JP6699085B2 - Ｆｃ結合性タンパク質の精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてＦｃ結合性タンパク質を精製する方法に関する。特に本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ由来のＦｃ結合性タンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてを高回収率かつ高純度に精製する方法に関する。

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。

Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ＫＡ）が１０^７Ｍ^−１以下であることが報告されている（非特許文献２）。ヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中の番号はアミノ酸番号を示しており、その番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。

近年になり見出されたＦｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性により、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献３）。また、Ｆｃレセプターの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィー担体の捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。しかしながら、前記目的でＦｃレセプターを利用するには、Ｆｃレセプターを高純度に精製することが重要である。

Ｆｃ結合性タンパク質（Ｆｃレセプター）の精製に関しては、疎水クロマトグラフィーを用いたＦｃ結合性タンパク質の精製について検討を行なっており、疎水クロマトグラフィー用担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を１０％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含む緩衝液で溶出させることでＦｃ結合性タンパク質を高純度かつ高効率な精製を実現している（特許文献１）。また陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたＦｃ結合性タンパク質の精製において、前記クロマトグラフィー用担体にアプライするＦｃ結合性タンパク質を含む溶液、および前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質の溶出液に尿素を添加することで、不純物の吸着を抑え、高純度かつ高効率な精製を実現している（特許文献２）。

特開２０１１−１２６８２７号公報 特開２０１２−２５０９４５号公報

Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｏｌ／Ｌｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１ Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｏｌ／Ｌｕｎｏｌ．，２７，１９２８−１９３２，１９９７ Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｏｌ／Ｌｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５

前述したように、Ｆｃ結合性タンパク質の精製に関しては、特許文献１および２の開示がある。しかしながら、さらなる精製純度および精製効率の向上が求められていた。また、これら特許文献で開示の方法で検討したＦｃ結合性タンパク質はヒトＦｃγＲＩ由来のタンパク質であるが、別のＦｃ結合性タンパク質であるヒトＦｃγＲＩＩＩａ由来のタンパク質に対して同様に検討したところ、高純度かつ高効率な精製を行なうことができなかった。

そこで本発明の目的は、Ｆｃ結合性タンパク質（特にヒトＦｃγＲＩＩＩａ由来のＦｃ結合性タンパク質）を、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて高純度かつ高効率に精製する方法を提供することにある。

前記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質を吸着した陽イオン交換クロマトグラフィー担体を洗浄する工程に用いる洗浄液、および前記担体からＦｃ結合性タンパク質を溶出させる工程に用いる溶出液における最適な塩濃度を見出し、本発明の完成に至った。

すなわち本発明の第一の態様は、
（１）陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加することで、前記担体にＦｃ結合性タンパク質を吸着させる工程と、
（２）洗浄液を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質を吸着した前記担体を洗浄する工程と、
（３）溶出液を用いて、前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出させる工程と、
を含むＦｃ結合性タンパク質の精製方法であって、
前記（２）の工程が、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の塩化ナトリウムを含む第一の洗浄液を用いて洗浄した後、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下かつ前記第一の洗浄液よりも高濃度の塩化ナトリウムを含む第二の洗浄液を用いて洗浄する工程であり、
前記（３）の工程が、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムを含む溶出液を用いてＦｃ結合性タンパク質を溶出させる工程である、前記精製方法である。

また本発明の第二の態様は、Ｆｃ結合性タンパク質が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質、または
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質である、
前記第一の態様に記載の精製方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加する、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液の一例として、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液（後述する粗精製Ｆｃ結合性タンパク質溶液を含む）や、前記培養液（後述する粗精製Ｆｃ結合性タンパク質溶液を含む）を陽イオン交換クロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーを用いて精製して得られた溶液があげられる。

本発明において、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換する宿主とは、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞に代表される動物細胞、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。なお宿主が大腸菌の場合は、特開２０１２−０３４５９１号公報および特開２０１３−０８５５３１号公報に開示した方法等により、形質転換体を培養することで前記タンパク質を発現させればよい。

本発明において、前記宿主の形質転換体の培養液から、クロマトグラフィー用担体に添加するための粗精製Ｆｃ結合性タンパク質溶液を得るには、発現の形態によって適宜選択すればよい。例えば、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズムに発現する場合は、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後、遠心分離により破砕残渣を除去することで、発現したタンパク質を含む無細胞抽出液を得ればよく、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズムから培養上清に漏出する場合は、培養液を遠心分離して得られる培養上清から発現したタンパク質を回収すればよい。なお薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、特開２０１３−２５２０９９号公報に開示した方法や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕するとよい。

本発明において、精製に用いる陽イオン交換クロマトグラフィー用担体は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基、スルホン酸基といった陽イオン交換基を担体に導入したものであれば特に限定はなく、具体例として、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ−６５０（以上、東ソー社製）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）があげられる。なお、前記陽イオン交換クロマトグラフィー用担体を用いて、本発明の精製方法を実施する際は、前記担体へのＦｃ結合性タンパク質を含む溶液（アプライ液）の添加量や、前記担体のタンパク吸着性能等によって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、前記陽イオン交換クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を添加する前に、あらかじめ、塩を含む適切な緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液、リン酸塩緩衝液等）で平衡化するとよい。

本発明の精製方法では、前述した緩衝液であらかじめ平衡化した陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液（アプライ液）を添加して、前記担体にＦｃ結合性タンパク質を吸着させた後、溶出工程前に洗浄液を用いて前記担体に吸着しないタンパク質を除去する。その際、前記除去操作を１５０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の塩化ナトリウムを含む第一の洗浄液を用いて除去した後、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下かつ前記第一の洗浄液よりも高濃度の塩化ナトリウムを含む第二の洗浄液を用いて除去することで行なう。具体的には、前記第一の洗浄液として平衡化した緩衝液に含まれる塩と同じイオン強度の塩化ナトリウムを含む緩衝液を、前記第二の洗浄液を前記第一の洗浄液以上かつ１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の濃度の塩化ナトリウムを含む緩衝液を、それぞれ用いる例があげられる。なお前記除去操作を行なう際に用いる、第一の洗浄液に含まれる塩化ナトリウム濃度を１００ｍｍｏｌ／Ｌ未満とし、第二の洗浄液に含まれる塩化ナトリウム濃度を１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下かつ前記第一の洗浄液よりも高い濃度とすると、その後の溶出工程により回収されるＦｃ結合性タンパク質の回収率や純度がさらに向上する点で好ましい。前記好ましい態様の一例として、陽イオン交換クロマトグラフィー用担体の平衡化に用いる緩衝液を４０ｍｍｏｌ／Ｌから６０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲の塩化ナトリウムに相当するイオン強度を有した緩衝液とし、第一の洗浄液に含まれる塩化ナトリウム濃度を４０ｍｍｏｌ／Ｌから６０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲とし、第二の洗浄液に含まれる塩化ナトリウム濃度を８０ｍｍｏｌ／Ｌから１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲とする例があげられる。

一方、前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出させるための溶出液は、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いればよい。なお、溶出液に含まれる塩化ナトリウムの濃度を３００ｍｍｏｌ／Ｌから４００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲とするとより好ましい。

本発明においてＦｃ結合性タンパク質とは、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）を構成するタンパク質、またはヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでの領域）（図１）を構成するタンパク質があげられる。なお必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域またはヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。本明細書におけるヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質や、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｖ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、
があげられる。中でも前記（ｉｉｉ）および（ｉｖ）、すなわちヒトＦｃγＲＩＩＩａ細胞外領域を構成するタンパク質のうち、少なくとも抗体のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んだタンパク質、または当該タンパク質を構成するアミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質に対して、本発明を適用させると好ましい。

前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報や特開２０１４−０２７９１６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質があげられる。

また前記（ｉｖ）の具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４０）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１４−１６６８８３号）があげられる。
（１）配列番号１の１８番目のメチオニンがアルギニンに置換
（２）配列番号１の２７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（３）配列番号１の２９番目のフェニルアラニンがロイシンまたはセリンに置換
（４）配列番号１の３０番目のロイシンがグルタミンに置換
（５）配列番号１の３５番目のチロシンがアスパラギン酸、グリシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、セリン、スレオニン、ヒスチジンのいずれかに置換
（６）配列番号１の４６番目のリジンがイソロイシンまたはスレオニンに置換
（７）配列番号１の４８番目のグルタミンがヒスチジンまたはロイシンに置換
（８）配列番号１の５０番目のアラニンがヒスチジンに置換
（９）配列番号１の５１番目のチロシンがアスパラギン酸またはヒスチジンに置換
（１０）配列番号１の５４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（１１）配列番号１の５６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（１２）配列番号１の５９番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１の６４番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１の６５番目のセリンがアルギニンに置換
（１６）配列番号１の７１番目のアラニンがアスパラギン酸に置換
（１７）配列番号１の７５番目のフェニルアラニンがロイシン、セリン、チロシンのいずれかに置換
（１８）配列番号１の７７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１の７８番目のアラニンがセリンに置換
（２０）配列番号１の８２番目のアスパラギン酸がグルタミン酸またはバリンに置換
（２１）配列番号１の９０番目のグルタミンがアルギニンに置換
（２２）配列番号１の９２番目のアスパラギンがセリンに置換
（２３）配列番号１の９３番目のロイシンがアルギニンまたはメチオニンに置換
（２４）配列番号１の９５番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（２５）配列番号１の１１０番目のロイシンがグルタミンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のアルギニンがグルタミンに置換
（２７）配列番号１の１１６番目のトリプトファンがロイシンに置換
（２８）配列番号１の１１８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（２９）配列番号１の１１９番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３０）配列番号１の１２０番目のグルタミン酸がバリンに置換
（３１）配列番号１の１２１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸またはグリシンに置換
（３２）配列番号１の１５１番目のフェニルアラニンがセリンまたはチロシンに置換
（３３）配列番号１の１５５番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１６３番目のスレオニンがセリンに置換
（３５）配列番号１の１６７番目のセリンがグリシンに置換
（３６）配列番号１の１６９番目のセリンがグリシンに置換
（３７）配列番号１の１７１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（３８）配列番号１の１８０番目のアスパラギンがリジン、セリン、イソロイシンのいずれかに置換
（３９）配列番号１の１８５番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１の１９２番目のグルタミンがリジンに置換
また前記（ｉｖ）の別の具体例としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（４１）から（１１１）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質があげられ、さらに具体的な例として配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含むＦｃ結合性タンパク質があげられる（特願２０１５−０４７４６２号）。
（４１）配列番号２の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはロイシンに置換
（４２）配列番号２の５５番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（４３）配列番号２の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４４）配列番号２の６７番目のチロシンがセリンに置換
（４５）配列番号２の７７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（４６）配列番号２の９３番目のアスパラギン酸がグリシンに置換
（４７）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（４８）配列番号２の１０６番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４９）配列番号２の１２８番目のグルタミンがロイシンに置換
（５０）配列番号２の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（５１）配列番号２の１３５番目のリジンがアスパラギンまたはグルタミン酸に置換
（５２）配列番号２の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（５３）配列番号２の１５８番目のロイシンがグルタミンに置換
（５４）配列番号２の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（５５）配列番号２の１９１番目のロイシンがアルギニンに置換
（５６）配列番号２の１９６番目のアスパラギンがセリンに置換
（５７）配列番号２の２０４番目のイソロイシンがバリンに置換
（５８）配列番号２の３４番目のメチオニンがイソロイシン、リジン、スレオニンのいずれかに置換
（５９）配列番号２の３７番目のグルタミン酸がグリシンまたはリジンに置換
（６０）配列番号２の３９番目のロイシンがメチオニンまたはアルギニンに置換
（６１）配列番号２の４９番目のグルタミンがプロリンに置換
（６２）配列番号２の６２番目のリジンがイソロイシンまたはグルタミン酸に置換
（６３）配列番号２の６４番目のグルタミンがトリプトファンに置換
（６４）配列番号２の６７番目のチロシンがヒスチジンまたはアスパラギンに置換
（６５）配列番号２の７０番目のグルタミン酸がグリシンまたはアスパラギン酸に置換
（６６）配列番号２の７２番目のアスパラギンがセリンまたはイソロイシンに置換
（６７）配列番号２の７７番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（６８）配列番号２の８０番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（６９）配列番号２の８１番目のセリンがアルギニンに置換
（７０）配列番号２の８３番目のイソロイシンがロイシンに置換
（７１）配列番号２の８４番目のセリンがプロリンに置換
（７２）配列番号２の８５番目のセリンがアスパラギンに置換
（７３）配列番号２の８７番目のアラニンがスレオニンに置換
（７４）配列番号２の９０番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（７５）配列番号２の９１番目のフェニルアラニンがアルギニンに置換
（７６）配列番号２の９３番目のアスパラギン酸がバリンまたはグルタミン酸に置換
（７７）配列番号２の９４番目のアラニンがグルタミン酸に置換
（７８）配列番号２の９７番目のバリンがメチオニンとグルタミン酸に置換
（７９）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がアラニンに置換
（８０）配列番号２の１０２番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（８１）配列番号２の１０６番目のグルタミンがロイシンに置換
（８２）配列番号２の１０９番目のロイシンがグルタミンに置換
（８３）配列番号２の１１７番目のグルタミンがロイシンに置換
（８４）配列番号２の１１９番目のグルタミン酸がバリンに置換
（８５）配列番号２の１２１番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（８６）配列番号２の１３０番目のプロリンがロイシンに置換
（８７）配列番号２の１３５番目のリジンがチロシンに置換
（８８）配列番号２の１３６番目のグルタミン酸がバリンに置換
（８９）配列番号２の１４１番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（９０）配列番号２の１４６番目のセリンがスレオニンに置換
（９１）配列番号２の１５４番目のリジンがアルギニンに置換
（９２）配列番号２の１５９番目のグルタミンがヒスチジンに置換
（９３）配列番号２の１６３番目のグリシンがバリンに置換
（９４）配列番号２の１６５番目のリジンがメチオニンに置換
（９５）配列番号２の１６７番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（９６）配列番号２の１６９番目のヒスチジンがチロシンに置換
（９７）配列番号２の１７４番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（９８）配列番号２の１７７番目のリジンがアルギニンに置換
（９９）配列番号２の１８５番目のセリンがグリシンに置換
（１００）配列番号２の１９４番目のセリンがアルギニンに置換
（１０１）配列番号２の１９６番目のアスパラギンがリジンに置換
（１０２）配列番号２の２０１番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０３）配列番号２の２０３番目のアスパラギンがイソロイシンまたはリジンに置換
（１０４）配列番号２の２０７番目のスレオニンがアラニンに置換
（１０５）配列番号２の９４番目のアラニンがセリンに置換
（１０６）配列番号２の９８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１０７）配列番号２の１１７番目のグルタミンがアルギニンに置換
（１０８）配列番号２の１５６番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（１０９）配列番号２の１７４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（１１０）配列番号２の１８１番目のリジンがグルタミン酸に置換
（１１１）配列番号２の２０３番目のアスパラギンがアスパラギン酸またはチロシンに置換
また前記（ｉｖ）のさらに別の具体例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において以下の（１１２）から（１１５）に示す天然に生じるアミノ酸置換のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質があげられる。
（１１２）配列番号１の６６番目のロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
（１１３）配列番号１の１４７番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１１４）配列番号１の１５８番目のチロシンがヒスチジンに置換
（１１５）配列番号１の１７６番目のバリンがフェニルアラニンに置換
本発明の精製方法において、カラムから溶出した画分に含まれるＦｃ結合性タンパク質を定量するには、従来から知られている安定かつ効率的に定量できる方法の中から適宜選択すればよいが、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着法）による分析方法が好ましい。

本発明の精製方法により得られたＦｃ結合性タンパク質は、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）など様々な用途に用いることができる。使用の際の形態や純度はその用途により異なり、本発明の精製方法により得られたＦｃ結合性タンパク質をそのまま用いてもよいし、さらに高度に精製したものを用いてもよいし、またその中間の純度の精製度合いのものを用いてもよい。

本発明は、（１）陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加することで、前記担体にＦｃ結合性タンパク質を吸着させる工程と、（２）洗浄液を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質を吸着した前記担体を洗浄する工程と、（３）溶出液を用いて、前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出させる工程と、を含むＦｃ結合性タンパク質の精製方法において、前記（２）の工程を、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ未満の塩化ナトリウムを含む第一の洗浄液を用いて洗浄した後、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下かつ前記第一の洗浄液よりも高濃度の塩化ナトリウムを含む第二の洗浄液を用いて洗浄する工程とし、前記（３）の工程を、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の塩化ナトリウムを含む溶出液を用いてＦｃ結合性タンパク質を溶出させる工程とすることを特徴としている。本発明により、一段階のカラムクロマトグラフィー操作によって、Ｆｃ結合性タンパク質（特にヒトＦｃγＲＩＩＩａ由来のＦｃ結合性タンパク質）を高回収率かつ高純度に精製することができる。

また、本発明の精製方法は前記担体に導入するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液の量（アプライ量）に係わらず適用可能な方法であるため、Ｆｃ結合性タンパク質の分析目的に適用できることはもちろん、工業的なＦｃ結合性タンパク質生産の一工程にも適用することができる。

本発明の精製方法で得られたＦｃ結合性タンパク質は、そのまま、またはさらなる精製により、医薬品、臨床検査薬、バイオセンサー、またはアフィニティーリガンド（分離剤）など様々な用途に用いることができる。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造を示す図。 実施例２において、溶出工程で得られる画分の純度を確認した結果（サイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム）。 比較例１において、溶出工程で得られる画分の純度を確認した結果（サイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム）。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は前記例に限定されるものではない。

実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質の調製
以降の実施例で用いるＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を、以下の方法で調製した。
（１）配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）を含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲ９Ｔ８−Ｒ１を、特開２０１４−２２３０６４号公報で開示の方法にて作成し、当該発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換した。なお配列番号３に記載の配列からなるＦｃ結合性タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において以下の（Ｉ）から（ＩＶ）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質である（特願２０１５−０４７４６２号）。
（Ｉ）配列番号２の４５番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換
（ＩＩ）配列番号２の６４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（ＩＩＩ）配列番号２の１３３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（ＩＶ）配列番号２の１８７番目のフェニルアラニンがセリンに置換
（２）得られた組換え大腸菌を、特開２０１２−０３４５９１号公報および特開２０１３−０８５５３１号公報で開示の方法に基づき、培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質を発現させた。
（３）組換え大腸菌の培養液より菌体を回収後、抽出液（１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、４０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、２５０Ｕｎｉｔ／ＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）、０．０００５（ｗ／ｖ）％のリゾチーム、０．５（ｗ／ｖ）％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）、および０．００１（ｗ／ｖ）％のデオキシコール酸ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０））を用いて、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
（４）（３）で得られた菌体抽出液から遠心分離により上清を回収し、Ｆｃ結合性タンパク質抽出液を得た。
（５）（４）で得られた抽出液を陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に添加するため、イオン強度（電気伝導度）が５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム濃度に相当するイオン強度となるよう調整した。

実施例２ Ｆｃ結合性タンパク質の精製
（１）実施例１の（５）で得られたＦｃ結合性タンパク質抽出液を、５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを添加した２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）であらかじめ平衡化させた陽イオン交換クロマトグラフィー用担体ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ−６５０Ｍ（東ソー社製）にアプライすることで、Ｆｃ結合性タンパク質を前記担体に吸着させた。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質を吸着した前記担体を、５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを添加した２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄することで、夾雑不純物を除去した（第一の洗浄工程）。
（３）さらに１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを添加した２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄することで、夾雑不純物を除去した（第二の洗浄工程）。
（４）３５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを添加した２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）をＦｃ結合性タンパク質を吸着した前記担体にアプライすることで、前記Ｆｃ結合性タンパク質を溶出させた（溶出工程）。
（５）第二の洗浄工程で得られた画分、および溶出工程で得られた画分に含まれるＦｃ結合性タンパク質の量を特開２０１４−２２３０６４号公報で開示のＥＬＩＳＡ法を用いて得た後、各画分に含まれるＦｃ結合性タンパク質の量を添加したＦｃ結合性タンパク質の量で除することで、Ｆｃ結合性タンパク質の回収率を算出した。またＦｃ結合性タンパク質の純度はサイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、東ソー社製）分析により算出した。

実施例３から５ならびに比較例１から４
実施例２（２）に記載の第一の洗浄工程、実施例２（３）に記載の第二の洗浄工程、および実施例２（４）に記載の溶出工程、で用いた２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中に含まれる塩化ナトリウムの濃度をそれぞれ表１に示す濃度とした他は、実施例２と同様な方法でＦｃ結合性タンパク質の精製を行なった。なお比較例１および２は、第二の洗浄工程をスキップしている。

実施例２から５ならびに比較例１から４の結果を表２にまとめて示す。第二の洗浄工程で用いる洗浄液に含まれる塩化ナトリウム濃度を１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下かつ第一の洗浄工程で用いる洗浄液に含まれる塩化ナトリウム濃度（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）以上とし、溶出工程で用いる洗浄液に含まれる塩化ナトリウム濃度を２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上とすることで、溶出工程で得られる画分におけるＦｃ結合性タンパク質の回収率が６５％以上かつ純度も８５％以上となり、Ｆｃ結合性タンパク質を高回収率かつ高純度に精製できることがわかる（実施例２から５）。なお実施例２において、溶出工程で得られる画分の純度を確認した結果（クロマトグラム）を図２に示す。

一方、第二の洗浄工程をスキップすると、溶出工程で得られる画分におけるＦｃ結合性タンパク質の純度（比較例１）または回収率（比較例２）が低下することがわかる。また第二の洗浄工程を行なっても、第二の洗浄工程で用いる洗浄液に含まれる塩化ナトリウム濃度が２００ｍｍｏｌ／Ｌ以上とすると、第二の洗浄工程で得られる画分にＦｃ結合性タンパク質が溶出するため、溶出工程で得られる画分におけるＦｃ結合性タンパク質の回収率（比較例３および４）が大きく低下することがわかる。なお比較例１において、溶出工程で得られる画分の純度を確認した結果（クロマトグラム）を図３に示す。

Claims (1)

1. （１）陽イオン交換クロマトグラフィー用担体に、Ｆｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加することで、前記担体にＦｃ結合性タンパク質を吸着させる工程と、
   （２）洗浄液を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質を吸着した前記担体を洗浄する工程と、
   （３）溶出液を用いて、前記担体に吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出させる工程と、
   を含むＦｃ結合性タンパク質の精製方法であって、
   前記（２）の工程が、５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む第一の洗浄液を用いて洗浄した後、１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む第二の洗浄液を用いて洗浄する工程であり、
   前記（３）の工程が、３００ｍｍｏｌ／Ｌ以上４００ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含む溶出液を用いてＦｃ結合性タンパク質を溶出させる工程であり、
   Ｆｃ結合性タンパク質が、
   （ｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質、または
   （ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１以上のアミノ酸置換が生じているアミノ酸配列のうち少なくとも３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質である、
   方法；
   （ａ）配列番号１の６６番目に該当するロイシンがヒスチジンまたはアルギニンに置換
   （ｂ）配列番号１の１４７番目に該当するグリシンがアスパラギン酸に置換
   （ｃ）配列番号１の１５８番目に該当するチロシンがヒスチジンに置換
   （ｄ）配列番号１の１７６番目に該当するバリンがフェニルアラニンに置換。

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