JP5631301B2 - ポリアルキレングリコールおよび遷移金属を用いて生体高分子を単離する方法 - Google Patents

Description

本発明は、組成物中の生物学的な高分子を単離する方法に関する。具体的に、本発明は、不純物を含有する組成物中の生体高分子を単離する方法に関し、該方法は、該組成物にポリアルキレングリコールを添加する工程と、該組成物に遷移金属を添加する工程と、該不純物から該生体高分子を分離する工程と、を含む。

組み換えタンパク質または抗体等の生物学的な高分子（即ち、生体高分子）は、多様な技術において重要である。従来から、生体高分子は、数例を挙げると、例えば、濾過、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、または前述の組み合わせ等のいくつかの異なる方法を用いて、精製されてきた。精製の方法は、通常、組成物中に生体高分子と共存する１つ以上の不純物とそれを区別する、生体高分子の特徴に基づいて選択される。膨大な数の生体高分子が商業的に重要であり、タイムリーにかつ費用効率の良い方法で、大量の生体高分子を精製する能力が望まれている。

商業的に重要な生体高分子としては、例えば、タンパク質および核酸（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）が挙げられる。多くの場合、工業規模で単離される生体高分子の２つの例は、モノクローナル抗体および融合タンパク質である。これらの抗体および融合タンパク質は、種々の診断および治療分野において価値があり、例えば、遺伝性および後天性の免疫不全症ならびに感染症等の種々の疾患を治療するために用いられている。

哺乳類細胞または細菌細胞を含有する工業規模のバイオリアクターからの生体高分子の収集は、通常、濾過または遠心分離のいずれかを用いて行われる。しかしながら、細胞培養においてタンパク質産生量の増加を引き起こすための最近の動きとしては、より高い細胞密度で作用するバイオリアクターが必要であり、これは、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、および他の培地成分等の不純物の量を増加させる。汚染物質レベルの増加は、細胞回収作業（例えば、濾過および遠心分離工程）、ならびに下流精製工程（例えば、クロマトグラフィおよび透析工程）の両方に対して、より高い需要を求めている。これらの高濃度の不純物の存在は、実施すべき必要がある精製工程の数を増やし、ひいては、費用を引き上げ、全体的な生産処理量を低減させ得る。増加したタンパク質産生は、一部のクロマトグラフ法の容量でさえ飽和し得る。

精製抗体を生成するための従来からの手法には、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、ＤＥＡＥまたはヒドロキシアパタイト）、免疫親和性精製法（例えば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ）、および透析が含まれ得る。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと。上述の方法の組み合わせの使用は、一般的である（例えば、エタノール分画、次いで、イオン交換クロマトグラフィおよび／またはカプリル酸（ＣＡ）沈澱を用いる血漿からの抗体精製）。例えば、非特許文献１、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６を参照のこと。加えて、発酵の酸性化を用いて、抗体および組み換えタンパク質の回収ならびに安定性が改善されてきている。例えば、非特許文献２を参照のこと。

抗体の単離および／または精製のために、種々の他の方法が、開発されている。例えば、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、および特許文献１５を参照のこと。しかしながら、これらの方法の多くは、大量の原料および回収損失をもたらす、工業規模で生産費用を高くする、および／または低処理量を有する可能性がある。

沈殿剤の導入により誘発された生体高分子の沈殿は、生体高分子を回収するのに迅速かつ効果的な方法であり得る。従来の沈殿技術としては、硫安沈殿法およびカプリル酸沈殿法が挙げられる。沈殿の従来からの短所の１つは、沈殿が完了した後、沈殿剤の除去を必要とすることである。この短所のために、多くの場合、沈殿は、上流精製法として用いられる。沈殿の別の短所は、所望の結果を得るために高濃度の沈殿剤を必要とし、ひいては、多量の廃棄物を生み出すことである。

これまでは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、種々の生体高分子を沈殿してきた。例えば、非特許文献３および国際公開第ＷＯ２００８／１００５７８号を参照のこと。ＰＥＧは、種々の環境下で、非変性であることが見出された。しかしながら、高濃度のＰＥＧを使用して、例えば、全量の２０％の所望の結果を達成している。高濃度のＰＥＧは、容量の著しい増加をもたらし、多量の廃棄物を生み出し、組成物の粘度を増加させる。さらに、必要とされる高濃度のＰＥＧは、精製に伴う費用を増大させる。

これまでに、金属親和性の沈殿も試みている。例えば、非特許文献４、および非特許文献５を参照のこと。しかしながら、所望の沈殿（最大８０ｍＭ）を達成するためには、高濃度の亜鉛も必要とされる。したがって、これらの高濃度での金属親和性の使用は、相当量の廃棄物を生成し、費用を大幅に引き上げる。

前述の問題および非効率の結果として、生体高分子の単離のための戦略を改善する必要がある。

米国特許第４，１６４，４９５号明細書 米国特許第４，１７７，１８８号明細書 米国再発行特許発明第３１，２６８号明細書 米国特許第４，９３９，１７６号明細書 米国特許第５，１６４，４８７号明細書 国際公開第２００８／１００５７８号 米国特許第７，０３８，０１７号明細書 米国特許第７，０６４，１９１号明細書 米国特許第６，８４６，４１０号明細書 米国特許第５，４２９，７４６号明細書 米国特許第５，１５１，５０４号明細書 米国特許第５，１１０，９１３号明細書 米国特許第４，９３３，４３５号明細書 米国特許第４，８４１，０２４号明細書 米国特許第４，８０１，６８７号明細書

ＭｃＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９６：２７１−２７８（１９８７） Ｌｙｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ７４５：２２２−３１（１９９４） Ｉｎｇｈａｍ，Ｋ．，"Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ，" ３０１−３０６（１９９０） Ｖａｎ Ｄａｍ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，"Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，" Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４９２−５０２（１９８９） Ｚａｗｏｒｓｋｉ，Ｐ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．，"Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｚｉｎｃ，" Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４４０−４４４（１９８８）

本発明は、不純物を含有する組成物中の生体高分子を単離する方法に関し、該方法は、（ａ）該組成物にポリアルキレングリコールを添加する工程と、（ｂ）該組成物に遷移金属を添加する工程と、（ｃ）該不純物から該生体高分子を分離する工程と、を含む。ポリアルキレングリコールと遷移金属との組み合わせは、不純物から生体高分子を相乗的に分離し、著しく収量を改善する。

種々のポリアルキレングリコールが使用され得る。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、ポリペンチレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。種々の分子量のポリアルキレングリコールが、使用され得る。いくつかの実施形態では、該ポリエチレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、該ポリエチレングリコールは、２，０００Ｄａ〜１５，０００Ｄａの分子量を有する。

種々の濃度のポリアルキレングリコールが、本発明の方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、該組成物中のポリアルキレングリコールの濃度は、約０．５％〜約３０％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、該組成物中のポリアルキレングリコールは、約２．０％〜約１０％（ｗ／ｖ）である。本発明のいくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、約１％〜２％（ｗ／ｖ）で、該組成物に存在する。

遷移金属を、本発明の方法において使用し、不純物からの生体高分子の分離を増加させることが可能である。いくつかの実施形態では、該遷移金属は、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、またはマンガンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、該遷移金属は、亜鉛である。種々の濃度の遷移金属が、使用され得る。いくつかの実施形態では、組成物中の遷移金属の濃度は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物中の遷移金属の濃度は、約２．５ｍＭ〜約１５ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物中の遷移金属の濃度は、約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭである。いくつかの実施形態では、組成物中の遷移金属の濃度は、約１．５ｍＭ〜３．５ｍＭである。

種々の方法を使用して、不純物から該生体高分子を分離することができる。いくつかの実施形態では、該分離は、該組成物を濾過することによって行われ、該濾過する工程が透過流れおよび固体流れを形成する。いくつかの実施形態では、該濾過する工程は、デッドエンドフィルタによって行われる。いくつかの実施形態では、該生体高分子は、実質的に該固体流れに存在する。いくつかの実施形態では、該分離する工程が、該組成物を濾過することによって行われ、該生体高分子は、該固体のままであり、該濾過する工程が膜間圧をもたらし、そして該膜間圧が該濾過する工程間、実質的に一定のままである。いくつかの実施形態では、該分離する工程は、該組成物を遠心分離に供することによって行われ、該遠心分離が上清および沈渣を形成する。いくつかの実施形態では、該生体高分子は、実質的に沈渣に存在する。

本発明に従って、種々の生体高分子を単離し得る。いくつかの実施形態では、該生体高分子は、タンパク質である。いくつかの実施形態では、該タンパク質は、可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、該タンパク質は、抗体である。

いくつかの実施形態では、本発明は、不純物を含有する組成物から生体高分子を単離するための方法である。いくつかの実施形態では、該組成物は、真核細胞物質を含む。いくつかの実施形態では、該不純物は、成長培地成分、タンパク質、脂質、核酸、リボ核酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ポリアルキレングリコールまたは遷移金属を利用するのみの方法と比較して、組成物から生体高分子の回収を増加させる。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の添加が、該生体高分子の回収を、３％を超えて増加させる。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の回収が、該生体高分子の回収を、１０％を超えて増加させる。いくつかの実施形態では、該生体高分子の回収は、ポリアルキレングリコールまたは遷移金属のみの使用と比較すると、ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の両方を使用する場合、相乗作用がある。

本発明のいくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、該遷移金属は、亜鉛であり、該分離する工程は、該溶液中の該生体高分子を沈殿させ、その後、該沈殿物を分離するように該組成物を遠心分離にかけることによって行われ、該生体高分子は、抗体である。

本発明のいくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、該遷移金属は、亜鉛であり、該分離する工程は、該溶液中の該生体高分子を沈殿させ、その後、該生体高分子を単離するように該組成物を濾過することによって行われ、該生体高分子は、抗体である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
不純物を含有する組成物中の生体高分子を単離する方法であって、
（ａ）上記組成物にポリアルキレングリコールを添加する工程と、
（ｂ）上記組成物に遷移金属を添加する工程と、
（ｃ）上記不純物から上記生体高分子を分離する工程と、を含む、方法。
（項目２）
上記ポリアルキレングリコールは、ポリペンチレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記ポリエチレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有する、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記ポリエチレングリコールは、２，０００Ｄａ〜１５，０００Ｄａの分子量を有する、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記ポリアルキレングリコールを添加する工程は、約０．５％〜約３０％（ｗ／ｖ）のポリアルキレングリコール濃度を有する組成物をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記ポリアルキレングリコールを添加する工程は、約２．０％〜約１０％（ｗ／ｖ）のポリアルキレングリコール濃度を有する組成物をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記遷移金属は、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、またはマンガンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記遷移金属は、亜鉛である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記遷移金属を添加する工程は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの遷移金属濃度を有する組成物をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記遷移金属を添加する工程は、約２．５ｍＭ〜約１５ｍＭの遷移金属濃度を有する組成物をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記（ｃ）の分離する工程は、上記組成物を濾過することによって行われ、上記濾過する工程が、透過流れおよび固体流れを形成する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記濾過する工程は、デッドエンドフィルタによって行われる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記生体高分子は、実質的に上記固体流れに存在する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記（ｃ）の分離する工程は、上記組成物を遠心分離に供することによって行われ、上記遠心分離が、上清および沈渣を形成する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記生体高分子は、実質的に上記沈渣に存在する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記生体高分子は、タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目１８）
上記タンパク質は、可溶性タンパク質である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記タンパク質は、抗体である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
上記組成物は、真核細胞物質を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
上記不純物は、タンパク質、脂質、核酸、リボ核酸、成長培地、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
上記ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の添加が、上記生体高分子の回収を、３％を超えて増加させる、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
上記ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の添加が、上記生体高分子の回収を、１０％を超えて増加させる、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
上記（ｃ）の分離する工程が、上記組成物を濾過することによって行われ、上記濾過する工程が膜間圧をもたらし、上記膜間圧が、上記濾過する工程の間、実質的に一定のままである、項目１〜１４および１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
（ａ）上記ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、
（ｂ）上記遷移金属は、亜鉛であり、
（ｃ）上記分離する工程は、上記溶液中の上記生体高分子を沈殿させ、その後、上記沈殿物を分離するように上記組成物を遠心分離にかけることによって行われ、
（ｄ）上記生体高分子は、抗体である、項目１に記載の方法。
（項目２６）
（ａ）上記ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、
（ｂ）上記遷移金属は、亜鉛であり、
（ｃ）上記分離工程は、上記溶液中の上記生体高分子を沈殿させ、その後、上記沈殿物を分離するように上記組成物を濾過することによって行われ、
（ｄ）上記生体高分子は、抗体である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
上記ポリアルキレングリコールおよび上記遷移金属の添加は、上記生体高分子の沈殿への相乗効果を有する、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
上記生体高分子の沈殿物を形成し、その後、洗浄する、項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
上記沈殿物を、水で洗浄する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記沈殿物を、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で、ＺｎＣｌ _２ を含む溶液で洗浄する、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
上記沈殿物を、約０．１％〜約２．５％の濃度で、ポリアルキレングリコールを含む溶液で洗浄する、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
上記生体高分子の単離のための、以下からなる群から選択される化合物の使用をさらに含む、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法
ａ）イミダゾール、
ｂ）グリシン、
ｃ）トリプトファン、
ｄ）システイン、
ｅ）ヒスチジン、
ｆ）ヒスタミン、および
ｇ）塩化アンモニウム。
（項目３３）
上記化合物は、イミダゾールである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
ポリアルキレングリコールは、約０．５％〜約５％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で、上記生体高分子の単離のために使用される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
ポリアルキレングリコールは、以下からなる群から選択される濃度（ｗ／ｖ）で、上記生体高分子の単離のために使用される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法
ａ）約０．５％、
ｂ）約１％、
ｃ）約１．５％、
ｄ）約２％、
ｅ）約２．５％、
ｆ）約３％、
ｇ）約３．５％、
ｈ）約４％、
ｉ）約４．５％、および
ｊ）約５％。
（項目３６）
遷移金属は、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの範囲内の濃度で、上記生体高分子の単離のために使用される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
遷移金属は、以下からなる群から選択される濃度で、上記生体高分子の単離のために使用される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法
ａ）約０．５ｍＭ、
ｂ）約１ｍＭ、
ｃ）約１．５ｍＭ、
ｄ）約２ｍＭ、
ｅ）約２．５ｍＭ、
ｆ）約３ｍＭ、
ｇ）約３．５ｍＭ、
ｈ）約４ｍＭ、
ｉ）約４．５ｍＭ、および
ｊ）約５ｍＭ。
（項目３８）
上記ポリアルキレングリコールを、上記組成物に添加して、約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリアルキレングリコールをもたらし、上記遷移金属を、上記組成物に添加して、約２．５ｍＭの濃度の遷移金属をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目３９）
上記生体高分子は、ポリアルキレングリコールまたは遷移金属を添加する前に、濃縮される、項目１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
上記生体高分子は、ポリアルキレングリコールおよび遷移金属を添加する前に、濃縮される、項目１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
上記添加前濃縮は、上記生体高分子の単離に必要とされるポリアルキレングリコールまたは遷移金属の量を、約２〜約４０倍減少させる、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
上記添加前濃縮は、上記生体高分子の単離に必要とされるポリアルキレングリコールまたは遷移金属の量を、以下からなる群から選択される因数分減少させる、項目３９または４０に記載の方法
ａ）約２倍、
ｂ）約３倍、
ｃ）約４倍、
ｄ）約５倍、
ｅ）約１０倍、
ｆ）約１５倍、
ｇ）約２０倍、
ｈ）約２５倍、
ｉ）約３０倍、
ｊ）約３５倍、および
ｋ）約４０倍。
（項目４３）
上記生体高分子は、沈殿前、または沈殿および洗浄前の上記生体高分子の比活性と比較して、約５０％〜約１００％の生物活性を保持する、項目１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
上記生体高分子は、沈殿前、または沈殿および洗浄前の上記生体高分子の比活性と比較して、以下からなる群から選択される値の生物活性を保持する、項目１〜４２のいずれか１項に記載の方法
ａ）約５０％、
ｂ）約６０％、
ｃ）約７０％、
ｄ）約８０％、
ｅ）約９０％、
ｆ）約９５％、および
ｇ）約１００％。

Ａｂ Ｃ沈殿に対する、ｐＨの効果を示す。Ａｂ Ｃの試料を、ｐＨ７、ｐＨ８、およびｐＨ９に滴定し、１時間放置した（Ａｂ Ｃの等電点は、約８．５である）。次いで、試料を濾過し、沈殿物（もしあれば）を捕捉し、Ａ_２８０での吸光度を測定した。滴定した試料に対する吸光測定を、出発物質（「ＣＣＭ」）と比較した。ｐＨ７、ｐＨ８、およびｐＨ９に滴定した試料に対する回収吸光度は、それぞれ、１０１．７％、９９．１％、１００．３％であった。これは、収集した生成物の濃度で、ｐＨのみでは、沈殿を誘発するのに十分ではないことを示す。 Ａｂ Ｃの沈殿および回収に対する、ＰＥＧ３３５０濃度（ｗ／ｖ）の効果を示す。収集したＡｂ Ｃの試料を、ｐＨ９．０に調節し、０％ ＰＥＧ３３５０、４％ ＰＥＧ３３５０、７％ ＰＥＧ３３５０、１０％ ＰＥＧ３３５０、１３％ ＰＥＧ３３５０、および２０％ ＰＥＧ３３５０で処理した。試料は、２〜８℃で、３０〜６０分間放置し、１４，０００ｒｐｍで３分間、遠心分離にかけた。上清をデカントし、沈渣を再懸濁緩衝液中で再懸濁した。対照として、収集したＡｂ Ｃ試料を用いて、サイズ排除クロマトグラフィによって回収率を計算した。Ａｂ Ｃを沈殿させ、＞９５％の回収率を達成するためには、少なくとも１０％ ＰＥＧ３３５０を必要とした。 異なるＰＥＧ濃度での、ＰＥＧのｐＨおよび分子量の効果を示す。Ａｂ Ｃの試料を、ｐＨ７、８、および９に滴定し、５％、１０％、または１５％のＰＥＧ分子量４００、１０００、３３５０、および８０００Ｄａで処理した。データは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ８０００が全て、５％以上の量で、高い回収率を生じることを示す。試料は、２〜８℃で、３０〜６０分間放置し、１４，０００ｒｐｍで３分間、遠心分離にかけた。上清をデカントし、沈渣を再懸濁緩衝液中で再懸濁した。対照として、収集したＡｂ Ｃ試料を用いて、サイズ排除クロマトグラフィによって回収率を計算した。 Ａｂ Ｃ回収に対する、ＰＥＧ分子量の効果を示す。Ａｂ Ｃの試料を、ｐＨ８に滴定し、２〜８℃または周囲温度で、１０％ ＰＥＧ３３５０またはＰＥＧ８０００で処理した。試料は、２〜８℃または周囲温度で、３０〜６０分間放置し、１４，０００ｒｐｍで３分間、遠心分離にかけた。上清をデカントし、沈渣を再懸濁緩衝液中で再懸濁した。対照として、収集したＡｂ Ｃ試料を用いて、サイズ排除クロマトグラフィによって回収率を計算した。ＰＥＧ３３５０およびＰＥＧ８０００はともに、高収率をもたらす。 ＰＥＧ沈殿前の抗体Ａｂ Ｃ製剤の純度を示す。 ｐＨ８．０で、１０％ ＰＥＧ８０００で沈殿した後の抗体Ａｂ Ｃの製剤の純度を示す。 ＰＥＧ沈殿前の抗体Ａｂ Ｄ製剤の純度を示す。 ｐＨ８．０で、１０％ ＰＥＧ８０００で沈殿した後の抗体Ａｂ Ｄの製剤の純度を示す。 ＰＥＧ沈殿前の抗体Ａｂ Ｅ製剤の純度を示す。 ｐＨ８．０で、１０％ ＰＥＧ８０００で沈殿した後の抗体Ａｂ Ｅの製剤の純度を示す。 ＰＥＧ沈殿前の抗体Ａｂ Ｆ製剤の純度を示す。 ｐＨ８．０で、１０％ ＰＥＧ８０００で沈殿した後の抗体Ａｂ Ｆの製剤の純度を示す。 Ａｂ Ｃの沈殿に対する、０ｍＭ ＺｎＣｌ_２および１０ｍＭ ＺｎＣｌ_２の効果を示す。また、種々のＺｎＣｌ_２濃度で、５％ ＰＥＧを添加する効果も示す。 ＰＥＧ沈殿前、ならびにｐＨ７．２で、５％ ＰＥＧ３３５０および５ｍＭ ＺｎＣｌ_２で沈殿した後の抗体Ａｂ Ｃ製剤の純度を示す。 種々のＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２の濃度が、ｐＨ７．０で、組成物中の抗体の沈殿において有する効果を示す。 種々のＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２の濃度が、ｐＨ８．０で、組成物中の抗体の沈殿において有する効果を示す。 種々のＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２の濃度が、ｐＨ９．０で、組成物中の抗体の沈殿において有する効果を示す。 イミダゾールの存在下で、ＰＥＧ３３５０およびＺｎＣｌ_２で沈殿した後のＡｂ Ｆのサイズ排除分析を示す。その後、Ａｂ Ｆの再可溶化画分を、アニオン交換工程および疎水性相互作用クロマトグラフィを通して精製した。 身体供給量の異なる濃度による、Ａｂ Ｆ沈殿物のデッドエンド（Ｎｕｔｓｃｈｅ）濾過を示す。差圧（ｐｓｉ）対処理量（Ｌ／ｍ^２）を（Ａ）に示し、濾液の容量（ｍＬ）対時間（分）を（Ｂ）に示した。 身体供給量の異なる濃度による、Ａｂ Ｆ沈殿物のデッドエンド（Ｎｕｔｓｃｈｅ）濾過を示す。差圧（ｐｓｉ）対処理量（Ｌ／ｍ^２）を（Ａ）に示し、濾液の容量（ｍＬ）対時間（分）を（Ｂ）に示した。 洗浄液の増加するダイア量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）（ＤＶ）で、洗浄したＡｂ Ｆ沈殿ケーキのサイズ排除分析を示す。低分子量の不純物（ＬＭＷ）を、矢印で強調する。 イミダゾールの存在下および非存在下で、ＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２による沈殿による低分子量の除去を示す。１０倍に濃縮したＡｂ Ｆ ＨＣＣＦを（Ａ）に示す。イミダゾールの非存在下で、ＰＥＧ３３５０およびＺｎＣｌ_２を用いたＡｂ Ｆの沈殿を、（Ｂ）（低分子量レベル約６％）に示し、イミダゾールの存在下で、３３５０およびＺｎＣｌ_２によるＡｂ Ｆの沈殿を、（Ｃ）（１％未満の低分子量レベル）に示した。

ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の両方の組み合わせの添加は、組成物中の生体高分子の沈殿を改善することが見出された。該生体高分子のこの沈殿は、該組成物に存在する不純物から該生体高分子の分離をもたらした。本発明は、不純物を含有する組成物中の生体高分子を単離する方法に関し、該方法は、（ａ）該組成物にポリアルキレングリコールを添加する工程と、（ｂ）該組成物に遷移金属を添加する工程と、（ｃ）該不純物から該生体高分子を分離する工程と、を含む。

別途文脈から明確にされない限り、「ａ」または「ａｎ」のもの（ｅｎｔｉｔｙ）という用語は、１つ以上のそのものを指し、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、１つ以上のたんぱく質を表すように理解されることに留意すべきである。このように、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で同じ意味で使用され得る。

「単離する（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」および「単離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）」という用語は、該組成物中に見出される少なくとも１つの他の望ましくない成分または不純物から生体高分子を分離することを指す。「単離する（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」という用語には、「精製する（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）」および「浄化する（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ）」が含まれる。生体高分子の単離の特定レベルは必要とされないが、いくつかの実施形態では、不純物の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（ｗ／ｗ）が、該生体高分子から分離される。例えば、いくつかの実施形態では、生体高分子の単離は、該組成物に元来は存在する、８０％の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）から該生体高分子を分離する工程を含む。

「浄化する（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ）」および「浄化（ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、組成物からの大粒子の除去を指す。例えば、細胞培養および成長培地に適用される場合、「浄化する」という用語は、例えば、原核および真核（例えば、哺乳類）細胞、脂質、ならびに／または細胞培養からの核酸（例えば、染色体およびプラスミドＤＮＡ）の除去を指す。

「精製する（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）」および「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、不純物の大きさにかかわらず、組成物中の不純物または他の汚染物質から本発明の生体高分子を分離することを指す。したがって、精製という用語は、「浄化」を包含するが、浄化中、除去されたもの（例えば、タンパク質、脂質、核酸、ならびに細胞残屑、ウイルス残屑、汚染されている細菌残屑、培地成分等の他の形態）よりもさらに小さい不純物をさらに包含し得る。生体高分子の精製の特定レベルは必要とされないが、いくつかの実施形態では、不純物の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、または９５％（ｗ／ｗ）は、該生体高分子から精製される。例えば、いくつかの実施形態では、生体高分子の精製は、組成物に元来は存在する、８０％のＨＣＰから生体高分子を分離する工程を含み得る。

本明細書に使用される、「相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｙ）」、「相乗的な（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ）」、または「相乗効果（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）」という用語は、添加物よりも大きい規模を有する効果を説明する。本発明のいくつかの実施形態では、ポリアルキレングリコールと遷移金属をあわせた両方の使用は、生体高分子の相乗的な生成物の回収または相乗的な沈殿を提供する。例えば、３％（ｗ／ｖ）ポリアルキレングリコールのみの使用により、５％の生体高分子を沈殿し、１０ｍＭ 最終濃度の遷移金属のみの使用により、５％の同一の生体高分子を沈殿した場合、３％ ポリアルキレングリコールと１０ｍＭ 遷移金属をあわせて両方を用いた生体高分子を沈殿する相加効果は、１０％の該生体高分子の沈殿であり得る。したがって、比較すると、３％ ポリアルキレングリコールと１０ｍＭ 遷移金属をあわせて両方を用いた場合の相乗効果は、１０％を超える任意の範囲で、生体高分子の沈殿であり得る。

種々のポリアルキレングリコールが、使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリアルキレンという用語は、一般式Ｉ：

の化合物であり得る。

いくつかの実施形態では、ｎは、約１０〜約５，０００、約２０〜約２，５００、約５０〜約２，０００、または約１００〜約５００であり得、ｍは、約１〜約１０である。さらなるポリアルキレングリコール分子は、前述されている。好適な例としては、米国特許第５，６４３，５７５号に記載されるもの等のポリプロピレングリコールが挙げられる。本発明の方法において有用な他のポリアルキレングリコールは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．のカタログ「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ２００１」に記載される。各々の開示は、参照することにより本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、ヘテロポリマーが使用され得、式中、異なるアルキル置換基は、ポリアルキレン分子（例えば、式ＩＩのポリアルキレン分子）に含有され、

式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４は独立して、水素または置換もしくは非置換アルキル、アリルアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリルアルキル、リン酸塩、ホスホアルキル、硫酸塩、またはスルホアルキルであり得、式中、各ｚサブユニットは同一または異なり得る。

いくつかの実施形態では、ｙは、約１〜約１０であり得る。いくつかの実施形態では、ｙの値は、任意に、各ｚサブユニットに対して異なり得る。いくつかの実施形態では、ｚは、約１０〜約５，０００、約２０〜約２，５００、約５０〜約２，０００、または約１００〜約５００であり得る。

いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、室温で、水溶性である。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、ポリペンチレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリエチレングリコールからなる群から選択され、式中、アルキル置換基のいずれかは、任意に、非置換であるか、またはアルキル、アリルアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリルアルキル、リン酸塩、ホスホアルキル、硫酸塩、もしくはスルホアルキルと置換される。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。

種々の分子量のポリアルキレングリコールが、使用され得る。ポリアルキレングリコールは、平均分子量で、実質的に異なり得るが、いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、約１，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ〜約２５，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａ、または約４，０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、約３，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、または９，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、２，０００Ｄａ〜１５，０００Ｄａの分子量を有する。

いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである場合、該ポリエチレングリコールは、１，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、約２，０００Ｄａ〜約２５，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａ、または約４，０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、該ポリエチレングリコールは、約３，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、または９，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、該ポリエチレングリコールは、２，０００Ｄａ〜１５，０００Ｄａの分子量を有する。

種々の濃度のポリアルキレングリコールが、組成物中で使用され得る。該ポリエチレンは、濃縮された、または任意に純粋な、原料からの組成物に添加され得る。組成物に添加する際、該濃縮された原料は、希釈される。いくつかの実施形態では、該組成物に該ポリアルキレングリコールを添加する工程は、約１％〜約４０％（ｗ／ｖ）、約２％〜約３５％（ｗ／ｖ）、約２．５％〜約３０％（ｗ／ｖ）、または約３％〜約３０％（ｗ／ｖ）のポリアルキレングリコール濃度を有する、組成物をもたらす。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコール濃度は、該組成物の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、該組成物に該ポリアルキレングリコールを添加する工程は、約２．０％〜約１０％（ｗ／ｖ）のポリアルキレングリコール濃度を有する組成物をもたらす。いくつかの実施形態では、該組成物に該ポリアルキレングリコールを添加する工程は、約０．５％〜約３０％（ｗ／ｖ）のポリアルキレングリコール濃度を有する組成物をもたらす。いくつかの実施形態では、該組成物に該ポリアルキレングリコールを添加する工程は、約０．５％〜約２．５％（ｗ／ｖ）のポリアルキレングリコール濃度を有する組成物をもたらす。いくつかの実施形態では、遷移金属と組み合わせて使用したポリアルキレングリコールの濃度は、遷移金属を添加しないで用いたポリアルキレングリコールの濃度よりも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％低く、当量の分離生体高分子を得る。このような実施形態では、ポリアルキレングリコールの使用の軽減、および精製後の残留廃棄物の生成を軽減したことに伴い、費用を削減することが可能である。

当業者は、異なる濃度、分子量、または種類のポリアルキレングリコール類が、異なる生体高分子に対してさらに有効であり得ることを理解されよう。いかなる方法論にも制限されることなく、遷移金属および生体高分子を含む組成物に、種々の濃度、分子量、または種類のポリアルキレングリコールを添加し、次いで、該生体高分子を精製する最も有効な方法を決定することによって、好適な濃度のポリアルキレングリコールを、決定することができる。

遷移金属を、本発明において使用し、不純物からの生体高分子の分離を増加させることが可能である。「遷移金属」という用語は、亜鉛、カドミウム、および水銀を含む、周期表のｄブロックにある任意の元素を指す。遷移金属の例としては、スカンジウム、チタニウム、バナジウム、クロム、鉄、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、およびマンガンが挙げられる。いくつかの実施形態では、該遷移金属は、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、またはマンガンである。いくつかの実施形態では、該遷移金属は、亜鉛である。いくつかの実施形態では、１種類以上の遷移金属が、使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、およびマンガンのうちの２種またはそれ以上の組み合わせが、使用され得る。いくつかの実施形態では、該遷移金属を微粉化し、遷移金属粒子の平均サイズを低下させる。

種々の濃度の組成物中の遷移金属が、本発明で用いるのに適している。当業者により、種々の内因性量の遷移金属は、通常は、組成物、例えば、収集採取物（内因性遷移金属）中に少量で存在し、種々の量の遷移金属を、本発明に従って収集採取物（外因性遷移金属）に添加することが可能であることを認識されよう。いくつかの実施形態では、該遷移金属の濃度は、外因性および内因性カチオンの両方を含む。しかしながら、実践上、内因性遷移金属の量は、通常、外因性遷移金属の量に比べて相対的に少ないため、外因性遷移金属のみを考慮することによって、該遷移金属の濃度を計算することができる。いくつかの実施形態では、濃縮された（または純粋な）原料からの遷移金属のアリコートを、本発明の組成物に添加して、所望の最終濃度の組成物中の遷移金属を得る。いくつかの実施形態では、組成物を遷移金属にさらに添加して、組成物中の遷移金属の濃度を希釈する。いくつかの実施形態では、該組成物に該遷移金属を添加する工程は、約０．１ｍＭ〜約１Ｍ、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．２ｍＭ〜約７５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約２０ｍＭの遷移金属濃度を有する組成物をもたらす。いくつかの実施形態では、該組成物に該遷移金属を添加する工程は、約１．５ｍＭ〜約１５ｍＭ、２．５ｍＭ〜約１５ｍＭ、または約０．３ｍＭ〜約７．０ｍＭの遷移金属濃度を有する組成物をもたらす。いくつかの実施形態では、ポリアルキレングリコールと組み合わせて使用した遷移金属の濃度は、ポリアルキレングリコールを添加しないで使用した遷移金属の濃度よりも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％低く、当量の分離生体高分子を得る。このような実施形態では、遷移金属の使用の軽減、および精製後の残留廃棄物の生成の軽減とともに、費用を削減することが可能である。

当業者により、異なる濃度の遷移金属が、異なる生体高分子に対してさらに有効であり得ることを認識されよう。いかなる方法論にも制限されることなく、ポリアルキレングリコールおよび生体高分子を含む組成物に、種々の濃度の遷移金属を添加し、次いで、最大量の生体高分子を回収することが可能な最低濃度を決定することによって、好適な濃度の遷移金属を、決定することができる。

当業者は、遷移金属が、塩形態に存在し得、例えば、ＣｕＣｌ_２等の銅塩は、水溶液中に入れる場合、銅カチオンを生成することができることを認識されよう。したがって、本明細書に使用される、「遷移金属を添加する工程」という句は、その帯電状態での遷移金属の添加だけでなく、本発明の組成物に導入する際、遷移金属を生成し得る塩または他の化合物の添加も包含し得る。いくつかの実施形態では、該遷移金属は、塩（例えば、ＣｕＣｌ_２、ＮｉＣｌ_２、ＺｎＣｌ_２、ＭｎＣｌ_２、ＣｕＢｒ_２、ＮｉＢｒ_２、ＺｎＢｒ_２、ＭｎＢｒ_２、ＣｕＳＯ_３、ＮｉＳＯ_３、ＺｎＳＯ_３、およびＭｎＳＯ_３）、またはこれらのカチオンもしくは塩のうちの１つ以上の組み合わせである。いくつかの実施形態では、該遷移金属は、例えば、ＣｕＣｌ_３、ＮｉＣｌ_３等のハロゲン化塩である。いくつかの実施形態では、該遷移金属は、銅グリシン酸塩、ニッケルグリシン酸塩、亜鉛グリシン酸塩、またはマンガングリシン酸塩である。特定の遷移金属が、精製／単離され得る異なる生体高分子にさらに適し得ることが期待され得る。しかしながら、当業者は、どの遷移金属が、対象の生体高分子の最大回収を達成するかを決定するために、多くの遷移金属を容易にかつ迅速に試験することができる。

いくつかの実施形態では、集合体において金属イオン結合に影響を及ぼす競合リガンドは、本発明において有用である。このようなリガンドの例としては、イミダゾール、グリシン、トリプトファン、システイン、ヒスチジン、ヒスタミン、塩化アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。（Ｋａｇｅｄａｌ，Ｌ，“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ” ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊａｎｓｏｎ，Ｊ−Ｃ，１９９８）、およびＰｒｚｂｙｃｉｅｎ ｅｔ ａｌ． “Ａ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ” Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ｉｎｔ．Ｓｃｉ（１９９６）を参照のこと）。

本発明において、「組成物」という用語は、本発明の生体高分子の少なくとも１つの分子と、任意に少なくとも１つの不純物との混合物を指し、ここで、不純物および生体高分子は同一ではない。いくつかの実施形態では、該組成物は、生体高分子、細胞宿主生物（例えば、哺乳類細胞）、および宿主生物を繁殖させ、対象の生体高分子の発現を可能にするのに十分な成長培地を含む。成長培地の選択および使用は、当業者には既知である。いくつかの実施形態では、該成長培地は、細胞培養培地である。細胞培養培地は、繁殖される細胞培養の種類に応じて異なる。いくつかの実施形態では、該細胞培養培地は、商業的に入手可能な培地である。いくつかの実施形態では、該組成物は、例えば、無機塩類、炭水化物（例えば、ブドウ糖、ガラクトース、マルトース、またはフルクトース等の糖類）、アミノ酸、ビタミン（例えば、ビタミンＢ群（例えば、Ｂ１２）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、リボフラビン、チアミン、およびビオチン）、脂肪酸および脂質（例えば、コレステロールおよびステロイド）、タンパク質およびペプチド（例えば、アルブミン、トランスフェリン、フィブロネクチン、およびフェチュイン）、血清（例えば、ウシ胎仔血清、新生子牛血清、およびウマ血清等のアルブミン、成長因子、および成長抑制剤を含む組成物）、微量元素（例えば、亜鉛、銅、セレニウム、およびトリカルボン酸中間体）、ならびにこれらの組み合わせを含有する成長培地を含む。成長培地の例としては、基本培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ）、複合培地（ＲＰＭＩ １６４０、Ｉｓｃｏｖｅｓ ＤＭＥＭ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ Ｌ−１５、ＴＣ １００）、無血清培地（例えば、ＣＨＯ、Ｈａｍ Ｆ１０および誘導体、Ｈａｍ Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）が挙げられるが、これらに限定されない。成長培地に見出される一般の緩衝液には、ＰＢＳ、Ｈａｎｋｓ ＢＳＳ、Ｅａｒｌｅｓ塩、ＤＰＢＳ、ＨＢＳＳ、およびＥＢＳＳが挙げられる。哺乳類細胞を培養するための培地は、当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅ．Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）、および他より入手可能である。成長培地に見出される他の成分には、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、システイン／シスチン、グルタミン、葉酸、グルタチオン、リレイン酸、リポ酸、オレイン酸、パルミチン酸、ピリドキサール／ピリドキシン、リボフラビン、セレニウム、チアミン、およびトランスフェリンが含まれ得る。当業者により、本発明の範囲内で可能な成長培地への修正があることを認識されよう。

いくつかの実施形態では、該組成物は、収集採取物をさらに含む。「収集採取物（ｈａｒｖｅｓｔ ｆｅｅｄ）」という用語は、細胞が、収集直前に存在する培地、または収集された細胞が、収集直後に入れられ、これに細胞を再懸濁する培地を指す。収集採取物には、成長培地、または収集された細胞もしくは細胞画分を再懸濁するのに適している他の培地について、上で列挙した組成物のいずれかを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、該収集培地は、水、緩衝液、浸透剤、抗分解剤等を含有してもよい。いくつかの実施形態では、本発明は、収集採取物から生体高分子を分離する方法に関する。

本発明の生体高分子は、細胞培養を含む組成物から単離され得、ここで、該細胞培養は、成長培地、および例えば、哺乳類細胞等の種々の真核細胞を含む。本発明の哺乳類細胞には、培養において増殖することが可能な、任意の哺乳類細胞が含まれる。例示的な哺乳類細胞には、例えば、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ ＤＧ４４を含む）、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＶ１（Ｃｏｓ；Ｃｏｓ−７を含む）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｃ１２７、骨髄腫細胞株（特に、マウス）、ＰＣ１２、ＨＥＫ−２９３細胞（ＨＥＫ−２９３ＴおよびＨＥＫ−２９３Ｅを含む）、ＰＥＲ Ｃ６、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ならびにＷ１３８細胞が含まれる。また、前述の細胞のいずれかに由来する哺乳類細胞を使用してもよい。

本発明の生体高分子を、成長培地、ならびに例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌等の種々の原核または非哺乳類細胞、ならびに例えば、緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等のシュードモナス属、例えば、サッカロミセス属、ピチア属、ハンゼヌラ、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シュワニオミセス属、およびヤロウイア属等の酵母細胞、例えば、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）、チョウ類（Ｌｉｐｉｄｏｔｅｒａ）、蛾類（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）、ショウジョウバエ属およびＳｆ９のような昆虫細胞、または例えば、シロイヌナズナ等の植物細胞内の種々の種を含む、細胞培養から単離することができる。当業者は、対象の生体高分子に応じて、適切な原核または非哺乳類細胞を選択することができる。

本発明に従って、種々の生体高分子を、単離し得る。いくつかの実施形態では、該生体高分子は、抗体、組み換えタンパク質、または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該タンパク質は、可溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、該タンパク質は、抗体である。

本明細書に使用される、「生物学的な生体高分子」または「生体高分子」という用語は、１ｋＤａを超える分子量を有する分子を指し、これを、生物から、または例えば、真核（例えば、哺乳類）細胞培養または原核（例えば、細菌）細胞培養等の細胞培養から単離することができる。いくつかの実施形態では、生体高分子という用語は、５０ｋＤａ、７５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２５ｋＤａ、または１５０ｋＤａを超える分子量を有する分子を指す。いくつかの実施形態では、該用語の使用は、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、ポリペプチド（タンパク質等）、炭水化物、および脂質のようなバイオポリマー等のポリマーを指す。いくつかの実施形態では、「生体高分子」という用語は、タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、「生体高分子」という用語は、組み換えタンパク質または融合タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、該タンパク質は、可溶性である。いくつかの実施形態では、該生体高分子は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体等の抗体である。

本明細書に使用される、「タンパク質」という用語は、単数の「タンパク質」、ならびに複数の「タンパク質」を包含することを意図する。したがって、本明細書に使用される、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「アミノ酸鎖」が挙げられるが、これらに限定されない用語、またはアミノ酸の鎖（単数または複数）を指すのに使用される、いずれかの他の用語を、「タンパク質」の定義に含み、「タンパク質」という用語を、これらの用語のいずれかの代わりに、または置き換え可能に使用し得る。該用語には、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然由来のアミノ酸による修飾等の翻訳後の修飾を行っているタンパク質がさらに含まれる。タンパク質には、例えば、ダイマー、トリマー等のマルチマーを形成する、ポリペプチドも含まれる。タンパク質という用語には、例えば、タンパク質（またはタンパク質のフラグメント）を、抗体（または抗体のフラグメント）に付着する、遺伝子融合プロセスにより産生されるタンパク質等の融合タンパク質も含まれる。本発明の融合タンパク質の例には、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＥ、ならびにリンホトキシンβ受容体免疫グロブリンＧ１から結合されたＦｃ領域からなるジスルフィド結合された二官能性タンパク質が含まれる。

本発明の方法に従って、抗体を精製し得る。「抗体」という用語は、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的な、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリにより生成されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体への抗−Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを指す。いくつかの実施形態では、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体を指す。「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原を免疫学的に結合する抗原結合部位を含有する分子も指す。本発明の方法によって精製され得る免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれかの種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）、またはサブクラスからなり得る。本発明の抗体には、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体も含まれる。本発明の抗体の例には、ナタリズマブ（ヒト化抗−ａ４インテグリンモノクローナル抗体）、ヒト化抗−αＶβ６モノクローナル抗体、ヒト化抗−ＶＬＡ１ ＩｇＧ１κモノクローナル抗体；ｈｕＢ３Ｆ６（ヒト化ＩｇＧ１／κモノクローナル抗体）等の市販抗体が含まれる。

本発明の方法によって精製された抗体は、鳥類および哺乳類を含む任意の動物起源からであり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製された抗体は、ヒト、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ抗体である。本明細書に使用される、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体、ならびにヒト免疫グロブリンライブラリからの、または１つ以上のヒト免疫グロブリンのための遺伝子組み換えの動物から単離される抗体、ならびに内因性免疫グロブリンを発現しない抗体が含まれる。例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号を参照のこと。いくつかの実施形態では、「抗体」という用語は、ナタリズマブ（ＴＹＳＢＡＲＩ（登録商標），Ｅｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の市販抗体を含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の方法によって精製され得る抗体には、例えば、自然抗体、無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント（例えば、１つ以上の抗原に結合するおよび／または認識する抗体フラグメント）、ヒト化抗体、ヒト抗体（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）、米国特許第５，５９１，６６９号および第５，５４５，８０７号）、抗体ファージライブラリから単離された抗体および抗体フラグメント（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２）、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））が含まれる。本発明の方法によって精製され得る抗体は、ＮもしくはＣ末端において異種ポリペプチドに組み換え技術によって融合され得る、またはポリペプチドまたは他の組成物に化学的に共役され得る（共有結合的な、および非共有結合的な共役を含む）。例えば、本発明の方法によって精製される抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子、および異種ポリペプチド等のエフェクタ分子、薬物、または毒素に組み換え技術によって融合されるか、または共役され得る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０８４９５号、第ＷＯ９１／１４４３８号、第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、およびＥＰ第３９６，３８７号を参照のこと。

いくつかの実施形態では、本発明の生体高分子または組成物は、薬学的に許容可能である。「薬学的に許容可能な」とは、音声医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に比例する過剰な毒性または他の合併症がなく、ヒトおよび動物の組織と接触するのに適している、生体高分子または組成物を指す。

いくつかの実施形態では、該生体高分子は、可溶性タンパク質である。「可溶性」という用語は、例えば、細胞質、ペリプラズムまたは細胞外培地等の細胞宿主の親水性、または水性環境に、実質的に局在するタンパク質の傾向を指す。したがって、細胞分別中、可溶性タンパク質は、一般的に、宿主細胞の細胞質、ペリプラズム、または細胞外成分で、実質的に単離され得る。いくつかの実施形態では、可溶性タンパク質は、洗浄剤の不在下で、水溶性である。当業者は、ポリペプチドの細胞局在、あるいはタンパク質の細胞分別も完全ではないことを認識されよう。したがって、「実質的に局在する」という句は、タンパク質の５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が、例えば、細胞質、ペリプラズム、または細胞外培地等の指定された細胞局在に存在するタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、該タンパク質は、細胞質タンパク質、または膜結合タンパク質であり得る。

本発明は、不純物を含有する組成物から生体高分子を単離するのに有用である。いくつかの実施形態では、該組成物は、真核細胞物質を含む。いくつかの実施形態では、該不純物は、成長培地成分、タンパク質、脂質、核酸、リボ核酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。

「不純物」という用語は、本発明の生体高分子とは異なる組成物の１つ以上の成分を指す。いくつかの実施形態では、該不純物には、無傷哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）またはマウス骨髄腫細胞（ＮＳＯ細胞））、または部分細胞（例えば、細胞残屑）を含み得る。いくつかの実施形態では、該不純物は、タンパク質（例えば、ＨＣＰ等の可溶性もしくは不溶性タンパク質、またはタンパク質のフラグメント）、脂質（例えば、細胞壁物質）、核酸（例えば、染色体もしくは染色体外ＤＮＡ）、リボ核酸（ｔ−ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）、またはこれらの組み合わせ、または対象の生体高分子とは異なるいずれかの他の細胞残屑を含む。いくつかの実施形態では、該不純物は、対象の生体高分子を生成した、または含有した宿主生物が起源であり得る。例えば、不純物は、対象のタンパク質を発現した原核または真核細胞の細胞成分（例えば、細胞壁、細胞タンパク質、ＤＮＡもしくはＲＮＡ等）であり得る。いくつかの実施形態では、該不純物は、宿主生物からのものではなく、例えば、不純物は、細胞培養培地もしくは成長培地、緩衝液、または培地添加物からのものであり得る。本明細書に使用される、不純物には、単一の望ましくない成分、またはいくつかの望ましくない成分の組み合わせを含み得る。

種々の手段を使用して、１つ以上の不純物から本発明の生体高分子を分離することができる。不純物から生体高分子を分離する手段の例としては、沈殿、免疫沈殿、クロマトグラフィ、濾過、限外濾過、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、Ｎｕｔｓｈｅ濾過、交差流濾過、遠心分離、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、不純物から生体高分子を分離する工程は、沈殿によって達成され、即ち、「分離する」および「沈殿する」という語は、置き換え可能であり得る。沈殿とは、溶液中の固体組成物の製剤を指す。いくつかの実施形態では、該固体は、溶液よりも高密度からなり、溶液相から「析出し」、溶液の底に沈降する（堆積）。いくつかの実施形態では、沈殿は、遠心分離によって強化または加速し得る。

いくつかの実施形態では、該組成物に該遷移金属および該ポリアルキレングリコールを添加すると、該生体高分子は、実質的に、該組成物から離れて沈殿する。いくつかの実施形態では、沈殿した生体高分子から単に該不純物をデカントし、それによって、該生体高分子を単離する。いくつかの実施形態では、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の該生体高分子は、該組成物から沈殿される。

いくつかの実施形態では、該不純物から生体高分子を分離する工程は、フィルタの使用によって達成される。「濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」または「濾過する（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）」という用語は、特定の細孔直径の１つ以上の半透性の細胞膜（または培地）に組成物を通過させることによって、組成物から懸濁粒子を除去するプロセスを指す。濾過に言及する場合、「透過流れ」という用語は、濾過中、フィルタ孔隙を通過する組成物の画分を指す。濾過に言及する場合、「固体流れ」という用語は、濾過中、フィルタ上に残留するか、またはフィルタ孔隙を通過しない組成物の画分を指す。いくつかの実施形態では、濾過後、本発明の生体高分子は、実質的に、透過流れ（即ち、それはフィルタ孔隙を通過し、制御される）に存在するが、不純物（例えば、細胞残屑、ＤＮＡ、および／またはＨＣＰ）は、実質的に、固体流れに存在する。いくつかの実施形態では、濾過後、本発明の生体高分子は、実質的に、固体流れに存在するが、不純物は、実質的に、透過流れに存在する。いくつかの実施形態では、「ベンチスケールの」濾過を使用して、工業規模の濾過のための適切な条件を予測することができる。

特定の生体高分子を精製するための好適なフィルタの種類、化学、およびモジュール構成は、当業者には既知であり、例えば、濾過され得る組成物の成分の量および大きさ、濾過され得る組成物の容量、ならびに濾過され得る組成物の細胞密度および生存率等の種々の要因に基づいて、選択することができる。例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ｔ，Ｂｏｙｃｈｙｎ Ｍ，Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ Ｔ，Ｂｕｌｍｅｒ Ｍ，Ｍｏｒｅ Ｊ，Ｈｏａｒｅ，Ｍ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８３（４），ｐｐ．４５４−４６４（２００３）を参照のこと。いくつかの実施形態では、膜フィルタ、プレートフィルタ、カートリッジフィルタ、バッグフィルタ、圧力葉フィルタ、回転ドラムフィルタ、または真空フィルタ等のフィルタが、使用され得る。いくつかの実施形態では、デプスフィルタ（ｄｅｐｔｈ ｆｉｌｔｅｒ）またはクロスフィルタ（ｃｒｏｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）が使用される。本発明に適用される、交差流フィルタモジュールの種類には、中空糸、管状、平板（加圧板）、スパイラル型、または渦流れ（例えば、回転）フィルタ形状が含まれる。いくつかの実施形態では、接線流フィルタが使用される。いくつかの実施形態では、接線流（交差流）の形態において、中空糸、管状、および平板膜モジュールが、利用された。採用され得る商業的に入手可能なフィルタは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の種々の製造供給元により製造される。いくつかの実施形態では、デッドエンドフィルタが使用される。採用され得る商業的に入手可能なデッドエンドフィルタは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、およびＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等の種々の製造供給元により製造される。

本発明のフィルタの孔径は、単離され得る生体高分子の種類および組成物に存在する不純物の種類に従って異なり得る。いくつかの実施形態では、フィルタの孔径は、０．１μｍ〜４．０μｍ、０．２μｍ〜２．０μｍ、または０．２μｍ〜１．５μｍの直径であり得る。

濾過中、フィルタを通して、収集採取物等の組成物の活動は、膜抵抗によって生じる膜間圧を生成する。膜表面が、細胞物質で堆積する（または極性化する）場合、一定の流速で細胞膜を横断して流れることに対する抵抗性が増加し、このようにして、駆動力または膜間圧を増加させる。細胞膜の表面付近の細胞物質の量が減少する、または細胞膜が極性化しなくなる合、膜間圧は、実質的に、一定のままである傾向がある。膜電位を計算する方法は、当業者には既知であり、これには、圧力トランスデューサー（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）またはゲージの使用が含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、膜間圧は、供給および固体流れの出口圧と透過流れの圧力との間の差異を得ることによって計算することができる。

概して、組成物（例えば、収集採取物）の濾過中、フィルタの膜間圧は、いっそう多くの組成物をフィルタに負荷する場合、有意に増加する。例えば、いくつかの実施形態では、膜間圧は、フィルタの孔が詰まるにつれて、濾過プロセスの開始（組成物の第１の量が、フィルタ中に設置される場合）から濾過プロセスの終了（典型的に、細胞物質の７〜１０倍の濃縮および３〜５倍の透析濾過に続く）まで、５ｐｓｉ、７ｐｓｉ、１０ｐｓｉ、１５ｐｓｉ、または２０ｐｓｉもしくはそれ以上増加する。したがって、膜間圧に言及する場合、「実質的に一定（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）」という用語は、濾過の経過にわたって、４ｐｓｉ、３ｐｓｉ、または２ｐｓｉを超えて増加しない、膜間圧を指す。いくつかの実施形態では、本発明は、組成物中の生体高分子を精製する方法を対象にし、該方法は、（ａ）該組成物にポリアルキレングリコールを添加する工程と、（ｂ）該組成物に遷移金属を添加する工程と、（ｃ）細胞膜を通して該組成物を濾過する工程と、を含み、該濾過する工程は、膜間圧をもたらし、ここで、該膜間圧は、濾過する工程の間、実質的に一定のままである。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、タンパク質のフィルタ排出を減少させる。「タンパク質のフィルタ排出」という用語は、等式Ｒ＝（１−［Ｃ_Ｐ／Ｃ_Ｒ］）によって例証され得、式中、Ｒは、タンパク質のフィルタ排出係数を示し、Ｃ_Ｐは、対象の生体高分子の瞬時の透過濃度であり、Ｃ_Ｒは、対象の生体高分子の瞬時の固体濃度である。いくつかの実施形態では、本発明は、該組成物にポリエチレングリコールを添加する工程と、該組成物に遷移金属を添加する工程と、該生体高分子を濾過する工程と、を含む、組成物中の生体高分子を単離する方法を対象にし、ここで、タンパク質のフィルタ排出係数の値は、ポリアルキレングリコールおよび／または遷移金属を添加しない、組成物中の生体高分子と比較して、所定の容量処理量が低い。

生体高分子を単離する場合、いくつかの実施形態では、大容量の組成物（例えば、収集採取物）が、例えば、市販の製造プロセス中、存在し得る。大容量は、精製プロセスにとっていくつかの課題がある。例えば、フィルタを通して流速の少量の変化が、単離される生体高分子の回収において有する効果は、大容量を使用する場合、増幅される。同様に、大容量を使用する場合、収穫採取物における細胞密度の増加が生成物回収において有する効果もまた、増幅される。したがって、大容量の組成物は、増幅され、かつ少量の使用と比較して、より大きな悪影響を及ぼす独自の問題がある。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、大容量の組成物に存在する生体高分子を単離する方法を対象にする。「大容量」という用語は、市販のおよび／または工業生成物の生体高分子に関連する容量を指す。いくつかの実施形態では、「大容量」という用語は、１０〜３０，０００リットル、２０〜２０，０００リットル、５０〜１５，０００リットルを指す。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、該組成物を遠心力に供する（即ち、遠心分離）ことによって、不純物から該生体高分子を分離する工程を含み、遠心分離が、上清および沈渣を形成する。遠心分離の種々の形態は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｂｏｙｃｈｙｎ Ｍ，Ｄｏｙｌｅ Ｗ，Ｂｕｌｍｅｒ Ｍ，Ｍｏｒｅ Ｊ，Ｈｏａｒｅ Ｍ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６９（１），ｐｐ．１−１０（２０００）を参照のこと。いくつかの実施形態では、遠心分離は、不純物（細胞または細胞残屑）および濃縮された細胞／細胞残屑沈渣が実質的にない、上清を形成する。遠心分離に言及する場合、「沈渣（ｐｅｌｌｅｔ）」または「固体ケーキ（ｓｏｌｉｄ ｃａｋｅ）」という用語は、遠心分離中、沈殿され（または沈渣され）、細胞／細胞残屑集団を形成する、組成物の画分を指す。「上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）」という用語は、遠心分離中、沈殿されない（または沈渣されない）組成物の画分、例えば、該組成物中の水相に残留する組成物の画分を指す。いくつかの実施形態では、遠心分離後、本発明の生体高分子は、実質的に、上清に存在する（即ち、それは、該組成物の液体画分中に実質的に懸濁されたままである）。いくつかの実施形態では、遠心分離後、本発明の生体高分子は、実質的に、沈渣に存在する（例えば、それは、溶液から凝結するか、または遠心分離から得られる沈渣に存在する）。いくつかの実施形態では、該生体高分子の５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％（ｗ／ｗ）は、沈渣に存在する。いくつかの実施形態では、密度勾配を使用して、該不純物から該生体高分子を分離する。したがって、いくつかの実施形態では、該生体高分子および該不純物はともに、遠心分離後、異なる濃度、ひいては、遠心分離装置の異なる場所にもかかわらず、上清に残留する。

種々の遠心分離装置が、使用され得る。いくつかの実施形態では、該遠心分離は、ディスクスタック（ｄｉｓｃ ｓｔａｃｋ）遠心分離機によって達成され得る。いくつかの実施形態では、「ベンチスケールの」濾過を使用して、工業規模の濾過のための適切な条件を推定することができる。遠心分離の変数は、対象の生体高分子の最適な単離を達成するために異なり得る。例えば、いくつかの実施形態では、生体高分子回収の質および／または生体高分子回収の量を増加させるために、種々の回転速度または流速が、使用され得る。

本発明は、初期高密度の生物学的物質を有する細胞培地を含有するバイオリアクターから生体高分子を単離する場合、有用であり得る。例えば、いくつかの高密度培地では、フィルタを横切る膜間圧を、多くの場合、高濃度の細胞物質のため、膜表面の付着物の結果として推定されるように、著しく低下する。同様に、フィルタ付着物の増加は、回収した生体高分子の量に影響を及ぼし得、産出を低下させ、透過流れにおいて、比較的に高い不純物レベルをもたらす。場合によっては、フィルタの機械的特性を超えた値まで、膜間圧を増加させ、ひいては、完了する前に操作を停止させ、著しく低い産出高を生じ得る。フィルタ膜間圧を低減するために、固体流れにおけるタンパク質回収を増加し、固体流れにおける不純物の量を削減し、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、濾過前に、ポリアルキレングリコールおよび遷移金属を添加する工程を含み、これは、他の不純物（ＤＮＡ等）の沈殿とともに、大きな細胞および細胞残屑の凝集を引き起こす。大粒子への不純物（細胞、細胞残屑、およびＤＮＡ）の凝集は、フィルタの表面付近の組成物の物質移動を改善し、ひいては、所定の透過流れの流量または流速でフィルタを横切る膜間圧を低減し得る。

いくつかの実施形態では、高細胞密度の組成物（例えば、収集採取物）から生体高分子を収集するのに有益であるか、または望ましい。高細胞密度の組成物は、正常な細胞密度の組成物と比較して独自の問題がある。例えば、高細胞密度の組成物は、組成物に存在するより高い量の不純物を有し、それによって、精製プロセス中、除去する必要がある不純物の量を増加させ得る。例えば、高細胞密度の組成物は、より迅速にフィルタを汚染し、それによって、組成物の濾過を妨げ得る。いくつかの実施形態では、高細胞密度の組成物は、より多くのフィルタ、またはより大きい表面積を有するフィルタの使用を必要とする。これらの要件は両方とも、濾過および／または製造損失に関連するより多くの費用をもたらし得る。本発明では、ポリアルキレングリコールおよび遷移金属を、該組成物に添加し、それによって、一部の不純物を除去し、より高い細胞密度の組成物の精製を可能にする。したがって、本発明におけるいくつかの実施形態は、高細胞密度の組成物に存在する生体高分子を単離する方法を対象にする。「高細胞密度」という用語は、一般に、哺乳類細胞に対して、１ｍＬあたり約１×１０^５〜３．５×１０^７、約１．０×１０^６〜約１．０×１０^７、または約５．０×１０^６〜約９．０×１０^６細胞の収集採取物の細胞密度を指す。当然ながら、当業者により、種々の細胞は、従来は、異なる細胞密度で成長することを理解されよう。したがって、いくつかの実施形態では、「高細胞密度の」細胞培地とは、その細胞株のために従来は実行される密度よりも高い密度で細胞に含有する細胞培地を指す。

本発明のいくつかの実施形態では、該組成物のｐＨは、該不純物から該生体高分子を分離する前に調節される。例えば、いくつかの実施形態では、該組成物のｐＨは、収集採取物のｐＨよりも低いｐＨに調節される。例えば、収集採取物を含むもの等の本発明の組成物は、一般に、調節しないで、約６．０〜約８．０、約６．５〜約７．５、または約６．８〜約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、該収集採取物のｐＨよりも低いいずれかのｐＨは、本発明の単離に使用され得る。いくつかの実施形態では、該組成物のｐＨは、約１．０〜約６．０、約２．０〜約５．５、約３．０〜約６．５、約３．０〜約５．０、約４．０〜約５．０、約４．０〜約４．７、約４．３〜約５．０、または約４．７〜約５．０の範囲内のｐＨまで低減させる。いくつかの実施形態では、該組成物のｐＨは、約４．０〜約４．７の範囲内のｐＨまで低減させる。いくつかの実施形態では、該ｐＨは、ｐＨ約３．５まで低減させる。いくつかの生体高分子に対して、３．５より低いｐＨは、対象の生体高分子の変性または不安定性をもたらし、したがって、望ましくない。いくつかの実施形態では、該組成物のｐＨは、約６．０〜約１０．０、約６．５〜約９．５、約７．０〜約９．０、約７．５〜約８．５、約７．０〜約８．０、または約７．５の範囲内のｐＨまで上昇させる。いくつかの実施形態では、該組成物のｐＨは、約７．０〜約９．０の範囲内まで上昇させる。いくつかの実施形態では、該ｐＨは、ｐＨ約８．０〜約９．０まで上昇させ得る。

本発明の該組成物のｐＨは、種々の手段によって調節され得る。いくつかの実施形態では、該ｐＨは、該組成物に酸または塩基を添加することによって低減させる。好適な酸としては、過塩素酸（ＨＣｌＯ_４）、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、臭化水素酸（ＨＢｒ）、塩酸（ＨＣｌ）、硝酸（ＨＮＯ_３）、硫酸（二陽子）（Ｈ_２ＳＯ_４）等の強酸、酢酸（ＣＨ_３ＣＯＯＨ）（例えば、氷酢酸）、クエン酸（Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７）、ギ酸（ＨＣＯＯＨ）、シアン化水素酸（ＨＣＮ）、硫酸水素塩イオン（ＨＳＯ_４ ⁻）等の弱酸、または上に列挙される酸のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好適な塩基としては、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）_２）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化ストロンチウム（Ｓｒ（ＯＨ）_２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）_２）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）等の強塩基、またはアンモニア等の弱塩基、または上に列挙される塩基のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、該組成物のｐＨは、リン酸塩緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム）、重炭酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、トロメタミン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ならびにこれらの組み合わせ等の緩衝液の使用まで調節され得る。

いくつかの実施形態では、該組成物への遷移金属の添加は、単離すると、対象の生体高分子、ならびに不純物の共沈を生じ、該生体高分子の還元された純度を生じる。いくつかの実施形態では、該組成物へのポリエチレングリコールの添加は、対象の生体高分子の回収を増加させるのに適している。「回収の増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）」という用語は、同一の精製方法であるが、遷移金属またはポリアルキレングリコールを添加しない方法と比較して、（ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の両方の添加を伴う）本発明の方法との比較を指す。例えば、方法Ａは、（該収集採取物への遷移金属の添加を含まないことを除いては）本発明の方法であり、１００ｍｇの対象の生体高分子を産出し、方法Ｂは、（方法Ｂは、該収集採取物への遷移金属の添加を含むことを除いては）方法Ａと同一であり、１１０ｍｇの生体高分子を産出する場合、方法Ｂは、１０％の「回収の増加」を有することが決定され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、該生体高分子の回収を、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または２５％を超えて増加させる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、回収を、最大１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または５０％まで増加させる。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の添加が、該生体高分子の回収を、３％を超えて増加させる。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の回収が、該生体高分子の回収を、１０％を超えて増加させる。

本発明のいくつかの実施形態では、ポリアルキレングリコールを該組成物に添加する。本発明のいくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、該遷移金属は、亜鉛であり、該分離する工程は、該溶液中の該生体高分子を沈殿させ、その後、該沈殿物を分離するように該組成物を遠心分離にかけることによって行われ、該生体高分子は、抗体である。

本発明のいくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、該遷移金属は、亜鉛であり、該分離する工程は、該溶液中の該生体高分子を沈殿させ、その後、該沈殿物を分離するように該組成物を濾過することによって行われ、該生体高分子は、抗体である。

本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法は、濾過プロセスの堅牢性を増加させる方法を対象にし、該方法は、（ａ）組成物にポリアルキレングリコールを添加する工程と、（ｂ）該組成物に遷移金属を添加する工程と、（ｃ）細胞膜を通して該組成物を濾過する工程と、を含む。「堅牢性の増加」という用語は、所定のフィルタに対するより広範囲の流速を使用するが、膜間圧、不純物濃度、または製造損失を増大させない、能力を指す。「堅牢性の増加」という用語は、所定のフィルタに対するより大容量、またはより高い細胞密度の収集採取物を濾過する、膜間圧、不純物濃度、または製造損失を増加させない、能力も指す。

本発明のいくつかの実施形態では、該方法は、濾過前、例えば、収集採取物等の生体高分子を含む組成物を浄化する方法に示され、該方法は、（ａ）該組成物にポリアルキレングリコールを添加する工程と、（ｂ）該組成物に遷移金属を添加する工程と、（ｃ）該組成物中の不純物から生体高分子を分離する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、組成物を浄化する工程は、Ｈａｃｈ ２１００ＡＮ Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ（Ｈａｃｈ Ｃｏ．，Ｌｏｖｅｌａｎｄ，ＣＯ）等の濁度計によって測定される、濁度の低下と相関する。

本発明の方法の工程は、種々の順序で順序付けることができる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールを添加する工程は、遷移金属を添加する工程および該不純物から生体高分子を分離する工程の前に存在する。いくつかの実施形態では、まず、該ポリアルキレングリコールを添加し、次いで、該遷移金属を添加し、次いで、生体高分子を不純物から分離する。他の実施形態では、まず、該遷移金属を添加し、第２に、該ポリアルキレングリコールを添加し、次いで、該生体高分子を分離する。いくつかの実施形態では、１つ以上の精製手順は、（ａ）ポリアルキレングリコールを添加する工程、（ｂ）遷移金属を添加する工程、あるいは（ｃ）該不純物から生体高分子を分離する工程の間に存在し得る。代替的に、本発明の方法の工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）は、例えば、工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の間に追加の精製手順がない、連続的なものであり得る。しかしながら、工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が連続的である場合、追加の精製手順は、工程（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前、または後に存在し得る。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールおよび該遷移金属は、組成物を添加する前に、共に混合し、一般の原料を形成する。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールおよび該遷移金属を、該組成物に同時に添加する。いくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールおよび該遷移金属を、任意の順序で、該組成物に逐次添加する。

いくつかの実施形態では、沈殿前の生体高分子の濃縮は、該生体高分子の沈殿および回収に必要とされるポリアルキレングリコールおよび／または遷移金属の量を低減するのに有用である。例えば、沈殿前の濃縮は、ポリアルキレングリコールおよび／または遷移金属の量を、約２〜約４０倍減少させ得る。限外濾過、精密濾過、および生体高分子濃縮の他の方法は、沈殿前濃縮の有効な方法である。

いくつかの実施形態では、該沈殿物を洗浄して、生体高分子を再溶解する前に、不純物をさらに除去し得る。例えば、該沈殿物は、水またはポリアルキレングリコール（例えば、約０．５％〜約５％（ｗ／ｖ）の濃度で）、遷移金属（例えば、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、芳香族複素環化合物（例えば、イミダゾール）、または様々な緩衝液を含有する溶液が挙げられるが、これらに限定されない、１つもしくは複数の溶液（または溶液の組み合わせ）で洗浄され得る。いくつかの実施形態では、洗浄は、溶液の添加、溶液中の沈殿物の沈降、および／または沈殿物からの溶液のデカントもしくはサイホニング（ｓｉｐｈｏｎｉｎｇ）によって達成される。

いくつかの実施形態では、該生体高分子は、１つ以上の生物活性、次いで、沈殿および再溶解を保持する。いくつかの実施形態では、該生体高分子は、１つ以上の生物活性、次いで、沈殿、洗浄、および再溶解を保持する。「生物活性」という用語は、該生体高分子の天然由来の機能を指す（「天然由来」には、タンパク質、抗体、または酵素等の生体高分子の突然変異を経由して誘発される異常もしくは変性した機能も含み得る）。抗体に対するある生物活性の一例としては、抗原への抗体の特異結合が含まれる。酵素に対する生物活性の一例としては、特異的酵素または酵素の触媒活性が含まれる。いくつかの実施形態では、該生体高分子は、（沈殿前、または沈殿および洗浄前の該生体高分子の比活性と比較して）約５０％〜約１００％の範囲の生物活性を保持する。例えば、該生体高分子は、沈殿前、または沈殿および洗浄前のその比生物活性の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％を保持し得る。

いくつかの実施形態では、該溶液のｐＨは、該生体高分子から遷移金属（亜鉛等）の再溶解および／または非結合にさらに影響を及ぼすように低減させる。

実施例
本発明は、具体例としてさらに詳細に説明される。以下の実施例は、例証目的で提示され、いかようにも本発明を限定することを意図しない。当業者は、本発明に従って、代替的な実施形態を得るために変更または修正され得る種々の重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。

実施例１
細胞培地化合物からの種々の抗体および他のタンパク質の沈殿を調査するために、いくつかの方法を試験し、これには、以下のものを含む。（１）単一の添加において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３５０のみを用いた、沈殿、（２）単一の添加において、塩化亜鉛のみを用いた、沈殿、（３）単一の添加において、ＰＥＧと塩化亜鉛との組み合わせを用いた、沈殿、（４）漸増削減において、ＰＥＧのみを用いた（即ち、ＰＥＧの増分加算）、沈殿、ならびに（５）漸増削減において、ＰＥＧと亜鉛との組み合わせを用いた（即ち、ＰＥＧおよび／もしくは亜鉛の漸増添加）、沈殿。

単一の削減においてＰＥＧのみを用いて、抗体Ａｂ Ｃ、Ａｂ Ｄ、およびＡｂ Ｅの沈殿を調査するために、該抗体を含有する浄化された収集採取物は、２Ｍ トリス塩基を用いて、ｐＨ８．０に調節した。次いで、該収集採取物を、２〜８℃の温度に調節し、精製プロセスを通してその温度で放置した。次いで、該収集採取物を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過した。１０％ ＰＥＧ３３５０濃度に達するように、７０％ ＰＥＧ３３５０原料を濾過した物質に添加した。該物質を、１０分間撹拌し、１時間放置した。次いで、１０％ ＰＥＧ組成物は、３，０００ｘｇで１０分間、遠心分離にかけ、その後、上清をデカントした。得られた沈渣を、１時間、振動／混合することによって、ＰＥＧ−Ｚｎの再懸濁緩衝液中で再懸濁した。再懸濁緩衝液は、緩衝液およびキレート剤を含む。

収集試料、再懸濁試料、および上清を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってアッセイし、いかなる希釈または濃縮要因も考慮して、純度および回収率を決定した。さらに、該収集試料および再懸濁試料を、ＥｌｉｓａおよびＱＰＣＲ方法によって、ＨＣＰおよびＤＮＡ含有量に関してアッセイした。「力価」という用語は、精製前の原料中の生成物の濃度を指す。結果を表１に示す。

実施例２
単一の削減において塩化亜鉛のみを用いて、抗体Ａｂ Ｃ、Ａｂ Ｄ、およびＡｂ Ｅの沈殿を調査するために、該抗体を含有する浄化された収集採取物は、２Ｍ トリス塩基を用いて、ｐＨ７．２に調節した。次いで、該収集採取物を、２〜８℃の温度に調節し、精製プロセスを通してその温度で放置した。該収集採取物を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過した。最終濃度が１０ｍＭ ＺｎＣｌ_２に達するように、２５０ｍＭ 塩化亜鉛原料を濾過した物質に添加した。該物質を、１０分間撹拌し、１時間放置した。

次いで、１０ｍＭ ＺｎＣｌ_２組成物は、３，０００ｘｇで１０分間、遠心分離にかけ、その後、上清をデカントした。得られた沈渣を、１時間、振動／混合することによって、ｐＨ７．２で、ＰＥＧ−Ｚｎの再懸濁緩衝液中で再懸濁した。

収集試料、再懸濁試料、および上清を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってアッセイし、いかなる希釈または濃縮要因も考慮して、純度および回収率を決定した。さらに、該収集試料および再懸濁試料を、ＥｌｉｓａおよびＱＰＣＲ方法によって、ＨＣＰおよびＤＮＡ含有量に関してアッセイした。結果を表２に示す。

実施例３
単一の添加において、ＰＥＧと塩化亜鉛との組み合わせを用いて、抗体Ａｂ ＣおよびＡｂ Ｆの沈殿を調査するために、該抗体を含有する浄化された採取物は、２Ｍ トリス塩基を用いて、ｐＨ７．２に調節した。次いで、該収集採取物を、２〜８℃の温度に調節し、精製プロセスを通してその温度で放置した。次いで、該収集採取物を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過した。

１回目の削減は、濃度が１．６％ ＰＥＧに達するように、７０％ ＰＥＧ３３５０原料を濾過した物質に添加し、そして、最終濃度が２．７ｍＭ ＺｎＣｌ_２に達するように、２５０ｍＭ ＺｎＣｌ_２を濾過した物質に添加する工程で構成された。次いで、該物質を、１０分間撹拌し、１時間放置した。次いで、得られた試料を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過し（「１濾液削減」）、濾液を保持した。

２回目の削減は、濾過試料の最終濃度が５．５％、および塩化亜鉛の最終濃度が５ｍＭになるように、ＰＥＧを添加することにより行われた。本物質を１時間放置した。

得られた沈殿物は、３，０００ｘｇで１０分間、遠心分離にかけ、その後、上清をデカントした。得られた沈渣を、１時間、振動／混合することによって、ｐＨ７．２で、ＰＥＧ−Ｚｎの再懸濁緩衝液中で再懸濁した。

収集試料、１回目の削減濾液、上清、および再懸濁した試料を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってアッセイし、いかなる希釈または濃縮要因も考慮して、純度および回収率を決定した。さらに、該収集試料および再懸濁試料を、ＥｌｉｓａおよびＱＰＣＲ方法によって、ＨＣＰおよびＤＮＡ含有量に関してアッセイした。結果を表３に示す。

実施例４
２回目の漸増削減においてＰＥＧのみを用いて、抗体Ａｂ Ｆの沈殿を調査するために、該抗体を含有する浄化した収集採取物は、２Ｍ トリス塩基を用いて、ｐＨ８．０に調節した。次いで、該収集採取物を、２〜８℃の温度に調節し、精製プロセスを通してその温度で放置した。次いで、該収集採取物を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過した。

１回目のＰＥＧ削減は、濃度が４．７５％ ＰＥＧに達するように、７０％ ＰＥＧ３３５０原料を濾過した物質に添加する工程で構成された。次いで、該物質を、１０分間撹拌し、次いで、１時間放置した。次いで、得られた試料を、０．２２μｍのフィルタを通して濾過し（「１濾液削減」）、濾液を保持した。

２回目の削減は、最終濃度が１０．５％になるように、ＰＥＧを濾過試料に添加することにより行われた。本物質を、１時間放置し、得られた沈殿物は、３，０００ｘｇで１０分間、遠心分離にかけた。得られた上清をデカントし、得られた沈渣を、１時間、振動／混合することによって、ｐＨ４．０で、ＰＥＧ−Ｚｎの再懸濁緩衝液を用いて再懸濁した。

収集試料、１回目の削減濾液、上清、および再懸濁した試料を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってアッセイし、いかなる希釈または濃縮要因も考慮して、純度および回収率を決定した。さらに、該収集試料および再懸濁試料を、ＥｌｉｓａおよびＱＰＣＲ方法によって、ＨＣＰおよびＤＮＡ含有量に関してアッセイした。結果を表４に示す。

実施例５
Ａｂ Ｆ沈殿の必要条件である試薬における力価効果（濃度）を検査した。Ａｂ Ｆの収集した細胞培地流体（ＨＣＣＦ）（ＨＣＣＦの初期濃度６．５ｇ Ａｂ Ｆ／Ｌ）を、２〜８℃で、２Ｍトリス塩基を用いて、ｐＨ７．２に調節した。ＨＣＣＦを、ＰＥＬＬＩＣＯＮ−２（登録商標）５０キロダルトン（ｋＤａ）カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、３２．５ｇ／Ｌあるいは６５ｇ／Ｌまで濃縮し、次いで、６５ｇ／Ｌでの１つの試料を、ｐＨ７．２にて、約７ｍＳ／ｃｍの伝導度で、６℃で、５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液に透析濾過した（緩衝液交換した）。４つの異なる試料を以下のように生産した。細胞培地流体（ＣＣＦ）中の６．５ｇ／Ｌ Ａｂ Ｆでのもの、ＣＣＦ中の３２．５ｇ／Ｌ Ａｂ Ｆでのもの、ＣＣＦ中の６５ｇ／Ｌ Ａｂ Ｆでのもの、およびリン酸ナトリウム緩衝液中の６５ｇ／Ｌでのもの。塩化亜鉛およびＰＥＧ３３５０を、各々の試料に対する所望の収率を得るように、要求される濃度に添加した。実験条件を表５に示し、実験結果を表６に示す。

実施例６
種々のＩｇＧ１分子の沈殿における種々の他の沈殿剤の効果を調査した。抗体Ａｂ ＡあるいはＡｂ Ｂのいずれかを発現する細胞培地を、種々の量のポリエチレングリコール、塩化亜鉛、エタノール、カプリル酸、あるいはリバロールのいずれかでインキュベートした。次いで、沈殿した抗体の量を、サイズ排除クロマトグラフィ（塩化亜鉛、エタノール、カプリル酸、およびリバロールに対して）によって、またはタンパク質Ａ ＨＰＬＣによって決定した。結果を表７に示す。

上のデータは、ＰＥＧ、エタノール、および亜鉛の存在が、モノマー収率、ならびに細胞物質の除去（ＯＤ_２８０により測定される）を増加させることを示唆している。データは、カプリル酸が、モノマー収率を除去するが、ＯＤ_２８０に影響を及ぼさないことを示唆している。リバロールでは、いずれの物質も沈殿しなかった。

実施例７
製造規模の用途に必要とされる沈殿剤の量を、１０，０００Ｌの成長室に基づいて決定することができる。表８は、提案された（１）沈殿に必要とされる、エタノール、塩化亜鉛、およびＰＥＧの濃度および量、（２）沈殿剤により添加された追加の容量、（３）沈殿剤と関連する有害性、（４）さらなる下流処理に必要とされる除去問題、ならびに（５）沈殿剤の特別な処分要求、を列挙する。

実施例８
１つ以上の沈殿剤を利用する効果を、ｐＨ７．０で、Ａｂ Ｃ抗体を含有する組成物において調査した。０．５％ ＰＥＧ、１％ ＰＥＧ、２％ ＰＥＧ、あるいは４％ ＰＥＧのいずれか、および２．５ｍＭ ＺｎＣｌ_２、５ｍＭ ＺｎＣｌ_２、あるいは１０ｍＭ ＺｎＣｌ_２のいずれかを含有するように、組成物を調節した。結果を表９に示す。

以下のように、ＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２の両方の添加は、単にＰＥＧまたはＺｎＣｌ_２のみよりも著しく高い沈殿効果を提供した。沈殿効果の増加はまた、ＰＥＧまたはＺｎＣｌ_２の相加効果よりも大きかった。したがって、ＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２は、合わせて使用する場合、生成物の回収率において相乗効果を示す。

実施例９
１つ以上の沈殿剤を利用する効果を、ｐＨ８．０で、Ａｂ Ｃ抗体を含有する組成物において調査した。０．５％ ＰＥＧ、１％ ＰＥＧ、２％ ＰＥＧ、あるいは４％ ＰＥＧのいずれか、および２．５ｍＭ ＺｎＣｌ_２、５ｍＭ ＺｎＣｌ_２、あるいは１０ｍＭ ＺｎＣｌ_２のいずれかを含有するように、組成物を調節した。結果を図１０に示す。

以下のように、ＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２の両方の添加は、単にＰＥＧまたはＺｎＣｌ_２のみよりも著しく高い沈殿効果を提供した。沈殿効果の増加はまた、ＰＥＧまたはＺｎＣｌ_２の相加効果よりも大きかった。したがって、ＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２は、合わせて使用する場合、生成物の回収率において相乗効果を示す。

実施例１０
１つ以上の沈殿剤を利用する効果を、ｐＨ９．０で、Ａｂ Ｃ抗体を含有する組成物において調査した。０．５％ ＰＥＧ、１％ ＰＥＧ、２％ ＰＥＧ、あるいは４％ ＰＥＧのいずれか、および２．５ｍＭ ＺｎＣｌ_２、５ｍＭ ＺｎＣｌ_２、あるいは１０ｍＭ ＺｎＣｌ_２のいずれかを含有するように、組成物を調節した。結果を図１１に示す。

以下のように、ＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２の両方の添加は、単にＰＥＧまたはＺｎＣｌ_２のみよりも著しく高い沈殿効果を提供した。この相乗的な沈殿効果はまた、ＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２を伴う、期待された相加効果よりも大きかった。

実施例１１
種々の他の抗体の沈殿における、ＰＥＧ、ＺｎＣｌ_２、および両方の組み合わせの効果を調査した。４つの異なる抗体：２つのＩｇＧ１抗体、および２つのＩｇＧ４抗体を試験した。生成物の回収率の結果を表９に表す。

表９のデータは、ＰＥＧとＺｎＣｌ_２との組み合わせが、種々の種類およびクラスの抗体の沈殿における相加効果よりも大きいことを示す。例えば、抗体Ａｂ Ｃを含む組成物に５％ ＰＥＧ（４％）および１０ｍＭ ＺｎＣｌ_２（３５％）を添加する際の期待された相加効果は、３９％であった。しかしながら、抗体Ａｂ Ｃの９１．１％が沈殿するため、相乗効果が、観察される。

実施例１２
Ｎｕｔｓｃｈｅ濾過で捕捉し、沈殿物を洗浄することにより、濃縮後、Ａｂ Ｆの沈殿を行った。

Ａｂ Ｆの収集した細胞培地流体（ＨＣＣＦ）（ＨＣＣＦの初期濃度６．７ｇ Ａｂ Ｆ／Ｌ）を、２〜８℃で、２Ｍトリス塩基を用いて、ｐＨ７．２に調節した。ＨＣＣＦを、ＰＥＬＬＩＣＯＮ−２（登録商標）５０キロダルトン（ｋＤａ）カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、６７ｇ／Ｌまで濃縮し、次いで、試料を、ｐＨ７．２にて、５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液に透析濾過した（緩衝液交換した）（注：濃縮は、様々な精密濾過／限外濾過膜およびフィルタもしくは方法、例えば、遠心力緩衝液交換または撹拌細胞等の他の濃縮方法を用いて、達成され得る）。激しく撹拌しながら、ｐＨ３．０で、２５０ｍＭ 塩化亜鉛を含有する原液を、最終濃度が２．５ｍＭになるように、濃縮した試料に単回ボーラスで添加した。塩化亜鉛を添加した後、３０％ ＰＥＧ３３５０および１００ｍＭ イミダゾールを、最終濃度が１．５％ ＰＥＧ３３５０および１０ｍＭ イミダゾールになるように、該撹拌試料に単一ボーラスで直ちに添加した。得られた沈殿物を、３０分間撹拌した。次いで、珪藻土（ＣＥＬＰＵＲＥ（登録商標）１０００）を、最終濃度が６０ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）になるように、撹拌沈殿物に添加し、一定の流速で、デッドエンドＮｕｔｓｃｈｅ（加圧された）フィルタに供給した。フィルタ圧が３０ｐｓｉに達する場合、沈殿ケーキを形成した。その後に、水を含む、少なくとも３当量の一連の溶液で、濾過ケーキを洗浄した。次いで、得られた沈殿ケーキを、ｐＨ５．０で、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、６０ｍＭ 酢酸塩で再可溶化した。注：沈殿試料は、ｐＨ７．２で、１００ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ５．０で、１００ｍＭ 酢酸塩；ｐＨ５．０で、２．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび６０ｍＭ 酢酸塩；ｐＨ８．０で、２５０ｍＭ トリスを含む、溶液の範囲で、再可溶化することができる。次いで、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルチップＳＤＳ−ＰＡＧＥ、宿主細胞タンパク質、ならびにＤＮＡ含有量によって、再可溶化された試料を、純度に関してアッセイした。

その後、再可溶化されたｍＡｂを、２つのクロマトグラフの工程：アニオン交換クロマトグラフィ、および疎水性交換クロマトグラフィを通して精製した。ＳＥＣ、宿主細胞タンパク質、およびＤＮＡ含有量によって、各々の得られた溶出液を、アッセイした。結果を図１２〜１４に示す。

実施例１３
捕捉および洗浄、ならびに沈降およびサイホニングによって、濃縮後、Ａｂ Ｆの沈殿を、実行した。

Ａｂ Ｆの収集した細胞培地流体（ＨＣＣＦ）（ＨＣＣＦの初期濃度６．７ｇ Ａｂ Ｆ／Ｌ）を、２〜８℃で、２Ｍトリス塩基を用いて、ｐＨ７．２に調節した。ＨＣＣＦを、ＰＥＬＬＩＣＯＮ−２（登録商標）５０キロダルトン（ｋＤａ）カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、６７ｇ／Ｌまで濃縮し、次いで、試料を、ｐＨ７．２にて、５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液に透析濾過した（緩衝液交換した）。（注：濃縮は、様々な精密濾過／限外濾過膜およびフィルタもしくは方法、例えば、遠心力緩衝液交換または撹拌細胞等の他の濃縮方法を用いて、達成され得る）。３５ｍＭ 塩化亜鉛を、最終濃度が２．５ｍＭになるように、濃縮した試料と混合した。塩化亜鉛を添加した後、１１％ ＰＥＧ３３５０および２００ｍＭ イミダゾールを、最終濃度が１．５％ ＰＥＧ３３５０および１０ｍＭ イミダゾールになるように、該試料に添加した。得られた沈殿物を、３０分間撹拌した。沈殿物を、２時間沈降させ、上清を吸引によって除去した。沈殿ケーキを、水を含む、少なくとも２当量のいくつかの溶液を用いて、元の容量に沈殿物を再懸濁することによって洗浄し、各々の沈殿物を洗浄する間の２時間、沈殿物を沈降させた。次いで、得られた沈殿ケーキを、ｐＨ５．０で、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、６０ｍＭ 酢酸塩で再可溶化した。次いで、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルチップＳＤＳ−ＰＡＧＥ、宿主細胞タンパク質、ならびにＤＮＡ含有量によって、再可溶化された試料を、純度に関してアッセイした。結果を表１０に示す。

実施例１４
ＰＥＧ３３５０およびＺｎＣｌ_２によるＡｂ Ｆの沈殿を、低分子量の不純物を除去するために実行した。

Ａｂ Ｆの収集した細胞培地流体（ＨＣＣＦ）（ＨＣＣＦの初期濃度６．７ｇ Ａｂ Ｆ／Ｌ）を、２〜８℃で、２Ｍトリス塩基を用いて、ｐＨ７．２に調節した。ＨＣＣＦを、ＰＥＬＬＩＣＯＮ−２（登録商標）５０キロダルトン（ｋＤａ）カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、６７ｇ／Ｌまで濃縮し、次いで、試料を、ｐＨ７．２にて、５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液に透析濾過した（緩衝液交換した）（注：濃縮は、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＰＥＬＬＩＣＯＮ−２（登録商標）を含む、様々な限外濾過膜を用いて、または遠心力緩衝液交換もしくは撹拌細胞を含む他の方法によって、達成され得る）。激しく撹拌しながら、ｐＨ３．０で、２５０ｍＭ 塩化亜鉛を含有する原液を、最終濃度が２．５ｍＭになるように、濃縮した試料に単回ボーラスで添加した。塩化亜鉛を添加した後、３０％ ＰＥＧ３３５０および１００ｍＭ イミダゾールを、最終濃度が１．５％ ＰＥＧ３３５０および１０ｍＭ イミダゾールになるように、該撹拌試料に単回ボーラスで直ちに添加した。得られた沈殿物を、３０分間撹拌し、試料採取し、再可溶化し、ＳＥＣによってアッセイし、低分子量の不純物含有量（ＬＭＷ）を決定した。イミダゾールの存在下で、ＺｎＣｌ_２およびＰＥＧ３３５０による沈殿は、ほぼゼロまでＬＭＷ不純物レベルを低減させることが見出され、イミダゾールの非存在下で、ＰＥＧおよびＺｎＣｌ_２による沈殿は、低分子量の不純物のレベルを約１６％〜約６％まで低減させることが見出された。結果を図１５に示す。

本発明は、記載される特定の実施形態によって範囲内に限定されるものではなく、それは、本発明の個々の態様の単なる説明として意図され、機能的に同等である任意の組成物または方法は、本発明の範囲内である。実際には、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。

本明細書において言及する、全ての刊行物および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照することによって援用されるように示された場合と同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。

Claims (34)

1. 不純物を含有する組成物中の組み換えタンパク質を単離する方法であって、
   （ａ）前記組成物にポリエチレングリコールを添加する工程と、
   （ｂ）前記組成物に亜鉛を添加する工程と、
   （ｃ）任意の順序の工程（ａ）および（ｂ）の後に、前記組み換えタンパク質に沈殿物を形成させる工程、および
   （ｄ）前記沈殿した組み換えタンパク質を回収する工程
   を包含し、ポリエチレングリコールおよび亜鉛の添加の濃度は、同じ濃度の亜鉛を添加するがポリエチレングリコールを添加しないことによって沈殿される前記組み換えタンパク質の量または画分と、同じ濃度のポリエチレングリコールを添加するが亜鉛を添加しないことによって沈殿される前記組み換えタンパク質の量または画分との組み合わせと比較して、多い量または画分の前記組み換えタンパク質を沈殿させる濃度であり、ポリエチレングリコールおよび亜鉛のみが、沈殿剤を構成し、
   ポリエチレングリコールは、０．５％〜３０％の範囲の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加され、亜鉛は０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲の最終濃度で添加され、前記組み換えタンパク質はモノクローナルＩｇＧ抗体、またはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む融合タンパク質である、方法。
2. 添加されたポリエチレングリコールは、１，０００ダルトン（Ｄａ）〜５０，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
3. 添加されたポリエチレングリコールは、以下：
   ａ）１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａ、
   ｂ）２，０００Ｄａ〜２５，０００Ｄａ、
   ｃ）２，０００Ｄａ〜１５，０００Ｄａ、
   ｄ）３，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａ、
   ｅ）４，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ、
   ｆ）３，０００Ｄａ、
   ｇ）３，３５０Ｄａ、
   ｈ）４，０００Ｄａ、
   ｉ）５，０００Ｄａ、
   ｊ）６，０００Ｄａ、
   ｋ）７，０００Ｄａ、
   ｌ）８，０００Ｄａ、および
   ｍ）９，０００Ｄａ
   からなる群より選択される平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
4. ポリエチレングリコールが、以下：
   ｂ） ０．５％〜２．５％；
   ｅ） ２．０％〜１０％；
   ｆ） ２．５％〜３０％；
   ｇ） ３％〜３０％；
   ｈ） ６％〜２１％；
   ｉ） ０．５％；
   ｊ） １％；
   ｋ） １．５％；
   ｌ） ２％；
   ｍ） ２．５％；
   ｎ） ３％；
   ｏ） ４％；
   ｐ） ５％；
   ｑ） ６％；
   ｒ） ７％；
   ｓ） ８％；
   ｔ） ９％；
   ｕ） １０％；
   ｖ） １１％；
   ｗ） １２％；
   ｘ） １３％；
   ｙ） １４％；
   ｚ） １５％；
   ａａ） ２０％；および
   ａｂ） ３０％
   からなる群より選択される最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項１に記載の方法。
5. 亜鉛が、以下：
   ｃ） ０．３ｍＭ〜７．０ｍＭ；
   ｄ） ０．５ｍＭ〜５０ｍＭ；
   ｅ） ０．５ｍＭ〜１５ｍＭ；
   ｆ） １ｍＭ〜５０ｍＭ；
   ｇ） １ｍＭ〜２０ｍＭ；
   ｈ） １．５ｍＭ〜１５ｍＭ；
   ｉ） ２．５ｍＭ〜１５ｍＭ；
   ｊ） ０．５ｍＭ；
   ｋ） １ｍＭ；
   ｌ） １．５ｍＭ；
   ｍ） ２．５ｍＭ；
   ｎ） ３．５ｍＭ；
   ｏ） ５ｍＭ；および
   ｐ） １０ｍＭ
   からなる群より選択される濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
6. 前記沈殿物が形成され、次いで洗浄される、請求項１に記載の方法。
7. 前記沈殿物が水で洗浄される、請求項６に記載の方法。
8. 前記沈殿物が、０．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度で亜鉛を含む溶液で洗浄される、請求項１に記載の方法。
9. 前記沈殿物が、０．１％〜２．５％の濃度でポリエチレングリコールを含む溶液で洗浄される、請求項１に記載の方法。
10. 前記沈殿物が、０．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度で遷移金属を、０．５％〜５％（ｗ／ｖ）の濃度でポリアルキレングリコールを含む溶液で洗浄される、請求項１に記載の方法。
11. 前記組み換えタンパク質の単離のための、以下：
    ａ）イミダゾール；
    ｂ）グリシン；
    ｃ）トリプトファン；
    ｄ）システイン；
    ｅ）ヒスチジン；
    ｆ）ヒスタミン；および
    ｇ）塩化アンモニウム
    からなる群より選択される化合物の使用をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
12. 前記化合物がイミダゾールである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記組み換えタンパク質が、ポリエチレングリコールまたは亜鉛の添加前に濃縮される、請求項１に記載の方法。
14. 予めの前記濃縮が、前記組み換えタンパク質の単離に必要とされるポリエチレングリコールまたは亜鉛の量を、２倍〜４０倍減少させる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記組み換えタンパク質は、沈殿前の前記組み換えタンパク質の比活性と比較して、以下：
    ａ） ５０％の比活性が保持；
    ｂ） ６０％の比活性が保持；
    ｃ） ７０％の比活性が保持；
    ｄ） ８０％の比活性が保持；
    ｅ） ９０％の比活性が保持；
    ｆ） ９５％の比活性が保持；および
    ｇ） １００％の比活性が保持、
    からなる群より選択される量で、生物学的活性を保持する、請求項１に記載の方法。
16. 不純物を含有する組成物中の組み換えタンパク質を単離する方法であって、
    （ａ）ポリエチレングリコールおよび亜鉛からなる沈殿剤を添加する工程と、
    （ｂ)前記組み換えタンパク質に沈殿物を形成させる工程と、
    （ｃ)前記沈殿した組み換えタンパク質を回収する工程と
    を包含し、ポリエチレングリコールおよび亜鉛の添加の濃度は、同じ濃度の亜鉛を添加するがポリエチレングリコールを添加しないことによって沈殿される前記組み換えタンパク質の量または画分と、同じ濃度のポリエチレングリコールを添加するが亜鉛を添加しないことによって沈殿される前記組み換えタンパク質の量または画分との組み合わせと比較して、多い量または画分の前記組み換えタンパク質を沈殿させる濃度であり、
    ポリエチレングリコールは、０．５％〜３０％の範囲の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加され、亜鉛は０．１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲の最終濃度で添加され、前記組み換えタンパク質はモノクローナルＩｇＧ抗体、またはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む融合タンパク質である、方法。
17. ポリエチレングリコールが、２％〜１０％の濃度で添加され、亜鉛が、１．５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度で添加される、請求項１６に記載の方法。
18. ポリエチレングリコールが、５％の濃度で添加され、亜鉛が、１０ｍＭの濃度で添加される、請求項１７に記載の方法。
19. ポリエチレングリコールが、１．５％の濃度で添加され、亜鉛が、２．５ｍＭの濃度で添加される、請求項１７に記載の方法。
20. 添加されるポリエチレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項２に記載の方法。
21. 添加されるポリエチレングリコールは、３，３５０Ｄａの平均分子量を有する、請求項２０に記載の方法。
22. ポリエチレングリコールは、０．５％〜２．５％の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項１に記載の方法。
23. ポリエチレングリコールは、２％〜１０％の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項１に記載の方法。
24. ポリエチレングリコールは、１．５％の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項２２に記載の方法。
25. 亜鉛は、０．５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
26. 亜鉛は、０．３ｍＭ〜７ｍＭの濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
27. 亜鉛は、２．５ｍＭの濃度で添加される、請求項２６に記載の方法。
28. ポリエチレングリコールは、０．５％〜２．５％の濃度で添加され、亜鉛は、１．５ｍＭ〜１５ｍＭの濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
29. ポリエチレングリコールは、１．５％の濃度で添加され、亜鉛は、２．５ｍＭの濃度で添加される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記不純物は、タンパク質、核酸またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
31. 前記不純物は、前記組み換えタンパク質を産生したか、または含有していた宿主生物に由来する、タンパク質、核酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
32. 前記組成物は、１０リットル〜３０，０００リットルの容量を有する、請求項１に記載の方法。
33. 前記組成物は、５０リットル〜１５，０００リットルの容量を有する、請求項１に記載の方法。
34. 添加される前記亜鉛がＺｎＣＬ _２ である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。