JP5680079B2 - Ｒｎａの正規化した定量化方法 - Google Patents

Description

本発明は、生物学および化学の分野内にある。特に、本発明は、分子生物学の分野内にある。より詳細には、本発明は、核酸の定量化およびリアルタイムＰＣＲの分野内にある。さらに、本発明は、ＲＮＡの正規化された定量化、および試料（例えば、ＲＮＡの混合物）中のＲＮＡの数量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）の正規化に関する。

ＲＮＡの混合物中の特定のＲＮＡを定量化（定量）することは、遺伝子発現解析、または核酸の混合物から特定の核酸を精製する間などの分子生物学におけるいくつもの適用において重要である。定量化方法では、試料中の特定のＲＮＡの濃度および／または相対的もしくは絶対的な量（ａｍｏｕｎｔ）を決定する。特に、遺伝子発現の解析に関して、例えば生物試料中のｍＲＮＡのレベルを測定するために、再現性があり、かつ相対的な方法が望まれる。例えば、比較できる容積、ＲＮＡ量、細胞材料などを有する生物試料を必ずしも得ることができるとは限らない。異なる試料は、例えば、異なる生物体もしくは個体からの異なる組織、または異なる化合物で処理された細胞培養試料に由来するＲＮＡを含み得る。

さらに、検出の感度および選択性ならびに生物試料中のＲＮＡの定量化が重要である。２つ以上の異なる（生物）試料において特定のＲＮＡの数量を良好に比較するため、または試料中の２つ以上の異なる特定のＲＮＡの数量を良好に比較するために、投入ＲＮＡに対するまたは特定のクラスの投入ＲＮＡに対する特定のＲＮＡの数量について正規化を実施しなければならない。特定のＲＮＡの数量は、例えば、これらの数量を、試料の内部標準と関連づける、または全体すなわち試料中の核酸の総量と、または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総量と関連づけることによって正規化することができる。

（生物）試料中のＲＮＡの従来の定量化のために、定量的（リアルタイム）ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が広く使用されている。ＲＮＡ、特にｍＲＮＡについて、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）がこの分野において使用される。定量的ＰＣＲ法から得られるデータを正規化するための異なる手法が使用されている。それらの中に、特異的なｍＲＮＡの数量の、様々な参照遺伝子、例えば、ベータアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、または２８ＳリボソームＲＮＡもしくは１８ＳリボソームＲＮＡなどのハウスキーピング遺伝子またはメンテナンス遺伝子のうち１種以上のｍＲＮＡの数量に対する正規化がある。しかし、そのような正規子遺伝子（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ ｇｅｎｅ）の発現レベルは、実験条件、試料の調製物および供給源（例えば、組織または細胞の型）に応じて変動することが示されており、したがってそれらは投入ＲＮＡを確実に表すわけではない。したがって、通常、調査中の試料間で変化しないものを同定するために、一連のさまざまなハウスキーピング遺伝子を、困難で誤りがちな手順で試験する必要がある。

他の手法は、例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの総含有量または例えば、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の総含有量に対する正規化を利用する。生物細胞および生物試料中のリボソームＲＮＡの含有量も、種々の因子に応じて変動しやすく、同様にｒＲＮＡに対する正規化はあまり好ましくない。例えば、総ＲＮＡ含有量、総ＲＮＡ含有量またはゲノムＤＮＡの総含有量に対する正規化を利用する方法も、例えば、これらの含有量またはＲＮＡ試料の質の変動によって制限される。異質の分子または人工的な分子、例えば、試料（例えば、細胞抽出物または組織に由来する試料）に取り込まれたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物に対する正規化も、それらが細胞中のＲＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）含有量を表さないので、全ての場合で適切な手順であるわけではない。

さらに、正規化されたデータおよび実験手順の再現性を比較するために、適用された実験条件を完全に文書化することが必要である。これは、特に対象のＲＮＡおよび正規化するＲＮＡの数量を、別々に、または異なる方法を使用して決定する場合に当てはまる。

したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、ＲＮＡまたはこのＲＮＡから生成したｃＤＮＡの数量を正規化するための改良された方法、特に、あまり困難ではなく誤りがちでない方法を開発し、提供することであった。

本発明は、試料中または複数の試料中の（特定の）ＲＮＡ（すなわち「標的ＲＮＡ」）の数量を、試料（複数可）中のＲＮＡの総数量；または試料（複数可）中の特定のクラスのＲＮＡの総数量に対して正規化するための強力な改良された方法（複数可）を提供する。本発明は、試料中または複数の試料中の（特定の）ＲＮＡ（すなわち「標的ＲＮＡ」）の数量を、試料（複数可）中のＲＮＡの総数量；または試料（複数可）中の特定のクラスのＲＮＡの総数量に対して正規化するためのキットにも関する。

本発明に関しては、特定のクラスのＲＮＡは、とりわけ、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアの）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｎＲＮＡ（核ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（低分子核小体ＲＮＡ）、ｓｃａＲＮＡ（低分子カハール体特異的ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ウイルスＲＮＡなど、または試料中の大量のＲＮＡと区別可能な任意の他のクラスまたはサブクラスのＲＮＡであってよい。

本発明の手段および方法は、核酸プローブの使用を含む。本発明による核酸プローブは、特定の核酸配列と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、核酸またはその断片である。

一般に、本発明は、試料中の定量化されるＲＮＡの数量を、
（ａ）試料中のＲＮＡの総数量、または
（ｂ）試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量
に対して正規化するための方法であって、
（ｉ）定量化されるＲＮＡを含有する試料を供給するステップと、
（ｉｉ）第１の核酸プローブの少なくとも末端領域が試料中のＲＮＡの特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第１の核酸プローブを試料に加えるステップであって、前記第１の核酸プローブが、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
（ｉｉｉ）試料中のＲＮＡを逆転写するステップであって、ＲＮＡの末端領域がｃＤＮＡを合成するためのプライマーとして機能し、前記第１のプローブが鋳型として機能するステップと、
（ｉｖ）試料中のＲＮＡの総量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総量を、必要に応じて、前記ＲＮＡから転写されたＤＮＡの領域と実質的に相補的な第２のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖ）定量化されるＲＮＡを、必要に応じて、定量化されるＲＮＡの限定された領域（ｄｅｆｉｎｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）と実質的に相補的な第３のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖｉ）定量化されるＲＮＡの数量と、試料中のＲＮＡの総数量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量との比を決定することによって、定量化されるＲＮＡの数量を正規化するステップと
を含む方法に関する。

本発明は、上記の方法のいずれかを実施するためのキットであって、試料中のＲＮＡの限定された領域または特定のクラスのＲＮＡと実質的に相補的な第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位および１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブを含み、必要に応じて、前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な１種以上の第２の核酸プローブを含むキットにも関する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
試料中の定量化されるＲＮＡの数量を、
（ａ）上記試料中のＲＮＡの総数量、または
（ｂ）上記試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量
に対して正規化するための方法であって、
（ｉ）定量化されるＲＮＡを含有する試料を供給するステップと、
（ｉｉ）第１の核酸プローブの少なくとも末端領域が上記試料中のＲＮＡの特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、上記第１の核酸プローブを上記試料に加えるステップであって、上記第１の核酸プローブが、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
（ｉｉｉ）上記試料中の上記ＲＮＡを逆転写するステップであって、上記ＲＮＡの末端領域がｃＤＮＡを合成するためのプライマーとして機能し、上記第１のプローブが鋳型として機能するステップと、
（ｉｖ）上記試料中のＲＮＡの総量または上記試料中の上記特定のクラスのＲＮＡの総量を、必要に応じて、上記ＲＮＡから転写されたＤＮＡの領域と実質的に相補的な第２のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖ）上記定量化されるＲＮＡを、必要に応じて、上記定量化されるＲＮＡの限定された領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖｉ）上記定量化されるＲＮＡの数量と、上記試料中のＲＮＡの総数量または上記試料中の上記特定のクラスのＲＮＡの総数量との比を決定することによって、上記定量化されるＲＮＡの数量を正規化するステップと
を含む方法。
（項目２）
上記定量化されるＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、上記特定のクラスのＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記定量化されるＲＮＡがｍＲＮＡであり、上記特定のクラスのＲＮＡがｍＲＮＡである、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記特異的な結合部位がポリＡ配列またはポリＡ尾部である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記逆転写ステップの後に、ＲＮアーゼを、ＲＮＡの消化を可能にする条件下で上記試料に加える、項目１から４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
上記ＲＮアーゼが、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＴ、および逆転写酵素のＲＮアーゼ活性からなる群から選択される、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記第１の核酸プローブが、ｄＴヌクレオチドがｄＵヌクレオチドに置き換えられているＤＮＡであり、ＲＮＡの総量または特定のクラスのＲＮＡの総量を定量化する前に、上記試料を、ウラシルと糖との間のＮ−グリコシル結合（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌｉｃ ｂｏｎｄ）の加水分解を可能にする条件下で、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと一緒にインキュベートするステップが実施される、項目１から６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
上記第１の核酸プローブの３’末端が遮断されている、項目１から７までのいずれか
一項に記載の方法。
（項目９）
定量化が、定量的リアルタイムＰＣＲを含む、項目１から８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
上記定量化が、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
逆転写と定量化が同じ反応容器内で実施される、項目９または１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
上記逆転写酵素が、上記定量化ステップの間に増幅のためにも使用されるポリメラーゼである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
定量的リアルタイムＰＣＲにおいて選択的プライマーまたはランダムプライマーが使用される、項目１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
上記第２の核酸プローブおよび第３の核酸プローブが、１種以上の蛍光色素で標識され、上記定量化ステップが、上記試料中の蛍光シグナルを検出することを含む、項目１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
遺伝子発現レベルを正規化するための、項目１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
さらに予め定量化されたＲＮＡを上記試料に加え、上記定量化ステップにおいて上記予め定量化されたＲＮＡの数量を決定する、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
上記予め定量化されたＲＮＡがｍＲＮＡである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
項目１から１７までのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、（ｉ）上記試料中のＲＮＡの限定された領域または特定のクラスのＲＮＡと実質的に相補的な第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位および１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、
（ｉｉ）上記第１の核酸プローブの上記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブと
を含むキット。
（項目１９）
特異的な核酸の数量を参照核酸の数量に対して正規化するための、項目１から１７までのいずれか一項に記載の方法または項目１８に記載のキットの使用。
（項目２０）
遺伝子発現解析のための、項目１から１７までのいずれか一項に記載の方法または項目１８に記載のキットの使用。

図１は、アダプター核酸を使用したＲＮＡの正規化された定量化のための方法の概略図である。

図１の方法は、試料中の定量化されるＲＮＡの数量の、
（ａ）試料中のＲＮＡの総数量；または
（ｂ）試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量
に対する正規化であって、
（ｉ）定量化されるＲＮＡ（Ａ参照；ｍＲＮＡと称される）を含有する試料を供給するステップと、
（ｉｉ）第１の核酸プローブの少なくとも末端領域（（Ｂ）におけるアダプター核酸のポリＵ部分）が試料中のＲＮＡの特異的な結合部位（（Ｂ）におけるｍＲＮＡのポリＡ尾部）とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第１の核酸プローブ（（Ａ）においてアダプター核酸と称される）を試料に加えるステップであって、前記第１の核酸プローブ（（Ａ）および（Ｂ）においてアダプター核酸と称される）が１種以上のプライマー結合部位および１つのプローブ結合部位を含むステップと、
（ｉｉｉ）試料中のＲＮＡを逆転写するステップであって、ＲＮＡの末端領域がｃＤＮＡを合成するためのプライマーとして機能し、前記第１のプローブが鋳型として機能するステップ（ステップ（Ａ）に加えられた適切な酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸およびバッファー、任意選択の他のプライマーおよび成分、（Ｂ）に記載のｃＤＮＡ合成反応）と、
（ｉｖ）試料中のＲＮＡの総量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総量を、前記ＲＮＡから転写されたＤＮＡの領域（（Ｃ）においてアダプターｃＤＮＡと称される）と実質的に相補的な第２のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖ）定量化されるＲＮＡを、必要に応じて、定量化されるＲＮＡの限定された領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖｉ）定量化されるＲＮＡの数量と、試料中のＲＮＡの総数量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量との比を決定することによって、定量化されるＲＮＡの数量を正規化するステップと
を含む正規化のために使用することができる。

この方法は、例えば、例えばＳｙｂｒＧｒｅｅｎのような挿入蛍光色素、または、例えば５’−３’エキソヌクレアーゼアッセイにおいて使用されるＴａｑｍａｎプローブのような鎖の片方に結合する配列特異的なプローブを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）のようなその後の反応において、アダプター核酸から生成したｃＤＮＡを検出するために適している。
図２は、アダプター核酸、および増幅、好ましくはＰＣＲ、より好ましくは挿入蛍光色素を使用するリアルタイムＰＣＲによる検出を使用する、ＲＮＡの正規化された定量化のための方法の好ましい実施形態の概略図である。この方法体系の特定の実施形態は、実施例１に示されている。

図２の方法は、試料中の定量化されるＲＮＡの数量の、
（ａ）試料中のＲＮＡの総数量；または
（ｂ）試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量
に対する正規化であって、
（ｉ）定量化されるＲＮＡ（Ａ参照；ｍＲＮＡと称される）を含有する試料を供給するステップと、
（ｉｉ）第１の核酸プローブの少なくとも末端領域（（Ｂ）におけるアダプター核酸のポリＵ部分）が試料中のＲＮＡの特異的な結合部位（（Ｂ）におけるｍＲＮＡのポリＡ尾部）とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第１の核酸プローブ（（Ａ）においてアダプター核酸と称される）を試料に加えるステップであって、前記第１の核酸プローブ（（Ａ）および（Ｂ）においてアダプター核酸と称される）が１種以上のプライマー結合部位および１つのプローブ結合部位を含むステップと、
（ｉｉｉ）試料中のＲＮＡを逆転写するステップであって、ＲＮＡの末端領域がｃＤＮＡを合成するためのプライマーとして機能し、前記第１のプローブが鋳型として機能するステップ（ステップ（Ａ）に加えられた適切な酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸およびバッファー、任意選択の他のプライマーおよび成分、（Ｂ）に記載のｃＤＮＡ合成反応）と、
（ｉｖ）試料中のＲＮＡの総量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総量を、前記ＲＮＡから転写されたＤＮＡの領域（（Ｃ）においてアダプターｃＤＮＡと称される）と実質的に相補的な第２のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖ）定量化されるＲＮＡを、必要に応じて、定量化されるＲＮＡの限定された領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して定量化するステップと
（ｖｉ）定量化されるＲＮＡの数量と、試料中のＲＮＡの総数量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量との比を決定することによって、定量化されるＲＮＡの数量を正規化するステップと
を含む正規化のために使用することができる。
図３は、アダプター核酸、および増幅、好ましくはＰＣＲ、より好ましくは１種以上の配列特異的なプローブを使用するリアルタイムＰＣＲによる検出を使用する、ＲＮＡの正規化された定量化のための方法の好ましい実施形態の概略図である。この方法体系の特定の実施形態は実施例５に示されている。

図３の方法は、試料中の定量化されるＲＮＡの数量の、
（ａ）試料中のＲＮＡの総数量；または
（ｂ）試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量
に対する正規化であって、
（ｉ）定量化されるＲＮＡ（Ａ参照；ｍＲＮＡと称される）を含有する試料を供給するステップと、
（ｉｉ）第１の核酸プローブの少なくとも末端領域（（Ｂ）におけるアダプター核酸のポリＵ部分）が試料中のＲＮＡの特異的な結合部位（（Ｂ）におけるｍＲＮＡのポリＡ尾部）とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第１の核酸プローブ（（Ａ）においてアダプター核酸と称される）を試料に加えるステップであって、前記第１の核酸プローブ（（Ａ）および（Ｂ）においてアダプター核酸と称される）が１種以上のプライマー結合部位および１つのプローブ結合部位を含むステップと、
（ｉｉｉ）試料中のＲＮＡを逆転写するステップであって、ＲＮＡの末端領域がｃＤＮＡを合成するためのプライマーとして機能し、前記第１のプローブが鋳型として機能するステップ（ステップ（Ａ）に加えられた適切な酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸およびバッファー、任意選択の他のプライマーおよび成分、（Ｂ）に記載のｃＤＮＡ合成反応）と、
（ｉｖ）試料中のＲＮＡの総量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総量を、前記ＲＮＡから転写されたＤＮＡの領域（（Ｃ）においてアダプターｃＤＮＡと称される）と実質的に相補的な第２のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖ）定量化されるＲＮＡを、必要に応じて、定量化されるＲＮＡの限定された領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して定量化するステップと
（ｖｉ）定量化されるＲＮＡの数量と、試料中のＲＮＡの総数量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量との比を決定することによって、定量化されるＲＮＡの数量を正規化するステップと
を含む正規化のために使用することができる。
図４は、実施例１に記載の実験（ｃＤＮＡ合成反応物５００μｌ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲによる検出）から得られた結果を示す。ｙ軸はＣｔ値を示し、ｘ軸は、それぞれのｃＤＮＡ合成反応において使用した投入ＲＮＡの量を示す。棒は、表１１に示されているリアルタイムＰＣＲにおいて得られたＣｔ値の平均値を表す。所与の量の投入ＲＮＡを用いたそのようなｃＤＮＡ合成反応物のそれぞれ５μｌを、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎに基づくリアルタイムＰＣＲ（破線の棒）において鋳型として使用し、その結果、リアルタイムＰＣＲ反応物のそれぞれにおける鋳型の量が、ｘ軸に示されている量の１／２００とＲＮＡ等価になった。Ｃｔ値とインプットした鋳型の量のほぼ完全な直線性を実証するために、対照として、投入ＲＮＡ１０００ｎｇおよび３１．２５ｎｇまでの連続的な１：２希釈物を用いたｃＤＮＡ反応物５μｌを鋳型として使用した（灰色の点が打たれた棒）。両方の条件についての線形回帰の線が示されている。 図５は、実施例２に記載の実験から得られた結果を示し、それは、Ｃｔ値とアダプターＲＮＡ分子の絶対的な数の直線性および１００％の範囲のＰＣＲ効率を実証している。Ｙ軸はＣｔ値を示し、ｘ軸は投入ＲＮＡ分子の数を示す。棒は、表１５に示されているリアルタイムＰＣＲにおいて得られたＣｔ値の平均値を表す。両方の条件についての線形回帰の線が示されている。 図６は、実施例３に記載の実験（ｃＤＮＡ合成物５００μｌ、プローブに基づくリアルタイムＰＣＲ）から得られた結果を示す。Ｙ軸はＣｔ値を示し、ｘ軸は、それぞれのｃＤＮＡ合成反応において使用した投入ＲＮＡの量を示す。棒は、表１９に示されているリアルタイムＰＣＲにおいて得られたＣｔ値の平均値を表す。所与の量の投入ＲＮＡを用いたそのようなｃＤＮＡ合成反応物のそれぞれ５μｌを、プローブに基づくリアルタイムＰＣＲにおいて鋳型として使用し、その結果、リアルタイムＰＣＲ反応物のそれぞれにおける鋳型の量が、ｘ軸に示されている量の１／２００とＲＮＡ等価になった。Ｃｔ値とインプットした鋳型の量のほぼ完全な直線性を実証することができた。線形回帰の線が示されている。

本発明は、試料中の定量化されるＲＮＡの数量を、
（ａ）試料中のＲＮＡの総数量、または
（ｂ）試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量
に対して正規化するための方法であって、
（ｉ）定量化されるＲＮＡを含有する試料を供給するステップと、
（ｉｉ）第１の核酸プローブの少なくとも末端領域が試料中のＲＮＡの特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第１の核酸プローブを試料に加えるステップであって、前記第１の核酸プローブが、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
（ｉｉｉ）試料中のＲＮＡを逆転写するステップであって、ＲＮＡの末端領域がｃＤＮＡを合成するためのプライマーとして機能し、前記第１のプローブが鋳型として機能するステップと、
（ｉｖ）試料中のＲＮＡの総量（ｔｏｔａｌ ａｍｏｕｎｔ）または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総量を、必要に応じて、前記ＲＮＡから転写されたＤＮＡの領域と実質的に相補的な第２のプローブを使用して定量化するステップと、
（ｖ）定量化されるＲＮＡを、必要に応じて、定量化されるＲＮＡの限定された領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して定量化するステップと、
定量化されるＲＮＡの数量と、試料中のＲＮＡの総数量または試料中の特定のクラスのＲＮＡの総数量との比を決定することによって、定量化されるＲＮＡの数量を正規化するステップと
を含む方法を提供する。

「ＲＮＡの総数量」または「特定のクラスのＲＮＡの総数量」は、定量化されるＲＮＡの数量を正規化するための参照数量（参照ＲＮＡ）を指す。

本発明に関しては、試料は定量化されるＲＮＡを含む核酸分子を含有する。ＲＮＡは、細胞または生物体に埋め込むことができるが、無細胞系の中に存在してもよい。試料は、流体、溶解物、固体マトリックスまたはＲＮＡ分子を含他のむ任意の試料であってよい。試料は、任意の起源、例えば、ウイルス起源、細菌起源、古細菌起源、真菌起源、リボソーム起源、真核生物起源または原核生物起源のものであってよい。試料は、任意の生物学的な供給源および任意の生物体、組織、細胞または細胞下区画に由来する試料であってよい。試料は、例えば、植物、真菌、動物、および特にヒトの試料からの試料であってよい。本発明に関しては、人工的なＲＮＡを含む試料も利用することができる。

特定の実施形態では、定量化されるＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、特定のクラスのＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択される。

さらに特定すると、定量化されるＲＮＡはｍＲＮＡであり、特定のクラスのＲＮＡはｍＲＮＡである。

本発明に関しては、一般に、遊離の３’−ＯＨ末端を有する（したがって、延長することができる）任意のＲＮＡを定量化することができる。

定量化されるＲＮＡおよび参照ＲＮＡは、任意の起源、例えば、ウイルス起源、細菌起源、古細菌起源、真菌起源、リボソーム起源、真核生物起源または原核生物起源のものであってよい。これは、任意の生物学的試料および任意の生物体、組織、細胞または細胞下区画に由来するＲＮＡであってよい。これは、例えば、植物、真菌、動物、および特にヒトのＲＮＡからのＲＮＡであってよい。ＲＮＡは、定量化する前に、例えば、単離、精製または改変によって前処理することができる。人工的なＲＮＡを定量化することもできる。

ｍＲＮＡは、種々の種から天然に生じるようなポリアデニル化されたメッセンジャーＲＮＡであってよい。ＲＮＡは、ポリＡ尾部を伴う、またはポリＡ尾部を伴わない任意のＲＮＡ試料であってもよく、ポリヌクレオチド尾部、例えばポリＡ尾部は、定量化する前に適切な方法、例えば、酵素、好ましくはポリＡポリメラーゼによってｉｎ ｖｉｔｒｏで付加される。

詳細には、特異的な結合部位は、ｍＲＮＡに対して特異的である、またはポリＡ配列またはポリＡ尾部である。ポリＡ尾部は、試料ＲＮＡ中に天然に存在するままであってよい。ポリＡ尾部を有さないＲＮＡの場合は、一実施形態では、適切なホモポリマーの尾部をＲＮＡの３’末端に付加するための実験手順を利用することができる。そのような尾部は、Ａ塩基、Ｃ塩基、Ｇ塩基、もしくはＵ塩基または適切な塩基類似体で構成されてよい。そのような尾部の付加は、化学的にまたは酵素的に実施することができる。この目的のための酵素は、例えば、ポリＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リガーゼ、または核酸の３’末端へのヌクレオチドの付加または連結を触媒する他の適切な酵素の群から選択することができる。

天然に存在するか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで付加されるかのいずれかのポリヌクレオチド尾部、例えばポリＡ尾部の長さは、１ヌクレオチド〜数千ヌクレオチド、好ましくは１ヌクレオチド〜数百ヌクレオチド、最も好ましくは５〜１００ヌクレオチドの長さで変動し得る。

本発明の一実施形態では、逆転写するステップの後に、ＲＮアーゼを、ＲＮＡの消化を可能にする条件下で試料に加える。

特に、ＲＮアーゼは、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＴおよび逆転写酵素のＲＮアーゼ活性からなる群から選択される。化学的方法および物理的方法、例えば、適切なｐＨの変化、温度の上昇、カチオンまたはアニオンまたはそのようなパラメータの１種以上の組み合わせも、ＲＮＡを分解するために適している。しかし、そのような方法は当業者に公知である。

本発明の特定の実施形態では、前記第１の核酸プローブは、ｄＴヌクレオチドがｄＵヌクレオチドに置き換えられているＤＮＡであり、試料を、ウラシルと糖との間のＮ−グリコシル結合（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌｉｃ ｂｏｎｄ）の加水分解を可能にする条件下で、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと一緒にインキュベートするステップを、ＲＮＡの総量または特定のクラスのＲＮＡの総量を定量化するステップの前に少なくとも１回実施する。

そのような逆転写反応において、追加的なプライマー、例えば、ある特定のＲＮＡ配列に特異的なプライマー、オリゴｄＴプライマー、種々の長さのランダムプライマーまたは選択された変性プライマー、すなわち好ましくは第１の核酸プローブと著しくハイブリダイズしないが、ＲＮＡ試料からｃＤＮＡ合成することを可能にするプライマーを使用することができる。

一部の実施形態では、前記第１の核酸プローブの３’末端を遮断することができる。ジデオキシヌクレオチド（ｄｉｄｅｓｏｘｙ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、逆塩基、スペーサー、色素、例えばＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒのようなクエンチャー部分、Ｄａｂｃｙｌ、Ｍｉｎｏｒ−Ｇｒｏｏｖｅ−Ｂｉｎｄｅｒ、例えば超塩基もしくはハロゲン化塩基のような改変塩基、または塩基類似体、脱塩基部位、３’−ＯＨ基を遮断すること（例えば、３’−ＯＨ基をリン酸基で置き換えること）を組み込むことを含む種々の方法体系により、核酸の３’末端が遮断されることが公知である。さらに、本発明の範囲内の反応を実施するために適した逆転写酵素または他の酵素のような適切な酵素の触媒活性を阻害する、糖の骨格、塩基または追加的な側鎖の他の可能性のある改変の全てを、遮断するために使用することができる。改変は、酵素的にまたは化学的に実施することができる。

特に、定量化するステップは、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、その後に検出測定を伴う標識化反応、および定量的リアルタイムＰＣＲからなる群から選択される方法を含む。さらに、定量化は、プローブとｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション、およびｃＤＮＡとハイブリダイズしたプローブの直接的または間接的な（例えば、リアルタイム定量的ＰＣＲなどの増幅反応における）検出に基づいてもよい。言い換えれば：１種以上のプローブを、第１の核酸プローブと相補的なｃＤＮＡとハイブリダイズさせることによって、生成したｃＤＮＡを定量化するために検出することができる。あるいは、その後の検出反応のためのプライミング部位、例えば、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター部位、ローリングサークル増幅のためのプライミング部位、等温増幅するためのプローブのための１種以上のハイブリダイゼーション部位、標識（例えば、蛍光色素、放射性同位元素）を担持する改変されたヌクレオチド、または二次的検出試薬（例えば、酵素、ハプテン）への結合を可能にする反応性基として有用な１種以上のエレメントを、第１の核酸プローブと相補的なｃＤＮＡに導入することができる。

定量化はＰＣＲに基づくことが好ましく、定量化は、定量的リアルタイムＰＣＲを含むことがより好ましい。

核酸の増幅は、代わりに、これらに限定されないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、自続配列複製（３ＳＲ）およびＱβ増幅を含めた、当技術分野で公知の他の種々の核酸の増幅方法のいずれによっても実現することができる。

定量化が、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲを含むことがより好ましい。本発明の好ましい実施形態では、定量化ステップ（複数可）は、（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち逆転写酵素）を使用して、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）に逆転写すること、（ｉｉ）逆転写によって作製されたＤＮＡを、ＰＣＲを使用して増幅すること、および（ｉｉｉ）増幅産物をリアルタイムで検出し、定量化することを含む。

本発明に関して、逆転写酵素活性を有する酵素は、ウイルス起源、細菌起源、古細菌起源および真核生物起源、特に耐熱性の生物体を含めた種々の起源の酵素を含む群から選択される。これは、イントロン、レトロトランスポゾンまたはレトロウイルス由来の酵素を含む。本発明の範囲内の逆転写酵素活性を有する酵素は、相補的な鋳型であるデオキシリボ核酸またはリボ核酸とハイブリダイズした、またはその逆のデオキシリボ核酸またはリボ核酸の３’末端に、前記鋳型であるデオキシリボ核酸またはリボ核酸と相補的な１種以上のデオキシリボヌクレオチドを、適切な反応条件（例えば、バッファーの条件）で付加する能力を有する酵素である。これは、本来この能力を持つ酵素だけでなく、その遺伝子配列が進化もしくは変異してそのような機能を獲得した酵素、またはバッファーもしくは他の反応パラメータを調整することによってそのような機能を獲得する酵素も含む。本発明に関しては、逆転写酵素活性を有する酵素は、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＥＡＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｍ−ＭＬＶ ＲＮアーゼＨ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、Ｍｏｎｓｔｅｒｓｒｉｐｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔおよびＴｈｅｒｍｏ−Ｘ（どちらもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む群から選択されることが好ましい。これは、本来この能力を持つ酵素だけでなく、その遺伝子配列が進化もしくは変異してそのような機能を獲得した酵素、またはバッファーもしくは他の反応パラメータを調整することによってそのような機能を獲得する酵素も含む。酵素は、例えば、ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のように、上昇した忠実度を有してもよい。１種以上の適切な逆転写酵素活性を有する酵素を混合して、最適化された条件または新規の特徴を獲得することができることも、当業者には明らかである。これは、とりわけ、例えば、中温性酵素と好熱性酵素の混合物、またはＲＮアーゼＨ活性を有する酵素とＲＮアーゼＨ陰性である酵素の混合物、または忠実度が上昇した酵素と好熱性酵素を含むことができる。多数の他の組み合わせが可能であることは、当業者には明らかである。逆転写酵素活性を有する酵素は、プライマーとしてポリヌクレオチド尾部を、および鋳型としてアダプター核酸を使用したｃＤＮＡの合成を可能にする少なくとも１つの酵素である。ポリＡ尾部またはアダプター核酸に使用される核酸の型に応じて、種々の酵素が可能である。これは、中温性の生物体または好熱性の生物体を起源としてよく、５℃〜１００℃、より好ましくは１０℃〜８０℃、最も好ましくは１５℃〜７５℃の温度範囲で活性をもたらす。

さらに好ましい実施形態では、逆転写するステップと定量化するステップを同じ反応容器内で実施する。

特定の実施形態では、逆転写酵素は、定量化ステップの間に増幅のためにも使用されるポリメラーゼである。

選択的プライマーまたはランダムプライマーを、定量的リアルタイムＰＣＲにおいて使用して、第１の核酸プローブのｃＤＮＡを定量化することができる。リアルタイムＰＣＲにおいて選択的プライマーを使用することが好ましい。より好ましい実施形態では、第１の核酸プローブから生成したｃＤＮＡの増幅を可能にする選択的プライマー、必要に応じて追加的なオリゴヌクレオチドプローブを使用する。必要に応じて、１種以上の追加的な選択的プライマーセットが反応物中に存在し、必要に応じて追加的なオリゴヌクレオチドプローブにより、定量化されるもう１つの標的核酸種を共増幅（多重増幅）することが可能になる。

定量化されるＲＮＡもしくはｃＤＮＡの数量およびＲＮＡもしくはｃＤＮＡの総数量または特定のクラスのＲＮＡもしくはｃＤＮＡの総数量を同時に決定することが好ましい。

本発明の一部の実施形態では、ＰＣＲ、特に、定量的リアルタイムＰＣＲに使用するポリメラーゼは、中温性の生物体もしくは好熱性の生物体由来のポリメラーゼである、または耐熱性ポリメラーゼである、または、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ Ｄｐｏ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｐａｃｉｆｉｃｕｓ（Ｔｐａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｅｇｇｅｒｔｓｏｎｉｉ（Ｔｅｇ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、第２の核酸プローブおよび任意選択の第３の核酸プローブを１種以上の蛍光色素で標識し、定量化するステップが、試料中の蛍光シグナルを検出することを含む。

第２の核酸プローブおよび任意選択の第３の核酸プローブは、ハイブリダイゼーションプローブ、加水分解プローブおよびヘアピンプローブからなる群から選択される蛍光標識されたプローブであることがより好ましい。

特に、蛍光標識されたプローブは、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｍｅｇａ Ｓｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｓｅｒｉｅｓの色素、およびＰＥＴまたは匹敵する励起特性および／または放出特性を有する他の適合性の蛍光色素または上記の色素と異なる波長で検出可能な他の色素からなる群から選択される色素で標識する。

特に、ハイブリダイゼーションプローブは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブである、または加水分解プローブはＴａｑＭａｎプローブである。他の実施形態では、ヘアピンプローブは、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、Ｓｕｎｒｉｓｅプライマー、ＬＵＸプライマーおよびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー、ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｍｎａｚｙｍｅおよび他の適合性のプローブ技術からなる群から選択される。

本発明による手段および方法は、遺伝子発現レベルを正規化するために使用されることが好ましい。

本発明の一部の実施形態では、さらに、予め定量化された核酸を試料に加え、定量化するステップにおいて前記予め定量化された核酸の数量を決定する。予め定量化された核酸はｍＲＮＡであることが好ましい。

定量化される２つ以上の核酸の数量は、同時に、すなわち一度に正規化することが好ましい。

本発明は、上記の方法のいずれかを実施するためのキットにも関し、キットは、試料中のＲＮＡの限定された領域または特定のクラスのＲＮＡと実質的に相補的な第１の核酸プローブ（「アダプタープローブ」、「アダプターオリゴヌクレオチド」または「アダプター核酸」）であって、１種以上のプライマー結合部位および１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、必要に応じて、前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブとを含む。

したがって、本発明は、試料中のＲＮＡの正規化された定量化のためのキットに関し、キットは、試料中のＲＮＡの限定された領域または特定のクラスのＲＮＡと実質的に相補的な第１の核酸プローブ（「アダプタープローブ」、「アダプターオリゴヌクレオチド」または「アダプター核酸」）であって、１種以上のプライマー結合部位および１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、必要に応じて、前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブとを含む。

キットの好ましい実施形態では、特定のクラスの核酸はｍＲＮＡであり、特異的な結合部位はポリＡである。この実施形態では、第１の核酸プローブ（「アダプタープローブ」）が、その５’末端に、約１〜１５０個、より好ましくは約２〜１００個、最も好ましくは約４〜８０個のＵヌクレオチドおよび／またはＴヌクレオチドを伴うポリＵ配列またはポリＴ配列を含むことが好ましい。

アダプタープローブは、１種以上のプライマー結合配列および／またはプローブ結合配列を含んでよく、したがってアダプタープローブが参照ＲＮＡの延長において鋳型として機能する場合、新しく合成された鎖（アダプタープローブと相補的な）は１種以上のプライマー結合部位またはプローブ結合部位を含む。プライマー結合部位および／またはプローブ結合部位は、そうでなければ定量化される核酸中または正規化するための参照として機能するＲＮＡもしくはＲＮＡのクラス中に生じない配列である。これらのプライマー結合部位および／またはプローブ結合部位は、増幅または定量化のために使用するプライマーおよび／または第２の核酸プローブと実質的に相補的な配列を有する。アダプタープローブは、少なくとも１つのプローブ結合部位および２つのプライマー結合部位（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）を含むことが好ましい。

いくつかの特定の実施形態におけるキットは、上で概説した１種以上の第２の核酸プローブおよび／またはプライマーをさらに含んでよい。キットは、ｄＮＴＰおよび／または緩衝物質または塩、例えば、Ｍｇ^２＋も含んでよい。

本発明の好ましい実施形態では、キットは、ポリメラーゼおよびプライマーセットおよび／または逆転写酵素をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、逆転写酵素をさらに含む。

一部の実施形態では、１種以上の構成成分を、同じ反応容器内で予備混合する。

一部の実施形態では、キットは、１種以上の予め定量化された較正用ＲＮＡ（複数可）、前記較正用ＲＮＡ（複数可）を増幅するためのプライマーセットおよび前記予め定量化されたＲＮＡ（複数可）の配列と実質的に相補的な第１の核酸プローブをさらに含んでよい。

一部の実施形態では、１種以上の構成成分を、同じ反応容器内で予備混合する。

本明細書で上に示したように、遺伝子発現の解析に関して、試料中のｍＲＮＡの定量化は、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して実施することができる。ＲＴ−ｑＰＣＲ法では、３つのステップ：（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち逆転写酵素）を使用して、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ、（ｉｉ）ＰＣＲを使用してｃＤＮＡを増幅するステップ、および（ｉｉｉ）増幅産物をリアルタイムで検出し、定量化するステップの組み合わせを使用する。逆転写およびＰＣＲに基づく増幅のために、ｄＮＴＰ（「ヌクレオチド混合物」）が反応バッファー中に存在することが必要である。本発明によるヌクレオチド混合物は、ＰＣＲにおいて使用するために適したｄＮＴＰの混合物、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ／ｄＵＴＰの混合物である。混合物は、必要に応じて改変されたヌクレオチドまたは標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含有してよい。本発明の特定の実施形態に関して、これらのｄＮＴＰの相対的な量は、鋳型核酸の特定のヌクレオチド含有量に応じて適合させることができる。ＲＴ−ｑＰＣＲのステップは、一段階のプロセス、または二段階のプロセスのいずれかで実施することができる。第１の場合では、逆転写およびＰＣＲに基づく増幅は、同じ反応容器内で、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ポリメラーゼのような内因性逆転写機能性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用することによって実施する。二段階の設定では、ＲＮＡを逆転写するステップとＤＮＡを増幅するステップを、別々に、例えば、異なる反応容器内で実施する。本発明による方法のステップは、例えば、マグネシウムイオンなどの塩を含む適切な反応バッファー中で行うことができる。すでに述べた通り、異なるステップは、同じバッファーおよび反応容器中で行ってよい、または、同じバッファーおよび反応容器中で行わなくてよい。ＲＴ−ｑＰＣＲと対照的に、ｑＰＣＲでは、逆転写は実施されず、したがって、これはＲＮＡではなくＤＮＡのための定量化方法である。

増幅反応のための、１種以上の緩衝物質、適切なｐＨ、Ｍｇ^２＋のような塩および補因子をもたらす適切な緩衝溶液、ならびに適切な反応条件、例えば温度は、当業者に公知である。

ＲＴ−ｑＰＣＲにおける（ｍ）ＲＮＡの逆転写ならびにｑＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲにおける（ｃ）ＤＮＡの増幅には、オリゴヌクレオチド（「プライマー」）によってプライミングすることが必要である。ＲＴ−ｑＰＣＲを用いてｍＲＮＡを定量化する場合では、ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズするオリゴ−ｄＴプライマーを使用することができる。しかし、長さが異なるランダムプライマーも利用することができる、または選択的な変性プライマーも導入することができる。

さらに、標準の定量的リアルタイムＰＣＲプロトコールおよびキットを、本発明による手段および方法のために適合させるまたは修正することができる。

上記の通り、リアルタイムＰＣＲ（本明細書では定量的ＰＣＲまたは定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とも称される）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、核酸を同時に増幅し定量化するための方法である。定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）は、ＲＮＡをＤＮＡに、例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することをさらに含む定量的リアルタイムＰＣＲ法である。ｑＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲ法では、増幅された核酸は、それが蓄積するにつれて定量化される。一般には、二本鎖ＤＮＡに挿入する蛍光色素（例えば、臭化エチジウムもしくはＳＹＢＲ（登録商法）Ｇｒｅｅｎ Ｉ）または相補的な核酸とハイブリダイズしたときに（例えば、ＤＮＡの蓄積）蛍光を発する改変された核酸プローブ（「レポータープローブ」）を、ｑＰＣＲに基づく方法における定量化のために使用する。特に、蛍光発生プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ（Ｒｏｃｈｅ））、加水分解プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｒｏｃｈｅ））、または分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー（ＤｘＳ）、Ｓｕｎｒｉｓｅプライマー（Ｏｎｃｏｒ）、ＬＵＸプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）などのヘアピンプローブなどを、レポータープローブとして使用することができる。本発明に従って、蛍光発生プライマーまたはプローブは、例えば蛍光色素が付着、例えば、共有結合的に付着したプライマーまたはプローブであってよい。そのような蛍光色素は、例えば、ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｍｅｇａ Ｓｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｓｅｒｉｅｓの色素、およびＰＥＴまたは匹敵する励起特性および／または放出特性を示す他の適合性の蛍光色素または上記の色素と異なる波長で検出可能な他の色素などであってよい。特定のレポータープローブは、蛍光クエンチャーをさらに含んでよい。

第１の核酸プローブは、本明細書では「アダプター核酸」とも称され、本発明に関しては、約１０〜数千ヌクレオチド、より好ましくは約２０〜５００ヌクレオチド、および最も好ましくは約３０〜１５０ヌクレオチドを有する核酸のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその類似体）である。アダプター核酸は、ＲＮＡの特異的な結合部位（特異的な配列）、例えば、ＲＮＡのポリＡ尾部と実質的に相補的な配列を有する第１の部分（「ハイブリダイズエレメント」）および第２の部分（「アダプター配列」）を含む。アダプター配列は、１種以上のプライマー結合部位および必要に応じて１つのプローブ結合部位を含む。アダプター配列は、検出方法において、この配列を鋳型として使用して生成したｃＤＮＡを特異的に検出することを可能にするために十分な長さを有するように選択することが好ましい。１つの好ましい検出方法はＰＣＲである。この場合、アダプター配列は、少なくとも１種のＰＣＲプライマー、より好ましくは２種のＰＣＲプライマー、および必要に応じて１種以上の配列特異的なプローブがハイブリダイズすることを可能にするために十分な長さを有する。このアダプター核酸の３’ＯＨ基を遮断して伸長を妨げることができる、またはｃＤＮＡの合成を可能にするために、このアダプター核酸の３’ＯＨ基は遊離していてよい。３’ＯＨを遮断するための適切な方法は、当技術分野で公知の標準の方法である。適切な方法は、３’リン酸基、逆塩基、脂肪族リンカー、アミノ改変因子、または他のものであってよい。アダプター核酸の第１の部分（「ハイブリダイズエレメント」）は、第２の部分（アダプター配列）と相対的な配列の３’であることが好ましい。特異的な結合部位がポリＡ尾部である場合、アダプター核酸（「ハイブリダイズエレメント」）の第１の部分は、Ｕ塩基および／またはＴ塩基を含んでよく、特に、ポリＵ配列またはポリＴ配列であってよい。好ましい実施形態では、ハイブリダイズエレメントの長さは、１〜１５０ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、最も好ましくは４〜８０ヌクレオチドである。有用な長さは、利用可能な作製技術または合成技術によって制限され得る。アダプター核酸の第２の部分は、約５〜数千ヌクレオチド、より好ましくは約１０〜５００ヌクレオチドおよび最も好ましくは約２０〜１４０ヌクレオチドの長さを有してよい。特異的な結合部位は、特定のクラスのＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの場合ではポリＡ尾部に特異的な配列であってよい。

第２の、第３の、および潜在的なさらなる核酸プローブは、第１の核酸プローブの配列または第１の核酸プローブの配列の相補的な核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）から実質的に取得した配列を有する、約１０〜１００ヌクレオチド、より好ましくは約１２〜５０ヌクレオチド、および最も好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。これらのプローブを改変してもよく、特に蛍光標識してもよい。これらは、定量的リアルタイムＰＣＲにおいて使用することができ、上で概説したレポータープローブであってよい。

当業者は、プローブおよびプライマーの長さおよび配列を、延長反応の反応温度、使用する特定の酵素（複数可）（例えば、耐熱性ポリメラーゼ、逆転写酵素）およびそれぞれの結合パートナーの配列に応じてどのように選択したらいいか分かっている。

本発明は、特定の核酸の数量を、参照核酸の数量に対して正規化するための、本発明の方法または本発明のキットの使用にも関する。

さらに、本発明は、遺伝子発現解析のための、本発明の方法または本発明のキットの使用にも関する。

（実施例１）
アダプター核酸を使用したＲＮＡの正規化された定量化およびリアルタイムＰＣＲにおけるｃＤＮＡの検出のための方法の技術的な概念の実現。

本実験では、図１に示されている技術的な概念の実現性を実証するものとする。反応物は、表１に示されている通り構成され、表２に示されているプロトコールを用いて行った。反応容積は、検出されるべきＲＮＡの量に依存する（表１参照）。この目的のために、表３の試薬を使用した。ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してＨｅｌａ細胞から単離された全ＲＮＡの希釈物がｃＤＮＡの合成における鋳型として機能する。バックグラウンドシグナルについての対照として、１μｇの全Ｈｅｌａ ＲＮＡおよびアダプター核酸を除く全ての構成成分を用いた陰性対照反応ｃＤＮＡ合成反応物。

逆転写した後、次いで、生成したｃＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲにおいて観察されたＣｔ値とｃＤＮＡの合成において使用したＲＮＡの量の相関が観察され得るかどうかどうかを分析するために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎに基づくリアルタイムＰＣＲにおいて鋳型として使用した。

この目的のために、酵素を不活性化した後（実施例１、表２参照：９５℃で５分間）、ｃＤＮＡ合成反応物５μｌを、以下のリアルタイムＰＣＲにおいて各反応の鋳型として加えた。リアルタイムＰＣＲにおける検出を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの化学作用を用いて行った。表９に、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ反応のための構成を示す。ＰＣＲ反応物は、表８からの構成成分を用いて調製した。その後、表１０に示されているサイクリングを実施した。リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍにおいて行った。その後に実行データを適切なソフトウェアを用いて解析した。結果を表１１および図４に示す。

結論：
約３０ｎｇから１μｇに至るまでのＲＮＡ量を定量化することが可能である。これは、ｃＤＮＡを合成するために使用されるＲＮＡ量の典型的な範囲を表している。

（実施例２）
プローブに基づくリアルタイムＰＣＲにおけるウラシル塩基を用いたアダプターＲＮＡまたはアダプターＤＮＡの正確な滴定の証明。Ｃｔ値と希釈率の相関の確認。

本実験では、アダプターＲＮＡの正確な滴定を実証する。さらに、Ｃｔ値と希釈率の相関が示され、それは、高いＰＣＲの効率を実証している。この目的のために、表１２からの構成成分を、表１３に示されている通り混合した。その後に、表１４のプロトコールを実施した。ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍにおいて実施した。この後、実行データを適切なソフトウェアを用いて解析した。結果を表１５および図５に示す。

（実施例３）
Ｃｔ値とｃＤＮＡの合成において使用されるＲＮＡの量の相関を実証するための、プローブに基づくリアルタイムＰＣＲによる、実施例１において生成したｃＤＮＡの解析
酵素を不活性化した後（実施例１、表２参照：９５℃で５分間）、一定数量のｃＤＮＡ合成反応物を以下のリアルタイムＰＣＲに適用した。リアルタイムＰＣＲにおける検出を、プローブに基づく化学作用を用いて行った。表１７に、プローブに基づくリアルタイムＰＣＲ反応のための構成を示す。ＰＣＲ反応物を、表１６からの構成成分を用いて調製した。その後、表１８に示されているサイクリングを実施した。リアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍにおいて実施した。この後、実行データを適切な計器ソフトウェアを用いて解析した。結果を表１９、２０および図６に示す。

結論：
８ｎｇから１μｇに至るまでのＲＮＡ量を定量化することが可能である。これは、ｃＤＮＡの合成に使用するＲＮＡ量の典型的な範囲を表している。

添付の図面は、本発明の例示的な実施形態を記載し、本発明の範囲を限定しない。これらの実施形態では、以下の定義を適用する：
ｍＲＮＡ：種々の種から天然に生じるようなポリアデニル化されたメッセンジャーＲＮＡであってよい。これは、天然にポリＡ尾部を伴う、またはポリＡ尾部を伴わない任意のＲＮＡ試料であってもよく、ポリヌクレオチド尾部は、適切な方法、例えば、酵素、好ましくはポリＡポリメラーゼによってｉｎ ｖｉｔｒｏで付加される。

１−ｘは、天然に存在する、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで付加されたポリヌクレオチド尾部の長さを記載する。適切な長さは、１〜数千ヌクレオチドまで変動する。

Ａ［Ａ］ＡＡＡＡは、ポリヌクレオチド尾部を説明し、それは天然に存在するポリＡ尾部、または適切な方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで付加されたポリヌクレオチド尾部であってよい。３’ＯＨは酵素的な伸長を可能にするために利用可能である。

アダプター核酸は、核酸のオリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはそれらの類似型である。アダプター核酸は、天然に存在するポリＡ尾部であり得るポリヌクレオチド尾部に所与の反応条件下でハイブリダイズするエレメントを含む。ポリＡ尾部を担持するｍＲＮＡの場合、ハイブリダイズエレメントは、尾部と相補的な塩基、すなわち、ポリＡ配列の場合では、Ｕ塩基および／またはＴ塩基を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、ハイブリダイズエレメントの長さは、１〜１５０ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、最も好ましくは４〜８０ヌクレオチドである。有用な長さは、利用可能な作製技術または合成技術によって制限され得る。

アダプター核酸は、アダプター配列をさらに含む。アダプター配列は、検出方法において、この配列を鋳型として使用して生成したｃＤＮＡを特異的に検出することを可能にするために十分な長さを有するように選択されることが好ましい。１つの好ましい検出方法はＰＣＲである。この場合、アダプター配列は、少なくとも１種のＰＣＲプライマー、より好ましくは２種のＰＣＲプライマー、および必要に応じて１種以上の配列特異的なプローブがハイブリダイズすることを可能にする十分な長さを有する。このアダプター核酸の３’ＯＨ基を遮断して伸長を妨げることができる、またはｃＤＮＡの合成を可能にするために、このアダプター核酸の３’ＯＨ基は遊離していてよい。３’ＯＨを遮断するための適切な方法は、当技術分野で公知の標準の方法である。適切な方法は、３’リン酸基、逆塩基、脂肪族リンカー、アミノ改変因子、または他のものであってよい。

酵素は、プライマーとしてポリヌクレオチド尾部を、および鋳型としてアダプター核酸を使用したｃＤＮＡの合成を可能にする少なくとも１つの酵素である。ポリＡ尾部またはアダプター核酸に使用される核酸の型に応じて、種々の酵素が可能である。これは、中温性の生物体または好熱性の生物体を起源としてよく、５℃〜１００℃、より好ましくは１０℃〜８０℃、最も好ましくは１５℃〜７５℃の温度範囲で活性をもたらす。

ｄＮＴＰは、ＤＮＡ合成に必要とされるデオキシヌクレオチド三リン酸である。混合物は、必要に応じて、改変されたヌクレオチドまたは標識されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含有してよい。

バッファーは、所与の反応温度および所与の１種以上の酵素でｃＤＮＡを合成するための反応条件をもたらす１種以上の緩衝物質、適切なｐＨ、カチオン、Ｍｇ^２＋のような補因子をもたらす適切な緩衝溶液である。

Claims (20)

1. 試料中の定量化されるＲＮＡの数量を、
   （ａ）前記試料中のＲＮＡの総数量、または
   （ｂ）ｍＲＮＡの総数量
   に対して正規化するための方法であって、
   （ｉ）定量化されるＲＮＡを含有する試料を供給するステップと、
   （ｉｉ）第１の核酸プローブの少なくとも末端領域が前記試料中のＲＮＡの特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で、前記第１の核酸プローブを前記試料に加えるステップであって、前記第１の核酸プローブが、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
   （ｉｉｉ）前記試料中の前記ＲＮＡを逆転写するステップであって、前記ＲＮＡの末端領域がｃＤＮＡを合成するためのプライマーとして機能し、前記第１のプローブが鋳型として機能するステップと、
   （ｉｖ）前記試料中のＲＮＡの総量または前記試料中の前記特定のクラスのＲＮＡの総量を、必要に応じて、前記ＲＮＡから転写されたＤＮＡの領域と実質的に相補的な第２のプローブを使用して定量化するステップと、
   （ｖ）前記定量化されるＲＮＡを、必要に応じて、前記定量化されるＲＮＡの限定された領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して定量化するステップと、
   （ｖｉ）前記定量化されるＲＮＡの数量と、前記試料中のＲＮＡの総数量または前記試料中の前記特定のクラスのＲＮＡの総数量との比を決定することによって、前記定量化されるＲＮＡの数量を正規化するステップと
   を含む方法。
2. 前記定量化されるＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
3. 前記定量化されるＲＮＡがｍＲＮＡであり、前記試料中の定量化されるＲＮＡの数量がｍＲＮＡの総量に対して正規化される、請求項２に記載の方法。
4. 前記特異的な結合部位がポリＡ配列またはポリＡ尾部である、請求項３に記載の方法。
5. 前記逆転写ステップの後に、ＲＮアーゼを、ＲＮＡの消化を可能にする条件下で前記試料に加える、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ＲＮアーゼが、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＩ、ＲＮアーゼＴ、および逆転写酵素のＲＮアーゼ活性からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記第１の核酸プローブが、ｄＴヌクレオチドがｄＵヌクレオチドに置き換えられているＤＮＡであり、ＲＮＡの総量または特定のクラスのＲＮＡの総量を定量化する前に、前記試料を、ウラシルと糖との間のＮ−グリコシル結合（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌｉｃ ｂｏｎｄ）の加水分解を可能にする条件下で、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと一緒にインキュベートするステップが実施される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１の核酸プローブの３’末端が遮断されている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
9. 定量化が、定量的リアルタイムＰＣＲを含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
10. 前記定量化が、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲを含む、請求項９に記載の方法。
11. 逆転写と定量化が同じ反応容器内で実施される、請求項９または１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記逆転写酵素が、前記定量化ステップの間に増幅のためにも使用されるポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
13. 定量的リアルタイムＰＣＲにおいて選択的プライマーまたはランダムプライマーが使用される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第２の核酸プローブおよび第３の核酸プローブが、１種以上の蛍光色素で標識され、前記定量化ステップが、前記試料中の蛍光シグナルを検出することを含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
15. 遺伝子発現レベルを正規化するための、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
16. さらに予め定量化されたＲＮＡを前記試料に加え、前記定量化ステップにおいて前記予め定量化されたＲＮＡの数量を決定する、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
17. 前記予め定量化されたＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    （ｉ）前記試料中のＲＮＡの限定された領域または特定のクラスのＲＮＡと実質的に相補的な第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位および１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、
    （ｉｉ）前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブと
    を含むキット。
19. 特異的な核酸の数量を参照核酸の数量に対して正規化するための、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法または請求項１８に記載のキットの使用。
20. 遺伝子発現解析のための、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法または請求項１８に記載のキットの使用。

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