JP6549705B2 - 自己蛍光の存在下での、生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージング - Google Patents

Description

関連出願へのクロスリファレンス
本願は、２０１４年９月２９日に提出された米国特許仮出願第６２／０５６８３０号に関連し、その仮出願の開示は参照により本明細書に組み入れられる。

技術分野
本発明は蛍光イメージングに関し、特に自己蛍光の存在下での、生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージングに関する。

ライフサイエンスでは、生物的物質を特定し解析する非侵襲的方法として蛍光が多く用いられる。タンパク質、核酸、脂肪、細胞および細胞コンポーネント、幹細胞、または小分子などの生物的物質内の特定ターゲットを、外来性または外因性の蛍光体でラベルすることができ、したがって、後でイメージすることができる。生物的物質はまた、生来的に蛍光性であり、これは生来的蛍光性または「自己蛍光」として知られている。それは外因的に与えられた蛍光体がない状態で生じるからである。自己蛍光は、生物的物質内の種々の内因性蛍光体に起因すると信じられている。そのような外因性蛍光体は例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、エラスチン、コラーゲン、フラビン、アミノ酸、およびポルフィリンを含む。

適切な励起波長を伴う光が生物的物質を照らすとき、自己蛍光および蛍光放射が生成され、イメージとして記録されうる。しかしながら、自己蛍光は蛍光体の組み合わせの結果であって数百ナノメートルに亘って延在する広い放射スペクトルにより特徴付けられる。特定の蛍光体の放射スペクトルと自己蛍光の放射スペクトルとが重なり合うとき、自己蛍光はその特定の蛍光体の放射を検出する能力と干渉しうる。そのような場合、関心のある蛍光体の蛍光をマスクすることによって信号検出感度を低減することに加えて、自己蛍光は偽陽性の結果を提供することによって検出の特定性を低減しうる。

この課題を解決するためのひとつのアプローチは、生物的物質の自己蛍光からの寄与分の検出放射信号を低減するか最小化する手段を用いることである。従来技術は、イメージ取得の前に生物的物質の種々の前処理を用いることで自己蛍光を低減する方法を説明する。しかしながら、そのような技術は生物的物質そのものの質を低下させ、多くの場合生体内アプリケーションには向かない。代替として、自己蛍光放射そのものを軽減することができない場合、取得された蛍光イメージのデジタル操作の手段によって、自己蛍光からの信号のイメージデータに対する寄与を最小化することが可能である。例えば、関心のある蛍光体および自己蛍光の両方からの合成信号を含むイメージでは、これらの方法のいくつかは、「純な」自己蛍光信号の予測を取得することと、そのような予測を用いて重み付け減算により自己蛍光を除去することと、に依存する。他の方法は、統計的相関技術を用いて追加的な自己蛍光信号を矯正する。これらのイメージデータ操作技術は従来技術文献に記載されているが、総じて、確度の低さによって、小さな（すなわち、低解像度）データセットの必要性によって、またはかなりの後処理の必要性によって、制限されている。したがって、生物的物質内の関心のある蛍光体によって放射された蛍光を、同じ生物的物質内の自己蛍光放射から素早くかつ正確に区別するための、高解像度イメージ処理技術を確立することが望ましい。

本発明のある態様によると、生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージを抽出するための方法であって、ターゲット蛍光体の放射の波長帯は生物的物質内の自己蛍光の放射の波長帯と重なる、方法が提供される。方法は、第１励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光およびターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる第１蛍光放射を誘起し、かつ、第２励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光から生じる第２蛍光放射を誘起することと、第１蛍光放射から第１蛍光イメージを取得し、かつ、第２蛍光放射から第２蛍光イメージを取得することと、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージを処理することで、ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを抽出することと、を含み、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージが取得される前に、第１励起光の相対強度と第２励起光の相対強度とが変調される。処理は、例えば、第１蛍光イメージから第２蛍光イメージを減じることを含んでもよい。

ある実施の形態によると、相対強度の変調は、第１蛍光放射および第２蛍光放射における波長領域を特定することであって、波長領域では蛍光体から生じる放射が第１蛍光放射には存在し、かつ、第２蛍光放射には存在しない、特定することと、波長領域の外側の波長帯を選択することと、選択された波長帯における、第１蛍光放射の相対強度と第２蛍光放射の相対強度との比を算出することと、第１励起光の相対強度および第２励起光の相対強度を調整することで、適切な算出比が達成されるまで、対応する第１蛍光放射または対応する第２蛍光放射もしくはその両方を調整することと、を含む。ある実施の形態によると、第１蛍光放射の相対強度と第２蛍光放射の相対強度との比は、第１蛍光放射に対応する曲線下面積値を第２蛍光放射に対応する曲線下面積値で除すことによって算出されてもよい。

本発明の別の態様によると、生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージを抽出するためのシステムであって、ターゲット蛍光体の放射の波長帯は生物的物質内の自己蛍光の放射の波長帯と重なる、システムが提供される。システムは、第１励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光およびターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる第１蛍光放射を誘起し、かつ、第２励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光から生じる第２蛍光放射を誘起する手段と、第１蛍光放射から第１蛍光イメージを取得し、かつ、第２蛍光放射から第２蛍光イメージを取得する手段と、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージの取得の前に、第１励起光の相対強度と第２励起光の相対強度とを変調する手段と、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージを処理することで、ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを抽出する手段と、を備える。ある実施の形態によると、照らす手段は照明モジュールを含み、取得する手段は蛍光放射取得モジュールを含み、処理する手段はプロセッサモジュールを含む。

ターゲット蛍光体がポルフィリンである実施の形態では、例えば、第１励起光は約４０５ｎｍの波長を有し、かつ、第２励起光は約４５０ｎｍの波長を有し、選択された波長帯は約６００ｎｍであり、算出比は約１である。

添付の図面は本発明の実施の形態を説明する。
実施の形態に係る例示的な方法を模式的に説明する。 尿中の自己蛍光およびポルフィリンから生じる蛍光スペクトル（図２Ａ）と、尿中の自己蛍光（図２Ｂ）と、種々の実施の形態にしたがって得られたポルフィリンのみに対応する差分スペクトル（図２Ｃ）と、を示す。 実施の形態に係る、４０５ｎｍおよび４５０ｎｍにおける、新鮮採取尿の蛍光スペクトル（図３Ａ）および光脱色された尿の蛍光スペクトル（図３Ｂ）を示す。 図３の蛍光スペクトルに対応するイメージを示す。ここで、左列（Ａ、Ｃ、Ｅ）は新鮮採取尿に関し、右列（Ｂ、Ｄ、Ｆ）は光脱色された尿に関し、上段（Ａ、Ｂ）は約４０５ｎｍの励起からの蛍光イメージに関し、中段（Ｃ、Ｄ）は約４５０ｎｍの励起からの蛍光イメージに関し、下段（Ｅ、Ｆ）は実施の形態にしたがい得られたターゲット蛍光体（ポルフィリン）に対応する差分イメージを示す。 図５Ａは、４０５ｎｍ光で励起されたときの対象の前腕の生体内蛍光イメージの例を示し、これは前腕からの自己蛍光とポルフィリン蛍光とを表している。図５Ｂは、４５０ｎｍ光で励起されたときの図５Ａと同じ前腕の領域の蛍光イメージを示し、これは図５Ａの自己蛍光レベルと同様なレベルまで自己蛍光が低減したことを示しており、４５０ｎｍ励起の下ではポルフィリン蛍光はない。図５Ｃは、実施の形態にしたがい自己蛍光が除去された状態の、ポルフィリンの蛍光イメージを示す。 図６Ａは、励起強度が６００ｎｍで調整された後の４０５ｎｍおよび４５０ｎｍにおける背景強度値を示す。励起間において、背景値の間の約２％より小さい差分が観測された。図６Ｂは、４０５ｎｍで励起された蛍光イメージからの信号対ノイズ比と、実施の形態にしたがって背景が除去された後の信号対ノイズ比と、の比較を示す。 実施の形態に係る、生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージを抽出するためのシステムを示す。 実施の形態に係る照明モジュールを示す。 実施の形態に係る蛍光放射取得モジュールを示す。

本発明の種々の態様および変形例の実装および実施の形態が以下に詳述される。それらの例は添付の図面に示される。

本発明のある態様によると、生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージを抽出するための方法であって、前記ターゲット蛍光体の放射の波長帯は前記生物的物質内の自己蛍光の放射の波長帯と重なる、方法が提供される。図１は、実施の形態に係る本発明の方法が模式的に示される。図１を参照すると、方法は、第１励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光およびターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる第１蛍光放射を誘起し、かつ、第２励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光から生じる第２蛍光放射を誘起することと、第１蛍光放射から第１蛍光イメージを取得し、かつ、第２蛍光放射から第２蛍光イメージを取得することと、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージを処理することで、ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを取得することと、を含み、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージが取得される前に、第１励起光の相対強度と第２励起光の相対強度とが変調される。

種々の実施の形態では、生物的物質は、生物的対象（例えば、ほ乳類）から導かれるかそれから得られるかそこにある物質を含み、さらには生体外の、元の位置の、または生体内の物質を含む。生物的物質の例は、人を含むほ乳類から導かれるかそこにある、生物的組織または流体もしくはそれらの一部と、器官と、細胞と、細胞株と、細胞構成物と、を含む。生物的物質は、例えば対象の発展の任意の時における上皮や結合組織や血管や筋肉や神経組織や骨などの対象から得られるか導かれるか該対象の組織にある細胞集合を含む。種々の実施の形態では、生物的物質は、ターゲット蛍光体（例えば、ポルフィリン）を含む健康な組織、病的組織、または悪性組織（例えば、がん組織または腫瘍組織）を含む。生物的物質の例はさらに、対象（人、動物）内に存在するバクテリアを含むバクテリアを含む。流体である生物的物質の例は、尿、リンパ液、血漿、血液を含む。種々の実施の形態では、生物的物質は、組織化学、免疫組織化学、細胞化学、免疫蛍光法、免疫ブロット法、または他の蛍光関連イメージング応用で用いられる組織部分であってもよい。

種々の実施の形態では、生物的物質内のターゲット蛍光体は、特定の波長の光で励起されたときに、異なる、典型的にはより長い、波長の光を発する蛍光体である。ターゲット蛍光体は、解析的関心、予後的関心、診断的関心、生理学的関心、病理的関心、またはそれらの組み合わせ、のある蛍光体を含む。種々の実施の形態では、ターゲット蛍光体は生物的物質内に自然に生じるもの（すなわち、内因性蛍光体）であってもよく、生物的物質に前駆体または最終形態の形で外から与えられたもの（すなわち、外因性蛍光体）であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。自然に生じるまたは内因性蛍光体の例は、ポルフィリンと、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）と、エラスチンと、コラーゲンと、フラビンと、アミノ酸と、を含む。ポルフィリンがターゲット蛍光体である実施の形態では、ポルフィリンは、関連する生物系にある有機化合物のクラスであってヘムの生合成における前駆中間体として形成される有機化合物のクラスを含む。例えば、人および他のほ乳類において共通に、８−、７−、６−、５−および４−カルボキシル基を伴うポルフィリンがヘムの合成で過剰量形成され、したがって、尿中に排出される。種々の実施の形態では、「ポルフィリン」という用語は、例えば、ポルフィリン派生物、コプロポルフィリン、ウロポルフィリン、プロトポルフィリン、ポルフィリン共役物、リポソーム、およびナノ小胞を含む。

外因性蛍光体の例は、生物的物質のコンポーネントに蛍光性を提供するか、該蛍光性を強化する（例えば、高める）ために用いられうる薬剤を含む種々の蛍光プローブまたは蛍光を含む。例えば、蛍光プローブは、コンポーネント内の内因性蛍光体の蛍光性を高めるために、生物的物質のそのコンポーネントに関連付けられるかまたは取り付けられてもよい。外因性蛍光プローブの例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、蛍光色素、４’６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、およびエオシンを含む。蛍光誘起剤の例は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）の産出を誘起するために細胞の染色体に挿入されてもよい遺伝子を含む。蛍光誘起剤は、ターゲット蛍光体の蛍光応答を強化できる補助剤であってもよい。例えば、ターゲット蛍光体がポルフィリンである実施の形態では、補助剤は、選択された食物源（例えば、ポルフィリン的食物または化学物質）、アミノレブリン酸、またはＨＥＭＥ経路における所定の酵素の抑制剤（例えば、フェロケラターゼ抑制剤）であってもよい。抑制剤は、消費されるか対象に与えられた場合、ポルフィリンの蛍光応答を増大させる。

生物的物質は、生物的物質内に存在する種々の内因性蛍光体のため、外から与えられた蛍光体がなくても自然に蛍光を示すか「自己蛍光」する。自己蛍光は、生物的物質内の種々の蛍光体に起因する。そのような蛍光体は例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、エラスチン、コラーゲン、フラビン、アミノ酸、リポフスチン、終末糖化産物およびポルフィリンを含む。本発明の方法およびシステムの種々の実施の形態において、生物的物質は、用いられる前に処理されたかそうでなければ扱われた物質を含む。例えば、ある実施の形態では、前処理は、生物的物質を光脱色することで生物的物質の自己蛍光を低減することを含んでもよい。この低減は、おそらく、自己蛍光に係る内因性蛍光体のいくつかを非活性化することによるものである。したがって、ターゲット蛍光体が生物的物質内において光脱色に対する感度が比較的低いか自己蛍光に係る蛍光体よりも低いレートで光脱色される場合に、ターゲット蛍光体の後の解像度の明瞭化を促進できる。

種々の実施の形態では、方法は、生物的物質を第１励起光で照らすことで、生物的物質の自己蛍光およびターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる第１蛍光放射を誘起することと、生物的物質を第２励起光で照らすことで、生物的物質の自己蛍光から生じる第２蛍光放射を誘起することと、を含む。種々の実施の形態では、第１励起光の波長は、第１励起光が生物的物質を照らす場合に、自己蛍光を生じさせる生物的物質内の蛍光体およびターゲット蛍光体の両方が励起され、第１蛍光放射を発するように、選択される。種々の実施の形態では、第２励起光の波長は、自己蛍光を生じさせる生物的物質内の蛍光体のみが励起され、第２蛍光放射を発するように、選択される。種々の実施の形態では、例えば、第１励起光は約３５０ｎｍから約４５０ｎｍの範囲の波長を有してもよく、第２励起光は約４５０ｎｍから約７００ｎｍの範囲の波長を有してもよい。第１励起光および第２励起光で生物的物質を照らすことは、間欠的照明、連続照明またはそれらの組み合わせを含む。

ターゲット蛍光体がポルフィリンである実施の形態では、第１励起光は約４０５ｎｍの波長を有し、かつ、第２励起光は約４５０ｎｍの波長を有する。図２（の影付き領域）は、尿中のポルフィリンから得られたデータを示す。特に、図２Ａは、尿中の自己蛍光およびポルフィリンの両方から生じた第１蛍光放射スペクトルであり、図２Ｂは、自己蛍光のみから生じた第２蛍光放射スペクトルである。図２Ｃは、ポルフィリンのみに対応する差分スペクトルである。図２に示される例では、尿は光脱色により前処理され、これによりポルフィリンと自己蛍光とのより良い区別が促進された。特に、約４５０ｎｍの波長の第２励起光で約３分間尿を照らすことで光脱色前処理が行われ、これにより未処理尿と比較して尿のポルフィリンと自己蛍光との改善された区別が得られた（図３）。図３は、新鮮採取尿からの蛍光スペクトル（図３Ａ）と、約４５０ｎｍの光への尿の約３分間の光脱色暴露の後に取得されたスペクトルと、を示す。

種々の実施の形態によると、方法は、第１蛍光放射から第１蛍光イメージを取得し、かつ、第２蛍光放射から第２蛍光イメージを取得することと、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージを処理することで、ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを抽出することと、を含み、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージが取得される前に、第１励起光の相対強度と第２励起光の相対強度とが変調される。図４Ａから４Ｄは図３のスペクトルに対応するイメージを示し、尿が新鮮採取されたとき、および、尿が約４５０ｎｍの光に約３分間曝されたとき、に取得されたものである。図４Ｅおよび４Ｆは、種々の実施の形態との関係で説明される処理の結果得られる、ポルフィリンのみに対応する差分イメージである。

ある実施の形態によると、イメージ取得前の相対強度の変調は、第１蛍光放射および第２蛍光放射における波長領域を特定することであって、波長領域では蛍光体から生じる放射が第１蛍光放射には存在し、かつ、第２蛍光放射には存在しない、特定することと、波長領域の外側の波長帯を選択することと、選択された波長帯における、第１蛍光放射の相対強度と第２蛍光放射の相対強度との比を算出することと、第１励起光の相対強度および第２励起光の相対強度を調整することで、適切な算出比が達成されるまで、対応する第１蛍光放射または対応する第２蛍光放射もしくはその両方を調整することと、を含む。種々の実施の形態によると、波長帯は波長を含む。例えば、ターゲット蛍光体がポルフィリンである実施の形態では、図２Ｃや図３Ｂに示されるように、ある波長領域において、ポルフィリンから生じる放射が第１蛍光放射中に存在する一方、第２蛍光放射には存在しない。この波長領域は、例えば、約６１５ｎｍから約６２５ｎｍの範囲、および約６６０ｎｍから約７００ｎｍの範囲にある。したがって、この波長領域の外の波長帯として６００ｎｍが選択された。これは、相対強度の調整が必要か否かを決定するために４０５ｎｍおよび４５０ｎｍにおける相対強度の比が計算される波長帯として用いられた。本例では、算出比がプラスマイナス２％内で約１となることが達成されるまで、相対強度が調整された。本例では、第１蛍光放射（すなわち、約４０５ｎｍの励起から生じる放射）に対応する曲線下面積値を第２蛍光放射（すなわち、４５０ｎｍの励起から生じる放射）に対応する曲線下面積値で除すことによって、６００ｎｍ波長帯において比が算出された。種々の実施の形態では、第１蛍光放射の選択された波長帯（例えば、選択された波長）の強度を第２蛍光放射の選択された波長帯（例えば、選択された波長）の強度で除すことによって、比が算出されてもよい。種々の実施の形態において、比を算出するために他の方法が用いられてもよい。例えば、そのような算出のために、面積ではなく、選択された波長帯（例えば、６００ｎｍ）での４０５ｎｍおよび４５０ｎｍの放射のそれぞれから生じるスペクトルのひとつ以上の強度点を用いてもよい。

種々の実施の形態では、処理は、第１蛍光イメージから第２蛍光イメージを減じることでターゲット蛍光体の自己蛍光無しイメージを生成することを含む（例えば、図４Ｅおよび４Ｆ）。

種々の実施の形態に係る方法およびシステムは、元の位置の蛍光を検出するために用いられてもよい。図５および図６の実験データは、ポルフィリンが対象の皮膚に局所的に与えられた場合の例示的結果を示す。この例では、約０．１ｍｇのコプロポルフィリンエステル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を約１０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶かすことでポルフィリン溶液が準備された。ポルフィリン溶液は、Ｑ−チップを用いて対象の前腕の小さな領域に塗布された。データを取得するために用いられた蛍光イメージングシステムは、約４０５ｎｍおよび約４５０ｎｍの最大ポルフィリン吸収における二重励起能力を特徴としていた。後者は、高レベルの組織自己蛍光を誘起するその特性により、主たるポルフィリン吸収帯の外における最も短い波長として、選択された。反射励起光が蛍光イメージと干渉しないことを確かなものとするために、イメージングシステム内のディテクタの前に６００ｎｍバンドパスフィルタ（６００ｎｍプラスマイナス５ｎｍ）が置かれた。また、４５０ｎｍでの自己蛍光と４０５ｎｍでの自己蛍光との比が約１に達するまで、４０５ｎｍおよび４５０ｎｍの励起強度が変調された。図５Ａは、４０５ｎｍ光で励起されたときの対象の前腕の生体内蛍光イメージであり、前腕からの自己蛍光およびポルフィリン蛍光を表す。図５Ｂは、４５０ｎｍ光で励起したときの図５Ａと同じ前腕の領域の蛍光イメージである。４５０ｎｍ励起により誘起された自己蛍光は４０５ｎｍ励起により誘起された自己蛍光よりも大きいので、４５０ｎｍの励起光を変調して、図５Ａの自己蛍光レベルと同様なレベルの自己蛍光を生成するようにした。図５Ｃは、実施の形態にしたがい自己蛍光が除去されたポルフィリンの蛍光イメージを示す。

図５Ａは、４０５ｎｍの単一励起を用いることでポルフィリン蛍光から生じる良く局所化された蛍光領域を生成することができることを示す。周囲の領域における高レベルの背景は、皮膚にいくつかの内因性蛍光体（例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、および脂肪）が存在することから生じる。同じ領域がポルフィリンの吸収スペクトルから離れた異なる励起波長（４５０ｎｍ）で励起された場合に、同様な自己蛍光パターンが観測されうる（図５Ｂ）。図５Ｃは、本発明の方法にしたがう処理の後に得られるイメージを示し、そこでは方法を用いることで自己蛍光の減衰に成功している。

図６Ａは、励起強度が６００ｎｍで調整された後の４０５ｎｍおよび４５０ｎｍにおける背景強度値を示す。励起間において、背景値の間の約２％より小さい差分が観測された。図６Ｂは、４０５ｎｍで励起された蛍光イメージからの信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）と、実施の形態にしたがって背景が除去された後の信号対ノイズ比と、の比較を示す。このアプローチを用いることで、４０５ｎｍでの単一励起を用いる場合と比べてＳ／Ｎ比の増大を達成することができる（図６Ｂを参照、そこではそれぞれ約２８．５、約１．９のＳ／Ｎ比が示される）。

種々の従来のアプローチは蛍光イメージの同時取得を含み、そこでは全ての蛍光種が照らされ、その蛍光放射が同時に収集される。次いで、取得されたイメージは、スペクトル分解や背景差分を含むひとつ以上の自己蛍光除去モデルを用いて処理される。自己蛍光を除去するために、差分を明らかにするためのスペクトル分解（線形分解）およびデジタル背景差分などの種々の従来アプローチが提案されてきたが、そのようなアプローチは取得後にイメージを操作すること、および自己蛍光の予め特徴付けられたスペクトルに依存し、したがって、較正が必要となり、またターゲット蛍光体の濃度に基づいて感度が変わりやすい。これらの方法はコスト効率的であって生体外イメージングおよび生体内イメージングの両方に適用可能ではあるが、それらが蛍光イメージから自己蛍光成分を完全に除去することは不可能であり、さらに機器の背景信号を扱うことも不可能である。種々の実施の形態との関連で説明された、イメージ取得前の第１励起光の相対強度および第２励起光の相対強度の変調は、例えば自己蛍光を生じさせる生物的物質内の蛍光体とターゲット蛍光体（例えば、ポルフィリン）との間で異なる光脱色レート、による放射の相対時間変化を補償する。従来技術で説明されるようにイメージ取得後にデジタル的に強度の変調が行われる場合、二つのイメージを処理してターゲット蛍光体のイメージを導く（例えば、減算）際の確度は低下する。特に、第１蛍光信号の強度と第２蛍光信号の強度とがかなり異なる場合はそうである。従来技術に係るスペクトル分解方法では多くの場合、サンプル中の自己蛍光量を予め知る必要があるが、これは一定で無い場合もある。加えて、生物的物質のイメージは、取得システムそのものからくる所定量のノイズや背景を含みうる。したがって、本発明と比べて、従来技術で教示されるイメージ取得後の強度正規化は、特にターゲット蛍光体が自己蛍光信号（例えば、内因性蛍光体または生物的物質の低濃度コンポーネント内の蛍光体）と比べてより低いレベルの信号を有する場合に、より多くのノイズを含み、かつその信号の質は限られる。さらに、従来技術で教示されるターゲット蛍光体の低レベル信号のイメージ取得後増幅は、機器背景信号も増幅し、それは信号の質に対してさらなる負の影響を与える。従来技術のアプローチとは違い、本発明は生物的物質内の蛍光の変化の動的リアルタイム補償を促進し、したがって、生物的物質の性質のリアルタイム表現を可能とする。

種々の実施の形態にしたがい生成されたデータは、種々の実施の形態との関連で説明された本発明の二重励起方法が、蛍光イメージの取得の前に選択波長での自己蛍光強度を変調することによって、生物組織の蛍光イメージング中に蛍光背景信号を低減するか軽減することを促進することを示す。種々の実施の形態によると、スペクトルイメージの取得は、計時された励起および一度に関心ターゲット蛍光体または背景のみからの光収集によって実行される。この励起と蛍光収集との時間的分離は、クロストークを最小化する。同じ励起源の下で放射信号を収集する代わりに、種々の実施の形態に係る本方法は、第２励起波長（これは関心ターゲット蛍光体からの蛍光を誘起しない）によって等価な背景レベルを誘起する。次いで、関心ターゲット蛍光体からの蛍光信号を低減することなしに、その背景レベルを減じることができる。

本方法は、組織自己蛍光が蛍光イメージングに影響を与える蛍光イメージングアプリケーションにとって有益でありうる。異なる励起源からの等価な自己蛍光シグネチャの検出は、単一蛍光励起よりも正確な分子診断を促進する。さらに、種々の実施の形態にしたがう二重蛍光イメージングアプローチは、他の処理後解析技術よりも堅牢かつ正確である。関心蛍光体の蛍光強度は、背景をデジタル的に除去することや背景レベルを変調することによっては影響を受けないからである。実施の形態にしたがい収集された実験データにより示されるように、本方法は、ポルフィリンなどの蛍光体の優先蓄積を用いることによる悪性組織の生体内特定のために用いられうる。

本発明のある態様によると、生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージを抽出するためのシステムが提供される。システムは、第１励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光およびターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる第１蛍光放射を誘起し、かつ、第２励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光から生じる第２蛍光放射を誘起する手段と、第１蛍光放射から第１蛍光イメージを取得し、かつ、第２蛍光放射から第２蛍光イメージを取得する手段と、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージの取得の前に、第１励起光の相対強度と第２励起光の相対強度とを変調する手段と、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージを処理することで、ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを抽出する手段と、を備える。

本発明の方法の種々の実施の形態に関連して、システムに関する選択された態様が上述のように説明された。図７を参照すると、生物的物質１４内のターゲット蛍光体１５のイメージを抽出するためのシステム１０の例示的実施の形態が示される。システム１０は、二重蛍光励起光で生物的物質１４を照らすための照明手段１２（例えば、生物的物質を照らすよう構成された光源）と、自己蛍光およびターゲット蛍光体の両方から生じる蛍光イメージおよび自己蛍光だけから生じる蛍光イメージを取得する手段１６（例えば、蛍光イメージを取得するよう構成されたイメージ取得アセンブリ）と、取得された蛍光イメージを処理してターゲット蛍光体のみを表すイメージを抽出する手段１８（例えば、取得されたイメージを処理するよう構成されたプロセッサアセンブリ）と、を備える。種々の実施の形態では、照明手段１２は例えば図８に示される照明モジュール２０を備える。照明モジュール２０は、ターゲット蛍光体および自己蛍光を生じさせる蛍光体を励起するのに適切な強度および波長を有する蛍光励起を提供するよう構成された蛍光励起源２２を備える。ある実施の形態では、蛍光励起源２２は、自己蛍光およびターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる放射を誘起するための第１励起光と、自己蛍光のみから生じる放射を誘起するための第２励起光と、を提供するための二重励起能力を有する単一励起源であってもよい。他の実施の形態では、蛍光励起源２２は二つの励起源（不図示）を含んでもよく、その一方は第１励起光を提供するためのものであり、他方は第２励起光を提供するためのものである。種々の実施の形態では、蛍光励起源２２は例えば、レーザダイオード（これは、例えば、ひとつ以上のファイバで接続されたダイオードレーザを含んでもよい）、ひとつ以上のＬＥＤ、アークランプ、または第１励起光および第２励起光を提供するのに十分な強度および適切な波長を有する他の照明技術を含む。種々の実施の形態では、蛍光励起源２２からの第１励起光および第２励起光は光学要素（すなわち、ひとつ以上の光学要素）を通じて投影されることで、生物サンプルを照らすのに用いられるべき出力を形成しかつ導くようにしてもよい。形成用光学要素は、例えば、ひとつ以上のレンズと、光ガイドと、ディフューザと、を含んでもよい。図８に示されるように、蛍光励起源２２からの出力２４はひとつ以上の収束レンズ２６を通過し、例えばＮｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＵＳＡから普通に取得可能なライトパイプなどの均質化ライトパイプ２８を通過する。最後に、光は、例えばＮｅｗｐｏｒｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＵＳＡから取得可能なすりガラスディフューザなどの光学ディフューザ３０（すなわち、ひとつ以上の光学ディフューザまたは回折要素）を通過する。蛍光励起源２２そのものへの電力は、例えばＬｕｍｉｎａ Ｐｏｗｅｒ Ｉｎｃ．， ＵＳＡから取得可能な大電流レーザドライバなどによって提供される。蛍光励起源２２がレーザである実施の形態では、レーザは、イメージ取得プロセス中、パルスモードで動作してもよい。本実施の形態では、ソリッドステートフォトダイオード３２などの光学センサは照明モジュール２０に組み込まれ、照明モジュール２０によって生成される照明強度を、種々の光学要素からの散乱や拡散反射を介してサンプルする。

代替的な実施の形態では、照明手段１２は、白色光照明などの追加的機能を提供するよう構成されてもよい。他の実施の形態では、本発明の方法およびシステムはさらに、ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを取得し、それを生物的物質の白色光イメージと合成することを含んでもよい。これにより、生物的物質のコンテキスト内でのターゲット蛍光体の位置が可視化される。生物的物質が人間の目では直接観察できない例においてこれは有用である。

種々の実施の形態では、図８の照明モジュール２０は、強度調整を可能とするために、蛍光励起源２２からの第１励起光の相対強度および第２励起光の相対強度を変調する手段（不図示）を備える。そのような変調手段は、光源への電力の変調、シャッタやアパーチャやチョッパによる光ビームの機械的遮断、光学的または光機械的または電気光学的そらし、光ビームのフィルタリングやブロッキング、または同様の手段、を含んでもよい。

図７に戻り、取得手段１６は、例えば、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージを取得するための図９に示される蛍光放射取得モジュール３０（例えば、カメラモジュール）を含む。図９に示されるように、生物的物質内のターゲット蛍光体からの蛍光放射４２および自己蛍光を生じさせる他の蛍光体からの蛍光放射またはその両方は、種々の光学要素、例えば４６ａ、４６ｂ、４８および５０の構成を用いて集められ、イメージセンサ４４に集束される。イメージセンサ４４によって変換された光信号から得られる電荷は、蛍光放射取得モジュール３０内の適切な読み出しおよび増幅エレクトロニクスによってビデオ信号に変換される。

図７に戻り、種々の実施の形態において、処理手段１８（例えば、プロセッサアセンブリ）は、例えば、放射信号を解析し、第１蛍光イメージから第２蛍光イメージを減じるための計算を行い、適切なディスプレイおよび／または記録デバイスに算出された情報を出力するためのプロセッサモジュール（不図示）を備える。種々の実施の形態において、プロセッサモジュールは、タブレットやラップトップやデスクトップやネットワークコンピュータなどの任意のコンピュータまたは計算手段を含む。種々の実施の形態では、プロセッサモジュールは、内部メモリやハードディスクやフラッシュメモリなどの実体的非一時的コンピュータ可読媒体にデータ（例えば、イメージシーケンス）を保存する能力を伴うデータ格納モジュールを有してもよく、それにより取得データの記録および／または後処理が可能となる。種々の実施の形態では、プロセッサモジュールは内部クロックを有してもよく、これにより種々の要素の制御が可能となり、また照明およびセンサシャッタの正しいタイミングが保証される。種々の他の実施の形態では、プロセッサモジュールはユーザ入力と出力のグラフィカル表示とを提供してもよい。イメージングシステムはオプションで、ビデオディスプレイ（不図示）を備えてもよい。このビデオディスプレイは、イメージが取得されているときにまたは記録された後の再生においてイメージを表示し、またはさらに方法の種々の段階において生成されたデータを可視化してもよい。種々の実施の形態において、処理手段はイメージングシステムと通信するか、またはイメージングシステムのコンポーネントである。実施の形態に係るイメージングシステムの例は内視鏡である。

動作において、および引き続き図７から図９の実施の形態を参照すると、生物的物質は、照明モジュール２０を含むシステム１０の照明手段１２の照明経路のなかに配置される。この場合、例えば、照明モジュール２０は生物的物質の領域の実質的に全体に亘って実質的に一様な照明フィールドを生成する。蛍光励起源２２（例えば、レーザダイオード）に電源が投入され、それはイメージセンサ（例えば、蛍光放射取得モジュール３０のイメージセンサ４４）のシャッタシーケンスを開始する。生物的物質からの蛍光放射は、図９の光学要素４６ａなどの蛍光放射取得モジュール３０のフロントイメージング光学要素によって、選択波長帯（例えば、ポルフィリンについて選択波長帯は約６００ｎｍ）において集められる。そして、相対強度の比が算出される。算出された比が適切な場合（例えば、ポルフィリンについて、適切な算出比は約０．９８から１．０２の範囲内である）、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージが取得される。比が適切でない場合、第１励起光の相対強度および第２励起光の相対強度が変調され、適切な比が達成されるまで比が再計算される。次いで、取得された第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージが減算され、ターゲット蛍光体のみを表す第３蛍光イメージが抽出される。

本発明の他の態様によると、コンピュータ実行可能（可読）プログラムコード手段を組み込みの形で有する実体的非一時的コンピュータ可読媒体が提供される。該プログラムコード手段は生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージを抽出するための方法であって、前記ターゲット蛍光体の放射の波長帯は前記生物的物質内の自己蛍光の放射の波長帯と重なる方法を含む。方法は、第１励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光およびターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる第１蛍光放射を誘起し、かつ、第２励起光で生物的物質を照らすことで生物的物質の自己蛍光から生じる第２蛍光放射を誘起することと、第１蛍光放射から第１蛍光イメージを取得し、かつ、第２蛍光放射から第２蛍光イメージを取得することと、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージを処理することで、ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを抽出することと、を含み、第１蛍光イメージおよび第２蛍光イメージが取得される前に、第１励起光の相対強度と第２励起光の相対強度とが変調される。

当業者であれば、種々の実施の形態に係るプログラムコード手段を任意の適切なプログラミング言語で記述可能であり、かつ、多くの形態でプロセッサに提供可能であることを理解するであろう。そのような多くの形態は、例えば、書き込み不可保持媒体（例えば、ＲＯＭやＣＤ−ＲＯＭディスクなどのリードオンリーメモリデバイス）に恒久的に保持される情報や、書き込み可能保持媒体（例えば、ハードドライブ）に変更可能に保持される情報や、ローカルエリアネットワーク、インターネットなどの公衆ネットワーク、または電子的インストラクションを保持するのに適切な任意のタイプの媒体などの通信媒体を通じてプロセッサに運ばれる情報、を含むがそれらに限定されない。本発明の方法の種々の実施の形態を実装するコンピュータ可読インストラクションを運ぶ場合、そのようなコンピュータ可読媒体は本発明の種々の実施の形態の例を表す。種々の実施の形態では、実体的非一時的コンピュータ可読媒体は全てのコンピュータ可読媒体を含み、本発明範囲はコンピュータ可読媒体を包含し、媒体は実体的および非一時的の両方である。

さらなる態様では、種々の実施の形態に関連して説明したように、システムと外因性蛍光体とを含むキットが提供される。

したがって、発明の種々の実施の形態は、自己蛍光と関心のある蛍光との未知の組み合わせから関心のある蛍光を区別することをより容易にする。本発明はターゲット蛍光体のイメージの質の改善を促進し、自己蛍光および背景を除去しつつ信号蛍光を保護し、かつ結果として得られる信号対自己蛍光比を増大させると共に全体的な検出感度を増大させる。本発明は広範な生物的物質に適用可能であり、任意の蛍光イメージングアプリケーションに適用可能である。本発明は、生物サンプルを撮像および解析することで、生物的物質内のひとつ以上の蛍光体ターゲットの存在、不在、濃度、および／または空間分布を識別するために使用されうる。本発明はさらに、医療診断や生物学的評価（例えば、生物学的現象の評価）や診断評価や治療診断や生理学的診断やそれらの組み合わせのための補償的ツールとして用いられてもよい。

詳述された種々の実施の形態と関連して本発明が説明されたが、示された詳細に限定されることを意図したものではない。本発明の範囲から外れることなく様々な変更や構造変形がなされうるからである。本発明の範囲から逸脱すること無く、説明された実施の形態の形態やコンポーネント配置やステップや詳細や動作順序の種々の変更を行うことができ、また本発明の他の実施の形態をなすこともでき、それらのものは本開示に触れた当業者には明らかであろう。したがって、添付の請求項は本発明の範囲に入るので、添付の請求項がそのような変形例および実施の形態をカバーすることが想定されている。「例えば」および「など」という用語およびそれらの文法的等価物について、そうでないと明記されない限り、「および非限定的に」というフレーズが次に続くものとして理解される。本明細書で用いられるように、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形はコンテキストがそうでないと明示的に述べない限り複数の指示物を含む。

Claims (44)

1. 生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージを抽出するためのシステムの作動方法であって、前記ターゲット蛍光体の放射の波長帯は前記生物的物質内の第２蛍光体の放射の波長帯と重なり、前記方法は、
   第１励起光で前記生物的物質を照らすことで前記第２蛍光体の蛍光および前記ターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる第１蛍光放射を誘起し、かつ、第２励起光で前記生物的物質を照らすことで前記第２蛍光体の前記蛍光のみから生じる第２蛍光放射を誘起することと、
   前記第１蛍光放射から第１蛍光イメージを取得し、かつ、前記第２蛍光放射から第２蛍光イメージを取得することと、
   前記第１蛍光イメージおよび前記第２蛍光イメージを処理することで、前記ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを抽出することと、を含み、
   前記第１蛍光イメージおよび前記第２蛍光イメージが取得される前に、前記第１蛍光放射の相対強度と前記第２蛍光放射の相対強度との適切な比が達成されるように、前記第１励起光の相対強度と前記第２励起光の相対強度とが変調される、システムの作動方法。
2. 前記相対強度の前記変調は、
   前記第１蛍光放射および前記第２蛍光放射における波長領域を特定することであって、前記波長領域では前記蛍光体から生じる放射が前記第１蛍光放射には存在し、かつ、前記第２蛍光放射には存在しない、特定することと、
   前記波長領域の外側の波長帯を選択することと、
   前記選択された波長帯における、前記第１蛍光放射の相対強度と前記第２蛍光放射の相対強度との比を算出することと、
   前記第１励起光の前記相対強度および前記第２励起光の前記相対強度を調整することで、適切な算出比が達成されるまで、前記対応する第１蛍光放射または前記対応する第２蛍光放射もしくはその両方を調整することと、を含む請求項１に記載の方法。
3. 前記波長領域の外側の前記波長帯は、前記第１蛍光放射および前記第２蛍光放射から生じる蛍光スペクトルのひとつ以上の波長を含む請求項２に記載の方法。
4. 前記第１蛍光放射の相対強度と前記第２蛍光放射の相対強度との前記比を算出することは、前記第１蛍光放射に対応する曲線下面積値を前記第２蛍光放射に対応する曲線下面積値で除すことを含む請求項２または３に記載の方法。
5. 前記ターゲット蛍光体がポルフィリンである場合、前記第１励起光は約４０５ｎｍの波長を有し、かつ、前記第２励起光は約４５０ｎｍの波長を有する請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記選択された波長帯は約６００ｎｍであり、前記算出比は約１である請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１蛍光イメージおよび前記第２蛍光イメージを処理することで前記ターゲット蛍光体を表す前記第３蛍光イメージを抽出することは、前記第１蛍光イメージから前記第２蛍光イメージを減じることを含む請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記生物的物質は光脱色により前処理される請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ターゲット蛍光体は内因性のものまたは外因性のものもしくはそれらの組み合わせである請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記内因性蛍光体は、ポルフィリン、ポルフィリン前駆体、ポルフィリン類似物、ポルフィリン派生物、ポルフィリン共役物、ポルフィリンリポソーム、ポルフィリンナノ小胞、またはそれらの組み合わせである請求項９に記載の方法。
11. 前記ポルフィリンは、コプロポルフィリン、ウロポルフィリン、プロトポルフィリン、またはそれらの組み合わせを含む請求項１０に記載の方法。
12. 前記外因性蛍光体は、蛍光色素、蛍光誘導剤、またはそれらの組み合わせである請求項９に記載の方法。
13. 組織化学、細胞化学、またはそれらの組み合わせにおける、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法の使用。
14. 生物的物質内のターゲット蛍光体のイメージを抽出するためのシステムであって、前記ターゲット蛍光体の放射の波長帯は前記生物的物質内の第２蛍光体の放射の波長帯と重なり、前記システムは、
    第１励起光で前記生物的物質を照らすことで前記第２蛍光体の蛍光および前記ターゲット蛍光体の蛍光の両方から生じる第１蛍光放射を誘起し、かつ、第２励起光で前記生物的物質を照らすことで前記第２蛍光体の前記蛍光のみから生じる第２蛍光放射を誘起する手段と、
    前記第１蛍光放射から第１蛍光イメージを取得し、かつ、前記第２蛍光放射から第２蛍光イメージを取得する手段と、
    前記第１蛍光イメージおよび前記第２蛍光イメージの取得の前に、前記第１蛍光放射の相対強度と前記第２蛍光放射の相対強度との適切な比が達成されるように、前記第１励起光の相対強度と前記第２励起光の相対強度とを変調する手段と、
    前記第１蛍光イメージおよび前記第２蛍光イメージを処理することで、前記ターゲット蛍光体を表す第３蛍光イメージを抽出する手段と、を備えるシステム。
15. 前記相対強度を変調する前記手段は、
    前記第１蛍光放射および前記第２蛍光放射における波長領域を特定する手段であって、前記波長領域では前記蛍光体から生じる放射が前記第１蛍光放射には存在し、かつ、前記第２蛍光放射には存在しない、特定する手段と、
    前記波長領域の外側の波長帯を選択する手段と、
    前記選択された波長帯における、前記第１蛍光放射の相対強度と前記第２蛍光放射の相対強度との比を算出する手段と、
    前記第１励起光の前記相対強度および前記第２励起光の前記相対強度を調整することで、適切な算出比が達成されるまで、前記対応する第１蛍光放射または前記対応する第２蛍光放射もしくはその両方を調整する手段と、を含む請求項１４に記載のシステム。
16. 前記波長領域の外側の前記波長帯は、前記第１蛍光放射および前記第２蛍光放射から生じる蛍光スペクトルのひとつ以上の波長を含む請求項１５に記載のシステム。
17. 前記第１蛍光放射の相対強度と前記第２蛍光放射の相対強度との前記比を算出する手段は、前記第１蛍光放射に対応する曲線下面積値を前記第２蛍光放射に対応する曲線下面積値で除す手段を含む請求項１５または１６に記載のシステム。
18. 前記ターゲット蛍光体がポルフィリンである場合、前記第１励起光は約４０５ｎｍの波長を有し、かつ、前記第２励起光は約４５０ｎｍの波長を有する請求項１４から１７のいずれか一項に記載のシステム。
19. 前記選択された波長帯は約６００ｎｍであり、前記算出比は約１である請求項１５から１８のいずれか一項に記載のシステム。
20. 前記第１蛍光イメージおよび前記第２蛍光イメージを処理することで前記ターゲット蛍光体を表す前記第３蛍光イメージを抽出する前記手段は、前記第１蛍光イメージから前記第２蛍光イメージを減じる手段を含む請求項１４から１９のいずれか一項に記載のシステム。
21. 前記照らす手段は蛍光励起源を含む照明モジュールを備え、前記蛍光励起源は前記第１励起光および前記第２励起光を生成するよう構成される請求項１４から２０のいずれか一項に記載のシステム。
22. 前記照明モジュールはさらに、前記照明モジュールを出る前記第１励起光および前記第２励起光を形成し、かつ、導くよう構成された光学要素を含む請求項２１に記載のシステム。
23. 前記光学要素は、レンズ、光ガイド、ディフューザ、またはそれらの組み合わせを含む請求項２２に記載のシステム。
24. 前記取得する手段は、イメージセンサを含む蛍光放射取得モジュールを備える請求項１４から２３のいずれか一項に記載のシステム。
25. 前記蛍光放射取得モジュールはさらに、前記イメージセンサの前に設けられた光学要素であって前記第１蛍光放射および前記第２蛍光放射を取得し、フィルタし、導くよう構成された光学要素を含む請求項２４に記載のシステム。
26. 前記処理する手段は、プロセッサモジュールを含む請求項１４から２５のいずれか一項に記載のシステム。
27. 前記プロセッサモジュールは、前記照らす手段の動作を制御するよう、前記取得する手段の動作を制御するよう、またはそれらの組み合わせを行うよう、構成される請求項２６に記載のシステム。
28. 前記生物的物質は光脱色により前処理される請求項１４から２７のいずれか一項に記載のシステム。
29. 前記ターゲット蛍光体は内因性のものまたは外因性のものもしくはそれらの組み合わせである請求項１４から２８のいずれか一項に記載のシステム。
30. 前記内因性蛍光体は、ポルフィリン、ポルフィリン前駆体、ポルフィリン類似物、ポルフィリン派生物、ポルフィリン共役物、ポルフィリンリポソーム、ポルフィリンナノ小胞、またはそれらの組み合わせである請求項２９に記載のシステム。
31. 前記ポルフィリンは、コプロポルフィリン、ウロポルフィリン、プロトポルフィリン、またはそれらの組み合わせを含む請求項３０に記載のシステム。
32. 前記外因性蛍光体は、蛍光色素、蛍光誘導剤、またはそれらの組み合わせである請求項２９に記載のシステム。
33. 前記生物的物質は、生物組織、生物流体、またはそれらの一部を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記生物的物質は、生物組織、生物流体、またはそれらの一部を含む請求項１３に記載の使用。
35. 前記生物的物質は、生物組織、生物流体、またはそれらの一部を含む請求項１４から３２のいずれか一項に記載のシステム。
36. 前記生物的物質は、ほ乳類から導かれるかほ乳類に存在する器官、細胞、細胞株、細胞構成物を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記生物的物質は、ほ乳類から導かれるかほ乳類に存在する器官、細胞、細胞株、細胞構成物を含む請求項１３に記載の使用。
38. 前記生物的物質は、ほ乳類から導かれるかほ乳類に存在する器官、細胞、細胞株、細胞構成物を含む請求項１４から３２のいずれか一項に記載のシステム。
39. 前記生物的物質は、健康な組織、病的組織、または悪性組織を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記生物的物質は、健康な組織、病的組織、または悪性組織を含む請求項１３に記載の使用。
41. 前記生物的物質は、健康な組織、病的組織、または悪性組織を含む請求項１４から３２のいずれか一項に記載のシステム。
42. 前記生物的物質は、組織化学、免疫組織化学、細胞化学、免疫蛍光法、免疫ブロット法、または蛍光関連イメージング応用で用いられる組織部分を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記生物的物質は、組織化学、免疫組織化学、細胞化学、免疫蛍光法、免疫ブロット法、または蛍光関連イメージング応用で用いられる組織部分を含む請求項１３に記載の使用。
44. 前記生物的物質は、組織化学、免疫組織化学、細胞化学、免疫蛍光法、免疫ブロット法、または蛍光関連イメージング応用で用いられる組織部分を含む請求項１４から３２のいずれか一項に記載のシステム。