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JP6343671B2 - トロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法 - Google Patents

トロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法 Download PDF

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Description

本発明はトロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法に関するものである。
エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は色々な種類の細胞から分泌される膜構造の小さい小胞である。エキソソームの直径は概略３０−１００ｎｍであると報告されている。エキソソームは電子顕微鏡を通した研究によって、原形質膜から直接離れて行くのではなく、多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ、ＭＶＢｓ）と呼ばれる細胞内特定区画に始まり細胞外に放出、分泌されるものと観察された。すなわち、多胞体と原形質膜の融合が起きると、小胞は細胞外環境に放出されるが、これをエキソソームと呼ぶ。このようなエキソソームがどのような分子的メカニズムによって作られるのかは確実に明らかになっていないが、赤血球細胞だけでなく、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球、樹枝状細胞、血小板、大食細胞などを含む多様な種類の免疫細胞と腫瘍細胞、幹細胞なども、生きている状態でエキソソームを生産して分泌すると知られている。特に、幹細胞から由来したエキソソームは受容体および蛋白質だけでなく核成分を含有しており、細胞間コミュニケーションに重要な役割をするものとして知られている。また、エキソソームは幹細胞に比べて動物血清を相対的に少なく含有しており、動物血清感染による症状（ｚｏｏｎｏｓｉｓ）の危険性も排除できる。このようなエキソソームの特性を考慮する時、エキソソームを利用した細胞治療法は既存の幹細胞治療法の限界を克服し得る新しいパラダイムになるものと期待される。
そこで、本発明者らは前記のように利用可能性が優秀なエキソソームの生産効率を上げるための方法に対する研究を継続した結果、トロンビンを利用する場合、幹細胞当たりの幹細胞由来のエキソソームの生成量が増加することを確認することによって本発明を完成した。
したがって、本発明の目的はトロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法を提供することである。
本発明の他の目的はトロンビンを含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進用培地組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的はトロンビンを利用した幹細胞由来のエキソソーム内成長因子発現増進方法を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法を提供する。
また、本発明はトロンビンを含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進用培地組成物を提供する。
また、本発明は幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む幹細胞由来のエキソソーム内成長因子発現増進方法を提供する。
本発明に係る方法は、幹細胞由来のエキソソームの生成を促進させる優秀な効果を有しており、これを通じて従来の公知の方法に比べて効率的にエキソソームを収得することができ、関連研究に有用に利用することができる。
本発明に係る方法を利用して収得した幹細胞由来のエキソソームの形態をＳＥＭイメージを通じて観察した結果を示した図面。 本発明に係る方法を利用して収得した幹細胞由来のエキソソームでエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９の発現を確認した結果を示した図面。 本発明に係る方法を利用して収得した幹細胞由来のエキソソームで成長因子であるＶＥＧＦおよびＨＧＦの発現を確認した結果を示した図面。 トロンビン処理濃度による幹細胞由来のエキソソームの生成程度を示した図面。 ＬＰＳ、Ｈ２Ｏ２またはトロンビンの処理濃度による幹細胞由来のエキソソームの生成程度を示した図面。 トロンビン処理による幹細胞内小胞体の形成程度を観察した結果を示した図面。 トロンビン処理によるエキソソーム内成長因子の発現を確認した結果を示した図面。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進方法を提供する。
前記トロンビンは培地内に１〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度で含むことができ、好ましくは１０〜２００Ｕ／ｍｌの濃度で含むことができる。
前記培養時間は、エキソソームが生成できる時間であれば制限はなく、好ましくは１２時間〜４８時間の間遂行され得る。
本発明において、「幹細胞」とは、未分化な細胞であって、自己複製能力を有しつつ二つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞である。
本発明の幹細胞は自家または同種由来の幹細胞であり得、ヒトおよびヒト以外の哺乳類を含む任意の類型の動物由来であり得、前記幹細胞が成体から由来したものであれ胎芽から由来したものであれ、これに限定されない。本発明の幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞を含み、好ましくは成体幹細胞である。前記成体幹細胞は間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、多分化能幹細胞または羊膜上皮細胞であり得、好ましくは間葉系幹細胞であるが、これに限定されない。前記間葉系幹細胞は臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜または胎盤などから由来した間葉系幹細胞であり得るが、これに限定されない。
本発明で「培地」とは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞の成長と増殖に必要な必須成分を含む組成物を意味するもので、当該分野で通常的に使われる幹細胞培養用培地をすべて含み、例えば、ＤＭＥＭ （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ （Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ （Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標） ＤＭＥＭなどの商業的に製造された培地または人為的に合成した培地を利用することができるが、これに限定されない。本発明の培地は一般的に炭素源、窒素源および微量元素成分を含み、アミノ酸、抗生剤などをさらに含むことができる。
本発明の具体的な一実施例では、間葉系幹細胞に１０〜１００Ｕ／ｍｌのトロンビンを含む血清フリー培養培地（ＭＥＭ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉａ）を処理した後、２４時間の間培養して幹細胞由来のエキソソームの生成を促進し、超高速遠心分離を通じてこれを分離した。
本発明に係る方法は、幹細胞由来のエキソソームの生成を促進させる優秀な効果を有しており、これを通じて従来の公知の方法に比べて効率的にエキソソームを収得することができる。
また、本発明はトロンビンを含む幹細胞由来のエキソソームの生成促進用培地組成物を提供する。
前記トロンビンは、培地内に１〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度で含むことができ、好ましくは１０〜２００Ｕ／ｍｌの濃度で含むことができる。
本発明の培地組成物はトロンビンの他に公知のエキソソーム生成促進物質を１種以上さらに含むことができるが、これに限定されない。
また、本発明は幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階を含む幹細胞由来のエキソソーム内成長因子発現増進方法を提供する。
本発明で「成長因子」とは、細胞分裂や生長、分化を促進する蛋白質性の生理活性物質を意味するもので、例えば、脳由来の神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、血管上皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、類似インスリン成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、骨由来成長因子（ｂｏｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＦ）、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ＣＳＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、角質細胞成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）などを含む。
前記成長因子は、好ましくは脳由来神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）または血管上皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）を含むが、これに限定されない。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより簡単に理解するために提供されるものに過ぎず、本発明の内容は実施例によって限定されるものではない。
実施例１．幹細胞由来のエキソソームの分離
幹細胞由来のエキソソームを分離するために、トロンビンおよび超遠心分離機（Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を利用した。より具体的に、１×１０６個の臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）由来間葉系幹細胞を６０ｍｍ培養皿（ｏｒａｎｇｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ＃ ４４５０２００）に分注した後、１週間の間培養した。培養皿に細胞がいっぱいに増殖したのを確認した後、濃度別（１０、２０、５０、１００Ｕ／ｍｌ）トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）が希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉａ）に取り替え、さらに２４時間の間培養した。その後、培養液を遠心分離チューブに分けて入れて４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移して細胞破片（ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。前記上澄み液を再び４℃、１００、０００ｒｐｍで２時間の間超遠心分離した後、上澄み液を除去してエキソソームを分離した（最終濃度：１５μｇ／ｍｌ）。
実施例２．幹細胞由来のエキソソームの確認
前記実施例１の過程を通じて分離したエキソソームが従来の公知のエキソソーム固有の特性を有しているかを確認するために、下記のような実験を遂行した。まず、分離したエキソソームをＳＥＭイメージを通じて観察し、ウェスタンブロットを利用して公知のエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）の発現を確認した。また、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を利用してエキソソーム膜を溶解した後、エキソソーム内の蛋白質を分離し、Ｐｒｏｃａｒｔａ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用してエキソソーム内成長因子であるＨＧＦとＶＥＧＦの量を測定した。その結果をそれぞれ図１〜図３に示した。
図１に示した通り、前記実施例１と同じ方法を通じて分離したエキソソームは約１００ｎｍ直径の球状を呈する正常な形態を示していることを確認した。
また、図２および図３に示した通り、前記実施例１と同じ方法を通じて分離したエキソソームは正常にエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９を発現しており、エキソソーム内に成長因子であるＶＥＧＦおよびＨＧＦが存在することを確認した。
実施例３．トロンビン処理によるエキソソーム生成促進効果
３−１．トロンビン処理濃度によるエキソソーム生成程度検証
トロンビン処理濃度による幹細胞由来のエキソソームの生成程度を確認するために、幹細胞培養時にトロンビンの濃度を異ならせて前記実施例１と同じ方法でエキソソームを分離してこれを定量した。その結果を図４に示した。
図４に示した通り、トロンビンの処理濃度が高くなるにつれて、幹細胞由来のエキソソームの生成が有意義に促進されることを確認した。
３−２．トロンビンを利用したエキソソーム生成促進方法の効率性検証
トロンビンを利用したエキソソーム生成促進方法の効率性を検証するために、トロンビンの代わりに培養培地にＬＰＳまたはＨ２Ｏ２を処理したことを除いては前記実施例１と同じ方法でエキソソームを分離してこれを定量した。その結果を図５に示した。
図５に示した通り、幹細胞培養時にトロンビンを処理する場合、他の物質を処理した群に比べて幹細胞由来のエキソソームの生成が顕著に増加することを確認した。
３−３．トロンビン処理による幹細胞内小胞体形成観察
トロンビン処理が幹細胞内小胞体の形成に及ぼす影響を確認するために、臍帯血由来間葉系幹細胞を５０Ｕ／ｍｌのトロンビンが希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉａ）で６時間の間培養した後、前記実施例１と同じ方法でエキソソームを分離してこれを電子顕微鏡で観察した。その結果を図６に示した。
図６に示した通り、トロンビン処理によって幹細胞内小胞体の形成が増加し、エキソソームの分泌が誘導されるたことを確認した。
３−４．トロンビン処理によるエキソソーム内成長因子発現観察
トロンビン処理がエキソソーム内成長因子の発現に及ぼす影響を確認するために、臍帯血由来間葉系幹細胞を５０Ｕ／ｍｌのトロンビンが希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉａ）で６時間の間培養した後、前記実施例１と同じ方法でエキソソームを分離した。溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を利用してエキソソーム膜を溶解した後、エキソソーム内の蛋白質を分離し、Ｐｒｏｃａｒｔａ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ（ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用してエキソソーム内成長因子であるＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ−６およびＶＥＧＦの量を測定した。その結果を図７に示した。
図７に示した通り、トロンビン処理によってエキソソーム内成長因子であるＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ−６およびＶＥＧＦの発現が増加したことを確認した。
以上の実験結果を通じて、トロンビンを利用して幹細胞由来のエキソソームの生成を促進させることができ、エキソソーム内成長因子の発現を増加させ得ることを確認した。
本発明に係る方法は、幹細胞由来のエキソソームの生成を促進させる優秀な効果を有しており、これを通じて従来の公知の方法に比べて効率的にエキソソームを収得することができ、関連研究に有用に利用することができる。

Claims (10)

  1. 幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階、および
    前記培地から、幹細胞由来のエキソソームを分離する段階
    を含む、幹細胞当たりの幹細胞由来のエキソソームの生成量を増加する方法。
  2. 前記幹細胞は胚性幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記成体幹細胞は間葉系幹細胞、ヒト組織由来の間葉系基質細胞、ヒト組織由来の間葉系幹細胞、多分化能幹細胞および羊膜上皮細胞で構成された群から選択される１種以上の成体幹細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 前記間葉系幹細胞は臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜および胎盤で構成された群から選択される１種以上の組織から由来した間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記培地はＤＭＥＭ （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ （Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ （Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ １６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２）、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、およびＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標） ＤＭＥＭからなる群から選択された１種以上の培地であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 前記トロンビンは培地内に１〜１０００Ｕ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記培養は１２時間〜４８時間の間実行されることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
  8. トロンビンを含む、幹細胞当たりの幹細胞由来のエキソソームの生成量増加用培地組成物。
  9. 幹細胞をトロンビンを含む培地で培養する段階、および
    前記培地から、幹細胞由来のエキソソームを分離する段階
    を含む、幹細胞当たりの幹細胞由来のエキソソーム内成長因子の生成量を増加する方法。
  10. 前記成長因子は脳由来神経成長因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）および血管上皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）からなる群から選択された１種以上であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6295341B2 (ja) * 2014-03-18 2018-03-14 サムソン ライフ パブリック ウェルフェア ファウンデーション 幹細胞由来エキソソームを有効成分として含む脳炎症性疾患の治療用組成物
AU2016275566B2 (en) * 2015-06-12 2022-02-24 Hudson Institute of Medical Research A method of treatment
KR20170085010A (ko) * 2016-01-12 2017-07-21 주식회사 강스템바이오텍 고함량의 성장인자를 함유한 줄기세포 유래 엑소좀
KR101843634B1 (ko) * 2016-04-15 2018-03-30 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 만성폐질환 치료용 조성물
WO2017188614A1 (ko) * 2016-04-27 2017-11-02 사회복지법인 삼성생명공익재단 미숙아 뇌실내 출혈 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별법
KR101860266B1 (ko) * 2016-07-01 2018-05-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물
WO2018004237A1 (ko) * 2016-07-01 2018-01-04 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 피부상처 치료용 조성물
TWI601741B (zh) * 2016-07-11 2017-10-11 財團法人國家衛生研究院 利用前列腺素受體ｅｐ４－拮抗劑誘導幹細胞製造含有高囊泡含物之外泌體囊泡的方法及其應用
JP6882450B2 (ja) * 2016-08-05 2021-06-02 株式会社エキソステムテックＥｘｏｓｔｅｍｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． 脂肪由来幹細胞から抽出されたエキソソームを有効成分として含む肺線維症の予防または治療用の組成物
KR101973284B1 (ko) * 2017-01-16 2019-04-29 사회복지법인 삼성생명공익재단 신생아 ｈｉｅ 치료용 조성물
CN106676064A (zh) * 2017-01-20 2017-05-17 深圳中健生物技术有限公司 一种脐带血间充质干细胞培养液
WO2018226051A2 (ko) * 2017-06-07 2018-12-13 주식회사 엑소스템텍 인간줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포 배양용 무혈청 배지 조성물
CN107349220A (zh) * 2017-07-26 2017-11-17 深圳市泰华细胞工程有限公司 一种包含成纤维细胞外泌体的制剂及其用途
WO2019040790A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Merakris Therapeutics, Llc COMPOSITIONS CONTAINING AMNIOTIC COMPONENTS AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE
KR101980453B1 (ko) * 2017-11-29 2019-08-30 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
CA3085756A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Purified exosome products, method of making, and methods of using
CN108823159B (zh) * 2018-07-13 2022-08-09 上海齐昔生物科技集团有限公司 Pdgf-bb对间充质干细胞释放的外泌体的影响
KR20190063453A (ko) 2019-01-15 2019-06-07 재단법인 아산사회복지재단 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
EP3930734A4 (en) 2019-02-28 2022-12-07 Merakris Therapeutics, LLC EXTRACELLULAR VESICLES DERIVED FROM AMBIENT WATER AND THEIR USES IN WOUND HEALING
JP7508048B2 (ja) 2019-04-04 2024-07-01 日産化学株式会社 細胞外小胞の分泌を促進するための組成物
WO2020222503A1 (ko) * 2019-04-29 2020-11-05 사회복지법인 삼성생명공익재단 단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법
KR102268589B1 (ko) 2019-04-29 2021-06-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 단백질분해효소 활성 수용체 매개 신호전달 경로의 활성을 이용한 세포외 소포의 고효율 생성능을 갖는 줄기세포의 선별방법
CN121014852A (zh) 2019-11-28 2025-11-28 再生因子有限公司 牛奶外泌体的新用途
KR20210127510A (ko) * 2020-04-14 2021-10-22 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 당뇨병성 피부질환 예방 또는 치료용 조성물
JP6967308B1 (ja) * 2020-06-30 2021-11-17 国立大学法人高知大学 胎児付属物由来組織細胞培養上清を含む脳神経障害治療剤
CN115212232A (zh) * 2021-04-16 2022-10-21 卓越细胞工程(香港)有限公司 间充质干细胞来源的外泌体治疗脑卒中的方法和组合物
WO2023054918A1 (ko) 2021-09-30 2023-04-06 주식회사 디자인셀 네프릴라이신을 과발현하는 줄기세포, 이의 배양액 및 이들로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2023080413A1 (ko) 2021-11-02 2023-05-11 주식회사 디자인셀 줄기세포 배양액 및 이로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 안구 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
CN116077531A (zh) * 2021-11-05 2023-05-09 国典(北京)医药科技有限公司 外泌体在制备脑卒中治疗用产品中的用途
CN114904043B (zh) * 2022-04-28 2023-07-21 深圳市儿童医院 复合水凝胶及其制备方法和应用
KR20240019971A (ko) 2022-08-05 2024-02-14 주식회사 엠제이바이오젠 엑소좀 농도 향상을 위한 조성물 및 방법
KR20240058028A (ko) * 2022-10-24 2024-05-03 주식회사 디자인셀 줄기세포 배양액 및 상기로부터 분리된 세포외소포를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20250153015A (ko) 2024-04-17 2025-10-24 사회복지법인 삼성생명공익재단 트롬빈을 처리한 중간엽 줄기세포에서 유래된 세포외 소포체를 포함하는 괴사성 장염의 예방 및 치료용 약학 조성물
CN118772245B (zh) * 2024-08-06 2024-12-27 广州飞来爱生命科技有限公司 一种治疗脑梗的脐带间充质干细胞及其制备方法和应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060084082A1 (en) * 1997-03-07 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
FR2788780B1 (fr) 1999-01-27 2001-03-30 Ap Cells Inc Procede de preparation de vesicules membranaires
CA2403508A1 (en) * 2000-04-18 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
US8537656B2 (en) 2000-07-19 2013-09-17 Ipr Licensing, Inc. Method for compensating for multi-path of a CDMA reverse link utilizing an orthogonal channel structure
PL378334A1 (pl) * 2002-12-13 2006-03-20 Celogos Kompozycja podłoża hodowlanego, sposób hodowli i sposób produkcji mioblastów, oraz ich zastosowanie
US8518390B2 (en) * 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
CA2565115A1 (en) * 2004-05-03 2005-11-10 Peter Maccallum Cancer Institute Methods for stem cell expansion and differentiation
US8034762B2 (en) * 2004-09-02 2011-10-11 Cognosci, Inc. Treatment of subarachnoid hemorrhage with Apo E analogs
CN101278045B (zh) * 2005-09-30 2016-03-23 东菱药品工业株式会社 干细胞和/或祖细胞的赋活剂
WO2007049096A1 (en) * 2005-10-25 2007-05-03 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) A method of expansion of endothelial progenitor cells
KR100926975B1 (ko) * 2007-08-01 2009-11-17 리젠프라임 주식회사 알지네이트로 코팅된 피브린／ｈａ 혼합체 스캐폴드를이용한 중간엽줄기세포의 분화방법 및 연골세포의 배양방법
NZ591294A (en) * 2008-08-20 2012-10-26 Anthrogenesis Corp Treatment of stroke using isolated placental cells
CA2743566C (en) * 2008-11-19 2021-11-09 Anthrogenesis Corporation Amnion derived adherent cells
KR20100116812A (ko) * 2009-04-23 2010-11-02 서울대학교산학협력단 세포응집을 이용한 심장줄기세포의 유도, 배양 방법 및 이 방법에 의해 제조된 줄기세포
EP2683389B1 (en) * 2011-03-11 2017-05-03 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to mesenchymal stem cell exosomes
KR101405437B1 (ko) * 2011-08-16 2014-06-11 사회복지법인 삼성생명공익재단 줄기세포 유래 미세소포를 포함하는 신경 생성 촉진용 조성물
WO2013039000A1 (ja) 2011-09-13 2013-03-21 Ochiya Takahiro アルツハイマー病の予防または治療のための医薬品
US9803176B2 (en) * 2011-12-30 2017-10-31 Amit Patel Methods and compositions for the clinical derivation of an allogenic cell and therapeutic uses
CN104321062B (zh) 2012-04-03 2018-09-25 兰诺龙有限公司 干细胞微粒
US20130273011A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-17 Medistem, Inc. Stem cells and stem cell generated nanoparticles for treatment of inflammatory conditions and acute radiation syndrome
CN104703609B (zh) 2012-07-19 2019-02-19 兰诺龙有限公司 干细胞微粒
US20140056842A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Jonathan Sackner-Bernstein Cellular therapeutic approaches to traumatic brain and spinal cord injury

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