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CN102065870A - 使用聚亚烷基二醇和过渡金属分离生物大分子的方法 - Google Patents

使用聚亚烷基二醇和过渡金属分离生物大分子的方法 Download PDF

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CN102065870A CN2009801137066A CN200980113706A CN102065870A CN 102065870 A CN102065870 A CN 102065870A CN 2009801137066 A CN2009801137066 A CN 2009801137066A CN 200980113706 A CN200980113706 A CN 200980113706A CN 102065870 A CN102065870 A CN 102065870A
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Abstract

本发明涉及分离组合物中的生物大分子的方法。具体地，本发明涉及分离含有杂质的组合物中的生物大分子的方法，所述方法包括添加聚亚烷基二醇至所述组合物中，添加过渡金属至所述组合物中，以及将所述生物大分子与所述杂质分离。

Description

使用聚亚烷基二醇和过渡金属分离生物大分子的方法
背景技术
本发明涉及分离组合物中的生物大分子的方法。具体地，本发明涉及分离含有杂质的组合物中的生物大分子的方法，所述方法包括添加聚亚烷基二醇至所述组合物中；添加过渡金属至所述组合物中；以及将所述生物大分子与杂质分离。
生物大分子(Biological macromolecule)(即，生物大分子(biomacromolecule))如重组蛋白或抗体在多种技术中很重要。传统上，生物大分子使用如下几种不同的方法来纯化：例如，过滤、离心、尺寸排阻色谱、亲和色谱、离子交换色谱、固定金属亲和色谱或上述的组合，仅列出一些。纯化方法一般是基于将生物大分子与在组合物中与生物大分子共存的一种或多种杂质区别的生物大分子特征如大小、电荷或对配体的亲和力来选择的。大量生物大分子是商业上重要的，并且以及时且经济有效的方法纯化大量生物大分子的能力是令人期望的。
商业上重要的生物大分子包括：例如，蛋白质和核酸，如DNA和RNA。通常在工业规模上分离的生物大分子的两个实例是单克隆抗体和融合蛋白。这些抗体和融合蛋白在多种诊断和治疗领域是有价值的并且已被用于治疗多种疾病，如遗传性和获得性免疫缺陷疾病和传染性疾病。
从工业规模的含有哺乳动物细胞或细菌细胞的生物反应器中收获生物大分子一般使用过滤或离心进行。然而，最近对于在细胞培养物中产生增加量的蛋白产物的倾向需要生物反应器在较高的细胞密度下操作，这增加了杂质的量，诸如DNA、宿主细胞蛋白和其他培养基组分。污染物水平的提高产生了对细胞收获操作(例如，过滤和离心步骤)以及下游纯化步骤(例如，色谱和透析步骤)二者更强的要求。这些较高浓度的杂质的存在可能增加需要进行的纯化步骤的数目，从而会增加成本并降低总体产物生产量。增加的蛋白产物甚至能够使一些色谱方法的容量饱和。
生产纯化的抗体的传统方法可以包括离心、离子交换色谱(例如，DEAE或羟基磷灰石)、免疫亲和纯化(例如，蛋白A或蛋白G)以及透析。参见：例如，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，Harlow和Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。使用上述方法的组合是常见的，例如使用乙醇分级分离从血浆纯化抗体，然后进行离子交换色谱和/或辛酸(CA)沉淀。参见，例如McKinney等人，J.Immunol.Methods96：271-278(1987)；美国专利第4,164,495号；4,177,188号；RE 31,268号；4,939,176号；5,164,487号和WO 2008/100578。此外，已经利用发酵的酸化作用来改善抗体和重组蛋白的回收率和稳定性。参见，例如Lydersen等人，Annals New York Academy of Sciences 745：222-31(1994)。
已经开发了多种其他的方法用于分离和/或纯化抗体。参见，例如美国专利第7,038,017号；7,064,191号；6,846,410号；5,429,746号；5,151,504号；5,110,913号；4,933,435号；4,841,024号；和4,801,687号。然而，这些方法中许多能够导致大的原料体积和回收率损失，在工业规模上具有高生产成本和/或具有低生产量。
通过引入沉淀剂诱导生物大分子沉淀可能是回收生物大分子的快速且有效的方法。传统的沉淀技术包括硫酸铵沉淀和辛酸沉淀。沉淀的一个传统缺点是需要在沉淀完成之后移除沉淀剂。由于这个缺点，通常将沉淀用作上游纯化方法。沉淀的另一缺点是需要高浓度的沉淀剂来达到期望的结果，从而产生了大量的废弃产物。
先前已使用聚乙二醇(PEG)来沉淀多种生物大分子。参见，例如Ingham，K.，″Precipitations of Proteins with Polyethylene Glycol(用聚乙二醇沉淀蛋白)，″301-306(1990)和WO 2008/100578。发现PEG在多种环境中都不变性。然而，一般使用高浓度的PEG来达到期望的结果，例如，总体积的20％。高浓度的PEG导致了体积的显著增加，产生了大量废弃物并且增加了组合物的粘度。此外，所需的高浓度的PEG增加了与纯化相关的成本。
先前也尝试了金属亲和沉淀。参见，例如Van Dam，M.等人，″MetalAffinity Precipitation of Proteins(蛋白质的金属亲和沉淀)，″Biotechno.Appl.Biochem，492-502(1989)和Zaworski，P.G.，等人，″Precipitation of Proteinsfrom Culture Supernatants Using Zinc(使用锌从培养物上清液中沉淀蛋白质)，″Analytical Biochem 440-444(1988)。然而，也需要高浓度的锌来达到期望的沉淀(高达80mM)。因此，在这些高浓度下使用金属亲合法产生了大量的废弃物并且显著增加了成本。
由于上述困难和缺陷，需要改进分离生物大分子的策略。
发明内容
本发明涉及在含有杂质的组合物中分离生物大分子的方法，所述方法包括：(a)添加聚亚烷基二醇至所述组合物中；(b)添加过渡金属至所述组合物中；以及(c)将所述生物大分子与杂质分离。聚亚烷基二醇和过渡金属的组合容许将生物大分子与杂质协同分离并且大大改善产率。
可以使用多种聚亚烷基二醇。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇选自由下列组成的组：聚戊二醇、聚丁二醇、聚丙二醇或聚乙二醇。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇是聚乙二醇。可以使用多种分子量的聚亚烷基二醇。在一些实施方式中，聚乙二醇具有1,000Da至20,000Da之间的分子量。在一些实施方式中，聚乙二醇具有2,000Da至15,000Da之间的分子量。
在本发明的方法中可以使用多种浓度的聚亚烷基二醇。在一些实施方式中，组合物中的聚亚烷基二醇的浓度为约0.5％至约30％(w/v)。在一些实施方式中，组合物中的聚亚烷基二醇为约2.0％至约10％(w/v)。在本发明的一些实施方式中，聚亚烷基二醇在组合物中为约1％-2％(w/v)。
本发明的方法中可以使用过渡金属来增加生物大分子与杂质的分离。在一些实施方式中，过渡金属选自由下列组成的组：锌、镍、酮、钴或锰。在一些实施方式中，过渡金属是锌。可以使用多种浓度的过渡金属。在一些实施方式中，组合物中的过渡金属的浓度为约1mM至约50mM。在一些实施方式中，组合物中的过渡金属的浓度为约2.5mM至约15mM。在一些实施方式中，组合物中的过渡金属的浓度为约0.5mM至约15mM。在一些实施方式中，组合物中的过渡金属的浓度为约1.5mM至3.5mM。
可以使用多种方法来将生物大分子与杂质分离。在一些实施方式中，分离是通过过滤组合物来进行，所述过滤形成了渗透流和固体流。在一些实施方式中，过滤由死端滤器进行。在一些实施方式中，生物大分子基本上在固体流中。在一些实施方式中，分离是通过过滤组合物来进行，生物大分子保留在固体中，并且其中所述过滤产生了跨膜压力；并且其中所述跨膜压力在过滤期间保持基本上恒定。在一些实施方式中，分离是通过使组合物经受离心来进行，所述离心形成了上清液和沉淀。在一些实施方式中，生物大分子基本上在沉淀中。
可以根据本发明分离多种生物大分子。在一些实施方式中，生物大分子是蛋白。在一些实施方式中，蛋白是可溶性蛋白。在一些实施方式中，蛋白是抗体。
在一些实施方式中，本发明是从含有杂质的组合物中分离生物大分子的方法。在一些实施方式中，组合物包含真核细胞材料。在一些实施方式中，杂质选自由下列组成的组：生长培养基组分、蛋白质、脂类、核酸、核糖核酸以及它们的组合。
在一些实施方式中，本发明的方法与仅采用聚亚烷基二醇或过渡金属的方法相比增加了生物大分子从组合物中的回收。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇和过渡金属的添加将生物大分子的回收率增加了高于3％。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇和过渡金属的回收将生物大分子的回收率增加了高于10％。在一些实施方式中，与使用单独的聚亚烷基二醇或过渡金属相比，当使用聚亚烷基二醇和过渡金属二者时，生物大分子的回收是协同的。
在本发明的一些实施方式中，聚亚烷基二醇是分子量在1,000Da至20,000Da之间的聚乙二醇；过渡金属是锌；分离是通过在溶液中沉淀生物大分子，并然后离心组合物以分离沉淀物来进行；并且所述生物大分子是抗体。
在本发明的一些实施方式中，聚亚烷基二醇是分子量在1,000Da至20,000Da之间的聚乙二醇；过渡金属是锌；分离是通过在溶液中沉淀生物大分子，并然后过滤组合物以分离所述生物大分子来进行；并且所述生物大分子是抗体。
附图说明
图1描绘了pH对Ab C沉淀的影响。将Ab C的样品滴定至pH 7、pH 8和pH 9，并保持1小时(Ab C的等电点为约8.5)。然后将样品过滤以捕获沉淀(如果存在)并检测在A280的吸光度。将滴定的样品的吸光度测量与起始材料(“CCM”)相比较。滴定至pH7、pH8和pH9的样品的回收的吸光度分别为101.7％、99.1％、100.3％。这表明仅pH不足以在收获的产物浓度下引起沉淀。
图2描绘PEG 3350浓度(w/v)对沉淀和AbC回收率的影响。将收获的Ab C样品调节至pH 9.0并且用0％PEG 3350、4％PEG 3350、7％PEG3350、10％PEG 3350、13％PEG 3350和20％PEG 3350处理。将样品在2-8℃下保持30-60分钟并以14,000rpm离心3分钟。滗去上清液并在重悬缓冲液中重悬沉淀。通过尺寸排阻色谱使用收获的Ab C样品作为对照来计算回收率。至少需要10％PEG 3350来沉淀Ab C并且达到＞95％的回收率。
图3A描绘pH和在不同PEG浓度下的PEG分子量的影响。将Ab C样品滴定至pH 7、8和9并用5％、10％或15％的分子量为400、1000、3350和8000Da的PEG处理。数据显示PEG 1000-PEG 8000均在≥5％的量下产生高回收率。将样品在2-8℃下保持30-60分钟并在14,000rpm下离心3分钟。滗去上清液并在重悬缓冲液中重悬沉淀。通过尺寸排阻色谱使用收获的Ab C样品作为对照来计算回收率。
图3B描述PEG分子量对Ab C回收率的影响。将Ab C样品滴定至pH 8并在2-8℃或环境温度下用10％PEG 3350或PEG 8000处理。将样品在2-8℃或环境温度下保持30-60分钟并以14,000rpm离心3分钟。滗去上清液并在重悬缓冲液中重悬沉淀。通过尺寸排阻色谱使用收获的Ab C样品作为对照来计算回收率。PEG 3350和PEG 8000均产生高产率。
图4A描绘在PEG沉淀之前抗体Ab C制剂的纯度，并且图4B代表在pH 8.0下用10％PEG 8000沉淀之后抗体Ab C制剂的纯度。
图5A描绘在PEG沉淀之前抗体Ab D制剂的纯度，并且图5B代表在pH 8.0下用10％PEG 8000沉淀之后抗体Ab D制剂的纯度。
图6A描绘在PEG沉淀之前抗体Ab E制剂的纯度，并且图6B代表在pH 8.0下用10％PEG 8000沉淀之后抗体Ab E制剂的纯度。
图7A描绘在PEG沉淀之前抗体Ab F制剂的纯度，并且图7B代表在pH 8.0下用10％PEG 8000沉淀之后抗体Ab F制剂的纯度。
图8A描绘0mM ZnCl2和10mM ZnCl2对Ab C的沉淀的影响。还呈现了在不同ZnCl2浓度下添加5％PEG的影响。
图8B描绘在PEG沉淀之前和在pH7.2下用5％PEG 3350和5mMZnCl2沉淀之后抗体Ab C制剂的纯度。
图9描绘在pH 7.0下多种PEG和ZnCl2浓度对组合物中抗体的沉淀的影响。
图10描绘在pH 8.0下多种PEG和ZnCl2浓度对组合物中抗体的沉淀的影响。
图11描绘在pH 9.0下多种PEG和ZnCl2浓度对组合物中抗体的沉淀的影响。
图12描绘在咪唑存在下用PEG 3350和ZnCl2沉淀之后Ab F的尺寸排阻分析。随后通过离子交换步骤和疏水相互作用色谱步骤纯化Ab F的重溶解部分。
图13描绘不同浓度的主体加料的Ab F沉淀的死端(Nutsche)过滤。差压(psi)与通过量(L/m2)显示在(A)中，并且滤液体积(ml)与时间(分钟)显示在(B)中。
图14描绘了在体积倍数(diavolume，DV)递增的洗涤溶液下洗涤的Ab F沉淀饼的尺寸排阻分析。用箭头突出了低分子量杂质(LMW)。
图15描绘了在存在和不存在咪唑的条件下通过用PEG和ZnCl2沉淀进行的低分子量移除。10倍浓缩的Ab F HCCF显示在(A)中。在不存在咪唑的条件下用PEG 3350和ZnCl2进行的Ab F沉淀显示在(B)中(LMW水平为约6％)，并且在存在咪唑的条件下用3350和ZnCl2进行的Ab F沉淀显示在(C)中(LMW水平＜1％)。
具体实施方式
发现添加聚亚烷基二醇和过渡金属二者的组合改善了组合物中的生物大分子的沉淀。这种生物大分子的沉淀导致生物大分子与组合物中存在的杂质分离。本发明涉及在含有杂质的组合物中分离生物大分子的方法，所述方法包括：(a)添加聚亚烷基二醇至所述组合物中；(b)添加过渡金属至所述组合物中；以及(c)将所述分离生物大分子与杂质分离。
应注意，除非另外从文中清楚得知，否则术语“一个”或“一种”实体是指一种或多种所述实体；例如，“一种蛋白”应理解为代表一种或多种蛋白。如此，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”以及“至少一种”在本文中可以互换使用。
术语“分离了(isolating)”和“分离(isolation)”是指将生物大分子与组合物中存在的至少一种其他不期望的组分或杂质分离。术语“分离了”包括“纯化了”和“净化了”。不要求生物大分子的具体的分离水平，然而在一些实施方式中，至少50％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(w/w)的杂质与生物大分子分离。例如，在一些实施方式中，生物大分子的分离将包括将生物大分子与组合物中最初存在的宿主细胞蛋白(HCP)的80％分离。
术语“净化了(clarifying)”和“净化(clarification)”是指从组合物中清除大的粒子。例如，如应用于细胞培养物和生长培养基时，术语“净化了”是指例如从细胞培养物中清除原核和真核(例如，哺乳动物)细胞、脂类和/或核酸(例如，染色体和质粒DNA)。
术语“纯化了(purifying)”和“纯化(purification)”是指将本发明的生物大分子与组合物中的杂质或其他污染物分离，而与杂质大小无关。因此，术语纯化将涵盖“净化”，但它还另外涵盖在大小上小于在净化期间清除的那些杂质的杂质，例如，蛋白质、脂类、核酸和其他形式的细胞碎片、病毒碎片、污染细菌碎片、培养基组分以及类似物。不要求生物大分子的具体的纯化水平，然而在一些实施方式中，至少50％、70％、80％、90％或95％(w/w)的杂质从生物大分子中纯化。例如，在一些实施方式中，生物大分子的纯化包括将生物大分子与组合物中最初存在的HCP的80％分离。
如本文所用的术语“协同”、“协同的”或“协同效应”描述具有大于加性的量值的效应。在本发明的一些实施方式中，一齐使用聚亚烷基二醇和过渡金属提供了生物大分子的协同产物回收或协同沉淀。例如，如果单独使用3％(w/v)聚亚烷基二醇沉淀5％的生物大分子并且单独使用10mM终浓度的过渡金属沉淀5％的同一生物大分子，则用3％聚亚烷基二醇和10mM过渡金属一齐沉淀生物大分子的加性效应是沉淀10％的生物大分子。因此，作为比较，当一齐使用3％聚亚烷基二醇和10mM过渡金属时的协同效应将生物大分子沉淀至大于10％的任何程度。
可以使用多种聚亚烷基二醇。在一些实施方式中，术语聚亚烷基可以是通式I的化合物：
在一些实施方式中，n可以是约10至约5,000、约20至约2,500、约50至约2,000或约100至约500，并且m是约1至约10。另外的聚亚烷基二醇分子之前已有描述。合适的实例包括聚丙二醇，如在美国专利第5,643,575号中所述的那些。可用于本发明的方法中的其他聚亚烷基二醇描述于Shearwater Polymers，Inc.目录“Polyethylene Glycol and Derivatives2001(聚乙二醇和衍生物2001)”中。每一个的公开内容均通过引用并入本文。
在一些实施方式中，可以使用杂聚物，其中在聚亚烷基分子中含有不同的烷基取代基，例如，式II的聚亚烷基分子：
Figure BPA00001245290900102
其中R1、R2、R3、R4可以独立地为氢或者取代的或未取代的烷基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基烷基、磷酸根、磷酸烷基、硫酸根或磺烷基，并且其中每个z亚基可以是相同的或不同的。
在一些实施方式中，y可以是约1至约10。在一些实施方式中，y的值对于各z亚基可以任选地不同。在一些实施方式中，z可以是约10至约5,000、约20至约2,500、约50至约2,000或约100至约500。
在一些实施方式中，聚亚烷基二醇在室温下是水溶性的。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇选自由下列组成的组：聚戊二醇、聚丁二醇、聚丙二醇或聚乙二醇，其中所述烷基取代基的任一种任选地为未取代的或经烷基、芳基烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基烷基、磷酸根、磷酸烷基、硫酸根或磺烷基取代的。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇为聚乙二醇。
可以使用多种分子量的聚亚烷基二醇。尽管聚亚烷基二醇的平均分子量基本上可以改变，但在一些实施方式中，聚亚烷基二醇具有的平均分子量为约1,000Da至约100,000Da。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇具有的分子量为1,000Da与50,000Da之间、约2,000Da至约25,000Da、约3,000Da至约20,000Da或约4,000至约10,000。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇具有的分子量为约3,000Da、4,000Da、5,000Da、6,000Da、7,000Da、8,000Da或9,000Da。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇具有2,000Da至15,000Da之间的分子量。
在一些实施方式中，其中聚亚烷基二醇为聚乙二醇，所述聚乙二醇具有的分子量为1,000Da与50,000Da之间、约2,000Da至约25,000Da、约3,000Da至约20,000Da或约4,000至约10,000。在一些实施方式中，聚乙二醇具有的分子量为约3,000Da、4,000Da、5,000Da、6,000Da、7,000Da、8,000Da或9,000Da。在一些实施方式中，聚乙二醇具有2,000Da至15,000Da之间的分子量。
组合物中可以使用多种聚亚烷基二醇浓度。聚亚乙基可以从浓缩的或任选地纯的储备液添加至组合物中。浓缩的储备液在添加至组合物时被稀释。在一些实施方式中，添加聚亚烷基二醇至组合物产生了具有约1％至约40％、约2％至约35％(w/v)、约2.5％至约30％(w/v)或约3％至约30％(w/v)的聚亚烷基二醇浓度的组合物。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇浓度为组合物的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、13％、14％或15％(w/v)。在一些实施方式中，添加聚亚烷基二醇至组合物中产生了具有约2.0％至约10％(w/v)的聚亚烷基二醇浓度的组合物。在一些实施方式中，添加聚亚烷基二醇至组合物中产生了具有约0.5％至约30％(w/v)的聚亚烷基二醇浓度的组合物。在一些实施方式中，添加聚亚烷基二醇至组合物中产生了具有约0.5％至约2.5％(w/v)的聚亚烷基二醇浓度的组合物。在一些实施方式中，与过渡金属组合使用的聚亚烷基二醇的浓度比获得等量的分离的生物大分子而不添加过渡金属时使用的聚亚烷基二醇的浓度低约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在这种实施方式中，较少的聚亚烷基二醇的使用可能伴随着成本降低，并且在纯化后产生较少的残余废弃物。
本领域的技术人员将理解对于不同的生物大分子，聚亚烷基二醇的不同浓度、分子量或类型可能更加有效。尽管不受任何方法论限制，聚亚烷基二醇的合适浓度可以如下确定：添加多种浓度、分子量或类型的聚亚烷基二醇到包含过渡金属和生物大分子的组合物中，然后确定纯化生物大分子的最有效方法。
本发明中可以使用过渡金属来增加生物大分子与杂质的分离。术语“过渡金属”是指在周期表的d-区中的任何元素，包括锌、镉和汞。过渡金属的实例包括钪、钛、钒、铬、铁、锌、镍、铜、钴和锰。在一些实施方式中，过渡金属是锌、镍、铜、钴或锰。在一些实施方式中，过渡金属是锌。在一些实施方式中，可以使用多于一种类型的过渡金属。例如，在一些实施方式中，可以使用锌、镍、铜、钴和锰的两种或更多种的组合。在一些实施方式中，将过渡金属微粉化以降低过渡金属粒子的平均大小。
组合物中多种浓度的过渡金属适用于本发明中。本领域的技术人员将认识到各种内源量的过渡金属正常可以少量存在于组合物中，例如，收获加料(harvest feed)(内源过渡金属)，并且可以根据本发明添加不同量的过渡金属至收获加料中(外源过渡金属)。在一些实施方式中，过渡金属的浓度包括外源和内源阳离子二者。然而，对于实践目的，因为内源过渡金属的量与外源过渡金属的量相比通常相对较小，所以过渡金属的浓度可以通过简单地考虑外源过渡金属来计算。在一些实施方式中，将来自浓缩的(或纯的)储备液的过渡金属等分试样添加到本发明的组合物中以获得组合物中所需终浓度的过渡金属。在一些实施方式中，将另外的组分添加到过渡金属中以稀释组合物中的过渡金属的浓度。在一些实施方式中，添加过渡金属至组合物中产生了具有约0.1mM至约1M、约0.1mM至约100mM、约0.2mM至约75mM、约0.5mM至约50mM或约1mM至约20mM的过渡金属浓度的组合物。在一些实施方式中，添加过渡金属至组合物中产生了具有约1.5mM至约15mM、2.5mM至约15mM或约0.3mM至约7.0mM的过渡金属浓度的组合物。在一些实施方式中，与聚亚烷基二醇组合使用的过渡金属的浓度比获得等量的分离的生物大分子而不添加聚亚烷基二醇时使用的过渡金属的浓度低约10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在这种实施方式中，较少的过渡金属的使用可能伴随着成本降低，并且在纯化后产生较少的残余废弃物。
本领域的技术人员将认识到对于不同的生物大分子不同浓度的过渡金属可能更加有效。尽管不受任何方法论限制，过渡金属的合适浓度可以如下确定：添加多种浓度的过渡金属到包含聚亚烷基二醇和生物大分子的组合物中，然后确定能够借以回收到最大量的生物大分子的最低浓度。
本领域的技术人员将认识到过渡金属能够以盐形式存在，例如置于水溶液中时铜盐如CuCl2可以产生铜阳离子。因此，如本文所用短语“添加过渡金属”将不仅涵盖添加带电状态的过渡金属，而且还涵盖添加盐和将在引入本发明的组合物中后产生过渡金属的其他化合物。在一些实施方式中，过渡金属是盐(例如，CuCl2、NiCl2，、ZnCl2、MnCl2、CuBr2、NiBr2，、ZnBr2、MnBr2、CuSO3、NiSO3、ZnSO3和MnSO3)、或这些阳离子或盐的一种或多种的组合。在一些实施方式中，过渡金属是卤化盐，例如，CuCl3、NiCl3等。在一些实施方式中，过渡金属是甘氨酸铜、甘氨酸镍、甘氨酸锌或甘氨酸锰。预计某些过渡金属对于要纯化/分离的不同的生物大分子可能更加合适。然而，本领域的技术人员可以容易并且迅速地测试许多种过渡金属以确定哪种过渡金属会达到感兴趣的生物大分子的最大回收率。
在一些实施方式中，影响金属离子以聚集结合的竞争性配体可用于本发明中。这种配体的实例包括但不限于：咪唑、甘氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸、组胺、氯化铵。(参见Kagedal，L，″Immobilized Metal Ion AffinityChromatography(固定的金属离子亲和色谱)″在Protein Purification：Principles，High Resolution Methods，and Applications(蛋白质纯化：原理、高分辨法和应用)(Janson，J-C，1998)中和Przbycien等人″A Model for MetalAffinity Precipitation(金属亲和沉淀的模型)″J.Coll.Int.Sci(1996))。
本发明中的术语“组合物”是指本发明的生物大分子的至少一种分子与任选地至少一种杂质的混合物，其中所述杂质和所述生物大分子不相同。在一些实施方式中，组合物包含生物大分子、细胞宿主生物体(例如哺乳动物细胞)和足以使宿主生物体繁殖并容许感兴趣的生物大分子表达的生长培养基。生长培养基的选择和使用是本领域的技术人员所已知的。在一些实施方式中，生长培养基是细胞培养基。细胞培养基根据所繁殖的细胞培养物的类型而改变。在一些实施方式中，细胞培养基是商购获得的培养基。在一些实施方式中，组合物包含含有下列物质的生长培养基：如无机盐、碳水化合物(例如，糖，如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖或果糖)氨基酸、维生素(例如，B族维生素(如，B12)、维生素A维生素E、核黄素、硫胺素和生物素)、脂肪酸和脂类(例如，胆固醇和类固醇)、蛋白质和肽(例如，白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白和胎球蛋白)、血清(例如，包含白蛋白、生长因子和生长抑制剂的组合物，如胎牛血清、新生牛血清和马血清)、微量元素(例如，锌、铜、硒和三羧酸中间体)以及它们的组合。生长培养基的实例包括但不限于：基础培养基(例如，MEM、DMEM、GMEM)、复合培养基(RPMI 1640、Iscoves DMEM、LeibovitzL-15、Leibovitz L-15、TC 100)、无血清培养基(例如，CHO、Ham F10及衍生物、Ham F12、DMEM/F12)。生长培养基中存在的常见的缓冲液包括PBS、Hanks BSS、Earles盐、DPBS、HBSS和EBSS。培养哺乳动物细胞的培养基是本领域中所熟知的并且可得自：例如，Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)、HyClone(Logan，UT)、Invitrogen公司(Carlsbad，CA)、Cambrex公司(E.Rutherford，NJ)、JRH Biosciences(Lenexa，KS)，IrvineScientific(Santa Ana，CA)以及其他公司。生长培养基中存在的其他组分可以包括抗坏血酸、柠檬酸盐、半胱氨酸/胱氨酸、谷氨酰胺、叶酸、谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、吡哆醛/吡哆醇、核黄素、硒、硫胺素和转铁蛋白。本领域的技术人员将认识到对生长培养基的改动将落在本发明的范围内。
在一些实施方式中，组合物还包含收获加料。术语“收获加料”是指在即将收获之前细胞存在于其中的介质，或在收获之后其中立即放置收获的细胞并且将细胞重悬于其中的介质。收获加料可以包括上述关于生长培养基所列的任何组分、或适于重悬收获的细胞或细胞部分的其他培养基。例如，在一些实施方式中，收获介质可以含有水、缓冲剂、渗透剂、抗降解剂等。在一些实施方式中，本发明涉及从收获加料中分离生物大分子的方法。
本发明的生物大分子可以从含有细胞培养物的组合物中分离，其中所述细胞培养物包含生长培养基和多种真核细胞，例如哺乳动物细胞。本发明的哺乳动物细胞包括能够以培养生长的任何哺乳动物细胞。示例性的哺乳动物细胞包括：例如，CHO细胞(包括CHO-K1、CHO DUKX-B11、CHO DG44)、VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos；Cos-7)、MDCK、293、3T3、C127、骨髓瘤细胞系(尤其是鼠的)、PC12、HEK-293细胞(包括HEK-293T和HEK-293E)、PER C6、Sp2/0、NS0和W138细胞。还可以使用衍生自任何上述细胞的哺乳动物细胞。
本发明的生物大分子可以从包含生长培养基和如下的各种原核或非哺乳动物细胞的细胞培养物中分离：例如，大肠杆菌(E.coli)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)内的多个物种，如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)；酵母细胞，如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉森酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和亚罗酵母属(Yarrowia)；昆虫细胞，如粉纹夜蛾(Trichoplusia)、鳞翅类(Lipidotera)、甜菜夜蛾(Spodoptera)、果蝇(Drosophila)和Sf9；或植物细胞，如拟南芥(Arabidopsis)。本领域的技术人员可以依据所感兴趣的生物大分子来选择适当的原核或非哺乳动物细胞。
可以根据本发明分离多种生物大分子。在一些实施方式中，生物大分子是抗体、重组蛋白或融合蛋白。在一些实施方式中，蛋白是可溶性蛋白。在一些实施方式中，蛋白是抗体。
如本文所用的术语“生物学的生物大分子”或“生物大分子”是指可以从生物体或从细胞培养物如真核(如哺乳动物)细胞培养物或原核(如细菌)细胞培养物分离的分子质量超过1kDa的分子。在一些实施方式中，术语生物大分子是指分子质量超过50kDa、75kDa、100kDa、125kDa或150kDa的分子。在一些实施方式中，该术语的使用是指聚合物，例如，诸如核酸(如DNA、RNA)、多肽(如蛋白质)、碳水化合物和脂类的生物聚合物。在一些实施方式中，术语“生物大分子”是指蛋白。在一些实施方式中，术语“生物大分子”是指重组蛋白或融合蛋白。在一些实施方式中，所述蛋白是可溶性的。在一些实施方式中，生物大分子是抗体，如单克隆抗体或多克隆抗体。
如本文所用的术语“蛋白质”旨在涵盖单数的“蛋白质”和复数的“蛋白质”。因此，如本文所用的，包括但不限于“肽”、“多肽”、“氨基酸链”或用于指一条或多条氨基酸链的任何其他术语的术语被包括在“蛋白质”的定义内，并且术语“蛋白质”可以用这些术语中的任一种代替或与其互换。该术语还包括经受如下的翻译后修饰的蛋白质：例如，糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、被已知的保护基团/封端基团衍生化、蛋白水解裂解或被非天然存在的氨基酸修饰。蛋白质还包括形成多聚体如二聚体、三聚体等的多肽。术语蛋白质还包括融合蛋白，如经由基因融合工艺产生的蛋白质，其中蛋白(或蛋白片段)附连在抗体(或抗体片段)上。本发明的融合蛋白的实例包括二硫键连接的双功能蛋白，该双功能蛋白包括来自人IgG1和人IgE的连接的Fc区以及淋巴毒素β受体免疫球蛋白G1。
抗体可以根据本发明的方法纯化。术语“抗体”是指多克隆的、单克隆的、多特异性的、人的、人源化的或嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体(包括：例如本发明抗体的抗-Id抗体)和上述任一种的表位结合片段。在一些实施方式中，术语“抗体”是指单克隆抗体。术语“抗体”也指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子。可以通过本发明的方法纯化的免疫球蛋白分子可以是任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)或亚类的免疫球蛋白分子。本发明的抗体还包括嵌合的、单链的和人源化的抗体。本发明的抗体的实例包括商业化的抗体，如那他珠单抗(人源化的抗-a4整联蛋白单克隆抗体)、人源化的抗-αVβ6单克隆抗体、人源化的抗-VLA1IgG1κ单克隆抗体；huB3F6(人源化的IgG1/κ单克隆抗体)。
通过本发明的方法纯化的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。在一些实施方式中，通过本发明的方法纯化的抗体是人、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驴、船兔(ship rabbit)、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。如本文所用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体并且包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体或从对一种或多种人免疫球蛋白转基因并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体。参见，例如Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号。在一些实施方式中，术语“抗体”包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体，包括商业化的抗体，如那他珠单抗(TYSBARI
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，Elan Pharmaceuticals，San Diego，CA)。
可以通过本发明的方法纯化的抗体包括：例如，天然抗体、完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段(例如结合和/或识别一种或多种抗原的抗体片段)、人源化抗体、人抗体(Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.7：33(1993)；美国专利第5,591,669号和5,545,807号)、从抗体噬菌体文库分离的抗体和抗体片段(McCafferty等人，Nature348：552-554(1990)；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Marks等人，Bio/Technology10：779-783(1992)；Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993))。通过本发明的方法纯化的抗体可以在N-末端或C-末端重组地融合至异源多肽或者化学轭合(包括共价和非共价轭合)至多肽或其他组分。例如，通过本发明的方法纯化的抗体可以重组地融合或轭合至用作检测测定中的标记和效应分子的分子上，如异源多肽、药物或毒素。参见，例如PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号；和EP 396,387。
在一些实施方式中，本发明的生物大分子或组合物是药学上可接受的。“药学上可接受的”是指在合理的药物判断范围内适于接触人和动物的组织而无过量的毒性或其他的与合理的效益/风险比相当的并发症的生物大分子或组合物。
在一些实施方式中，生物大分子是可溶性蛋白。术语“可溶性”是指蛋白基本上定位在细胞宿主的亲水性或基于水的环境如胞质、周质或细胞外介质的倾向。因此，在细胞分级分离期间，可溶性蛋白一般将基本上与宿主细胞的胞质、周质或胞外组分分离。在一些实施方式中，可溶性蛋白在不存在洗涤剂的条件下是水溶性的。本领域的技术人员应认识到多肽的细胞定位和蛋白的细胞分级分离都不是绝对的。因此，短语“基本上定位”是指其中所述蛋白的50％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％在指定的细胞位置如胞质、周质或细胞外介质中。在一些实施方式中，蛋白可以是膜蛋白或膜相关蛋白。
本发明可用于从含有杂质的组合物中分离生物大分子。在一些实施方式中，组合物包含真核细胞材料。在一些实施方式中，杂质选自由下列组成的组：生长培养基组分、蛋白质、脂类、核酸、核糖核酸以及它们的组合。
术语“杂质”是指与本发明的生物大分子不同的组合物的一种或多种组分。在一些实施方式中，杂质可以包括完整的哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)或鼠骨髓瘤细胞(NSO细胞)或部分细胞如细胞碎片。在一些实施方式中，杂质包括蛋白(例如，可溶性或不溶性蛋白或蛋白片段，如HCP)、脂类(例如，细胞壁材料)、核酸(例如，染色体或染色体外DNA)、核糖核酸(t-RNA或mRNA)或它们的组合、或与感兴趣的生物大分子不同的任何其他细胞碎片。在一些实施方式中，杂质可能来源于产生或含有感兴趣的生物大分子的宿主生物体。例如，杂质可以是表达感兴趣的蛋白的原核或真核细胞的细胞组分(例如，细胞壁、细胞蛋白、DNA或RNA等)。在一些实施方式中，杂质不来自宿主生物体，例如杂质可以来自细胞培养基或生长培养基、缓冲液或培养基添加剂。本文所用的杂质可以包括单个不期望的组分或几种不期望的组分的组合。
可以使用多种手段来将本发明的生物大分子与一种或多种杂质分离。将生物大分子与杂质分离的手段的实例包括但不限于：沉淀、免疫沉淀、色谱、过滤、超滤、透析过滤、Nutshe过滤、错流过滤、离心以及它们的组合。
在一些实施方式中，生物大分子与杂质的分离通过沉淀来达成，即，词语“分离”和“沉淀”可以互换使用。沉淀是指在溶液中形成固体组分。在一些实施方式中，固体比溶液的密度大并且“落”到溶质相之外，下沉到溶液底(沉降)。在一些实施方式中，沉淀可以通过离心增强或加速。
在一些实施方式中，在添加过渡金属和聚亚烷基二醇到组合物之后，生物大分子基本上从组合物中沉淀出来。在一些实施方式中，简单地将杂质从沉淀的生物大分子滗出，从而分离生物大分子。在一些实施方式中，50％、60％、70％、80％、85％、90％92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的生物大分子从组合物中沉淀出来。
在一些实施方式中，生物大分子与杂质的分离通过使用滤器达成。术语“过滤(filtration)”或“过滤了(filtering)”是指通过将组合物通过指定孔径直径的一个或多个半透性膜(或介质)而从组合物中移除悬浮的粒子的过程。术语“渗透流”在涉及过滤时是指在过滤期间流过滤器孔的组合物部分。术语“固体流”在涉及过滤时是指在过滤期间保留在滤器上或未流过滤器孔的组合物部分。在一些实施方式中，本发明的生物大分子在过滤后基本上在渗透流中(即，其流过滤器孔并且被收集)，而杂质(例如，细胞碎片、DNA和/或HCP)则基本上在固体流中。在一些实施方式中，过滤后本发明的生物大分子基本上在固体流中，而杂质则基本上在渗透流中。在一些实施方式中，可以使用“小试规模”过滤来预测用于工业规模过滤的适当条件。
用于纯化具体生物大分子的合适的滤器类型、化学性质和模块配置(module configuration)是本领域的那些技术人员已知的并且可以根据多种因素选择，例如，待过滤的组合物的组分的量和大小、待过滤的组合物的体积和待过滤的组合物的细胞密度和生活力。参见，例如Reynolds T，Boychyn M，Sanderson T，Bulmer M，More J，Hoare，M，Biotechnology andBioengineering(生物技术与生物工程)，83(4)，第454-464页(2003)。在一些实施方式中，可以使用如下的滤器：膜滤器、板式滤器、筒式滤器、袋式滤器、加压叶滤器、转筒式滤器或真空滤器。在一些实施方式中，使用深度滤器(depth filter)或交错滤器(cross filter)。应用于本发明的错流滤器模块类型包括中空纤维、管、平板(板-和-框)、螺旋卷(spiral wound)或涡流(例如，旋转的)滤器几何形状。在一些实施方式中，使用切向流滤器。在一些实施方式中，在切向流(错流)模式中采用中空纤维、管和平板膜模块。可以采用的商购获得的滤器是多个制造厂商制造的，如Millipore公司(Billerica，MA)、Pall公司(East Hills，NY)、GE HealthcareSciences(Piscataway，NJ)和Sartorius公司(Goettingen，Germany)。在一些实施方式中，使用死端滤器。可以采用的商购获得的死端滤器是多个制造厂商制造的，如Millipore公司(Billerica，MA)、Pall公司(East Hills，NY)、GE Healthcare Sciences(Piscataway，NJ)和Sartorius公司(Goettingen，Germany)。
本发明滤器中的孔径可以根据分离的生物大分子类型和组合物中存在的杂质类型而变化。在一些实施方式中，滤器孔径可以是直径为0.1μm至4.0μm、0.2μm至2.0μm或0.2μm至1.5μm。
在过滤期间组合物诸如收获加料移动通过滤器因膜阻力而产生了跨膜压力。随着细胞材料在膜表面积累(或极化)，以恒定流速流经膜的阻力增加，从而引起驱动力或跨膜压力增加。如果近膜表面的细胞材料的量降低，或如果膜被较少地极化，则跨膜压力趋向于保持基本上恒定。计算跨膜势(transmembrane potential)的方法是本领域那些技术人员已知的并且包括压力传感器或压力计的使用。在本发明的一些实施方式中，跨膜压力可以通过获得加料和固体流出口压力的平均值与渗透流压力之差来计算。
一般地，在组合物例如收获加料过滤期间，随着更多的组合物加载到滤器上，滤器的跨膜压力显著增加。例如，在一些实施方式中，从过滤过程开始(当第一批量的组合物置于滤器上时)到因滤器孔被堵塞而过滤过程结束(通常跟随细胞材料的7-10×浓缩和3-5×透析过滤)跨膜压力增加了5psi、7psi、10psi、15psi或20psi或更高。因此，术语“基本上恒定的”在涉及跨膜压力时是指在整个过滤过程中跨膜压力增加不大于4psi、3psi或2psi。在一些实施方式中，本发明涉及纯化组合物中的生物大分子的方法，所述方法包括：(a)添加聚亚烷基二醇至所述组合物中；(b)添加过渡金属至所述组合物中；以及然后(c)通过膜过滤所述组合物，所述过滤产生了跨膜压力，其中所述跨膜压力在过滤期间保持基本上恒定。
在一些实施方式中，本发明的方法降低了蛋白滤器排斥(protein filterrejection)。术语“蛋白滤器排斥”可以通过等式R＝(1-[CP/CR])来示例，其中R代表蛋白滤器排斥系数、CP是感兴趣的生物大分子的瞬时渗透浓度，并且CR是感兴趣的生物大分子的瞬时固体浓度。在一些实施方式中，本发明涉及分离组合物中的生物大分子的方法，所述方法包括：添加聚乙二醇至所述组合物中；添加过渡金属至所述组合物中并过滤所述生物大分子，其中对于给定体积通过量，所述蛋白滤器排斥系数的值与没有聚亚烷基二醇和/或过渡金属添加的组合物中的生物大分子相比较低。
当分离生物大分子时，在一些实施方式中，可以存在大体积的组合物(例如，收获加料)，例如在商业制造过程中。大体积对纯化过程存在几种挑战。例如，通过滤器的流速的小的改变对分离的生物大分子回收率的影响在使用大体积时被放大。同样，当使用大体积时，收获加料中细胞密度的增加对产物回收率的影响也被放大。因此，使用大体积的组合物存在被放大的独特问题，并且与较小的体积相比具有较大的区分。因此，在一些实施方式中，本发明涉及分离在大体积的组合物中存在的生物大分子的方法。术语“大体积”是指与生物大分子的商业和/或工业生产相关的体积。在一些实施方式中，术语“大体积”是指10至30,000升、20至20,000升或50至15,000升。
在一些实施方式中，本发明的方法包括通过使组合物经受离心力(即，离心)而将生物大分子与杂质分离，其中离心形成了上清液和沉淀。各种离心形式是本领域内所已知的。参见，例如Boychyn M，Doyle W，Bulmer M，More J，Hoare M，Biotechnology and Bioengineering(生物技术与生物工程)，69(1)，第1-10页(2000)。在一些实施方式中，离心形成了基本上不含杂质(细胞或细胞碎片)的上清液和集中的细胞/细胞碎片沉淀。术语“沉淀”或“固体饼”在涉及离心时是指在离心期间被沉淀(或成粒)形成细胞/细胞碎片团块的组合物部分。术语“上清液”是指在离心期间组合物没有被沉淀(或成粒)的部分，例如保留在组合物中的水相内的组合物部分。在一些实施方式中，离心后本发明的生物大分子基本上在上清液中(即，它基本上保持悬浮在组合物的液体部分中)。在一些实施方式中，离心后，本发明的生物大分子基本上在沉淀中(例如，它从溶液沉淀出来或存在于离心所得的沉淀中)。在一些实施方式中，50％、60％、70％、80％、85％、90％92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(w/w)的生物大分子在沉淀中。在一些实施方式中，使用密度梯度来分离生物大分子与杂质。因此，在一些实施方式中，在离心后生物大分子和杂质均保留在上清液中，但密度不同，从而处在离心装置中的不同位置。
可以使用多种离心装置。在一些实施方式中，离心可以通过盘叠离心(disc stack centrifugation)来完成。在一些实施方式中，可以使用“小试规模”过滤来预测用于工业规模过滤的适当条件。可以改变离心变量来达到对感兴趣的生物大分子的最佳分离。例如，在一些实施方式中，可以使用多种旋转速度或流速来增加生物大分子回收的质量和/或生物大分子回收的数量。
当从含有细胞培养物的具有高初始密度的生物材料的生物反应器中分离生物大分子时可使用本发明。例如，在一些高密度培养物中，跨膜压力通常跨过滤器显著降低，这大概是高浓度的细胞材料致使膜表面污损的结果。增加的滤器污损继而能够不利地影响回收的生物大分子的数量，降低产量并导致在渗透流中相对较高的杂质水平。在一些情况下，跨膜压力可能增加至超过滤器的机械性能的值，从而引起操作在完成之前停止并导致显著降低的产物产率。为了降低滤器跨膜压力、增加固体流中的蛋白回收率并降低固体流中的杂质量，在一些实施方式中，本发明的方法包括在过滤之前添加聚亚烷基二醇和过渡金属，从而引起大细胞和细胞碎片的絮凝连同其他杂质(如DNA)的沉淀。杂质(细胞、细胞碎片和DNA)絮凝成大粒子能够改善滤器表面附近的组合物的质量转移，从而在预定的渗透流流量或流速下降低跨滤器的跨膜压力。
在一些实施方式中，从高细胞密度组合物(例如，收获加料)中收获生物大分子是有益的或期望的。高细胞密度组合物与正常的细胞密度组合物相比存在独特的问题。例如，高细胞密度组合物在组合物中可以存在较高量的杂质，从而增加了在纯化过程期间需要清除的杂质的量。例如，较高细胞密度组合物可能更快地污损滤器，从而阻止组合物的过滤。在一些实施方式中，高细胞密度组合物需要使用较多的滤器或具有较大表面积的滤器。这些需要均导致与过滤相关的成本更高和/或产物损失。在本发明中，将聚亚烷基二醇和过渡金属添加到组合物中，从而移除一些杂质，并容许较高细胞密度组合物的纯化。因此，本发明的一些实施方式涉及分离在高细胞密度组合物中存在的生物大分子的方法。术语“高细胞密度”一般是指下列在收获加料中的细胞密度：对于哺乳动物细胞为每ml约1×105至3.5×107、约1.0×106至约1.0×107、或约5.0×106至约9.0×106个细胞。当然，本领域的技术人员将理解不同的细胞传统上在不同的细胞密度下生长。因此，在一些实施方式中，“高细胞密度”细胞培养物是指含有密度高于该细胞系传统上所实践的密度的细胞的细胞培养物。
在本发明的一些实施方式中，在将生物大分子与杂质分离之前调节组合物的pH。例如，在一些实施方式中，将组合物的pH调节至低于收获加料的pH。本发明的组合物(例如包括收获加料的那些组合物)一般在不调节的情况下具有约6.0至约8.0、约6.5至约7.5或约6.8至约7.2的pH。在一些实施方式中，低于收获加料的pH的任何pH可用于本发明的分离。在一些实施方式中，将组合物的pH降低至如下范围内的pH：约1.0至约6.0、约2.0至约5.5、约3.0至约6.5、约3.0至约5.0、约4.0至约5.0、约4.0至约4.7、约4.3至约5.0或约4.7至约5.0。在一些实施方式中，将组合物的pH降低至约4.0至约4.7的范围内。在一些实施方式中，可以将pH降低至约3.5的pH。对于一些生物大分子，低于3.5的pH导致感兴趣的生物大分子变性或不稳定，因而是不期望的。在一些实施方式中，将组合物的pH增加至下列范围内的pH：约6.0至约10.0、约6.5至约9.5、约7.0至约9.0、约7.5至约8.5、约7.0至约8.0或约7.5。在一些实施方式中，将组合物的pH增加至约7.0至约9.0的范围内。在一些实施方式中，可以将pH增加至约8.0或约9.0的pH。
本发明的组合物的pH可以通过多种手段来调节。在一些实施方式中，通过将酸或碱添加至组合物中来降低pH。合适的酸包括但不限于：强酸，如高氯酸(HClO4)、氢碘酸(HI)、氢溴酸(HBr)、盐酸(HCl)、硝酸(HNO3)、硫酸(双质子的)(H2SO4)；或弱酸，如乙酸(CH3COOH)(例如冰乙酸)、柠檬酸(C6H8O7)、甲酸(HCOOH)、氢氰酸(HCN)、硫酸氢根离子(HSO4 -)或上面所列的任何酸的组合。合适的碱包括但不限于：强碱，如氢氧化钾(KOH)、氢氧化钡(Ba(OH)2)、氢氧化铯(CsOH)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锶(Sr(OH)2)、氢氧化钙(Ca(OH)2)、氢氧化锂(LiOH)、氢氧化铷(RbOH)；或弱碱，如氨，或上面所列的任何碱的组合。
在一些实施方式中，可以通过使用缓冲液来调节组合物的pH，如磷酸盐缓冲液(例如，磷酸钠和磷酸钾)、碳酸氢盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、氨丁三醇缓冲液、HEPES缓冲液以及它们的组合。
在一些实施方式中，添加过渡金属至组合物中导致感兴趣的生物大分子与杂质共沉淀，从而导致分离后生物大分子的纯度降低。在一些实施方式中，添加聚乙二醇至组合物中适于提高感兴趣的生物大分子的回收率。术语“提高的回收率”是指本发明的方法(添加聚亚烷基二醇和过渡金属二者)与不添加过渡金属或聚亚烷基二醇的相同纯化方法的比较。例如，如果方法A是本发明的方法(不同的是其不包括添加过渡金属至收获加料)并产生100mg的感兴趣的生物大分子，并且方法B与方法A相同(不同的是方法B包括添加过渡金属至收获加料)并产生110mg的生物大分子，那么将确定方法B具有10％的“提高的选择性回收率”。在一些实施方式中，本发明的方法将生物大分子的回收率提高了大于3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方式中，本发明的方法将回收率提高了多达10％、15％、20％、25％、30％或50％。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇和过渡金属的添加将生物大分子的回收率提高了大于3％。在一些实施方式中，聚亚烷基二醇和过渡金属的回收将生物大分子的回收率提高了大于10％。
在本发明的一些实施方式中，将聚亚烷基二醇添加至组合物中。根据本发明的一些实施方式，聚亚烷基二醇是具有1,000Da至20,000Da之间的分子量的聚乙二醇；过渡金属是锌；分离是通过在溶液中沉淀生物大分子，并然后离心组合物以分离沉淀物来进行；并且所述生物大分子是抗体。
在本发明的一些实施方式中，聚亚烷基二醇是具有1,000Da至20,000Da之间的分子量的聚乙二醇；过渡金属是锌；分离是通过在溶液中沉淀生物大分子，并然后过滤组合物以分离沉淀物来进行；并且所述生物大分子是抗体。
在本发明的一些实施方式中，本发明的方法涉及增加过滤过程的稳健度的方法，所述方法包括：(a)添加聚亚烷基二醇至组合物中；(b)添加过渡金属至所述组合物中；以及(c)通过膜过滤所述组合物。术语“增加稳健度”是指对于给定滤器使用较宽范围的流速而不增加跨膜压力、杂质浓度或产物损失的能力。术语“增加稳健度”还指对于给定滤器过滤较大体积或较高细胞密度的收获加料而不增加跨膜压力、杂质浓度或产物损失的能力。
在本发明的一些实施方式中，所述方法涉及在过滤之前净化包含生物大分子的组合物(例如收获加料)的方法，所述方法包括：(a)添加聚亚烷基二醇至所述组合物中；(b)添加过渡金属至所述组合物中；以及(c)将所述生物大分子与所述组合物中的杂质分离。在一些实施方式中，净化组合物与降低浊度相关，如由浊度计诸如Hach 2100AN浊度计(Hach Co.，Loveland，CO)所测量的。
本发明的方法的步骤可以按多种顺序排序。例如，在本发明的一些实施方式中，在添加过渡金属和将生物大分子与杂质分离之前添加聚亚烷基二醇。在一些实施方式中，先添加聚亚烷基二醇，再添加过渡金属，然后将生物大分子与杂质分离。在其他实施方式中，先添加过渡金属，再添加聚亚烷基二醇，然后分离生物大分子。在一些实施方式中，可以在(a)添加聚亚烷基二醇、(b)添加过渡金属、或(c)将生物大分子与杂质分离之间存在一个或多个纯化步骤。可选择地，本发明的方法的步骤(a)、(b)或(c)可以是连续的，例如，在步骤(a)、(b)和(c)之间无额外的纯化步骤。然而，在步骤(a)、(b)和(c)是连续的时，可以在步骤(a)、(b)和(c)之前或之后存在额外的纯化步骤。在一些实施方式中，将聚亚烷基二醇和过渡金属在添加至组合物之前混合在一起以形成共用储备液。在一些实施方式中，将聚亚烷基二醇和过渡金属同时添加到组合物中。在一些实施方式中，将聚亚烷基二醇和过渡金属以任意顺序连续添加到组合物中。
在一些实施方式中，在沉淀之前生物大分子的浓缩在降低生物大分子的沉淀和回收所需的聚亚烷基二醇和/或过渡金属的数量方面是有效的。例如，沉淀之前的浓缩可能将聚亚烷基二醇和/或过渡金属的数量降低约2倍至约40倍。超滤、微滤和其他方法的生物大分子浓缩是在沉淀之前浓缩的有效方法。
在一些实施方式中，可以洗涤沉淀以在生物大分子的重溶解之前进一步移除杂质。例如，可以用一种或多种溶液(或溶液的组合)洗涤沉淀，所述溶液包括但不限于水或含有聚亚烷基二醇(例如，浓度为约0.5％至约5％(w/v))、过渡金属(例如，浓度为约0.5mM至约5mM)、螯合剂(例如，EDTA)、芳族杂环化合物(例如，咪唑)的溶液或各种缓冲溶液。在一些实施方式中，洗涤是通过添加溶液、沉降溶液中的沉淀和/或从沉淀滗出或虹吸出溶液来完成。
在一些实施方式中，生物大分子在沉淀和重溶解之后保持一种或多种生物活性。在一些实施方式中，生物大分子在沉淀、洗涤和重溶解之后保持一种或多种生物活性。术语“生物活性”是指天然存在的生物大分子功能(“天然存在的”还可以包括通过生物大分子(诸如蛋白、抗体或酶)中的突变而引入的异常的或改变的功能)。抗体的一种生物活性的实例包括抗体与抗原的特异性结合。酶的生物活性的实例包括酶的特异性酶促或催化活性。在一些实施方式中，生物大分子保留了约50％至约100％范围内的生物活性(与沉淀之前或沉淀和洗涤之前的生物大分子特异性活性相比)。例如，生物大分子可能保留了在沉淀之前或沉淀和洗涤之前的特异性生物活性的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约100％。
在一些实施方式中，将溶液的pH降低以进一步实现过渡金属(如锌)自生物大分子的重溶解和/或解离。
实施例
将通过具体实施例更详细地描述本发明。下列实施例是为了示例的目的提供的，并且不旨在以任何方式限制本发明。本领域的那些技术人员将容易地认识到可以改变或修改各种非关键的参数以产生根据本发明的替代性实施方式。
实施例1
为了研究各种抗体和其他蛋白自细胞培养化合物的沉淀，测试了几种方法，所述方法包括：(1)仅使用单次添加的聚乙二醇(PEG)3350进行沉淀；(2)仅使用单次添加的氯化锌进行沉淀；(3)使用单次添加的PEG和氯化锌的组合进行沉淀；(4)仅使用增量阶段(incremental cut)的PEG(即，增加的PEG添加)进行沉淀；和(5)使用增量阶段的PEG和锌的组合(即，增加的PEG和/或锌添加)进行沉淀。
为了研究仅使用单次添加(in a single cut)的PEG对抗体Ab C、AbD和Ab E进行的沉淀，用2M Tris碱将含有所述抗体的澄清的收获加料调节至pH 8.0。然后将收获加料调节至2-8℃之间的温度，并在整个纯化过程中保持该温度。然后将收获加料通过0.22μm滤器过滤。将70％PEG3350储备液添加到过滤的材料中至达到10％的PEG 3350浓度。将材料搅拌10分钟，并保持1小时。然后以3,000×g离心10％PEG组合物10分钟，之后滗去上清液。通过摇动/混合1小时将所得的沉淀重悬于PEG-Zn重悬缓冲液中。重悬缓冲液包含缓冲剂和螯合剂。
在考虑任何的稀释因数或浓集因数的情况下通过SEC-HPLC测定收获样品、重悬样品和上清液以确定纯度和回收率。另外，通过Elisa和QPCR方法测定收获样品和重悬样品的HCP和DNA含量。术语“滴度”是指在纯化前，加料储备液中的产物浓度。结果呈现在表1中。
表1
Figure BPA00001245290900301
实施例2
为了研究仅使用单次添加氯化锌对抗体Ab C、Ab D、Ab E进行的沉淀，用2M Tris碱将含有所述抗体的澄清的收获加料调节至pH 7.2。然后将收获加料调节至2-8℃之间的温度，并在整个纯化过程中保持该温度。将收获加料通过0.22μm滤器过滤。将250mM氯化锌储备液添加至过滤的材料中至达到10mM的ZnCl2终浓度。将材料搅拌10分钟，并保持1小时。
然后以3,000×g离心10mM ZnCl2组合物10分钟，之后滗去上清液。通过摇动/混合1小时将所得的沉淀重悬于pH 7.2的PEG-Zn重悬缓冲液中。
在考虑任何的稀释因数或浓集因数的情况下通过SEC-HPLC测定收获样品、重悬样品和上清液以确定纯度和回收率。另外，通过Elisa和QPCR方法测定收获样品和重悬样品的HCP和DNA含量。结果呈现在表2中。
表2
Figure BPA00001245290900302
实施例3
为了研究使用单次添加的PEG和氯化锌的组合对抗体Ab C和Ab F进行的沉淀，用2M Tris碱将含有所述抗体的澄清的收获物调节至pH 7.2。然后将收获加料调节至2-8℃之间的温度，并在整个纯化过程中保持该温度。然后将收获加料通过0.22μm滤器过滤。
第一阶段包括：添加70％PEG 3350储备液至过滤的材料中至达到1.6％的PEG浓度，并添加250mM ZnCl2至过滤的材料中至达到2.7mM的ZnCl2终浓度。然后将材料搅拌10分钟，并保持1小时。然后将所得样品通过0.22μm滤器过滤(“阶段1滤液)，并保留滤液。
第二阶段是通过添加PEG至滤液样品达5.5％的终浓度并添加氯化锌达5mM的终浓度进行的。将这种材料保持1h。
以3,000×g离心所得沉淀10分钟，之后滗去上清液。通过摇动/混合1小时将所得的沉淀重悬于pH 7.2的PEG-Zn重悬缓冲液中。
在考虑任何的稀释因数或浓集因数的情况下通过SEC-HPLC测定收获样品、第一阶段滤液、上清液和重悬样品以确定纯度和回收率。另外，通过Elisa和QPCR方法测定收获样品和重悬样品的HCP和DNA含量。结果呈现在表3中。
表3
  产物   滴度   pH   ％PEG 3350   产物回收率   纯度
  Ab C   10.0g/L   8   4％   83％   95％
  Ab F   9.3g/L   8   8％   90％   85％
实施例4
为了研究仅使用两个增量阶段的PEG对抗体Ab F进行的沉淀，用2M Tris碱将含有所述抗体的澄清的收获物调节至pH 8.0。然后将收获加料调节至2-g℃之间的温度，并在整个纯化过程中保持该温度。然后将收获加料通过0.22μm滤器过滤。
第一PEG阶段包括添加70％PEG 3350储备液至过滤的材料中达4.75％的PEG浓度。然后将材料搅拌10分钟，并保持1小时。然后将所得样品通过0.22μm滤器过滤(“阶段1滤液”)，并保留滤液。
通过添加PEG至滤液样品中达到10.5％的终浓度来进行第二阶段。将这种材料保持1小时并以3,000×g离心所得沉淀10分钟。滗去所得的上清液，并使用pH 4.0的PEG-Zn重悬缓冲液通过摇动/混合1小时将所得的沉淀重悬。
在考虑任何的稀释因数或浓集因数的情况下通过SEC-HPLC测定收获样品、第一阶段滤液、上清液和重悬样品以确定纯度和回收率。另外，通过Elisa和QPCR方法测定收获样品和重悬样品的HCP和DNA含量。结果呈现在表4中。
表4
实施例5
检测了滴度(浓度)对Ab F沉淀的试剂要求的影响。在2-8℃下用2M Tris碱将Ab F的收获细胞培养液(HCCF)(HCCF的初始浓度为6.5g AbF/L)调节至pH 7.2。使用PELLICON-2
Figure BPA00001245290900331
50千道尔顿(kDa)筒(Millipore，Inc.)将HCCF浓缩至32.5g/L或65g/L；然后将65g/L的一个样品透析过滤(更换缓冲液)到在6℃下传导率为约7mS/cm的pH 7.2的5mM磷酸钠缓冲液中。产生了四种不同的样品：一种为细胞培养液(CCF)中的6.5g/L Ab F；一种为CCF中的32.5g/L Ab F；一种为CCF中的65g/L Ab F；并且一种为磷酸钠缓冲液中的65g/L。添加氯化锌和PEG 3350至所需的浓度以达到每种样品各自的期望产率。实验条件呈现在表5中并且实验结果呈现在表6中。
表5
Figure BPA00001245290900332
表6
Figure BPA00001245290900333
Figure BPA00001245290900341
实施例6
研究了多种其他沉淀剂对各种IgG1分子的沉淀的影响。用不同量的聚乙二醇、氯化锌、乙醇、辛酸或利凡诺孵育表达抗体Ab A或Ab B的细胞培养物。然后通过尺寸排阻色谱(对于氯化锌、乙醇、辛酸和利凡诺)或通过蛋白A HPLC测定沉淀的抗体的量。结果呈现在表7中。
表7
Figure BPA00001245290900342
上述数据表明PEG、乙醇和锌的存在增加了单体产率以及细胞材料的清除(如通过OD280所测量的)。数据表明辛酸降低了单体产率，但不影响OD280。利凡诺不沉淀任何物质。
实施例7
制造规模使用所需的沉淀剂的量可以根据10,000L生长室确定。表8列出了建议的：(1)沉淀所需的乙醇、氯化锌和PEG的浓度和量；(2)由沉淀剂增加的额外体积；(3)沉淀剂相关的危害；(4)进一步的下游处理所需的清除问题；和(5)沉淀剂的具体处理要求。
表8
Figure BPA00001245290900351
实施例8
研究了在7.0的pH下采用多于一种的沉淀剂对含有Ab C抗体的组合物的影响。将组合物调节至含有0.5％PEG、1％PEG、2％PEG或4％PEG以及2.5mM ZnCl2、5mM ZnCl2或10mM ZnCl2。结果显示在图9中。
如可以看到的，添加PEG和ZnCl2二者提供了比仅添加PEG或ZnCl2显著更高的沉淀效应。增加的沉淀效应还比PEG或ZnCl2的加性效应更高。因此，PEG和ZnCl2在一齐使用时对产品回收率表现出协同效应。
实施例9
研究了在8.0的pH下采用多于一种的沉淀剂对含有抗体Ab C的组合物的影响。将组合物调节至含有0.5％PEG、1％PEG、2％PEG或4％PEG以及2.5mM ZnCl2、5mM ZnCl2或10mM ZnCl2。结果显示在图10中。
如可以看到的，添加PEG和ZnCl2二者提供了比仅添加PEG或ZnCl2显著更高的沉淀效应。增加的沉淀效应还比PEG或ZnCl2的加性效应更高。因此，PEG和ZnCl2在一齐使用时对产品回收率表现出协同效应。
实施例10
研究了在9.0的pH下采用多于一种的沉淀剂对含有抗体Ab C的组合物的影响。将组合物调节至含有0.5％PEG、1％PEG、2％PEG或4％PEG以及2.5mM ZnCl2、5mM ZnCl2或10mM ZnCl2。结果显示在图11中。
如可以看到的，添加PEG和ZnCl2二者提供了比仅PEG或ZnCl2显著更高的沉淀效应。这种协同的沉淀效应还比PEG和ZnCl2一起的预期加性效应更高。
实施例11
研究了PEG、ZnCl2以及二者的组合对多种其他抗体的沉淀的影响。测试了四种不同的抗体：两种IgG1抗体和两种IgG4抗体。产物回收率的结果呈现在表9中。
表9
Figure BPA00001245290900361
Figure BPA00001245290900371
表9中的数据证明PEG和ZnCl2的组合提供了大于对各种型和类的抗体沉淀的加性效应。例如，添加5％PEG(4％)和10mM ZnCl2(35％)至包含抗体Ab C的组合物的预期加性效应是39％。然而，观察到了协同效应，因为沉淀了91.1％的抗体Ab C协同效应。
实施例12
通过用Nutsche过滤捕获和沉淀洗涤来进行浓缩之后的Ab F沉淀。
在2-8℃下用2M Tris碱将Ab F的收获细胞培养液(HCCF)(HCCF的初始浓度为6.7g Ab F/L)调节至pH 7.2。
Figure BPA00001245290900372
50千道尔顿(kDa)筒(Millipore，Inc.)将HCCF浓缩至67g/L；然后将样品透析过滤(更换缓冲液)到pH 7.2的5mM磷酸钠缓冲液中。(注意：浓缩可以使用多种微滤/超滤膜和滤器或方法来达成，例如使用其他浓缩方法，如离心缓冲液更换或搅拌细胞)。在剧烈搅拌时，将pH3.0的含有250nM氯化锌的储备溶液的单个团块(single bolus)添加到浓缩的样品中至终浓度为2.5mM。添加氯化锌之后，将30％PEG 3350和100mM咪唑的单个团块立即添加到搅拌的样品中至终浓度为1.5％PEG 3350和10mM咪唑。将所得的沉淀搅拌30分钟。然后将硅藻土(CELPURE
Figure BPA00001245290900373
1000)添加至搅拌的沉淀中至终浓度为60g/L(w/v)并以恒定的流速供应至死端的Nutsche(加压的)滤器。当滤器压力达30psi时，形成沉淀饼。随后用至少3体积当量的一系列溶液(包括水)洗涤滤饼。然后用pH 5.0的40mM EDTA、60mM乙酸重溶解所得沉淀饼。注意：可以用包括下列的一系列溶液重溶解沉淀样品：100mM EDTApH 7.2；100mM乙酸pH 5.0；2.5mM EDTA和60mM乙酸pH 5.0；250mMTris pH 8.0。然后通过尺寸排阻色谱(SEC)、SDS-PAGE和凝胶-芯片SDS-PAGE测定重溶解的样品的纯度、并测定宿主细胞蛋白和DNA含量。
随后通过两个色谱步骤纯化重溶解的mAb：离子交换色谱和疏水交换色谱。通过SEC、宿主细胞蛋白和DNA含量测定各得到的洗脱物。结果描绘在图12-14中。
实施例13
通过捕获和洗涤并通过沉降和虹吸进行浓缩后的Ab F沉淀。
在2-8℃下用2M Tris碱将Ab F的收获细胞液(HCCF)(HCCF的初始浓度为6.7g Ab F/L)调节至pH 7.2。50千道尔顿(kDa)筒(Millipore，Inc.)将HCCF浓缩至67g/L；然后将样品透析过滤(更换缓冲液)到pH 7.2的5mM磷酸钠缓冲液中。(注意：浓缩可以使用多种微滤/超滤膜和滤器或方法来达成，例如使用其他浓缩方法，如离心缓冲液更换或搅拌细胞)。将35mM氯化锌与浓缩的样品混合至终浓度为2.5mM。添加氯化锌之后，将11％PEG 3350和200mM咪唑立即添加到样品中至终浓度为1.5％PEG3350和10mM咪唑。将所得的沉淀搅拌30分钟。容许沉淀沉降2小时并通过抽吸移除上清液。如下洗涤沉淀饼：用至少2体积当量的几种溶液(包括水)将沉淀重悬至最初的体积，在每两次沉淀洗涤之间容许沉淀沉降2h。然后用pH 5.0的40mM EDTA、60mM乙酸重溶解所得沉淀饼。然后通过尺寸排阻色谱(SEC)、SDS-PAGE和凝胶-芯片SDS-PAGE测定重溶解的样品的纯度、并测定宿主细胞蛋白和DNA含量。结果呈现在表10中。
表10：
Figure BPA00001245290900382
Figure BPA00001245290900391
实施例14
用PEG 3350和ZnCl2进行Ab F沉淀以移除低分子量杂质。
在2-8℃下用2M Tris碱将Ab F的收获细胞液(HCCF)(HCCF的初始浓度为6.7g Ab F/L)调节至pH 7.2。
Figure BPA00001245290900392
50千道尔顿(kDa)筒(Millipore，Inc.)将HCCF浓缩至67g/L；然后将样品透析过滤(更换缓冲液)到pH 7.2的5mM磷酸钠缓冲液中。(注意：可以使用包括50kDa MWCOPELLICON-2
Figure BPA00001245290900393
的多种超滤膜或通过包括离心缓冲液更换或搅拌细胞的其他方法达成浓缩)。在剧烈搅拌时，将pH3.0的含有250nM氯化锌的储备溶液的单个团块添加到浓缩的样品中至终浓度为2.5mM。添加氯化锌之后，将30％PEG 3350和100mM咪唑的单个团块立即添加到搅拌的样品中至终浓度为1.5％PEG 3350和10mM咪唑。将所得沉淀搅拌30分钟、取样并重溶解，并通过SEC测定所得沉淀以确定低分子量杂质含量(LMW)。发现在存在咪唑的条件下用ZnCl2和PEG 3350进行的沉淀将LMW杂质水平降低至接近零；发现在不存在咪唑的条件下用PEG和ZnCl2进行的沉淀将低分子量杂质水平由约16％降低至约6％。结果展示在图15中。
本发明不被限制在所描述的具体实施方式的范围内，具体实施方式仅旨在作为本发明的各方面的例示，并且功能上等同的任何组合物或方法均在本发明的范围内。实际上，除了本文所显示和描述的那些以外，本发明的各种修改由上述说明书和附图将对本领域的熟练技术人员变得明显。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本说明书中所提到的所有的出版物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同将每一个篇单独的出版物或专利申请特定地且单独地指示为通过引用并入一样。

Claims (44)

1.一种分离含有杂质的组合物中的生物大分子的方法，所述方法包括：
(a)添加聚亚烷基二醇至所述组合物中；
(b)添加过渡金属至所述组合物中；以及
(c)将所述生物大分子与所述杂质分离。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇选自由下列组成的组：聚戊二醇、聚丁二醇、聚丙二醇或聚乙二醇。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述聚乙二醇具有1,000Da至20,000Da之间的分子量。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述聚乙二醇具有2,000Da至15,000Da之间的分子量。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述添加聚亚烷基二醇产生了具有约0.5％至约30％(w/v)的聚亚烷基二醇浓度的组合物。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述添加聚亚烷基二醇产生了具有约2.0％至约10％(w/v)的聚亚烷基二醇浓度的组合物。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述过渡金属选自由下列组成的组：锌、镍、铜、钴或锰。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述过渡金属是锌。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述添加过渡金属产生了具有约1mM至约50mM的过渡金属浓度的组合物。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述添加过渡金属产生了具有约2.5mM至约15mM的过渡金属浓度的组合物。
12.如权利要求1所述的方法，其中(c)的所述分离是通过过滤所述组合物进行的，所述过滤形成了渗透流和固体流。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述过滤是通过死端滤器进行的。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述生物大分子基本上在所述固体流中。
15.如权利要求1所述的方法，其中(c)的所述分离是通过使所述组合物经受离心来进行的，所述离心形成了上清液和沉淀。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述生物大分子基本上在所述沉淀中。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述生物大分子是蛋白质。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述蛋白质是可溶性蛋白质。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含真核细胞材料。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述杂质选自由下列组成的组：蛋白质、脂类、核酸、核糖核酸、生长培养基以及它们的组合。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇和过渡金属的添加将所述生物大分子的回收率增加了大于3％。
23.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇和过渡金属的回收将所述生物大分子的回收率增加了大于10％。
24.如权利要求1-14和17-23中任一项所述的方法，其中(c)中的所述分离是通过过滤所述组合物进行的，其中所述过滤产生了跨膜压力；并且其中所述跨膜压力在过滤期间保持基本上恒定。
25.如权利要求1所述的方法，其中
(a)所述聚亚烷基二醇是具有1,000Da与20,000Da之间的分子量的聚乙二醇
(b)所述过渡金属是锌
(c)所述分离是通过沉淀溶液中的所述生物大分子，并然后离心所述组合物以分离沉淀来进行的；并且
(d)所述生物大分子是抗体。
26.如权利要求1所述的方法，其中
(a)所述聚亚烷基二醇是具有1,000Da与20,000Da之间的分子量的聚乙二醇
(b)所述过渡金属是锌
(c)所述分离是通过沉淀溶液中的所述生物大分子，并然后过滤所述组合物以分离沉淀来进行的；并且
(d)所述生物大分子是抗体。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述聚亚烷基二醇和所述过渡金属的添加对所述生物大分子的沉淀具有协同效应。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中形成所述生物大分子的沉淀，并然后洗涤该沉淀。
29.如权利要求28所述的方法，其中用水洗涤所述沉淀。
30.如权利要求28所述的方法，其中用包含浓度为约0.5mM至约5mM的ZnCl2的溶液洗涤所述沉淀。
31.如权利要求28所述的方法，其中用包含浓度为约0.1％至约2.5％.的聚亚烷基二醇的溶液洗涤所述沉淀。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，所述方法还包括使用选自由下列组成的组的化合物以用于分离所述生物大分子：
a)咪唑；
b)甘氨酸；
c)色氨酸；
d)半胱氨酸；
e)组氨酸；
f)组胺；以及
g)氯化铵。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述化合物是咪唑。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中浓度在约0.5％至约5％(w/v)的范围内的聚亚烷基二醇用于分离所述生物大分子。
35.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中浓度(w/v)选自由下列组成的组的聚亚烷基二醇用于分离所述生物大分子：
a)约0.5％；
b)约1％；
c)约1.5％；
d)约2％；
e)约2.5％；
f)约3％；
g)约3.5％；
h)约4％；
i)约4.5％；以及
j)约5％。
36.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中浓度在约0.5mM至约5mM的范围内的过渡金属用于分离所述生物大分子。
37.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中浓度选自由下列组成的组的过渡金属用于分离所述生物大分子：
a)约0.5mM；
b)约1mM；
c)约1.5mM；
d)约2mM；
e)约2.5mM；
f)约3mM；
g)约3.5mM；
h)约4mM；
i)约4.5mM；以及
j)约5mM。
38.如权利要求1所述的方法，其中将所述聚亚烷基二醇添加到所述组合物中以产生约1.5％(w/v)的聚亚烷基二醇浓度并且其中将所述过渡金属添加到所述组合物中以产生约2.5mM的过渡金属浓度。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中在添加聚亚烷基二醇或过渡金属之前浓缩所述生物大分子。
40.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中在添加聚亚烷基二醇和过渡金属之前浓缩所述生物大分子。
41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述之前浓缩将分离所述生物大分子所需的聚亚烷基二醇或过渡金属的数量降低约2倍至约40倍。
42.如权利要求39或40所述的方法，其中所述之前浓缩将分离所述生物大分子所需的聚亚烷基二醇或过渡金属的数量降低选自由下列组成的组的倍数：
a)约2倍；
b)约3倍；
c)约4倍；
d)约5倍；
e)约10倍；
f)约15倍；
g)约20倍；
h)约25倍；
i)约30倍；
j)约35倍；以及
k)约40倍。
43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述生物大分子保留了与沉淀之前或沉淀和洗涤之前的所述生物大分子的特异性活性相比约50％至约100％的生物活性。
44.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述生物大分子保留了与沉淀之前或沉淀和洗涤之前的所述生物大分子的特异性活性相比为选自由下列组成的组的值的生物活性：
a)约50％；
b)约60％；
c)约70％；
d)约80％；
e)约90％；
f)约95％；以及
g)约100％。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114432811A (zh) * 2022-01-14 2022-05-06 南昌大学 一种错端滤一体式复合滤筒除尘装置

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150122645A (ko) * 2013-02-26 2015-11-02 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 비이온성 유기 폴리머들 및 전기양성 표면들의 존재에서의 단백질 정제
KR20150122650A (ko) * 2013-02-28 2015-11-02 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 상승된 전도도에서 비이온성 유기 폴리머들의 존재에서의 단백질 정제
PT3677271T (pt) 2013-03-13 2023-05-31 Univ Miami Método de isolamento e purificação de microvesículas de sobrenadantes de cultura celular e fluidos biológicos
EP3255054A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the purification of biological macromolecular complexes
EP3971291A1 (en) 2017-02-27 2022-03-23 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
AU2023340945A1 (en) 2022-09-16 2025-03-13 Amgen Inc. A method for harvesting products from perfusion cultures

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3808189A (en) * 1973-03-15 1974-04-30 American Cyanamid Co Isolation of gamma globulin preparations enriched in iga and igm using polyethylene glycol
DK139056B (da) * 1976-04-06 1978-12-11 Nordisk Insulinlab Fremgangsmåde til udvinding af immunoglobulin, der er egnet til intravenøs indgivelse.
US4164495A (en) * 1976-04-06 1979-08-14 Nordisk Insulinlaboratorium Method of recovering immunoglobulin using a polyol and an alkanoic acid
DK25877A (da) * 1977-01-21 1978-08-15 Nordisk Insulinlab Fremgangsmaade til udvinding af renset albumin fra blodplasma
US4841024A (en) * 1986-09-15 1989-06-20 Becton Dickinson And Company Purification of antibodies
US4801687A (en) * 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
DE68921982T4 (de) 1988-06-14 1996-04-25 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US4939176A (en) * 1988-12-20 1990-07-03 Miles Inc. Viral inactivation process
US4933435A (en) * 1989-04-05 1990-06-12 Bioprobe International Antibody purification process
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5151504A (en) * 1989-11-17 1992-09-29 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for purification of monoclonal antibodies
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
CA2078689C (en) 1990-03-20 2003-02-11 Sherie L. Morrison Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
DK0447585T4 (da) * 1990-03-22 2003-09-01 Biotest Pharma Gmbh Fremgangsmåde til fremstilling af et intravenøst tolerant immunglobulin-G-præparat
US5110913A (en) * 1990-05-25 1992-05-05 Miles Inc. Antibody purification method
US5135875A (en) * 1990-08-15 1992-08-04 Abbott Laboratories Protein precipitation reagent
JPH09506761A (ja) 1990-11-09 1997-07-08 ステファン ディー．ギリーズ サイトカインの免疫複合体
US5525519A (en) * 1992-01-07 1996-06-11 Middlesex Sciences, Inc. Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5665570A (en) * 1994-02-10 1997-09-09 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody-encoding recombinant DNA and its use
US5429746A (en) * 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
US5641870A (en) * 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
DE19543737A1 (de) * 1995-11-24 1997-05-28 Hoechst Ag Verfahren zur Ultrafiltration von Peptide oder Proteine enthaltender biologischer Matrices
US5907035A (en) * 1996-05-23 1999-05-25 Baxter Biotech Technology Sarl Aqueous two-phase metal affinity partitioning protein purification system
WO2000020835A2 (en) * 1998-10-07 2000-04-13 Sigma-Aldrich Co. Thromboplastin reagents and methods for preparing and using such reagents
ATE300956T1 (de) * 1999-04-13 2005-08-15 Apc Europ S A Anwendung und herstellungsverfahren von tierischen gammaglobulin-reichen plasmaprotein mischungen
US7064191B2 (en) * 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6846410B2 (en) * 2002-05-03 2005-01-25 Zirchrom Separations, Inc. High stability porous metal oxide spherules used for one-step antibody purifications
GB0624227D0 (en) * 2006-12-05 2007-01-10 Common Services Agency Protein purification

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114432811A (zh) * 2022-01-14 2022-05-06 南昌大学 一种错端滤一体式复合滤筒除尘装置

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