JP6260975B2

JP6260975B2 - Ｔｅｒｔ−ブチルｎ−［２−｛４−［６−アミノ−５−（２，４−ジフルオロベンゾイル）−２−オキソピリジン−１（２ｈ）−イル］−３，５−ジフルオロフェニル｝エチル）−ｌ−アラニネート又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物

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Publication number: JP6260975B2
Application number: JP2015537346A
Authority: JP
Inventors: ピンタット、ステファン; デイヴィス、スティーヴン、ジョン; モファット、デヴィッド、フェスタス、チャールズ
Original assignee: マクロファージファーマリミテッド
Priority date: 2012-10-17
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2018-01-17
Anticipated expiration: 2033-10-15
Also published as: EP2909175A1; CY1122194T1; US20160297760A1; HRP20171320T1; IL256560A; SMT201900524T1; PL3222616T3; PT2909175T; RS56184B1; IL237863B; SI3222616T1; CN106496106A; JP6464244B2; US20180127371A1; ZA201501958B; AU2013333636B2; SG10201708166SA; US20150246883A1; KR102164536B1; AU2013333636A1

Description

技術分野
本発明は、アミノ酸エステル化合物及びアミノ酸エステル化合物を含む組成物に関する。また本発明は、p38 MAPキナーゼ酵素の阻害における当該化合物又は組成物の使用に関する。また本発明は、本発明の化合物のエステル基の加水分解により生成された酸に関する。

背景技術
TNF-α、IL1-β及びIL-8のようなサイトカインの産生レベルの上昇を導く、単球、マクロファージ及び好中球を含む白血球の不適切な活性化は、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、喘息及び乾癬などのいくつかの炎症性疾患や炎症性成分を伴う細胞増殖性疾患の病因の特徴である。炎症性細胞によるサイトカインの産生は、種々の外部刺激に対する応答の結果であり、いくつかの細胞内シグナル伝達機構の活性化を導く。これらのうち顕著なものは、細胞成長、分化及びストレス応答を調節する高度に保存されたシグナル伝達キナーゼからなるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)スーパーファミリーである。哺乳動物細胞は、MAPKの少なくとも3つのファミリーを含む：p42/44細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK) MAPK、c-Jun NH2-末端キナーゼ(JNKs)、及びp38 MAPK(p38α/Mpk2/RK/SAPK2α/CSBP1/2ともよばれる)。p38 MAPKは、リポ多糖(LPS)による単球の刺激の後にチロシンリン酸化されるキナーゼとして同定された後に、最初にクローニングされた[Hanら, Science 1994,265,808]。哺乳動物p38のさらなるホモログは、記載されており、p38β[Jiangら, J. Biol. Chem, 1996, 271, 17920]、p38γ[Liら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 228, 334]、及びp38δ[Jiangら, J.Biol.Chem. 1997, 272, 30122]を含む。p38α及びp38βは遍在して発現されるが、p38γは骨格筋に主に限定され、p38δは肺及び腎臓において主に発現される。

宿主の防御細胞によるサイトカインの放出、ならびにサイトカイン及び他の炎症誘発性ストレスに対する白血球の応答は、p38 MAPKにより調節され程度を変動させる[Cuendaら, FEBS Lett, 1995, 364, 229〜233]。他の細胞タイプにおいて、p38 MAPKは、TNF-αにより刺激された気管支上皮細胞によるIL-8の産生、及びLPS-刺激内皮細胞における細胞接着分子ICAM-1のアップレギュレーションのようなストレス応答を制御する。二重特異性キナーゼMKK3及びMKK6によるTGYモチーフの二重リン酸化を介した活性化により、p38 MAPKは、転写因子及びその他のキナーゼのリン酸化によりその効果を発揮する。MAPキナーゼ-活性化タンパク質キナーゼ-2(MAPKAPK-2)は、p38リン酸化についての標的として同定されている。MAPKAPK-2欠損マウス[Kotlyarovら, Nat. Cell Biol. 1999, 1, 94〜97]では、LPS/ガラクトサミン媒介内毒素性ショックに応答してTNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及びIFN-γの放出レベルが低下した。これらのサイトカイン、及びCOX-2のレベルの調節は、mRNAレベルで行われる。TNF-αレベルは、TNF-α mRNAの3'-UTRのAUリッチエレメントを介して、翻訳制御により調節され、MAPKAPK-2シグナル伝達がTNF-α mRNA翻訳を増加させる。MAPKAPK-2シグナル伝達は、COX-2、IL-6及びマクロファージ炎症性タンパク質についてのmRNAの安定性の増加を導く。MAPKAPK-2は、p38 MAPKの細胞内位置を決定するとともに、p38 MAPKシグナル伝達を変換し、そのカルボキシ末端に核局在化シグナルと、その自己抑制ドメインの一部分として核外輸送シグナルとを保持する[Engelら, EMBO J. 1998, 17, 3363〜3371]。ストレスが負荷された細胞では、MAPKAPK-2及びp38 MAPKが核から細胞質に移動し、この移動は、p38 MAPKが触媒活性である場合にのみ起こる。この事象は、p38 MAPKによるリン酸化の結果としてのMAPKAPK-2核外輸送シグナルの曝露により駆動されると考えられている[Mengら, J. Biol. Chem. 2002, 277, 37401〜37405]。さらに、p38 MAPKは、ATF1/2(活性化転写因子(activating transcription factors) 1/2)、CHOP-10/GADD-153(成長停止及びDNA損傷誘導性遺伝子(growth arrest and DNA damage inducible gene) 153)、SAP-1(血清応答因子アクセサリータンパク質(serum response factor accessory protein)-1)、及びMEF2C(筋細胞エンハンサー因子(myocyte enhancer factor)-2)などの炎症を媒介すると考えられるいくつかの転写因子のリン酸化を直接又は間接的に導く[Fosterら, Drug News Perspect. 2000, 13, 488〜497]。

小分子によるp38 MAPK活性の阻害が、リウマチ性関節炎、COPD、喘息及び脳虚血などの、不適切なサイトカイン産生により媒介されるいくつかの疾患の状態の治療に有用であることが、いくつかの場合において示されている。この様相は、いくつかの総説の主題である[Salituroら, Current Medicinal Chemistry, 1999, 6, 807〜823及びKumarら, Nature Reviews Drug Discovery 2003, 2, 717〜726]。

p38 MAPKの阻害剤は、ラットにおけるコラーゲン誘導関節炎[Reveszら, Biorg. Med. Chem. Lett., 2000, 10, 1261〜1364]、及びラットにおけるアジュバント誘導関節炎[Wadsworthら, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1999, 291, 1685〜1691]のようなリウマチ性関節炎の動物モデルにおいて、効果があることが示されている。膵炎誘導肺損傷のマウスモデルにおいて、p38 MAPK阻害剤による前処理が、気道及び肺浮腫におけるTNF-α放出を減少させた[Denhamら, Crit. Care Med., 2000, 29, 628及びYangら, Surgery, 1999, 126, 216]。オボアルブミン(OVA)感作マウスにおけるOVA攻撃の前のp38 MAPKの阻害は、炎症のアレルギー性気道モデルにおける気道でのサイトカイン及び炎症性細胞の蓄積を低下させた[Underwoodら, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2000,293, 281]。p38 MAPキナーゼの活性の増加は、炎症性腸疾患に罹患している患者において観察されている[Waetzigら, J. Immunol, 2002,168, 5432〜5351]。p38 MAPK阻害剤は、心臓肥大 [Behrら, Circulation, 2001, 104, 1292〜1298]、及び局所脳虚血[Baroneら, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001, 296, 312〜321]のラットモデルにおいて効果があることが示されている。

ＷＯ 2007/129040及びＷＯ2009/060160の両者はp38 MAPキナーゼ阻害剤であるアルファアミノ酸エステルを開示している。開示された化合物において、エステル基は、1若しくは複数の細胞内エステラーゼ酵素によりカルボン酸基に加水分解されるエステル基であり;またアルファアミノ酸エステルの炭素上の置換基は側鎖を形成し、その側鎖は天然又は非天然のアルファアミノ酸の側鎖である。

開示される化合物は、p38 MAPK(p38α、β、γ及びδ)、並びにそのアイソフォーム及びスプライスバリアント、特にp38α、p38β及びp38β2の強力で選択的な阻害剤であると述べられている。したがって、これらの化合物は、医学の分野で、例えば本明細書に記載される免疫及び炎症性障害の治療及び予防において有用である。上記の化合物は、アミノ酸モチーフ又は細胞内カルボキシルエステラーゼにより加水分解され得るアミノ酸エステルモチーフ-NH-CHR1R2が分子内に存在することを特徴とする。親油性アミノ酸エステルモチーフを有する本発明の化合物は、細胞膜を通過し、細胞内カルボキシルエステラーゼにより酸に加水分解される。極性加水分解産物は、細胞膜を容易に通過しないので、細胞内に蓄積する。よって、この化合物のp38 MAPキナーゼ活性は、細胞内で持続し、増強される。本発明の化合物は、国際特許出願WO03076405の開示に含まれるp38 MAPキナーゼ阻害剤に関連するが、本発明の化合物は、上記のアミノ酸エステルモチーフを有する点で、これらとは異なる。

ＷＯ2007/129040は、それに関連する化合物がマクロファージに選択的に蓄積する化合物を含むことを開示している。マクロファージは、サイトカイン、特にTNFα及びIL-1の放出により炎症性障害において重要な役割を演じていることが知られている(van Roonら, Arthritis and Rheumatism, 2003, 1229〜1238)。関節リウマチにおいて、これらは、関節の炎症及び関節の破壊の維持に主に寄与する。マクロファージは、腫瘍の成長及び発達にも関与する(Naldini及びCarraro, Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005, 3〜8)。よって、マクロファージ細胞増殖を選択的に標的にする薬剤は、癌及び自己免疫疾患の治療において価値があるだろう。特定の細胞のタイプを標的することは、副作用の低減を導くことが期待される。エステラーゼモチーフがp38キナーゼ阻害剤に連結する様式が、それが加水分解されるかを決定し、よって、それが異なる細胞のタイプにおいて蓄積するか否かを決定する。具体的には、マクロファージは、ヒトカルボキシルエステラーゼhCE-1を含有するが、他のタイプの細胞は含有しない。ＷＯ2007/129040の一般式(I)において、エステラーゼモチーフR1CH(R2)NH-の窒素がカルボニル(-C(=O)-)に直接連結していない場合、すなわちYが-C(=O)、-C(=O)O-又は-C(=O)NR₃-基でない場合、エステルは、hCE-1のみによって加水分解されるので、阻害剤は、マクロファージにおいてのみ蓄積する。本明細書において、「単球」と特定しない限り、マクロファージの用語は、マクロファージ(腫瘍関連マクロファージを含む)及び／又は単球のことをいうために用いられる。

ＷＯ2009/060160は、ＷＯ2007/129040の一般的な開示の範囲の具体的な化合物の１群を開示しているが、具体的に同定も例示もされていない。化合物は上述のマクロファージ選択性を示している。

発明の概要
本願発明者は、化合物tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートが、p38 MAPキナーゼ活性を阻害することに顕著に優れていることを見出した。試験は、ヒト血液中におけるエステルTNF-α阻害に対するIC50値が、関連化合物に観察されるヒト血液中エステルTNF-α阻害に対するIC50値を考慮すると期待されるよりも有意に低いことを示している。さらに発明者によりなされた試験は、本発明の化合物のバイオアベイラビリティーが構造的に類似の公知化合物から予想されるよりもより高いことを実証している。

従って、本発明は、化合物:tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物を提供する。

また本発明は、１以上の製薬上許容し得る担体及び/又は賦形剤と一緒に当該化合物を含む医薬組成物を提供する。

別の態様においては、本発明は、ヒト又は動物体の療法による治療方法に使用するための上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物を提供する。

本発明は、またインビトロ又はインビボでのp38 MAPキナーゼ酵素活性阻害において使用するための上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物を提供する。さらに、自己免疫又は炎症性疾患の予防又は治療に使用するための上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物を提供する。また細胞増殖性疾患の治療に使用するための上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物を提供する。

別の態様において、本発明は、かかる阻害に有効な量の上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物に酵素を接触させる工程を含む、p38 MAPキナーゼ酵素活性を阻害する方法を提供する。また、上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物の有効量を自己免疫又は炎症性疾患の対象に投与する工程を含む、前記疾患の治療又は予防方法を提供する。さらに上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物の有効量を細胞増殖性疾患の対象に投与する工程を含む、前記疾患の治療方法を提供する。前記治療は、細胞増殖性疾患の発症を改善又は減少させることを含みうる。

さらに別の態様において、本発明は、p38 MAPキナーゼ酵素活性を阻害するための薬剤の製造における上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物の使用を提供する。さらに自己免疫又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬剤の製造における上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物の使用も提供する。また細胞増殖性疾患の治療のための薬剤の製造における上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物の使用を提供する。

本発明は、また活性成分として上記に定義される化合物又は上記に定義される組成物を含むp38 MAPキナーゼ酵素活性の阻害用薬剤を提供する。該薬剤は典型的には、自己免疫又は炎症性疾患の予防又は治療用である。あるいは細胞増殖性疾患の治療用であってもよい。

また本発明により、酸：N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニンが提供される。

発明の詳細な説明
本発明は、化合物：tert-ブチル N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートを提供する。

本発明の化合物は、塩、水和物又は溶媒和物の形態で製造しうる。したがって、本発明は、該化合物の塩、水和物又は溶媒和物も提供する。典型的には、塩は製薬上許容され得る塩である。

本明細書で用いる場合、製薬上許容され得る塩は、製薬上許容し得る酸又は塩基との塩である。製薬上許容し得る酸としては、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸または硝酸などの無機酸、及びクエン酸、サリチル酸、グルタミン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、酒石酸、安息香酸、酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はp-トルエンスルホニル酸などの有機酸の両者が挙げられる。製薬上許容し得る塩基としては、アルカリ金属(例えば、ナトリウム又はカリウム)及びアルカリ土類金属(例えばカルシウム、バリウム又はマグネシウム)、水酸化物、ならびにアルキルアミン、アラルキルアミン及び複素環アミンなどの有機塩基が挙げられる。適切な有機塩基の例としては、N-メチル-D-グルカミン、コリントリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、L-アルギニン、L-リジン、N-エチルピペリジン、ジベンジルアミンが挙げられるが、これらに限定されない。適切な塩の総説のために、Stahl及びWermuthによるHandbook of Pharmaceutical Salts：Properties, Selection, and Use(Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)を参照されたい。

本発明の化合物の適切な塩としては、製薬上許容し得る塩の例として本明細書に記載のものが挙げられる。

用語「溶媒和物」は、本明細書では、本発明の化合物と、1以上の製薬上許容し得る溶媒分子、例えばエタノールの化学量論量とを含む分子複合体を表すのに用いられる。用語「水和物」は、該溶媒が水のときに用いられる。

誤解を避けるために、本発明の化合物は、任意の互変異性型で使用しうる。

本発明の化合物は、キラル中心を含む。該化合物は、典型的にはL-アラニネート誘導体(すなわち、実施例1に図示される)の形態である。しかしながら、該化合物は、D-アラニネート誘導体又はD-体及びL-体の混合物として存在してもよい。ここで混合物が存在する場合、好ましくは、少なくとも90%、95%又は99%が、L-アラニネート誘導体として存在する。

本発明の化合物の生成の適当なスキーム及びプロセスは、続く実施例のセクションを参照して、以下に述べる。

原料は、典型的には、4-クロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩及び2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノールである。2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノールは実施例セクションのスキーム１に類似した下記スキームを用いて製造しうる:

ジフルオロニトロベンゼンは市販されている。工程1は、tert-ブチルアセテート基をフェニル環にニトロ基に対してパラに付加することが要求される。工程２は、対応する酸を形成するためにエステル基の加水分解が要求される。酸は、工程３における１級アルコールに還元される。工程４では、ニトロ基はアミンに還元される。

4-クロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩は、ＷＯ 2003076405に記載された実験手順を用いて製造してもよい。

化合物、tert-ブチル N-(2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートは、その後実施例セクションのスキーム２に類似の下記スキームを用いて合成してもよい。

工程1において、2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノール及び4-クロロフェニル3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩を一緒に反応させて2-(4-{[3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドイル]アミノ}-3,5-ジフルオロフェニル)エチルアセテートを形成する。工程２において、プロピオル酸を加えて、2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチルアセテートを形成する。工程3において、アセテート基を加水分解してアルコールにし、工程4において、得られたアルコール基を酸化してアルデヒドにする。本発明の化合物は、その後工程５において、tert-ブチル L-アラニネート塩酸塩の付加により形成される。tert-ブチル L-アラニネート塩酸塩は市販されている。

本発明は、また化合物と一緒に１以上の製薬上許容し得る担体及び/又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、典型的に本発明の化合物を85重量％以下含む。より典型的には、本発明の化合物を50重量％以下含む。好ましい医薬組成物は、無菌性でパイロジェンフリーである。

本発明の化合物は、多様な剤型で投与することができる。したがって、例えば、錠剤、トローチ、カプセル、ロゼンジ、水性懸濁液もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは分散性顆粒として経口的に投与することができる。本発明の化合物は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内（intrasternally）、経皮的又は点滴技術のいずれかで非経口的にも投与しうる。用いるビヒクル及び濃度に応じて、薬剤は、ビヒクル中に懸濁又は溶解できる。有利には、局所麻酔剤、防腐剤及び緩衝剤などアジュバントをビヒクル中に溶解できる。また化合物は、坐剤として投与してもよい。化合物は、吸入器又は噴霧器を介して、エアロゾルの形態で吸入により投与してもよい。

発明の化合物は、典型的には、製薬上許容し得る担体又は希釈剤と一緒に投与用に製剤化する。例えば、固形経口形態は、活性化合物と一緒に、可溶化剤、例えば、シクロデキストリン又は修飾シクロデキストリン;希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、蔗糖、セルロース、トウモロコシデンプン又は馬鈴薯デンプン;滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸カルシウム及び/又はポリエチレングリコール;結合剤;例えば、デンプン、アラビアゴム、トラガントガム、ゼラチン、シロップ剤、アカシア、ソルビトール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン;脱凝集剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギネート又はデンプングリコール酸ナトリウム;泡立ち混合物;染料;甘味料;レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸類などの湿潤剤;及び一般的に、医薬品の処方に使用される非毒性及び薬理学的不活性物質を含んでもよい。かかる製薬学的製剤は、公知の方法、例えば、混合、造粒、打錠、糖衣又はフィルムコーティングプロセスの手段により製造しうる。

経口投与用の液体分散は、液剤、シロップ剤、乳剤及び懸濁剤でありえる。液体製剤は、懸濁剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン硬化食用油；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシア；非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、例えばアーモンド油、ヤシ油、グリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコールなどの油状エステル；防腐剤、例えばメチルもしくはプロピルp-ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸、などの通常の添加剤、ならびに所望により通常の矯味矯臭剤又は着色剤を含み得る。液剤は可溶化剤、例えばシクロデキストリン又は修飾シクロデキストリンを含みうる。シロップ剤は、担体として、例えば蔗糖又は蔗糖グリセリン及び/又はマンニトール及び/又はソルビトールを含みうる。

懸濁剤及び乳剤は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを含みうる。筋肉内注射用の懸濁剤又は液剤は、活性化合物と一緒に、製薬上許容し得る担体、例えば滅菌水、オリーブ油、エチルオレエート、グリコール、例えばプロピレングリコール;可溶化剤、例えばシクロデキストリン又は修飾シクロデキストリン、ならびに所望により適当な量の塩酸リドカインを含みうる。

静脈内又は点滴用液剤は、担体として、例えば滅菌水、及び可溶化剤、例えばシクロデキストリン又は修飾シクロデキストリンを含みうる。あるいは好ましくは無菌性、水性、等張生理食塩水溶液の形態でありえる。

皮膚への局所的な塗布のために、薬剤は、クリーム、ローション又は軟膏剤として製造できる。薬剤に使用し得るクリーム又は軟膏の製剤は、例えば英国薬局方のような製薬の標準的な参考書に記載されるような当該技術に周知の通常の製剤である。

吸入による局所的適用のために、薬剤は、例えば圧力駆動噴射噴霧器又は超音波噴霧器によるか、あるいは好ましくは噴射剤駆動計量供給噴霧器又は微粉末の噴射剤フリーの投与、例えば吸入カプセルもしくはその他の「乾燥粉末」送達系によるエアロゾル送達用に処方できる。賦形剤、例えば噴射剤(例えば計量供給エアロゾルの場合、Frigen)、界面活性剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤、矯味矯臭剤及び充填剤(例えば粉末吸入器の場合、ラクトース)が、このような吸入製剤に存在し得る。吸入の目的のために、患者に適する吸入法を用いて、最適粒子サイズのエアロゾルを発生させ投与できる多数の装置が利用可能である。アダプタ(スペーサー、エキスパンダー)及び洋ナシ形の容器(例えばNebulator（登録商標）、Volumatic（登録商標）)、及び特に粉末吸入器の場合の計量供給エアロゾル用の吹きかけるスプレーを発射する自動装置(Autohaler(登録商標))の使用に加えて、多くの技術的解決法が利用可能である(例えば、Diskhaler（登録商標）、Rotadisk（登録商標）、Turbohaler（登録商標）、又は例えば欧州特許出願EP 0 505 321に記載されるような吸入器)。

眼への局所的な使用のために、薬剤は、適正な滅菌の水性又は非水性のビヒクル中の液剤又は懸濁剤として製造できる。添加剤、例えばメタ重硫酸ナトリウム又はエデト酸二ナトリウムなどの緩衝剤；防腐剤、例えば酢酸もしくは硝酸フェニル水銀、塩化ベンザルコニウム又はクロルヘキシジンなどの殺菌剤及び殺真菌剤、及びヒプロメロースなどの増粘剤も含むことができる。

治療有効量の本発明の化合物が対象に投与される。いずれの特定の患者についての具体的な用量レベルが、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与の時間、投与ルート、排泄ルート、薬物の組み合わせ及び治療を受ける特定の疾患の重篤度などの種々の因子に依存することが理解される。最適な用量レベル及び投与の頻度は、臨床試験により通常決定される。

典型的な１日用量は、具体的な化合物の活性、治療を受ける対象の年齢、体重及び状態、疾患の種類や重篤度ならびに投与頻度やルートにしたがって、体重ｋｇあたり５０ｍｇ以下、例えば体重ｋｇあたり０．００１〜５０ｍｇである。好ましくは、１日投与量レベルは、０．０５ｍｇ〜２ｇ、好ましくは、０．１ｍｇ〜１０ｍｇである。本発明の化合物は、典型的に非毒性の量で患者に投与される。

本発明は、療法によるヒト又は動物体の治療方法に使用するための本明細書中に定義された化合物又は本明細書中に定義された組成物を提供する。

本発明の化合物及び組成物がp38 MAPキナーゼ酵素活性を阻害することは見出されている。したがって当該化合物及び組成物は、p38 MAPキナーゼ活性によって調節される疾患および状態の予防および治療に有用である。p38 MAPキナーゼ活性により調節される疾患及び状態としては、癌及び乾癬などの細胞増殖性疾患、ハンチントン病などのポリグルタミン病、アルツハイマー病のような神経変性疾患、関節リウマチのような自己免疫疾患、糖尿病、血液病、炎症性疾患、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化症及び感染の炎症性続発症（inflammatory sequelia of infection）などが挙げられる。特定の例は、細胞増殖性疾患、自己免疫疾患及び炎症性疾患である。

自己免疫疾患はしばしば炎症性成分を有する。かかる状態としては、急性播種性全身脱毛症、ANCA陽性の疾患、ベーチェット病、シャーガス病、慢性疲労症候群、自律神経障害、脳脊髄炎、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、汗腺膿瘍、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、セリアック病、炎症性腸疾患、クローン病、１型糖尿病、ファンコニー症候群、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、川崎病、全身性エリテマトーデス、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発動脈炎、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、オプソシオナス（opsocionus）ミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、結節性多発動脈炎、多発筋痛、関節リウマチ、ライター症候群、シェーグレン症候群、側頭動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、温自己免疫性溶血性貧血、間質性膀胱炎、ライム疾患、限局性強皮症、乾癬、サルコイドーシス、強皮症、潰瘍性大腸炎、及び白斑が挙げられる。

本発明の化合物及び組成物で予防又は治療しうる他の炎症性の状態としては、例えば、虫垂炎、皮膚炎、皮膚筋炎、心内膜炎、結合組織炎、歯肉炎、舌炎、肝炎、汗腺膿瘍、虹彩炎、喉頭炎、乳腺炎、心筋炎、腎炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、肺炎、前立腺炎、腎盂腎炎、及び口内炎、移植拒絶反応（腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓（例えば、膵島細胞）、骨髄、角膜、小腸、皮膚同種移植片（skin allograft）、皮膚同種移植片（skin homograft）及び心臓弁異種移植片（xengrafts）などの器官、セーラム（sewrum）病及び移植片対宿主病など）、急性膵炎、慢性膵炎、急性呼吸窮迫症候群、セザリー（Sexary）症候群、先天性副腎皮質過形成症、非化膿性甲状腺炎、癌に関連のある高カルシウム血症癌、天疱瘡、水疱性疱疹状皮膚炎、重症多形性紅斑、剥脱性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、季節性もしくは通年性アレルギー性鼻炎、気管支喘息、接触皮膚炎、アトピー性（astopic）皮膚炎、薬物過敏症、アレルギー性結膜炎、角膜炎、眼部帯状疱疹、虹彩炎及び虹彩毛様体炎、脈絡網膜炎、視神経炎、症候性サルコイドーシス、劇症又は播種性肺結核化学療法、成人の特発性血小板減少性紫斑病、成人における二次性血小板減少症、後天性（自己免疫性）溶血性貧血、成人の白血病及びリンパ腫、小児期の急性白血病、限局性腸炎、自己免疫性血管炎、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、固形臓器移植拒絶反応、セプシス、原発性胆汁性肝硬変及び原発性硬化性胆管炎が挙げられる。

本発明の化合物及び組成物は、炎症性及び自己免疫疾患及び状態の予防及び治療に有用である。本発明の化合物及び組成物を用いて治療することができる炎症性及び自己免疫疾患及び状態としては、関節リウマチ、乾癬性関節炎、1型糖尿病、喘息、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、及び感染性の状態を伴う炎症（例えば、セプシス）、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性閉塞性肺領域疾患、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、及び移植片対宿主病が挙げられる。

本発明の化合物及び組成物は、細胞増殖性疾患、例えば癌の治療にも有用である。治療することができる癌の例としては、乳癌、卵巣癌、肺癌、膵臓癌、肝癌、大腸癌、腎臓癌、リンパ腫及び黒色腫が挙げられる。例えば、治療され得る癌としては、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、リンパ腫、又はメラノーマが挙げられる。

また本発明は、酸:

N-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニンに関する。

酸は、本発明の化合物の加水分解により製造してもよい。

本明細書に述べたように、本発明の化合物は、マクロファージ選択的である。したがって、本発明の化合物のエステル基は、ヒトカルボキシエステラーゼｈＣＥ−１を含む細胞により加水分解されうるが、ｈＣＥ−２又はｈＣＥ−３を含む細胞によっては加水分解されない。したがって、酸は、ｈＣＥ−１を含む細胞内で本発明の化合物のエステル基の加水分解時に生成され、酸は選択的にかかる細胞内に蓄積される。

本発明は、さらに以下の実施例において示される。

本発明の化合物は、以下の実施例に従い製造されうる。

略語
CDI=カルボニルジイミダゾール
DCM=ジクロロメタン
DMF=ジメチルホルムアミド
EtOAc=酢酸エチル
HCl=塩酸
LCMS=高速液体クロマトグラフィー/質量分析
MeOH=メタノール
MgSO₄=硫酸マグネシウム
Na₂CO₃=炭酸ナトリウム
NaHCO₃=炭酸水素ナトリウム
NMR=核磁気共鳴
STAB=ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド
THF=テトラヒドロフラン
g=グラム
mg=ミリグラム
mL=ミリリットル
mmol=ミリモル

市販の試薬及び溶媒(HPLC grade)は、更なる精製をしないで使用した。溶媒は、Buchiロータリーエバポレータを用いて除去した。マイクロ波照射は、Biotage Initiator（登録商標）Eightマイクロ波合成装置を用いて行った。フラッシュクロマトグラフィーカラムによる化合物の精製は、Fluorochemから得た粒子サイズ40〜63μm(230〜400メッシュ)のシリカゲルを用いて行った。

¹H NMRスペクトルは、重水素化溶媒中でのBruker 300 MHz AV分光計で記録した。ケミカルシフト(δ)は、百万分率である。薄層クロマトグラフィー(TLC)分析は、Kieselgel 60 F₂₅₄(Merck)プレートで行い、UV光を用いて視覚化した。

分析HPLC/MSは、Agilent HP1100 LC システムで、逆相Luna C18 カラム(3mm、50x4.6mm)、2.25分かけてのグラジェント5〜95%B(A=水/0.1%ギ酸、B=アセトニトリル/0.1%ギ酸)、流量=2.25mL/分、を用いて行った。UVスペクトルは、220及び254nmにてG1315B DAD検出器を用いて記録した。質量スペクトルは、m/z150〜800の範囲にわたりLC/MSD SL G1956B検出器で得た。データは、ChemStation及びChemStation Data Browserソフトウエアを用いて積分して報告した。

中間体
中間体１：4-クロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩

中間体１は、ＷＯ2003076405に記載された実験手順を用いて製造できる。

中間体２：2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノール

中間体２は、次のスキーム１に示されるルートを用いて合成された。

工程1 -ｔｅｒｔ−ブチル（３，５−ジフルオロ−４−ニトロフェニル）アセテート
無水DMF(200mL)中のジフルオロニトロベンゼン(24.96g、157mmol)及びtert-ブチルクロロアセテート(38.0mL、267mmol)の溶液を、窒素下で、1時間かけて、無水DMF(200mL)中のカリウム tert-ブトキシド(61.61g、549mmol)の冷(-35℃)懸濁液に滴下し加えた。反応液を-35℃で1.5時間撹拌し、2N HCl(240mL)で反応を止め、ヘプタン(4x200mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を水(3x200mL)、食塩水(200mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、ろ過し減圧下に濃縮し黄色の油を得た。カラムクロマトグラフィ(ヘプタン中の10%EtOAc)による精製により黄色の油(37.64g)を得た。別の二つのバッチ(10.00g及び23.54gのジフルオロニトロベンゼン)はそれぞれ14.30g及び31.39gの生成物を得た。３つのバッチのすべての¹H NMRは、所望の化合物と少量の未同定不純物を示した。３つのバッチは合わせて、さらなる精製はしないで次の工程に使用した。
¹H NMR (300 MHz、CDCl₃) 7.05 (2H, d, J=8.5 Hz), 3.56 (2H, s), 1.46 (9H, s).

工程2 - (3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)酢酸
トリフルオロ酢酸(150mL)をDCM(300mL)中のtert-ブチル(3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)アセテート(83.33g、305mmol)の冷(0℃)溶液に20分にわたり滴下し加えた。滴下完了時に、反応液を室温まで温めて、3時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮し粘着性の褐色の固体を得た。ヘプタンでトリチュレーションすることにより、黄色の固体(53.29g、2工程を経て収率67%)として標記の化合物を得た。
¹H NMR (300 MHz、CDCl₃) 7.08 (2H, d, J=8.5 Hz), 3.74 (2H, s), -CO₂ H not visible.

工程3 - 2-(3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)エタノール
ボラン-ジメチルスルフィド錯体(35mL、368mmol)を窒素下で20分にわたり、無水THF(500mL)中の(3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)酢酸(53.29g、245mmol)の冷(0℃)溶液に滴下し添加した。添加完了後、反応液を室温に温め、16時間撹拌し、0℃に冷却し、注意深くMeOH(300mL)で反応を止め、減圧下で濃縮し褐色の油を得た。ドライフラッシュクロマトグラフィー(ヘプタン中60-80% EtOAc)による精製によりオレンジ色の油(38.90g、収率78%)として標記の化合物を得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 7.01 (2H, d, J=8.7 Hz), 3.93 (2H, t, J=6.2 Hz), 2.92 (2H, t, J=6.2 Hz), 2.34 (1H, br s).

工程4 - 2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノール
2-(3,5-ジフルオロ-4-ニトロフェニル)エタノール(38.90g、191mmol)をEtOAc(250mL)中に溶解した。反応容器の脱気及び窒素充填を３回行った。パラジウムカーボン(10重量％、4.00g)を加え、容器の脱気及び窒素充填を３回行った。最終的に、容器を脱気し水素を充填し、容器に水素を含むバルーンを装着した。その後水素下で室温で15時間撹拌し、水素バルーンを再充填し、混合液をさらに25時間撹拌した。反応液をCelite(R)を通してろ過し、濾液を減圧下で濃縮し褐色の油を得た。ドライフラッシュクロマトグラフィー(ヘプタン中50% EtOAc)による精製によりベージュ色の固体(20.70g、収率62%)として標記の化合物を得た。
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) 6.73-6.70 (2H, m), 3.81 (2H, t, J=6.4 Hz), 2.75 (2H, t, J=6.4 Hz), -OH 及び -NH ₂ not visible.

実施例1：tert-ブチル N-(2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート

実施例１は、次のスキーム２に示すルートを用いて合成した。

工程1 - 2-(4-{[3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドイル]アミノ}-3,5-ジフルオロフェニル)エチルアセテート
2-(4-アミノ-3,5-ジフルオロフェニル)エタノール(20.71g、120mmol)を氷酢酸(400mL)中のクロロフェニル 3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドチオエート塩酸塩(41.26g、114mmol)溶液に添加した。反応液を80℃で2.5時間撹拌し、無水酢酸(21mL、228mmol)を加えた。80℃でさらに45分後、反応液を室温に冷却し、減圧下で濃縮し褐色の油を得た。EtOAcでトリチュレーションしベージュ色の固体を得、その固体をジエチルエーテルで洗浄した。その固体をNaHCO₃の飽和水溶液中に取り上げ、３０分間激しく攪拌した。固体を濾取し、水で洗浄し、減圧下で乾燥し、ベージュ色の固体(23.36g、収率52%)として標記の化合物を得た。
LCMS：m/z 397 [M+H]⁺.

工程2 - 2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチルアセテート
プロピオル酸(5.4mL、88mmol)を、窒素下で無水THF(400mL)中のCDI(14.27g、88mmol)の冷(0℃)溶液に5分かけて滴下し加えた。添加完了後、反応液を室温に温め、1時間撹拌した。無水THF(200mL)中の2-(4-{[3-(2,4-ジフルオロフェニル)-3-オキソプロパンイミドイル]アミノ}-3,5-ジフルオロ-フェニル)エチルアセテート(23.26g、59mmol)溶液を加え、反応液を還流で6.5時間撹拌した。反応液を室温まで冷却し、16.5時間放置した。プロピオル酸(5.4mL、88mL)、CDI(14.27g、88mmol)及びTHF(200mL)を上述した通りに処理し、反応液に加え、続いて還流でさらに6時間撹拌した。続いて反応液を室温まで冷却し減圧下で濃縮し、褐色の油を得た。ドライフラッシュクロマトグラフィー(DCM中5% MeOH)による精製により濃褐色の固体を得た。さらにその個体をEtOAcでのトリチュレーションにより精製し、黄色の固体(7.45g、収率28%)として標記の化合物を得た。
LCMS：m/z 449 [M+H]⁺及び471 [M+Na]⁺.

工程3 - 6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-1-[2,6-ジフルオロ-4-(2-ヒドロキシエチル)フェニル]ピリジン-2(1H)-オン
2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチルアセテート(7.45g、17mmol)を6N HCl(80mL)中に懸濁し、反応液を21.5時間還流した。固体を濾取し、NaHCO₃の飽和水溶液(200mL)中に取り上げ、３０分間激しく攪拌した。固体を濾取し、水で洗浄し、真空オーブン(40℃)内で乾燥し、ベージュ色の固体として標記の化合物を得た。
LCMS：m/z 407 [M+H]⁺及び 429 [M+Na]⁺.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) 7.57 (1H, td, J=6.6, 8.3 Hz), 7.41 (1H, td, J=2.4, 9.7 Hz), 7.37-7.29 (3H, m), 7.23 (1H, td, J=2.3, 8.5 Hz), 5.74 (1H, d, J=9.8 Hz), 4.78 (1H, t, J=5.1 Hz), 3.76-3.70 (2H, m), 2.86 (2H, t, J=6.7 Hz), -NH ₂ not visible

工程4 - {4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}-アセトアルデヒド
デス-マーチンペルヨージナン（Dess-Martin periodinane）(1.03g、2.4mmol)を、DCM(20mL)中の6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-1-[2,6-ジフルオロ-4-(2-ヒドロキシエチル)フェニル]ピリジン-2(1H)-オン(823mg、2.0mmol)の懸濁液に加えた。反応液を室温で2時間撹拌し、NaHCO₃の飽和水溶液(10mL)及びチオ硫酸ナトリウムの飽和水溶液(10mL)で反応を止め、３０分間激しく攪拌した。水相を分離し、さらにDCM(2x20mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥し(MgSO₄)、ろ過し、減圧下で濃縮し、淡褐色の固体(819mg)として標記の化合物を得た。これを次の工程において更なる精製無しで使用した。

工程5 - tert-ブチルN-(2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート
tert-ブチル L-アラニネート塩酸塩(552mg、3.0mmol)及びSTAB(1.29g、6.1mmol)を{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}-アセトアルデヒド(819mg、2.0mmol)の溶液に加えた。反応液を室温で3.5時間撹拌し、Na₂CO₃の飽和水溶液(20mL)で反応を止め、２０分間激しく撹拌した。水相を分離し、さらにEtOAc(2x20mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を食塩水(20mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO₄)、ろ過し、減圧下で濃縮し黄色の油を得た。カラムクロマトグラフィ(ＤＣＭ中5% MeOH)による精製により、淡黄色の固体(492mg,2ステップにわたり収率78%)として標記の化合物を得た。
LCMS：純度98%, m/z 534 [M+H]⁺.
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) 7.58 (1H, td, J=6.8, 8.3 Hz), 7.41 (1H, td, J=2.3, 9.8 Hz), 7.37-7.30 (3H, m), 7.23 (1H, td, J=2.3, 8.5 Hz), 5.74 (1H, d, J=9.8 Hz), 3.20 (1H, d, J=7.0 Hz), 2.89-2.70 (4H, m), 1.42 (9H, s), 1.16 (3H, d, J=7.0 Hz), -NH ₂及び -NH- not visible

生物学的活性の測定
p38 MAPキナーゼ活性
p38 MAPキナーゼ活性を阻害する化合物の能力をUpstate(Dundee UK)により行われるアッセイにおいて測定した。最終反応容量25μL中に、p38 MAPキナーゼa(5〜10 mU)を、25mM Tris pH 7.5、0.002mM EGTA、0.33mg/mLミエリン塩基性タンパク質、10mM酢酸Mg及び[g-33p-ATP](比活性約500cpm/pmol、所望の濃度)と一緒にインキュベートする。反応を、MgATPミックスの添加により開始する。室温にて40分間のインキュベートの後に、反応を、5μLの3%リン酸溶液の添加により停止させる。10μLの反応を、次いで、P30フィルタマットにスポットし、75mMリン酸中で5分間３回洗浄、及びメタノール中で１回洗浄した後に、乾燥してシンチレーションカウントを行う。

二回のデータ点を、DMSO中のストック溶液の1/3 log希釈系列から作製する。最高濃度10μMから9つの希釈段階を作製し、「化合物なし」ブランクを含める。標準的な放射分析フィルタ結合アッセイを、Km又はそれに近いATP濃度で行う。シンチレーションカウントからのデータを回収し、Prismソフトウエアによるフリー−フィット分析に供する。作製された曲線から、50%阻害を与える濃度を決定し、報告する。

THP-1細胞のLPS刺激
THP-1細胞を、100μlに4×10⁴細胞/ウェルの密度で、V底96ウェル組織培養処理プレートに植え、37℃にて5% CO₂中で16時間インキュベートした。阻害剤を100μlの組織培養培地中に添加した2時間後に、細胞を1μg/mlの最終濃度のLPS(E coli 005:B5株、Sigma)で刺激し、37℃にて5%CO₂中で6時間インキュベートした。TNF-αのレベルを、サンドイッチELISA(R&D Systems #QTA00B)により、無細胞上清から測定した。

ヒト全血のLPS刺激
全血を、ヘパリン添加ヴァキュテイナー(Becton Dickinson)を用いて静脈穿刺により採取し、等容量のRPMI1640組織培養培地(Sigma)で希釈した。100μlを、V底96ウェル組織培養処理プレートに植えた。100μlのRPMI1640培地中に阻害剤を添加2時間後に、血液を、100ng/mlの最終濃度のLPS(E coli 005:B5、Sigma)で刺激し、37℃にて5%CO₂中で6時間インキュベートした。TNF-αのレベルを、サンドイッチELISA(R&D Systems #QTA00B)により、無細胞上清から測定した。

マウスにおける血漿曝露
化合物を下記の手順を用いて、8%DMSO、92%ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（水中11.25%）中で処方した：化合物を100%DMSO中で完全に溶解し、続いてヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン溶液を加えた。形成された微細な沈殿物をHCl水溶液の添加及び水酸化ナトリウム水溶液でpHを4に調整することにより再溶解した。

各化合物は、雄のCD1マウス（25〜20グラム）に、5ml/kgの総投与量で、10mg/kg経口投与した。3匹のマウスを各時点のために使用した。血液サンプルは以下の時点：5、15、30、60、120、240及び360分に、ハロタン/イソフルラン麻酔下で、末端心臓穿刺により採取した。血液サンプルを、NaF/EDTAを含む予め冷却したチューブに採取し混合した。サンプルを2分間7-7.5×gでスピンさせた。血漿を吸引し、凍結した。

血漿サンプルを、内部標準を含むアセトニトリルの３つのボリュームを使用して、タンパク質の沈殿により調製した。上清をLCMS(Sciex API 3000, HP1100 binary pump, CTC PAL)により分析した。クロマトグラフィーはAcentis C8 (50 x 2.1 mm)カラム、水/0.1％ギ酸中の5〜95％のアセトニトリルの移動相に基づいた。

曝露（AUC）は、PKソリューションズ2.0(Summit Research Services, Montrose, Colorado)を使用して、血漿濃度対時間プロフィールから算出した。

表1-本発明の化合物及び構造的関連化合物の生物学的活性
カラムA〜Dは次のデータを提供する:
A - エステル酵素アッセイ(p38 キナーゼ A(invitrogen))、IC50(nM);
B - 酸酵素アッセイ(p38 キナーゼ A(invitrogen))、IC50(nM);
C - エステルTNF-アルファ阻害(THP-1 cells)、IC50(nM);及び
D - エステルTNF-アルファ阻害(ヒト全血)、IC50(nM)

結論
表1は、本発明者の化合物がp38 MAPキナーゼの良好な阻害剤である示している。また、THP-1細胞及びヒト血液中のエステルTNF-α阻害のIC50値は非常に低い。特に、ヒト血液中のエステルTNF-α阻害は、関連化合物について観察されたヒト血液中のエステルTNF-α阻害のIC50値を考慮すると期待されるよりも有意に低い。

表２に示したＡＵＣデータは、本発明の化合物のバイオアベイラビリティーが構造的に類似した公知の化合物よりもはるかに高いことを示す。

Claims

化合物:tert-ブチルN-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネート、又はその製薬上許容され得る塩、水和物もしくは溶媒和物。
化合物が、tert-ブチルN-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートのエタンスルホン酸塩である請求項1に記載の化合物。
化合物が、tert-ブチルN-[2-{4-[6-アミノ-5-(2,4-ジフルオロベンゾイル)-2-オキソピリジン-1(2H)-イル]-3,5-ジフルオロフェニル}エチル)-L-アラニネートのメタンスルホン酸塩である請求項1に記載の化合物。
請求項１〜３のいずれか1項に記載の化合物を１以上の製薬上許容し得る担体及び/又は賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
請求項１〜３のいずれか1項に記載の化合物を活性成分として含有する医薬組成物。
請求項１〜３のいずれか1項に記載の化合物を活性成分として含むp38 MAPキナーゼ酵素活性阻害剤。
自己免疫又は炎症性疾患の予防又は治療用である、請求項６に記載の剤。
関節リウマチ、乾癬性関節炎、１型糖尿病、喘息、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、感染状態を伴う炎症、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎又は移植片対宿主病の予防又は治療用である、請求項６又は７に記載の剤。
細胞増殖性疾患の治療用である、請求項６に記載の剤。
癌の治療用である、請求項６又は９に記載の剤。
乳癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、リンパ腫又はメラノーマの治療用である、請求項６、９又は１０に記載の剤。