内のすべてのエレメントの同時発現のためにデザインされた合成マイクロＲＮＡクラスターを含み得る。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、
AGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGTAAACTGAGCTTGCTCTACTGTGAAGCCACAGATGGGTAGAGCAAGCACAGTTTACCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTT（配列番号１）
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１を含む。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、
CATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGGGATGTGTACTTCTGAACTTGTGTTGAATCTCATGGAGTTCAGAAGAACACATCCGCACTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCA（配列番号２）
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性、または
GGGCCTGGCTCGAGCAGGGGGCGAGGGATTCCGCTTCTTCCTGCCATAGCGTGG
TCCCCTCCCCTATGGCAGGCAGAAGCGGCACCTTCCCTCCCAATGACCGCGTCTTCGTCG（配列番号３）
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、
配列番号２;または配列番号３を含む。
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
AGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGTAAACTGAGCTTGCTCTACTGTGAAGCCACAGATGGGTAGAGCAAGCACAGTTTACCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTTCCCGGGCATCTCCATGGCTGTACCACCTTGTCGGGGGATGTGTACTTCTGAACTTGTGTTGAATCTCATGGAGTTCAGAAGAACACATCCGCACTGACATTTTGGTATCTTTCATCTGACCAGCTAGCGGGCCTGGCTCGAGCAGGGGGCGAGGGATTCCGCTTCTTCCTGCCATAGCGTGGTCCCCTCCCCTATGGCAGGCAGAAGCGGCACCTTCCCTCCCAATGACCGCGTCTTCGTC（配列番号３１）
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む。諸実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３１を含む。
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が開示される。この系は、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターと、好ましくは細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるためのエンベローププラスミドと、目的の遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドとを含む。諸実施形態では、目的の遺伝子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子のうちの１つまたは複数を含む。諸実施形態では、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。さらなる実施形態では、レンチウイルス粒子は、パッケージング細胞株によって産生される。諸実施形態では、レンチウイルス粒子は、目的の標的の産生を調整することができる。諸実施形態では、目的の標的は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＨＩＶ ＲＮＡ配列のうちのいずれかである。この系は、第１のヘルパープラスミドおよび第２のヘルパープラスミドをさらに含んでよい。諸実施形態では、第１のヘルパープラスミドはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現し、第２のヘルパープラスミドはｒｅｖ遺伝子を発現する。
別の態様では、細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が提供される。レンチウイルス粒子は、好ましくは細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質と、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターとを含む。諸実施形態では、エンベロープタンパク質は、Ｔ細胞に感染するように最適化されていてよい。諸実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染するように最適化されている。
別の態様では、改変細胞が提供される。改変細胞は、本態様および実施形態に従って使用するための、レンチウイルスベクター系に感染することができる任意の細胞を含む。諸実施形態では、細胞は、レンチウイルス粒子に感染したＣＤ４＋Ｔ細胞である。諸実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、ＨＩＶ抗原を認識するように選択されたものである。諸実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ抗原を含む。諸実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、レンチウイルス粒子に感染した後に低下したレベルのＣＣＲ５を発現する。
別の態様では、治療処置レジメンのための被験体を選択する方法が提供される。本方法は、有効量の第１の刺激剤で被験体を免疫化するステップと；被験体から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製し、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連付けられる第１の定量化可能な測定値を決定するステップと；ＰＢＭＣを治療有効量の第２の刺激剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させ、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連付けられる第２の測定値を決定するステップとを様々に含み、ここで、第２の定量化可能な測定値が第１の定量化可能な測定値より高い場合、被験体が処置レジメンのために選択される。少なくとも１つの因子は、Ｔ細胞の増殖またはＩＦＮガンマ産生に関連する任意の因子を含み得る。
前出の全体的な説明、ならびに以下の図面の簡単な説明および詳細な説明は、例示的かつ説明的なものであり、特許請求される本発明のさらなる説明を提供することを意図している。他の目的、利点、および新規の特徴は、以下の図面の簡単な説明および本発明の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろう。
図１は、本開示のｅｘ ｖｉｖｏ処置方法のフロー図を示す。
図２は、本開示に従うＣＤ４＋Ｔ細胞の変更および新しい感染の防止を示す。
図３は、治療用ベクター、ヘルパープラスミド、およびエンベローププラスミドからなる、例示的なレンチウイルスベクター系を示す。ここで示されている治療用ベクターは、本明細書においてＡＧＴ１０３とも呼ばれる好ましい治療用ベクターであり、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５－ｍｉＲ２１Ｖｉｆ－ｍｉＲ１８５－Ｔａｔを含有する。
図４は、環状化形態の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
図５は、環状化形態の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
図６は、環状化形態の、さらなる例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
図７は、例示的なベクター配列を示す。ＣＣＲ５向性ＨＩＶ株の伝播を阻害するためのプロモーターおよびｍｉＲクラスターのプラス（すなわち、ゲノム）鎖配列を開発した。下線のない配列は、このｍｉＲクラスターに対して好ましいプロモーターとして選択された転写のＥＦ－１アルファプロモーター（配列番号１０８）を含む。下線のある配列は、ｍｉＲ３０ ＣＣＲ５（配列番号１）、ｍｉＲ２１ Ｖｉｆ（配列番号２）、およびｍｉＲ１８５ Ｔａｔ（配列番号１１１）（配列番号３３に集合的に示されている）からなるｍｉＲクラスターを示す。
図８は、本開示の様々な態様による例示的なレンチウイルスベクター構築物を示す。
図９は、ＡＧＴｃ１２０細胞における実験的ベクターによるＣＣＲ５のノックダウン、および対応するＲ５向性ＨＩＶ感染の防止を示す。（Ａ）ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターありまたはなしでのＡＧＴｃ１２０細胞におけるＣＣＲ５の発現を示す。（Ｂ）ＨＩＶのＮｅｆ遺伝子に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現していたＨＩＶ ＢａＬウイルスストックによる感染に対する形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞の感受性を示す。 同上
図１０は、本開示のレンチウイルスベクターにおける、ｓｈＲＮＡ阻害剤配列によるＣＣＲ５発現の調節を実証するデータを示す。（Ａ）潜在的候補のスクリーニングデータが示されている。（Ｂ）ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ－１（配列番号１６）の形質導入後のＣＣＲ５ノックダウンデータが示されている。
図１１は、本開示のレンチウイルスベクターにおける、ｓｈＲＮＡ阻害剤配列によるＨＩＶ成分の調節を実証するデータを示す。（Ａ）ｒｅｖ／ｔａｔ標的遺伝子のノックダウンデータが示されている。（Ｂ）ｇａｇ標的遺伝子のノックダウンデータが示されている。
図１２は、本明細書に記載されるように、ＨＩＶ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞におけるＴａｔタンパク質の発現をＡＧＴ１０３が低減させることを実証するデータを示す。
図１３は、本開示のレンチウイルスベクターにおける、合成マイクロＲＮＡ配列によるＨＩＶ成分の調節を実証するデータを示す。（Ａ）Ｔａｔノックダウンデータが示されている。（Ｂ）Ｖｉｆノックダウンデータが示されている。
図１４は、長鎖または短鎖のＷＰＲＥ配列のいずれかを含有する本開示のレンチウイルスベクターにおける、合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節を実証するデータを示す。
図１５は、長鎖または短鎖のＷＰＲＥ配列のいずれかを含有する本開示のレンチウイルスベクターにおける、合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節を実証するデータを示す。
図１６は、ＷＰＲＥ配列ありまたはなしの本開示のレンチウイルスベクターにおける、合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節を実証するデータを示す。
図１７は、本開示のレンチウイルスベクターにおける、合成マイクロＲＮＡ配列を調節するＣＤ４プロモーターによるＣＣＲ５発現の調節を実証するデータを示す。
図１８は、ＨＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の検出を実証するデータを示す。
図１９は、ＨＩＶ特異的なＣＤ４ Ｔ細胞の拡大増殖およびレンチウイルス形質導入を実証するデータを示す。（Ａ）処置の例示的なスケジュールが示されている。（Ｂ）本明細書に記載される、ＣＤ４でゲーティングしたＴ細胞におけるＩＦＮガンマ産生が示されている。（Ｃ）本明細書に記載される、ＣＤ４でゲーティングしたＴ細胞におけるＩＦＮガンマ産生およびＧＦＰ発現が示されている。（Ｄ）本明細書に記載されるＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が示されている。（Ｅ）本明細書に記載されるワクチン接種後、かつｅｘ ｖｉｖｏペプチドおよび拡大増殖に続いてのＰＢＭＣからのＩＦＮガンマ産生が示されている。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
同上。
図２０は、漸増するＡＧＴ１０３－ＧＦＰの用量応答およびＣＣＲ５発現の阻害に関する機能アッセイを実証するデータを示す。（Ａ）漸増量のＡＧＴ１０３－ＧＦＰに関する用量応答データが示されている。（Ｂ）ＣＣＲ５発現という点で正規分布した集団が示されており、集団平均の左へのシフトは、ＡＧＴ１０３－ＧＦＰの形質導入に起因するＣＣＲ５発現の減少を示す。（Ｃ）漸増用量のＡＧＴ１０３－ＧＦＰによるＣＣＲ５発現の阻害パーセンテージが示されている。 同上。 同上。
図２１は、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＡＧＴ１０３の形質導入効率を実証するデータを示す。（Ａ）本明細書に記載されるように、形質導入された細胞（ＧＦＰ陽性）の頻度がＦＡＣＳにより示されている。（Ｂ）本明細書に記載される細胞あたりのベクターコピー数が示されている。 同上。
図２２は、本明細書に記載される、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製のＡＧＴ１０３阻害を実証するデータを示す。
図２３は、ＨＩＶ誘導性枯渇からの初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＡＧＴ１０３保護を実証するデータを示す。
図２４は、ＨＩＶ特異的な、ＡＧＴ１０３を形質導入したＣＤ４ Ｔ細胞が高度に濃縮されたＣＤ４＋ Ｔ細胞集団の生成を実証するデータを示す。（Ａ）本明細書に記載される細胞集団に関するＣＤ４およびＣＤ８の発現プロファイルを示す。（Ｂ）本明細書に記載される細胞集団に関するＣＤ４およびＣＤ８の発現プロファイルを示す。（Ｃ）本明細書に記載される細胞集団に関するＩＦＮガンマおよびＣＤ４の発現プロファイルを示す。（Ｄ）本明細書に記載される細胞集団に関するＩＦＮガンマおよびＧＦＰの発現プロファイルを示す。 同上。 同上。 同上。
概説
本明細書では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患を処置および／または防止して機能的治癒を達成するための方法および組成物が開示される。本方法および組成物は、後述するように、組み込みレンチウイルス、非組み込みレンチウイルス、および関連するウイルスベクター技術を含む。
本明細書では、治療用ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、免疫療法、およびＨＩＶ感染を処置するためにそれらを使用する方法が開示される。諸実施形態では、ＨＩＶ感染の機能的治癒を達成するための方法および組成物が提供される。本明細書の図１に示されるように、様々な態様および実施形態は、第１の刺激事象、例えば、ＨＩＶ感染患者において、例えばＨＡＡＲＴの毎日の投与によるウイルス血症の安定な抑制と共に、ＨＩＶに対する強力な免疫応答をもたらすことを意図するワクチンを用いた、第１の治療的免疫化を含む。諸実施形態では、第１の刺激事象により、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の画分が濃縮される。この後には、（１）白血球除去または静脈血からのＰＢＭＣの精製もしくはＰＢＭＣの画分の精製による末梢白血球の単離、（２）第２の刺激事象、例えば、任意のワクチンまたはタンパク質、例えばＨＩＶまたはＨＩＶ関連ペプチドなどの好適な刺激剤によるＣＤ４ Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの刺激、（３）ペプチド刺激への生物学的応答に基づく濃縮された細胞集団の選択、（４）治療用レンチウイルス形質導入、ｅｘ ｖｉｖｏのＴ細胞培養の実施、および（５）元の患者への再注入が続く。
ＣＤ４＋Ｔ細胞などの新しい細胞がＨＩＶに感染することを防止するには、様々な方法および組成物を使用することができる。例えば、図２に解説されているように、新しい細胞が感染するのを防止するためには、ＣＣＲ５発現をターゲティングしてウイルスの付着を防止することができる。さらに、残存するあらゆる感染性ウイルスＲＮＡの破壊をターゲティングすることもできる。前出のことに関し、また本明細書の図２を参照すると、ＨＩＶに既に感染している細胞におけるＨＩＶウイルスのサイクルを止める組成物および方法が提供される。ＨＩＶウイルスのサイクルを止めるためには、潜伏感染ＣＤ４＋Ｔ細胞などの潜伏感染細胞によって産生されるウイルスＲＮＡをターゲティングする。
ＨＩＶの治癒を達成しようとするこれまでの試みは、とりわけ、保護的な遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞が十分な数だけ得られなかったことが原因で不成功に終わっている。この数が臨界閾値を下回っていると、本明細書に記載される機能的治癒は達成されない。例えば、抗レトロウイルス薬療法が終了すると、通常、ＨＩＶの再出現が続いて起こる。その後、患者は多くの場合、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の急速な破壊を経験し、過去の遺伝子療法にもかかわらず、疾患進行の再開が続く。本明細書に記載される組成物および方法に従うＨＩＶ特異的Ｔ細胞の選択的濃縮を用いることにより、様々な実施形態において機能的治癒を含む、新しいＨＩＶ処置レジメンが開発された。
定義および解釈
本明細書で別途定義されない限り、本開示との関連で使用される科学および技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈により別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学、およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。特記なき限り、本開示の方法および技術は概して、当技術分野で周知であり、かつ本明細書随所で引用され、論じられる様々な一般的参考文献およびより具体的な参考文献に記載されている、従来の方法に従って行われる。例えば、Sambrook J.およびRussell D. Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor LaboratoryPress、Cold Spring Harbor、N.Y.（２０００年）、Ausubelら、Short Protocols in MolecularBiology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology、Wiley, John & Sons, Inc.（２００２年）、HarlowおよびLane Using Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（１９９８年）、およびColiganら、Short Protocols in Protein Science、Wiley,John & Sons, Inc.（２００３年）を参照されたい。任意の酵素反応または精製技術は、製造元の仕様に従って、当技術分野で一般的に実行されるように、または本明細書に記載されるように行われる。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにこれらの検査手技および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者には理解され、この用語が使用される文脈に応じてある程度異なるであろう。「約」という用語が使用される文脈を考慮して、その用語の使用が当業者にとって明確でない場合、「約」は、特定の用語の最大プラス１０％またはマイナス１０％を意味する。
本明細書で使用される場合、活性剤「の投与」または「を投与すること」という用語は、処置を必要とする被験体に、この個体の身体に治療上有用な形態および治療有効量で導入され得る形態で、本発明の活性剤を提供することを意味する。
本明細書で使用される場合、「ＡＧＴ１０３」という用語は、本明細書で詳述される、ｍｉＲ３０－ＣＣＲ５／ｍｉＲ２１－Ｖｉｆ／ｍｉＲ１８５－ＴａｔマイクロＲＮＡクラスター配列を含有するレンチウイルスベクターの特定の実施形態を指す。
本明細書で使用される場合、「ＡＧＴ１０３Ｔ」という用語は、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターを含有するレンチウイルスが形質導入された細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「ＣＣＲ５」という用語は、Ｃ－Ｃケモカイン受容体５を指す。本明細書における「ＣＣＲ５デルタ３２」への言及は、ＣＣＲ５遺伝子における変異体遺伝子型への言及である。
本明細書で使用される場合、「ＣＤ」という用語は、特定の表面抗原分類タンパク質を指す。本明細書で使用されるこの用語の非限定的な例は、ＣＤ４タンパク質発現である。このようなタンパク質の例としては、ＣＤ４が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ｃＡＲＴ」という用語は、抗レトロウイルス薬併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）を指す。「ｃＡＲＴ」という用語は、ＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス薬療法）と同義的に使用される場合がある。
本明細書および特許請求の範囲の全体において、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という単語、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」などの変形は、記載された整数または整数群の包含を暗示するが、いかなる他の整数または整数群の除外も暗示するものではないと理解される。さらに、本明細書で使用される場合、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」という用語は、限定することなく含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）」という用語は、細胞供給源の注入後の被験体における持続的生着の定量的レベルを決定することが当業者にとって可能であることを指す（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．、３２３巻：５７０～５７８頁（１９９０年）、Ｄｕｄｌｅｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２４巻：３６３～３７３頁（２００１年）、Ｙｅｅら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：１４１～１４６頁（２００１年）、Ｒｏｏｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ、９２巻：１５４９～１５５５頁（１９９８年）を参照されたい）。
「発現」、「発現される」、または「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシング、または他の形態の転写後修飾もしくは翻訳後修飾を含む場合がある。
上記に言及した、また本明細書でさらに定義される「機能的治癒」という用語は、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴなどの継続的なＨＩＶ療法を過去に必要としたＨＩＶ＋の個体が、そのようなＨＩＶ療法のより低い用量、断続的な用量、交代的な薬物の組合せまたは単剤を使用するか、またはその投薬を中止した場合に、ウイルス複製が低いかまたは検出不可能な状態で生存し得るような状況または状態を指す。個体は、低レベルのウイルス複製を維持し、疾患進行を減速または終結させるために補助療法が未だ必要であっても「機能的に治癒した」と言われる場合がある。機能的治癒の起こり得る転帰は、特定される時間枠、例えば１か月間、３か月間、６か月間、１年間、３年間、および５年間、ならびに定義され得るその他すべての時間枠内に再発が検出されないような、ＨＩＶのすべてまたは実質的にすべての最終的な根絶である。
「ＨＩＶワクチン」という用語は、ＨＩＶ特異的免疫応答を誘発することを意図する、免疫原と、ビヒクルと、アジュバントを包含する。「ＨＩＶワクチン」という用語は、本明細書に記載される「刺激剤」という用語の意味に含まれる。「ＨＩＶワクチン」は、ＨＩＶであり得る精製された不活化ウイルス粒子もしくは不活化ウイルス粒子全体、または、特異的免疫を誘発することができるＨＩＶタンパク質、糖タンパク質もしくはタンパク質断片を産生するように細胞を指向することができる組換え細菌ベクター、プラスミドＤＮＡもしくはＲＮＡに加えて、ＨＩＶタンパク質、タンパク質断片もしくはペプチド、糖タンパク質断片もしくはグリコペプチドを発現することができる組換えウイルスベクターを含み得る。代わりに、形質導入の前にＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を濃縮する目的で、またはレンチウイルスを形質導入したＣＤ４ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのために、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、Ｔ細胞受容体特異的抗体、マイトジェン、スーパー抗原、サイトカイン、および他の化学的または生物学的刺激をはじめとする免疫刺激のための特定の方法を使用して、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞を活性化してもよい。活性化物質は、可溶性であってもよく、ポリマー集合体であってもよく、リポソームもしくはエンドソームベースであってもよく、またはビーズに連結していてもよい。刺激に対する細胞の応答を改善し、かつ／または培養および形質導入の間のＣＤ４ Ｔ細胞の生存を改善するために、インターロイキン２、６、７、１２、１５、２３、またはその他を含むサイトカインを付加してよい。前出のいずれも限定するものではないが、代わりに、「ＨＩＶワクチン」という用語は、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンおよびそのバリアントを包含する。ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンは、公知の高度に弱毒化した二重組換えＭＶＡワクチンである。ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンは、公知のＭＶＡベクターにＨＩＶ－１ ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖ配列を挿入することによって構築された（例えば、Ｇｏｅｐｆｅｒｔら（２０１４年）Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．、２１０巻（１号）：９９～１１０頁を参照されたい。また、ＷＯ２００６０２６６６７も参照されたい。これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれている）。「ＨＩＶワクチン」という用語には、以下の表１、および優先権書類（そのすべてはその全体が本明細書に組み込まれている）に含まれる任意の同様の表に提供される、任意の１つまたは複数のワクチンも含まれる。
Figure 0007162895000001
Figure 0007162895000002
Figure 0007162895000003
Figure 0007162895000004
Figure 0007162895000005
Figure 0007162895000006
「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、生きている生物において起こるプロセスを指す。「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、生きている生物の外側で起こるプロセスを指す。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ処置とは、患者の体内で起こる処置を指し、一方でｅｘ ｖｉｖｏ処置とは、患者の体外で起こるが、それでもその患者由来の組織を使用するか、その組織に接近するか、またはその組織と相互作用する処置である。ｅｘ ｖｉｖｏ処置ステップはその後、後続のｉｎ ｖｉｖｏ処置ステップを含んでもよい。
「ｍｉＲＮＡ」という用語はマイクロＲＮＡを指し、本明細書では「ｍｉＲ」と呼ばれる場合もある。「マイクロＲＮＡクラスター」という用語は、ベクター上で互いの近傍に位置し、かつ共発現する、少なくとも２つのマイクロＲＮＡを指す。
「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現させるために使用され得る任意の細胞株を指す。
「ＰＢＭＣ」という用語は末梢血単核細胞を指す。
「パーセント同一性」という用語は、２つまたはそれよりも多い核酸またはポリペプチド配列の文脈では、後述の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または目視検査により測定して、最大の一致のために比較およびアラインメントしたとき、同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、２つまたはそれよりも多い配列またはサブ配列を指す。適用に応じて、「パーセント同一性」は、比較されている配列の領域にわたって、例えば機能的ドメインにわたって存在する場合もあれば、または代替的に、比較される２つの配列の全長にわたって存在する場合もある。配列比較では、典型的には１つの配列が参照配列としての機能を果たし、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv.Appl. Math.、２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol.、４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman、Proc.Nat'l. Acad. Sci. USA、８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索方法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実装、または目視検査（Ausubelら、下記を全体的に参照されたい）によって実施することができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Altschulら、J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３～４１０頁（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトから公的に利用可能である。
２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性はＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comにて利用可能）のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスと、４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みと、１、２、３、４、５、または６の長さ重みとを使用して決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（CABIOS、４巻：１１～１７頁（１９８９年））を使用し、ＰＡＭ１２０残基重み表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティを使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comにて利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol.（４８巻）：４４４～４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みと、１、２、３、４、５、または６の長さ重みとを使用して決定することができる。
本開示の核酸およびタンパク質配列は、公開データベースに対する検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用して、例えば、関連する配列を特定することができる。このような検索は、Altschulら（１９９０年）、J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３～１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴのヌクレオチド検索を行うと、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴのタンパク質検索を行うと、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップありアラインメントを得るためには、Altschulら（１９９７年）、Nucleic Acids Res.、２５巻（１７号）：３３８９～３４０２頁に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用してよい。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液と接触させて使用するのに好適な化合物、物質、組成物、および／または剤形を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合性のある、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを指し、これらを含む。本組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Bergeら（１９７７年）、J Pharm Sci、６６巻：１～１９頁を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「物理的選択方法」という用語は、細胞のより大きな混合物（例えばＰＢＭＣ）中の細胞型を陽性選択するために使用され得る任意の物理的方法を指す。物理的選択方法の非限定的な例は、磁性ビーズによるソーティングである。
本明細書で使用される場合、「配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）」という用語は、「配列番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ Ｎｏ）」という用語と同義である。
本明細書で使用される場合、「低分子ＲＮＡ」とは、概して約２００ヌクレオチドまたはそれ未満よりも短い長さであり、サイレンシングまたは干渉機能を有する非コードＲＮＡを指す。他の実施形態では、低分子ＲＮＡは、約１７５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１００ヌクレオチドもしくはそれ未満、または約７５ヌクレオチドもしくはそれ未満の長さである。このようなＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む。本開示の「低分子ＲＮＡ」は、標的遺伝子の遺伝子発現を、例えば標的遺伝子のｍＲＮＡの破壊をもたらす経路によって阻害またはノックダウンすることができなければならない。
本明細書で使用される場合、「刺激剤」という用語は、免疫応答を刺激することができるあらゆる外因性因子を指し、限定されるものではないが、ワクチン、ＨＩＶワクチン、およびＨＩＶまたはＨＩＶ関連ペプチドを含む。刺激剤は、好ましくは、Ｔ細胞応答を刺激することができる。
本明細書で使用される場合、「被験体」という用語は、ヒト患者を含むが、他の哺乳動物も含む。「被験体」、「個体」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用される場合がある。
「Ｔａｔ」という用語は、ＨＩＶ ｔａｔ遺伝子およびその遺伝子産物、ならびにそれらのバリアントを指す。
「治療有効量」という用語は、所与の病気、傷害、疾患、または状態を患う患者に見られる合併症の症状、進行、または発症を処置または防止するために十分な、好適な組成物および好適な剤形における本発明の活性剤の分量を指す。治療有効量は、患者の状態またはその重症度、および処置される被験体の年齢、体重などの状態に応じて異なる。治療有効量は、例えば、投与経路、被験体の状態、ならびに当業者に理解される他の要素を含む、いくつかの要素のうちのいずれかに応じて異なり得る。
本明細書で使用される場合、「治療用ベクター」という用語は、ＡＧＴ１０３ベクターなどのレンチウイルスベクターと同義である。
「処置」または「処置すること」という用語は、概して、処置されている被験体の自然経過を変更することを試みる介入を指し、予防のために行われてもよいし、または臨床病理過程中に行われてもよい。望ましい効果としては、疾患の発症または再発を防止すること、症状を緩和すること、疾患の何らかの直接的もしくは間接的な病理学的帰結を抑制、減少、または阻害すること、病状を回復または軽減させること、および寛解または改善された予後を引き起こすことが挙げられるが、これらに限定されない。
「ワクチン」という用語は、「治療用ワクチン」という用語と交換可能に使用され、個体において免疫応答を誘発することができる外因性因子を指し、限定されるものではないが、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質（ｖｉｒａｌｌｙ ｖｅｃｔｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、細菌ベクター化タンパク質（ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ ｖｅｃｔｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ペプチドもしくはペプチド断片、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。
「Ｖｉｆ」という用語は、ＨＩＶ ｖｉｆ遺伝子およびその遺伝子産物、ならびにそれらのバリアントを指す。
本開示の諸態様の説明
本明細書で詳述されるように、一態様では、ＨＩＶに感染した細胞を処置する方法が提供される。本方法は、概して、ｅｘ ｖｉｖｏで行われる、ＨＩＶに感染した被験体から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を治療有効量の刺激剤と接触させるステップと、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系をＰＢＭＣにｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップと、そのような形質導入を達成するために十分な期間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣを培養するステップとを含む。諸実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣは約１～約３５日間培養される。諸実施形態では、本方法は、形質導入されたＰＢＭＣを被験体に注入するステップをさらに含む。諸実施形態では、被験体はヒトである。諸実施形態では、刺激剤は、ペプチドまたはペプチドの混合物であり、また諸実施形態では、ｇａｇペプチドを含む。さらなる実施形態では、刺激剤はワクチンを含む。諸実施形態では、ワクチンはＨＩＶワクチンであり、さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントである。諸実施形態では、ウイルス送達系はレンチウイルス粒子を含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む。諸実施形態では、ＨＩＶ ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのうちの少なくとも１つを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含む。
別の態様では、ＨＩＶ＋の個体から末梢血を得るステップと；血液を分画してＰＢＭＣ集団を得るステップと；ＰＢＭＣ集団を精製された抗原提示細胞またはＨＩＶの成分を代表するペプチドもしくはタンパク質と接触させるステップと；接触させたＰＢＭＣ集団を約１～約１２日間培養して抗原特異的集団を拡大増殖させるステップと；ペプチド刺激に応答する細胞を陽性選択して、濃縮された細胞画分を生成するステップと；本明細書で詳述されるウイルス送達系を濃縮された細胞画分にｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップと、適度な形質導入を確実にするために十分な期間にわたって、形質導入された細胞の画分を培養するステップとを含む方法が開示される。
諸実施形態では、ＰＢＭＣ集団をさらに精製して、ＰＢＭＣの精製画分を生成する。諸実施形態では、ＰＢＭＣのさらに精製した画分を、ＨＩＶの成分を代表するペプチドまたはタンパク質と接触させる。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは配列番号１を含む。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高いパーセント同一性、または配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２または配列番号３を含む。
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有する配列を含む。諸実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３１を含む。
別の態様では、被験体においてＨＩＶ感染を処置するための細胞産物を製造する方法が開示される。本方法は、概して、血中白血球を得るステップと、被験体から白血球を取り出すステップと、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＰＢＭＣの規定の画分を精製するステップとを含む。本方法は、ＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分を治療有効量の刺激剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させるステップと；刺激剤への応答に基づく陽性選択によって抗原特異的Ｔ細胞の割合を増やすステップと；少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系をＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分にｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップと；改変細胞集団の形質導入および成長を達成するために十分な期間にわたって、形質導入されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分を培養するステップとをさらに含む。本方法は、例えば、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞についてＰＢＭＣを濃縮すること、またはサイトカイン発現に基づいて抗原特異的細胞を選択すること、または細胞の治療用画分を濃縮するための選択方法の組み合わせによる、ＰＢＭＣのさらなる濃縮をさらに含んでよい。諸実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分は、約１～約３５日間培養される。本方法は、形質導入されたＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの精製画分を被験体に注入するステップをさらに伴い得る。被験体はヒトであり得る。第１の刺激剤のうちの少なくとも１つは、ペプチドまたはペプチドの混合物を含んでよく、ＨＩＶゲノムによりコードされるタンパク質のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多くを代表してよい。諸実施形態では、第１の刺激剤のうちの少なくとも１つは、ｇａｇペプチドを含む。第１の刺激剤のうちの少なくとも１つは、ワクチンを含んでもよい。諸実施形態では、ワクチンはＨＩＶワクチンであり、さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントである。諸実施形態では、第１の刺激剤は、ｇａｇペプチドの混合物である。
諸実施形態では、ウイルス送達系はレンチウイルス粒子を含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む。ＨＩＶ ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含み得る。少なくとも１つの遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、またはそれらのクラスターを含み得る。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、合成マイクロＲＮＡクラスターを含む。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１を含む。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性、または配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２または配列番号３を含む。
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有する配列を含む。諸実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３１を含む。
別の態様では、レンチウイルスベクターが開示される。このレンチウイルスベクターは、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントを含み、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む。別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む、レンチウイルスベクターが開示される。ＨＩＶ ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含み得る。少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含み得る。少なくとも１つのコードされた遺伝子エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含み得る。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。諸実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号１を含む。
別の態様では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高いパーセント同一性、または配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高いパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝子エレメントは、配列番号２または配列番号３を含む。
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
配列番号３１と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高いパーセント同一性を有する配列を含む。諸実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、配列番号３１を含む。
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が提供される。この系は、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターと；好ましくは細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるための少なくとも１つのエンベローププラスミドと；目的の遺伝子、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子のいずれかを発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドとを含み、レンチウイルスベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞によって産生され、このレンチウイルス粒子は、目的の標的配列の調整、例えばケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生の阻害、またはＨＩＶ ＲＮＡ配列のターゲティングが可能である。
別の態様では、細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、好ましくは細胞に感染するように最適化された少なくとも１つのエンベロープタンパク質と、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターとを含む。エンベロープタンパク質は、Ｔ細胞に感染するように最適化されていてよい。諸実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染するように最適化されている。
別の態様では、改変細胞が開示される。諸実施形態では、改変細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。諸実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、本明細書に記載されるレンチウイルス粒子に感染している。諸実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、刺激剤による過去の免疫化に基づいてＨＩＶ抗原を認識するように選択されたものである。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識されるＨＩＶ抗原は、ｇａｇ抗原を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、レンチウイルス粒子に感染した後に低下したレベルのＣＣＲ５を発現する。
別の態様では、治療処置レジメンのための被験体を選択する方法が開示される。本方法は、概して、有効量の第１の刺激剤で被験体を免疫化するステップと；被験体から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製し、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連付けられる第１の定量化可能な測定値を決定するステップと；ＰＢＭＣを治療有効量の第２の刺激剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させ、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連付けられる第２の測定値を決定するステップとを含み、ここで、第２の定量化可能な測定値が第１の定量化可能な測定値と異なる（例えば、より高い）場合、被験体が処置レジメンのために選択される。少なくとも１つの因子は、Ｔ細胞の増殖またはＩＦＮガンマ産生であり得る。
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
一般的に「ＨＩＶ」とも呼ばれるヒト免疫不全ウイルスは、ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレトロウイルスである。ＡＩＤＳとは、免疫系の進行性不全が、生命を脅かす日和見感染およびがんを蔓延させる状態である。処置しなければ、ＨＩＶ感染後の平均生存期間は、ＨＩＶサブタイプおよび宿主集団の遺伝的特質に応じて９～１１年と推定される。ＨＩＶによる感染は、血液、精液、膣液、尿道球腺液（ｐｒｅ－ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、唾液、涙、リンパ液もしくは脳脊髄液、または母乳を含むがこれらに限定されない体液の移入、あるいは汚染された血液または組織産物の使用によって起こる。ＨＩＶは、感染した個体において遊離ウイルス粒子として存在する場合もあれば、感染した免疫細胞内に存在する場合もある。
ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞などのヒト免疫系に不可欠な細胞に感染するが、向性はＨＩＶサブタイプ間で異なり得る。ＨＩＶ感染に対して特に感受性であり得る免疫細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＩＶ感染は、感染していないバイスタンダー細胞のアポトーシス、感染細胞の直接的なウイルスによる殺傷、および感染細胞を認識するＣＤ８細胞傷害性リンパ球による感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の殺傷を含むがこれらに限定されないいくつかの機構により、低レベルのＣＤ４＋Ｔ細胞をもたらす。ＣＤ４＋Ｔ細胞数が臨界レベル未満に低下すると、細胞媒介性免疫が失われ、日和見感染およびがんに対して身体が、次第により感受性になる。
ＨＩＶは構造的に多くの他のレトロウイルスと異なる。ＲＮＡゲノムは、少なくとも７つの構造的目印（ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳ）、および１９種のタンパク質をコードする少なくとも９つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ならびに場合によってはｔａｔ、ｅｎｖおよびｒｅｖの融合物である１０番目のｔｅｖ）からなる。これらの遺伝子のうちの３つ、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖは、新しいウイルス粒子のための構造タンパク質を作るのに必要な情報を含有する。
ＨＩＶは主にＣＤ４ Ｔ細胞において複製し、細胞の破壊または調節不全を引き起こして宿主免疫を低下させる。ＨＩＶは、組み込まれたプロウイルスとして感染を確立し、特定の細胞におけるウイルス発現がこの細胞に影響する細胞病理または宿主免疫系による検出のレベル未満に減少する潜伏状態に入る場合があるため、ＨＩＶは処置が困難であり、長期間の抗レトロウイルス薬併用療法（ｃＡＲＴ）の後でさえも根絶されていない。ほとんどの場合、ｃＡＲＴによって生存が延長され得るとはいえ、ＨＩＶ感染は致命的疾患を引き起こす。
ＨＩＶとの闘いの主な目標は、疾患を治癒するための戦略を展開することである。長期のｃＡＲＴはこの目標を遂げていないため、研究者らは代替的手技に目を向けている。治療的免疫化（感染が起こった後のワクチンの使用）により宿主免疫を改善しようとする初期の取り組みによる影響は、僅かまたは皆無であった。同様に、処置強化による影響は、中程度または皆無であった。
遺伝子療法の使用により多少の進歩があったが、前向きな結果は散発的であり、宿主細胞へのウイルスの侵入において決定的な役割を果たす、ＣＣＲ５をコードする遺伝子の一方または両方の対立遺伝子に欠損を有する稀なヒトの間でしか見出されていない。しかしながら、多くの研究者は、遺伝子療法がＨＩＶの治癒をいずれ達成する見込みが最も高いと楽観している。
本明細書に開示されるように、本発明の方法および組成物は、すべてのＨＩＶの身体からの完全な根絶を含む場合も含まない場合もある機能的治癒を達成することができる。上記に言及したように、機能的治癒は、ｃＡＲＴを過去に必要としたＨＩＶ＋の個体が、ｃＡＲＴをより低い用量もしくは断続的な用量で使用した場合に、ウイルス複製が低いかもしくは検出不可能な状態で生存し得るか、またはｃＡＲＴを完全に中止できる可能性があるような状況または状態として定義される。本明細書で使用される場合、機能的治癒は、低レベルのウイルス複製を維持し、疾患進行を減速または終結させるために補助療法が未だ必要である可能性があり得る。機能的治癒の起こり得る転帰は、再発の可能性のすべてを防止するような、ＨＩＶの最終的な根絶である。
機能的治癒の達成における主な障害は、ＨＩＶ自体の基礎生物学にある。ウイルス感染は、ほぼすべての免疫機能に重要なＣＤ４ Ｔ細胞を欠失させる。最も重要なことには、ＨＩＶ感染およびＣＤ４ Ｔ細胞の枯渇は、個々の細胞の活性化を必要とする。活性化は、再編成されたＴ細胞受容体を使用して病原体または他の分子を認識する、個々のＣＤ４ Ｔ細胞クローンの特異的な機構である。
ＨＩＶの場合、感染により、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の集団が活性化されて感染し、結果として、ウイルスに対してさほど特異的でない他のＴ細胞より先に枯渇するため、ウイルスに対する免疫系の防御が効果的に損なわれる。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の応答能は長期ｃＡＲＴ中に復元されるが、ｃＡＲＴが中断されると、ウイルス感染のリバウンドによってこのプロセスが繰り返され、ウイルス特異的細胞が再度欠失させ、疾患進行の時間軸が元に戻る。
明らかに、機能的治癒は、ｃＡＲＴが中断されたら宿主の自然免疫がＨＩＶに対抗してこれを制御できるよう、十分なＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞が保護されている場合にのみ可能である。一実施形態では、本発明は、遺伝子療法の有効性を改善してＨＩＶ疾患の機能的治癒をもたらすための方法および組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＨＩＶに対する宿主免疫を増強して機能的治癒をもたらすための方法および組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、患者においてＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を濃縮して機能的治癒を達成するための方法および組成物を提供する。
本発明の一実施形態では、処置は、被験体のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、または約１０００％濃縮する。
遺伝子療法
ウイルスベクターは、疾患を治療または防止する目的で遺伝子構築物を宿主細胞に送達するために使用される。
遺伝子構築物は、既存の欠損を補正または補完する機能性遺伝子または遺伝子の一部分、調節タンパク質をコードするＤＮＡ配列、アンチセンス、短鎖相同ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡなどを含む調節ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、および病状を変更するのに重要な細胞因子について競合するようにデザインされたＲＮＡまたはタンパク質のいずれかをコードするデコイ配列を含み得るが、これらに限定されない。遺伝子療法は、これらの治療用遺伝子構築物を標的細胞に送達して、特定の疾患の処置または緩和をもたらすことを伴う。
ＨＩＶ疾患の処置において遺伝子療法を利用する複数の取り組みが進行中であるが、これまでの結果は不十分である。ＣＣＲ５遺伝子（ＣＣＲ５デルタ３２として公知の対立遺伝子）の自発的な欠失を有する稀なＨＩＶ患者においては、少数の処置成功例が得られた。
ＣＣＲ５の全体的な発現を低下させ、かつ／またはＨＩＶ複製の低下に役立てるため、レンチウイルスにより送達されるヌクレアーゼまたは遺伝子欠失／改変の他の機構を使用することができる。少なくとも１つの研究は、ＣＣＲ５デルタ３２の遺伝的バックグラウンドを有する患者にレンチウイルスが投与されたとき、疾患の処置が成功したと報告している。しかしながら、これは唯一の成功例であり、ＣＣＲ５デルタ３２の遺伝子型を有しない多くの他の患者は処置に成功していない。結果として、個々のウイルスベクター構築物の性能、および機能的なＨＩＶの治癒を達成するための戦略を通じたベクターの使用の改善の両方の点から、ＨＩＶに対するウイルス遺伝子療法の性能を改善させる実質的な必要性が存在する。
例えば、一部の既存の療法は、細胞をＨＩＶ感染に耐性にする試みにおいて、ＣＣＲ５の一部分を欠失させるジンクフィンガーヌクレアーゼに依拠する。しかしながら、最適な処置の後でさえ、Ｔ細胞の３０％しかヌクレアーゼによって改変されておらず、改変されたもののうち、ＨＩＶ感染を防止するように改変されていたのは、ＣＤ４ Ｔ細胞集団全体の１０％のみであった。対照的に、開示されている方法では、実質的にすべての細胞が、ＨＩＶ感染を可能にするために必要なレベル未満にＣＣＲ５発現が低減しているレンチウイルス導入遺伝子を有することになる。
開示されている方法の目的では、遺伝子療法は、親和性増強Ｔ細胞受容体、ＣＤ４ Ｔ細胞上（または代替的にはＣＤ８ Ｔ細胞上）のキメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質に起因する細胞死を回避するためのシグナル伝達経路の改変、ＴＲＥＸ、ＳＡＭＨＤ１、ＭｘＡまたはＭｘＢタンパク質、ＡＰＯＢＥＣ複合体、ＴＲＩＭ５アルファ複合体、テザリン（ＢＳＴ２）、および哺乳動物細胞においてＨＩＶ複製を低減させることができると特定された同様のタンパク質を含むＨＩＶ制限エレメントの発現増加を含み得るが、これらに限定されない。
免疫療法
歴史的に、ワクチンは、天然痘、ポリオ、麻疹、および黄熱病をはじめとする致命的な感染性疾患に対する対抗手段の主力であった。残念ながら、現在認可されているＨＩＶ用ワクチンはない。ＨＩＶウイルスは、免疫系から逃れる独特の方法を有し、ヒトの身体は、これに対して有効な免疫応答を確立することができないと思われる。結果として、科学者らは、ＨＩＶからの保護を提供するために何が必要かを明確に把握していない。
しかしながら、免疫療法は、従来のワクチンのアプローチによってこれまで対処されなかった解決策を提供し得る。生物学的療法とも呼ばれる免疫療法は、感染またはがんと闘うために身体の自然防御能を後押しするようにデザインされた処置の一種である。免疫療法は、免疫系機能の改善、ターゲティング、または復旧のために、身体または実験室のいずれかで作られる材料を使用する。
開示される本発明の一部の実施形態では、宿主の抗ＨＩＶ免疫を増加させる目的でＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞集団を濃縮するために、免疫療法のアプローチが使用され得る。開示される本発明の一部の実施形態では、宿主の抗ＨＩＶ免疫を増加させる目的で宿主の免疫細胞に形質導入するために、組み込み型または非組み込み型のレンチウイルスベクターが使用され得る。本発明のさらに別の実施形態では、宿主の免疫応答を増加させるために好適なビヒクルおよび／または生物学的もしくは化学的アジュバントと組み合わせた、死滅粒子、ウイルス様粒子、ＨＩＶペプチドまたはペプチド断片、組換えウイルスベクター、組換え細菌ベクター、精製されたサブユニットまたはプラスミドＤＮＡを含むがこれらに限定されない、ＨＩＶタンパク質を含むワクチンが、ウイルス特異的Ｔ細胞または抗体の集団を濃縮するために使用される場合があり、これらの方法は、レンチウイルスまたは他のウイルスベクターを使用したＨＩＶにターゲティングされた遺伝子療法の使用により、さらに増強することができる。
方法
一態様では、本開示は、ウイルスベクターを使用してＨＩＶ疾患の機能的治癒を達成するための方法を提供する。本方法は、概して、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を増やすための免疫療法と、その後に必要に応じてＨＩＶならびにＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の阻害剤を送達するためのレンチウイルス形質導入とを含む。
一実施形態では、本方法は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を増やすための第１の刺激事象を含む。第１の刺激は、ワクチンを含むがこれに限定されない、患者のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮するために好適な任意の薬剤のうちの１つまたは複数の投与を含み得る。
治療用ワクチンは、処置が行われている地理的領域の優勢なウイルス型を代表するタンパク質配列を有する１つまたは複数のＨＩＶタンパク質を含み得る。治療用ワクチンは、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌ベクター化タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカインおよび／またはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、ならびに免疫化の方法を含む。ワクチン接種は、当技術分野で公知の標準的方法に従って施してよく、ＨＩＶ患者は、免疫化とその後のレンチウイルス形質導入を含むｅｘ ｖｉｖｏでのリンパ球の培養との間の中間期（ｉｎｔｅｒｖａｌ）中に抗レトロウイルス薬療法を継続してよい。
一部の実施形態では、ＨＩＶ＋患者をＨＩＶワクチンで免疫化すると、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度が、約２、約２５、約２５０、約５００、約７５０、約１０００、約１２５０、または約１５００倍（またはこれらの値の間の任意の量）だけ増加する。ワクチンは、開示されているレンチウイルスベクター、他のウイルスベクター、またはワクチン送達系として使用される他の細菌ベクターを含む、いずれの臨床的に利用されるまたは実験用のＨＩＶワクチンであってもよい。別の実施形態では、ベクターは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードして、より高力価の中和抗体を誘導する。別の実施形態では、ベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｔｅｖ、ならびにＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳを含むがこれらに限定されない、ＨＩＶに関するペプチドまたはペプチド断片をコードする。代替的に、開示されている方法で使用されるＨＩＶワクチンは、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌ベクター化タンパク質、ペプチドもしくはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはサイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的もしくは化学的アジュバントを含み得る。
一実施形態では、本方法は、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌ベクター化タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、ならびに再刺激の方法を使用した、治療用ワクチン接種により過去に免疫化された個人または患者由来のＣＤ４ Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの再刺激を含む。ｅｘ ｖｉｖｏでの再刺激は、ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫化に使用されたものと同じワクチンもしくは免疫刺激性の化合物を使用して行われてもよく、またはｉｎ ｖｉｖｏでの免疫化に使用されたものとは異なるワクチンもしくは免疫刺激性の化合物を使用して行われてもよい。さらに一部の実施形態では、患者は、この個体がＨＩＶタンパク質に対して十分に高い抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答を有していれば、治療用ワクチン接種またはＣＤ４ Ｔ細胞の再刺激を事前に必要としない。これらの実施形態では、そのような患者は、ウイルス抗原、ワクチン、またはペプチドでＣＤ４ Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて刺激した後、刺激への応答に基づいてＨＩＶ特異的Ｔ細胞を選択することのみを必要とする場合がある。濃縮細胞調製物は、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれよりも多くのＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含んでよく、ＨＩＶ媒介性枯渇から保護することができる遺伝子のレンチウイルス形質導入のために使用される。ポリクローナルマイトジェンとサイトカインによる刺激は、濃縮された形質導入Ｔ細胞の数を、元の患者に注入し戻すのに適切なレベルに達するまで増加させる。
諸実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が白血球除去によって得られ、ｅｘ ｖｉｖｏで処置されて、約１×１０９個のＣＤ４ Ｔ細胞が得られ、このうち約０．１％、約１％、約５％、または約１０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％が、抗原応答という点でＨＩＶ特異的であり、また、開示されているレンチウイルスベクターにより送達された治療用導入遺伝子を有することからＨＩＶ耐性でもある。代替的には、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、または約１×１０１２個のＣＤ４ Ｔ細胞が再刺激のために単離され得る。ｅｘ ｖｉｖｏでの再刺激のためには、任意の好適な量のＣＤ４ Ｔ細胞が単離される。
単離されたＣＤ４ Ｔ細胞は、過去の治療用ワクチン接種に存在した抗原を含み得るＨＩＶワクチン抗原による再刺激の間中、適切な培地において培養され得る。長期のｅｘ ｖｉｖｏ培養中のウイルスの再出現を防止するため、逆転写酵素、プロテアーゼ、またはインテグラーゼの阻害剤を含む抗レトロウイルス治療薬を添加してもよい。ＣＤ４ Ｔ細胞の再刺激は、培養物中のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を増やすために使用される。同じ手順は、精製により得られた末梢血単核細胞を含むより少ない血液量を使用してＨＩＶ特異的Ｔ細胞を特定し、この亜集団の頻度を測定する、分析目的で使用することもできる。
ＰＢＭＣ画分は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞について、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化のために過去に使用されたワクチンの成分と一致するかまたはこれを補完するＨＩＶタンパク質とこれらの細胞を接触させることによって濃縮することができる。ｅｘ ｖｉｖｏでの再刺激は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の相対的な頻度を約２、約５、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約２００倍増加させ得る。さらなる濃縮は、ＨＩＶ抗原、ワクチン、またはペプチドに応答する細胞の陽性選択によって得られる。陽性選択は、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製品番号１３０－０２８－７０１、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１）または、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｐｒｏｄｉｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製品番号２００－０７５－３０１、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１）を含め、二重特異性試薬により捕捉され、磁性カラムでの陽性選択ができるように磁性ビーズ抗体で標識された、サイトカイン（インターフェロンガンマまたは腫瘍壊死因子アルファを含むがこれらに限定されない）の発現に基づいた生存細胞の選択に適合する、同様の手動もしくは自動システムを用いて達成される。濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＭＨＣクラスＩＩ、および当技術分野で公知の他のものを含む、活性化Ｔ細胞で優先的に発現される細胞表面マーカーを検出することができる抗体で、刺激した細胞を標識することによっても達成され得る。標識された細胞の精製は、蛍光活性化細胞ソーティング、磁性ビーズソーティング、または生存細胞を表現型の特徴に基づいて精製することができる他の物理的方法によるものであってよい。
本方法は、ＣＤ４ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの治療的免疫化およびｅｘ ｖｉｖｏでの再刺激を、ｅｘ ｖｉｖｏでのレンチウイルス形質導入および培養と組み合わせるステップをさらに含む。
よって、一実施形態では、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞が濃縮されている再刺激したＰＢＭＣまたはＰＢＭＣの画分は、上述のように陽性選択され、１、２、３、４、５、または最大１２、２０、もしくは３０日間培養した後、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ Ｔ細胞試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製品番号１７０－０７６－１５６、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１）、または他の植物もしくは真菌ベースのアグルチニン、または、細胞表面ＣＤ３およびＣＤ２８を認識してこれらの分子を架橋し、ポリクローナルＴ細胞活性化を引き起こすことができる他の試薬などの、ポリクローナルマイトジェンを用いて、再度活性化させることができる。ポリクローナル刺激後、細胞は、治療用抗ＨＩＶレンチウイルスまたは他のベクターで形質導入され、そのような形質導入のために十分な期間、例えば約１～約２１日間、最大約３５日間などにわたって培養下に維持される。代替的に、これらの細胞は、約１～約１８日間、約１～約１５日間、約１～約１２日間、約１～約９日間、または約３～約７日間にわたって培養されてもよい。よって、形質導入された細胞は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、または約３５日間にわたって培養され得る。ポリクローナルマイトジェンを用いた活性化は、細胞産物製造プロセスに含まれる場合もあれば、含まれない場合もある。
さらなる実施形態では、形質導入された細胞が十分な期間にわたって培養されたら、形質導入されたＣＤ４ Ｔ細胞は、元の患者に注入し戻される。注入は、当技術分野で公知の様々なデバイスおよび方法を使用して行うことができる。一部の実施形態では、注入には、再生着の効率を上昇させるためにシクロホスファミドまたは同様の化合物による前処置が付随する場合がある。
一部の実施形態では、処置プロセスの間中継続された被験体の抗レトロウイルス薬療法レジメンに、ＣＣＲ５にターゲティングされた療法が付加され得る。ＣＣＲ５にターゲティングされた療法の例としては、マラビロク（ＣＣＲ５アンタゴニスト）またはラパマイシン（ＣＣＲ５を低下させる免疫抑制剤）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、抗レトロウイルス薬療法が停止される場合があり、被験体がウイルスのリバウンドについて試験される場合がある。リバウンドが起こらなければ、アジュバント療法を除去してもよく、被験体をウイルスのリバウンドについて再度試験することができる。
様々な実施形態では、ｃＡＲＴもしくはＨＡＡＲＴを含む抗レトロウイルス薬療法を低減した場合またはこれを使用しない場合、かつアジュバント療法を低減した場合またはこれを使用しない場合に、約２６週間にわたってウイルス抑制が持続すれば、ＨＩＶの機能的治癒とみなすことができる。機能的治癒の他の定義は本明細書に記載されている。
開示されている方法で使用されるレンチウイルスベクターおよび他のベクターは、目的の、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、もしくは少なくとも５種の遺伝子、または少なくとも６種の遺伝子、または少なくとも７種の遺伝子、または少なくとも８種の遺伝子、または少なくとも９種の遺伝子、または少なくとも１０種の遺伝子、または少なくとも１１種の遺伝子、または少なくとも１２種の遺伝子をコードし得る。ＨＩＶにターゲティングされた遺伝子療法の多用途性および治療可能性を考慮すると、本発明のウイルスベクターは、（ｉ）感染性疾患に関連する抗原または感染性病原体によって産生される毒素に対する抗体、（ｉｉ）免疫細胞の成長または機能に必要とされ、かつＨＩＶおよび他の慢性または急性のヒトウイルスまたは細菌病原体において遭遇される免疫調節不全に対する治療薬であり得る、インターロイキンを含むサイトカイン、（ｉｉｉ）ＣＤ８抑制因子を含む、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＩＶの成長を抑制する因子、（ｉｖ）ケモカイン受容体ＣＣＲ５の変異もしくは欠失、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の変異もしくは欠失、またはケモカイン受容体ＣＸＣＲ５の変異もしくは欠失、（ｖ）ＨＩＶに関連する特定の受容体もしくはペプチドまたはＨＩＶに関連する宿主タンパク質に対するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、（ｖｉ）ＨＩＶに関連する特定の受容体もしくはペプチドまたはＨＩＶに関連する宿主タンパク質に対する低分子干渉ＲＮＡ、あるいは（ｖｉｉ）ＨＩＶまたはＡＩＤＳを処置するために使用され得る多様な他の治療上有用な配列を含むがこれらに限定されない、遺伝子または核酸配列をコードし得る。
開示されている方法で使用され得るＨＩＶにターゲティングされた遺伝子療法のさらなる例としては、親和性増強Ｔ細胞受容体、ＣＤ４ Ｔ細胞上（または代替的にはＣＤ８ Ｔ細胞上）のキメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質に起因する細胞死を回避するためのシグナル伝達経路の改変、ＴＲＥＸ、ＳＡＭＨＤ１、ＭｘＡまたはＭｘＢタンパク質、ＡＰＯＢＥＣ複合体、ＴＲＩＭ５アルファ複合体、テザリン（ＢＳＴ２）、および哺乳動物細胞においてＨＩＶ複製を低減させることができると特定された同様のタンパク質を含むＨＩＶ制限エレメントの発現増加が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、患者は、本発明の方法に従う処置を受けると同時にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けていてもよい。他の実施形態では、患者は、本発明の方法に従って処置される前または処置された後にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けてもよい。一部の実施形態では、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴは、本発明の方法に従う処置の間中維持され、患者は、血液中のＨＩＶウイルス負荷および血液中のレンチウイルスを形質導入したＣＤ４ Ｔ細胞の頻度についてモニタリングされ得る。好ましくは、本発明の方法に従って処置される前にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けた患者は、本発明の方法に従う処置の後にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを中止または低減することができる。
有効度の目的上、形質導入されたＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度は、遺伝子療法の効果の新規の代替マーカーであり、本明細書においてより詳細に論じられるように決定することができる。
組成物
様々な態様では、本開示は、感受性細胞へのＨＩＶの侵入を阻害する遺伝子構築物を送達することができるレンチウイルスベクターを提供する。例として、本明細書による１つの作用機構は、感受性細胞へのウイルス進入速度を低減させるため、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ケモカイン受容体に対するｍＲＮＡレベルを低下させることである。
代替的に、開示されているレンチウイルスベクターは、入ってくるＨＩＶゲノムＲＮＡの安定性を低減させることによってＨＩＶ感染細胞の形成を阻害することができる。また、さらに別の実施形態では、開示されているレンチウイルスベクターは、潜伏感染細胞からのＨＩＶ産生を防止することができ、その作用機構は、短鎖相同ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、または他の調節ＲＮＡ種を含む阻害性ＲＮＡの作用により、ウイルスＲＮＡ配列の不安定性を引き起こすことである。
開示されている治療用レンチウイルスは概して、２種類の遺伝子カーゴのうち少なくとも１種を含む。第１に、このレンチウイルスは、感受性細胞へのＨＩＶの侵入に重要なケモカイン受容体ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡの発現を指向する遺伝子エレメントをコードし得る。第２の種類の遺伝子カーゴは、逆転写、ＲＮＡスプライシング、タンパク質を産生するＲＮＡ翻訳、または粒子を産生し感染を伝播するウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングを防止する目的で、ＨＩＶのＲＮＡ配列をターゲティングする低分子ＲＮＡ分子を発現することができる構築物を含む。例示的な構造が図３に図示されている。
図３（上パネル）に示されるように、例示的な構築物は、多数のセクションまたは成分を含み得る。例えば、一実施形態では、例示的なＬＶ構築物は、以下のセクションまたは成分を含み得る。
・ ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス末端反復配列（long terminal repeat））、
・ ５’ＬＴＲ（染色体組み込み後にベクターの複製を防止するために切り詰めることができるＨＩＶ末端反復配列の一部分）、
・ Ｐｓｉ（パッケージング中のウイルス粒子へのベクターＲＮＡゲノムの組み込みを可能にするパッケージングシグナル）、
・ ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメントを付加すると、ＲＮＡを細胞の核から細胞質に動員することによって導入遺伝子からの発現を改善することができる）、
・ ｃＰＰＴ（宿主細胞染色体への導入遺伝子の組み込みの前に第二鎖ＤＮＡ合成を促進するポリプリントラクト（poly purine tract））、
・ プロモーター（プロモーターは、組み込まれた導入遺伝子からのＲＮＡ転写を開始してマイクロＲＮＡクラスター（または構築物の他の遺伝子エレメント）を発現し、一部の実施形態では、ベクターはＥＦ－１プロモーターを使用し得る）、
・ 抗ＣＣＲ５（宿主細胞因子ＣＣＲ５のメッセンジャーＲＮＡをターゲティングして細胞表面上のその発現を低減させるマイクロＲＮＡ）、
・ 抗Ｒｅｖ／Ｔａｔ（ＨＩＶのＲｅｖコード領域とＴａｔコード領域との間の接合部におけるＨＩＶのゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡをターゲティングするマイクロＲＮＡ。本出願では、ｍｉＲＮＡ Ｔａｔと呼称されるか、または同様の説明が与えられる場合がある）、
・ 抗Ｖｉｆ（Ｖｉｆコード領域内のＨＩＶのゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡをターゲティングするマイクロＲＮＡ）、
・ ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントは、核のＲＮＡ輸送を促進するために使用され得るさらなるベクター成分である）、および
・ デルタＵ３ ３’ＬＴＲ（ベクターの安全性を改善するためにＵ３領域の一部分を欠失させた、ＨＩＶの３’末端反復配列の改変バージョン）。
上記の成分は単なる例であること、また、構築物がＨＩＶ遺伝子の発現を防止し、感染の伝播を減少させることができる限り、このような成分を再編成したり、他のエレメントと置換したり、または別様に変更したりしてよいことは、当業者には認識されよう。
本発明のベクターは、上記のいずれかまたは両方の種類の遺伝子カーゴ（すなわち、遺伝子の発現を指向する遺伝子エレメント、または翻訳もしくは転写を防止することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡなどの低分子ＲＮＡ）を含んでよく、本発明のベクターは、ＨＩＶの処置または診断の目的でさらに有用な産物をコードしてもよい。例として、一部の実施形態では、これらのベクターは、遺伝子改変細胞をｉｎ ｖｉｖｏで選択的に維持する目的でベクターまたは抗生物質耐性遺伝子を追跡することを目的として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしてもよい。
開示されているベクターに組み込まれる遺伝子エレメントの組み合わせは、特に限定されない。例えば、本明細書におけるベクターは、単一の低分子ＲＮＡ、２個の低分子ＲＮＡ、３個の低分子ＲＮＡ、４個の低分子ＲＮＡ、５個の低分子ＲＮＡ、６個の低分子ＲＮＡ、７個の低分子ＲＮＡ、８個の低分子ＲＮＡ、９個の低分子ＲＮＡ、または１０個の低分子ＲＮＡ、または１１個の低分子ＲＮＡ、または１２個の低分子ＲＮＡをコードしてよい。このようなベクターは、低分子ＲＮＡと共働して機能してＨＩＶの発現および感染を防止するように他の遺伝子エレメントをさらにコードしてもよい。
治療用レンチウイルスが、プロモーター領域、調節ＲＮＡのターゲティング、および調節ＲＮＡの種類の代わりに代替配列を使用し得ることは、当業者には理解されよう。さらに、本開示の治療用レンチウイルスは、レンチウイルス粒子をパッケージングするために使用されるプラスミドの変化を含む場合があり、これらの変化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生レベルを上昇させるために必要とされる。
レンチウイルスベクター系
本明細書の様々な態様および実施形態に従うレンチウイルスビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。様々な実施形態では、逆転写および組み込みのための、プロモーターに作動可能に連結した、レンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する１つのベクターが提供される。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。他の実施形態では、ウイルスカプシドを形成するための、プロモーターに作動可能に連結した、レンチウイルスＧａｇタンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターが提供される。諸実施形態では、このｇａｇ核酸配列は、ｐｏｌ核酸配列の少なくとも一部とは別個のベクター上にある。他の実施形態では、ｇａｇ核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌ核酸配列とは別個のベクター上にある。
本明細書のベクターには多数の改変を行ってよく、これらを使用して粒子を作り出すと、野生型復帰変異体を得る機会がさらに最小限に抑えられる。これらは、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔ欠失、およびマトリクス（ＭＡ）欠失を含むが、これらに限定されない。諸実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれる、レンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノム由来のヌクレオチドを含有しない。
粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来の核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結したエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別個のベクターが使用される。このｅｎｖベクターも、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。一実施形態では、ｅｎｖ核酸配列は、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする。
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルスに由来しないが、異なるウイルスに由来する。結果として得られる粒子は、シュードタイプ化粒子と呼ばれる。エンベロープの適切な選択により、実質的に任意の細胞に「感染」することができる。例えば、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ－Ｇ、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（ムンプスまたは麻疹）、およびオルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）のものなどの細胞内区画をターゲティングするエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができる。好ましくは使用することができる他のエンベロープとしては、ＭＬＶ－Ｅ、ＭＬＶ－Ａ、およびＧＡＬＶなどのモロニー白血病ウイルス由来のものが挙げられる。これら後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合に特に好ましい。所望の宿主細胞に応じて他のエンベロープタンパク質を選択してもよい。例えば、脳への送達には、ドーパミン受容体などの特定の受容体のターゲティングを使用することができる。別の標的は血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルスエンベロープを使用してターゲティングすることができる。例えば、転写後修飾によってＧＰになるエボラのＧＰ、およびＧＰ２糖タンパク質である。別の実施形態では、シュードタイプ化エンベロープ（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）を有する異なるレンチウイルスカプシドを使用することができる。ＳＨＩＶシュードタイプ化ベクターは、サルなどの動物モデルにおいて容易に使用することができる。
本明細書に提供されるレンチウイルスベクター系は、典型的には、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｒｅｖ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子は、それぞれが個々のプラスミドで提供される場合もあれば、１つまたは複数の遺伝子が同じプラスミドで一緒に提供される場合もある。一実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子は、同じプラスミドで提供される（例えば図４）。別の実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子が第１のプラスミドで提供され、ｒｅｖ遺伝子が第２のプラスミドで提供される（例えば図５）。したがって、３ベクター系（例えば図４および６）および４ベクター系（例えば図５）はいずれも、本明細書に記載されるレンチウイルスを産生するために使用され得る。諸実施形態では、治療用ベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞、例えばパッケージング細胞株にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞株である。治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、最終的にレンチウイルス粒子が産生される。
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が開示される。この系は、本明細書に記載されるレンチウイルスベクターと；細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるためのエンベローププラスミドと；ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドとを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子がパッケージング細胞株によって産生され、このレンチウイルス粒子は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生の阻害、またはＨＩＶ ＲＮＡ配列のターゲティングが可能である。
別の態様では、本明細書では治療用ベクターとも呼ばれるレンチウイルスベクターは、次のエレメント：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号３４～３５）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号３６）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号３７）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号３８）、ＥＦ－１αプロモーター（配列番号４）、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）、ｍｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）、ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２または８０）、およびΔＵ３ ３’ＬＴＲ（配列番号３９）を含む。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化を使用して、本明細書で参照される配列を改変することができる。
別の態様では、ヘルパープラスミドは、次のエレメント：ＣＡＧプロモーター（配列番号４１）、ＨＩＶ成分ｇａｇ（配列番号４３）、ＨＩＶ成分ｐｏｌ（配列番号４４）、ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号４５）、ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号４６）、およびＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号４７）を含む。別の態様では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させるための第１のヘルパープラスミドと、ｒｅｖ遺伝子を発現させるための第２の別個のプラスミドとを含むように、ヘルパープラスミドを改変してよい。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化を使用して、本明細書で参照される配列を改変することができる。
別の態様では、エンベローププラスミドは、次のエレメント：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号６０）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）（配列番号６２）を含む。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列変化を使用して、本明細書で参照される配列を改変することができる。
様々な態様では、レンチウイルスパッケージングに使用されるプラスミドは、ベクターの機能を損失することなく、様々なエレメントの置換、付加、除去、または変異によって改変される。例えば、限定されるものではないが、次のエレメントは、パッケージング系を構成するプラスミドにおいて同様のエレメントに取って代わることができる：伸長因子１（ＥＦ－１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターは、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターに取って代わることができる。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡに取って代わることができる。ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築されていてよい。ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質は、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、インフルエンザＡ家禽ペストウイルス（ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅ ｖｉｒｕｓ）（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）の膜糖タンパク質で置換され得る。
様々なレンチウイルスパッケージング系を商業的に取得することができ（例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤのＬｅｎｔｉ－ｖｐａｋパッケージングキット）、本明細書に記載されるようにデザインすることもできる。さらに、レンチウイルス粒子の産生効率を含め、任意の数の関連要素を改善するためにレンチウイルスパッケージング系の諸態様を置換または改変することは、当業者の技能の範囲内である。
バイオアッセイ
様々な態様では、本発明は、機能的治癒の達成するためのＨＩＶ処置の成功を決定するためのバイオアッセイを含む。これらのアッセイは、患者における形質導入されたＨＩＶ特異的なＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を測定することにより、開示されている免疫化および処置の方法の有効度を測定するための方法を提供する。ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞が認識可能である。なぜなら、とりわけ、これらが増殖し、細胞表面マーカーの組成を変更し、リン酸化を含むシグナル伝達経路を誘導し、かつ／あるいは、サイトカイン、ケモカイン、カスパーゼ、リン酸化シグナル伝達分子、または他の細胞質および／もしくは核成分であり得る特定のマーカータンパク質を発現するからである。特定の応答するＣＤ４ Ｔ細胞は、例えば、フローサイトメトリーソーティング、磁性ビーズ分離、または抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の単離の他の認識されている方法を使用したＨＩＶ特異的細胞のソーティングを可能にする、標識されたモノクローナル抗体またはｍＲＮＡ配列の特異的なｉｎ ｓｉｔｕ増幅を使用して認識される。単離されたＣＤ４ Ｔ細胞を試験すると、組み込まれた治療用レンチウイルスを有する細胞の頻度が決定される。質量分析、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡまたは抗体染色と併せた個々の細胞のマイクロ流体分離を含む単一細胞試験法を使用して、ＨＩＶに対する応答性および組み込まれた治療用レンチウイルスの存在を確認することもできる。
よって、様々な実施形態では、本発明による処置の適用（例えば、（ａ）免疫化、（ｂ）ｅｘ ｖｉｖｏでの白血球／リンパ球の培養、（ｃ）精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌ベクター化タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクルによる再刺激、ならびに（ｄ）濃縮された形質導入Ｔ細胞の注入）の後に続いて患者をアッセイすることで、処置の有効度を決定することができる。体内の標的Ｔ細胞の閾値は、所定値における、例えば、治療用レンチウイルスからの遺伝子改変を有する約１×１０８個のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞における機能的治癒を測定するように確立してよい。代替的に、この閾値は、患者の体内で約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、または約１×１０１０個のＣＤ４ Ｔ細胞であってもよい。
治療用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞は、フローサイトメトリー、セルソーティング、ＦＡＣＳ分析、ＤＮＡクローニング、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲもしくはＱ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＳＨ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ハイスループットシーケンシング、ＲＮＡシーケンシング、オリゴヌクレオチドプライマー伸長、または当技術分野で公知の他の方法などであるがこれらに限定されない、任意の好適な方法を使用して決定することができる。
遺伝子改変を有する抗原特異的Ｔ細胞を定義するための方法は当技術分野で公知であるが、このような方法を利用し、有効度の標準的な尺度として組み込み型または非組み込み型の遺伝子療法の構築物を含むＨＩＶ特異的Ｔ細胞を特定することを組み合わせることは、本明細書において様々に記載されるように、ＨＩＶ処置の分野において新規の概念である。
用量および剤形
開示されている方法および組成物は、ＨＩＶ＋患者をその疾患の様々な段階で処置するために使用され得る。したがって、投薬レジメンは、患者の状態および投与方法に基づいて異なり得る。
様々な実施形態では、初回のｉｎ ｖｉｖｏ免疫化のためのＨＩＶ特異的ワクチンは、必要とする被験体に様々な用量で投与される。一般に、筋肉内注射により送達されるワクチンは、不活化ウイルス粒子から調製された全ウイルスタンパク質、ウイルス様粒子、または組換え系から精製されたウイルスタンパク質もしくはウイルス調製物から精製されたもののいずれかのＨＩＶタンパク質を、約１０μｇ～約３００μｇ、約２５μｇ～約２７５μｇ、約５０μｇ～約２５０μｇ、約７５μｇ～約２２５、または約１００μｇ～約２００μｇ含む。組換えウイルスベクターまたは細菌ベクターは、記載されるありとあらゆる経路によって投与されてもよい。筋肉内ワクチンは、約１μｇ～約１００μｇ、約１０μｇ～約９０μｇ、約２０μｇ～約８０μｇ、約３０μｇ～約７０μｇ、約４０μｇ～約６０μｇ、または約５０μｇの好適なアジュバント分子を含み、注射１用量あたり０．１～５ｍｌの体積の油、食塩水、緩衝液、または水に懸濁され、可溶性調製物であってもエマルジョン調製物であってもよい。一部のウイルスベクター化もしくは細菌ベクター化ワクチン、融合タンパク質、リポソーム製剤、または同様の調製物を含む、経口的、直腸、口腔、性器粘膜、または鼻腔内に送達されるワクチンは、より高い量のウイルスタンパク質およびアジュバントを含有してもよい。真皮、真皮下（ｓｕｂ－ｄｅｒｍａｌ）、または皮下のワクチンは、経口的、直腸、または鼻腔内に送達されるワクチンにより似ている量のタンパク質およびアジュバントを利用する。初回免疫化に対する応答に応じて、ワクチン接種は、同じかまたは代替の送達経路を使用して１～５回繰り返され得る。間隔は、免疫化の間で２～２４週間であり得る。ワクチン接種に対する免疫応答は、ＥＬＩＳＡまたは同様の方法論を使用して、血清、血漿、膣分泌物、直腸分泌物、唾液、または気管支肺胞洗浄液中のＨＩＶ特異的抗体を試験することによって測定される。細胞性免疫応答は、ワクチン抗原によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に続いて、細胞内のサイトカインの蓄積について染色を行った後、フローサイトメトリーまたはリンパ球増殖、リン酸化シグナル伝達タンパク質の発現、もしくは細胞表面活性化マーカーの変化を含む同様の方法によって試験される。投薬の上限は個々の患者に基づいて決定してよく、各個々の製品または製品ロットに関する毒性／安全性プロファイルに依存する。
免疫化は、１回、２回、３回、または繰り返し行ってよい。例として、ＨＩＶ免疫化のための薬剤は、必要とする被験体に、１週間に１回、１週間おきに１回、３週間ごとに１回、１か月に１回、１か月おきに、３か月ごとに、６か月ごとに、９か月ごとに、１年に１回、１８か月ごとに、２年ごとに、３６か月ごとに、または３年ごとに投与してよい。
免疫化は概して、ＣＤ４ Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの拡大増殖および濃縮前に少なくとも１回行われ、免疫化は、ｅｘ ｖｉｖｏでの白血球／リンパ球の培養／再刺激および注入後に１回、２回、３回、またはそれよりも多く行われ得る。
一実施形態では、免疫化のためのＨＩＶワクチンは、医薬組成物として投与される。一実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、臨床適用のための多様な経鼻、肺、経口、外用、または非経口剤形で製剤化される。剤形はそれぞれ、様々な崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤(thickener)、結合剤、希釈剤、例えば湿潤剤、または他の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、注射用に製剤化されてもよい。
免疫化を目的とするＨＩＶワクチン組成物は、任意の薬学的に許容される方法、例えば、鼻腔内投与、口腔投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与、非経口投与（静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、大槽内投与、腹腔内）投与、肺投与、膣内投与、局所投与、外用投与、乱切後の外用投与、粘膜投与、エアロゾルによる、または口腔もしくは経鼻スプレー製剤による投与を使用して投与することができる。
さらに、ＨＩＶワクチン組成物は、固体剤形、錠剤、丸剤、ロゼンジ、カプセル、液体分散物、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、経鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体剤形、および懸濁物など、任意の薬学的に許容される剤形に製剤化することができる。さらに、本組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。さらに、本組成物は、経皮送達系であってもよい。
別の実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、経口投与のための固体剤形で製剤化され、この固体剤形は、粉末、顆粒、カプセル、錠剤、または丸剤であり得る。さらに別の実施形態では、固体剤形は、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、ラクトース、微結晶性セルロース、またはゼラチンなどの１つまたは複数の賦形剤を含む。さらに、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出形態または改変放出形態である。改変放出剤形は、制御放出または延長放出、腸内放出などを含む。改変放出剤形に使用される賦形剤は、一般的に当業者に公知である。
さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、舌下または口腔剤形として製剤化される。このような剤形は、舌下に投与される舌下錠剤または溶液組成物、および頬と歯肉との間に配置される口腔錠剤を含む。
なおもさらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化される。このような本発明の剤形は、経鼻送達のための溶液、懸濁物、およびゲル組成物を含む。
一実施形態では、医薬組成物は、懸濁物、エマルジョン、またはシロップなど、経口投与のための液体剤形で製剤化される。他の実施形態では、液体剤形は、水および流動パラフィンなどの一般的に使用されている単純な希釈剤に加えて、保水剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、甘味料、芳香族化合物、または保存料などの様々な賦形剤を含み得る。特定の実施形態では、ＨＩＶワクチンまたはその薬学的に許容される塩を含む組成物は、小児患者への投与に好適であるように製剤化される。
一実施形態では、医薬組成物は、滅菌水溶液、懸濁物、エマルジョン、非水性溶液、または坐薬など、非経口投与のための剤形で製剤化される。他の実施形態では、非水性溶液または懸濁物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、またはオレイン酸エチルなどの注射可能なエステルを含む。坐薬の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ ６１、カカオ脂、ラウリン油、またはグリセリンゼラチンが使用され得る。
医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与時間および方式、排出速度、ならびに疾患の重症度に応じて異なり得る。
再刺激の目的では、概して、リンパ球、ＰＢＭＣ、および／またはＣＤ４ Ｔ細胞を患者から取り出し、再刺激および培養のために単離する。単離した細胞は、免疫化に使用したものと同じＨＩＶワクチンもしくは活性化剤と接触させても、または異なるＨＩＶワクチンもしくは活性化剤と接触させてもよい。一実施形態では、単離した細胞は、培養物中の約１０６個の細胞あたり約１０ｎｇ～５μｇ（または任意の他の好適な量）のＨＩＶワクチンまたは活性化剤と接触させる。より具体的には、単離した細胞は、培養物中の約１０６個の細胞あたり約５０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約３００ｎｇ、約４００ｎｇ、約５００ｎｇ、約６００ｎｇ、約７００ｎｇ、約８００ｎｇ、約９００ｎｇ、約１μｇ、約１．５μｇ、約２μｇ、約２．５μｇ、約３μｇ、約３．５μｇ、約４μｇ、約４．５μｇ、または約５μｇのＨＩＶワクチンまたは活性化剤と接触させてもよい。
活性化剤またはワクチンは、概して、各ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養で１回使用されるが、約１５～約３５日の間隔の後に繰り返されてもよい。例えば、繰り返しの投薬は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、または約３５日目に行われ得る。
濃縮され再刺激した細胞の形質導入では、例えば図４または図６に開示されているレンチウイルスベクターまたは他の公知のベクター系を細胞に形質導入してよい。形質導入される細胞は、培養物中の標的細胞あたり約１～１，０００個（または任意の他の好適な量）のウイルスゲノム（レンチウイルスベクターを含有する培養液のＲＴ－ＰＣＲアッセイにより測定）と接触させてよい。レンチウイルス形質導入は、培養物中の標的細胞あたり１～１，０００個という同じ範囲のウイルスゲノムを使用し、１～５回繰り返してよい。
細胞の濃縮
様々な実施形態では、Ｔ細胞などの細胞がＨＩＶ感染患者から得られ、培養される。培養は、マルチウェルプレートにて馴化培地（「ＣＭ」）を含む培養培地中で行われ得る。上清ｐ２４ｇａｇのレベル（「ｐ２４」）およびウイルスＲＮＡレベルが標準的手段によって評価され得る。ＣＭ培養細胞が１ｎｇ／ｍｌ未満の上清ｐ２４レベルのピークを有する患者は、さらなる抗ウイルス剤の使用ありまたはなしのＣＭにおける大規模なＴ細胞の拡大増殖に好適な患者であり得る。さらに、異なる薬物または目的の薬物の組み合わせを異なるウェルに加えてよく、試料中のウイルスレベルに対する影響を標準的手段によって評価することができる。適度なウイルス抑制をもたらす薬物の組み合わせは、治療上有用な組み合わせである。特定の被験体に関する適度なウイルス抑制を構成するものが何かを決定することは、適格な技師の能力の範囲内である。ウイルスの拡大増殖を制限することにおける目的の薬物の有効性を試験するために、抗ＣＤ３抗体などのさらなる因子を培養物に添加してウイルス産生を刺激してもよい。当技術分野で公知のＨＩＶ感染細胞試料の培養方法とは異なり、ＣＭでは２か月超の期間にわたるＴ細胞の培養が可能であり、これにより、長期の薬物有効性をアッセイする有効な系がもたらされる。
このアプローチにより、ＣＭを含む培地中の細胞の培養による、細胞集団内のＨＩＶ ＬＴＲプロモーター領域によって駆動される遺伝子発現の阻害が可能になる。ＣＭ４における培養は、転写媒介性タンパク質とＨＩＶ遺伝子発現調節エレメントとの間の１つまたは複数の相互作用を変更することにより、ＨＩＶ ＬＴＲにより駆動される遺伝子発現を阻害する可能性が高い。目的の転写媒介性タンパク質は、ＡＰ－１、ＮＦカッパＢ、ＮＦ－ＡＴ、ＩＲＦ、ＬＥＦ－１、およびＳｐ１などの宿主細胞がコードするタンパク質、ならびにＨＩＶがコードするタンパク質であるＴａｔを含む。目的のＨＩＶ遺伝子発現調節エレメントは、ＡＰ－１、ＮＦカッパＢ、ＮＦ－ＡＴ、ＩＲＦ、ＬＥＦ－１、およびＳｐ１の結合部位、ならびにＴａｔと相互作用するトランス作用応答エレメント（「ＴＡＲ」）を含む。
好ましい実施形態では、ＨＩＶ感染細胞は、感受性の転写媒介性タンパク質配列および感受性のＨＩＶ調節エレメント配列を有する被験体から得られる。より好ましい実施形態では、ＨＩＶ感染細胞は、野生型の転写媒介性タンパク質配列および野生型のＨＩＶ調節配列を有する被験体から得られる。
Ｔ細胞を濃縮する別の方法は、免疫親和性に基づく選択を利用する。この方法は、第１および第２の細胞集団、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞集団の同時の濃縮または選択を含む。初代ヒトＴ細胞を含有する細胞は、インキュベーション組成物中で、ＣＤ４に特異的に結合する第１の免疫親和性試薬およびＣＤ８に特異的に結合する第２の免疫親和性試薬と、これらの免疫親和性試薬が試料中の細胞表面でそれぞれＣＤ４およびＣＤ８分子に特異的に結合する条件下で接触される。第１および／または第２の免疫親和性試薬に結合した細胞が回収され、これにより、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を含む濃縮された組成物が生成される。このアプローチは、最適以下の収量の濃度である第１および／または第２の免疫親和性試薬の濃度を用いた組成物のインキュベーションを含み得る。注目すべきことに、一部の実施形態では、形質導入された細胞は、混合されたＴ細胞集団であり、他の実施形態では、形質導入された細胞は、混合されたＴ細胞集団ではない。
一部の実施形態では、固体支持体が球体、例えばビーズ、例えばマイクロビーズまたはナノビーズである、免疫親和性に基づく選択が使用される。他の実施形態では、ビーズは磁性ビーズであってもよい。別の実施形態では、抗体は、球体またはクロマトグラフィーマトリクスなどの固体表面に固定化された結合試薬と可逆的結合を形成することができる１つまたは複数の結合パートナーを含有し、抗体は、固体表面に可逆的に動員される。一部の実施形態では、前記固体表面で抗体が結合した細胞表面マーカーを発現する細胞は、結合試薬と結合パートナーとの間の可逆的結合の破壊によりマトリクスから回収可能である。一部の実施形態では、結合試薬は、ストレプトアビジンであるか、またはストレプトアビジン類似体もしくは変異体である。一部の実施形態では、ＨＩＶタンパク質、ワクチン、またはペプチドに特異的に応答する細胞を、これらの細胞におけるサイトカインの発現に基づいて捕捉するために、免疫親和性に基づく選択が使用される。二重特異性捕捉試薬は、Ｔ細胞に結合し、また、その細胞から放出されるサイトカインを捕捉する。サイトカインは好ましくはインターフェロンガンマであるが、腫瘍壊死因子アルファ、またはＴ細胞により産生されることが公知の他のサイトカインを含み得る。固定化されたサイトカインは、磁性ビーズにより改変された第２の免役親和性試薬によって認識される。第１の捕捉試薬－サイトカイン－第２の免役親和性試薬および磁性ビーズと合わさった細胞は、磁性カラムに保持されるため、ＨＩＶタンパク質、ワクチン、またはペプチドによる刺激後にサイトカインを発現せず、生きた状態で維持されている細胞から精製除去される。磁場からマトリクスを取り出すと、標識された細胞の放出および高度に濃縮された集団としての捕捉が可能になる。一部の事例では、濃縮された細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８マイクロビーズまたはレンチウイルス形質導入と適合する同様の刺激試薬などのポリクローナルマイトジェンで刺激される前に、数を増加させるため、１～３０日間にわたって培養され得る。
造血系および／または造血幹細胞の初代細胞の安定な形質導入は、細胞の表面をレンチウイルスベクターと、細胞表面に結合する少なくとも１つの分子との両方とｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで接触させることによって得ることができる。これらの細胞は、成長および／または増殖を促す条件下で、２つまたはそれよりも多くの層を備える通気された容器において培養してよい。一部の実施形態では、このアプローチは、非ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇および／または広いポリクローナルな拡大増殖と併せて使用され得る。
Ｔ細胞を濃縮する別のアプローチでは、ＰＢＭＣをペプチドで刺激し、インターフェロンガンマなどのサイトカインを分泌する細胞を濃縮する。このアプローチは、概して、Ｔ細胞を含有する細胞の混合物を抗原で刺激し、抗原で刺激した細胞の分離を、これらが産物で標識されている程度に従って行うことを伴う。抗原刺激は、少なくとも１つのＴ細胞の抗原特異的な刺激を誘発するのに有効な条件下で、細胞を少なくとも１つの抗原に曝露することによって達成される。産物による標識は、少なくとも１つの捕捉部分を含有するように細胞の表面を改変し、産物が分泌され、放出され、前記捕捉部分に特異的に結合する（「捕捉される(captured)」または「封入される（entrapped）」）条件下で細胞を培養すること、および捕捉された産物を標識部分で標識することによって達成され、標識された細胞は、標識手順の一環としても分離手順の一環としても溶解されない。捕捉部分は、濃縮ステップを洗練し、概して抗原特異的Ｔ細胞の、特にＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を増加させるために、細胞表面糖タンパク質ＣＤ３またはＣＤ４の検出を組み込む場合がある。
以下の実施例は、本発明の諸態様を解説するために提示するものである。しかしながら、本発明はこれらの実施例に記載される特定の条件または詳細に限定されないことを理解されたい。本明細書で言及される刊行物はすべて、参照により明示的に組み込まれている。
（実施例１：レンチウイルスベクター系の開発）
図３（直鎖形態）および図４（環状化形態）にまとめたようにレンチウイルスベクター系を開発した。まず図３の上部を参照すると、左から右に、次のエレメント：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号３４～３５）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号３６）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号３７）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号３８）、ＥＦ－１αプロモーター（配列番号４）、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）、ｍｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）、ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２または８０）、およびΔＵ３ ３’ＬＴＲ（配列番号３９）を有する代表的な治療用ベクターをデザインし産生した。図３で詳述されている治療用ベクターは、本明細書ではＡＧＴ１０３とも呼ばれる。
次に図３の中央部を参照すると、左から右に、次のエレメント：ＣＡＧプロモーター（配列番号４１）、ＨＩＶ成分ｇａｇ（配列番号４３）、ＨＩＶ成分ｐｏｌ（配列番号４４）、ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号４５）、ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号４６）、およびＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号４７）を有するヘルパープラスミドをデザインし産生した。
次に図３の下部を参照すると、左から右に、次のエレメント：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号６０）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）（配列番号６２）を有するエンベローププラスミドをデザインし産生した。
２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入）において、治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミド（図３に示したもの）をトランスフェクションした後、レンチウイルス粒子を産生した。機能的なウイルス粒子を産生した２９３Ｔ／１７ ＨＥＫ細胞のトランスフェクションでは、プラスミドＤＮＡの取り込み効率を上昇させるために試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を用いた。プラスミドおよびＤＮＡは最初に、血清を含まない培養培地に３：１の比（ＰＥＩのＤＮＡに対する質量比）で別々に添加した。２～３日後、細胞培地を収集し、高速遠心分離および／または濾過の後にアニオン交換クロマトグラフィーを行うことにより、レンチウイルス粒子を精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）の点から表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ ｐ２４レベルを測定し（ｐ２４タンパク質がレンチウイルス粒子に組み込まれている）、定量的ＰＣＲにより、または細胞を感染させ光を使用することにより（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）、細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数を測定することによって達成した。
上記に言及したように、レンチウイルス粒子の産生のための３ベクター系（すなわち、２ベクターレンチウイルスパッケージング系）をデザインした。この３ベクター系の概略は図４に示されている。図４の概略は、これまでに図３に記載した直鎖系の環状化バージョンである。図４を参照しながら簡潔に述べると、最上部のベクターは、この場合はＲｅｖを含むヘルパープラスミドである。図４の中央にあるベクターは、エンベローププラスミドである。最下部のベクターは、これまでに記載した治療用ベクターである。
より具体的に図４を参照すると、ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号４０）、ＣＡＧプロモーター（配列番号４１）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号４２）、ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号４３）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号４４）、ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号４５）、ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号４６）、ＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号４７）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号４８）を含む。
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号６０）、ベータグロビンイントロン（配列番号６１）、ＶＳＶ－Ｇ（配列番号６２）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号６３）を含む。
代替のベクター系において、また図６に関して、本明細書においてベクター配列は配列番号１０５～１０７として提供される。
ヘルパー（＋Ｒｅｖ）およびエンベローププラスミドを含む２ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成。
材料および方法：
ヘルパープラスミドの構築：Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４－３ ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ Ａｉｄｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）からのＤＮＡ断片の初回ＰＣＲ増幅によってヘルパープラスミドを構築した。ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の同じ部位に挿入するために使用され得る、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するためのプライマーをデザインした。フォワードプライマーは（５’－ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣ ＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ－３’）（配列番号８１）であり、リバースプライマーは（５’－ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ－３’）（配列番号８２）であった。Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ断片の配列は次の通りであった。
GAATTCATGAATTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGATACTCATAGAAATCTGCGGACATAAAGCTATAGGTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTCAACATAATTGGAAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGCTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAGACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTCAAGATTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCTGCAGGGTTAAAACAGAAAAAATCAGTAACAGTACTGGATGTGGGCGATGCATATTTTTCAGTTCCCTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAGTGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAACAAAATCCAGACATAGTCATCTATCAATACATGGATGATTTGTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAACAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTTGGATGGGTTATGAACTCCATCCTGATAAATGGACAGTACAGCCTATAGTGCTGCCAGAAAAGGACAGCTGGACTGTCAATGACATACAGAAATTAGTGGGAAAATTGAATTGGGCAAGTCAGATTTATGCAGGGATTAAAGTAAGGCAATTATGTAAACTTCTTAGGGGAACCAAAGCACTAACAGAAGTAGTACCACTAACAGAAGAAGCAGAGCTAGAACTGGCAGAAAACAGGGAGATTCTAAAAGAACCGGTACATGGAGTGTATTATGACCCATCAAAAGACTTAATAGCAGAAATACAGAAGCAGGGGCAAGGCCAATGGACATATCAAATTTATCAAGAGCCATTTAAAAATCTGAAAACAGGAAAGTATGCAAGAATGAAGGGTGCCCACACTAATGATGTGAAACAATTAACAGAGGCAGTACAAAAAATAGCCACAGAAAGCATAGTAATATGGGGAAAGACTCCTAAATTTAAATTACCCATACAAAAGGAAACATGGGAAGCATGGTGGACAGAGTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAGTTTGTCAATACCCCTCCCTTAGTGAAGTTATGGTACCAGTTAGAGAAAGAACCCATAATAGGAGCAGAAACTTTCTATGTAGATGGGGCAGCCAATAGGGAAACTAAATTAGGAAAAGCAGGATATGTAACTGACAGAGGAAGACAAAAAGTTGTCCCCCTAACGGACACAACAAATCAGAAGACTGAGTTACAAGCAATTCATCTAGCTTTGCAGGATTCGGGATTAGAAGTAAACATAGTGACAGACTCACAATATGCATTGGGAATCATTCAAGCACAACCAGATAAGAGTGAATCAGAGTTAGTCAGTCAAATAATAGAGCAGTTAATAAAAAAGGAAAAAGTCTACCTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGAATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTGGTCAGTGCTGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGAAGAACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACCTACCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGGGAAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGCCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCTTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTAATTCCAGCAGAGACAGGGCAAGAAACAGCATACTTCCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAGCAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAATAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTCCTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATCAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAA（配列番号８３）
次に、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位を有する、Ｒｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いでこのＤＮＡ断片を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は次の通りであった。
TCTAGAATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATCAAAGCAACCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTGGCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTACTCTTGATTGTAACGAGGATTGTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTCCTACAATATTGGAGTCAGGAGCTAAAGAATAGAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCAGCGGCCGCCCCGGG（配列番号８４）
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターを、ＣＡＧエンハンサー／プロモーター＋ニワトリベータアクチンイントロン配列に置き換えた。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位を有する、ＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有するＤＮＡ断片を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いでこのＤＮＡ断片を、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位においてプラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は次の通りであった。
ACGCGTTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGGAATTC（配列番号８５）
ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドの構築：
隣接するＥｃｏＲＩ制限部位を有する水疱性口内炎Ｉｎｄｉａｎａウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）配列を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いでこのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ制限部位においてｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ＣＭＶ特異的なプライマーを使用したシーケンシングによって正しい方向を決定した。ＤＮＡ配列は次の通りであった。
GAATTCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGCAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACATCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAGAATTC（配列番号８６）
本明細書に記載される方法および材料を使用し、４ベクター系（すなわち、３ベクターレンチウイルスパッケージング系）もデザインし、産生した。この４ベクター系の概略は図５に示されている。図５を参照しながら簡潔に述べると、最上部のベクターは、この場合はＲｅｖを含まないヘルパープラスミドである。上から２番目のベクターは、別個のＲｅｖプラスミドである。下から２番目のベクターは、エンベローププラスミドである。最下部のベクターは、これまでに記載した治療用ベクターである。
図５を部分的に参照すると、ヘルパープラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号４９）、ＣＡＧプロモーター（配列番号５０）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号５１）、ＨＩＶ ｇａｇ（配列番号５２）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号５３）、ＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号５４）、ＨＩＶ ＲＲＥ（配列番号５５）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号５６）を含む。
Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーター（配列番号５７）、ＨＩＶ Ｒｅｖ（配列番号５８）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号５９）を含む。
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号６０）、ベータグロビンイントロン（配列番号６１）、ＶＳＶ－Ｇ（配列番号６２）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号６３）を含む。
ヘルパー、Ｒｅｖ、およびエンベローププラスミドを含む３ベクターレンチウイルスパッケージング系の合成。
材料および方法：
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドの構築：
ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することにより、Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドを構築した。隣接するＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を有するこの配列は、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いでこのＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列を、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位においてヘルパープラスミドに挿入した。ＤＮＡ配列は次の通りである。
TCTAGAAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCACCCGGG（配列番号８７）
Ｒｅｖプラスミドの構築：
隣接するＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を有するＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ Ｒｅｖ配列を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎにより、単一のＤＮＡ断片として合成した。次いでこのＤＮＡ断片を、ＣＭＶプロモーターが、ＲＳＶプロモーターに置き換えられているＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位においてｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＤＮＡ配列は次の通りであった。
CAATTGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTATCTGAGGGGACTAGGGTGTGTTTAGGCGAAAAGCGGGGCTTCGGTTGTACGCGGTTAGGAGTCCCCTCAGGATATAGTAGTTTCGCTTTTGCATAGGGAGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAATACACTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACAGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTCCGCATTGCAGAGATAATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCCATTTGACCATTCACCACATTGGTGTGCACCTCCAAGCTCGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCCCTCGAAGCTAGCGATTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAACTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAGCAACCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTAGCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTACTCTTGATTGTAACGAGGATTGTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTCCTACAATATTGGAGTCAGGAGCTAAAGAATAGTCTAGA（配列番号８８）
２ベクターおよび３ベクターのパッケージング系のためのプラスミドは、同様のエレメントで改変することができ、イントロン配列は、ベクターの機能を損失することなく除去できる可能性があった。例えば、以下のエレメントは、２ベクターおよび３ベクターのパッケージング系において同様のエレメントに取って代わることができた。
プロモーター：伸長因子１（ＥＦ－１）（配列番号６４）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号６５）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号６６）は、ＣＭＶ（配列番号６０）またはＣＡＧプロモーター（配列番号１００）に取って代わることができる。これらの配列は、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号６７）およびｂＧＨポリＡ（配列番号６８）は、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号４８）に取って代わることができる。これらの配列は、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築されていてよい。例えば、Ｂａｌ株由来のＨＩＶ Ｇａｇ（配列番号６９）、ＨＩＶ Ｐｏｌ（配列番号７０）、およびＨＩＶ Ｉｎｔ（配列番号７１）は、本明細書に概説されるヘルパー／ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドに含有されるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と交換することができる。これらの配列は、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
エンベロープ：ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質は、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号７２）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号７３）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号７４）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号７５）、インフルエンザＡ家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号７６）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号７７）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号７８）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号７９）由来の膜糖タンパク質で置換され得る。これらのエンベロープの配列は、本明細書の配列の部分において特定される。さらに、これらの配列は、付加、置換、欠失、または変異によってさらに変化させることもできる。
まとめると、３ベクター系対４ベクター系は、部分的には次のように比較および対比することができる。３ベクターのレンチウイルスベクター系は、１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ－Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；ならびに３．治療用ベクター：ＲＳＶ ５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲを含有する。４ベクターのレンチウイルスベクター系は、１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ－Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；ならびに４．治療用ベクター：ＲＳＶ ５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲを含有する。上記のエレメントに対応する配列は、本明細書の配列表の部分において特定される。
（実施例２：抗ＨＩＶレンチウイルスベクターの開発）
この実施例の目的は、抗ＨＩＶレンチウイルスベクターを開発することであった。
阻害性ＲＮＡのデザイン。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓケモカインＣ－Ｃモチーフ受容体５（ＣＣＲ５）（ＧＣ０３Ｐ０４６３７７）のｍＲＮＡ配列を使用して、ヒト細胞においてＣＣＲ５レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのプログラムまたはＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ－ｉＴ ＲＮＡｉ ＤｅｓｉｇｎｅｒなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡデザインプログラムによって選択された候補から、潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。選択された個々のｓｈＲＮＡ配列を、レンチウイルスベクターのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＨ１、Ｕ６、または７ＳＫのすぐ３’側に挿入して、ｓｈＲＮＡ発現を調節した。これらのレンチウイルス－ｓｈＲＮＡ構築物を使用して細胞の形質導入を行い、特異的なｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを低下させるために最も強力なｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡ骨格内に個々に包埋して、ＣＭＶまたはＥＦ－１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にした。マイクロＲＮＡ骨格は、mirbase.orgから選択した。ＲＮＡ配列を合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしても合成し、レンチウイルスベクターを使用せずに細胞に直接導入した。
ヒト免疫不全ウイルス１型のＢａｌ株（ＨＩＶ－１ ８５ＵＳ＿ＢａＬ、受託番号ＡＹ７１３４０９）のゲノム配列を使用して、ヒト細胞におけるＨＩＶ複製レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。配列相同性および経験に基づいて、この検索ではＨＩＶのＴａｔおよびＶｉｆ遺伝子の領域に焦点を合わせたが、当業者には、これらの領域の使用は非限定的であり、他の潜在的な標的が選択され得ることは理解されよう。重要なことに、ｇａｇまたはｐｏｌ遺伝子の高度に保存された領域は、ベクターの製造に必要なパッケージング系補完プラスミドにこれらと同じ配列が存在したため、ｓｈＲＮＡによってターゲティングすることができなかった。ＣＣＲ５（ＮＭ ０００５７９．３、ＮＭ ００１１００１６８．１特異的）ＲＮＡと同様に、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅが主催しているＧｅｎｅ－Ｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（broadinstitute.org/mai/public）またはＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ－ｉＴ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（rnadesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&pid=6712627360706061801）などのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡデザインプログラムによって選択された候補から、潜在的なＨＩＶ特異的ＲＮＡ干渉配列を選択した。選択された個々のｓｈＲＮＡ配列を、レンチウイルスベクターのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＨ１、Ｕ６、または７ＳＫのすぐ３’側に挿入して、ｓｈＲＮＡ発現を調節した。これらのレンチウイルス－ｓｈＲＮＡ構築物を使用して細胞の形質導入を行い、特異的なｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを低下させるために最も強力なｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡ骨格内に個々に包埋して、ＣＭＶまたはＥＦ－１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にした。
ベクターの構築。ＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆのｓｈＲＮＡについて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ，ＬＬＣによって合成した。重複するセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、セ氏７０度から室温に冷却中にアニールした。レンチウイルスベクターを、セ氏３７度で１時間にわたり、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化されたレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクターとオリゴ（３：１比）を混合し、アニールさせ、ライゲートした。ライゲーション反応は、室温で３０分間Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５マイクロリットルのライゲーションミックスを、２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。セ氏４２度での熱ショック後に形質転換が達成された。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物耐性コロニー（アンピシリン耐性プラスミドの存在を示す）を回収し、精製し、ＬＢブロスにおいて拡大増殖させた。オリゴ配列の挿入を調べるために、採取した細胞培養物からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために使用したプロモーターに特異的なプライマーを使用したＤＮＡシーケンシングにより、レンチウイルスベクターにおけるｓｈＲＮＡ配列の挿入を検証した。ＨＩＶ複製を制限することが決定された例示的なベクター配列は図７に見出すことができる。例えば、ＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆ遺伝子発現に対する活性が最も高いｓｈＲＮＡ配列を、次いで、ＥＦ－１アルファプロモーターの制御下でマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）クラスターにアセンブルした。プロモーターおよびｍｉＲ配列は図７に示されている。
さらに、標準的な分子生物学技術（例えば、Sambrook；Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版）ならびに本明細書に記載される技術を使用して、本明細書の図８に示されるように、一連のレンチウイルスベクターを開発した。
ベクター１を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＣＣＲ５（配列番号１６、１８、２０、２２、または２４－Ｙ）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクター２を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＲｅｖ／Ｔａｔ（配列番号１０）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＣＣＲ５（配列番号１６、１８、２０、２２、または２４）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクター３を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＧａｇ（配列番号１２）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＣＣＲ５（配列番号１６、１８、２０、２２、または２４）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクター４を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；７ＳＫエレメント（配列番号１０３）；ｓｈＲｅｖ／Ｔａｔ（配列番号１０）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＣＣＲ５（配列番号１６、１８、２０、２２、または２４）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクター５を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＥＦ１エレメント（配列番号４）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ＭｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクター６を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＥＦ１エレメント（配列番号４）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ＭｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１５５Ｔａｔ（配列番号１０４）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクター７を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＥＦ１エレメント（配列番号４）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ＭｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクター８を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＥＦ１エレメント（配列番号４）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ＭｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクター９を開発し、これは、左から右に、末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＣＤ４エレメント（配列番号３０）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ｍｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）を含有する。
ベクターの開発
これらの実験のために開発したベクターのすべてが必ずしも予想され得た通りに機能したとは限らないことに留意されたい。より具体的には、ＨＩＶに対するレンチウイルスベクターは、１）標的細胞表面上のＨＩＶ結合タンパク質（受容体）のレベルを低下させて初期のウイルスの付着および侵入を遮断する阻害性ＲＮＡ、２）ウイルスＴａｔタンパク質を隔離し、ウイルス遺伝子発現をトランス活性化するその能力を減少させる、ＨＩＶ ＴＡＲ配列の過剰発現、および３）ＨＩＶゲノム内の重要な保存配列を攻撃する阻害性ＲＮＡという、３つの主要な成分を含み得る。
上記の第１の点に関して、重要な細胞表面ＨＩＶ結合タンパク質は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５である。ＨＩＶ粒子は、ＣＤ４およびＣＣＲ５細胞表面タンパク質に結合することにより、感受性Ｔ細胞に付着する。ＣＤ４は、Ｔ細胞の免疫学的機能に重要な細胞表面上の必須の糖タンパク質であるため、その発現レベルを操作するための標的として、これは選択しなかった。しかしながら、ＣＣＲ５遺伝子のヌル変異のホモ接合体として生まれ、受容体発現が完全に欠如している人々は、いくつかの感染性疾患に対する感受性の増強および稀な自己免疫が発生する可能性を除いては通常の生活を送る。よって、ＣＣＲ５の調整は比較的安全なアプローチであると決定され、抗ＨＩＶレンチウイルスベクターの開発における主要な標的であった。
上記の第２の点に関して、ウイルスＴＡＲ配列は、ウイルスＴａｔタンパク質と密に結合するＨＩＶゲノムＲＮＡの高度に構造化された領域である。Ｔａｔ：ＴＡＲ複合体は、ウイルスＲＮＡの効率的な生成に重要である。ＴＡＲ領域の過剰発現は、Ｔａｔタンパク質を隔離し、ウイルスＲＮＡのレベルを低下させる、デコイ分子として想定された。しかしながら、ＴＡＲは、レンチウイルス粒子の製造に使用された細胞を含め、ほとんどの哺乳動物細胞に対して毒性があることが証明された。さらにＴＡＲは、他の実験室においてウイルス遺伝子発現を阻害するのに非効率的であり、ＨＩＶ遺伝子療法において実行可能な成分としては却下された。
様々な実施形態では、ｉ）一連のＨＩＶ単離物にわたり合理的に保存されている配列が、目的の地理的領域における流行を代表すること；ｉｉ）ウイルスベクター中の阻害性ＲＮＡの活性に起因するＲＮＡレベルの低下により、対応するタンパク質レベルが、ＨＩＶ複製を有意に低減させるのに十分な量だけ低下すること；およびｉｉｉ）阻害性ＲＮＡによりターゲティングされるウイルス遺伝子配列が、製造中にウイルスベクター粒子のパッケージングおよびアセンブリに必要とされる遺伝子に存在しないことという、３つの基準を満たすウイルス遺伝子配列が特定された。様々な実施形態では、ＨＩＶ ＴａｔおよびＲｅｖ遺伝子の接合部における配列、ならびにＨＩＶ Ｖｉｆ遺伝子内の第２の配列が、阻害性ＲＮＡによってターゲティングされた。Ｔａｔ／Ｒｅｖのターゲティングは、この領域はＨＩＶゲノム内のエンベロープ遺伝子と重複するため、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の発現を低減させるというさらなる利益を有する。
ベクターの開発および試験のための様々な方法は、まず好適な標的（本明細書に記載されている）を特定した後、細胞モデルで試験するための個々または複数の阻害性ＲＮＡ種を発現するプラスミドＤＮＡを構築し、最後に、抗ＨＩＶ機能が証明された阻害性ＲＮＡを含有するレンチウイルスベクターを構築することに依拠する。レンチウイルスベクターは、毒性、ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生中の収量、およびＣＣＲ５発現レベルの低下またはウイルス遺伝子産物の低減によるウイルス複製の阻害という点でのＨＩＶに対する有効性について試験される。
以下の表２は、複数のバージョンの阻害性構築物を通して臨床候補に到達するまでの進行を実証する。最初にｓｈＲＮＡ（短鎖相同ＲＮＡ）分子をデザインし、プラスミドＤＮＡ構築物から発現させた。
以下の表２で詳述するプラスミド１～４は、ＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＲＴ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ配列を試験した。各ｓｈＲＮＡは細胞モデルにおいてウイルスタンパク質発現を抑制するのに活性であったが、さらなる開発を妨げた２つの重要な問題があった。第１に、これらの配列は、北米および欧州で現在循環しているクレードＢ ＨＩＶ株を代表するものではないＨＩＶの実験室単離物に対してターゲティングされた。第２に、これらのｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターパッケージング系において重要な成分をターゲティングし、製造中のベクター収量を大きく低減させることになる。表２で詳述するプラスミド５は、ＣＣＲ５をターゲティングするために選択され、リード候補配列をもたらした。表２で詳述するプラスミド６、７、８、９、１０、および１１は、ＴＡＲ配列を組み込んだものであり、レンチウイルスベクター製造に使用された細胞を含む哺乳動物細胞に対して許容されない毒性をもたらしたことが分かった。表２で詳述するプラスミド２は、Ｔａｔ ＲＮＡ発現を低減させることができるリードｓｈＲＮＡ配列を特定した。表２で詳述するプラスミド１２は、レンチウイルスベクターにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されるｓｈＣＣＲ５の有効性を実証し、これが最終産物に存在するはずであることを裏付けた。表２で詳述するプラスミド１３は、レンチウイルスベクターにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されるｓｈＶｉｆの有効性を実証し、これが最終産物に存在するはずであることを裏付けた。表２で詳述するプラスミド１４は、レンチウイルスベクターにおいてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されるｓｈＴａｔの有効性を実証し、これが最終産物に存在するはずであることを裏付けた。表２で詳述するプラスミド１５は、単一のプロモーターから発現されたｍｉＲクラスターの形態で、ｍｉＲ ＣＣＲ５、ｍｉＲ ＴａｔおよびｍｉＲ Ｖｉｆを含有した。これらのｍｉＲは、レンチウイルスベクターパッケージング系において重要な成分をターゲティングせず、哺乳動物細胞に対して無視できる毒性を有することが証明された。クラスター内のｍｉＲは、以前に試験された個々のｍｉＲに対して等しく有効であり、全体的な影響は、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ ＢａＬ株の複製の実質的な低減であった。
Figure 0007162895000007
Figure 0007162895000008
Figure 0007162895000009
Figure 0007162895000010
Figure 0007162895000011
Figure 0007162895000012
機能アッセイ。ＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆ ｓｈＲＮＡ配列を含有する個々のレンチウイルスベクター、ならびに、実験の目的で、ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰと呼称されるレンチウイルスベクターを、ＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆの発現をノックダウンする能力について試験した。ポリブレンの存在下または非存在下のいずれかで、哺乳動物細胞にレンチウイルス粒子を形質導入した。２～４日後に細胞を収集し、タンパク質およびＲＮＡをＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆの発現について分析した。ウェスタンブロットアッセイまたは特異的な蛍光抗体による細胞の標識（ＣＣＲ５アッセイ）後、ＣＣＲ５特異的抗体またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを使用し、改変および非改変細胞の蛍光を比較する分析的フローサイトメトリーによって、タンパク質レベルを試験した。
レンチウイルス試験の開始。１０％ ＦＢＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０を使用してＴ細胞培養培地を作った。ＩＬ－２ １０，０００単位／ｍｌ、ＩＬ－１２ １μｇ／ｍｌ、ＩＬ－７ １μｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５ １μｇ／ｍｌのサイトカインストックも事前に調製した。
レンチウイルスを形質導入する前に、感染性ウイルス力価を決定し、適切な感染多重度（ＭＯＩ）になるように添加するためのウイルスの量を算出した。
０～１２日目：抗原特異的濃縮。０日目、凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、１０分間１２００ｒｐｍにて１０ｍｌの３７℃培地で洗浄し、２×１０６／ｍｌの濃度で３７℃培地に再懸濁した。この細胞を、２４ウェルプレート中０．５ｍｌ／ウェルにて、３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。最適な刺激条件を定義するために、以下の表３に列挙した試薬の組み合わせで細胞を刺激した。
Figure 0007162895000013
最終濃度：ＩＬ－２＝２０単位／ｍｌ、ＩＬ－１２＝１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－７＝１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５＝１０ｎｇ／ｍｌ、ペプチド＝５μｇ／ｍｌの個々のペプチド、ＭＶＡ ＭＯＩ＝１。
４日目および８日目、０．５ｍｌの新鮮培地およびサイトカインを列挙した濃度で（濃度はすべて培養物中の最終濃度を示す）、刺激した細胞に添加した。
１２～２４日目：非特異的拡大増殖およびレンチウイルス形質導入。１２日目、刺激した細胞をピペット操作によりプレートから取り出し、新鮮なＴ細胞培養培地に１×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁した。再懸濁した細胞をＴ２５培養フラスコに移し、製造元の説明に従い、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８と、それに加えて上記に列挙したサイトカインで刺激した。フラスコを垂直姿勢でインキュベートした。
１４日目、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰをＭＯＩ２０で添加し、培養物を２日間インキュベーターに戻した。このとき、細胞をピペット操作により回収し、１３００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって収集し、同じ体積の新鮮培地に再懸濁し、再び遠心分離して緩い細胞ペレットを形成した。この細胞ペレットを、先行ステップで使用したものと同じサイトカインを含む新鮮培地に、１ｍｌあたりの生存細胞０．５×１０６個の細胞で再懸濁した。
１４～２３日目にかけて、細胞の数を２日ごとに評価し、細胞を新鮮培地で０．５×１０６／ｍｌに希釈した。サイトカインは毎回添加した。
２４日目に細胞を収集し、細胞からビーズを除去した。ビーズを除去するため、２分間にわたり、選別用磁石に入れた好適な管に細胞を移した。細胞を含有する上清を新しい管に移した。次いで細胞を新鮮培地中１×１０６／ｍｌで１日間培養した。アッセイを行い、抗原特異的Ｔ細胞およびレンチウイルスを形質導入した細胞の頻度を決定した。
可能性のあるウイルス増大を防止するため、アンプレナビル（０．５ｎｇ／ｍｌ）を刺激の第１日目および培養中１日おきに培養物に添加した。
ＩＦＮガンマの細胞内サイトカイン染色により抗原特異的Ｔ細胞を調査する。ペプチド刺激後または１×１０６細胞／ｍｌでのレンチウイルス形質導入後の培養細胞を、培地単独（陰性対照）、Ｇａｇペプチド（５μｇ／ｍｌの個々のペプチド）、またはＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ、陽性対照）で刺激した。４時間後、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（１：１０００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加してゴルジ輸送を遮断した。８時間後、細胞を洗浄し、製造元の説明に従ってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを用い、細胞外抗体（ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および細胞内抗体（ＩＦＮガンマ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで試料を分析した。適切なアイソタイプ適合抗体で標識した対照試料を各実験に含めた。Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
レンチウイルス形質導入率をＧＦＰ＋細胞の頻度によって決定した。形質導入された抗原特異的Ｔ細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋ＧＦＰ＋ＩＦＮガンマ＋細胞の頻度によって決定する。ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＧＦＰ＋ＩＦＮガンマ＋細胞の試験は対照として含まれている。
これらの結果は、ＨＩＶ特異的タンパク質の発現を特異的にノックダウンするようにデザインされたレンチウイルスを標的Ｔ細胞集団のＣＤ４ Ｔ細胞に形質導入することにより、ウイルスに対して免疫があるＴ細胞の拡大増殖可能な集団が産生され得ることを示す。この実施例は、開示されているレンチウイルス構築物をワクチン接種と組み合わせて使用するとＨＩＶ患者の機能的治癒がもたらされ得ることを示す概念の証拠として機能する。
（実施例４：実験的ベクターによるＣＣＲ５のノックダウン）
ＡＧＴｃ１２０は、多量のＣＤ４およびＣＣＲ５を安定に発現するＨｅｌａ細胞株である。ＬＶ－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下で発現される赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙありまたはなしでＡＧＴｃ１２０に形質導入を行った。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質の遺伝子発現は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス最初期プロモーター）発現カセットによって制御された。ＬＶ－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターはマイクロＲＮＡクラスターを欠いていたが、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙは、ＣＣＲ５、Ｖｉｆ、およびＴａｔに対する治療用ｍｉＲＮＡを発現した。
図９Ａに示されるように、形質導入効率は＞９０％であった。７日後、細胞を収集し、ＣＣＲ５に対する蛍光モノクローナル抗体で染色し、分析的フローサイトメトリーに供した。ＣＣＲ５ ＡＰＣの平均蛍光強度（ｘ軸）を最頻値に正規化した細胞数（ｙ軸）に対してプロットするこれらのヒストグラムにおいて、アイソタイプ対照は灰色で示されている。細胞表面ＣＣＲ５について染色した後、レンチウイルスなしまたは対照レンチウイルス（ｍＣｈｅｒｒｙマーカーのみを発現する）で処置した細胞はＣＣＲ５密度の変化を示さなかったが、ＡＧＴ１０３（右のセクション）は、ＣＣＲ５染色強度をアイソタイプ対照のレベル近くまで低減させた。７日後、Ｒ５向性ＨＩＶレポーターウイルスＢａｌ－ＧＦＰありまたはなしで細胞を感染させた。３日後に細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析した。９０％超の細胞が形質導入されていた。ＡＧＴ１０３－ＣＭＶ／ＣＭＶｍＣｈｅｒｒｙは、対照ベクターで処置された細胞と比較して、形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞におけるＣＣＲ５発現を低減させ、Ｒ５向性ＨＩＶ感染を遮断した。
図９Ｂは、トランスフェクトされたＡＧＴｃ１２０細胞のＨＩＶ感染に対する相対的な非感受性を示す。上記のように、レンチウイルスベクターはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現し、ＨＩＶにも感染した（ＧＦＰを発現する）形質導入細胞は、フォールスカラーフローサイトメトリードットプロットの右上象限に二重陽性細胞として現れることになる。ＨＩＶの非存在下（上パネル）では、いかなる条件下でもＧＦＰ＋細胞は存在しなかった。ＨＩＶ感染後（下パネル）、レンチウイルス形質導入の非存在下で５６％の細胞が感染し、ＬＶ－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙが形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞では５３．６％の細胞が感染した。治療用ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙベクターを細胞に形質導入したとき、細胞が形質導入され感染したことを示す二重陽性象限には、細胞の０．８３％しか現れなかった。
５３．６２（対照ベクターを含む二重陽性細胞の割合）を０．８３（治療用ベクターを含む二重陽性細胞の割合）で割ると、この実験系においてＡＧＴ１０３が６５倍超のＨＩＶからの保護をもたらしたことが示される。
（実施例５：レンチウイルスベクターにおけるｓｈＲＮＡ阻害剤配列によるＣＣＲ５発現の調節）
阻害性ＲＮＡのデザイン。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓケモカイン受容体ＣＣＲ５（ＣＣＲ５、ＮＣ ０００００３．１２）の配列を使用して、ヒト細胞においてＣＣＲ５レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのプログラムまたはＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ－ＩＴ ＲＮＡ ｉＤｅｓｉｇｎｅｒなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡデザインプログラムによって選択された候補から、潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。ｓｈＲＮＡ配列を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＨ１、Ｕ６、または７ＳＫのすぐ後でプラスミドに挿入し、ｓｈＲＮＡ発現を調節することができる。ｓｈＲＮＡ配列は、ＣＭＶまたはＥＦ－１アルファなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによる発現を可能にするために、同様のプロモーターを使用してレンチウイルスベクターに挿入するか、またはマイクロＲＮＡ骨格内に包埋してもよい。ＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとして合成し、プラスミドまたはレンチウイルスベクターから独立して利用することもできる。
プラスミドの構築。ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡについて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列を、ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。オリゴヌクレオチド配列を７０℃でインキュベートすることによってアニールし、次いで室温に冷ました。アニールしたオリゴヌクレオチドを３７℃で１時間にわたり制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで７０℃で２０分間にわたり酵素を不活化した。並行して、プラスミドＤＮＡを、３７℃で１時間にわたり、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化されたプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、血漿とオリゴヌクレオチド配列を３：１のインサート対ベクター比でライゲートした。ライゲーション反応は、室温で３０分間Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行った。２．５μＬのライゲーションミックスを、２５μＬのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。形質転換には４２℃での熱ショックが必要であった。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、コロニーをＬブロスにおいて拡大増殖させた。オリゴ配列の挿入を調べるために、採取した細胞培養物からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡミニプレップキットを使用してプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素消化によって試験した。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために使用したプロモーターに特異的なプライマーを使用したＤＮＡシーケンシングにより、プラスミドへのｓｈＲＮＡ配列の挿入を検証した。
ＣＣＲ５ ｍＲＮＡの低減に関する機能アッセイ：ＣＣＲ５発現の阻害に関するアッセイでは、２つのプラスミドの共トランスフェクションが必要であった。第１のプラスミドは、ＣＣＲ５ ｍＲＮＡに対して指向された５つの異なるｓｈＲＮＡ配列のうちの１つを含有する。第２のプラスミドは、ヒトＣＣＲ５遺伝子のｃＤＮＡ配列を含有する。プラスミドを２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。４８時間後、細胞を溶解し、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを抽出した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔを使用し、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ＰＣＲ機械を使用した定量的ＲＴ－ＰＣＲにより、試料を分析した。ポリメラーゼ連鎖反応分析の標準的条件で、フォワードプライマー（５’－ＡＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＧＡＧＡＡＧＧ－３’）（配列番号９３）およびリバースプライマー（５’－ＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＡＴＣＡ－３’）（配列番号９４）を使用し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いてＣＣＲ５発現を検出した。ポリメラーゼ連鎖反応分析の標準的条件で、フォワードプライマー（５’－ＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ－３’）（配列番号９５）およびリバースプライマー（５’－ＧＧＣＧＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴ－３’）（配列番号９６）を使用し、ベータアクチン遺伝子発現に関するｍＲＮＡに対して試料を正規化した。各試料についてアクチンメッセンジャーＲＮＡのレベルに正規化したＣｔ値によってＣＣＲ５ ｍＲＮＡの相対発現を決定した。結果を図１０に示す。
図１０Ａに示されるように、ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ構築物およびＣＣＲ５発現プラスミドの共トランスフェクションにより、２９３Ｔ細胞におけるＣＣＲ５のノックダウンを試験した。対照試料には、いずれのヒト遺伝子もターゲティングしないスクランブルｓｈＲＮＡ配列、およびＣＣＲ５発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの６０時間後、試料を採取し、定量的ＰＣＲによってＣＣＲ５ ｍＲＮＡレベルを測定した。さらに、図１０Ｂに示されるように、ＣＣＲ５ ｓｈＲＮＡ－１（配列番号１６）を発現するレンチウイルスの形質導入後のＣＣＲ５ノックダウン。
（実施例６：レンチウイルスベクターにおけるｓｈＲＮＡ阻害剤配列によるＨＩＶ成分の調節）
阻害性ＲＮＡのデザイン。
ＨＩＶ１型Ｒｅｖ／Ｔａｔ（５’－ＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣ－３’）（配列番号９）およびＧａｇ（５’－ＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴ－３’）（配列番号１１）の配列を使用して、
Ｒｅｖ／Ｔａｔ：
（５’ＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＴＴＴ－３’）（配列番号１０）、および
Ｇａｇ：
（５’ＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴ－３’）（配列番号１２）のｓｈＲＮＡをデザインした。これらは、上述のように合成し、プラスミドにクローニングした。
プラスミドの構築。Ｒｅｖ／ＴａｔまたはＧａｇ標的配列を、細胞または組織における遺伝子発現のレポーターとして一般的に使用されているホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）に挿入した。さらに、１つのプラスミドは、Ｒｅｖ／Ｔａｔ ｓｈＲＮＡを発現するように構築し、第２のプラスミドは、Ｇａｇ ｓｈＲＮＡを発現するように構築した。プラスミドの構築は上述の通りであった。
Ｒｅｖ／ＴａｔまたはＧａｇ ｍＲＮＡのｓｈＲＮＡターゲティングに関する機能アッセイ：本発明者らはプラスミドの共トランスフェクションを使用し、ｓｈＲＮＡプラスミドが、共トランスフェクトされた細胞においてルシフェラーゼメッセンジャーＲＮＡを分解し、発光の強度を減少させることができるかどうかを試験した。ｓｈＲＮＡ対照（スクランブル配列）を使用して、ルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞からの最大光収量を確立した。３’－ＵＴＲ（ｍＲＮＡの非翻訳領域）に挿入されたＲｅｖ／Ｔａｔ標的配列を含有するルシフェラーゼ構築物を、Ｒｅｖ／Ｔａｔ ｓｈＲＮＡ配列とともに共トランスフェクトすると、発光が約９０％低減し、ｓｈＲＮＡ配列の強力な機能が示された。３’－ＵＴＲにＧａｇ標的配列を含有するルシフェラーゼ構築物を、Ｇａｇ ｓｈＲＮＡ配列とともに共トランスフェクトしたとき、同様の結果が得られた。これらの結果は、ｓｈＲＮＡ配列の強力な活性を示す。
図１１Ａに示されるように、２９３Ｔ細胞における一過性のトランスフェクションによって３’ＵＴＲ内の標的ｍＲＮＡ配列に融合したＲｅｖ／Ｔａｔ標的遺伝子のノックダウンを、ルシフェラーゼ活性の低減によって測定した。図１１Ｂは、ルシフェラーゼ遺伝子に融合したＧａｇ標的遺伝子配列のノックダウンを示す。結果は、それぞれ三連で行った３つの独立したトランスフェクション実験の平均±ＳＤとして表示されている。
（実施例７：ＡＧＴ１０３はＴａｔおよびＶｉｆの発現を減少させる）
例示的なベクターＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰを細胞にトランスフェクトした。ＡＧＴ１０３および他の例示的なベクターは、以下の表３に定義してある。
Figure 0007162895000014
Ｔリンパ芽球様細胞株（ＣＥＭ；ＣＣＲＦ－ＣＥＭ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎカタログ番号ＣＣＬ１１９）にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰを形質導入した。４８時間後、ウイルス配列全体をコードするＨＩＶ発現プラスミドを細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用してインタクトなＴａｔ配列のレベルを試験した。図１２に示されるように、インタクトなＴａｔ ＲＮＡの相対発現レベルは、対照レンチウイルスベクターの存在下でおよそ８５０から、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰの存在下でおよそ２００まで低下し、全体で＞４分の１の低下であった。
（実施例８：レンチウイルスベクターにおける合成マイクロＲＮＡ配列によるＨＩＶ成分の調節）
阻害性ＲＮＡのデザイン。ＨＩＶ－１ ＴａｔおよびＶｉｆ遺伝子の配列を使用して、ヒト細胞においてＴａｔまたはＶｉｆレベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を検索した。Ｂｒｏａｄ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのプログラムまたはＴｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ－ＩＴ ＲＮＡ ｉＤｅｓｉｇｎｅｒなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡデザインプログラムによって選択された候補から、潜在的なＲＮＡ干渉配列を選択した。ＴａｔまたはＶｉｆのノックダウンに最も強力である選択したｓｈＲＮＡ配列を、ＣＭＶまたはＥＦ－ＩアルファなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによる発現を可能にするために、マイクロＲＮＡ骨格内に包埋した。ＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとして合成し、プラスミドまたはレンチウイルスベクターから独立して使用することもできる。
プラスミドの構築。Ｔａｔ標的配列（５’－ＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧ－３’）（配列番号７）をｍｉＲ１８５の骨格に組み込んで、Ｔａｔ ｍｉＲＮＡ（５’－ＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧＣＧＴＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＧＡＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧ－３’）（配列番号３）を作り出し、これをレンチウイルスベクターに挿入し、ＥＦ－１アルファプロモーターの制御下で発現させた。同様に、Ｖｉｆ標的配列（５’－ＧＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＣＴＴ－３’）（配列番号６）をｍｉＲ２１の骨格に組み込んで、Ｖｉｆ ｍｉＲＮＡ（５’－ＣＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＡＣＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＣＣＧＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＡ－３’）（配列番号２）を作り出し、これをレンチウイルスベクターに挿入し、ＥＦ－１アルファプロモーターの制御下で発現させた。結果として得られたＶｉｆ／Ｔａｔ ｍｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを、レンチウイルスベクターパッケージング系を使用して２９３Ｔ細胞内で産生した。ＶｉｆおよびＴａｔ ｍｉＲＮＡを、すべてＥＦ－１プロモーターの制御下で発現されるｍｉＲ ＣＣＲ５、ｍｉＲ Ｖｉｆ、およびｍｉＲ ＴａｔからなるマイクロＲＮＡクラスターに包埋した。
Ｔａｔ ｍＲＮＡの蓄積のｍｉＲ１８５Ｔａｔによる阻害に関する機能アッセイ。２９３Ｔ細胞に形質導入するため、ｍｉＲ１８５ Ｔａｔを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＥＦ１－ｍｉＲ－ＣＣＲ５－Ｖｉｆ－Ｔａｔ）を、５に等しい感染多重度で使用した。形質導入の２４時間後、標準的条件下でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用し、ＨＩＶ株ＮＬ４－３を発現するプラスミド（ｐＮＬ４－３）を細胞にトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡを抽出し、Ｔａｔ特異的プライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによってＴａｔメッセンジャーＲＮＡのレベルを試験し、対照のアクチンｍＲＮＡレベルと比較した。
Ｖｉｆタンパク質の蓄積のｍｉＲ２１ Ｖｉｆによる阻害に関する機能アッセイ。２９３Ｔ細胞に形質導入するため、ｍｉＲ２１ Ｖｉｆを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ－ＥＦ１－ｍｉＲ－ＣＣＲ５－Ｖｉｆ－Ｔａｔ）を、５に等しい感染多重度で使用した。形質導入の２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用し、ＨＩＶ株ＮＬ４－３を発現するプラスミド（ｐＮＬ４－３）を細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を溶解し、全可溶性タンパク質を試験して、Ｖｉｆタンパク質の含有量を測定した。確立された技術に従い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって細胞溶解物を分離した。分離したタンパク質をナイロン膜に移し、Ｖｉｆ特異的モノクローナル抗体またはアクチン対照抗体でプローブした。
図１３Ａに示されるように、対照レンチウイルスベクターか、または合成ｍｉＲ１８５ ＴａｔもしくはｍｉＲ１５５ ＴａｔのいずれかのマイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターのいずれかを形質導入した２９３Ｔ細胞において、Ｔａｔのノックダウンを試験した。２４時間後、ＨＩＶベクターｐＮＬ４－３をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と共に２４時間トランスフェクトし、次いで、Ｔａｔに対するプライマーを用いたｑＰＣＲ分析のためにＲＮＡを抽出した。図１３Ｂに示されるように、対照レンチウイルスベクターか、または合成ｍｉＲ２１ ＶｉｆのマイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターのいずれかを形質導入した２９３Ｔ細胞において、Ｖｉｆのノックダウンを試験した。２４時間後、ＨＩＶベクターｐＮＬ４－３をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００と共に２４時間トランスフェクトし、次いで、ＨＩＶ Ｖｉｆに対する抗体を用いた免疫ブロット分析のためにタンパク質を抽出した。
（実施例９：レンチウイルスベクターにおける合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節）
ＣＣＲ５の合成ｍｉＲ３０配列（ＡＧＴ１０３：ＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＴＡ（配列番号９７）、ＡＧＴ１０３－Ｒ５－１：ＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣ（配列番号９８）、またはＡＧＴ１０３－Ｒ５－２：ＣＡＴＡＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＧＡＣＡＣ（配列番号９９）を含有するレンチウイルスベクターを、ＣＥＭ－ＣＣＲ５細胞に形質導入した。６日後、ＡＰＣコンジュゲートＣＣＲ５抗体を用いたＦＡＣＳ分析によってＣＣＲ５発現を決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって定量化した。ＣＣＲ５レベルは、１００％に設定したＬＶ－対照を用いて％ＣＣＲ５として表した。ＡＧＴ１０３およびＡＧＴ１０３－Ｒ５－１の標的配列は、ＣＣＲ５標的配列５番と同じ領域内にある。ＡＧＴ１０３－Ｒ５－２の標的配列は、ＣＣＲ５標的配列１番と同じである。ＡＧＴ１０３（全ＣＣＲ５の２％）は、ＡＧＴ１０３－Ｒ５－１（全ＣＣＲ５の３９％）、およびＣＣＲ５レベルを低下させないＡＧＴ１０３－Ｒ５－２と比較して、ＣＣＲ５レベルを低下させるのに最も有効である。このデータは本明細書で図１４に実証されている。
（実施例１０：長鎖または短鎖のＷＰＲＥ配列のいずれかを含有するレンチウイルスベクターにおける、合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節）
ベクターの構築。レンチウイルスベクターは、多くの場合、治療用遺伝子または遺伝子構築物の最適な発現のためにＲＮＡ調節エレメントを必要とする。一般的な選択肢は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を使用することである。本発明者らは、全長ＷＰＲＥ：
(5’AATCAACCTCTGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCT-3’)（配列番号３２）
を含有するＡＧＴ１０３を、短縮されたＷＰＲＥエレメント
(5’AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTC-3’)（配列番号８０）
を含有する改変されたＡＧＴ１０３ベクターと比較した。
ベクター配列における長鎖対短鎖ＷＰＲＥエレメントに応じた細胞表面ＣＣＲ５発現の調整に関する機能アッセイ。長鎖または短鎖のＷＰＲＥエレメントを含有するＡＧＴ１０３を、５に等しい感染多重度でＣＥＭ－ＣＣＲ５ Ｔ細胞に形質導入するために使用した。形質導入の６日後に細胞を収集し、細胞表面ＣＣＲ５タンパク質を検出することができるモノクローナル抗体で染色した。この抗体は蛍光マーカーにコンジュゲートされており、その染色の強度は、細胞表面上のＣＣＲ５のレベルに正比例する。対照レンチウイルスは細胞表面ＣＣＲ５レベルに影響を及ぼさず、平均蛍光強度が７３．６単位の単一集団がもたらされた。長鎖ＷＰＲＥエレメントを有する従来のＡＧＴ１０３は、ＣＣＲ５発現を１１単位の平均蛍光強度レベルまで低減させた。短鎖ＷＰＲＥエレメントを組み込むように改変されたＡＧＴ１０３は、平均蛍光強度が１３単位の単一の細胞集団をもたらした。したがって、短鎖ＷＰＲＥエレメントの置換は、細胞表面ＣＣＲ５発現を低減させるＡＧＴ１０３の能力に、ほとんどまたは全く影響しなかった。
図１４に示されるように、長鎖または短鎖のいずれかのＷＰＲＥ配列を含有するＡＧＴ１０３をＣＥＭ－ＣＣＲ５細胞に形質導入した。６日後、ＡＰＣコンジュゲートＣＣＲ５抗体を用いたＦＡＣＳ分析によってＣＣＲ５発現を決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として定量化した。ＣＣＲ５レベルは、１００％に設定したＬＶ－対照を用いて％ＣＣＲ５として表した。ＣＣＲ５レベルの低下は、短鎖ＷＰＲＥ配列（全ＣＣＲ５の５．５％）または長鎖ＷＰＲＥ配列（全ＣＣＲ５の２．３％）のいずれかを有するＡＧＴ１０３でも同様であった。
（実施例１１：ＷＰＲＥ配列ありまたはなしのレンチウイルスベクターにおける合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節）
ベクターの構築。ＣＣＲ５発現のＡＧＴ１０３による下方調節にＷＰＲＥが必要であるかどうかを試験するため、本発明者らは、ＷＰＲＥエレメント配列を有しない改変ベクターを構築した。
ＡＧＴ１０３ベクターに長鎖ＷＰＲＥエレメントを含むか含まないかに応じた細胞表面ＣＣＲ５発現の調整に関する機能アッセイ。ＣＣＲ５発現レベルのＡＧＴ１０３による調整にＷＰＲＥが必要であるかどうかを試験するため、本発明者らは、５に等しい感染多重度を使用し、ＡＧＴ１０３、またはＷＰＲＥを欠いた改変ベクターを、ＣＥＭ－ＣＣＲ５ Ｔ細胞に形質導入した。形質導入の６日後に細胞を収集し、細胞表面ＣＣＲ５タンパク質を認識することができるモノクローナル抗体で染色した。このモノクローナル抗体は蛍光マーカーに直接コンジュゲートされており、その染色の強度は、細胞表面あたりのＣＣＲ５分子の数に正比例する。レンチウイルス対照ベクターは細胞表面ＣＣＲ５レベルに影響を及ぼさず、平均蛍光強度が１６４の均一な集団をもたらした。レンチウイルスベクター（長鎖ＷＰＲＥを有し、またＧＦＰマーカータンパク質を発現するＡＧＴ１０３）、ＧＦＰを欠いているが長鎖ＷＰＲＥエレメントを含有するＡＧＴ１０３、またはＧＦＰおよびＷＰＲＥの両方を欠いているＡＧＴ１０３はすべて、細胞表面ＣＣＲ５発現を調整するのに同様に有効であった。ＧＦＰを除去した後、ＷＰＲＥエレメントありまたはなしのＡＧＴ１０３は、細胞表面ＣＣＲ５発現を調整する能力という点で区別不能であった。
ＧＦＰおよびＷＰＲＥありまたはなしのＡＧＴ１０３をＣＥＭ－ＣＣＲ５細胞に形質導入した。６日後、ＡＰＣコンジュゲートＣＣＲ５抗体を用いたＦＡＣＳ分析によってＣＣＲ５発現を決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として定量化した。ＣＣＲ５レベルは、１００％に設定したＬＶ－対照を用いて％ＣＣＲ５として表した。ＣＣＲ５レベルの低下は、ＷＰＲＥ配列あり（全ＣＣＲ５の０％）またはなし（全ＣＣＲ５の０％）のＡＧＴ１０３で同様であった。このデータは図１６に実証されている。
（実施例１２：レンチウイルスベクターにおける合成マイクロＲＮＡ配列を調節するＣＤ４プロモーターによるＣＣＲ５発現の調節。）
ベクターの構築。ＣＣＲ５、Ｖｉｆ、およびＴａｔの遺伝子発現を抑制するマイクロＲＮＡクラスターを発現させるために代替のプロモーターを代わりに用いることの影響を試験するため、改変バージョンのＡＧＴ１０３を構築した。通常のＥＦ－１プロモーターの代わりに、本発明者らは、配列：
(5’TGTTGGGGTTCAAATTTGAGCCCCAGCTGTTAGCCCTCTGCAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAACAAAGGGCCTAGATTTCCCTTCTGAGCCCCACCCTAAGATGAAGCCTCTTCTTTCAAGGGAGTGGGGTTGGGGTGGAGGCGGATCCTGTCAGCTTTGCTCTCTCTGTGGCTGGCAGTTTCTCCAAAGGGTAACAGGTGTCAGCTGGCTGAGCCTAGGCTGAACCCTGAGACATGCTACCTCTGTCTTCTCATGGCTGGAGGCAGCCTTTGTAAGTCACAGAAAGTAGCTGAGGGGCTCTGGAAAAAAGACAGCCAGGGTGGAGGTAGATTGGTCTTTGACTCCTGATTTAAGCCTGATTCTGCTTAACTTTTTCCCTTGACTTTGGCATTTTCACTTTGACATGTTCCCTGAGAGCCTGGGGGGTGGGGAACCCAGCTCCAGCTGGTGACGTTTGGGGCCGGCCCAGGCCTAGGGTGTGGAGGAGCCTTGCCATCGGGCTTCCTGTCTCTCTTCATTTAAGCACGACTCTGCAGA-3’)（配列番号３０）
を使用し、ＣＤ４糖タンパク質発現のためのＴ細胞特異的プロモーターを置換した。
細胞表面でのＣＣＲ５タンパク質の発現を低減させる効力という点でＥＦ－１およびＣＤ４遺伝子プロモーターを比較する機能アッセイ。通常のＥＦ－１プロモーターの代わりにＣＤ４遺伝子プロモーターを用いることにより改変されたＡＧＴ１０３を、ＣＥＭ－ＣＣＲ５ Ｔ細胞の形質導入に使用した。形質導入の６日後に細胞を収集し、細胞表面ＣＣＲ５タンパク質を認識することができるモノクローナル抗体で染色した。このモノクローナル抗体は蛍光マーカーにコンジュゲートされており、染色強度は、細胞表面ＣＣＲ５タンパク質のレベルに正比例する。対照レンチウイルスの形質導入は、ＣＣＲ５特異的モノクローナル抗体で染色されたＣＥＭ－ＣＣＲ５ Ｔ細胞の集団をもたらし、８１．７単位の平均蛍光強度をもたらした。マイクロＲＮＡを発現させるためにＥＦ－１プロモーターの代わりにＣＤ４遺伝子プロモーターを使用して改変されたＡＧＴ１０３は、平均蛍光強度が１７．３単位にほぼ等しい広い染色の分布を示した。この結果に基づくと、ＥＦ－１プロモーターは、マイクロＲＮＡの発現に関してＣＤ４遺伝子プロモーターと少なくとも同様であり、これより優れている可能性が高い。所望の標的細胞集団に応じて、ＥＦ－１プロモーターは、すべての細胞型で普遍的に活性があり、ＣＤ４プロモーターは、Ｔリンパ球においてのみ活性がある。
ＣＣＲ５、Ｖｉｆ、およびＴａｔの合成マイクロＲＮＡ配列を調節するＣＤ４プロモーターを含有するレンチウイルスベクター（ＡＧＴ１０３）を、ＣＥＭ－ＣＣＲ５細胞に形質導入した。６日後、ＡＰＣコンジュゲートＣＣＲ５抗体を用いたＦＡＣＳ分析によってＣＣＲ５発現を決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として定量化した。ＣＣＲ５レベルは、１００％に設定したＬＶ－対照を用いて％ＣＣＲ５として表した。ＬＶ－ＣＤ４－ＡＧＴ１０３を形質導入した細胞において、ＣＣＲ５レベルは全ＣＣＲ５の１１％であった。これは、ＥＦ１プロモーターを含有するＬＶ－ＡＧＴ１０３で観察されたものと同等である。このデータは図１７に実証されている。
（実施例１３：ＨＩＶ Ｇａｇ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の検出）
細胞および試薬。凍結された生存可能な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をワクチン会社から得た。候補ＨＩＶ治療用ワクチンを試験する早期臨床治験（治験登録：ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＮＣＴ０１３７８１５６）に登録したＨＩＶ＋の個体に由来する代表的な検体を用い、データを得た。「ワクチン接種前」および「ワクチン接種後」の研究のために２つの検体を得た。細胞培養製品、サプリメント、およびサイトカインは商業的供給元から得た。Thompson, et al.（２０１６年）、「DNA/MVA Vaccinationof HIV-1 Infected Participants with Viral Suppression on AntiretroviralTherapy, followed by Treatment Interruption: Elicitation of Immune Responseswithout Control of Re-Emergent Virus.」、PLoS One、１１巻（１０号）：ｅ０１６３１６４頁に記載されているように、Ｇｅｏｖａｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａ ６２Ｂに対する応答について、細胞を試験した。ＨＩＶ－１ Ｇａｇポリタンパク質の全体を表す合成ペプチドをＧｅｏＶａｘから得て、ＨＩＶ（ＧＡＧ）ＵｌｔｒａペプチドセットをＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（www.jpt.com）、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た。ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａは、それぞれ１５アミノ酸長であり、１１個のアミノ酸が重複している、１５０個のペプチドを含有する。これらを化学的に合成し、次いで精製し、液体クロマトグラフィー－質量分析によって分析した。集合的にこれらのペプチドは、ＨＩＶ Ｇａｇポリタンパク質の主要な免疫原性領域を表し、公知のＨＩＶ株の間で５７．８％の平均カバレッジ（coverage）となるようデザインされている。ペプチド配列は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＨＩＶ配列データベース（http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/NEWALIGN/align.html）に基づいている。各ペプチドにつき２５マイクログラムの乾燥したトリフルオロ酢酸塩としてペプチドを提供し、およそ４０マイクロリットルのＤＭＳＯに溶解させ、次いで最終濃度までＰＢＳで希釈する。ＣＤ４および細胞質のＩＦＮガンマを検出するためのモノクローナル抗体を商業的供給源から得て、インターフェロンガンマに対してＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて細胞内染色を行った。ペプチドをＤＭＳＯに再懸濁した。ＤＭＳＯのみの対照条件が含まれる。
ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するための機能アッセイ。凍結ＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清、サプリメント、およびサイトカインを含有するＲＰＭＩ培地に再懸濁した。ワクチン接種前または後に収集した、培養されたＰＢＭＣを、Ｇｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ試薬の存在下で２０時間にわたり、ＤＭＳＯ対照、ＭＶＡ ＧｅｏＶａｘ（細胞あたり１プラーク形成単位に等しい感染多重度）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ＧｅｏＶａｘ（１マイクログラム／ｍｌ）、またはＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物（１マイクログラム／ｍｌ）で処置した。細胞を収集し、洗浄し、固定し、透過処理し、そして細胞表面ＣＤ４または細胞内インターフェロンガンマに特異的なモノクローナル抗体で染色した。染色された細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ分析用フローサイトメーターで分析し、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットでデータをゲーティングした。四角で囲まれた領域内の強調された細胞は二重陽性であり、ＭＶＡまたはペプチドでの刺激後のインターフェロンガンマ発現に基づいてＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞と指定される。四角で囲まれた領域内の数字は、全ＣＤ４のうちＨＩＶ特異的と特定されたもののパーセンテージを示す。ＤＭＳＯまたはＭＶＡに対する強い応答は検出されなかった。ＧｅｏＶａｘのペプチドは、ＪＰＴのＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物と比較してより少ない応答細胞を誘発したが、差異はわずかであり、有意ではなかった。
図１８に示されるように、ワクチン接種前または後のＨＩＶ陽性患者由来のＰＢＭＣを、ＤＭＳＯ（対照）、ＧｅｏＶａｘのＨＩＶ Ｇａｇを発現する組換えＭＶＡ（ＭＶＡ ＧｅｏＶａｘ）、ＧｅｏＶａｘのＧａｇペプチド（Ｐｅｐ ＧｅｏＶａｘ、本明細書ではＧａｇペプチドプール１とも呼ばれる）、またはＪＰＴのＧａｇペプチド（ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａ、本明細書ではＧａｇペプチドプール２とも呼ばれる）で２０時間刺激した。標準的なプロトコールを使用した細胞内染色およびフローサイトメトリーにより、ＩＦＮｇ産生を検出した。フローサイトメトリーデータは、ＣＤ４ Ｔ細胞に対してゲーティングした。四角内に捕捉された数字は、全ＣＤ４ Ｔ細胞のうち、抗原特異的刺激に対するサイトカイン応答に基づいて「ＨＩＶ特異的」と指定されたもののパーセンテージである。
（実施例１４：ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の拡大増殖およびレンチウイルスの形質導入）
ＰＢＭＣを濃縮してＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の割合を増加させ、これらの細胞にＡＧＴ１０３を形質導入して細胞産物ＡＧＴ１０３Ｔを産生するための方法のデザインおよび試験。
治療用ＨＩＶワクチンを受けたＨＩＶ陽性患者のＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）のｅｘ ｖｉｖｏ培養のためのプロトコールをデザインした。この実施例において、治療用ワクチンは、３用量のＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡに続いて、２用量の同じＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ遺伝子を発現するＭＶＡ ６２－Ｂ（改変ワクシニアＡｎｋａｒａ番号６２－Ｂ）からなった。このプロトコールはワクチン製品に特異的でなく、免疫化後のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の十分なレベルしか必要としない。静脈血を収集し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によってＰＢＭＣを精製した。代わりに、抗体カクテルを使用した陽性または陰性選択方法および蛍光活性化または磁性ビーズソーティングによって、ＰＢＭＣまたは規定の細胞トラクション（cellular traction）を調製してもよい。精製されたＰＢＭＣを洗浄し、サプリメント、抗生物質、およびウシ胎仔血清を含有する標準的な培地で培養する。これらの培養物に、ＨＩＶ Ｇａｇポリタンパク質内の可能性のあるＴ細胞エピトープを代表する合成ペプチドのプールを添加した。インターロイキン２およびインターロイキン１２、インターロイキン２およびインターロイキン７、インターロイキン２およびインターロイキン１５の組み合わせを試験した後に選択されたインターロイキン２およびインターロイキン１２のサイトカインを添加することにより、培養物を補完する。ペプチド刺激には、およそ１２日間の培養期間が続く。１２日間の培養中、新鮮培地および新鮮なサイトカインサプリメントをおよそ４日ごとに１回添加した。
ペプチド刺激期間は、ＰＢＭＣ培養物中のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を増加させるようにデザインされている。これらのＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞は、事前の治療的免疫化によって活性化させた。これらは、合成ペプチドへの曝露によって再刺激し、増殖させてもよい。本発明者らの目標は、全体の１％を超えるかまたはこれに等しいＣＤ４ Ｔ細胞がペプチド刺激培養期間の終わりまでにＨＩＶ特異的であることを達成することである。
培養のおよそ１２日目に細胞を洗浄して、残存する材料を除去し、次いで、ＣＤ４ Ｔ細胞表面タンパク質のＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体で修飾された合成ビーズで刺激する。Ｔ細胞のポリクローナル刺激のためのこの十分に確立された方法は、細胞を再活性化し、ＡＧＴ１０３レンチウイルスの形質導入に対して細胞をより感受性にする。レンチウイルス形質導入は培養のおよそ１３日目に行われ、１から５の間の感染多重度を使用する。形質導入後、細胞を洗浄して残存するレンチウイルスベクターを除去し、インターロイキン２およびインターロイキン１２を含有する培地中で培養し、新鮮培地およびサイトカインを培養のおよそ２４日目までおよそ４日ごとに１回添加する。
培養期間の間中、抗レトロウイルス薬のサキナビルをおよそ１００ｎＭの濃度で添加し、あらゆる可能性のあるＨＩＶの増大を抑制する。
培養のおよそ２４日目に細胞を採取し、洗浄し、効力およびリリース（release）アッセイのために試料を取っておき、次いで残りの細胞を凍結保存培地に懸濁してから、ＡＧＴ１０３が形質導入されたおよそ１×１０８個のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を含有する、１用量あたり細胞およそ１×１０１０個の単一のアリコートにおいて凍結する。
２つの交互の効力アッセイのうちの１つにおいて、細胞産物（ＡＧＴ１０３Ｔ）の効力を試験する。効力アッセイ１では、ＣＤ４ Ｔ細胞１個あたりのゲノムコピー（組み込まれたＡＧＴ１０３ベクター配列）の平均数を試験する。産物をリリースするための最小の効力は、ＣＤ４ Ｔ細胞１個あたりおよそ０．５個のゲノムコピーである。このアッセイは、磁性ビーズで標識したモノクローナル抗体を使用してＣＤ３陽性／ＣＤ４陽性Ｔ細胞の陽性選択を行い、全細胞ＤＮＡを抽出し、定量的ＰＣＲ反応を使用してＡＧＴ１０３ベクターに特有の配列を検出することにより行う。効力アッセイ２では、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の亜集団内における組み込まれたＡＧＴ１０３のゲノムコピーの平均数を試験する。このアッセイは、まず、ＨＩＶ Ｇａｇタンパク質を代表する合成ペプチドのプールでＰＢＭＣを刺激することにより達成される。次いで、ＣＤ４ Ｔ細胞に結合することができ、分泌されたインターフェロンガンマサイトカインを捕捉することもできる特異的抗体試薬で細胞を染色する。ＣＤ４陽性／インターフェロンガンマ陽性細胞を磁性ビーズ選択によって捕捉し、全細胞ＤＮＡを調製し、細胞１個あたりのＡＧＴ１０３のゲノムコピー数を定量的ＰＣＲ反応によって決定する。アッセイ２を使用した効力に基づくリリース基準は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞１個あたり０．５個を超えるかまたはこれと等しいゲノムコピーがＡＧＴ１０３細胞産物中に存在することを必要とする。
治療用ＨＩＶワクチンを受けたＨＩＶ陽性患者のＰＢＭＣからＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を濃縮し形質導入するための機能試験。ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度に対する治療用ワクチン接種の影響をペプチド刺激アッセイによって試験した（図１９パネルＢ）。ワクチン接種前のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度は、この代表的個体において０．０３６％であった。ワクチン接種後、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度は、０．０７６％の値までおよそ２倍増加した。細胞質のインターフェロンガンマの蓄積により特定される応答細胞（ＨＩＶ特異的）は、特異的ペプチド刺激後にしか検出されなかった。
本発明者らはまた、ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を濃縮するためのペプチド刺激の後にＡＧＴ１０３形質導入を行った場合、培養物中の全ＣＤ４ Ｔ細胞のうち、ＨＩＶ特異的であり、かつＡＧＴ１０３が形質導入されたものをおよそ１％生成するという本発明者らの目標が達成されるかどうかを試験した。この場合において本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰを参照）を発現する実験用バージョンのＡＧＴ１０３を使用した。図１９、パネルＣでは、ペプチド刺激（ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａ）およびＡＧＴ１０３形質導入後の、ワクチン接種後の培養により、全ＣＤ４ Ｔ細胞の１．１１％がＨＩＶ特異的であり（ペプチド刺激に応答したインターフェロンガンマの発現に基づく）、かつＡＧＴ１０３が形質導入された（ＧＦＰの発現に基づく）ことが実証された。
治療用ＨＩＶワクチン研究における数名の患者を試験して、ペプチド刺激への応答の範囲を評価し、将来のヒトでの臨床治験における遺伝子療法アームに参加するための適格性基準の定義付けを開始した。図１９パネルＤは、４名のワクチン治験参加者のワクチン接種前および後の検体を比較し、これらの参加者におけるＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を示す。３つの事例において、ワクチン接種後の検体は、全ＣＤ４ Ｔ細胞の０．０７６％を超えるかまたはこれと等しいＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の値を示す。この値に達する能力は、ワクチン接種前の検体からは予想されなかった。なぜなら、患者００１－００４および患者００１－００６の両方で、ワクチン接種前のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の値は０．０２％から開始したが、一方ではワクチン接種後のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の最終的な値が０．１２％に達し、他方の個体ではワクチン接種後にこの値が増加していないためである。ＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を増加させるという点でワクチンに良好に応答した同患者３名は、ペプチド刺激および培養後のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の実質的な濃縮も示した。図１９パネルＥに示される３つの事例では、ペプチド刺激およびその後の培養により、それぞれ、全ＣＤ４ Ｔ細胞の２．０７％、０．７２％、または１．５４％がＨＩＶ特異的であった試料が生成された。これらの値は、治療用ＨＩＶワクチンに応答する個体の大多数が、全ＣＤ４ Ｔ細胞のうちおよそ１％が、最終的な細胞産物においてＨＩＶ特異的でありＡＧＴ１０３が形質導入されたものであることを達成する本発明者らの目標を可能にするために、ペプチド刺激に対して十分に大きなｅｘ ｖｉｖｏ応答を有することを示す。
図１９に示されるように、パネルＡには処置のスケジュールが記載されている。パネルＢは、ＰＢＭＣをＧａｇペプチドまたはＤＭＳＯ対照で２０時間にわたって刺激したことを実証する。ＩＦＮガンマ産生をＦＡＣＳによる細胞内染色によって検出した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を分析のためにゲーティングした。パネルＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を拡大増殖し、パネルＡに示される方法を使用してＡＧＴ１０３－ＧＦＰを形質導入したことを実証する。拡大増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞は、サイトカインを全く含まない新鮮培地中で２日間静置し、ＧａｇペプチドまたはＤＭＳＯ対照で２０時間にわたって再刺激した。ＩＦＮガンマ産生およびＧＦＰ発現をＦＡＣＳによって検出した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を分析のためにゲーティングした。パネルＤは、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＩＦＮガンマ陽性、ワクチン接種前および後）の頻度が４名の患者から検出されたことを実証する。パネルＥは、４名の患者由来のワクチン接種後のＰＢＭＣを拡大増殖し、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を調査したことを実証する。
（実施例１５：用量応答）
ベクターの構築。ＡＧＴ１０３の改変バージョンを構築して、漸増するＡＧＴ１０３に対する用量応答および細胞表面ＣＣＲ５レベルに対するその影響を試験した。ＡＧＴ１０３は、ＣＭＶプロモーターの制御下の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを含むように改変した。形質導入された細胞は、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５ ｍｉＲ２１Ｖｉｆ ｍｉＲ１８５ＴａｔマイクロＲＮＡクラスターを発現し、ＧＦＰの発現に起因して緑色光を発する。
漸増するＡＧＴ１０３－ＧＦＰの用量応答およびＣＣＲ５発現の阻害に関する機能アッセイ。細胞あたり０～５の感染多重度を使用して、ＣＥＭ－ＣＣＲ５ Ｔ細胞にＡＧＴ１０３－ＧＦＰを形質導入した。細胞表面ＣＣＲ５に特異的な蛍光コンジュゲート（ＡＰＣ）モノクローナル抗体で、形質導入された細胞を染色した。染色の強度は、細胞表面あたりのＣＣＲ５分子の数に比例する。緑色蛍光の強度は、細胞あたりの組み込まれたＡＧＴ１０３－ＧＦＰコピー数に比例する。
図２０に示されるように、パネルＡは、漸増するＡＧＴ１０３－ＧＦＰに対する用量応答および細胞表面ＣＣＲ５発現に対するその影響を実証する。０．４に等しい感染多重度では、細胞のうち１．０４％だけが、緑色であり（形質導入を示す）、かつ著しく低減したＣＣＲ５発現を示す。１に等しい感染多重度では、ＣＣＲ５ｌｏｗ，ＧＦＰ＋細胞数は、６８．１％に増加する／５に等しい感染多重度では、ＣＣＲ５ｌｏｗ，ＧＦＰ＋細胞数は、９５．７％に増加した。これらのデータは、ＡＧＴ１０３－ＧＦＰの漸増用量と共により低い平均蛍光強度に向かう、ＣＣＲ５染色という点で正規分布の集団を示す図２０のパネルＢにおいて、ヒストグラム形態で提示されている。ＡＧＴ１０３－ＧＦＰの効力は、ＡＧＴ１０３－ＧＦＰの漸増用量に伴うＣＣＲ５発現の阻害パーセンテージを示す図２０のパネルＣにグラフ形態で提示されている。５に等しい感染多重度では、ＣＣＲ５発現レベルが９９％を超えて低下した。
（実施例１６：ＡＧＴ１０３は初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を効率的に形質導入する）
ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターでの初代ＣＤ４ Ｔ細胞の形質導入。緑色蛍光タンパク質マーカー（ＧＦＰ）を含有する改変されたＡＧＴ１０３ベクターを、精製された初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞に形質導入するため、０．２から５の間の感染多重度で使用した。
初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞におけるＡＧＴ１０３の形質導入効率に関する機能アッセイ。磁性ビーズ標識抗体および標準的な手順を使用して、ＣＤ４ Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣ（ＨＩＶ陰性ドナー）から単離した。精製されたＣＤ４ Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでｅｘ ｖｉｖｏにて刺激し、ＡＧＴ１０３形質導入前にインターロイキン２を含有する培地で１日培養した。レンチウイルスベクター用量（感染多重度）と形質導入効率との間の関係は、図２１パネルＡに実証されており、０．２に等しい感染多重度ではＣＤ４陽性Ｔ細胞のうち９．２７％にＡＧＴ１０３が形質導入され、５に等しい感染多重度ではＣＤ４陽性Ｔ細胞の６３．１％にＡＧＴ１０３が形質導入されて、この値が増加したことが示されている。初代ＣＤ４陽性Ｔ細胞の効率的な形質導入を達成することに加えて、細胞あたりのゲノムコピー数を定量化することも必要である。図２１パネルＢでは、細胞あたりのゲノムコピー数を決定するために、いくつかの感染多重度で形質導入した初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞の全細胞ＤＮＡを定量的ＰＣＲによって試験した。０．２に等しい感染多重度では、パネルＡにおける９．２７％のＧＦＰ陽性ＣＤ４ Ｔ細胞と十分一致する、細胞１個あたり０．０９６個のゲノムコピーが測定された。１に等しい感染多重度では、細胞１個あたり０．６９１個のゲノムコピーが生成され、５に等しい感染多重度では、細胞１個あたり１．２４５個のゲノムコピーが生成された。
図２１に示されるように、ＰＢＭＣから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとＩＬ－２で１日間刺激し、様々な濃度でＡＧＴ１０３を形質導入した。２日後にビーズを除去し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を収集した。パネルＡに示されるように、形質導入された細胞（ＧＦＰ陽性）の頻度をＦＡＣＳによって検出した。パネルＢに示されるように、細胞あたりのベクターコピー数をｑＰＣＲによって決定した。５の感染多重度（ＭＯＩ）では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の６３％に、細胞あたり平均１個のベクターコピーが形質導入された。
（実施例１７：ＡＧＴ１０３は初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製を阻害する）
初代ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞にＡＧＴ１０３を形質導入することによる細胞のＨＩＶ感染からの保護。治療用レンチウイルスＡＧＴ１０３を、初代ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に形質導入するため、細胞あたり０．２から５の間の感染多重度で使用した。次いで形質導入された細胞に、侵入のために細胞表面ＣＣＲ５を必要としないＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ株ＮＬ４．３を負荷した。このアッセイは、初代ＣＤ４陽性Ｔ細胞における増殖性感染を防止するという点での、ＨＩＶのＶｉｆおよびＴａｔ遺伝子に対するマイクロＲＮＡの効力を試験するが、感染した初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞から放出されるＨＩＶの量を検出するためには、間接的な方法を使用する。
初代ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞のＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ感染からのＡＧＴ１０３による保護に関する機能アッセイ。磁性ビーズ標識抗体および標準的な手順を使用して、ＣＤ４ Ｔ細胞をヒトＰＢＭＣ（ＨＩＶ陰性ドナー）から単離した。精製されたＣＤ４ Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでｅｘ ｖｉｖｏにて刺激し、０．２から５の間の感染多重度を使用して、ＡＧＴ１０３形質導入前にインターロイキン２を含有する培地で１日培養した。形質導入の２日後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養物に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように操作されたＨＩＶ株ＮＬ４．３を負荷した。形質導入しＨＩＶに曝露した初代ＣＤ４ Ｔ細胞培養物を７日間維持してから、ＨＩＶを含有する無細胞培養液を収集した。この無細胞培養液を使用して、高度に許容性のＴ細胞株Ｃ８１６６を２日間にわたって感染させた。ＨＩＶに感染したＣ８１６６細胞の割合を、フローサイトメトリーでＧＦＰの蛍光を検出することによって決定した。模擬レンチウイルス感染では、感染多重度０．１の用量のＮＬ４．３ ＨＩＶについて、Ｃ８１６６ Ｔ細胞の１５．４％において増殖性感染を確立することができる量のＨＩＶが培養液中に放出された。感染多重度０．２の用量のＡＧＴ１０３について、Ｃ８１６６細胞のＨＩＶ感染に関するこの値は５．３％に低減し、１に等しい感染多重度のＡＧＴ１０３では、Ｃ８１６６ Ｔ細胞の３．１９％しかＨＩＶに感染しなかった。Ｃ８１６６感染は、５に等しい感染多重度を使用したＡＧＴ１０３形質導入後に、さらに０．６２％に低減した。形質導入に使用されるＡＧＴ１０３の量と、培養培地中に放出されるＨＩＶの量との間には、明らかな用量応答関係がある。
図２２に示されるように、ＰＢＭＣから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとＩＬ－２で１日間刺激し、様々な濃度（ＭＯＩ）でＡＧＴ１０３を形質導入した。２日後にビーズを除去し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を０．１ＭＯＩのＨＩＶ ＮＬ４．３－ＧＦＰに感染させた。２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＩＬ－２（３０Ｕ／ｍｌ）と共に７日間培養した。培養の最後に上清を収集して、ＨＩＶ許容性細胞株Ｃ８１６６を２日間にわたって感染させた。ＨＩＶに感染したＣ８１６６細胞（ＧＦＰ陽性）をＦＡＣＳによって検出した。Ｃ８１６６細胞の感染低下によって観察されるように、ＡＧＴ１０３の感染多重度の増加に伴い、生存可能なＨＩＶが低減した（ＭＯＩ ０．２＝６５．６％、ＭＯＩ １＝７９．３％、およびＭＯＩ ５＝９６％）。
（実施例１８：ＡＧＴ１０３は初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をＨＩＶ誘導性枯渇から保護する）
ＨＩＶ媒介性細胞病理および細胞枯渇から保護するための初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞へのＡＧＴ１０３の形質導入。健康なＨＩＶ陰性ドナーからＰＢＭＣを得て、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、次いでインターロイキン２を含有する培地で１日培養してから、０．２から５の間の感染多重度を使用したＡＧＴ１０３の形質導入を行った。
ＨＩＶ媒介性細胞病理からの初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞のＡＧＴ１０３による保護に関する機能アッセイ。ＡＧＴ１０３を形質導入した初代ヒトＣＤ４ Ｔ細胞を、細胞進入のためにＣＣＲ５を必要としないＨＩＶ ＮＬ ４．３株（ＣＸＣＲ４向性）に感染させた。ＣＸＣＲ４向性ＮＬ ４．３を使用する場合、ＨＩＶ複製に対するＶｉｆおよびＴａｔマイクロＲＮＡの影響のみが試験されている。ＨＩＶ ＮＬ ４．３の用量は感染多重度０．１であった。ＨＩＶ感染の１日後、細胞を洗浄して残存ウイルスを除去し、インターロイキン２を加えた培地で培養した。１４日間の培養中３日ごとに細胞を収集し、次いで、ＣＤ４に特異的であり、かつ蛍光マーカーに直接コンジュゲートされたモノクローナル抗体で染色して、ＰＢＭＣ中のＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合の測定を可能にした。無処置のＣＤ４ Ｔ細胞、または対照レンチウイルスベクターを形質導入したＣＤ４ Ｔ細胞は、ＨＩＶ負荷に対して高度に感受性であり、ＰＢＭＣ中のＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合は、培養１４日目までに１０％未満に下がった。対照的に、ＡＧＴ１０３には、ＨＩＶ負荷による細胞枯渇の防止に対して用量依存的効果があった。感染多重度０．２のＡＧＴ１０３用量では、培養１４日目までにＰＢＭＣの２０％超がＣＤ４ Ｔ細胞であったが、この値は、５に等しい感染多重度のＡＧＴ１０３用量では、ＰＢＭＣの５０％超が培養１４日目までにＣＤ４陽性Ｔ細胞となるまで増加した。繰り返すが、ＡＧＴ１０３には、ヒトＰＢＭＣにおけるＨＩＶ細胞変性に対して明らかな用量応答効果がある。
図２３に示されるように、ＰＢＭＣをＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとＩＬ－２で１日間刺激し、様々な濃度（ＭＯＩ）でＡＧＴ１０３を形質導入した。２日後にビーズを除去し、細胞を０．１ＭＯＩのＨＩＶ ＮＬ４．３に感染させた。２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＩＬ－２（３０Ｕ／ｍｌ）と共に培養した。細胞を３日ごとに収集し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度をＦＡＣＳによって分析した。ＨＩＶに１４日間曝露した後、ＬＶ－対照を形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞は８７％低減し、ＡＧＴ１０３ ＭＯＩ０．２では６０％低減し、ＡＧＴ１０３ ＭＯＩ１では３７％低減し、ＡＧＴ１０３ ＭＯＩ５では１７％低減した。
（実施例１９：ＨＩＶ特異性について濃縮され、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰが形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団の生成）
ＨＩＶに対する治療用ワクチン接種がＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の分布に及ぼした影響は最小限であった。図２４Ａに示されるように、ＣＤ４ Ｔ細胞集団は、分析的フローサイトメトリードットプロットの左上象限に示されており、一連のワクチン接種後に全Ｔ細胞の５２％から５７％に変化している。これらは代表的なデータである。
ＨＩＶ治療用ワクチン治験の参加者由来の末梢血単核細胞を、培地＋／－インターロイキン２／インターロイキン１２または＋／－インターロイキン７／インターロイキン１５において１２日間にわたり培養した。一部の培養物は、Ｔ細胞刺激のためのエピトープペプチドの供給源としての、ＨＩＶ－１のｐ５５ Ｇａｇタンパク質全体を表す重複するペプチド（ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物）で刺激した。これらのペプチドは１０～２０アミノ酸長であり、ＨＩＶ－１ ＢａＬ株のＧａｇ前駆体タンパク質（ｐ５５）の全体を表すようにそれらの長さの２０～５０％が重複している。個々のペプチドの組成および配列は、主な循環ＨＩＶ配列の領域変動を補償するために、または詳細な配列情報がこの療法を受けている個々の患者に関して利用可能である場合に、調整することができる。培養終了時に、細胞を回収し、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８モノクローナル抗体で染色し、ＣＤ３＋集団をゲーティングし、ここに表示した。ワクチン接種前または後のいずれの試料についても、ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物による刺激は培地対照と同様であり、ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物は細胞に対して毒性ではなく、ポリクローナルマイトジェンとして作用していなかったことが示された。この分析の結果は図２４Ｂに見出すことができる。
ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物およびインターロイキン２／インターロイキン１２は、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の最適な拡大増殖をもたらした。図２４Ｃの上パネルに示されるように、ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物に曝露されたワクチン接種後の検体では、サイトカイン（インターフェロンガンマ）を分泌する細胞が増加した。ワクチン接種前の試料では、抗原性ペプチドへの曝露の結果として、サイトカイン分泌細胞が０．４３から０．６９％に増加した。対照的に、ワクチン接種後の試料は、ペプチド刺激の結果として、全ＣＤ４ Ｔ細胞のうち０．６２から１．７６％へのサイトカイン分泌細胞の増加を示した。これらのデータは、ＨＩＶ抗原へのＣＤ４ Ｔ細胞の応答に対するワクチン接種の強い影響を実証する。
最後に、抗原で拡大増殖したＣＤ４ Ｔ細胞にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰを形質導入すると、ＨＩＶの機能的治癒の一環として患者に注入するために必要であるＨＩＶ特異的でＨＩＶ耐性のヘルパーＣＤ４ Ｔ細胞が産生された（他の様々な態様および実施形態によれば、ＡＧＴ１０３単独が使用される；例えば、臨床的実施形態はＣＭＶ－ＧＦＰセグメントを含まなくてもよい）。図２４Ｄの上パネルは、培養物中のＣＤ４＋Ｔ細胞集団を分析した結果を示す。図２４Ｄのｘ軸は、個々の細胞にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰが形質導入されたことを示す、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発光を示す。図２４Ｄに示されるように、ワクチン接種後の試料では、全ＣＤ４ Ｔ細胞のうち、両方のサイトカインを分泌するものが１．１１％回収され、これらの細胞がＨＩＶ抗原に特異的に応答し、またＡＧＴ１０３／ＣＭＶ－ＧＦＰが形質導入されていることが示された。これが標的細胞集団であり、注入およびＨＩＶの機能的治癒のために意図される臨床産物である。抗原刺激およびその後のｅｘ ｖｉｖｏ培養のポリクローナル拡大増殖期の間に細胞拡大増殖の効率により、４×１０８個の抗原特異的な、レンチウイルスを形質導入したＣＤ４ Ｔ細胞が産生され得る。これは細胞産生の標的を４倍上回り、これにより、抗原特異的でＨＩＶ耐性のＣＤ４ Ｔ細胞が、血液１マイクロリットルあたり細胞およそ４０個、または全循環ＣＤ４ Ｔ細胞の約５．７％という数が達成できるであろう。
以下の表４は、開示されているベクターおよび方法を使用した、ＨＩＶ特異的でＨＩＶ耐性のＣＤ４ Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ産生の結果を示す。
Figure 0007162895000015
（実施例２０：ＨＩＶの処置のための臨床研究）
ＡＧＴ１０３Ｔは、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターも形質導入されている、＞５×１０７個のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を含有する、遺伝子改変された自己ＰＢＭＣである。
第Ｉ相臨床治験では、ｃＡＲＴを受けている間に、ＨＩＶ感染、血液１ｍｍ３あたりＣＤ４＋Ｔ細胞数＞６００個の細胞、および血漿１ｍｌあたり２００個未満のコピーの安定なウイルス抑制が確認された、成人の研究参加者に、ｅｘ ｖｉｖｏで改変された自己ＣＤ４ Ｔ細胞（ＡＧＴ１０３Ｔ）を注入することの安全性および実現可能性を試験する。研究参加者はすべて、第Ｉ相臨床治験の間、各自の標準的な抗レトロウイルス薬物適用を継続して受けることになる。最大４０名の研究参加者が、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質を発現する組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ｒＭＶＡ）の筋肉内注射による２用量を８週間おいて受ける。第２の免疫化の７～１０日後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のために血液試料を収集し、ＨＩＶ－１ Ｇａｇポリタンパク質を代表する重複する合成ペプチドのプールによる刺激に応答するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を測定する。Ｇａｇ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度の測定に基づき、ワクチン応答者のうち上位半数の被験体を遺伝子療法アームに登録し、応答者のうち下位半数の被験体は研究を継続しない。上位の応答者のカットオフは、全ＣＤ４ Ｔ細胞のうち≧０．０６５％のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度であることが予測される。本発明者らの治験の遺伝子療法アームに登録された被験体に白血球除去を施し、これに続いて、ｅｘ ｖｉｖｏで培養し、ＨＩＶ Ｇａｇペプチドとインターロイキン２およびインターロイキン１２で１２日間刺激し、次いでＣＤ３／ＣＤ２８二重特異性抗体で修飾されたビーズで再度刺激した、ＰＢＭＣの精製を行う（Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離または抗体による陰性選択を使用する）。ｅｘ ｖｉｖｏ培養中の自己ＨＩＶの出現を防止するため、抗レトロウイルス薬のサキナビルを１００ｎＭで含める。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の１日後、１から１０の間の感染多重度でＡＧＴ１０３を細胞に形質導入する。形質導入された細胞をさらに７～１４日間培養し、この間それらはポリクローナル増殖によって拡大増殖する。培養期間は、細胞を採取および洗浄し、効力および安全性リリースアッセイのためにアリコートを取っておき、残りの細胞を凍結保存培地に再懸濁することによって終了する。単回用量は、≦１×１０１０個の自己ＰＢＭＣである。効力アッセイは、インターフェロンガンマを発現することによりペプチド刺激に応答するＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を測定する。他のリリース基準としては、ＨＩＶ特異的でありＡＧＴ１０３も形質導入されているＣＤ４ Ｔ細胞が０．５×１０７個以上生成物に含まれていなければならないことが挙げられる。別のリリース基準は、細胞あたりのＡＧＴ１０３ゲノムコピー数が３を超えてはならないことである。ＡＧＴ１０３Ｔ注入の５日前、被験体は、１用量のブスルフラム（busulfuram）（またはＣｙｔｏｘａｎ）の馴化レジメンの後、遺伝子改変されたＣＤ４ Ｔ細胞を含有する≦１×１０１０個のＰＢＭＣの注入を受ける。
第ＩＩ相研究では、ＡＧＴ１０３Ｔ細胞療法の有効度を評価する。第ＩＩ相研究の参加者には、本発明者らの第Ｉ相研究に既に登録しており、遺伝子改変された自己のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の成功裏かつ安定な生着を有し、有効度評価（１．３．）に記載されるようにモニタリングされるパラメータの肯定的な変化として定義される臨床応答を有すると判断された個体が含まれる。研究参加者は、各自の既存の抗レトロウイルス薬物適用のレジメンにマラビロクを加えるよう求められる。マラビロクは、ＣＣＲ５レベルの低下を目的とする遺伝子療法の有効性を増強するＣＣＲ５アンタゴニストである。マラビロクレジメンが実施されたら、被験体は、それまでの抗レトロウイルス薬物レジメンを中止し、２８日間にわたり、または２回の連続した毎週の採血時の血漿中ウイルスＲＮＡレベルが１ｍｌあたり１０，０００を超えるまで、マラビロク単独療法のみを維持するよう求められる。ウイルス血症が持続的に高い場合、参加者は、各自のＨＩＶケアの医師の推奨に従ってマラビロクありまたはなしで、各自の元の抗レトロウイルス薬物レジメンに戻るよう要請される。
マラビロク単独療法中に＞２８日間にわたって参加者のＨＩＶが抑制されたままである場合（血漿１ｍｌあたり２，０００未満のｖＲＮＡコピー）、４週間にわたってマラビロクの投薬を徐々に低減させるよう求められ、その後さらに２８日間にわたって集中的なモニタリングが行われる。マラビロク単独療法によるＨＩＶの抑制が維持された被験体は、機能的治癒を有するとみなされる。マラビロク退薬後でさえＨＩＶの抑制が維持される被験体も、機能的治癒を有する。６か月にわたって毎月モニタリングし、その後はさほど集中的でないモニタリングにより、機能的治癒の耐久性が確立される。
患者の選択
組み入れ基準：
・ 年齢１８～６０歳。
・ 研究登録前に記録されたＨＩＶ感染。
・ 研究期間中に抗レトロウイルス薬物レジメンを変更しないこと（医療上の指示がある場合を除く）を含め、研究により強制される評価に従う意志がなければならない。
・ １立方ミリメートルあたりＣＤ４＋Ｔ細胞数＞５００個の細胞（細胞／ｍｍ３）
・ ＞４００個の細胞／ｍｍ３のＣＤ４＋Ｔ細胞最下点
・ ＨＩＶウイルス量＜１，０００コピー／ミリリットル（ｍＬ）
除外基準：
・ 何らかのウイルス肝炎
・ 急性ＨＩＶ感染
・ ＨＩＶウイルス量＞１，０００コピー／ｍＬ
・ 活発または最近（過去６か月）のＡＩＤＳを定義する合併症
・ 研究登録から１２週間以内におけるＨＩＶ薬物適用の何らかの変化
・ 処置に成功した皮膚の基底細胞癌を除く、少なくとも５年間にわたって寛解していないがんまたは悪性疾患
・ ＮＹＨＡグレード３もしくは４のうっ血性心不全または制御不良の狭心症もしくは不整脈の現在の診断
・ 出血障害歴
・ 過去３０日間の慢性的なステロイドの使用
・ 妊娠中または授乳中
・ 能動的な薬物またはアルコールの乱用
・ 過去３０日間の深刻な病気
・ 別の臨床治験に現在参加しているか、または何らかの以前の遺伝子療法
安全性評価
・ 急性注入反応
・ 注入後安全性追跡調査
有効度評価 － 第Ｉ相
・ 改変ＣＤ４ Ｔ細胞の数および頻度。
・ 改変ＣＤ４ Ｔ細胞の耐久性。
・ メモリーＴ細胞機能の尺度としてのＧａｇペプチド再刺激に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ応答（ＩＣＳアッセイ）。
・ ワクチン接種前および後の時点と比較した多機能性の抗ＨＩＶ ＣＤ８ Ｔ細胞応答。
・ ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に二重スプライシングされたＨＩＶ ｍＲＮＡを作るＣＤ４ Ｔ細胞の頻度。
有効度評価 － 第ＩＩ相
・ 遺伝子改変ＣＤ４ Ｔ細胞の数および頻度。
・ マラビロク単独療法によるウイルス抑制の維持（１ｍｌあたり＜２，０００個のｖＲＮＡコピー、ただし２回連続した毎週の採血で１ｍｌあたりのｖＲＮＡコピーが５×１０４を超えない場合は許容される）。
・ マラビロク投与中および退薬後のウイルス抑制の持続。
・ 安定なＣＤ４ Ｔ細胞数。
ＡＧＴ１０３Ｔは、≧５×１０７個のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を含有し、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターも形質導入されている、最大１×１０１０個の遺伝子改変された自己ＣＤ４＋Ｔ細胞からなる。第Ｉ相臨床治験では、ｃＡＲＴを受けている間に、ＨＩＶ感染、血液１ｍｍ３あたりＣＤ４＋Ｔ細胞数＞６００個の細胞、および血漿１ｍｌあたり２００個未満のコピーの安定なウイルス抑制が確認された、成人の研究参加者において、ｅｘ ｖｉｖｏで改変された自己ＣＤ４ Ｔ細胞（ＡＧＴ１０３Ｔ）を注入することの安全性および実現可能性を試験する。最大４０名の研究参加者が、ＨＩＶ Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質を発現する組換え改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ｒＭＶＡ）の筋肉内注射による２回の用量を８週間おいて受ける。第２の免疫化の７～１０日後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のために血液試料を収集し、ＨＩＶ－１ Ｇａｇポリタンパク質を代表する重複する合成ペプチドのプールによる刺激に応答するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を測定する。Ｇａｇ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度の測定に基づき、ワクチン応答者のうち上位半数の被験体を遺伝子療法アームに登録し、応答者のうち下位半数の被験体は研究を継続しない。上位の応答者のカットオフは、全ＣＤ４ Ｔ細胞のうち≧０．０６５％のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度であることが予測される。本発明者らの治験の遺伝子療法アームに登録された被験体に白血球除去を施し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を陰性選択によって濃縮する。濃縮されたＣＤ４サブセットをＣＤ４陰性サブセットの細胞数の１０％と混合して、供給源および抗原提示細胞を提供する。濃縮されたＣＤ４ Ｔ細胞をＨＩＶ Ｇａｇペプチドとインターロイキン２およびインターロイキン１２で１２日間刺激し、次いで、ＣＤ３／ＣＤ２８二重特異性抗体で修飾されたビーズで再度刺激する。ｅｘ ｖｉｖｏ培養中の自己ＨＩＶの出現を防止するため、抗レトロウイルス薬のサキナビルを１００ｎＭで含める。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の１日後、１から１０の間の感染多重度でＡＧＴ１０３を細胞に形質導入する。形質導入された細胞をさらに７～１４日間培養し、この間それらはポリクローナル増殖によって拡大増殖する。培養期間は、細胞を採取および洗浄し、効力および安全性リリースアッセイのためにアリコートを取っておき、残りの細胞を凍結保存培地に再懸濁することによって終了する。単回用量は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットが濃縮された≦１×１０１０個の自己細胞である。効力アッセイは、インターフェロンガンマを発現することによりペプチド刺激に応答するＣＤ４ Ｔ細胞の頻度を測定する。他のリリース基準としては、ＨＩＶ特異的でありＡＧＴ１０３も形質導入されているＣＤ４ Ｔ細胞が０．５×１０７個以上生成物に含まれていなければならないことが挙げられる。別のリリース基準は、細胞あたりのＡＧＴ１０３ゲノムコピー数が３を超えてはならないことである。ＡＧＴ１０３Ｔ注入の５日前、被験体は、１用量のブスルフラム（またはＣｙｔｏｘａｎ）の馴化レジメンの後、≦１×１０１０個の濃縮され遺伝子改変されたＣＤ４ Ｔ細胞の注入を受ける。
第ＩＩ相研究では、ＡＧＴ１０３Ｔ細胞療法の有効度を評価する。第ＩＩ相研究の参加者には、本発明者らの第Ｉ相研究に既に登録しており、遺伝子改変された自己のＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の成功裏かつ安定な生着を有し、有効度評価（１．３．）に記載されるようにモニタリングされるパラメータの肯定的な変化として定義される臨床応答を有すると判断された個体が含まれる。研究参加者は、各自の既存の抗レトロウイルス薬物適用のレジメンにマラビロクを加えるよう求められる。マラビロクは、ＣＣＲ５レベルの低下を目的とする遺伝子療法の有効性を増強するＣＣＲ５アンタゴニストである。マラビロクレジメンが実施されたら、被験体は、それまでの抗レトロウイルス薬物適用のレジメンを中止し、２８日間にわたり、または２回の連続した毎週の採血時の血漿中ウイルスＲＮＡレベルが１ｍｌあたり１０，０００を超えるまで、マラビロク単独療法のみを維持するよう求められる。ウイルス血症が持続的に高い場合、参加者は、各自のＨＩＶケアの医師の推奨に従ってマラビロクありまたはなしで、各自の元の抗レトロウイルス薬物レジメンに戻るよう要請される。
マラビロク単独療法中に＞２８日間にわたって参加者のＨＩＶが抑制されたままである場合（血漿１ｍｌあたり２，０００未満のｖＲＮＡコピー）、４週間にわたってマラビロクの投薬を徐々に低減させるよう求められ、その後さらに２８日間にわたって集中的なモニタリングが行われる。マラビロク単独療法によるＨＩＶの抑制が維持された被験体は、機能的治癒を有するとみなされる。マラビロク退薬後でさえＨＩＶの抑制が維持される被験体も、機能的治癒を有する。６か月にわたって毎月モニタリングし、その後はさほど集中的でないモニタリングにより、機能的治癒の耐久性が確立される。
。
Figure 0007162895000016
Figure 0007162895000017
Figure 0007162895000018
Figure 0007162895000019
Figure 0007162895000020
Figure 0007162895000021
Figure 0007162895000022
Figure 0007162895000023
Figure 0007162895000024
Figure 0007162895000025
Figure 0007162895000026
Figure 0007162895000027
Figure 0007162895000028
Figure 0007162895000029
Figure 0007162895000030
Figure 0007162895000031
Figure 0007162895000032
Figure 0007162895000033
Figure 0007162895000034
Figure 0007162895000035
Figure 0007162895000036
Figure 0007162895000037
Figure 0007162895000038
Figure 0007162895000039
Figure 0007162895000040
Figure 0007162895000041
Figure 0007162895000042
Figure 0007162895000043
Figure 0007162895000044
Figure 0007162895000045
Figure 0007162895000046
Figure 0007162895000047
Figure 0007162895000048
Figure 0007162895000049
Figure 0007162895000050
Figure 0007162895000051
Figure 0007162895000052
Figure 0007162895000053
Figure 0007162895000054
Figure 0007162895000055
Figure 0007162895000056
Figure 0007162895000057
Figure 0007162895000058
Figure 0007162895000059
Figure 0007162895000060
Figure 0007162895000061
Figure 0007162895000062
Figure 0007162895000063
Figure 0007162895000064
Figure 0007162895000065
Figure 0007162895000066
Figure 0007162895000067
Figure 0007162895000068
Figure 0007162895000069
Figure 0007162895000070
Figure 0007162895000071
Figure 0007162895000072
Figure 0007162895000073
Figure 0007162895000074
Figure 0007162895000075
Figure 0007162895000076
Figure 0007162895000077
Figure 0007162895000078
Figure 0007162895000079
以上、本発明の好ましい実施形態のうちのいくつかを記載し、具体的に例示したが、本発明がこのような実施形態に限定されることは意図していない。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、これに様々な改変を行ってよい。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＨＩＶに感染した細胞を処置する方法であって、
（ａ）ｅｘ ｖｉｖｏで行われる、ＨＩＶに感染した被験体から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を治療有効量の刺激剤と接触させるステップと、
（ｂ）少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系を前記ＰＢＭＣにｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップであって、前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む、ステップと、
（ｃ）少なくとも１日間にわたって、形質導入された前記ＰＢＭＣを培養するステップとを含む、方法。
（項目２）
前記ＰＢＭＣからＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性選択するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの物理的選択方法を使用して陽性選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
形質導入された前記ＰＢＭＣを被験体に注入するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記被験体がヒトである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記刺激剤がペプチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ペプチドがｇａｇペプチドを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記刺激剤がワクチンを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ワクチンがＨＩＶワクチンを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ＨＩＶワクチンが、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡと、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡとを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＨＩＶ ＲＮＡ配列が、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ Ｔａｔ配列、またはそれらのバリアントを含む、項目１または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、項目１または１１に記載の方法。
（項目１４）
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、マイクロＲＮＡクラスターを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、配列番号１と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有するマイクロＲＮＡを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、配列番号１を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、
ａ．配列番号２と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性、または
ｂ．配列番号３と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％のパーセント同一性
を有するマイクロＲＮＡを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、配列番号２または配列番号３を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記マイクロＲＮＡクラスターが、配列番号３１と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のパーセント同一性を有する配列を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記マイクロＲＮＡクラスターが、配列番号３１を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
被験体においてＨＩＶ感染を処置する方法であって、
（ａ）有効量の第１の刺激剤で前記被験体を免疫化するステップと、
（ｂ）前記被験体から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップと、
（ｃ）前記ＰＢＭＣを治療有効量の第２の刺激剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させるステップと、
（ｄ）少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系を前記ＰＢＭＣにｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップと、
（ｅ）少なくとも１日間にわたって、形質導入された前記ＰＢＭＣを培養するステップとを含む、方法。
（項目２２）
前記ＰＢＭＣからＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性選択するステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの物理的選択方法を使用して陽性選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
形質導入された前記ＰＢＭＣを前記被験体に注入するステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の刺激剤および前記第２の刺激剤が同じである、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の刺激剤および前記第２の刺激剤のうちの少なくとも１つが、ＨＩＶワクチンを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
前記ＨＩＶワクチンが、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ウイルス送達系がレンチウイルス粒子を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２９）
前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡ、またはＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
被験体においてＨＩＶ感染を処置する方法であって、
（ａ）有効量の第１の刺激剤で前記被験体を免疫化するステップと、
（ｂ）前記被験体から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップと、
（ｃ）前記ＰＢＭＣからＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性選択するステップと、
（ｄ）前記ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を治療有効量の第２の刺激剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させるステップと、
（ｄ）少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系を前記ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞にｅｘ ｖｉｖｏで形質導入するステップと、
（ｅ）少なくとも１日間にわたって、形質導入された前記ＰＢＭＣを培養するステップとを含む、方法。

Claims (34)

  1. ＨＩＶに感染した細胞を処置する方法において使用するための、形質導入された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む組成物であって、前記形質導入されたＰＢＭＣは、
    （ａ）ＨＩＶに感染した被験体からＰＢＭＣを得るステップであって、前記被験体が、治療有効量のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を濃縮する第１の刺激剤で過去に免疫化されている、ステップと、
    （ｂ）前記ＰＢＭＣを、治療有効量のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を濃縮する第２の刺激剤と接触させる、または接触させたステップであって、前記接触がｅｘ ｖｉｖｏで行われる、ステップと、
    （ｃ）ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、前記ＰＢＭＣからＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性選択する、または陽性選択したステップと、
    （ｄ）ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系を用いて前記ＰＢＭＣに形質導入する、または形質導入したステップであって、少なくとも１つのコードされる遺伝子エレメントが、
    配列番号３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列；あるいは
    （ｉ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列、および、（ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列と、配列番号１１１と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列；あるいは
    以下、（ｉｉｉ）マイクロＲＮＡ骨格に組み込まれた配列番号９７と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列、（ｉｖ）マイクロＲＮＡ骨格に組み込まれた配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列、および（ｖ）マイクロＲＮＡ骨格に組み込まれた配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列の全て
    を含む、ステップであって、
    ここで、前記少なくとも１つの遺伝子エレメントは、発現した場合、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害すること、ならびに、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列およびＨＩＶ Ｔａｔ配列をターゲティングすることができる、ステップと、
    （ｅ）少なくとも１日間にわたって、前記形質導入されたＰＢＭＣを培養する、または培養したステップ
    とを含む、方法によって産生される、組成物。
  2. 前記ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＰＢＭＣから少なくとも１つの物理的選択方法を使用して陽性選択される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記形質導入されたＰＢＭＣが、約１～約３５日間までにわたって培養される、請求項１に記載の組成物。
  4. 被験体に注入される、または注入されたことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記被験体がヒトである、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記第１の刺激剤および前記第２の刺激剤の少なくとも１つがペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ペプチドがｇａｇペプチドを含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記第１の刺激剤および前記第２の刺激剤の少なくとも１つが、ワクチンを含む、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記ワクチンがＨＩＶワクチンを含む、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記ＨＩＶワクチンが、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントを含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記第１の刺激剤および前記第２の刺激剤が同じである、請求項１に記載の組成物。
  12. 前記ウイルス送達系がレンチウイルス粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、発現した場合にＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、配列番号３１、配列番号１または配列番号９７のいずれか１つを含む場合、前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、発現した場合にケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
  16. 前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、マイクロＲＮＡクラスターを含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記マイクロＲＮＡクラスターが、
    配列番号３１；または
    配列番号１、配列番号２および配列番号１１１の少なくとも２つ；または
    配列番号９７、配列番号６および配列番号７の各々
    を含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 被験体においてＨＩＶ感染を処置する方法において使用するための、形質導入された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む組成物であって、前記形質導入されたＰＢＭＣが、
    （ａ）前記被験体から白血球を取り出す、または取り出したステップであって、前記被験体が、治療有効量のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を濃縮する第１の刺激剤で過去に免疫化されているステップと、
    （ｂ）前記白血球からＰＢＭＣをｅｘ ｖｉｖｏで精製する、または精製したステップと、
    （ｃ）前記ＰＢＭＣからＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を陽性選択する、または陽性選択したステップと、
    （ｄ）前記ＰＢＭＣを治療有効量のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を濃縮する第２の刺激剤とｅｘ ｖｉｖｏで接触させる、または接触させたステップと、
    （ｅ）少なくとも１つの遺伝子エレメントをコードするウイルス送達系を用いて前記ＰＢＭＣにｅｘ ｖｉｖｏで形質導入する、または形質導入したステップであって、前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、
    配列番号３１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列；あるいは
    （ｉ）配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列、および、（ｉｉ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列と、配列番号１１１と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列；あるいは
    以下、（ｉｉｉ）マイクロＲＮＡ骨格に組み込まれた配列番号９７と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列、（ｉｖ）マイクロＲＮＡ骨格に組み込まれた配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列、および（ｖ）マイクロＲＮＡ骨格に組み込まれた配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を含む配列の全て
    を含む、ステップであって、
    ここで、前記少なくとも１つの遺伝子エレメントは、発現した場合、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害すること、ならびに、ＨＩＶ Ｖｉｆ配列およびＨＩＶ Ｔａｔ配列をターゲティングすることができる、ステップと、
    （ｆ）少なくとも１日間にわたって、形質導入された前記ＰＢＭＣを培養する、または培養したステップ
    とを含む、方法によって産生される、組成物。
  19. 前記ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記ＰＢＭＣから少なくとも１つの物理的選択方法を使用して陽性選択される、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記形質導入されたＰＢＭＣが、約１～約３５日間までにわたって培養される、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記被験体に注入される、または注入されたことを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
  22. 前記被験体がヒトである、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記第１の刺激剤および前記第２の刺激剤の少なくとも１つがペプチドを含む、請求項１８に記載の組成物。
  24. 前記ペプチドがｇａｇペプチドを含む、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記第１の刺激剤および前記第２の刺激剤の少なくとも１つが、ワクチンを含む、請求項１８に記載の組成物。
  26. 前記ワクチンがＨＩＶワクチンを含む、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ＨＩＶワクチンが、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはそのバリアントを含む、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記第１の刺激剤および前記第２の刺激剤が同じである、請求項１８に記載の組成物。
  29. 前記ウイルス送達系がレンチウイルス粒子を含む、請求項１８に記載の組成物。
  30. 前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ＨＩＶ ＲＮＡ配列をターゲティングすることができる少なくとも１つの低分子ＲＮＡを含む、請求項１８に記載の組成物。
  31. 前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、配列番号３１、配列番号１または配列番号９７のいずれか１つを含む場合、前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができる低分子ＲＮＡも含む、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
  33. 前記少なくとも１つの遺伝子エレメントが、マイクロＲＮＡクラスターを含む、請求項３２に記載の組成物。
  34. 前記マイクロＲＮＡクラスターが、
    配列番号３１；または
    配列番号１、配列番号２および配列番号１１１の少なくとも２つ；または
    配列番号９７、配列番号６および配列番号７の各々
    を含む、請求項３３に記載の組成物。
JP2019500423A 2016-07-08 2017-07-07 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法 Active JP7162895B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022133225A JP2022166288A (ja) 2016-07-08 2022-08-24 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662360185P 2016-07-08 2016-07-08
US62/360,185 2016-07-08
US201662385864P 2016-09-09 2016-09-09
US62/385,864 2016-09-09
US201662409270P 2016-10-17 2016-10-17
US62/409,270 2016-10-17
PCT/US2017/013019 WO2018009246A1 (en) 2016-07-08 2017-01-11 Hiv pre-immunization and immunotherapy
USPCT/US2017/013019 2017-01-11
PCT/US2017/041168 WO2018009847A1 (en) 2016-07-08 2017-07-07 Hiv pre-immunization and immunotherapy

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022133225A Division JP2022166288A (ja) 2016-07-08 2022-08-24 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2019525914A JP2019525914A (ja) 2019-09-12
JP2019525914A5 JP2019525914A5 (ja) 2020-07-02
JP7162895B2 true JP7162895B2 (ja) 2022-10-31

Family

ID=60913003

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019500475A Active JP6971492B2 (ja) 2016-07-08 2017-01-11 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
JP2019500423A Active JP7162895B2 (ja) 2016-07-08 2017-07-07 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
JP2021174409A Pending JP2022028677A (ja) 2016-07-08 2021-10-26 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
JP2022133225A Pending JP2022166288A (ja) 2016-07-08 2022-08-24 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
JP2024080081A Pending JP2024099855A (ja) 2016-07-08 2024-05-16 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2019500475A Active JP6971492B2 (ja) 2016-07-08 2017-01-11 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021174409A Pending JP2022028677A (ja) 2016-07-08 2021-10-26 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
JP2022133225A Pending JP2022166288A (ja) 2016-07-08 2022-08-24 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
JP2024080081A Pending JP2024099855A (ja) 2016-07-08 2024-05-16 Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法

Country Status (7)

Country Link
US (11) US11911458B2 (ja)
EP (2) EP3481418A4 (ja)
JP (5) JP6971492B2 (ja)
AU (3) AU2017292582C1 (ja)
CA (1) CA3028982A1 (ja)
IL (4) IL284348B2 (ja)
WO (2) WO2018009246A1 (ja)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100183558A1 (en) 2008-10-17 2010-07-22 Zhennan Lai Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
US11980663B2 (en) 2015-07-08 2024-05-14 American Gene Technologies International Inc. HIV pre-immunization and immunotherapy
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
AU2017207906B2 (en) 2016-01-15 2021-03-11 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
US10888613B2 (en) 2016-02-08 2021-01-12 American Gene Technologies International Inc. Method of producing cells resistant to HIV infection
ES2911448T3 (es) 2016-03-09 2022-05-19 American Gene Tech Int Inc Vectores combinados y métodos para el tratamiento del cáncer
WO2017213697A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 American Gene Technologies International Inc. Non-integrating viral delivery system and methods related thereto
IL284348B2 (en) 2016-07-08 2025-06-01 American Gene Tech Int Inc Hiv pre-immunization and immunotherapy
WO2018017882A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 American Gene Technologies International Inc. Viral vectors for treating parkinson's disease
BR112019014082A2 (pt) * 2017-01-09 2020-03-03 American Gene Technologies International Inc. Imunoterapia para hiv sem etapa de pré-imunização
KR102737836B1 (ko) 2017-04-03 2024-12-03 아메리칸 진 테크놀로지스 인터내셔널 인코포레이티드 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
US12384830B2 (en) 2017-06-02 2025-08-12 Regents Of The University Of Minnesota Compositions and methods for improving immunotherapy
JP2021519069A (ja) * 2018-03-27 2021-08-10 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド 遺伝子改変リンパ球の製造方法
AU2019244479B2 (en) 2018-03-30 2024-12-19 Les Hopitaux Universitaires De Geneve Micro RNA expression constructs and uses thereof
WO2020027094A1 (ja) * 2018-07-31 2020-02-06 サイアス株式会社 ｉＰＳ細胞を介して再生Ｔ細胞集団を製造する方法
US11352646B2 (en) 2018-11-05 2022-06-07 American Gene Technologies International Inc. Vector system for expressing regulatory RNA
WO2020227605A2 (en) * 2019-05-08 2020-11-12 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Dna encoded il-36 gamma as an adjuvant
CN112048523A (zh) * 2019-06-05 2020-12-08 南京艾德免疫治疗研究院有限公司 一种常规离心制备高滴度慢病毒载体的方法
US20240279678A1 (en) * 2020-03-03 2024-08-22 American Gene Technologies International Inc. On demand expression of exogenous factors in lymphocytes to treat hiv
WO2024036217A2 (en) * 2022-08-09 2024-02-15 Fred Hutchinson Cancer Center Immunization strategies to more naturally guide the maturation of antibodies against human immunodeficiency virus (hiv) in hiv-infected subjects
WO2024155830A2 (en) * 2023-01-18 2024-07-25 Fred Hutchinson Cancer Center Viral particle producer cells with landing pad-integrated viral vectors
WO2025050047A1 (en) * 2023-09-01 2025-03-06 American Gene Technologies International Inc. Combination immunotherapy and antiviral treatment

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017007994A1 (en) 2015-07-08 2017-01-12 American Gene Technologies International Inc. Hiv pre-immunization and immunotherapy
WO2017139065A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 American Gene Technologies International Inc. Hiv vaccination and immunotherapy

Family Cites Families (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5668255A (en) 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5674703A (en) 1992-12-02 1997-10-07 Woo; Savio L. C. Episomal vector systems and related methods
FI951138A7 (fi) 1993-07-13 1995-04-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Puuttellisia adenovirusvektoreita ja niiden käyttö geeniterapiassa
EP0932694A2 (en) 1996-09-11 1999-08-04 THE UNITED STATES GOVERNMENT as represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Aav4 vector and uses thereof
US6635472B1 (en) 1997-08-15 2003-10-21 Rubicon Laboratory, Inc. Retrovirus and viral vectors
AU1124499A (en) 1997-10-28 1999-05-17 Maxygen, Inc. Human papillomavirus vectors
JP2002506652A (ja) 1998-03-20 2002-03-05 トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパーを含まない製造のための組成物及び方法
ATE424114T1 (de) 1998-10-01 2009-03-15 Univ Southern California Retrovirales genübertragungssystem und entsprechendes verwendungverfahren
US6156514A (en) 1998-12-03 2000-12-05 Sunol Molecular Corporation Methods for making recombinant cells
US6410013B1 (en) 1999-01-25 2002-06-25 Musc Foundation For Research Development Viral vectors for use in monitoring HIV drug resistance
WO2000072886A1 (en) 1999-05-26 2000-12-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Episomally replicating lentiviral vectors
WO2001083797A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
JP2004505892A (ja) 2000-05-12 2004-02-26 ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　カリフォルニア ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）−感染細胞の治療
US20060057553A1 (en) 2000-05-30 2006-03-16 Estuardo Aguilar-Cordova Chimeric viral vectors for gene therapy
NO314588B1 (no) * 2000-09-04 2003-04-14 Bionor Immuno As HIV-peptider, antigener, vaksinesammensetning, immunoassay- testsett og en fremgangsmåte for å påvise antistoffer indusert av HIV
US7122181B2 (en) 2000-12-19 2006-10-17 Research Development Foundation Lentiviral vector-mediated gene transfer and uses thereof
US20030119770A1 (en) 2001-08-02 2003-06-26 Zhennan Lai Intercellular delivery of a herpes simplex virus VP22 fusion protein from cells infected with lentiviral vectors
WO2003015708A2 (en) 2001-08-18 2003-02-27 Myriad Genetics, Inc Composition and method for treating hiv infection
US7737124B2 (en) 2001-09-13 2010-06-15 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell
WO2003040311A2 (en) 2001-10-25 2003-05-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Efficient inhibition of hiv-1 viral entry through a novel fusion protein including of cd4
US20070203333A1 (en) 2001-11-30 2007-08-30 Mcswiggen James RNA interference mediated inhibition of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040248296A1 (en) 2002-03-20 2004-12-09 Beresford Paul J. HIV therapeutic
AU2003237159A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 University Of Florida Treatment for phenylketonuria
WO2004037847A2 (en) 2002-05-07 2004-05-06 Chiron Corporation Hiv envelope-cd4 complexes and hybrids
US20040161412A1 (en) 2002-08-22 2004-08-19 The Cleveland Clinic Foundation Cell-based VEGF delivery
AU2003265948B8 (en) 2002-09-06 2009-09-03 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy
EP1567539B1 (en) 2002-11-04 2009-09-23 University of Massachusetts Allele-specific rna interference
WO2004053137A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Cytos Biotechnology Ag Method for protein production
ATE481476T1 (de) 2003-05-08 2010-10-15 Life Technologies Corp Erzeugung und isolierung antigenspezifischer t- zellen
WO2004104591A2 (en) 2003-05-23 2004-12-02 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Improvements to gamma delta t cell-mediated therapy
WO2005005644A1 (en) 2003-07-11 2005-01-20 Cytos Biotechnology Ag Gene expression system
US20050019927A1 (en) 2003-07-13 2005-01-27 Markus Hildinger DECREASING GENE EXPRESSION IN A MAMMALIAN SUBJECT IN VIVO VIA AAV-MEDIATED RNAi EXPRESSION CASSETTE TRANSFER
US20050138677A1 (en) 2003-09-16 2005-06-23 Pfister Herbert J. Transgenic animal model for the treatment of skin tumors
US20070275010A1 (en) 2003-09-18 2007-11-29 Mark Feinberg Mva Vaccines
WO2005033282A2 (en) 2003-10-01 2005-04-14 Pharmacia & Upjohn Company Llc Polyamide compositions and therapeutic methods for treatment of human papilloma virus
US20080039413A1 (en) 2003-10-21 2008-02-14 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
JPWO2005051927A1 (ja) 2003-11-26 2007-12-06 株式会社クレハ Ｈｉｖ−１感染末梢血単核球の刺激培養によるｃｄ４陽性ｔ細胞の培養方法、及びｈｉｖ−１の増殖阻害剤
EP1753777B1 (en) 2004-02-25 2014-05-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF HIV INFECTION USING TRIM5a
JP2007527240A (ja) 2004-03-01 2007-09-27 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー アレルギー性鼻炎および喘息のためのＲＮＡｉベースの治療
TW201705980A (zh) 2004-04-09 2017-02-16 艾伯維生物技術有限責任公司 用於治療ＴＮＦα相關失調症之多重可變劑量療法
US20080227736A1 (en) 2004-06-03 2008-09-18 Regents Of The University Of California, Targeting Pseudotyped Retroviral Vectors
US20080131940A1 (en) 2004-06-25 2008-06-05 Robert Chiu Target Cell-Specific Short Interfering Rna and Methods of Use Thereof
AU2005277547B2 (en) 2004-08-16 2011-08-25 Immune Disease Institute, Inc. Method of delivering RNA interference and uses thereof
WO2006039721A2 (en) 2004-10-08 2006-04-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Bisphosphonate compounds and methods for bone resorption diseases, cancer, bone pain, immune disorders, and infectious diseases
EP1647595A1 (en) * 2004-10-15 2006-04-19 Academisch Medisch Centrum bij de Universiteit van Amsterdam Nucleic acids against viruses, in particular HIV
JP2008518591A (ja) 2004-11-02 2008-06-05 イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー 複製欠損アデノウイルスベクターの製造のためのアデノウイルスアンプリコンおよびプロデューサー細胞、その製造方法および用途
US7790446B2 (en) 2005-02-11 2010-09-07 Kosagen Cell Factory Oü Vectors, cell lines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication of hybrid plasmids and expression of gene products
MX2007010008A (es) 2005-02-16 2008-01-18 Lentigen Corp Vectores lentivirales y su uso.
CN101160055A (zh) 2005-02-16 2008-04-09 莱蒂恩公司 慢病毒载体及其用途
SI2002003T1 (sl) 2005-05-27 2016-05-31 Ospedale San Raffaele S.R.L. Genski vektor, ki vsebuje mi-RNA
WO2007015122A1 (en) 2005-08-02 2007-02-08 Genexel, Inc. Therapy for alzheimer’s disease
US20070032443A1 (en) 2005-08-02 2007-02-08 Jaeseob Kim Therapy for Alzheimer's disease
US20070105835A1 (en) 2005-11-07 2007-05-10 Kazantsev Aleksey G Compositions and methods for modulating poly(ADP-ribose) polymerase activity
WO2007133674A2 (en) 2006-05-12 2007-11-22 Lentigen Corporation Lentiviral vector compositions, methods and applications
US8535897B2 (en) 2006-06-19 2013-09-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Assays for non-apoptotic cell death and uses thereof
US20080003225A1 (en) 2006-06-29 2008-01-03 Henri Vie Method for enhancing the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and uses of T cells expressing CD16 receptors
US8124752B2 (en) 2006-07-10 2012-02-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the MYC gene
EP1878440A1 (en) 2006-07-13 2008-01-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for increasing the efficiency of therapeutic antibodies using gamma delta cell activator compounds
KR20090034395A (ko) 2006-07-26 2009-04-07 노파르티스 아게 운데카프레닐 피로포스페이트 합성효소의 억제제
US20080199961A1 (en) 2006-08-25 2008-08-21 Avi Biopharma, Inc. ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS
US8052968B2 (en) 2006-10-16 2011-11-08 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in diagnostic and therapeutic methods
ES2639568T3 (es) * 2007-01-23 2017-10-27 Janssen Pharmaceutica Nv Método para diseñar un régimen farmacológico para pacientes infectados con el VIH
JP2010523709A (ja) 2007-04-12 2010-07-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ イリノイ Ｆｐｐｓ、ｇｇｐｐｓ及びｄｐｐｓを含む複数の標的に対して高い効能を有するビスホスホネート化合物及び方法
US20080293142A1 (en) 2007-04-19 2008-11-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction
EP2008656A1 (en) 2007-06-28 2008-12-31 Bergen Teknologioverforing AS Compositions for the treatment of hyperphenylalaninemia
US20110177155A1 (en) * 2007-08-21 2011-07-21 Immune Disease Institute, Inc. Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells
JP2011509945A (ja) 2008-01-16 2011-03-31 オパール セラピューティクス プロプライエタリー リミテッド 免疫調節組成物およびその使用
GB0802754D0 (en) 2008-02-14 2008-03-26 Inst Superiore Di Sanito Antisense RNA targetting CXCR4
EP2090659A1 (en) 2008-02-14 2009-08-19 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Infectious particle, process for its preparation and use thereof
EP2271754A4 (en) * 2008-03-28 2013-01-16 Virxsys Corp IMMUNOGENIC VECTORS BASED ON LENTIVIRUS
GB0810209D0 (en) 2008-06-04 2008-07-09 Cambridge Entpr Ltd Pluripotency associated epigenetic factor
WO2010005686A2 (en) 2008-06-16 2010-01-14 Polyplus Battery Company Aqueous lithium/air battery cells
US8629334B2 (en) 2008-07-16 2014-01-14 University Of Florida Research Foundation, Inc. Viral-based transient-expression vector system for trees
US20110207226A1 (en) 2008-08-20 2011-08-25 Virxsys Corporation Non-integrating lenti/adeno-associated virus hybrid vector system
US8871515B2 (en) 2008-09-17 2014-10-28 Isogenis, Inc. Construction of fully-deleted adenovirus-based gene delivery vectors and uses thereof
US20100183558A1 (en) 2008-10-17 2010-07-22 Zhennan Lai Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
EP2362783A2 (en) 2008-10-31 2011-09-07 Biogen Idec MA Inc. Light targeting molecules and uses thereof
WO2010051521A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Lentigen Corporation Cell therapy product for the treatment of hiv infection
EP2362912A1 (en) 2008-11-14 2011-09-07 Life Technologies Corporation Compositions and methods for engineering cells
EP2191834A1 (en) 2008-11-26 2010-06-02 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Compositions and methods for treating retrovirus infections
CN102438631A (zh) 2009-04-09 2012-05-02 史坦赛特股份有限公司 抗hiv干细胞及其用途
BRPI1013771A2 (pt) 2009-04-13 2016-04-05 Apceth Gmbh & Co Kg "células-tronco mesenquimais projetadas e método de uso das mesmas para tratar tumores."
US8728458B2 (en) 2009-04-30 2014-05-20 The Regents Of The University Of California Combination anti-HIV vectors, targeting vectors, and methods of use
EP2949208B1 (en) 2009-07-15 2017-11-15 Calimmune Inc. Dual vector for inhibition of human immunodeficiency virus
US20120135032A1 (en) * 2009-10-08 2012-05-31 Bavarian Nordic A/S Generation of a broad t-cell response in humans against hiv
US20120027725A1 (en) 2009-11-30 2012-02-02 Galvin Jeffrey A Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules to treat liver cancer
CN101805750B (zh) 2009-12-29 2011-11-30 浙江大学 法呢基焦磷酸合成酶rna干扰重组慢病毒载体构建及用途
EP2536838A4 (en) * 2010-02-18 2013-08-21 Univ Emory VECTOR FOR THE EXPRESSION OF HIV ANTIGENES AND GM-CSF AND CORRESPONDING METHODS FOR GENERATING IMMUNE RESPONSE
WO2011119942A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Vistagen Therapeutics, Inc. Induction of ips cells using transient episomal vectors
WO2011133687A2 (en) 2010-04-20 2011-10-27 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for inhibition of beta2-adrenergic receptor degradation
DK2561078T3 (en) 2010-04-23 2019-01-14 Cold Spring Harbor Laboratory NEW STRUCTURALLY DESIGNED SHRNAs
EP2575894B1 (en) 2010-05-28 2015-02-25 Oxford Biomedica (UK) Ltd Delivery of lentiviral vectors to the brain
JP5805089B2 (ja) 2010-08-10 2015-11-04 タカラバイオ株式会社 細胞集団の製造方法
EP2625294A4 (en) 2010-10-07 2014-03-26 Univ Columbia PROCESS FOR TREATING TUMORS WITH A P53 MUTATION
WO2012061075A2 (en) 2010-10-25 2012-05-10 The Regents Of The University Of California Hiv resistant and functional hematopoietic stem/progenitor cells and macrophages from induced pluripotent stem cells
JP6091435B2 (ja) 2011-02-22 2017-03-08 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）ベクターを用いたタンパク質の送達
CN103533955A (zh) 2011-04-13 2014-01-22 因缪尼卡姆股份公司 用于激发t细胞的方法
CA2870511C (en) 2011-04-21 2023-08-08 University Of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
EP2782596A4 (en) 2011-11-22 2015-07-29 Philadelphia Children Hospital VIRUS VECTORS FOR HIGHLY EFFICIENT TRANSGENIC ADMINISTRATION
US9745631B2 (en) 2011-12-20 2017-08-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for diagnosing and treating oncogenic kras-associated cancer
WO2013119880A1 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Global Bio Therapeutics Usa, Inc. Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
US10335482B2 (en) 2012-06-06 2019-07-02 Bionor Immuno As Method of inducing an anti-HIV-1 immune response comprising administering a C5/TM-GP41 peptide dimer
JP2015524264A (ja) 2012-07-17 2015-08-24 ユニベルシテ ドゥ ジュネーブ 遺伝子発現の下方制御のための核酸
WO2014052855A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Population Diagnostics, Inc. Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
CN105051192B (zh) 2012-11-13 2020-04-17 科迪艾克生物科学公司 治疗剂的递送
AU2013355327A1 (en) 2012-12-05 2015-06-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of metabolic disorders
US9642921B2 (en) 2012-12-20 2017-05-09 Tocagen Inc. Cancer combination therapy and recombinant vectors
WO2014117050A2 (en) 2013-01-26 2014-07-31 Mirimus, Inc. Modified mirna as a scaffold for shrna
CN103184224A (zh) 2013-04-03 2013-07-03 衡阳师范学院 一种抗艾滋病病毒感染的三联miRNA及构建方法
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
EP3461909A1 (en) 2013-05-21 2019-04-03 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Isoforms of gata6 and nkx2-1 as markers for diagnosis and therapy of cancer and as targets for anti-cancer therapy
JP6516740B2 (ja) 2013-08-02 2019-05-22 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 幹細胞及びキメラ抗原受容体を介した抗腫瘍性ｔ細胞免疫の改変
WO2015042308A2 (en) 2013-09-18 2015-03-26 City Of Hope Rna-based hiv inhibitors
EA201992208A1 (ru) 2013-10-22 2020-07-31 Транслейт Био, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
EP3066201B1 (en) 2013-11-07 2018-03-07 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions with governing grnas
EP2878674A1 (en) 2013-11-28 2015-06-03 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Stable episomes based on non-integrative lentiviral vectors
GB201322091D0 (en) 2013-12-13 2014-01-29 Cambridge Entpr Ltd Modified serpins for the treatment of bleeding disorders
MA39867A (fr) 2014-04-23 2017-03-01 Juno Therapeutics Inc Procédés d'isolement, de culture et de manipulation génétique de populations de cellules immunitaires pour une thérapie adoptive
RS60106B1 (sr) 2014-04-25 2020-05-29 Bluebird Bio Inc Mnd promoterni himerni antigenski receptori
CA3205555A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Genethon Treatment of hyperbilirubinemia
CA2955254A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Immunomedics, Inc. Identification of cancer genes by in-vivo fusion of human cancer cells and animal cells
SI3197472T1 (sl) 2014-09-22 2022-01-31 Tanea Medical Ab Rekombinantni proteini brez PHE za uporabo pri zdravljenju fenilketonurije
MA40783A (fr) * 2014-10-03 2017-08-08 Los Alamos Nat Security Llc Vaccins contre le vih comprenant un ou plusieurs antigènes episensus de population
US11053314B2 (en) 2014-10-10 2021-07-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods to eliminate cancer stem cells by targeting CD47
WO2016061232A2 (en) * 2014-10-14 2016-04-21 Texas Tech University System Multiplexed shrnas and uses thereof
WO2016069518A2 (en) * 2014-10-27 2016-05-06 International Aids Vaccine Initiative Genetically stable replication competent sendai virus vector(s) containing and expressing optimized hiv genes
WO2016069716A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The Scripps Research Institute Compositions and methods comprising tyrosyl-trna synthetases and resveratrol compounds
ES2833449T3 (es) 2015-05-18 2021-06-15 Csl Behring Gene Therapy Inc Terapia génica para el tratamiento del VIH y usos de la misma
GB201509202D0 (en) 2015-05-28 2015-07-15 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Semi-static cell culture
JP6924487B2 (ja) 2015-06-10 2021-08-25 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド 非組み込みウイルス送達システムおよびその使用の方法
CA2994192C (en) 2015-08-13 2020-06-16 Beihao Stem Cell And Regenerative Medicine Research Institute Co., Ltd. Induced extended pluripotent stem cells, methods of making and using
CN105112370B (zh) 2015-08-25 2019-02-05 杭州优善生物科技有限公司 一种体外刺激外周血γδT细胞高效增殖的方法及其应用
BR112018005741A2 (pt) 2015-09-22 2018-10-09 Univ Pennsylvania método de redirecionamento de células t para tratar infecção por hiv
WO2017068077A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods and products for genetic engineering
US11389546B2 (en) 2015-12-09 2022-07-19 Modernatx, Inc. Heterologous UTR sequences for enhanced mRNA expression
AU2017207906B2 (en) 2016-01-15 2021-03-11 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
ES2911448T3 (es) 2016-03-09 2022-05-19 American Gene Tech Int Inc Vectores combinados y métodos para el tratamiento del cáncer
WO2017173453A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications
WO2017213697A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 American Gene Technologies International Inc. Non-integrating viral delivery system and methods related thereto
IL284348B2 (en) 2016-07-08 2025-06-01 American Gene Tech Int Inc Hiv pre-immunization and immunotherapy
WO2018017882A1 (en) 2016-07-21 2018-01-25 American Gene Technologies International Inc. Viral vectors for treating parkinson's disease
US10772887B2 (en) 2016-08-03 2020-09-15 Kagoshima University Anti-HTLV-1 drug and therapeutic agent for HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP)
KR102738752B1 (ko) 2016-12-30 2024-12-06 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 유전자 치료
BR112019014082A2 (pt) 2017-01-09 2020-03-03 American Gene Technologies International Inc. Imunoterapia para hiv sem etapa de pré-imunização
JP7273713B2 (ja) 2017-02-08 2023-05-15 ダナ－ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド ヘテロ二官能性化合物を用いた調整可能な内因性タンパク質分解
KR102737836B1 (ko) 2017-04-03 2024-12-03 아메리칸 진 테크놀로지스 인터내셔널 인코포레이티드 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
JP2020524996A (ja) 2017-06-16 2020-08-27 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド ヒトガンマデルタｔ細胞を介する腫瘍細胞傷害性の活性化のための方法および組成物
BR112020006672A2 (pt) 2017-10-02 2020-09-24 American Gene Technologies International Inc. vetores com combinações de promotor e acentuador para tratar fenilcetonúria
JP2021519069A (ja) 2018-03-27 2021-08-10 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド 遺伝子改変リンパ球の製造方法
US20210275589A1 (en) 2018-07-13 2021-09-09 Nanjing Legend Biotech Co. Ltd. Co-receptor systems for treating infectious diseases
US11352646B2 (en) 2018-11-05 2022-06-07 American Gene Technologies International Inc. Vector system for expressing regulatory RNA
EP3976076A4 (en) 2019-05-31 2023-06-07 American Gene Technologies International Inc. OPTIMIZED EXPRESSION OF PHENYLALANINE HYDROXYLASE

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017007994A1 (en) 2015-07-08 2017-01-12 American Gene Technologies International Inc. Hiv pre-immunization and immunotherapy
WO2017139065A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 American Gene Technologies International Inc. Hiv vaccination and immunotherapy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mol. Ther. Nucleic Acids (Apr 2016) vol.5, e312
Molecular Therapy (2015) vol.23, no.2，p.310-320,Supplementary materials

Also Published As

Publication number Publication date
US10233464B2 (en) 2019-03-19
US20190218573A1 (en) 2019-07-18
IL284348B1 (en) 2025-02-01
US20200109417A1 (en) 2020-04-09
AU2017292582B2 (en) 2020-10-22
US20190201523A1 (en) 2019-07-04
US11612649B2 (en) 2023-03-28
US11911458B2 (en) 2024-02-27
CA3028982A1 (en) 2018-01-11
IL264064A (en) 2019-01-31
IL264064B (en) 2021-02-28
IL284348B2 (en) 2025-06-01
IL276038B (en) 2021-07-29
US20240238406A1 (en) 2024-07-18
US20180010147A1 (en) 2018-01-11
EP3481435A1 (en) 2019-05-15
AU2024204743A1 (en) 2024-08-29
AU2021200210A1 (en) 2021-03-18
WO2018009246A1 (en) 2018-01-11
US10036038B2 (en) 2018-07-31
AU2017292582A1 (en) 2019-01-17
US12370253B2 (en) 2025-07-29
US11090379B2 (en) 2021-08-17
US20210330783A1 (en) 2021-10-28
US20250121051A1 (en) 2025-04-17
US20180291399A1 (en) 2018-10-11
US10494647B2 (en) 2019-12-03
EP3481435A4 (en) 2020-03-11
JP2022028677A (ja) 2022-02-16
IL284348A (en) 2021-07-29
JP2024099855A (ja) 2024-07-25
JP2019525914A (ja) 2019-09-12
EP3481418A1 (en) 2019-05-15
IL276038A (en) 2020-08-31
JP2019527055A (ja) 2019-09-26
JP6971492B2 (ja) 2021-11-24
JP2022166288A (ja) 2022-11-01
US20240108714A1 (en) 2024-04-04
US20240091339A1 (en) 2024-03-21
WO2018009847A1 (en) 2018-01-11
US20230241200A1 (en) 2023-08-03
AU2017292582C1 (en) 2021-11-11
IL300730A (en) 2023-04-01
EP3481418A4 (en) 2020-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7162895B2 (ja) Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
JP7551157B2 (ja) Ｈｉｖワクチン接種および免疫療法
JP7260170B2 (ja) 事前の免疫化ステップのないｈｉｖ免疫療法
JP2021519069A (ja) 遺伝子改変リンパ球の製造方法
WO2025050047A1 (en) Combination immunotherapy and antiviral treatment

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200520

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200520

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210608

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210907

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20211105

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211208

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20220427

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220824

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20220824

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20220824

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20220912

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20220913

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20221011

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20221012

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7162895

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250