JP5680078B2 - ライゲーションに基づく核酸の正規化した定量化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物学および化学の分野内にある。特に、本発明は、分子生物学の分野内にある。より詳細には、本発明は、核酸の定量化およびリアルタイムＰＣＲの分野内にある。さらに、本発明は、核酸の正規化された定量化、および試料（例えば、核酸の混合物）中の核酸の数量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）の正規化に関する。
核酸の混合物中の特定の核酸を定量化（定量）することは、遺伝子発現解析、または核酸の混合物から特定の核酸を精製する間などの分子生物学におけるいくつもの適用において重要である。定量化方法では、試料中の特定の核酸の濃度および／または相対的もしくは絶対的な量（ａｍｏｕｎｔ）を決定する。特に、遺伝子発現の解析に関して、例えば生物試料中のｍＲＮＡのレベルを測定するために、再現性があり、かつ相対的方法が望まれる。例えば、比較できる容積、核酸量、細胞材料などを有する生物試料を必ずしも得ることができるとは限らない。異なる試料は、例えば、異なる生物体もしくは個体からの異なる組織、または異なる化合物で処理された細胞培養試料に由来するＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。
さらに、検出の感度および選択性ならびに生物試料中の核酸の定量化が重要である。２つ以上の異なる（生物）試料において特定の核酸の数量を良好に比較するため、または試料中の２つ以上の異なる特定の核酸の数量を良好に比較するために、投入核酸に対するまたは特定のクラスの投入核酸に対する特定の核酸の数量について正規化を実施しなければならない。特定の核酸の数量は、例えば、これらの数量を、試料の内部標準と関連づける、または全体すなわち試料中の核酸の総量と、または試料中の特定のクラスの核酸の総量と関連づけることによって正規化することができる。
（生物）試料中の核酸の従来の定量化のために、定量的（リアルタイム）ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が広く使用されている。ＲＮＡ、特にｍＲＮＡについて、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）がこの分野において使用される。定量的ＰＣＲ法から得られるデータを正規化するための異なる手法が使用されている。それらの中に、特定のｍＲＮＡの数量の、様々な参照遺伝子、例えば、ベータアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、または２８ＳリボソームＲＮＡもしくは１８ＳリボソームＲＮＡなどのハウスキーピング遺伝子またはメンテナンス遺伝子のうち１種以上のｍＲＮＡの数量に対する正規化がある。しかし、そのような正規子遺伝子（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ ｇｅｎｅ）の発現レベルは、実験条件、試料の調製物および供給源（例えば、組織または細胞の型）に応じて変動することが示されており、したがってそれらは投入核酸を確実に表すわけではない。したがって、通常、調査中の試料間で変化しないものを同定するために、一連の様々なハウスキーピング遺伝子を、困難で誤りがちな手順で試験する必要がある。
他の手法は、例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの総含有量または例えば、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の総含有量に対する正規化を利用する。生物細胞および生物試料中のリボソームＲＮＡの含有量も、種々の因子に応じて変動しやすく、同様にｒＲＮＡに対する正規化はあまり好ましくない。例えば、総核酸含有量、総ＲＮＡ含有量またはゲノムＤＮＡの総含有量に対する正規化を利用する方法も、例えば、これらの含有量または核酸試料の質の変動、ならびに各試料中の核酸の量を正確に測定することの煩わしい必要性によって制限される。異質の分子または人工的な分子、例えば、試料（例えば、細胞抽出物または組織に由来する試料）に取り込まれたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物に対する正規化も、それらが、例えば、数量および完全性に関して、細胞中の核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）含有量を表さないので、全ての場合で適切な手順であるわけではない。
さらに、正規化されたデータおよび実験手順の再現性を比較するために、適用された実験条件を完全に文書化することが必要である。これは、特に対象の核酸および正規化する核酸の数量を、別々に、または異なる方法を使用して決定する場合に当てはまる。
したがって、本発明の根底にある技術的な問題は、生物試料に普遍的に適用することができる、核酸の数量を正規化するための改良された方法、特に、あまり困難ではなく誤りがちでない方法を開発し、提供することであった。
本発明は、試料中または複数の試料中の（特定の）核酸（すなわち「標的核酸」）の数量を、試料（複数可）中の核酸の総数量；または試料（複数可）中の特定のクラスの核酸の総数量に対して正規化するための強力な改良された方法（複数可）を提供する。本発明は、試料中または複数の試料中の（特定の）核酸（すなわち「標的核酸」）の数量を、試料（複数可）中の核酸の総数量；または試料（複数可）中の特定のクラスの核酸の総数量に対して正規化するためのキットにも関する。
本発明に関しては、特定のクラスの核酸は、とりわけ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアの）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｎＲＮＡ（核ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（低分子核小体ＲＮＡ）、ｓｃａＲＮＡ（低分子カハール体特異的ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ウイルスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｓｎＤＮＡ（低分子核ＤＮＡ）など、または試料中の大量の核酸と区別可能な任意の他のクラスまたはサブクラスの核酸であってよい。
本発明の手段および方法は、核酸プローブの使用を含む。本発明による核酸プローブは、特定の核酸配列と実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、核酸またはその断片である。
一般に、本発明は、試料中の定量化される核酸の数量を、（ｉ）試料中の核酸の総数量（ｔｏｔａｌ ｑｕａｎｔｉｔｙ）、または（ｉｉ）試料中の特定のクラスの核酸の総数量に対して正規化するための方法であって、（ａ）定量化される核酸を含有する試料を供給するステップと、（ｂ）１種以上の第１の核酸プローブを、前記第１の核酸プローブの少なくとも末端領域が試料中の核酸の特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で試料に加えるステップであって、第１の核酸プローブが、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、（ｃ）ハイブリダイズした後の３’末端および５’末端が、ライゲーションが起こり得るように位置するような核酸プローブ（複数可）の任意の２つの末端領域間のライゲーションを可能にする条件下で、試料中のハイブリダイズした核酸をリガーゼと接触させるステップと、（ｄ）２種のプライマーおよび必要に応じて前記第１の核酸プローブの限定された領域（ｄｅｆｉｎｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）と実質的に相補的な第２のプローブを使用して、ステップ（ｃ）からのライゲーション産物を定量化することによって核酸の総量（ｔｏｔａｌ ａｍｏｕｎｔ）または特定のクラスの核酸の総量を定量化するステップと、（ｅ）定量化される核酸を、前記定量化される核酸の領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して定量化するステップと、（ｆ）定量化される核酸の数量と、核酸の総数量または特定のクラスの核酸の総数量との比を決定することによって、定量化される核酸の数量を正規化するステップとを含む方法に関する。
本発明は、試料中の核酸の正規化された定量化のためのキットであって、（ａ）試料中の核酸の限定された領域または特定のクラスの核酸と実質的に相補的な１種以上の第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じて１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、（ｂ）リガーゼと、（ｃ）前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブを含むキットにも関する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
試料中の定量化される核酸の数量を、
（ｉ）前記試料中の核酸の総数量、または
（ｉｉ）前記試料中の特定のクラスの核酸の総数量
に対して正規化するための方法であって、
（ａ）定量化される核酸を含有する試料を供給するステップと、
（ｂ）１種以上の第１の核酸プローブを、前記第１の核酸プローブ（複数可）の少なくとも末端領域が前記試料中の核酸の特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で前記試料に加えるステップであって、前記第１の核酸プローブ（複数可）が、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
（ｃ）ハイブリダイズした後の３’末端および５’末端が、ライゲーションが起こり得るように位置するような核酸プローブ（複数可）の任意の２つの末端領域間のライゲーションを可能にする条件下で、前記試料中の前記ハイブリダイズした核酸をリガーゼと接触させるステップと、
（ｄ）前記第１の核酸プローブ（複数可）の限定された領域と実質的に相補的な第２のプローブまたは挿入ｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素を使用してステップ（ｃ）からのライゲーション産物を定量化することによって、核酸の総量または前記特定のクラスの核酸の総量を定量化するステップと、
（ｅ）前記定量化される核酸の領域と実質的に相補的な第３のプローブまたは挿入ｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素を使用して、前記定量化される核酸を定量化するステップと、
（ｆ）前記定量化される核酸の数量と、核酸の総数量または前記特定のクラスの核酸の総数量との比を決定することによって、前記定量化される核酸の数量を正規化するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記定量化される核酸がＲＮＡであり、前記特定のクラスの核酸がＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記定量化されるＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、ＲＮＡの総数量が、ＲＮＡの総数量、ｍＲＮＡの総数量、ｒＲＮＡの総数量、ｔＲＮＡの総数量、ｎＲＮＡの総数量、ｓｉＲＮＡの総数量、ｓｎＲＮＡの総数量、ｓｎｏＲＮＡの総数量、ｓｃａＲＮＡの総数量、マイクロＲＮＡの総数量、ｄｓＲＮＡの総数量、リボザイムの総数量、リボスイッチの総数量、ウイルスＲＮＡの総数量からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記定量化されるＲＮＡがｍＲＮＡであり、前記特定のクラスの核酸がｍＲＮＡである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記特異的な結合部位がｍＲＮＡに対して特異的である、ホモポリマーの配列である、またはポリＡ配列もしくはポリＡ尾部である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記定量化される核酸がＤＮＡであり、前記特定のクラスの核酸がＤＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記定量化されるＤＮＡが、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡおよびｍｔＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡであり、ＤＮＡの総数量が、ＤＮＡの総数量、ｃＤＮＡの総数量、ｄｓＤＮＡの総数量、ｓｓＤＮＡの総数量、プラスミドＤＮＡの総数量、コスミドＤＮＡの総数量、染色体ＤＮＡの総数量、ウイルスＤＮＡの総数量およびｍｔＤＮＡの総数量からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記定量化されるＤＮＡがｃＤＮＡであり、前記特定のクラスの核酸がｃＤＮＡである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記特異的な結合部位がポリＴ配列またはポリＴ尾部である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
定量化が、定量的リアルタイムＰＣＲまたは定量的リアルタイム等温増幅を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ライゲーションステップの後に、前記試料中のＲＮＡおよび／または前記特定のクラスのＲＮＡの逆転写を可能にする条件下で、前記試料中のＲＮＡを逆転写酵素と接触させるステップをさらに含む、項目２から５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ライゲーションされる２つの末端領域が、別々の核酸プローブの一部である、または同じ核酸プローブ上にある、項目１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第２の核酸プローブおよび第３の核酸プローブが、１種以上の蛍光色素で標識され、前記定量化ステップが、前記試料中の蛍光シグナルを検出することを含む、項目１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
項目１から１３までのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、（ａ）前記試料中の核酸の限定された領域または特定のクラスの核酸と実質的に相補的な１種以上の第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じて１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、
（ｂ）リガーゼと、
（ｃ）前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブまたはｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素と
を含むキット。
（項目１５）
特異的な核酸の数量を参照核酸の数量に対して正規化するための、または遺伝子発現解析のための、項目１から１３までのいずれか一項に記載の方法または項目１４に記載のキットの使用。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
試料中の定量化される核酸の数量を、
（ｉ）前記試料中の核酸の総数量、または
（ｉｉ）前記試料中の特定のクラスの核酸の総数量
に対して正規化するための方法であって、
（ａ）定量化される核酸を含有する試料を供給するステップと、
（ｂ）１種以上の第１の核酸プローブを、前記第１の核酸プローブ（複数可）の少なくとも末端領域が前記試料中の核酸の特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で前記試料に加えるステップであって、前記第１の核酸プローブ（複数可）が、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
（ｃ）ハイブリダイズした後の３’末端および５’末端が、ライゲーションが起こり得るように位置するような核酸プローブ（複数可）の任意の２つの末端領域間のライゲーションを可能にする条件下で、前記試料中の前記ハイブリダイズした核酸をリガーゼと接触させるステップと、
（ｄ）前記第１の核酸プローブ（複数可）の限定された領域と実質的に相補的な第２のプローブまたは挿入ｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素を使用してステップ（ｃ）からのライゲーション産物を定量化することによって、核酸の総量または前記特定のクラスの核酸の総量を定量化するステップと、
（ｅ）前記定量化される核酸の領域と実質的に相補的な第３のプローブまたは挿入ｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素を使用して、前記定量化される核酸を定量化するステップと、
（ｆ）前記定量化される核酸の数量と、核酸の総数量または前記特定のクラスの核酸の総数量との比を決定することによって、前記定量化される核酸の数量を正規化するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記定量化される核酸がＲＮＡであり、前記特定のクラスの核酸がＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記定量化されるＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、ＲＮＡの総数量が、ＲＮＡの総数量、ｍＲＮＡの総数量、ｒＲＮＡの総数量、ｔＲＮＡの総数量、ｎＲＮＡの総数量、ｓｉＲＮＡの総数量、ｓｎＲＮＡの総数量、ｓｎｏＲＮＡの総数量、ｓｃａＲＮＡの総数量、マイクロＲＮＡの総数量、ｄｓＲＮＡの総数量、リボザイムの総数量、リボスイッチの総数量、ウイルスＲＮＡの総数量からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記定量化されるＲＮＡがｍＲＮＡであり、前記特定のクラスの核酸がｍＲＮＡである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記特異的な結合部位がｍＲＮＡに対して特異的である、ホモポリマーの配列である、またはポリＡ配列もしくはポリＡ尾部である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記定量化される核酸がＤＮＡであり、前記特定のクラスの核酸がＤＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記定量化されるＤＮＡが、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡおよびｍｔＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡであり、ＤＮＡの総数量が、ＤＮＡの総数量、ｃＤＮＡの総数量、ｄｓＤＮＡの総数量、ｓｓＤＮＡの総数量、プラスミドＤＮＡの総数量、コスミドＤＮＡの総数量、染色体ＤＮＡの総数量、ウイルスＤＮＡの総数量およびｍｔＤＮＡの総数量からなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記定量化されるＤＮＡがｃＤＮＡであり、前記特定のクラスの核酸がｃＤＮＡである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記特異的な結合部位がポリＴ配列またはポリＴ尾部である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
定量化が、定量的リアルタイムＰＣＲまたは定量的リアルタイム等温増幅を含む、項目１から９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記ライゲーションステップの後に、前記試料中のＲＮＡおよび／または前記特定のクラスのＲＮＡの逆転写を可能にする条件下で、前記試料中のＲＮＡを逆転写酵素と接触させるステップをさらに含む、項目２から５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ライゲーションされる２つの末端領域が、別々の核酸プローブの一部である、または同じ核酸プローブ上にある、項目１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第２の核酸プローブおよび第３の核酸プローブが、１種以上の蛍光色素で標識され、前記定量化ステップが、前記試料中の蛍光シグナルを検出することを含む、項目１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
項目１から１３までのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、（ａ）前記試料中の核酸の限定された領域または特定のクラスの核酸と実質的に相補的な１種以上の第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じて１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、
（ｂ）リガーゼと、
（ｃ）前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブまたはｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素と
を含むキット。
（項目１５）
特異的な核酸の数量を参照核酸の数量に対して正規化するための、または遺伝子発現解析のための、項目１から１３までのいずれか一項に記載の方法または項目１４に記載のキットの使用。
本発明は、試料中の定量化される核酸の数量を、（ｉ）試料中の核酸の総数量、または（ｉｉ）試料中の特定のクラスの核酸の総数量に対して正規化するための方法であって、（ａ）定量化される核酸を含有する試料を供給するステップと、（ｂ）１種以上の第１の核酸プローブを、第１の核酸プローブの少なくとも末端領域が試料中の核酸の特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で試料に加えるステップであって、第１の核酸プローブが、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、（ｃ）ハイブリダイズした後の３’末端および５’末端が、ライゲーションが起こり得るように位置するような核酸プローブ（複数可）の任意の２つの末端領域間のライゲーションを可能にする条件下で、試料中のハイブリダイズした核酸をリガーゼと接触させるステップと、（ｄ）プライマーおよび必要に応じて前記第１の核酸プローブの限定された領域と実質的に相補的な第２のプローブを使用して、ステップ（ｃ）からのライゲーション産物を定量化することによって核酸の総量または特定のクラスの核酸の総量を定量化するステップと、前記定量化される核酸の領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して、定量化される核酸を定量化するステップと、（ｆ）定量化される核酸の数量と、核酸の総数量または特定のクラスの核酸の総数量との比を決定することによって、定量化される核酸の数量を正規化するステップとを含む方法を提供する。
第１の核酸プローブのプライマー結合部位および／またはプローブ結合部位は、プライマーおよび必要に応じて第２の核酸プローブを使用した第１の核酸プローブの増幅および／または検出または定量化が、ステップ（ｃ）においてライゲーションに成功した後のみに起こり得るように配置される。
試料は、少なくとも定量化される核酸を含む核酸分子を含有する。核酸は、細胞または生物体に埋め込むことができるが、無細胞系の中に存在してもよい。試料は、流体、溶解物、固体マトリックスまたは核酸分子を含む他の任意の試料であってよい。
本発明に関しては、核酸は、デオキシリボ核酸（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）に関する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、生物体において天然に存在するが、ＤＮＡおよびＲＮＡは生きている生物体の外側に存在してもよい、または生物体に追加されてもよい。核酸は、任意の起源、例えば、ウイルス起源、細菌起源、古細菌起源、真菌起源、リボソーム起源、真核生物起源または原核生物起源のものであってよい。これは、任意の生物学的試料および任意の生物体、組織、細胞または細胞下区画に由来する核酸であってよい。これは、例えば、植物、真菌、動物からの核酸、特にヒトの核酸であってよい。核酸は、定量化する前に、例えば、単離、精製または改変によって前処理することができる。人工的な核酸も定量化することができる。核酸の長さは変動してよい。核酸は、改変されてよく、例えば、１つ以上の改変された核酸塩基または改変された糖部分（例えば、メトキシ基を含む）を含んでよい。核酸の骨格は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）にあるような１つ以上のペプチド結合を含んでよい。核酸は、非プリン類似体または非ピリミジン類似体またはヌクレオチド類似体などの塩基類似体を含んでよい。核酸は、タンパク質、ペプチドおよび／またはアミノ酸などの追加的な付着物も含んでよい。
本発明の特定の実施形態では、定量化される核酸はＲＮＡであり、特定のクラスの核酸はＲＮＡである。
本発明の特定の実施形態では、定量化される核酸はＲＮＡであり、特定のクラスの核酸はＲＮＡである。
さらに特定すると、定量化されるＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり、ＲＮＡの総数量は、ＲＮＡの総数量、ｍＲＮＡの総数量、ｒＲＮＡの総数量、ｔＲＮＡの総数量、ｎＲＮＡの総数量、ｓｉＲＮＡの総数量、ｓｎＲＮＡの総数量、ｓｎｏＲＮＡの総数量、ｓｃａＲＮＡの総数量、マイクロＲＮＡの総数量、ｄｓＲＮＡの総数量、リボザイムの総数量、リボスイッチの総数量、ウイルスＲＮＡの総数量からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、定量化されるＲＮＡはｍＲＮＡであり、特定のクラスの核酸はｍＲＮＡである。
特異的な結合部位は、ｍＲＮＡに対して特異的である、またはホモポリマーの核酸配列、例えば、ポリＡ配列もしくはポリＡ尾部であることが好ましい。ポリＡ尾部は、試料ＲＮＡ中に天然に存在するままであってよい。ポリＡ尾部を有さないＲＮＡの場合は、適切なホモポリマーの尾部をＲＮＡの３’末端に付加するための実験手順を利用することができる。そのような尾部は、Ａ塩基、Ｃ塩基、Ｇ塩基、もしくはＵ塩基または適切な塩基類似体で構成されてよい。そのような尾部の付加は、化学的にまたは酵素的に実施することができる。酵素は、ポリＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リガーゼ、または核酸の３’末端へのヌクレオチドの付加または連結を触媒する他の適切な酵素のクラスから選択することができる。
本発明の別の実施形態では、定量化される核酸はＤＮＡであり、特定のクラスの核酸はＤＮＡである。
本発明の特定の実施形態では、定量化されるＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡおよびｍｔＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡであり、ＤＮＡの総数量は、ＤＮＡの総数量、ｃＤＮＡの総数量、ｄｓＤＮＡの総数量、ｓｓＤＮＡの総数量、プラスミドＤＮＡの総数量、コスミドＤＮＡの総数量、染色体ＤＮＡの総数量、ウイルスＤＮＡの総数量およびｍｔＤＮＡの総数量からなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、定量化されるＤＮＡはｃＤＮＡであり、特定のクラスの核酸はｃＤＮＡである。特異的な結合部位はホモポリマーの配列、例えば、ポリＴ配列またはポリＴ尾部であることが好ましい。
本発明の一部の実施形態では、第１の核酸プローブはＤＮＡまたはＲＮＡまたは人工的な核酸または改変された核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）である。第１の核酸プローブはＤＮＡまたはＲＮＡであることが好ましく、ＤＮＡであることが最も好ましい。
第２の核酸プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたは人工的な核酸または改変された核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）であってよい。第２の核酸プローブは、前記第１の核酸プローブのプローブ結合部位の配列と実質的に相補的な配列を有する。したがって、第２の核酸プローブは、当業者に公知のある特定の条件（温度、塩濃度）下で、第１の核酸プローブとハイブリダイズすることができる。第２の核酸プローブが第１の核酸プローブとハイブリダイズすることは、第１の核酸プローブが首尾よくライゲーションされたことを表し得る。
第３の核酸プローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたは人工的な核酸または改変された核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）であってよい。第３の核酸プローブは、定量化される核酸の配列と実質的に相補的な配列を有する。したがって、第３の核酸プローブは、当業者に公知のある特定の条件（温度、塩濃度）下で、定量化される核酸とハイブリダイズすることができる。
本発明の特定の実施形態では、定量化するステップは、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、その後に検出測定を伴う標識化反応、および定量的リアルタイムＰＣＲまたは等温性の標的増幅からなる群から選択される方法を含む。定量化ステップは、定量的リアルタイムＰＣＲまたは定量的リアルタイム等温増幅を含むことが好ましい。定量化は、定量的リアルタイムＰＣＲを含むことがより好ましい。
核酸を定量化するために使用する、ＰＣＲに基づく方法以外の増幅方法としては、これらに限定されないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、自続配列複製（３ＳＲ）、Ｑβ増幅および（熱安定性の）ヘリカーゼ依存性増幅（（ｔ）ＨＤＡ）が挙げられる。ＮＡＳＢＡ、ＴＡＳ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、３ＳＲ、（ｔ）ＨＤＡおよびＱβ増幅は、等温増幅方法である。
本発明の一部の実施形態では、方法は、ライゲーションステップの後に、試料中のＲＮＡおよび／または特定のクラスのＲＮＡを逆転写することを可能にする条件下で、試料中のＲＮＡを逆転写酵素と接触させるステップをさらに含む。
定量化ステップは、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲまたは定量的リアルタイム逆等温増幅を含むことが好ましい。
定量化ステップが、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲを含むことが最も好ましい。本発明の好ましい実施形態では、定量化ステップ（複数可）は、（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち逆転写酵素）を使用して、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）をＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）に逆転写すること、（ｉｉ）逆転写によって作製されたＤＮＡを、ＰＣＲを使用して増幅すること、および（ｉｉｉ）増幅産物をリアルタイムで検出し、定量化することを含む。
特定の実施形態では、逆転写するステップと定量化するステップを同じ反応容器内で実施する。
一部の実施形態では、逆転写酵素は、定量化ステップの間に増幅のためにも使用されるポリメラーゼである。
本発明の実施形態に関して、選択的プライマーまたはランダムプライマーを、定量的リアルタイムＰＣＲまたは等温増幅において使用することができる。
「プライマー」は、本明細書では、転写される核酸（「鋳型」）と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。複製の間、ポリメラーゼによって、ヌクレオチドが、鋳型のそれぞれのヌクレオチドと相補的なプライマーの３’末端に付着する。
本発明による一部の方法では、ライゲーションされる２つの末端領域は、別々の核酸プローブの一部である。他の実施形態では、ライゲーションされる２つの末端領域は、同じ核酸プローブ上にある。
一部の実施形態では、第１の核酸プローブはＤＮＡであり、リガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼおよびＥ．ｃｏｌｉリガーゼからなる群から選択されるＤＮＡリガーゼである。好ましいリガーゼは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである。
本発明の好ましい実施形態では、第１の核酸プローブはＲＮＡであり、リガーゼはＴ４ ＲＮＡリガーゼである。
定量化される核酸の数量および核酸の総数量または特定のクラスの核酸の総数量を同時に決定することが好ましい。
本発明の特定の実施形態では、定量的リアルタイムＰＣＲに使用するポリメラーゼは、好熱性の生物体由来のポリメラーゼである、または耐熱性ポリメラーゼである、または、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（Ｔｆｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ Ｄｐｏ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｐａｃｉｆｉｃｕｓ（Ｔｐａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｅｇｇｅｒｔｓｓｏｎｉｉ（Ｔｅｇ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（Ｔｂｒ）およびＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。
本発明の好ましい実施形態では、第２の核酸プローブおよび第３の核酸プローブを１種以上の蛍光色素および／またはクエンチャーで標識し、定量化するステップが、試料中の蛍光シグナルを検出することを含む。
第２の核酸プローブおよび第３の核酸プローブは、ハイブリダイゼーションプローブ、加水分解プローブおよびヘアピンプローブからなる群から選択される蛍光標識されたプローブであることがより好ましい。
特に、蛍光標識されたプローブは、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒおよびＰＥＴまたは同様の励起特性および放出特性を有する類似の色素からなる群から選択される色素で標識する。
特に、ハイブリダイゼーションプローブは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ（Ｒｏｃｈｅ）である、または加水分解プローブはＴａｑＭａｎプローブ（Ｒｏｃｈｅ）である。他の実施形態では、ヘアピンプローブは、分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、Ｓｕｎｒｉｓｅプライマー、ＬＵＸプライマーおよびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマーからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本発明による手段および方法は、遺伝子発現レベルを正規化するために使用される。
本発明の一部の実施形態では、さらに、予め定量化された核酸を試料に加え、定量化するステップにおいて前記予め定量化された核酸の数量を決定する。予め定量化された核酸は、例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡであってよい。予め定量化された核酸は合成ＲＮＡであることが好ましい。
定量化される２つ以上の核酸の数量は、同時に、すなわち一度に正規化することが好ましい。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、試料中の定量化されるｍＲＮＡの数量を、試料中のｍＲＮＡの総数量に対して正規化するための方法であって、（ａ）定量化されるｍＲＮＡを含有する試料を供給するステップと、（ｂ）１種以上の第１の核酸プローブを、前記第１の核酸プローブの少なくとも末端領域が試料中のｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で試料に加えるステップであって、第１の核酸プローブが、１種以上のプライマー結合部位および必要に応じて１つのプローブ結合部位を含むステップと、（ｃ）ハイブリダイズした後の３’末端および５’末端が、ライゲーションが起こり得るように位置するような核酸プローブ（複数可）の任意の２つの末端領域間のライゲーションを可能にする条件下で、試料中のハイブリダイズした核酸をリガーゼと接触させるステップと、（ｄ）試料中のｍＲＮＡを逆転写することを可能にする条件下で、試料中のｍＲＮＡを逆転写酵素と接触させるステップと、（ｅ）プライマーおよび必要に応じて前記第１の核酸プローブの限定された領域と実質的に相補的な第２のプローブを使用して、ステップ（ｃ）からのライゲーション産物を定量化することによって総量を定量化するステップと、（ｆ）前記定量化されるｍＲＮＡの領域と実質的に相補的な第３のプローブを使用して、定量化されるｍＲＮＡを定量化するステップと、（ｇ）定量化されるｍＲＮＡの数量と、ｍＲＮＡの総数量との比を決定することによって、定量化されるｍＲＮＡの数量を正規化するステップとを含む方法に関する。
本発明は、上記の方法のいずれかを実施するためのキットにも関し、キットは、（ａ）試料中の核酸の限定された領域または特定のクラスの核酸と実質的に相補的な１種以上の第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じて１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、（ｂ）リガーゼと、（ｃ）前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブとを含む。
したがって、本発明は、試料中の核酸の正規化された定量化のためのキットに関し、キットは、（ａ）試料中の核酸の限定された領域または特定のクラスの核酸と実質的に相補的な１種以上の第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位および必要に応じて１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、（ｂ）リガーゼと、（ｃ）前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブとを含む。
本発明の好ましい実施形態では、キットは、ポリメラーゼをさらに含む。キットは、ヌクレオチド混合物および反応バッファー（複数可）および／またはプライマーセット、および必要に応じて、ライゲーション産物を増幅し、検出するための第２のプローブもさらに含んでよい。一部の実施形態では、キットは、逆転写酵素をさらに含む。
したがって、本発明の好ましい実施形態は、試料中の定量化されるｍＲＮＡの数量を試料中のｍＲＮＡの総数量に対して正規化するためのキットに関し、キットは、試料中のｍＲＮＡのポリＡ配列と実質的に相補的な１種以上の第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位および必要に応じて１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブを含む。
特定の実施形態では、キットは、１種以上の予め定量化された較正用核酸、前記較正用核酸を増幅するためのプライマーセットおよび前記予め定量化された核酸の配列と実質的に相補的な第１の核酸プローブをさらに含む。
一部の実施形態では、１種以上の構成成分を、同じ反応容器内で予備混合する。
本明細書で上に示したように、遺伝子発現の解析に関して、試料中のｍＲＮＡの定量化は、定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して実施することができる。ＲＴ−ｑＰＣＲ法では、３つのステップ：（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち逆転写酵素）を使用して、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ、（ｉｉ）ＰＣＲを使用してｃＤＮＡを増幅するステップ、および（ｉｉｉ）増幅産物をリアルタイムで検出し、定量化するステップの組み合わせを使用する。逆転写およびＰＣＲに基づく増幅のために、ｄＮＴＰ（「ヌクレオチド混合物」）が反応バッファー中に存在することが必要である。本発明によるヌクレオチド混合物は、ＰＣＲにおいて使用するために適したｄＮＴＰの混合物、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ／ｄＵＴＰの混合物である。本発明の特定の実施形態に関して、これらのｄＮＴＰの相対的な量は、鋳型核酸の特定のヌクレオチド含有量に応じて適合させることができる。ＲＴ−ｑＰＣＲのステップは、一段階のプロセス、または二段階のプロセスのいずれかで実施することができる。第１の場合では、逆転写およびＰＣＲに基づく増幅は、同じ反応容器内で、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ポリメラーゼのような内因性逆転写機能性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用することによって、または逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用することによって実施する。二段階の設定では、ＲＮＡを逆転写するステップとＤＮＡを増幅するステップを、別々に、例えば、異なる反応容器内で実施する。本発明による方法のステップは、例えば、マグネシウムイオンなどの塩を含む適切な反応バッファー中で行うことができる。すでに述べた通り、異なるステップは、同じバッファーおよび反応容器中で行ってよい、または、同じバッファーおよび反応容器中で行わなくてよい。ＲＴ−ｑＰＣＲと対照的に、ｑＰＣＲでは、逆転写は実施されず、したがって、これはＲＮＡではなくＤＮＡについての定量化方法である。
ＲＴ−ｑＰＣＲにおける（ｍ）ＲＮＡの逆転写ならびにｑＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲにおける（ｃ）ＤＮＡの増幅には、オリゴヌクレオチド（「プライマー」）によってプライミングことが必要である。ＲＴ−ｑＰＣＲを用いてｍＲＮＡを定量化する場合では、ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡのポリＡ尾部にハイブリダイズするオリゴ−ｄＴプライマーを使用することができる。しかし、長さが異なるランダムプライマーも利用することができる。
さらに別の実施形態では、等温性のリアルタイム増幅反応を実施することができる。遺伝子発現の解析に関して、ＰＣＲの代わりに、例えば、ヘリカーゼ依存性増幅を利用する定量的リアルタイム逆転写等温増幅を使用して、試料中のｍＲＮＡの定量化を実施することができる。そのような方法は、以下のステップを用いる：（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち逆転写酵素）を使用してｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するステップ、（ｉｉ）等温増幅によってｃＤＮＡを増幅するステップ、および（ｉｉｉ）増幅産物をリアルタイムで検出し、定量化するステップ。逆転写および等温性に基づいた増幅のために、ｄＮＴＰ（「ヌクレオチド混合物」）が反応バッファー中に存在することが必要である。本発明によるヌクレオチド混合物は、ＰＣＲにおいて使用するために適したｄＮＴＰの混合物、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ／ｄＵＴＰの混合物である。本発明の特定の実施形態に関して、これらのｄＮＴＰの相対的な量は、鋳型核酸の特定のヌクレオチド含有量に応じて適合させることができる。ＲＴ−等温増幅のステップは、一段階のプロセス、または二段階のプロセスのいずれかで実施することができる。第１の場合では、逆転写および等温増幅は、同じ反応容器内で、例えば、鎖を分離するためのヘリカーゼ、内因性逆転写機能性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用することによって、または、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの混合物を使用することによって実施する。二段階の設定では、ＲＮＡを逆転写するステップおよびＤＮＡを増幅するステップを、別々に、例えば、異なる反応容器内で実施する。本発明による方法のステップは、例えば、マグネシウムイオンなどの塩を含み、ＡＴＰまたはｄＡＴＰまたは一本鎖結合性タンパク質などの追加的な補因子を含有してよい適切な反応バッファー中で行うことができる。すでに述べた通り、異なるステップは、同じバッファーおよび反応容器中で行ってよい、または、同じバッファーおよび反応容器中で行わなくてよい。
さらに、等温増幅プロトコールまたは標準の定量的リアルタイムＰＣＲプロトコールおよびキットを、本発明による手段および方法のために適合させるまたは修正することができる。
上記の通り、リアルタイムＰＣＲ（本明細書では定量的ＰＣＲまたは定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とも称される）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、核酸を同時に増幅し定量化するための方法である。定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）は、ＲＮＡをＤＮＡに、例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することをさらに含む定量的リアルタイムＰＣＲ法である。ｑＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲ法では、増幅された核酸は、それが蓄積するにつれて定量化される。一般には、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）にインターカレートする蛍光色素、例えば、臭化エチジウムもしくはＳＹＢＲ（登録商法）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、または相補的な核酸とハイブリダイズしたときに（例えば、ＤＮＡの蓄積）蛍光を発する改変された核酸プローブ（「レポータープローブ」）を、ｑＰＣＲに基づく方法における定量化のために使用する。特に、蛍光発生プライマー、ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ（Ｒｏｃｈｅ））、加水分解プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｒｏｃｈｅ））、または分子ビーコン、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー（ＤｘＳ）、Ｓｕｎｒｉｓｅプライマー（Ｏｎｃｏｒ）、ＬＵＸプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマー（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）などのヘアピンプローブなどを、レポータープローブとして使用することができる。本発明に従って、蛍光発生プライマーまたはプローブは、例えば蛍光色素が付着、例えば、共有結合的に付着したプライマーまたはプローブであってよい。そのような蛍光色素は、例えば、ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン）、ＶＩＣ、ＮＥＤ、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＩＲＤ−７００／８００、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ３．５、ＣＹ５．５、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＲＯＸ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＰＥＴ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（商標）、Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｂｏｔｈｅｌｌ Ｂｌｕｅ（登録商標）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｇｏｌｄ、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｒｅｄ ６１０、Ｑｕａｓａｒ（商標）６７０、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅｄ６４０（登録商標）、Ｑｕａｓａｒ（商標）７０５、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅｄ７０５（登録商標）などであってよい。特定のレポータープローブは、蛍光クエンチャーをさらに含んでよい。
本発明は、特定の核酸の数量を、参照核酸の数量に対して正規化するための、本発明の方法または本発明のキットの使用にも関する。
さらに、本発明は、遺伝子発現解析のための、本発明の方法または本発明のキットの使用にも関する。
（実施例１）
ｍＲＮＡ上でのオリゴヌクレオチドプローブの環状化
試料中に含有されるメッセンジャーＲＮＡの最初の量に正比例する増幅標的を生成するために、図１に示されているとおりの、図４に示されている配列を有するプローブ分子を供給する。
ｍＲＮＡ上でのオリゴヌクレオチドプローブの環状化
試料中に含有されるメッセンジャーＲＮＡの最初の量に正比例する増幅標的を生成するために、図１に示されているとおりの、図４に示されている配列を有するプローブ分子を供給する。
オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端におけるポリ（Ｔ）配列がｍＲＮＡのポリ（Ａ）部分とハイブリダイズする。これらの配列が、ｍＲＮＡ標的鋳型とヘッドトゥテール配置でハイブリダイズしている場合、リガーゼによって末端をつなぎ合わせ、この環状化されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いて増幅することができる、共有結合によって閉じた一本鎖の標的核酸を創製することができる。
ｍＲＮＡ標的上でのプローブの環状化は、以下の実験条件に従って行った：８０ｎｇ、４０ｎｇまたは２０ｎｇのいずれかの白血球ＲＮＡを、それぞれＴ４リガーゼ１μｌ、Ｔ４リガーゼライゲーションバッファー４μｌ、水６μｌと混合し、最終的な反応容積２０μｌ中、室温で６０分間インキュベートした。標的ＲＮＡを含まない陰性対照を含めた。各反応物は、０．１μＭまたは０．０１μＭのいずれかの、図４に示されているオリゴヌクレオチドも含有した。
（実施例２）
試料のｍＲＮＡ含有量を示す環状化された標的オリゴヌクレオチドの増幅
環状化された標的オリゴヌクレオチドの増幅を、実施例１に記載のライゲーション反応物を用いて行った。ライゲーション反応物を、１：１０または１：１００のいずれかに希釈し、これらの希釈物２μｌを、最終的な容積２０μｌ中、２×ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、および濃度１μＭのプライマーを含有する増幅反応に供した。プライマー配列は以下の通りであった：プライマー１：５’−ｔｇｇａｇｇｔｃｃａｔｔａａａｇｃｃａａｇｔｔ−３’およびプライマー２：５’−ｔｇｇｔｇｃｃａｔｇｔａａｇｇａｔｇａａｔｇｔ−３’。９５℃で５分間のホットスタートポリメラーゼ再活性化ステップの後、サイクルのプロトコールは、９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間の４０サイクルからなった。シグナルを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにおいて、ｄｓＤＮＡに特異的な結合色素であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用した、反応物のリアルタイムモニタリングを用いて検出した。あるいは、図１の青色の配列と相補的な配列特異的な蛍光標識プローブも、検出のために使用することができる。表１に示されているデータにより、元のＲＮＡ投入量に比例する閾値サイクル数（Ｃｔ）値（２倍の鋳型の希釈物により、およそ１Ｃｔのシフトが生じる）が明白に示され、これは、メッセンジャーＲＮＡ分子のポリ（Ａ）部分とハイブリダイズしている一本鎖オリゴヌクレオチドの環状化および検出を利用して、試料中に含有されるｍＲＮＡの量を検出することができ、したがって、全体の遺伝子発現レベルを試料の総ｍＲＮＡ含有量に対して正規化するためのツールとして利用することができることを実証している。標的ＲＮＡが存在しないもの（ＮＴＣ）では、シグナルは検出されない。全ての増幅反応を３回実施し、平均Ｃｔ値を算出した。
試料のｍＲＮＡ含有量を示す環状化された標的オリゴヌクレオチドの増幅
環状化された標的オリゴヌクレオチドの増幅を、実施例１に記載のライゲーション反応物を用いて行った。ライゲーション反応物を、１：１０または１：１００のいずれかに希釈し、これらの希釈物２μｌを、最終的な容積２０μｌ中、２×ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）、および濃度１μＭのプライマーを含有する増幅反応に供した。プライマー配列は以下の通りであった：プライマー１：５’−ｔｇｇａｇｇｔｃｃａｔｔａａａｇｃｃａａｇｔｔ−３’およびプライマー２：５’−ｔｇｇｔｇｃｃａｔｇｔａａｇｇａｔｇａａｔｇｔ−３’。９５℃で５分間のホットスタートポリメラーゼ再活性化ステップの後、サイクルのプロトコールは、９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間の４０サイクルからなった。シグナルを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにおいて、ｄｓＤＮＡに特異的な結合色素であるＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用した、反応物のリアルタイムモニタリングを用いて検出した。あるいは、図１の青色の配列と相補的な配列特異的な蛍光標識プローブも、検出のために使用することができる。表１に示されているデータにより、元のＲＮＡ投入量に比例する閾値サイクル数（Ｃｔ）値（２倍の鋳型の希釈物により、およそ１Ｃｔのシフトが生じる）が明白に示され、これは、メッセンジャーＲＮＡ分子のポリ（Ａ）部分とハイブリダイズしている一本鎖オリゴヌクレオチドの環状化および検出を利用して、試料中に含有されるｍＲＮＡの量を検出することができ、したがって、全体の遺伝子発現レベルを試料の総ｍＲＮＡ含有量に対して正規化するためのツールとして利用することができることを実証している。標的ＲＮＡが存在しないもの（ＮＴＣ）では、シグナルは検出されない。全ての増幅反応を３回実施し、平均Ｃｔ値を算出した。
（表１：異なるＲＮＡ濃度に対する実験的なＣｔ値）
Claims (15)
- 試料中の定量化される核酸の数量を、
（ｉ）前記試料中の核酸の総数量、または
（ｉｉ）ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡの総数量
に対して正規化するための方法であって、
（ａ）定量化される核酸を含有する試料を供給するステップと、
（ｂ）１種以上の第１の核酸プローブを、前記１種以上の第１の核酸プローブの少なくとも末端領域が前記試料中の核酸の特異的な結合部位とハイブリダイズし、それによって二本鎖核酸が作出されることを可能にする条件下で前記試料に加えるステップであって、前記１種以上の第１の核酸プローブが、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じてプローブ結合部位を含むステップと、
（ｃ）ハイブリダイズした後の３’末端および５’末端が、ライゲーションが起こり得るように位置するような１種以上の核酸プローブの任意の２つの末端領域間のライゲーションを可能にする条件下で、前記試料中の前記ハイブリダイズした核酸をリガーゼと接触させるステップと、
（ｄ）前記１種以上の第１の核酸プローブの限定された領域と実質的に相補的な第２のプローブまたは挿入ｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素を使用してステップ（ｃ）からのライゲーション産物を定量化することによって、核酸の総量または前記特定のクラスの核酸の総量を定量化するステップと、
（ｅ）前記定量化される核酸の領域と実質的に相補的な第３のプローブまたは挿入ｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素を使用して、前記定量化される核酸を定量化するステップと、
（ｆ）前記定量化される核酸の数量と、核酸の総数量または前記特定のクラスの核酸の総数量との比を決定することによって、前記定量化される核酸の数量を正規化するステップと
を含む方法。 - 前記定量化される核酸がＲＮＡであり、前記試料中の定量化される核酸の数量がＲＮＡまたはｍＲＮＡの総数量に対して正規化される、請求項１に記載の方法。
- 前記定量化されるＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチおよびウイルスＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
- 前記定量化されるＲＮＡがｍＲＮＡであり、前記試料中の定量化されるＲＮＡの数量がｍＲＮＡの総数量に対して正規化される、請求項３に記載の方法。
- 前記特異的な結合部位がｍＲＮＡに対して特異的である、ホモポリマーの配列である、またはポリＡ配列もしくはポリＡ尾部である、請求項４に記載の方法。
- 前記定量化される核酸がＤＮＡであり、前記試料中の定量化されるＤＮＡの数量がＤＮＡまたはｃＤＮＡの総数量に対して正規化される、請求項１に記載の方法。
- 前記定量化されるＤＮＡが、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡおよびｍｔＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
- 前記定量化されるＤＮＡがｃＤＮＡであり、前記試料中の定量化されるＤＮＡの数量がｃＤＮＡの総数量に対して正規化される、請求項７に記載の方法。
- 前記特異的な結合部位がポリＴ配列またはポリＴ尾部である、請求項８に記載の方法。
- 定量化が、定量的リアルタイムＰＣＲまたは定量的リアルタイム等温増幅を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーションステップの後に、前記試料中のＲＮＡおよび／または前記特定のクラスのＲＮＡの逆転写を可能にする条件下で、前記試料中のＲＮＡを逆転写酵素と接触させるステップをさらに含む、請求項２から５までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲーションされる２つの末端領域が、別々の核酸プローブの一部である、または同じ核酸プローブ上にある、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の核酸プローブおよび第３の核酸プローブが、１種以上の蛍光色素で標識され、前記定量化ステップが、前記試料中の蛍光シグナルを検出することを含む、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、（ａ）前記試料中の核酸の限定された領域または特定のクラスの核酸と実質的に相補的な１種以上の第１の核酸プローブであって、１種以上のプライマー結合部位を含み、必要に応じて１つのプローブ結合部位を含む第１の核酸プローブと、
（ｂ）リガーゼと、
（ｃ）前記第１の核酸プローブの前記プローブ結合部位と実質的に相補的な第２の核酸プローブまたはｄｓＤＮＡ特異的蛍光色素と
を含むキット。 - 特異的な核酸の数量を参照核酸の数量に対して正規化するための、または遺伝子発現解析のための、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法または請求項１４に記載のキットの使用。
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