JP6050555B2 - Ｐｔｏの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いたターゲット核酸配列の検出 - Google Patents

Description

本願は、２０１３年７月１５日付で大韓民国特許庁に出願された大韓民国特許出願番号第２０１３−００８３０７２号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として挿入される。

本発明は、ＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する技術に関する。

ＤＮＡハイブリダイゼーションは、分子生物学の基本的な過程である。しかし、ハイブリダイゼーションにのみ主に依存する従来の方法及び過程では、プローブと非ターゲット配列との間の非特異的なハイブリダイゼーションによる擬陽性結果の発生可能性が高い。したがって、従来の方法及び過程は、信頼度を改善しなければならない問題点が残っている。

ハイブリダイゼーション過程以外にも、追加的に酵素反応を用いた幾つかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法が提示された。

ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法で、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた標識プローブは、アップストリームプライマー依存的ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって切断されて、ターゲット配列の存在を示すシグナルを発生させる（米国特許第５，２１０，０１５号、第５，５３８，８４８号、及び第６，３２６，１４５号）。ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法は、シグナル発生のための２つの接近法を提示する：重合依存的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）及び重合独立的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）。重合依存的切断で、アップストリームプライマーの延長は、必ず核酸重合酵素が標識プローブの５’末端に接触する前に発生しなければならない。延長反応が進行しながら、重合酵素は、標識プローブの５’末端を次第に切断する。重合独立的切断で、アップストリームプライマー及び標識プローブは、非常に近接してターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、アップストリームプライマーの３’末端と核酸重合酵素の結合は、前記核酸重合酵素を標識プローブの５’末端に接触させて、標識を放出する。また、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法は、その５’末端にターゲット配列とハイブリダイズされない５’末端領域を有する標識プローブが切断されて、５’末端領域を含む断片が形成されることを開示している。

ターゲット配列に非相補的な５’末端領域を有するプローブが、５’ヌクレアーゼによって切断されて、５’末端領域を含む断片が放出される幾つかの方法が報告された。

例えば、特許文献１は、ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって切断される切断構造を開示している。テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）に非相補的な５’部位、及びテンプレートに相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドがテンプレートにハイブリダイズされ、アップストリームオリゴヌクレオチドは、非常に近接してテンプレートにハイブリダイズされる切断構造が例示されている。前記切断構造は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素または減少した合成活性を有する変形ＤＮＡ重合酵素によって切断されて、テンプレートに非相補的な５’部位が放出される。次いで、前記放出された５’部位は、ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされて切断構造を形成し、これにより、漸進的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。

特許文献２は、３’末端がブロッキングされたアップストリームオリゴヌクレオチドを有する切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼによって切断されて、非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）領域が放出され、前記放出された５’フラップ領域が、サイズ分析または相互作用的二重標識によって検出される過程を開示している。特許文献３は、検出可能な放出されたフラップが核酸合成依存的な、フラップ媒介連続的増幅方法によって生成されることを開示している。この方法では、第１切断構造から放出されたフラップが、核酸合成依存的な方式で第２切断構造を切断して第２切断構造からフラップを放出させ、前記放出されたフラップが検出される。

特許文献４は、核酸合成によって生成された放出されたフラップの形成、放出されたフラップの延長、フラップ延長の間にオリゴヌクレオチドの切断及びオリゴヌクレオチドの切断によって生成されたシグナル検出を含む方法を開示している。

液相での蛍光−標識プローブのハイブリダイゼーションによって、一種の蛍光標識を用いる場合にも、メルティングカーブ分析によって多数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。しかし、相互作用的二重標識プローブの５’ヌクレアーゼ−媒介切断によってターゲット配列を検出する従来技術は、マルチプレックスターゲット検出において、互いに異なるターゲット配列に対して、互いに異なる種類の蛍光標識を必要とし、このような蛍光標識種類の数の限界のために検出されるターゲット配列の数は制限される。

特許文献５は、ターゲット核酸配列に非相補的な５’部位を有するプローブの切断及びキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）プローブのハイブリダイゼーションを用いたターゲット検出方法を開示している。標識は、非相補的な５’部位に位置する。ターゲット配列にハイブリダイズされた標識プローブは、切断されて断片を放出し、以後、前記断片は、キャプチャープローブにハイブリダイズされてターゲット配列の存在が検出される。この方法で、非切断された／完全な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブは、キャプチャープローブにハイブリダイズされないことが必須的である。そのためには、短い長さを有するキャプチャープローブが、固相基質上に固定されなければならない。しかし、このような制限は、固相基質でのハイブリダイゼーションの効率を低め、また反応条件の最適化も難しくする。

したがって、より便利かつ信頼性及び再現性のあるハイブリダイゼーション方式で、ハイブリダイゼーションだけではなく、５’核酸切断反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような酵素反応によって、固相でターゲット配列、特に、複数のターゲット配列を向上させた正確性で検出するための新規な接近法に対する開発要求が台頭しつつある。

本明細書の全般に亘って多数の特許及び文献が参照され、その引用がカッコで囲まれている。本発明及び本発明が属する技術分野のレベルをより明確に説明するために、このような特許及び文献の公開は、その全体として本明細書に参照して含まれている。

米国特許第５，６９１，１４２号 米国特許第７，３８１，５３２号 米国特許第６，８９３，８１９号 米国特許第７，３０９，５７３号 米国出願公開第２００８−０２４１８３８号

本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列の検出のための新規なプロトコルを定立し、この新規なプロトコルによれば、ターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーション、５’核酸切断反応及び延長を含む酵素反応及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって達成される。本発明のプロトコルは、固相でより改善された正確性及び便宜性を有し、複数のターゲット配列を検出することができる。

したがって、本発明の目的は、ＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＰＣＥ−ＩＨ分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、添付した特許請求の範囲及び図面と共に下記の詳細な説明によってより明確になる。

本発明の一態様において、本発明は、次の段階を含み、ＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＰＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し；
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＣＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって；前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し；前記延長鎖は、標識を含み；
（ｅ）前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＩＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記ＩＯは、前記延長鎖に相補的な配列を含み；前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し；及び（ｆ）前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって；前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列の検出のための新規なプロトコルを定立し、この新規なプロトコルによれば、ターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーション、５’核酸切断反応及び延長を含む酵素反応及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって達成される。本発明のプロトコルは、固相でより改善された正確性及び便宜性を有し、複数のターゲット配列を検出することができる。

本発明は、プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ハイブリダイゼーション；ＰＴＯの切断及び延長；及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含む連続した段階を用いる。したがって、本発明は、ＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析と名付けられる。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、まずＰＴＯをターゲット核酸配列とハイブリダイズさせ、人為的に選択した配列を有するＣＴＯをテンプレートとして使うことによって、ターゲット−依存的な方式で延長鎖を形成させ、最後に、前記延長鎖を固相に固定されたＩＯとハイブリダイズさせる。すなわち、本発明は、ＰＴＯハイブリダイゼーション及び切断、ＣＴＯハイブリダイゼーション及び延長、及びＩＯハイブリダイゼーションを含む一連の反応を用いて、本発明の特異性を非常に向上させる。
（ｂ）固相は、制限された反応環境を提供することができるために、ターゲット核酸配列及び固相基質上に固定されたオリゴヌクレオチド間の直接的なハイブリダイゼーションは、効率的な反応結果が得られない。一方、本発明は、ターゲット核酸配列の関与なしに、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションを用いるので、一般的または典型的な反応条件下でより効率的に検出結果が得られる。このような利点は、より便利な方式で非常に多様な特性を有する臨床試料の複数のターゲット核酸検出のための反応条件を確立可能にし、擬陽性シグナルの発生を防止する。
（ｃ）固相に固定されたＩＯは、標識を含まない。したがって、固相に固定された標識オリゴヌクレオチドを長期保管する場合に発生する標識分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）の問題点がない。
（ｄ）ターゲット核酸配列とプローブの直接的なハイブリダイゼーションを用いる従来の方法で、プローブは、相補的な配列と競争する方式でターゲット核酸配列に結合する。対照的に、本発明は、このような競争的なハイブリダイゼーションを避けることができる。本発明は、ＰＴＯ及びＣＴＯの量を調節することによって、延長鎖のみがＣＴＯをテンプレートとして用いて増幅され、これにより、延長鎖がＣＴＯの妨害なしに効率的にＩＯとハイブリダイズされることができるために、より効率的なプローブハイブリダイゼーションが可能である。
さらに、ターゲット核酸配列の一鎖とプローブの直接的なハイブリダイゼーションを用いる従来の方法で、ターゲット核酸配列の反対側鎖の長さは、プローブの長さよりも相対的に長い。したがって、より長い長さのプローブ（すなわち、より高いＴｍ値のプローブ）を使って反対側鎖のハイブリダイゼーション競争力よりもプローブのハイブリダイゼーション競争力を向上させるのには限界がある。本発明で、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションを抑制するＣＴＯの長さは、より短く調節される。したがって、ＩＯの長さを調節（すなわち、Ｔｍ値の調節）することによって、ＩＯのハイブリダイゼーション競争力をＣＴＯのハイブリダイゼーション競争力よりも向上させうる。
（ｅ）本発明は、固相でのシグナルをリアルタイム方式で検出し、かつ一定の温度範囲で提供されるシグナル（例えば、メルティングカーブ分析）の検出も可能である。
（ｆ）本発明は、固相に固定されたオリゴヌクレオチドを用いるので、一種の蛍光標識を使うとしても、複数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。
（ｇ）ＰＴＯの５’−タギング部位の配列、ＣＴＯの配列及びＩＯの配列が、ターゲット核酸配列を考慮せずに選択可能であるということは注目すべき点である。これは、ＰＴＯの５’−タギング部位、ＣＴＯ及びＩＯのための配列プール（ｐｏｏｌ）をあらかじめデザインすることを可能にする。ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、必ずターゲット核酸配列を考慮して準備せねばならないが、ＣＴＯ及びＩＯは、ターゲット核酸配列についての考慮や知識なしに既製作の方式で準備しうる。

ＰＣＥ−ＩＨ分析で利用されるプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）及び固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）の図式的な構造を示す。特に、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＩＯの３’末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。 ＰＣＥ−ＩＨ分析で利用されるプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）及び固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）の図式的な構造を示す。特に、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＩＯの３’末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。 ＰＴＯから放出された断片に結合された単一標識を用いるＰＣＥ−ＩＨ分析の一具現例を図式的に示す。ＩＯは、延長鎖の延長配列に相補的な配列を含む。 延長鎖に挿入される標識を用いるＰＣＥ−ＩＨ分析の一具現例を図式的に示す。 Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡの存在を分析するためにＰＴＯの５’末端に結合された単一標識を用いるＰＣＥ−ＩＨ分析の結果を示す。ターゲット核酸配列が存在する場合、固相基質上で蛍光シグナルが検出された。 延長鎖とＩＯのハイブリダイゼーションに対するＣＴＯの影響に対する結果を示す。 延長鎖とＩＯのハイブリダイゼーションに対するＣＴＯの影響に対する結果を示す。 ＰＴＯ対ＣＴＯの多様なｍｏｌ比を用いたＰＣＥ−ＩＨ分析の結果を示す。 ＰＴＯ対ＣＴＯの多様なｍｏｌ比を用いたＰＣＥ−ＩＨ分析の結果を示す。

本発明をより詳細に説明すれば、次の通りである：
段階（ａ）：アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション
本発明によれば、ターゲット核酸配列を、まずアップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）とハイブリダイズさせる。

本明細書で使われる用語“ターゲット核酸”、“ターゲット核酸配列”、または“ターゲット配列”は、検出しようとする核酸配列を意味し、これは、ハイブリダイゼーション、アニーリング、または増幅条件下で、プローブまたはプライマーとアニーリングまたはハイブリダイズされる。

本明細書で使われる用語“プローブ（ｐｒｏｂｅ）”は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位または部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。

本明細書で使われる用語“プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）”は、核酸鎖（テンプレート）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在時に、そして、適した温度とｐＨとで合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを意味する。

特定の具現例で、プローブ及びプライマーは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。本発明で利用されるプローブまたはプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含みうる。また、プローブまたはプライマーは、リボヌクレオチドを含みうる。

プライマーは、重合剤の存在下で延長産物の合成をプライミングさせることができる程度に十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含んだ多くの因子によって決定される。本明細書で使われる用語“アニーリング”または“プライミング”は、テンプレート核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、重合酵素がヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはその一部に相補的な核酸分子を形成させる。

本明細書で使われる用語“ハイブリダイズ”は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、完全に一致するか、一部のミスマッチで実質的に一致する２つの核酸鎖間で起こりうる。ハイブリダイゼーションのための相補性は、ハイブリダイゼーション条件、特に、温度によって変わりうる。

ターゲット核酸配列とアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとのハイブリダイゼーションは、最適化手続きによって一般的に決定される適したハイブリダイゼーション条件下で実施される。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄回数、バッファ成分、及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ）の長さと、ＧＣ含量及びターゲットヌクレオチド配列を含んだ多様な因子によって変わりうる。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを用いる場合、低い厳格条件を選択することが望ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）］で確認することができる。

用語“アニーリング”と“ハイブリダイズ”は、差がなく、本明細書で混用されて使われる。

アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を有する。本明細書で使われる用語“相補的”は、所定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズされるほどに十分に相補的であることを意味し、用語“実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”及び“完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”であることをいずれも包括する意味を有し、例えば、完全に相補的であることを意味する。

前記ＰＴＯの５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む。本明細書で使われる用語“非相補的（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”は、所定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズされないほどに十分に非相補的であることを意味し、用語“実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”及び“完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”であることをいずれも包括する意味を有し、例えば、完全に非相補的であることを意味する。

例えば、ＰＴＯの５’−タギング部位と関連して使われる用語“非相補的”は、所定のアニーリング条件または厳格条件下で前記５’−タギング部位がターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズされないほどに十分に非相補的であることを意味し、用語“実質的に非相補的”及び“完全に非相補的”であることをいずれも包括する意味を有し、例えば、完全に非相補的であることを意味する。

本明細書で使われる用語“プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）”は、（ｉ）プローブの役割をする３’−ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされた後、ＰＴＯから核酸切断（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）方式で放出される、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。前記ＰＴＯで５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位は、５’→３’順序で位置しなければならない。ＰＴＯは、図１に図式的に例示されている。

一具現例で、前記段階（ａ）でハイブリダイゼーションは、前記３’−ターゲッティング部位が前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位が前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない厳格条件下で実施される。

前記ＰＴＯは、如何なる特定の長さを有することを要求しない。例えば、ＰＴＯの長さは、１５〜１５０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、２０〜１５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、３０〜１５０ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、３５〜１００ヌクレオチド、３５〜８０ヌクレオチド、３５〜６０ヌクレオチド、または３５〜５０ヌクレオチドであり得る。前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、それがターゲット核酸配列と特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも可能である。例えば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、または２０〜３０ヌクレオチドの長さを有しうる。前記５’−タギング部位は、それがＣＴＯのキャプチャリング部位に特異的にハイブリダイズされて延長される限り、如何なる長さも可能である。例えば、前記ＰＴＯの５’−タギング部位は、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、または１５〜２０ヌクレオチドの長さを有しうる。

前記ＰＴＯの３’末端は、３’−ＯＨターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を有することもある。特定の具現例で、ＰＴＯの３’末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。

前記ブロッキングは、従来の方法によって達成されうる。例えば、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基に、ビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、またはアルカンジオールのような化学的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）を付け加えて実施することができる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはデオキシヌクレオチドのように３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを用いて実施することができる。

択一的に、前記ＰＴＯが、ヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。

前記ＰＴＯの５’−タギング部位及びターゲット核酸配列間の非ハイブリダイゼーションは、特定ハイブリダイゼーション条件下で前記ＰＴＯの５’−タギング部位及びターゲット核酸配列間に安定した二本鎖を形成しないことを意味する。本発明の一具現例によれば、前記ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションに関与しない前記ＰＴＯの５’−タギング部位は、一本鎖を形成する。

前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置する。

また、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたアップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導する。

前記アップストリームオリゴヌクレオチドによるＰＴＯの切断の誘導は、２つの方式で達成されうる：（ｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−独立的切断誘導；及び（ｉｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−依存的切断誘導。

前記アップストリームオリゴヌクレオチドが、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断の誘導に十分な程度に前記ＰＴＯに近接して位置する場合、前記アップストリームオリゴヌクレオチドに結合した前記酵素は、延長反応なしに前記ＰＴＯを切断する。一方、前記アップストリームオリゴヌクレオチドが、前記ＰＴＯと離隔して位置する場合、重合酵素活性を有する酵素（例えば、鋳型−依存的重合酵素）は、前記アップストリームオリゴヌクレオチド（例えば、アップストリームプライマー）の延長を促進させ、前記延長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＰＴＯを切断する。

したがって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、２つの方式で前記ＰＴＯに対して相対的に位置しうる。前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−独立した方式で前記ＰＴＯの切断の誘導に十分な程度にＰＴＯに近接して位置しうる。択一的に、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式で前記ＰＴＯの切断の誘導に十分な程度に前記ＰＴＯと離隔して位置しうる。

本明細書で、地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）または位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使われる用語“近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）”は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位に近接して位置して、ニック（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、前記用語は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位から１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、または１〜１５ヌクレオチド離隔して位置することを意味する。

本明細書で、地点または位置を言及しながら使われる用語“離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）”は、延長反応が起こるのに十分な程度の如何なる地点または位置を含む。

一具現例によれば、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式でＰＴＯの切断の誘導に十分な程度にＰＴＯと離隔して位置する。

一具現例によれば、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。前記アップストリームプライマーは、延長−独立的切断誘導または延長−依存的切断に適し、前記アップストリームプローブは、延長−独立的切断誘導に適している。

択一的に、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有しうる。特定の具現例で、前記重なる配列は、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、または１〜３ヌクレオチドの長さである。前記アップストリームオリゴヌクレオチドが、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−一部と部分的に重なる配列を有する場合、段階（ｂ）の切断反応で３’−ターゲッティング部位は、５’−タギング部位と共に部分的に切断される。また、前記重なる配列は、３’−ターゲッティング部位の所望のサイト（ｓｉｔｅ）を切断させる。

一具現例によれば、前記アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。

アップストリームオリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断を誘導して、ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片が放出される限り、アップストリームオリゴヌクレオチドによる切断反応に関する従来技術が、本発明に適用可能である。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号、及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号を、本発明に適用することができる。

一具現例によれば、本発明の方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施される。前記ダウンストリームプライマーは、ＰＴＯにハイブリダイズされるターゲット核酸配列を追加的に生成させて、ターゲット検出の敏感度を向上させる。

一具現例によれば、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーを用いる場合、プライマーの延長のために、鋳型−依存的核酸重合酵素が追加的に使われる。

一具現例によれば、前記アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブ）、前記ダウンストリームプライマー及び前記ＰＴＯの５’−タギング部位は、本発明者によって開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（Ｄｕａｌ Ｐｒｉｍｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ＤＰＯ）構造を有する。前記ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来のプライマー及びプローブに比べて、非常に改善されたターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎら、Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。

一具現例によれば、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、本発明者によって開発された変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕａｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ｍＤＳＯ）構造を有する。前記変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造は、従来のプローブに比べて、非常に改善されたターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ ２０１１／０２８０４１）。

段階（ｂ）：ＰＴＯの切断から断片の放出
引き続き、前記ＰＴＯの切断のための条件下で前記段階（ａ）の結果物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断されて、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。

本明細書で使われる用語“ＰＴＯの切断のための条件”は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によってターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯが切断されるのに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、バッファ、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして、酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素としてＴａｑ ＤＮＡ重合酵素が利用される場合、ＰＴＯの切断のための条件は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、及び温度を含む。

前記ＰＴＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、その３’−ターゲッティング部位は、ハイブリダイゼーションに関与し、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず、一本鎖を形成する（参照：図２）。このように、一本鎖及び二本鎖構造いずれもを含むオリゴヌクレオチドは、当業者に知られた多様な技術によって５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて切断されうる。

前記ＰＴＯの切断サイトは、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプローブまたはアップストリームプライマー）の種類、アップストリームオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションサイト及び切断条件によって変わる（参照：米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、及び第７，３８１，５３２号、または米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。

前記ＰＴＯの切断反応のために、多数の従来技術が利用され、５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。

簡略に、段階（ｂ）で、３種の切断サイトが存在することができる。最初の切断サイトは、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’−ターゲッティング部位）及び非ハイブリダイゼーション部位（５’−タギング部位）間のジャンクション位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）である。二番目の切断サイトは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’末端から３’−方向に幾つかのヌクレオチドほど離隔して位置するサイトである。前記二番目の切断サイトは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置する。三番目の切断サイトは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’末端から５’−方向に幾つかのヌクレオチドほど離隔して位置するサイトである。

一具現例によれば、アップストリームプライマーの延長時に、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素によるＰＴＯの切断のための初期サイト（ｉｎｉｔｉａｌ ｓｉｔｅ）は、ＰＴＯ及びターゲット核酸配列間の二本鎖の開始点（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）またはその開始点から１〜３ヌクレオチドほど離隔した位置である。

このような観点で、本明細書で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断と関連して使われる用語“ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片”は、（ｉ）５’−タギング部位、（ｉｉ）５’−タギング部位、及び３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部、及び（ｉｉｉ）５’−タギング部位の一部を含む意味として使われる。また、本明細書で、“ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片”は、“断片”または“ＰＴＯ断片”と表現される。

一具現例によれば、前記ＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する１つのブロッカーを含むブロッカー部位を有し、前記ブロッカー部位は、初期切断サイト及び／または連続した切断の調節に利用される。一具現例によれば、前記ＰＴＯは、ブロッカーとして５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むブロッカー部位を有する。例えば、前記ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’−ターゲッティング部位）及び非ハイブリダイゼーション部位（５’−タギング部位）間のジャンクション位置で切断を誘導するために、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ブロッカーでブロッキングされうる。前記ブロッカー部位に含まれるブロッカーの個数は、制限されず、１〜１０、２〜１０、３〜８、または３〜６ブロッカーを含む。ＰＴＯに存在するブロッカーは、連続または不連続方式で存在し、望ましくは、連続した方式である。ブロッカーとして５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、当業者に知られた如何なるものも含む。例えば、前記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート結合、ホスホネート結合、ホスホロアミダート結合、及び２’−カーボーハイドレート変形を含む。一具現例によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合、アリールホスホロアミダート結合、ホスホロセレネート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリル変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマーオリゴデオキシヌクレオチド、及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形を含む。

一具現例によれば、ブロッカーとしてヌクレオチドは、ロック核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ；ＬＮＡ）を含む。

ＰＴＯの５’−タギング部位の一部、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部、及びＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のように、ＰＴＯまたはＣＴＯと関連して使われる用語“一部（ｐａｒｔ）”は、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５ヌクレオチド、望ましくは、１、２、３、または４ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味する。

一具現例によれば、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼであり、望ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼである。

本発明で、５’ヌクレアーゼ活性を有する適したＤＮＡ重合酵素は、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。特定の具現例で、熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。

択一的に、本発明は、減少した重合酵素活性を有するように変形された、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素を使うことができる。

一具現例によれば、使われるＦＥＮ（ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ−特異的ヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。

本発明で適したＦＥＮヌクレアーゼは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｂｒｉｅｒｌｙｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｇｎｅｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む、多様なバクテリア種から得たＦＥＮヌクレアーゼを含む。

前記段階（ａ）でアップストリームプライマーを用いる場合、ＰＴＯの切断のための条件は、アップストリームプライマーの延長反応を含みうる。

一具現例によれば、前記段階（ａ）でアップストリームプライマーが使われ、前記アップストリームプライマーの延長のために、鋳型−依存的重合酵素が使われ、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と同一である。

選択的に、前記段階（ａ）でアップストリームプライマーが使われ、前記アップストリームプライマーの延長のために、鋳型−依存的重合酵素が使われ、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と異なる。

段階（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーション
前記ＰＴＯから放出された断片は、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）とハイブリダイズされる。

前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。

前記ＣＴＯは、ＰＴＯから放出された断片の延長のためのテンプレートとして役割を果たす。プライマーとして作用する前記断片は、前記ＣＴＯにハイブリダイズされ、延長されて延長二量体を形成する。

前記テンプレーティング部位は、ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的な限り、如何なる配列も含みうる。また、テンプレーティング部位は、ＰＴＯから放出された断片の延長のためのテンプレートとしての役割ができる限り、如何なる配列も含みうる。

前述したように、ＰＴＯの５’−タギング部位を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされうる。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされうる。ＰＴＯの５’−タギング部位の一部を有する断片が放出される場合、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされうる。

さらに、ＰＴＯの切断サイトを予想することによって、ＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位が５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインする場合、５’−タギング部位の一部を有する断片、または５’−タギング部位を有する断片は、キャプチャリング部位とハイブリダイズされて延長されうる。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む断片が放出される場合、前記断片は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、前記断片の３’末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在するにも拘らず、成功的に延長されうる。これは、プライマーの３’末端が一部のミスマッチヌクレオチド（例えば、１〜３ミスマッチヌクレオチド）を含むにも拘らず、プライマーが反応条件によって延長されるためである。

５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部（参照：図１）は、前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を有するようにデザインされ、ミスマッチヌクレオチドと関連した問題を解決することができる（参照：図１）。

一具現例で、前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のヌクレオチド配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位上の予想される切断サイトによって選択されうる。前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のヌクレオチド配列は、１〜１０ヌクレオチド、１〜５ヌクレオチド、または１〜３ヌクレオチドの長さを有しうる。

前記ＣＴＯの３’末端は、前記断片とのハイブリダイゼーションに関与しない追加的なヌクレオチドを含みうる。また、前記断片と安定してハイブリダイズされる限り、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、前記断片の一部（例えば、断片の３’末端部位を含む断片の一部）にのみ相補的なヌクレオチド配列を含みうる。

本明細書で使われる用語“５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位”は、前述したように、ＣＴＯのキャプチャリング部位の多様なデザイン及び組成を含むものと本願に記載される。

前記ＣＴＯは、ヘアピン構造を有するようにデザインされうる。

前記ＣＴＯの長さは、多様であり得る。例えば、前記ＣＴＯは、６〜１０００ヌクレオチド、６〜５００ヌクレオチド、６〜３００ヌクレオチド、６〜１００ヌクレオチド、６〜８０ヌクレオチド、６〜６０ヌクレオチド、６〜４０ヌクレオチド、１５〜１０００ヌクレオチド、１５〜５００ヌクレオチド、１５〜３００ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、２０〜１０００ヌクレオチド、２０〜５００ヌクレオチド、２０〜３００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、３０〜１０００ヌクレオチド、３０〜５００ヌクレオチド、３０〜３００ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、または３０〜４０ヌクレオチドの長さである。前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５〜１００ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、または１５〜２０ヌクレオチドの長さである。前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＰＴＯから放出された断片の延長でテンプレートとしての役割ができる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、１〜９００ヌクレオチド、１〜４００ヌクレオチド、１〜３００ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜８０ヌクレオチド、１〜６０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、２〜９００ヌクレオチド、２〜４００ヌクレオチド、２〜３００ヌクレオチド、２〜１００ヌクレオチド、２〜８０ヌクレオチド、２〜６０ヌクレオチド、２〜４０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、５〜９００ヌクレオチド、５〜４００ヌクレオチド、５〜３００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜８０ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、１０〜９００ヌクレオチド、１０〜４００ヌクレオチド、１０〜３００ヌクレオチド、１５〜９００ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、または１５〜２０ヌクレオチドの長さである。

前記ＣＴＯの３’末端は、３’−ＯＨターミナルを有しうる。具体的に、ＣＴＯの３’末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。ＣＴＯの非延長ブロッキングは、従来の方法によって達成されうる。例えば、ブロッキングは、ＣＴＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基に、ビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、またはアルカンジオールのような化学的モイエティを追加して実施することができる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを用いて実施することができる。

前記ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯとハイブリダイズされて、断片の延長に適した形態を提供する。また、非切断ＰＴＯが、その５’−タギング部位を通じてＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされるとしても、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、ＣＴＯとハイブリダイズされず、延長二量体の形成が防止される。

前記段階（ｃ）でのハイブリダイゼーションは、前記段階（ａ）での説明を参照して詳細に説明される。

段階（ｄ）：延長二量体を形成するための前記断片の延長
前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する。前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を形成し、これにより、延長二量体を形成する。一方、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた非切断されたＰＴＯは、延長されず、延長二量体も形成されない。

前記延長鎖は、検出可能なシグナルを提供する標識を含む。

本明細書で使われる用語“延長二量体（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）”は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた断片が鋳型−依存的核酸重合酵素とＣＴＯのテンプレーティング部位をテンプレートとして用いて延長される延長反応によって形成された二量体を意味する。

本明細書で断片と共に使われる用語“延長鎖（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ）”は、断片及び断片の延長配列で構成された配列を意味する。本明細書で断片と共に使われる用語“延長配列（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”は、延長鎖で断片を除いた新たに合成された配列を意味する。

前記段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素は、如何なる核酸重合酵素、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉの“クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）”断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素及びバクテリオファージＴ７ＤＮＡ重合酵素を含みうる。具体的に、前記重合酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む、多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡ重合酵素である。より具体的には、前記鋳型−依存的核酸重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。

一具現例によれば、前記段階（ｂ）で使われる５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、段階（ｄ）で使われる鋳型−依存的核酸重合酵素と同一である。具体的には、前記段階（ｂ）で使われる５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、アップストリームプライマーの延長のために使われる鋳型−依存的核酸重合酵素、及び段階（ｄ）で使われる鋳型−依存的核酸重合酵素は、互いに同一である。

前記段階（ｄ）は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片が延長されて、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体が形成される条件下で実施される。ターゲット核酸配列が存在しない場合、ＰＴＯは、切断されず、結局、延長二量体は形成されない。

前記延長鎖は、検出可能なシグナルを提供する標識を含む。

本発明に利用される標識は、当業者に公知の多様な標識を含む。

一具現例によれば、前記延長鎖に含まれた標識は、（ｉ）ＰＴＯから放出された断片に結合された単一標識、（ｉｉ）前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される標識、または（ｉｉｉ）前記断片に結合された単一標識及び前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される標識いずれもから由来の標識である。

本発明で使われた標識システムは、標識の種類及び標識されたオリゴヌクレオチドによって次のように分類されうる：

（ｉ）ＰＴＯ断片に結合された単一標識
本発明は、単一標識を用いることによって、ターゲット核酸配列の存在を示す延長鎖の存在に対するシグナルを提供することができる（参照：図２及び図３）。単一標識で標識されたＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされ、ＣＴＯ上で延長されて延長鎖を生成し、前記単一標識は、延長鎖に含まれる。引き続き、前記延長鎖が固相基質に固定されたＩＯにハイブリダイズされて、固相基質上に検出可能なシグナルを提供した後、延長鎖の存在を示すシグナルが検出される。

前記単一標識は、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学標識、及び金属標識を含む。

一具現例によれば、前記単一標識は、蛍光標識を含む。前記蛍光単一標識の種類は、下記に敍述した相互作用的二重標識についての説明を参照して説明することができる。

前記標識は、従来の方法によってＰＴＯ（例えば、ＰＴＯの５’−タギング部位）に結合されうる。例えば、前記標識は、少なくとも３つの炭素原子を含むスぺーサ（例えば、３−カーボンスぺーサ、６−カーボンスぺーサ、または１２−カーボンスぺーサ）を通じてＰＴＯに結合されうる。一具現例によれば、ＰＴＯから放出されたＰＴＯ断片が単一標識を含ませる限り、前記ＰＴＯ上の単一標識は、如何なるサイトにも位置しうる。一具現例によれば、前記ＰＴＯ上の単一標識は、５’−タギング部位の如何なるサイトにも位置し、例えば、５’−タギング部位の５’末端に位置しうる。

（ｉｉ）延長反応の間に延長鎖に挿入される標識
一具現例によれば、本発明で使われる標識は、延長鎖に挿入される標識であり、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、第１非天然塩基を含むヌクレオチドを含み、前記段階（ｄ）の延長反応は、標識及び前記第１非天然塩基に対して特異的結合親和性を有する第２非天然塩基を含むヌクレオチドの存在下で実施され、これにより、前記延長鎖に標識が挿入される。

本明細書で使われる用語“非天然塩基（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ）”は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）のような天然塩基の誘導体を意味し、これらは、水素−結合塩基対を形成しうる。本明細書で使われる用語“非天然塩基”は、母化合物（ｍｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として天然塩基と異なる塩基対パターン（例えば、水素結合パターン）を有する塩基を含み、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号、及び第６，０３７，１２０号に記載されている。非天然塩基間の塩基対は、天然塩基と類似に２または３つの水素結合を含む。また、非天然塩基間の塩基対は、特定の方式でも形成される。

非天然塩基の特定の例は、塩基対の組合せで次のような塩基を含む：ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ、及びＭ／Ｎ（参照：米国特許第７，４２２，８５０号）。

前記延長鎖に挿入される標識は、望ましくは、ヌクレオチド、より望ましくは、ヌクレオチドトリホスフェートに結合される。前記標識は、望ましくは、塩基に結合される。

例示された具現例を図３を参照して説明する。ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯから放出された断片は、ｉｓｏ−ｄＣを含むＣＴＯとハイブリダイズされ、蛍光標識で標識されたｉｓｏ−ｄＧが延長反応の間にｉｓｏ−ｄＣの反対側に挿入されて延長鎖に蛍光標識が導入される。引き続き、前記延長鎖が固相基質上に固定されたＩＯにハイブリダイズされて、固相基質上に検出可能なシグナルを提供し、延長鎖の存在を示すシグナルが検出される。

一具現例によれば、本発明で使われる標識は、延長鎖に挿入される標識であり、前記段階（ｄ）の延長反応は、単一標識を含むヌクレオチドの存在下で実施され、これにより、前記延長鎖に標識が挿入される。このような場合、単一標識を含むヌクレオチドの塩基の種類及びＣＴＯのテンプレーティング部位の配列に依存的な方式で複数個の同じ単一標識が延長鎖に挿入される。

（ｉｉｉ）ＰＴＯ断片の単一標識及び延長鎖に挿入される標識の組合せ
一具現例によれば、本発明で使われる標識は、断片に結合された単一標識及び延長反応の間に延長鎖に挿入される標識の組合せであり、前記単一標識及び前記挿入された標識は、受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）及び供与体（ｄｏｎｏｒ）の対を含む相互作用的二重標識である。

例えば、蛍光単一標識（供与体）で標識された５’−タギング部位を含むＰＴＯは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた後に切断される。蛍光単一標識（供与体）を含むＰＴＯ断片は、ｉｓｏ−ｄＣを含むＣＴＯにハイブリダイズされ、受容体で標識されたｉｓｏ−ｄＧが延長反応の間にｉｓｏ−ｄＣの反対側に挿入されて延長鎖に受容体が導入され、これにより、延長鎖上に相互作用的二重標識が形成される。引き続き、前記延長鎖は、固相基質上に固定されたＩＯにハイブリダイズされ、供与体に対する励起光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｌｉｇｈｔ）を用いて照射させて、供与体から受容体へのエネルギー転移を誘発し、これにより、受容体からのシグナル変化を誘導して、固相基質上に検出可能なシグナルを提供する。

一具現例によれば、前記受容体及び供与体の対は、延長鎖がＩＯにハイブリダイズされる場合に、クエンチング（または、エネルギー転移）の誘導に適したサイトに位置する。

当業者に公知されている受容体及び供与体分子が、本発明で有用である。

適した蛍光分子及び受容体−供与体の対（例えば、レポーター−クエンチャー対）は、次のように多様な文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｒ ＡＮＤ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６）；米国特許第３，９９６，３４５号、及び第４，３５１，７６０号。

本発明で有用な供与体または受容体分子として蛍光標識は、当業者に知られた如何なる分子も含みうる。その例は、次の通りである：Ｃｙ２^ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯ^ＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ^ＴＭ（５１９）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３^ＴＭ（５７０）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ^ＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５^ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ^ＴＭ（６１５）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯ^ＴＭ−３（６３１）、Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５^ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０（５４４）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０（５５９）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０（５９１）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（６１０）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ ６７０（７０５）、及びＱｕａｓａｒ ７０５（６１０）。カッコの数字は、ｎｍ単位で表示した最大発光波長である。

（ｉｖ）インターカレーティング染料
一具現例によれば、前記段階（ｅ）のハイブリダイゼーションは、インターカレーティング染料の存在下で実施し、延長鎖に含まれた標識は、前記インターカレーティング染料からのシグナルを受ける受容体であり、前記延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドに挿入されたインターカレーティング染料からのシグナルは、前記受容体に転移され、前記受容体は、検出可能なシグナルを提供する。

本発明で有用なインターカレーティング染料の例は、ＳＹＢＲ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１、ＢＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１、ＳＹＴＯ^ＴＭ４３、ＳＹＴＯ^ＴＭ４４、ＳＹＴＯ^ＴＭ４５、ＳＹＴＯＸ^ＴＭＢｌｕｅ、ＰＯＰＯ^ＴＭ−１、ＰＯＰＯ^ＴＭ−３、ＢＯＢＯ^ＴＭ−１、ＢＯＢＯ^ＴＭ−３、ＬＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１、ＪＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ１、ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ１、ＳＹＴＯ^ＴＭ１１、ＳＹＴＯ^ＴＭ１３、ＳＹＴＯ^ＴＭ１５、ＳＹＴＯ^ＴＭ１６、ＳＹＴＯ^ＴＭ２０、ＳＹＴＯ^ＴＭ２３、ＴＯＴＯ^ＴＭ−３、ＹＯＹＯ^ＴＭ３、ＧｅｌＳｔａｒ^ＴＭ、及びチアゾールオレンジ（ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ）を含む。前記インターカレーティング染料は、二本鎖核酸分子内に特異的に挿入されてシグナルを発生させる。

例えば、蛍光標識（受容体）で標識された５’−タギング部位を含むＰＴＯが、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた後に切断される。蛍光標識（受容体）を含むＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされ、延長されて延長鎖を形成する。引き続き、前記延長鎖は、供与体としてのインターカレーティング染料の存在下で固相基質上に固定されたＩＯにハイブリダイズされて、前記ハイブリッド内にインターカレーティング染料が挿入される。供与体に対する励起光を用いて照射した後、供与体から受容体へのエネルギー転移が誘発され、これにより、受容体からのシグナル変化を誘導して、固体基質上に検出可能なシグナルを提供する。

択一的に、延長鎖に含まれる標識の使用なしに、段階（ｅ）のハイブリダイゼーションは、インターカレーティング染料の存在下で実施され、延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドに挿入されたインターカレーティング染料からのシグナルを検出して、ターゲット核酸配列の存在を分析する。

段階（ｅ）：延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーション
前記段階（ｄ）の延長鎖は、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）にハイブリダイズされ、これにより、ターゲット配列の存在を示すシグナルが固相基質上に提供される。

前記ＩＯは、固相基質上に固定され、延長鎖に相補的な配列を含む。

一具現例によれば、前記ＩＯは、（ｉ）延長配列の全部または一部、及び（ｉｉ）延長鎖内の断片の一部に相補的な配列を含む。

一具現例によれば、前記ＩＯが延長鎖内の断片とハイブリダイズ可能な配列を含む場合、前記段階（ｅ）は、前記ＩＯのハイブリダイズ可能な配列及び前記延長鎖内の断片間のハイブリダイゼーションのみでは安定したハイブリッドを形成しない条件下で実施される。前記条件を使うことは、標識を含む非切断されたＰＴＯ及びＩＯ間のハイブリダイゼーションの抑制に寄与し、これにより、非ターゲットシグナル（偽シグナル）の発生を抑制する。前記条件は、反応温度、反応混合物の塩濃度、及びバッファのｐＨを含む。

特定の具現例で、前記ＩＯの配列は、非切断されたＰＴＯとハイブリッドを形成しないように選択される。例えば、前記ＩＯ及び非切断されたＰＴＯの５’−タギング部位間の相補性は、９０％未満、７０％未満、５０％未満、３０％未満、または２０％未満であり、これは、延長鎖／ＩＯハイブリッドの形成のためのハイブリダイゼーション条件によって変わりうる。

一具現例によれば、前記ＩＯは、延長配列にのみ相補的な配列を含みうる。

前記ＩＯは、標識を含まない。

前記ＩＯの長さは、多様であり得る。例えば、前記ＩＯは、５〜１００ヌクレオチド、５〜８０ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、５〜１０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、または２０〜３０ヌクレオチドの長さを有しうる。

本発明の一具現例で、前記ＩＯは、その延長が防止されるように、その３’末端がブロッキングされる。

前記ＩＯは、その５’末端または３’末端を通じて固相基質上に直接的または間接的に固定される。本発明の一具現例で、前記ＩＯは、その５’末端または３’末端を通じて固相基質上に固定される。具体的に、前記ＩＯは、その５’末端を通じて固相基質上に固定される。

前記ＩＯは、共有または非共有結合方式で固相基質の表面上に固定されうる。前記固定されたＩＯが固相基質表面に間接的に固定される場合、適したリンカーを用いる。本発明で有用なリンカーは、固相基質表面上のプローブ固定化に利用される如何なるリンカーも含みうる。例えば、アミン官能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を有するアルキルまたはアリール化合物、またはチオール官能性を有するアルキルまたはアリール化合物が、ＩＯ固定化のためのリンカーとして利用されうる。また、ｐｏｌｙ（Ｔ）末端またはｐｏｌｙ（Ａ）末端がリンカーとして使われる。リンカーとして使われるポリ（Ｔ）末端またはポリ（Ａ）末端は、ＩＯの配列と見なされない。

一具現例によれば、本発明で利用される固相基質は、マイクロアレイである。本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業者に公知の如何なるものも含みうる。本発明のあらゆる過程、すなわち、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション、切断、延長、メルティング及び蛍光検出は、マイクロアレイ上で実施される。マイクロアレイ上に固定されたＩＯは、ハイブリダイゼーション可能アレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として役割を果たす。マイクロアレイを製作するための固相基質は、金属（例えば、金、金と銅との合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ_２ウェーハ、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース、及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。前記固相基質は、ディップスティック、プレート、粒子（例えば、ビーズ）、親和性カラム、及び膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）の形態であり得る。本発明の多数の固定されたＩＯは、固相基質上の１つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）領域または２つ以上のアドレサブル領域上に固定され、固相基質は、２〜１，０００，０００個のアドレサブル領域を含みうる。フォトリソグラフィー、インクジェッティング、機械的マイクロスポッティング、及びその類似方法のような従来の製作技術によって、アレイまたは特定応用のためのアレイを生産するために、固定されたＩＯが製作することができる。

固定されたＩＯにハイブリダイズされた延長鎖上の標識が物理的に分離されているために、固相で実施する本発明は、一種の標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。したがって、固相で、本発明によって検出されるターゲット核酸配列の数は制限されるものではない。

前記ＣＴＯ及び前記ＩＯは、前記延長鎖とのハイブリダイゼーションで競争的なので、前記ＣＴＯは、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションを抑制する可能性が高い。

例えば、延長鎖及びＣＴＯ間の延長二量体の形成は、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションを妨害しうる。

一具現例によれば、前記段階（ｅ）は、延長鎖が一本鎖状態で前記ＩＯとのハイブリダイゼーションに有利な条件下で実施され、これにより、延長鎖及びＣＴＯ間の延長二量体の形成による延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションの抑制が防止される。

一具現例によれば、前記ＣＴＯとＩＯとのハイブリダイゼーションよりも、前記延長鎖が一本鎖状態でＩＯとのハイブリダイゼーションに有利な条件は、前記段階（ｅ）で一本鎖状態の延長鎖の数を増加させる条件である。

一具現例によれば、前記段階（ｅ）で一本鎖状態の延長鎖の数を増加させる条件は、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーション前に前記延長二量体を変性させることであり得る。前記変性は、一本鎖状態の延長鎖及びＩＯ間の接触機会を増加させ、これにより、延長鎖及びＩＯ間の増加した数のハイブリッドが生成される。特定の具現例で、本発明の方法は、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーション前に延長二量体を変性させる段階をさらに含む。

一具現例によれば、前記段階（ｅ）で一本鎖状態の延長鎖の数を増加させる条件は、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーション前にＣＴＯを除去することであり得る。例えば、ビオチン化ＣＴＯ（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ＣＴＯ）は、ストレプトアビジン（ｓｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ）またはアビジン（ａｖｉｄｉｎ）に対する特異的親和性を通じて除去される。一具現例で、本発明の方法は、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーション前にＣＴＯを除去する段階をさらに含む。

特定の具現例で、前記ＣＴＯの除去は、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションのための容器とは異なる容器で実施される。

択一的に、前記段階（ｅ）で一本鎖状態の延長鎖の数を増加させる条件は、ＰＴＯのＣＴＯに対するｍｏｌ比（ｍｏｌｅ ｒａｔｉｏ）が１超（具体的に、１．２以上、１．３以上、１．５以上、１．８以上、２以上、３以上、４以上、５以上、７以上、または１０以上のｍｏｌ比）でＰＴＯ及びＣＴＯを使うことである。ｍｏｌ比を調節することによって、ＣＴＯと延長二量体を形成せず、一本鎖状態で存在する延長鎖の数が増加する。

本発明者らは、本発明の方法の検出効率を向上させるために鋭意研究し、次のような結果を得た：本発明の方法の全体反応の間にＣＴＯの量は一定に存在する一方、延長鎖は、ターゲット核酸配列の存在に依存的な方式で生成される。延長鎖の数が増加するにつれて、ＣＴＯにハイブリダイゼーションされていない一本鎖状態の延長鎖の数は増加する。したがって、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションに対するＣＴＯによる抑制が最大限排除され、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションが十分に発生して、本発明の方法の検出効率を向上させうる。ＰＴＯの切断効率、ＰＴＯ断片及びＣＴＯ間のハイブリダイゼーション効率及びＰＴＯ断片の延長効率などを考慮する時、ＰＴＯの量は、ＣＴＯよりも多く使うことが望ましい。このようなＰＴＯ対ＣＴＯの量（すなわち、ｍｏｌ比）が調節される場合、本発明の方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）〜（ｆ）の全部または一部を繰り返す段階をさらに含む。例えば、段階（ａ）〜（ｄ）の変性を含んで繰り返して実施する場合、ＣＴＯの量は変わらず延長鎖のみが繰り返して生成される。このように、延長鎖がより効率的に生成され、一本鎖状態の延長鎖がさらに優勢になり、さらに、ＣＴＯよりも延長鎖の数がさらに多くなる。一具現例で、変性を含む繰り返し段階は、少なくとも延長二量体を変性させる段階を含みうる。他の構成要素（例えば、アップストリームオリゴヌクレオチド、ダウンストリームプライマー、及び酵素）は、制限因子にならないように十分な量で使われる。

文言“反復サイクルの間に変性を含んで”または“変性を含んで繰り返す”で、用語“変性”は、二本鎖核酸分子を一本鎖核酸分子に分離することを意味する。

ＣＴＯ及びＩＯ間のハイブリダイゼーション競争と関連した問題点を克服するための他の接近法で、前記段階（ｅ）及び／または段階（ｆ）は、延長鎖とＩＯとのハイブリダイゼーション競争力をＣＴＯと延長鎖とのハイブリダイゼーション競争力よりも向上させる条件下で実施される。

前記延長鎖とＩＯとのハイブリダイゼーション競争力をＣＴＯと延長鎖とのハイブリダイゼーション競争力よりも向上させる条件は、延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドのＴｍ値及びＣＴＯ及び延長鎖間のハイブリッドのＴｍ値を調節することである。例えば、段階（ｅ）で形成された延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドのＴｍ値は、ＣＴＯ及び延長鎖間のハイブリッドのＴｍ値よりも高いように（例えば、５℃高い、１０℃高い、または２０℃高いように）調節される。段階（ｅ）で形成された延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドのＴｍ値は、ＣＴＯ及び延長鎖間のハイブリッドのＴｍ値とは最大限差が少ないＴｍ値を有するように調節される（例えば、４０℃低い、３５℃低い、３０℃低い、２５℃低い、２０℃低い、１５℃低い、１０℃低い、５℃低いＴｍ値、または同じＴｍ値）。前記Ｔｍ値の調節は、ＣＴＯまたはＩＯの配列または長さを調節するか、ヌクレオチド類似体（例えば、ＰＮＡまたはＬＮＡ）を使うことで実施される。

前記ＣＴＯ及びＩＯの配列は、ターゲット核酸配列と無関係に選択され、これらのＴｍ値は、容易に調節することができる。

本明細書で使われる用語“Ｔｍ”は、二本鎖核酸分子の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の半分が一本鎖分子に解離されるメルティング温度を意味する。Ｔｍ値は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの長さ及びＧ／Ｃ含量によって決定される。Ｔｍ値は、Ｗａｌｌａｃｅ ｒｕｌｅ（Ｒ．Ｂ．Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：３５４３−３５４７（１９７９））及びｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ方法（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ．Ｊｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：３５５５−３５６２（１９９６））；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４：４５０１−４５０５（１９９６））のような従来の方法によって計算することができる。

前記ＩＯは、延長鎖内の断片にハイブリダイズ可能な配列を含むようにデザインされ、このような場合、ＩＯ及び延長鎖間のハイブリッドがＩＯが延長配列にのみハイブリダイズ可能な配列を含むようにデザインされた場合と比較して、相対的に高いＴｍ値を有しうる。

前述した配列デザイン戦略は、延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションのために延長鎖で延長配列のみを用いる場合に比べて、相対的に短い長さのＣＴＯを利用可能にする。相対的に短い長さのＣＴＯの利用は、より効率的な方式でハイブリッドのＴｍ値を調節する接近法を適用可能にする。特に、相対的に長い長さのＣＴＯを用いる場合、ＣＴＯによって形成されたハイブリッドはさらに高いＴｍ値を有し、ＩＯは、ハイブリダイゼーション競争力のために相対的に長い長さを有するか、さらに多いヌクレオチド類似体を含ませなければならない。

前述した配列デザイン戦略は、ハイブリッドのＴｍ値を調節する接近法でより便利な方式でＴｍ値を調節可能にする。

延長鎖及びＣＴＯ間のハイブリッド形態は、固相基質上に集積されたＩＯに接近することが容易ではない。したがって、一本鎖状態の延長鎖が有利に固相基質上に集積されたＩＯと接触し、固相基質上のＩＯにハイブリダイズされる。特定の具現例で、一本鎖状態の延長鎖は、ＩＯにハイブリダイズされ、一本鎖状態で存在する。

段階（ｆ）：シグナルの検出
最終的に、生成された検出可能なシグナルが、固相基質上から検出される。前記検出可能なシグナルは、延長鎖の存在を示し、前記延長鎖の存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。

一具現例によれば、延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドを示すシグナルは、延長鎖及びＩＯがハイブリッドを形成する既定の温度で提供され、前記既定の温度から検出される。

一具現例によれば、前記シグナル検出は、反応の終了時点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）で提供されるシグナルを検出することで実施される。

一具現例によれば、前記シグナル検出は、反応の進行によるシグナルの変化をリアルタイムで検出するためにリアルタイム検出方式で実施される。

固相で共焦点検出機器を用いることによって、反応溶液に存在する標識からのシグナル影響なしに固相基質上に存在するシグナルのみが検出されうる。

一具現例によれば、本発明は、ターゲット核酸配列の定量のために使われる。

一具現例によれば、前記シグナルを検出するための段階（ｆ）は、一定温度範囲で延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドをメルティングするか、または前記ハイブリッドをメルティングし、ハイブリダイズさせる過程で固相基質上に提供されるシグナルを検出することで実施される。このようなシグナル検出は、当業者に公知のメルティング分析によって実施される。

前記メルティング分析は、当業者に公知の多様な方法によって実施することができる。本明細書で使われる用語“メルティング分析（ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）”は、狭い意味のメルティング分析とハイブリダイゼーション分析とを包括する意味として使われる。メルティング分析は、２種の異なる温度でシグナルを測定する方法、メルティング（ハイブリダイゼーション）カーブ分析、メルティング（ハイブリダイゼーション）パターン分析、及びメルティング（ハイブリダイゼーション）ピーク分析を含む。

前記メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、例えば、米国特許第６，１７４，６７０号及び第５，７８９，１６７号、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖら、Ｇｅｎｅ １８８：４５（１９９７）；Ｋｏｃｈｉｎｓｋｙ及びＭｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １９：３４３（２００２）；Ｌｉｖｅｈｉｔｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｙｎａｍ．１１：７８３（１９９４）；及びＨｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８７（１９９９）で説明するような従来の技術によって得られる。例えば、メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、ハイブリダイゼーション厳格度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のパラメータに対するアウトプットシグナル（ｏｕｔｐｕｔ ｓｉｇｎａｌ）変化のグラフィックプロット（ｇｒａｐｈｉｃ ｐｌｏｔ）またはディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）で構成することができる。アウトプットシグナルは、ハイブリダイゼーションパラメータに対して直接にプロッティングされうる。典型的に、メルティングカーブまたはハイブリダイゼーションカーブは、Ｙ軸には、二量体構造の程度（すなわち、ハイブリダイゼーション程度）を示すアウトプットシグナル、例えば、蛍光がプロッティングされ、Ｘ軸には、ハイブリダイゼーションパラメータがプロッティングされる。

前記メルティング（ハイブリダイゼーション）カーブ分析及びメルティング（ハイブリダイゼーション）ピーク分析は、米国特許第８，０３９，２１号の説明を参照してさらに詳しく説明される。

特定の具現例で、メルティング分析は、ターゲット核酸配列の定量分析のために少なくとも２回以上実施される。前記メルティング分析から得られたメルティングピークの面積及び高さは、延長鎖の量に影響を受け、これは、ターゲット核酸配列の初期量についての情報を提供する。

特定の具現例で、本発明は、（ｉ）反復サイクルの間に変性を含み、（ａ）〜（ｄ）段階を繰り返して延長鎖の数を増加させる段階；（ｉｉ）ＩＯ及び延長鎖間のハイブリッドに対してメルティング分析を実施する段階；及び（ｉｉｉ）前記段階（ｉ）と（ｉｉ）とを少なくとも２回以上繰り返す段階を含む。データは、少なくとも２つの点を有する既定の繰り返し間隔（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ）で得られ得る。引き続き、メルティングピーク面積または高さが、閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と交差するメルティング分析のサイクル数を測定して、ターゲット核酸配列の量を定量化する。択一的に、メルティング分析の結果（例えば、メルティング分析面積または高さ）をメルティング分析の各サイクル数（または、累積サイクル数）に対してプロッティングし、比較してターゲット核酸配列の量を定量化する。

特定の具現例で、本発明の方法は、シグナルの検出前に固相基質を洗浄する段階をさらに含む。

プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＩＯは、天然ｄＮＭＰｓ及び／またはＮＭＰｓで構成することができる。択一的に、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＩＯは、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／２０７０２号参照）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／２２４８９号、第ＷＯ ９８／３９３５２号、及び第ＷＯ ９９／１４２２６号参照）を含みうる。ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＩＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含みうる。用語“ユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）”は、それぞれの天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基とほぼ区別なしに塩基対を形成できることを意味する。

前述したように、ＰＴＯは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’末端から３’−方向に離隔して位置するサイトで切断されうる。前記切断サイトは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置しうる。ＰＴＯ断片が、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む場合、前記３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部にハイブリダイズされるＣＴＯのサイトは、ユニバーサル塩基、縮退性配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはそれらの組合せを含みうる。例えば、ＰＴＯが、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’末端から３’−方向に１つのヌクレオチドほど離隔して位置するサイトで切断される場合、前記ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部は、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。もし、ＰＴＯが、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’末端から３’−方向に２つのヌクレオチドほど離隔して位置するサイトで切断される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端は、縮退性配列を含み、その３’−方向に隣接したヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。このように、３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部の多様なサイトでＰＴＯの切断が起こる場合、ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮退性配列を用いることが有用である。また、アップストリームプライマー延長−依存的切断誘導下で、同一な５’−タギング部位を有するＰＴＯを複数のターゲット核酸配列スクリーニングに用いる場合、３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部が、異なるＰＴＯ断片が生成されうる。このような場合、ユニバーサル塩基及び縮退性配列は、ＣＴＯに有用に使われる。ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮退性配列を用いる戦略は、複数のターゲット核酸配列のスクリーニングのために、一タイプのＣＴＯまたは最小限のタイプのＣＴＯを使う。

一具現例によれば、本発明の方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）〜（ｆ）の全部または一部を繰り返す段階をさらに含む。このような繰り返しは、ターゲット核酸配列及び／またはターゲットシグナルを増幅可能にする。

特定の具現例で、過量のＰＴＯを使い、繰り返しサイクル数を調節して、過量の延長鎖を生成する。

一具現例によれば、段階（ａ）〜（ｆ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施される。例えば、段階（ａ）〜（ｂ）、（ｃ）〜（ｄ）及び（ｅ）〜（ｆ）は、互いに異なる反応容器で実施される。

特定の具現例で、段階（ａ）〜（ｂ）及び（ｃ）〜（ｆ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施される。前記段階（ａ）〜（ｂ）及び（ｃ）〜（ｆ）は、１つの反応容器でも互いに異なる方式で実施される。例えば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位及びターゲット核酸配列間のハイブリダイゼーションが断片及びＣＴＯ間のハイブリダイゼーションまたは延長鎖及びＩＯ間のハイブリダイゼーションよりもさらに厳格な条件下で起こりうる場合、段階（ａ）〜（ｂ）の繰り返しは、段階（ｃ）〜（ｆ）過程の隋伴なしに進行し、段階（ａ）〜（ｂ）の完了後に段階（ｃ）〜（ｆ）を進行できる。

特定の具現例で、段階（ａ）〜（ｄ）及び（ｅ）〜（ｆ）は、互いに異なる２つの反応容器で実施される。

特定の具現例で、段階（ａ）〜（ｂ）は、反復サイクルの間に変性を含んで繰り返して実施される。

一部段階の繰り返し、繰り返し内に変性の介入、一部段階の分離及び検出時点は、本発明の原理によって多様に変更されうるということは、当業者には明白である。

特定の具現例で、反復サイクルの間に変性を含む繰り返しが、アップストリームプライマーを含む段階（ａ）の反応混合物を用いて実施される場合、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で、例えば、ＰＣＲ方法によって実施される。

特定の具現例で、反復サイクルの間に変性を含む繰り返しが、アップストリームプローブを含む段階（ａ）の反応混合物を用いて実施される場合、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施される。

本明細書で使われる用語“核酸試料（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓａｍｐｌｅ）”は、核酸分子を含む非生物学的試料（例えば、食品、水、空気、土壌、及び廃水）または生物学的試料を意味する。生物学的試料は、動物、植物、ヒト、菌類、バクテリア及びウイルスから由来されうる。生物学的試料は、細胞、組織または生物学的源泉からの流体、血液、血しょう、血清、リンパ、牛乳、小便、糞便、眼球液、唾液、精液、脳抽出物、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃組織抽出物であり得る。

本発明は、検出及び／または増幅しようとするターゲット核酸配列が如何なる特定配列または長さを有することを要求せず、前記ターゲット核酸配列は、あらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を含む。ターゲット核酸配列は、一本鎖または二本鎖であり得る。

ｍＲＮＡを出発物質として用いる場合、アニーリング段階の実施以前に逆転写段階が必須的であり、その詳細な内容は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８）］に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマーまたはｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用される。

ターゲット核酸配列は、あらゆる天然原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物とヒトとを含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウィロイド核酸を含む。また、前記核酸分子は、組替えによって生産または生産される如何なる核酸分子、または化学的に合成または合成される如何なる核酸分子であり得る。したがって、前記核酸配列は、天然で発見されるか、または発見されないこともある。前記ターゲット核酸配列は、知られたまたは知られていない配列を含みうる。

本発明は、またヌクレオチド変異の検出に有用である。特定の具現例で、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。本明細書で使われた用語“ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）”は、連続的ＤＮＡセグメントのうち、特定位置のＤＮＡ配列での或る単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入を意味する。このような連続的ＤＮＡセグメントは、１つの遺伝子または１つの染色体の或る他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）または多型対立遺伝子変異（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）であり得る。例えば、本発明から検出されるヌクレオチド変異は、単一ヌクレオチド多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）、欠失、挿入、置換、及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノム内の多様な変異（例えば、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ＭＴＨＦＲ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性と関連した変異及び腫瘍形成−誘発変異を含む。本明細書で使われる用語“ヌクレオチド変異”は、核酸配列の特定位置でのあらゆる変異を含む。すなわち、用語“ヌクレオチド変異”は、核酸配列の特定位置での野生型及びそのあらゆる突然変異型を含む。

ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異の検出のための本発明において、利用されるプライマーまたはプローブが、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でマッチングテンプレート（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と表現される。利用されるプライマーまたはプローブが、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に非相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でミスマッチングテンプレート（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と表現される。

ヌクレオチド変異の検出のために、アップストリームプライマーの３’末端は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異サイトの対向側にあるようにデザインされうる。一具現例によれば、アップストリームプライマーの３’末端は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有する。ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有するアップストリームプライマーの３’末端は、マッチングテンプレートにアニーリングされ、延長されてＰＴＯの切断を誘導する。その結果、形成されたＰＴＯ断片は、ＣＴＯとハイブリダイズされて延長され、ＩＯにハイブリダイズされてターゲットシグナルを提供する。逆に、アップストリームプライマーの３’末端が、ミスマッチングテンプレートのヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、延長のために、プライマーの３’末端のアニーリングが必須的な条件下では、アップストリームプライマーがミスマッチングテンプレートとハイブリダイズされる場合にも、アップストリームプライマーは延長されず、これにより、ターゲットシグナルの発生が起こらない。

択一的に、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有するＰＴＯのハイブリダイゼーションに依存的なＰＴＯの切断を利用できる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有するＰＴＯは、マッチングテンプレートにハイブリダイズされ、引き続き切断される。その結果、形成されたＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされて延長され、ＩＯにハイブリダイズされてターゲットシグナルを提供する。一方、調節された条件下で、前記ＰＴＯは、ヌクレオチド変異位置に非相補的な配列を有するミスマッチングテンプレートには、ハイブリダイズされず、切断されない。特に、このような場合、ＰＴＯのヌクレオチド変異に相補的な配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の中間に位置する。

一具現例によれば、人為的なミスマッチヌクレオチドの使用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別可能性を向上させる。

択一的に、本発明は、特定ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの選択性のために、３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置したヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を有するＰＴＯを使う。ヌクレオチド変異の検出のために、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に位置し、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列を有する。

ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（すなわち、マッチテンプレート）にハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部は、マッチテンプレートと二本鎖を形成するが、ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチテンプレート）にハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ミスマッチテンプレートと二本鎖を形成しない。

本明細書で、ＰＴＯを言及しながら使われる用語“ヌクレオチド変異区別サイト”は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部上に存在する、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に相補的な配列である。

一具現例によれば、前記ヌクレオチド変異区別サイトは、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド、より望ましくは、８ヌクレオチド、さらに望ましくは、６ヌクレオチド、さらに望ましくは、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または１ヌクレオチド以内に離隔して位置する。望ましくは、前記ヌクレオチド変異区別サイトは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端に位置する。

プローブのヌクレオチド変異区別サイトまたはターゲット配列上のヌクレオチド変異サイトで言及される用語“サイト”は、本明細書で単一ヌクレオチドだけではなく、多数のヌクレオチドも含む意味として使われる。

関心のあるヌクレオチド変異でのこのような区別されるハイブリダイゼーションパターンは、ＰＴＯの初期切断サイトで差を提供し、これにより、２種のＰＴＯ断片が生成されて関心のあるヌクレオチド変異の存否によってシグナル差が発生するということは、注目すべきことである。

前記関心のあるヌクレオチド変異の存在下で、第１断片は、ＰＴＯ及びマッチングテンプレート間のハイブリッドの切断によって生成され、関心のあるヌクレオチド変異の非存在下で、第２断片は、ＰＴＯ及びミスマッチングテンプレート間のハイブリッドの切断によって生成される。前記第２断片は、前記第２断片を前記第１断片と異ならせる追加的な３’末端部位を含む。

単一ヌクレオチド変異の検出のための一具現例で、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端は、前記ターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異に相補的な配列を有する。前述したように、マッチングテンプレートとハイブリダイズされたＰＴＯの切断は、例えば、アップストリームプライマー延長−依存的切断誘導下で、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端に３’−方向に直ちに近接したサイトで誘導されうる。ＰＴＯ断片の３’末端は、単一ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチドを有する。ＰＴＯ断片は、ヌクレオチド変異に該当する配列を含むキャプチャリング部位を有するＣＴＯとハイブリダイズされた後、延長されて延長二量体を形成する。前記延長二量体は、ＩＯにハイブリダイズされてターゲットシグナルを提供する。もし、同一なＰＴＯが、単一ヌクレオチド変異を除いては、マッチングテンプレートと同一な配列を有するミスマッチングテンプレートにハイブリダイズされる場合、ＰＴＯの切断は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端から３’−方向に２つのヌクレオチドほど離隔したサイトで発生することがある。ＰＴＯ断片の３’末端は、単一ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド以外に追加的に切断されたヌクレオチドを有する。追加的に切断されたヌクレオチドにハイブリダイズされるＣＴＯのサイトが、前記追加的に切断されたヌクレオチドに非相補的な配列を有するようにデザインされた場合、ＰＴＯ断片の３’末端は、ＣＴＯにハイブリダイズされず、調節された条件下で、ＰＴＯ断片は延長されない。

一具現例によれば、前記３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部に存在する、ヌクレオチド変異に相補的な配列を有するＰＴＯの切断サイトは、マッチングテンプレートまたはミスマッチングテンプレートとのハイブリダイゼーションによって異なり、これにより、前記何れか１つのハイブリダイゼーション反応から放出されるそれぞれのＰＴＯ断片は、望ましくは、その３’末端の一部、より望ましくは、その３’末端で異なる配列を有する。

一具現例によれば、ＰＴＯ断片の３’末端の一部での差を考慮したＣＴＯのヌクレオチド配列の選択は、マッチングテンプレートをミスマッチングテンプレートと区別可能にする。

一具現例によれば、それぞれのＰＴＯ断片の生成は、ＣＴＯの延長反応によって区別して検出されうる。

一具現例によれば、前記第２断片が、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる時、前記第２断片が延長されることを防止するために、前記ＣＴＯが、前記第２断片の追加的な３’末端部位とハイブリダイズされないように選択された配列を前記ＣＴＯが有する。

前述したように、前記第１断片の延長は、ＩＯとのハイブリダイゼーションによって検出される。

一具現例によれば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部は、前記ヌクレオチド変異区別サイトから１〜１０ヌクレオチド（より望ましくは、１〜５ヌクレオチド）以内に離隔して位置する非塩基対モイエティを含む。

ＰＴＯが変異区別サイトに非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にハイブリダイズされる時、前記非塩基対モイエティは、３’−ターゲッティング部位の５’末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを防止する。非塩基対モイエティ（例えば、人為的ミスマッチヌクレオチド）の使用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別可能性を向上させる。

一具現例によれば、ＰＴＯがヌクレオチド変異区別サイトに相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列とハイブリダイズされる時、前記非塩基対モイエティは、５’末端の一部及びターゲット核酸配列間の二本鎖の形成を抑制しない。

一具現例によれば、非塩基対モイエティは、ＰＴＯ及びマッチングテンプレートのハイブリッド上の初期切断サイトとＰＴＯ及びミスマッチングテンプレートのハイブリッド上の初期切断サイトとの距離を拡大させる。

一具現例によれば、非塩基対モイエティ配列の導入は、初期切断サイト、特に、ＰＴＯ及びミスマッチングテンプレート間のハイブリッド上の初期切断サイトを調節することができさせる。

一具現例によれば、非塩基対モイエティは、ヌクレオチド変異区別サイトのダウンストリームに位置する。

非塩基対モイエティは、ターゲット核酸配列間に塩基対を形成しない如何なるモイエティも含む。望ましくは、非塩基対モイエティは、（ｉ）人為的なミスマッチ塩基、塩基対を形成することができない天然／非天然塩基、塩基対を形成することができないように変形された塩基、またはユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、（ｉｉ）塩基対を形成することができないように変形された非塩基対ヌクレオチド、または（ｉｉｉ）非塩基対形成化合物（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）である。

例えば、非塩基対モイエティは、アルキレン基、リボフラノシルナフタレン、デオキシリボフラノシルナフタレン、メタリン酸塩、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合、及びアリールホスホロアミダート結合を含む。従来のカーボンスぺーサも、非塩基対モイエティとして利用される。非塩基対モイエティとしてのユニバーサル塩基は、ＰＴＯの切断サイトの調節に有用である。

デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５’−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含む塩基対は、天然塩基間の結合力よりも低い結合力を有するので、ユニバーサル塩基は、特定ハイブリダイゼーション条件下で非塩基対モイエティとして利用されうる。

５’末端の一部に導入された非塩基対モイエティは、望ましくは、１〜１０、より望ましくは、１〜５、さらに望ましくは、１〜２つのモイエティを有する。５’末端の一部内の多数の非塩基対モイエティは、連続または不連続方式で存在することができる。特定の具現例で、非塩基対モイエティは、２〜５つの連続したモイエティを有する。

特定の具現例で、非塩基対モイエティは、非塩基対形成化合物である。

一具現例によれば、ＰＴＯのヌクレオチド変異区別サイト及び非塩基対モイエティは、３’−ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド（より望ましくは、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または１ヌクレオチド、さらに望ましくは、１ヌクレオチド）以内に離隔して位置する。

５’末端にターゲット核酸配列に非相補的な末端及び５’末端部位にヌクレオチド変異区別サイトをいずれも含むプローブが、ヌクレオチド変異区別サイトのヌクレオチドに対するミスマッチテンプレートにハイブリダイズされる場合、前記５’末端部位は、一本鎖を形成し、残りの部位は、ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しうる。プローブデザイン観点で、このようなプローブは、ＰＴＯと異なるが、前記プローブがミスマッチングテンプレートにハイブリダイゼーションされれば、ＰＴＯ構造を有するプローブと見なされる。したがって、ＰＴＯを用いる本発明の分析方法によってシグナルが発生しうる。前記応用は、プローブのヌクレオチド変異区別サイトに非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列の検出に有用である。

増幅ブロッカー（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｌｏｃｋｅｒ）を用いた選択的増幅（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と共にＰＣＥ−ＩＨ分析は、効率的に少量のヌクレオチド変異を検出することができる。

通常の臨床試料は、豊かな野生型対立遺伝子（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ａｌｌｅｌｅ）及び少量の突然変異対立遺伝子（ｍｕｔａｎｔ ａｌｌｅｌｅ）を含む。増幅段階で、豊かな野生型対立遺伝子の増幅は、ほとんどの増幅試薬を消耗する可能性が高く、したがって、突然変異対立遺伝子は増幅されず、シグナル発生が防止される。このような問題を克服するために、野生型対立遺伝子の増幅は防止しながら、突然変異対立遺伝子を選択的に増幅するための方法が提示された。

代表的に、増幅ブロッカーとしてＰＮＡまたはＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドを用いる方法が報告された（ＵＳ ２００４／００１４１０５，ＵＳ ７，８０３，５４３，ＵＳ ８，２０６，９２９，Ｈ．Ｏｒｕｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：５３３２−５３３６（１９９３）Ａ．Ｓｅｎｅｓｃａｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３３０４−３３０８（２００５），Ｙ．Ｎａｇａｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５：７２７６−７２８２（２００５），Ｈｅｎｒｉｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：５３３２−５３３６（１９９３）及びＬｕｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ ２ ｅ１２（２００６））。前記方法は、“クランピング方法（ｃｌａｍｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）”と呼ばれる。

一般的に、クランピングのための増幅ブロッカーは、同一条件下で、ただ増幅ブロッカーに完全に相補的な配列を有するテンプレートにのみハイブリダイズされ、さらには、単一ミスマッチを有するテンプレートにもハイブリダイズされないようにデザインされる。プライマーアニーリングまたは鎖延長（ｃｈａｉｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を抑制する増幅ブロッカーにハイブリダイズされたテンプレートは、増幅されず、増幅ブロッカーにハイブリダイズされていないテンプレートのみ増幅される。ＰＮＡ及びＬＮＡのような核酸類似体は、単一塩基差のみでも相当なＴ_ｍ差を示すという点で、増幅ブロッカーとして有用である。

使われる重合酵素がヌクレアーゼ活性を有する場合、増幅ブロッカーは、前記ヌクレアーゼ活性に対する耐性を有することが要求される。

ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異領域に互いに異なる配列を有する２つの変異体（ｖａｒｉａｎｔ）タイプが１つの試料に存在する場合、増幅ブロッカーは、関心のあるヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列は増幅させ、他のヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列は増幅させないことによって、より効率的な方式で関心のあるターゲットヌクレオチド変異を検出することができる。特に、増幅ブロッカーの使用は、豊かな野生型対立遺伝子及び少量の突然変異対立遺伝子を含む臨床試料から少量の突然変異対立遺伝子の検出に非常に有用である。

増幅ブロッカーを使うとしても、野生型対立遺伝子の増幅が完全に防止されないこともある。しかし、ヌクレオチド変異に対する優れた区別可能性を有したＰＴＯを用いるＰＣＥ−ＩＨ分析は、従来技術によってほぼ検出されない少量の突然変異対立遺伝子を検出可能にする。

特定の具現例で、プライマーのダウンストリームに位置する増幅ブロッカーは、プライマーの延長をブロッキングする。

特定の具現例で、前記増幅ブロッカーは、天然（ｎａｔｕｒａｌ）ヌクレオシド／ヌクレオチド、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体、またはこれらの組合せで作られたオリゴヌクレオチドである。

特定の具現例で、前記増幅ブロッカーは、５’ヌクレアーゼ活性に耐性があるバックボーンを有するヌクレオシド／ヌクレオチドを含む。５’ヌクレアーゼ活性に耐性があるバックボーンを有するヌクレオシド／ヌクレオチドは、当業者に知られている如何なるものも含む。例えば、前記ヌクレオシド／ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート結合、ホスホネート結合、ホスホロアミダート結合及び２’−カーボーハイドレート変形を含む。特定の具現例で、５’ヌクレアーゼに耐性があるバックボーンを有するヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合、アリールホスホロアミダート結合、ホスホロセレネート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリル変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマーオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形を含む。

一具現例によれば、前記増幅ブロッカーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ブリッジ核酸（ＢＮＡ）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホルアミダート（ＮＰ）オリゴマー、狭い溝結合物質（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）が連結されたオリゴヌクレオチド（ＭＧＢ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマー、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキルホスホネートオリゴマー、ホスホルアミダート、β−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、α−ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、またはこれらの組合せを含む。

特定の具現例で、前記増幅ブロッカーは、５’ヌクレアーゼに耐性を有し、ハイブリダイゼーションでそのＴｍ値は、１つのミスマッチによっても大きく影響を受ける。前記言及された特性を有する代表的な例は、ＰＮＡまたはＬＮＡを含む増幅ブロッカーである。

前記増幅ブロッカーは、如何なる長さも有しうる。例えば、前記増幅ブロッカーは、５〜１００ヌクレオチド、５〜８０ヌクレオチド、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、または２０〜３０ヌクレオチドの長さを有しうる。

特定の具現例で、前記増幅ブロッカーは、その延長が防止されるように、その３’末端がブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）される。

ターゲット核酸配列上のヌクレオチド変異領域の対向側に位置する増幅ブロッカーのヌクレオチド変異区別サイト（すなわち、非ターゲットヌクレオチド変異に相補的な領域）は、前記増幅ブロッカーが非ターゲットヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列の増幅を抑制するが、ターゲットヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列の増幅を抑制しない限り、増幅ブロッカーの如何なるサイトにも位置しうる。

特定の具現例で、増幅ブロッカーのヌクレオチド変異区別サイトは、その５’末端部位、中間部位、または３’末端部位に位置しうる。

前記増幅ブロッカーは、増幅ブロッカーのアップストリームに位置するプライマーから２００ヌクレオチド超過、１００ヌクレオチド超過、５０ヌクレオチド超過、３０ヌクレオチド超過、２０ヌクレオチド超過、１０ヌクレオチド超過、５ヌクレオチド超過、２ヌクレオチド超過、または１ヌクレオチド超過で離隔しうる。前記増幅ブロッカーは、前記プライマーに直ちに隣接することができる。

増幅ブロッカーと共にＰＣＥ−ＩＨ分析をヌクレオチド変異を検出するために用いる場合、ＰＴＯ及び増幅ブロッカーは、ターゲット核酸配列の二本鎖のうち、同一鎖または互いに異なる鎖に位置するようにデザインされうる。同一鎖に位置するようにデザインされる場合、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションでＰＴＯ及び増幅ブロッカーは、相互間に影響を与え、反応条件または配列の調節が要求されている。

一具現例によれば、本発明で利用されるターゲット核酸配列は、増幅プライマーによってのプレ増幅された（ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）核酸配列である。

本発明の利点は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時に（マルチプレックス）検出するという点でさらに注目されうる。

一具現例によれば、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために実施され；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含み、前記ＩＯは、少なくとも２種のＩＯを含む。

一具現例によれば、本発明は、ＰＴＯに対する少なくとも２種のダウンストリームプライマーを用いて実施される。

本発明によって検出されるターゲット核酸配列は、多様な核酸配列、例えば、ゲノム内の配列、人為的に分離されるか、断片化された配列、及び合成配列（例えば、ｃＤＮＡ配列及びバーコード配列）を含む。例えば、ターゲット核酸配列は、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）のための核酸マーカー配列を含む。ＩＰＣＲは、ＰＣＲと共に核酸マーカー配列及び抗体間のコンジュゲートを使い、これは、タンパク質を含んだ多種のターゲットの検出に幅広く適用される（Ｓａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ｐｐ：１２０−１２２（１９９２）、米国特許第５，６６５，５３９号、Ｎｉｅｍｅｙｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３ ｐｐ：２０８−２１６（２００５）、米国出願公開第２００５／０２３９１０８号及びＹｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２ ｐｐ：７９６〜８００（２０１０））。本発明のターゲット核酸分子は、ＩＰＣＲ方法で使われる核酸マーカーを含み、本発明は、ＩＰＣＲ方法で核酸マーカーの検出に適用可能である。

ターゲット核酸配列の増幅を含む一具現例
本発明は、ターゲット核酸配列を合成することができるアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーで構成されたプライマー対を用いるターゲット核酸配列の増幅と共に同時に実施される。

本発明の他の態様において、本発明は、次の段階を含むＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含むプライマー対及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；前記ＰＴＯは、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し；前記ＰＴＯは、その延長が防止されるように、その３’末端がブロッキングされており；
（ｂ）前記プライマーの延長及び前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；前記ＰＴＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされれば、前記アップストリームプライマーは延長され、前記延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって；前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し；前記延長鎖は、標識を含み、
（ｅ）前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記ＩＯは、前記延長鎖に相補的な配列を含み；前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し；及び（ｆ）前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって；前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明の具現例は、前述した本発明の方法の段階に従うため、これらの間の共通した内容は、本明細書の複雑性をもたらす過度な重複を避けるために省略する。

一具現例によれば、本発明は、反復サイクルの間に変性を含み、段階（ａ）〜（ｆ）の全部または一部（例えば、段階（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）、または（ａ）〜（ｅ））を少なくとも２回以上繰り返すことをさらに含む。前記反応の繰り返しは、少なくとも５、１０、２０、または３０回以上であり、最大７０、６０、５０、または４０回以下である。

アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性に基づいたＰＣＥ−ＩＨ分析
本発明の追加的な態様において、本発明は、次の段階を含むＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を、プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；前記ＰＴＯは、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断され、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって；前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し；前記延長鎖は、標識を含み、
（ｅ）前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；前記ＩＯは、前記延長鎖に相補的な配列を含み；前記延長鎖と前記ＩＯとの間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し；及び
（ｆ）前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって；前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。

アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を基にする本発明の方法は、アップストリームオリゴヌクレオチドを利用しないことを除いては、アップストリームオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＥ−ＩＨ分析による方法と同一なので、これらの間の共通した内容は、本明細書の複雑性をもたらす過度な重複を避けるために省略する。

面白くも、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を基にする本発明の方法は、アップストリームオリゴヌクレオチドを使わずとも、ＰＣＥ−ＩＨ分析によってターゲットシグナルを実際に提供する。

本発明の方法のために、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する従来の酵素が利用されうる。５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素のうち、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する幾つかの酵素があり、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素がある。

ターゲット核酸配列の増幅及びＰＴＯの切断効率を考慮すれば、本発明のＰＣＥ−ＩＨ分析は、望ましくは、アップストリームオリゴヌクレオチドを用いて実施される。

一具現例によれば、本発明は、反復サイクルの間に変性を含み、段階（ａ）〜（ｆ）の全部または一部（例えば、段階（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）、または（ａ）〜（ｅ））を少なくとも２回以上繰り返すことをさらに含む。前記反応の繰り返しは、少なくとも５、１０、２０、または３０回以上であり、最大７０、６０、５０、または４０回以下である。

ターゲット検出用キット
本発明のさらに他の態様において、本発明は、次を含むＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する：
（ａ）アップストリームオリゴヌクレオチド；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み；
（ｂ）プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し；前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ）キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）；前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し；前記延長鎖は、標識を含み；及び
（ｄ）固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）；前記ＩＯは、固相基質上に固定化されており；前記ＩＯは、前記延長鎖に相補的な配列を含み；前記延長鎖と前記ＩＯとの間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供する。

本発明のキットは、前述した本発明の検出方法を実施するために製作されるので、これらの間の共通した内容は、本明細書の複雑性をもたらす過度な重複を避けるために省略する。

特定の具現例で、前記キットは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む。特定の具現例で、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼである。

一具現例によれば、ＰＴＯ及びＣＴＯは、ＰＴＯのＣＴＯに対するｍｏｌ比が１超（具体的に、１．２以上、１．３以上、１．５以上、１．８以上、２以上、３以上、４以上、５以上、７以上、または１０以上のｍｏｌ比）で含まれる。

一具現例によれば、前記ＩＯは、（ｉ）延長配列の全部または一部、及び（ｉｉ）延長鎖内の断片の一部に相補的な配列を含む。

一具現例で、前記延長鎖に含まれた標識は、（ｉ）ＰＴＯから放出された前記断片に結合された単一標識、（ｉｉ）延長反応の間に延長鎖に挿入される標識、または（ｉｉｉ）前記断片に結合された単一標識及び前記延長反応の間に延長鎖に挿入される標識の組合せである。

一具現例によれば、前記キットは、延長反応の間に延長鎖に挿入される標識をさらに含む。

特定の具現例で、前記標識は、延長鎖に挿入される標識であり、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、第１非天然塩基を含むヌクレオチドを含み、前記段階（ｄ）の前記延長反応は、標識及び前記第１非天然塩基に対して特異的結合親和性を有する第２非天然塩基を含むヌクレオチドの存在下で実施され、これにより、前記延長鎖に前記標識が挿入される。

特定の具現例で、前記標識は、前記断片に結合された単一標識及び延長反応の間に延長鎖に挿入される標識の組合せであり、前記単一標識及び前記挿入された標識は、受容体及び供与体の対を含む相互作用的二重標識である。

特定の具現例で、前記キットは、インターカレーティング染料をさらに含み、前記延長鎖に含まれた標識は、前記インターカレーティング染料からのシグナルを受ける受容体である。

一具現例によれば、ＰＴＯ、ＣＴＯ及び／またはＩＯは、その延長が防止されるように、その３’末端がブロッキングされる。

特定の具現例で、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。

一具現例によれば、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、その５’末端の一部に前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。一具現例によれば、前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列は、１〜１０ヌクレオチドの長さである。

一具現例によれば、前記キットは、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために使われ；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含み、前記ＩＯは、少なくとも２種のＩＯを含む。

一具現例によれば、前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。

一具現例によれば、前記キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含む。

実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、添付の請求項に提示された本発明の範囲が、これら実施例によって制限されるものではないということは、当業者にとって明白である。

実施例１：ＰＴＯの切断及び延長依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析の評価
本発明者らは、マイクロアレイ上で単一標識されたプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）及び固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）を用いたＰＣＥ−ＩＨ分析が、ターゲット核酸配列を検出できるか否かを実験した。

アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーとの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を使った。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対するゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使った。

ＰＴＯは、その５’末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有する。ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＩＯは、それらの３’末端がカーボンスぺーサでブロッキングされている。ＩＯは、リンカーアーム（ｌｉｎｋｅｒ ａｒｍ）としてｐｏｌｙ（Ｔ）_１０を有し、これをその５’末端のアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ６）を用いてガラススライドの表面上に固定した。蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブをその３’末端のアミノ基（ＡｍｉｎｏＣ７）を用いてガラススライドの表面上に固定した。

本実施例で、もし、ＮＧが存在する場合、ＮＧに特異的にハイブリダイズされたＰＴＯは切断され、蛍光レポーターが標識されたＰＴＯ断片が生成される。前記ＰＴＯ断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にアニーリングされ、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位上で延長されて、その５’末端に蛍光レポーター分子を有する延長鎖を形成する。前記延長鎖は、ＩＯにハイブリダイズすることができる。前記ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長、ＩＯに前記延長鎖のハイブリダイゼーションをマイクロアレイ上で同時に行った。前記反応後、延長鎖−ＩＯ二量体の存在または非存在を分析した。

本実施例で使ったアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ、ＩＯ、及びマーカーの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：２）
ＰＴＯ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｓｅｒ］−３’（配列番号：３）
ＣＴＯ ５’−ＣＡＴＡＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｓｅｒ］−３’（配列番号：４）
ＩＯ ５’−［Ａｍｉｎｏ Ｃ６］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＣＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣＧＣ［Ｃ３ ｓｐａｓｅｒ］−３’（配列番号：５）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［Ａｍｉｎｏ Ｃ７］−３’（配列番号：６）
（Ｉ：デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯ−ＮＶの５’−タギング部位を示す）

ＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ，Ｋｏｒｅａ）をＩＯ及びマーカー （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：５及び６）の製作に用いた。ＮＳＢスポッティングバッファ（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に最終濃度５０μＭになるように溶解させたＩＯ及びマーカーをＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒ^ＴＭ１６ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ，Ｃｈｉｎａ）を用いてＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリンティングした。前記ＩＯ及びマーカーを３ｘ１フォーマット（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｓｐｏｔｓ）で平行にスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）し、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度で保持されるチャンバに一晩インキュべーティングした。そして、前記スライドを２ｘＳＳＰＥ（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍリン酸水素二ナトリウム及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファ溶液で３７℃で３０分間洗浄して、非特異的に結合されたＩＯ及びマーカーを除去し、蒸留水で洗浄した。次いで、スライド遠心分離機を用いて前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させ、使用前まで４℃暗室で保管した。

ＮＧ遺伝子のゲノムＤＮＡ１００ｐｇ、アップストリームプライマー（配列番号：１）１０ｐｍｏｌｅ、ダウンストリームプライマー（配列番号：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号：３）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号：４）０．５ｐｍｏｌｅ、及び２Ｘ マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、及び２．４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素）（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）１５μｌを含有した３０μｌの最終体積でＰＣＥ−ＩＨ反応を実施し、ＩＯ（配列番号：５）が交差結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。前記スライドを熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）内のインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ブロック上に位置させた。ＰＣＥ−ＩＨ反応を次のように実施した：９５℃で１５分変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の反応過程を４０サイクル繰り返し後、５５℃で３０分ハイブリダイゼーションさせた。

前記反応以後、前記スライドを１分間蒸留水で洗浄した。イメージを共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４３００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳＡ）を用いて５−μｍピクセル解像度でスキャニングして獲得した。蛍光強度を定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェアであるＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳＡ）を用いて分析した。蛍光強度を周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を試験するために、スポットを３つずつスポッティングした。蛍光強度は、３つのスポットの平均値で表わした。

図４に示されたように、蛍光強度は、ターゲットがない場合と比較して、ターゲットが存在する場合、確実に増加した。このような結果は、マイクロアレイ上で単一−標識ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＩＯを用いるＰＣＥ−ＩＨ分析が、ターゲット核酸配列を検出することができるということを示す。

実施例２：延長鎖とＩＯのハイブリダイゼーションに及ぼすＣＴＯの影響評価
延長鎖がターゲット核酸配列の存在下で生成される場合、延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドの形成は、ＣＴＯと延長鎖のハイブリダイゼーションによって抑制されうる。本発明者らは、多様な濃度のＣＴＯ及び延長鎖を模倣した合成延長鎖（Ｓｙｎ−ＥＳ）を用いて延長鎖及びＩＯ間のハイブリッドの形成に及ぼすＣＴＯの影響を調査した。Ｓｙｎ−ＥＳは、その５’末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有する。

実施例１で使われた同一なＴａｑ ＤＮＡ重合酵素、ＣＴＯ、ＩＯ及びマーカーを本実施例で使った。

本実施例で、Ｓｙｎ−ＥＳの配列は、次の通りである：
Ｓｙｎ−ＥＳ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧ−３’（配列番号：７）

スライド製作は、実施例１で使われた同一なプロトコルで行った。

ＣＴＯ（配列番号：４）２、１、０．５、または０ｐｍｏｌｅ、Ｓｙｎ−ＥＳ（配列番号：７）１ｐｍｏｌｅ、及び２Ｘ マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、及び２．４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素）（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）１５μｌを含有した３０μｌの最終体積で反応を実施し、ＩＯ（配列番号：５）が交差結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。前記スライドを熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）内のインサイチュブロック上に位置させた。ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。

前記反応以後、前記スライドを１分間蒸留水で洗浄した。イメージを共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４３００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳＡ）を用いて５−μｍピクセル解像度にスキャニングして獲得した。蛍光強度を定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェアであるＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳＡ）を用いて分析した。蛍光強度を周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を試験するために、スポットを３つずつスポッティングした。蛍光強度は、３つのスポットの平均値で表わした。

図５Ａ及び図５Ｂで示すように、ＣＴＯの濃度が増加するにつれて、蛍光強度は確実に減少した。

実施例３：多様な比率のＰＴＯ対ＣＴＯを用いたＰＣＥ−ＩＨ分析の評価
実施例２で示すように、延長鎖及びＣＴＯ間のハイブリッドの形成は、延長鎖及びＩＯのハイブリダイゼーションを抑制する。延長鎖がターゲット核酸配列の存在下で生成される場合、一本鎖状態の延長鎖の数の増加は、延長鎖及びＩＯのハイブリダイゼーションを向上させる。

一本鎖状態の延長鎖の数を調節する１つの方法は、ＰＴＯ対ＣＴＯの比率を変化させることである。ターゲットの存在下で、ＣＴＯよりもさらに高い濃度のＰＴＯを使うことは、一本鎖状態の延長鎖の生成を増加させて蛍光強度を向上させる。本発明者らは、多様な濃度のＣＴＯを用いることによって、多様なＰＴＯ対ＣＴＯの比率が蛍光強度に如何に影響を及ぼすかについて調査した。

実施例１で使われた同一なＴａｑ ＤＮＡ重合酵素、アップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ、ＩＯ及びマーカーを本実施例で使った。

スライド製作は、実施例１で使われた同一なプロトコルで行った。

ＮＧ遺伝子のゲノムＤＮＡ１００ｐｇ、アップストリームプライマー（配列番号：１）１０ｐｍｏｌｅ、ダウンストリームプライマー（配列番号：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号：３）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号：４）３、１、または０．５ｐｍｏｌｅ及び２Ｘ マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、及び２．４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素）（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）１５μｌを含有した３０μｌの最終体積でＰＣＥ−ＩＨ反応を実施し、ＩＯ（配列番号：５）が交差結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに前記全体混合物を適用した。スライドをインサイチュブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。ＰＣＥ−ＩＨ反応を次のように実施した：９５℃で１５分変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の反応過程を４０サイクル繰り返し後、５５℃で３０分ハイブリダイゼーションさせた。

前記反応以後、前記スライドを１分間蒸留水で洗浄した。イメージを共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４３００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳＡ）を用いて５−μｍピクセル解像度にスキャニングして獲得した。蛍光強度を定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェアであるＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳＡ）を用いて分析した。蛍光強度を周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を試験するために、スポットを３つずつスポッティングした。蛍光強度は、３つのスポットの平均値で表わした。

図６Ａ及び図６Ｂに示されたように、ＣＴＯの濃度が減少するにつれて、ターゲットの存在下で蛍光強度は確実に増加した。

本発明の望ましい具現例を詳しく記述したところ、本発明の原理による変形及び修正が可能であるということは、当業者に明白であり、本発明の範囲は、添付の請求項とその均等物とによって定義される。

Claims (25)

1. 次の段階を含むＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法：
   （ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
   前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み；
   前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；
   前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；
   前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し；
   （ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；
   前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；
   （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
   前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；
   前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；
   （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって；
   前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し；
   前記延長鎖は、標識を含み；
   （ｅ）前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
   前記ＩＯは、前記延長鎖に相補的な配列を含み；
   前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し；及び
   （ｆ）前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって；
   前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
2. 前記段階（ｅ）は、前記延長鎖が一本鎖状態で前記ＩＯとのハイブリダイゼーションに有利な条件下で実施され、これにより、前記延長鎖及び前記ＣＴＯ間の前記延長二量体の形成による前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリダイゼーションの抑制が防止されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記条件は、前記段階（ｅ）で前記一本鎖状態の延長鎖の数を増加させることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記段階（ｅ）で前記一本鎖状態の延長鎖の数を増加させる前記条件は、前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリダイゼーション前に前記延長二量体を変性させることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記段階（ｅ）で前記一本鎖状態の延長鎖の数を増加させる前記条件は、前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリダイゼーション前に前記ＣＴＯを除去することを特徴とする請求項３に記載の方法。
6. 前記段階（ｅ）で前記一本鎖形態の延長鎖の数を増加させる前記条件は、ＰＴＯのＣＴＯに対するｍｏｌ比が１超で前記ＰＴＯ及び前記ＣＴＯを使うことを特徴とする請求項３に記載の方法。
7. 前記ＰＴＯのＣＴＯに対するｍｏｌ比は、１．２以上であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 前記段階（ｅ）は、前記延長鎖と前記ＩＯとのハイブリダイゼーション競争力を、前記ＣＴＯと前記延長鎖とのハイブリダイゼーション競争力よりも向上させる条件下で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記延長鎖と前記ＩＯとのハイブリダイゼーション競争力を、前記ＣＴＯと前記延長鎖とのハイブリダイゼーション競争力よりも向上させる前記条件は、前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリッドのＴｍ値及び前記ＣＴＯ及び前記延長鎖間のハイブリッドのＴｍ値を調節することを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 前記ＩＯは、（ｉ）前記延長配列の全部または一部、及び（ｉｉ）前記延長鎖内の前記断片の一部に相補的な配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記延長鎖に含まれた前記標識は、（ｉ）前記ＰＴＯから放出された前記断片に結合された単一標識、（ｉｉ）前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される標識、または（ｉｉｉ）前記断片に結合された前記単一標識及び前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される前記標識の組合せであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 前記標識は、前記延長鎖に挿入される標識であり、
    前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、第１非天然塩基を含むヌクレオチドを含み、
    前記段階（ｄ）の前記延長反応は、標識及び前記第１非天然塩基に対して特異的結合親和性を有する第２非天然塩基を含むヌクレオチドの存在下で実施され、これにより、前記延長鎖に前記標識が挿入されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記標識は、前記断片に結合された前記単一標識及び前記延長反応の間に前記延長鎖に挿入される前記標識の組合せであり、前記単一標識及び前記挿入された標識は、受容体及び供与体の対を含む相互作用的二重標識であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
14. 前記段階（ｅ）の前記ハイブリダイゼーションは、インターカレーティング染料の存在下で実施され、前記延長鎖に含まれた前記標識は、前記インターカレーティング染料からのシグナルを受ける受容体であり、前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリッドに挿入されたインターカレーティング染料からのシグナルは、前記受容体に転移され、前記受容体は、検出可能なシグナルを提供することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
15. 前記ＰＴＯ、前記ＣＴＯ及び／または前記ＩＯは、その延長が防止されるように、その３’末端がブロッキングされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 前記シグナルを検出するための前記段階（ｆ）は、一定温度範囲で前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリッドをメルティングするか、または前記ハイブリッドをメルティングし、ハイブリダイズさせる過程で、前記固相基質上に提供されるシグナルを検出することで実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）〜（ｆ）の全部または一部を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
18. 前記段階（ａ）〜（ｆ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
19. 前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために実施され；
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含み、前記ＩＯは、少なくとも２種のＩＯを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
20. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
21. 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施されることを特徴とする請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
22. 次の段階を含むＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含むプライマー対及びプロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
    前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み；
    前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；
    前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；
    前記ＰＴＯは、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し；
    前記ＰＴＯは、その延長が防止されるように、その３’末端がブロッキングされており；
    （ｂ）前記プライマーの延長及び前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；
    前記ＰＴＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされれば、前記アップストリームプライマーは延長され、前記延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；
    （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
    前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；
    前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；
    （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって；
    前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し；
    前記延長鎖は、標識を含み、
    （ｅ）前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
    前記ＩＯは、前記延長鎖に相補的な配列を含み；
    前記延長鎖及び前記ＩＯ間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し；及び
    （ｆ）前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって；
    前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
23. 次の段階を含むＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列を、プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
    前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；
    前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；
    （ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；
    前記ＰＴＯは、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断され、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；
    （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片を、キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
    前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；
    前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；
    （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって；
    前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し；
    前記延長鎖は、標識を含み、
    （ｅ）前記延長鎖を、固相基質上に固定された固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）とハイブリダイズさせる段階であって；
    前記ＩＯは、前記延長鎖に相補的な配列を含み；
    前記延長鎖と前記ＩＯとの間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供し；及び
    （ｆ）前記延長鎖の存在を示す前記シグナルを検出する段階であって；
    前記延長鎖の存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
24. 次を含むＰＴＯの切断及び延長−依存的固定化オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＣＥ−ＩＨ）分析によって固相で核酸試料内のターゲット核酸配列を検出するためのキット：
    （ａ）アップストリームオリゴヌクレオチド；
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含み；
    （ｂ）プロービング・アンド・タギングオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）；
    前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含み；
    前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず；
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し；
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；
    （ｃ）キャプチャリング・アンド・テンプレーティングオリゴヌクレオチド（ＣＴＯ）；
    前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；
    前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；
    前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な延長配列を含む延長鎖を生成し、延長二量体を形成し；
    前記延長鎖は、標識を含み；及び
    （ｄ）固定化オリゴヌクレオチド（ＩＯ）；
    前記ＩＯは、固相基質上に固定化されており；
    前記ＩＯは、前記延長鎖に相補的な配列を含み；
    前記延長鎖と前記ＩＯとの間のハイブリダイゼーションは、前記固相基質上に検出可能なシグナルを提供する。
25. ＰＴＯのＣＴＯに対するｍｏｌ比が１超で前記ＰＴＯ及びＣＴＯを含むことを特徴とする請求項２４に記載のキット。