JP6761705B2 - ５α−リダクターゼ阻害剤及び泌尿器系疾患治療・予防用組成物ならびにこれらの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、西洋カボチャ種子のエタノール又はメタノール抽出物を有効成分とする５α−リダクターゼ阻害剤に関する。また、西洋カボチャ種子のエタノール又はメタノール抽出物を有効成分とする泌尿器系疾患治療・予防用組成物に関する。また、西洋カボチャ種子をエタノールまたはメタノール抽出することにより５α―リダクターゼ阻害剤または泌尿器系疾患治療・予防用組成物を製造する方法に関する。

カボチャ種子油が前立腺肥大、頭髪の薄毛（ＡＧＡ）、頻尿等に有効であることは知られている。前立腺肥大、頭髪の薄毛（ＡＧＡ）、頻尿の進行にはテストステロンが生体内で還元されて生じるデハイドロテストステロン（ＤＨＴ）が関与しているといわれている。カボチャ種子油には、この還元作用を促進する５α−リダクターゼの活性を阻害する働きがある。

ところで、カボチャには、西洋カボチャ(Cucurbita maxima)、東洋カボチャ(Cucurbita moschata)、及びペポカボチャ(Cucurbita pepo)の３種類がある。西洋カボチャは、日本で一般に、食用に、又は冷凍食品や調理食品に加工されているカボチャである。東洋カボチャは、日本カボチャとも言われ、粘質でねっとりした食感を有するが、現在ではほとんど栽培されていない。ペポカボチャは、もっぱら海外で栽培されているが、その用途は食用ではなく、種子の食用油（パンプキンシードオイル）としての用途である。
さらに、西洋カボチャと東洋カボチャは、殻（種皮）のある種子を持つが、ペポカボチャは、殻（種皮）のない種子を持つ点が大きな違いであり、これらは同じカボチャ属であっても、果肉部分も種子部分も生物学的構造には大きな違いがある。

これまで前立腺肥大、頭髪の薄毛（ＡＧＡ）、頻尿等などに対する有効な作用について研究され発表されてきたのは、すべてペポカボチャの種子油に対してのものであった。事実、ドイツ連邦保健局、植物治療薬のコミッションＥによればペポカボチャ種子が女性の排尿障害用の薬剤として承認されている（非特許文献１）。このようにカボチャ属でもペポカボチャの種子油のみ研究が十分にされてきた背景としては、ペポカボチャは種皮が薄いため搾油が容易であり、種子油が大量に製造、販売されていることからその活性についても十分に研究することができた。
しかし、西洋カボチャおよび東洋カボチャは、種皮が殻のように固く、また、種子がワタに覆われているため、種子とワタを分離すること、および種子から種皮を取り除くことが非常に困難であり、長い間廃棄され利用されることはなかったのである。
本発明者らは、農産廃棄物、未利用バイオマスの有効利用の観点から、西洋カボチャおよび東洋カボチャの特性について探索をしたところ、西洋カボチャおよび東洋カボチャの種子油に５α−リダクターゼ阻害活性があることを世界で初めて突き止め、その後、西洋カボチャおよび東洋カボチャ種子油を大量生産する技術を開発し、それぞれについて特許を取得した（特許文献１、特許文献２）。

このように、ペポカボチャ、西洋カボチャ、東洋カボチャの種子油に５αリダクターゼ阻害活性があることはわかったものの、それぞれの種子油の生理活性物質がどのような物質であるかは依然として不明のままである。
さらには、カボチャ種子の搾油したオイル分ではなく、種子のオイル分以外の抽出物についての報告は数えるほどしかない（特許文献３〜５）。ましてや西洋カボチャの種子の抽出物についての報告は皆無である。

特許文献３には、クランベリーまたはその抽出物及びカボチャ種子又はその抽出物を含む泌尿器系疾患予防治療用組成物について開示されている。カボチャ種子としてペポカボチャとセイヨウカボチャが挙げられており、抽出物としてはエタノール、グリコール、グリセリン等の極性溶媒や超臨界条件下での二酸化炭素による抽出が好ましい例として挙げられている。実施例ではカボチャ種子を細切りし、エタノールで抽出したカボチャ種子エキスを配合した顆粒に尿失禁の改善効果や頻尿の改善効果があることが示されている。しかし、ここで用いたカボチャが西洋カボチャであるかペポカボチャであるかについては記載が無く、入手容易性を考慮すれば、ペポカボチャの可能性が高いと推測できる。また、本文献ではクランベリーとともに用いた場合の胃もたれ等に副作用が軽減するという効果に着目しており、尿失禁や頻尿改善効果が高いと考察されているものの、わずか５人のうち「良くなった」が１人、「やや良くなった」が２人、「変化なし」が２人であり、この差が有意な差であるかも不明である。
以上より、文献３には、西洋カボチャ種子のエタノール抽出物の頻尿等の改善効果については記載されていない。

特許文献４には、排尿障害治療剤としてカボチャ種子の乾燥エキスとイソフラボンとを含有する組成物について開示されている。カボチャ種子の乾燥エキスとしては、西洋カボチャ種子の６０重量％エタノール抽出物の乾燥によって得られたエキスを用いられたと記載されてはいる。しかし、カボチャの学名「Cucurbita e pepo Linne」より西洋カボチャ（Cucurbita maxima）ではなく、ペポカボチャの間違いである。したがって、文献４にも西洋カボチャ種子のエタノール抽出物については記載も示唆もされていない。

特許文献５には、ペポカボチャ種子の水抽出物を有効成分とする泌尿器系疾患予防治療用組成物について開示されている。ここでは、搾油後のペポカボチャ種子を５００μｍ以下に粉砕した後水抽出したものが、ペポカボチャ種子の６０％エタノール抽出物に比べて有意に薬理活性が高いことが示され、特許化されている（特許第５６９０１０２号）。これらはやはりペポカボチャについての抽出物であり、西洋カボチャ種子については開示も示唆もされていない。

特許第５６７９８３２号公報 特許第５６１５４８４号公報 特開２００１−３４２１４２号公報 特開２０００−２９０１９２号公報 特開２０１２−４６４５９号公報

Mark Blumenthal，Werner Busse，Alicia Goldberg，Joerg Gruenwald，Tara Hall，Chance W.Riggins，Robert S. Rister，Sigrid Klein，"The CompleteGerman Commission E Monographs"，Published November 30，RevisedJanuary 17，1991.

以上のとおり、カボチャ種子自体の溶媒抽出物に関する報告はすべてペポカボチャについての報告であり、西洋カボチャ種子自体の溶媒抽出物に関する報告はない。これは、西洋カボチャ種子は、その硬い種皮を取り除くことが非常に困難であり、本発明者らによってその技術が開発されて間もないため、種子油以外の含有成分やその生理活性については未知の状況にあるためと考えられる。
本発明は、西洋カボチャ種子に含まれる成分の新たな可能性を追求することを課題として、これまで探索されていなかった西洋カボチャ種子の種子油以外の成分を溶媒抽出することを目的として、極性〜非極性まで様々な溶媒で抽出することにより西洋カボチャ種子溶媒抽出物を取得し、各溶媒の抽出物の生理活性について調べた。

その結果、本発明者らは、西洋カボチャ種子の様々な溶媒抽出物のうち、エタノール又はメタノール抽出物に、他の溶媒では抽出され得なかった高い５α−リダクターゼ阻害活性を見出した。また、当該抽出物に泌尿器系疾患治療・予防効果があることも確認した。本発明は、これらの知見にもとづき完成されたもので以下の構成を有する。
（１）
西洋カボチャ種子のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とする５α―リダクターゼ阻害剤。
（２）
西洋カボチャ種子の子葉粉砕物のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とする５α―リダクターゼ阻害剤。
（３）
西洋カボチャ種子のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とする泌尿器系疾患治療・予防用組成物。
（４）
西洋カボチャ種子の子葉粉砕物のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とする泌尿器系疾患治療・予防用組成物。
（５）
５α―リダクターゼ阻害剤または泌尿器系疾患治療・予防用組成物を製造する方法であって、
西洋カボチャ種子をエタノール又はメタノールで抽出して西洋カボチャ種子のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を得る工程を含む、前記方法。
（６）
西洋カボチャ種子をエタノール又はメタノールで抽出する工程が、
西洋カボチャ種子の種皮を除去して子葉を得る工程
子葉を粉砕して子葉粉砕物を得る工程
子葉粉砕物をエタノール又はメタノールで抽出する工程
を含む、前記（５）に記載の方法。
（７）
西洋カボチャ種子の搾油粕のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とする５α―リダクターゼ阻害剤。
（８）
西洋カボチャ種子の搾油粕のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とする泌尿器系疾患治療・予防用組成物。
（９）
５α―リダクターゼ阻害剤または泌尿器系疾患治療・予防用組成物を製造する方法であって、
西洋カボチャ種子の搾油粕をエタノール又はメタノールで抽出してエタノール抽出物又はメタノール抽出物を得る工程を含む、前記方法。

本発明によれば、西洋カボチャ種子のエタノールまたはメタノール抽出物に高い５α−リダクターゼ阻害活性があることが判明したことから、搾油工程を経ずに５α−リダクターゼ阻害物質を製造することができる。また、搾油などによる種子油を含まないことからカプセル化などにより簡単に活性の高い濃縮物として利用することができる。また、本発明の抽出物には、泌尿器系疾患予防治療効果も認められることから、同様に治療用組成物を製造し、利用することが可能である。

（カボチャの種類）
本発明に用いるカボチャは、西洋カボチャであり、学名をCucurbita maximaという。西洋カボチャは、その種子が硬い殻(種皮)で覆われているため、種子からのエタノール又はメタノールによる抽出効率を上げるためには、種皮をあらかじめ除去し、得られた子葉を粉砕するか、あるいは、種皮がついたまま粉砕するなどして子葉部分がエタノール又はメタノールと接触可能に露出するように前処理をすることが望ましい。また、種子の搾油後の粕も同様に利用することができる。したがって、本発明の西洋カボチャ種子のエタノール又はメタノール抽出物は、種子自体の抽出物、子葉部分の抽出物、種子又は子葉の搾油後の粕の抽出物のいずれも含むものとする。
以下、エタノールとメタノールを代表してエタノールについて説明するが、これをメタノールに置き換えて使用できることは言うまでもない。

（種皮の除去）
西洋カボチャ種子の硬い種皮の除去は、例えばお米の玄米を精米する方法を適用することができる。したがって、すでに公知の精米機を利用して種皮を除去することができる。除去の程度、例えば精米の程度でいえば、白米の程度、５分づきの程度、７分づきの程度などがあるが、目的に応じて、適宜調整することができる。
また、この他にも特開２０１４−１３３７８９号に記載の方法を利用することもできる。すなわち、カボチャ種子を水分値７０〜９０％に調整後、滑り止め用の溝のついた回転する２本のローラーの間を通過させることにより、種皮および胚乳を取り除く方法である。種皮を取り除くことにより子葉部分が得られる。

（種子または子葉の粉砕）
エタノールの抽出対象としては、種皮を上記の方法により取り除いて得られた子葉を粗挽き又は粉砕した粗挽き物または粉砕物を利用することができる。あるいは、種子をそのまま種皮がついたまま粗挽き又は粉砕した、粗挽き物または粉砕物を利用することもできる。さらには、種子あるいは子葉を搾油して得られる搾油粕の粗挽き又は粉砕した粗挽き物または粉砕物を利用することができる。特にことわらない限りは、粗挽きと粉砕を合わせて粉砕等、粗挽き物と粉砕物を合わせて粉砕物等、あるいは単に粉砕物ということがある。
粉砕の程度は、粉砕物等にエタノールが浸透できる大きさであればよく、粒子径が小さければ、より浸透がされやすく、大きければ浸透が十分にされないことがある。種皮を除いた子葉の粉砕物等の平均粒子径は、例えば、０．１ｍｍ〜５ｍｍが挙げられる。
また、西洋カボチャは、種皮を上記のように精米の原理で取り除く場合は、種皮を取り除くのと同時に子葉の粉砕物を得ることもできる。すなわち、西洋カボチャ種子を精米機で処理すると、お米の部分が種皮、糠の部分が子葉の粉砕物に相当し、種皮と子葉粉砕物にきれいに分離することが可能である。

（エタノール又はメタノールによる抽出処理）
本発明のエタノール等による抽出の対象となる種子は洗浄され、その後乾燥されているものが望ましい。乾燥後の水分率は５〜１５％が望ましい。
本発明のエタノール等による抽出は、５α−リダクターゼ阻害活性を高めることができるような抽出条件であればよく、主にエタノール等の添加量および浸漬時間によりコントロールすることができる。

エタノールの添加量および浸漬時間は、種子の子葉部分又は搾油粕に浸透できる量および時間であればよく、これらは、種皮の除去の有無、種子又は搾油粕の粉砕の有無によっても異なる。西洋カボチャは種子が硬い種皮で覆われているため、種皮を取り除いてからエタノールによる抽出処理、あるいは種皮を取り除いて粉砕してからエタノールによる抽出処理をすることが望ましい。また、種皮を取り除かない場合は、種皮ごとカボチャ種子を２以上に粉砕するなどして少なくともエタノールが子葉に浸透できるように子葉部分を露出させることが望ましい。

エタノールの添加量は、種子重量の１００〜１，０００重量％程度であればよい。また、種皮を取り除いた子葉に対しては、子葉重量の５０〜５００重量％程度であればよい。西洋カボチャの粉砕子葉に対しては、１００％以上が好ましく、２００％以上がさらに好ましく、３００％以上がよりいっそう好ましく、５００％以上がもっとも好ましい。搾油粕に対しては、１００％以上が好ましく、２００％以上がさらに好ましく、３００％以上がよりいっそう好ましく、５００％以上がもっとも好ましい。

エタノールによる抽出時間（浸漬時間）は、種子の子葉部分又は搾油粕にエタノールが浸透できる時間が望ましく、1時間以上が望ましく、５時間以上がさらに望ましく、１０時間以上がよりいっそう望ましい。
エタノールに浸漬する方法は、種子、子葉、又は搾油粕の粉砕物にエタノールを添加し、撹拌してまんべんなくエタノールを種子、子葉、又は搾油粕の粉砕物に接触させることが望ましい。撹拌に超音波を使用するとより効率的に抽出でき、時間も短くてすむ。添加はふりかけまたは噴霧、漬け置き、エタノールの入った容器内の通過などにより行うことができる。さらに、種子、子葉、又は搾油粕の粉砕物をカラムに詰め、それの上部もしくは下部からアルコールを流すことにより連続的に抽出することができる。また、エタノールと種子等の接触後の浸漬(換言すれば、接触状態の保持、以下同じ)は、エタノールが蒸発しない程度の温度で密封した状態で浸漬されることが望ましい。
エタノールは、エタノール単独でも水とエタノールの混合物の状態でも使用することができ、混合物の場合、７０％以上のエタノールが望ましく、８０％以上がさらに望ましく、９０％以上がよりいっそう望ましく、９９％以上がもっとも望ましい。

（脱アルコール）
西洋カボチャ種子粉砕物等をエタノールに浸漬した後、粉砕物等を濾過等により除去し、エタノール抽出物を得ることができる。ここでアルコール分が余計である場合や濃縮したい場合には、エタノールをロータリーエバポレーターなどを用いて減圧濃縮することにより、エタノール抽出物の濃縮物を得ることができる。使用目的によっては、アルコール分を完全に除くことが望ましい場合がある。エタノール抽出物とエタノール抽出物の濃縮物は、特に断りのない限り、本明細書においてエタノール抽出物として表す。

（各種溶媒による抽出物）
本発明の西洋カボチャ種子エタノール抽出物は、高い５α−リダクターゼ阻害活性を有することを確認した。しかし、他の溶媒で同様に抽出した抽出物は全くあるいはほとんど同活性を有しなかった。すなわち、西洋カボチャ種子のヘキサン抽出物、ベンゼン抽出物、ジエチルエーテル抽出物、クロロホルム抽出物、塩化メチレン抽出物、テトラヒドロフラン抽出物、アセトニトリル抽出物、Ｎ，Ｎジメチルフォルムアミド抽出物、ジオキサン抽出物、アセトン抽出物、水抽出物には５α−リダクターゼ阻害活性は全くなかった（０〜５％）。また、酢酸エチル抽出物、ｎブタノール抽出物、イソプロピルアルコール抽出物にはわずかながら５α−リダクターゼ阻害活性が認められた（１０〜１５％）。これに対して、メタノール抽出物、エタノール抽出物には７８％、９２％という高い阻害活性が認められた。なお、これらの阻害活性は後述する試験例１により行われた５α−リダクターゼ阻害活性測定結果によるものである。メタノールとエタノールは水溶性の極性溶媒であるが、同じく水溶性の極性溶媒である水とは全く異なる結果となり、水抽出物には５α−リダクターゼ阻害活性は認められなかった。また、メタノール、エタノールと同じアルキルアルコールであるイソプロピルアルコールやｎブタノールの抽出物にも５α−リダクターゼ阻害活性は認められなかった。また、油脂類の抽出に使用される典型溶媒であるヘキサン抽出物にも５α−リダクターゼ阻害活性は認められなかった。
これらの結果より、本発明の５α−リダクターゼ阻害活性物質はエタノールまたはメタノールに溶出し、ヘキサンや水などには溶出しない物質であることがわかった。換言すれば西洋カボチャ種子のエタノール抽出物と、水抽出物又はヘキサン抽出物等とは異なる物質であると言える。
ここで、これまで西洋カボチャ種子を搾油した種子油に５α−リダクターゼ阻害活性があることが知られていた。しかし、５α−リダクターゼ阻害活性物質が搾油した油に溶解している成分であるなら、油脂類との相溶性の高いヘキサンにも溶解して抽出されるはずであるところ、ヘキサンに活性物質はほとんど溶出されなかった。したがって、これまで報告されてきた西洋カボチャ種子油中の活性成分とも異なる成分であると推定される。すなわち、西洋カボチャ種子油と、本発明の西洋カボチャ種子エタノール抽出物とは異なる成分であり、異なる物質である。

（用途）
本発明により製造された西洋カボチャ種子エタノール抽出物は、従来の西洋カボチャ種子油と同様に使用することができるが、西洋カボチャ種子油に比べて５α−リダクターゼ阻害活性が顕著に高いことから、少ない量でも同等の活性が得られ、また同じ量を摂取すればさらに高い効果が得られる。したがって、本発明の製造方法により得られた５α−リダクターゼ阻害活性の高い西洋カボチャ種子エタノール抽出物は、これを添加して５α−リダクターゼ阻害機能を付与した飲食品として、あるいはこれを有効成分とする５αリダクターゼ阻害剤として、サプリメントや医薬品として利用できる。すなわち、本発明は西洋カボチャ種子のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とする５αリダクターゼ阻害用食品組成物でもある。
また、本発明の西洋カボチャ種子エタノール抽出物は、頻尿改善作用及び前立腺肥大症改善作用も実証されたことから、泌尿器系疾患予防・改善・治療用途のサプリメントや医薬としても利用できる。すなわち、本発明は、西洋カボチャ種子のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を有効成分とする泌尿器系疾患予防・改善・治療用食品組成物でもある。
以下、本発明を実施例をもとに説明するがこれに限定されるものではない。

〔５αリダクターゼ阻害活性の測定方法〕
１．試験方法
（１）試薬類の調製
（ｉ）補酵素
β−ＮＡＤＰＨを０．７７ｍｇ／ｍＬになるように１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２）に溶解させた。
（ｉｉ）基質
テストステロン（東京化成工業株式会社）を、プロピレングリコール：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー＝１：１で０．５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた。内部標準であるｐ−ヒドロキシベンゾエイド（東京化成工業株式会社）は、０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにメタノールに溶解させた。酢酸エチルは和光純薬から購入したものをそのまま使用した。
（ｉｉｉ）酵素溶液
雄性ラットから肝臓を摘出し、−８０℃で保存した。肝臓は重量測定した後、５倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２）でホモジネートした。肝臓ホモジネート液は、９，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清は、阻害活性試験日まで−８０℃で保存した。
（２）測定手順
５αリダクターゼ阻害活性試験は以下の方法に従って行った。
活性試験を行うための反応液の組成を下記表１にまとめた。反応液は、１５μＬのテストステロン溶液、１０μＬの被験物質溶液（ＤＭＳＯに溶解）、１００μＬの酵素溶液及び２５μＬのＮＡＤＰＨ溶液を混合し調製した。尚、ブランクには被験物質の代わりにＤＭＳＯを加え、酵素溶液の代わりに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２）をそれぞれ加えた。また、コントロールには被験物質の代わりにＤＭＳＯを加えた。被験物質は、カボチャ種子オイルやその処理物（抽出物）である。
酵素反応は、本反応液を３７℃，３０分間インキュベートすることで行った。反応は、酢酸エチル２５０μＬと内部標準溶液を２５μＬを加え混合させることで停止させた。反応液は、９，０００×ｇで１０分間遠心分離をし、得られた上清１００μＬを分取し、遠心エバポレーターで乾固させた。乾固物はメタノール１００μＬに溶解させ、ＨＰＬＣでテストステロンの定量を行った。
阻害活性は、ブランク、コントロール、サンプルそれぞれのテストステロンのピーク面積から以下の式で阻害率（％）として求めた。

式

〔試験例１〕西洋カボチャ種子の各種溶媒による抽出物の取得と５α−リダクターゼ阻害活性
西洋カボチャ種子を各種の溶媒で抽出し、得られた各抽出物の５α−リダクターゼ阻害活性を測定した。
１．試験方法
西洋カボチャの種子を水洗浄し、乾燥して、水分率を５％とし、その乾燥種子を乳鉢で粉砕した。粉砕種子１００ｇに対して、表２に示す抽出溶媒を５倍量添加し、５℃で１夜撹拌した。その後、抽出液を濾過し、減圧濃縮して油状の抽出物を得た。得られた抽出物１ｇにＤＭＳＯを添加して５ｍＬにメスアップして被験物質溶液とし、１０μＬ採取して実施例１の方法によりの５αリダクターゼ阻害活性を測定した。

２．試験結果
結果を表２に示した。抽出に用いた溶媒の極性の低いもの（ヘキサン）から高いもの（水）の順に並べ、西洋カボチャ種子の各溶媒抽出物の５α−リダクターゼ阻害活性を阻害率（％）で示した。西洋カボチャ種子中の５α−リダクターゼ阻害活性物質はヘキサンなどの非極性溶媒には全く溶けず、極性溶媒の水にもほとんど溶けない。しかしながら、水に近い極性溶媒のエタノールおよびメタノールには驚くほど良く溶けて５α−リダクターゼ阻害活性物質が抽出されることがわかった。

３．考察
このように非極性から極性の数多くの溶媒を用いて西洋カボチャの種子中にある５α−リダクターゼ阻害活性を示す生理活性成分の抽出を試みた結果、エタノール又はメタノールによって特異的に抽出されることが判明した。
西洋カボチャ種子をエタノール及びメタノールに浸漬して得られた各溶液を減圧濃縮し、エタノール及びメタノールを完全に除いたものは油状の物質であり、乾固することはなかった。したがって、西洋カボチャ種子中の５α−リダクターゼ阻害活性物質はエタノールおよびメタノールによって西洋カボチャ種子から溶出する油脂類と共に抽出された。

〔試験例２〕カボチャの種類の違いによる、カボチャ種子エタノール抽出物の５αリダクターゼ阻害活性の比較
１．試験方法
西洋カボチャのほかに、東洋カボチャおよびペポカボチャについて、抽出するための溶媒をエタノールに特定した以外は、試験例１と同様に試験を行い、各カボチャ種子のエタノール抽出物を得た。各カボチャ種子のエタノール抽出物１ｇをＤＭＳＯで５ｍＬにメスアップして被験物質溶液とし、１０μＬ採取して上述の５αリダクターゼ阻害活性測定方法により活性を測定した。

２．試験結果
結果を表３に示した。西洋カボチャ種子のエタノール抽出物は、東洋カボチャ種子およびペポカボチャ種子のエタノール抽出物より高い５αリダクターゼ阻害活性を示した。特に、西洋カボチャ種子は、ペポカボチャ種子に比べて２倍以上に相当する高い活性を示した。

３．考察
上記のとおり、カボチャ種子エタノール抽出物の５αリダクターゼ阻害活性はカボチャの種類により非常に異なるものであった。
しかし、カボチャ種子を搾油した油の５αリダクターゼ阻害活性は、カボチャの種類により大きな違いは見られなかった（特願２０１５−１９２３９４号実施例１〜３）。
したがって、搾油により油中に取り出される種子中の５αリダクターゼ阻害活性物質とエタノールに溶出されてくる種子中の５αリダクターゼ阻害活性物質とは、カボチャの種類によって相違すると考えられた。即ち、西洋カボチャ種子からは他のカボチャ種子とは異なり、エタノールによって、より多くの５αリダクターゼ阻害活性物質が抽出されることがわかった。
なお、西洋カボチャ種子のエタノール抽出物について、急性毒性試験を行ったところ、毒性はみられなかった(試験結果示さず)。

〔試験例３〕西洋カボチャ種子のエタノール抽出物の頻尿改善作用の確認
１．試験方法
（１）西洋カボチャ種子のエタノール抽出物含有ソフトカプセルの調整
抽出溶媒をエタノールにした以外は、試験例１と同様にして、西洋カボチャ種子のエタノール抽出物（油状物）を得た。得られた抽出物（油状物）を０．４ｇ／カプセルとなるようにゼラチンソフトカプセルに封入し、エタノール抽出物含有ゼラチンソフトカプセルを製造した。当該製造は、三生医薬株式会社に委託して行った（以下、エタノールまたはメタノール抽出物含有ゼラチンソフトカプセルの製造において同じ）。
（２）被験者
４６歳から７２歳の男女４０名を対象に非盲検試験で行った。
（３）投与方法
ソフトカプセルを１日３個（０．４ｇ×３個＝１．２ｇ／日）、１２週間継続して被験者に投与した。
（４）評価方法
評価は、投与開始前、投与開始６週間後、投与開始１２週間後に、（Ａ）過活動膀胱症状質問票（Overactive Bladder Symptom Score、略してOABSS、表４）（＊）及び（Ｂ）国際前立腺症状スコア（International Prostate Symptom Score、略してI-PSS、表５）（＊＊）により行った。
＊過活動膀胱が疑われるときの問診で使われる質問票のこと
＊＊前立腺肥大症が疑われるときの問診で使われるWHO（世界保健機構）が1995年に定めた問診票のこと。

２．試験結果
（Ａ）過活動膀胱症状質問票（OABSS）による評価結果を表６に示す。
西洋カボチャ種子エタノール抽出物の投与開始６週間以降すべての評価項目において投与開始前に比べて有意な改善効果がみられた。
（Ｂ）国際前立腺症状スコア（I-PSS）による評価結果を表７に示す。
西洋カボチャ種子エタノール抽出物の投与開始１２週間以降すべての評価項目において投与開始前に比べて有意な改善効果がみられた。

３．考察
このように西洋カボチャ種子エタノール抽出物には、頻尿等の改善作用があることがわかった。また、その原因となる過活動膀胱および前立腺肥大症のいずれにも対しても改善作用があることがわかった。

[製造例１]本発明の西洋カボチャ種子エタノール抽出物を含むゼラチンソフトカプセルの製造
水洗後乾燥した西洋カボチャの種子１０ｋｇをレェチェ製グラインドミックスＧＭ２００を用いて粉砕し、それに９５％エタノール５０ｋｇを加えて、５℃で１夜撹拌した。エタノール抽出液を濾過後、ロータリーエバポレーターＲ−２１５（ヤマト科学株式会社製）を用いて減圧濃縮し、エタノールを除き、油状物０．５ｋｇを得た。この油状物をエタノールに一定量溶解し、５αリダクターゼ阻害活性を測定したところ９０％の阻害率を示した。
このエタノール抽出操作を繰り返して得た油状物５ｋｇについてして、エタノール抽出物含有ゼラチンソフトカプセルを製造した。このエタノール抽出物含有ゼラチンソフトカプセルは頻尿の改善と予防に有効な健康食品として用いられる。

[製造例２]本発明の西洋カボチャ種子エタノール抽出物を含む焼酎の製造
水洗乾燥した西洋カボチャ種子２ｋｇを家庭用精米機（ＢＲ−ＥＢ１０（ＨＡ）、象印製）により表皮を除き、子葉の粉砕物を得た。得られた子葉粉砕物９００ｇを焙煎し、室温まで冷却後、これに焼酎１０ｋｇ（エタノール度数２０％）を加え、時々撹拌しながら３０日間室温下で放置した。
これにより得られたエタノール抽出液を脱脂綿を用いて濾過し、西洋カボチャ種子のエタノール抽出物を含む焼酎を製造した。この焼酎は緑色を呈し、味、香りともに優れていた。
この焼酎の５αリダクターゼ阻害活性を測定したところ２４％の阻害率を示した。
この焼酎は頻尿の改善と予防に有効な健康食品として用いることができる。

[製造例３]本発明の西洋カボチャ種子メタノール抽出物を含むゼラチンソフトカプセルの製造
西洋カボチャの種子を水洗乾燥したもの１０ｋｇをレェチェ製グラインドミックスＧＭ２００を用いて粉砕し、それに９８％メタノール５０ｋｇを加えて、５℃で１夜撹拌した。メタノール抽出液を濾過後、ロータリーエバポレーターＲ２１５（ヤマト科学株式会社製）を用いて減圧濃縮し、メタノールを除き、さらにその濃縮物に少量のエタノールを加えて溶解し、減圧濃縮することを繰り返して行い、メタノールを完全に除いて油状物を得た。
得られた油状物をエタノールに一定量溶解し、５αリダクターゼ阻害活性を測定したところ８７％の阻害率を示した。
このメタノール抽出操作を繰り返して得た油状物５ｋｇについて、ゼラチンソフトカプセルを製造した。このメタノール抽出物含有ゼラチンソフトカプセルは頻尿の改善と予防に有効な健康食品として用いることができる。

[製造例４]本発明の西洋カボチャ種子エタノール抽出物を含むゼラチンソフトカプセルの製造
西洋カボチャの種子を水洗乾燥したものをＥＸ―１００型搾油機（ハンダー油機株式会社製）を用いて搾油した後に得られた搾油粕２０ｋｇをグラインドミックスＧＭ―２０（レェチェ社製）を用いて粉砕し、それに９０％エタノール１００ｋｇを加えて、ＵＳ−１８０型超音波洗浄器(株式会社エスエヌデイ製)のバット内に入れ、２時間振動撹拌した。エタノール抽出液を濾過し、ロータリーエバポレーターＲ―２１５（ヤマト科学株式会社製）を用いて減圧濃縮し、エタノールを除き、油状物１．２ｋｇを得た。この油状物をエタノールに一定量溶解し、５αリダクターゼ阻害活性を測定したところ９４％の阻害率を示した。
このエタノール抽出操作を繰り返して得られた油状物５ｋｇについて、ゼラチンソフトカプセルを製造した。このエタノール抽出物含有ゼラチンソフトカプセルは頻尿の改善と予防に有効な健康食品として用いられる。

本発明の西洋カボチャ種子のエタノールまたはメタノール抽出物を有効成分とする５α−リダクターゼ阻害剤および泌尿器系疾患予防治療用組成物によれば、食用としの安全性がすでに確立されている食品成分を原料としているものであるから、副作用の恐れが無く安心して服用することができる。

Claims (3)

1. ５α-リダクターゼ阻害剤または泌尿器系疾患治療・予防用組成物を製造する方法であって、
   西洋カボチャ種子をエタノール又はメタノールで抽出して西洋カボチャ種子のエタノール抽出物又はメタノール抽出物を得る工程を含む、前記方法。
2. 西洋カボチャ種子をエタノール又はメタノールで抽出する工程が、
   西洋カボチャ種子の種皮を除去して子葉を得る工程
   子葉を粉砕して子葉粉砕物を得る工程
   子葉粉砕物をエタノール又はメタノールで抽出する工程
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. ５α-リダクターゼ阻害剤または泌尿器系疾患治療・予防用組成物を製造する方法であって、
   西洋カボチャ種子の搾油粕をエタノール又はメタノールで抽出してエタノール抽出物又はメタノール抽出物を得る工程を含む、前記方法。