JP2009098009A - 蛍光検出装置およびその装置に使用される微小開孔金属薄膜の作製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光検出装置において、簡易的光学系を用いて安価に高感度な蛍光検出を可能とする。
【解決手段】光源８からの励起光９を、基板６の励起光９の入射面とは異なる表面に成膜された、励起光９の波長以下の径を有する微小開孔２４ａを持つ微小開孔金属薄膜２４と基板６との界面２４ｂに向けて基板６を通して入射させ、微小開孔２４ａにおいて近接場光２３を発生させる。この近接場光２３および／または近接場光２３により微小開孔金属薄膜２４に誘起される表面プラズモンにより、金属薄膜２４に接するように供給された試料１に含まれる蛍光標識５を発光させ、この蛍光標識５からの蛍光を検出器１０で検出する。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光法により試料中の特定物質を検出する蛍光検出装置、およびその蛍光検出装置に使用する微小開孔金属薄膜の作製方法に関するものであり、特に詳細には近接場光を利用した蛍光検出装置、および浸漬吸着法を用いた微小開孔金属薄膜の作製方法に関するものである。

バイオ測定等において、蛍光法は高感度かつ容易な測定法として広く用いられている。蛍光法とは、特定波長の光に励起されて蛍光を発する被検出物質を含むと考えられる試料に、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出することによって定性的または定量的に被検出物質の存在を確認する方法である。また、被検出物質自身が蛍光体ではない場合には、この被検出物質を有機蛍光色素等の蛍光標識で標識し、その後同様にして蛍光を検出することにより、その標識の存在をもって被検出物質の存在を確認する方法である。

とりわけここ数年、蛍光法は、冷却ＣＣＤの発達など光検出器の高性能化と相まって、バイオ研究には欠かせない道具となっている。また、蛍光標識に用いる材料においても、特に可視領域では蛍光量子収率の高い蛍光色素、例えばＦＩＴＣ（蛍光 ５２５ｎｍ、蛍光量子収率 ０．６）やＣｙ５（蛍光 ６８０ｎｍ、蛍光量子収率 ０．３）のような実用の目安となる０．２を超える蛍光色素が開発され広く用いられている。

本出願人は、表面プラズモンによる電場の増強を用いて、蛍光信号を増大するセンサについて特許出願をした（特許文献１）。この方法を用いれば、１ｐＭを切るような高感度検出が可能である。しかしながら、一般的に表面プラズモンを励起するためには、プリズム基板等を用いた複雑な光学系（以下、単にプリズム光学系と言う）を要するため、装置が大型になりコストが高くなるのが普通である。

また、本出願人は、径が２００ｎｍ程度の微小開孔を有する微小開孔薄膜を利用して、簡易的に近接場を発生させ、プリズム光学系を使わない簡易な光学系を用いた蛍光測定を可能にするセンサについて特許出願をした（特許文献２）。これにより、光散乱ノイズの影響をほとんど無視できる低ノイズの蛍光測定系を安価に実現することができる。しかしながら、一般的にさらなるＳ／Ｎ比の向上が望まれており、ノイズの低減のみではなく、蛍光強度の増幅も必要とされている。
特願２００６−２５５３７４号公報 特願２００６−２２４９８６号公報

本発明は、上記のような蛍光検出装置において、簡易な光学系を用いることを可能にすると共にさらなるＳ／Ｎ比の向上を可能にする、安価で高感度検出可能な蛍光検出装置を提供することを目的とするものである。

さらに本発明は、この蛍光検出装置に使用する微小開孔金属薄膜の作製において、安定かつ密着性の良い薄膜の作製と良質かつ均一性の良い微小開孔の作製との両立を可能とする微小開孔金属薄膜の作製方法を提供することを目的とするものである。

本発明による第１の蛍光検出装置は、
励起光を発する光源と、
励起光を受ける位置に配された、この励起光を透過させる材料からなる基板と、
基板の励起光入射面とは異なる一面に形成された、径が励起光の波長以下である微小開孔を有する微小開孔金属薄膜を含む検出部と、
検出部に、蛍光標識にて標識された被検出物質を含む試料を接触させるように供給する試料供給手段と、
蛍光標識からの蛍光を検出する位置に配された光検出器と
を備えてなり、
検出部における基板と微小開孔金属薄膜の界面に対して、基板を通し入射された励起光により、微小開孔において発生せしめられた近接場光および／またはこの近接場光により微小開孔金属薄膜に誘起された表面プラズモンによって、蛍光標識を励起し、この蛍光標識から発せられる蛍光を検出するように構成されていることを特徴とするものである。

また、本発明による第２の蛍光検出装置は、
励起光を発する光源と、
励起光を受ける位置に配された、この励起光を透過させる材料からなる基板と、
基板の励起光入射面とは異なる一面に形成された、径が励起光の波長以下である微小開孔を有する微小開孔金属薄膜を含む検出部と、
検出部表面に固定された特異的結合物質と、
検出部に、蛍光標識と被検出物質を含む試料を接触させるように供給する試料供給手段と、
蛍光標識からの蛍光を検出する位置に配された光検出器と
を備えてなり、
検出部における基板と微小開孔金属薄膜の界面に対して、基板を通し入射された励起光により、微小開孔において発生せしめられた近接場光および／またはこの近接場光により微小開孔金属薄膜に誘起された表面プラズモンによって、蛍光標識を励起し、この蛍光標識から発せられる蛍光を検出するように構成されていることを特徴とするものである。

なお本発明において「微小開孔薄膜」とは、径が使用する励起光の波長以下である微小開孔を有する薄膜を意味し、特にその薄膜材料が金属であるものを「微小開孔金属薄膜」という。また、微小開孔の「径」とは、開孔の開口面積と等価な面積を有する円の直径を意味するものとする。

また、「検出部」とは、基板の表面に微小開孔金属薄膜が設けられた領域であって、その領域に被検出物質とともに接触された試料中の蛍光標識が、基板を通して入射された励起光により微小開孔において発生せしめられた近接場光あるいは近接場光により微小開孔金属薄膜に誘起された表面プラズモンによって、蛍光標識から蛍光を発光させたとき、その蛍光を光学的に検出させるようにした部分である。

そして、「特異的結合物質」とは、例えばタンパク質に対するリガンドあるいは抗原に対する抗体といった、ある特定の物質に対して特異的に結合する性質を有する物質を意味する。

上記特異的結合物質は、次のような２種類の蛍光法に対応するためのものである。すなわち一つは、例えば被検出物質が抗原で、特異的結合物質が上記抗原に対する一次抗体であって、基板に固定された一次抗体に抗原を結合させ、その後この抗原を二次抗体（蛍光標識にて標識されたリンカー）を介して蛍光標識にて標識し、結果的に基板に固定されたこの蛍光標識からの蛍光を検出する、すなわち抗原の存在する箇所からの蛍光を検出する、いわゆる「サンドイッチ方式」による蛍光法である。もう一つは、同様に基板に固定された一次抗体に対して、抗原および二次抗体を競合的に結合させ、このうち結果的に基板に固定された二次抗体に結合している蛍光標識からの蛍光を検出する、すなわち抗原の存在しない箇所からの蛍光を検出する、いわゆる「競合方式」による蛍光法である。これら２種類の蛍光法は、抗原抗体反応に限らず検出条件に応じて適宜蛍光標識にて標識されたリンカーおよび特異的結合物質を選択することで実施することができる。

この場合、特異的結合物質を固定する場所は、検出部の露出面である。すなわち、微小開孔金属薄膜の表面および／または微小開孔金属薄膜の微小開孔における基板の露出面であり、特に、微小開孔金属薄膜に特異的結合物質を固定するときはその場所として微小開孔近傍がより望ましい。

また、検出部は、微小開孔金属薄膜表面に疎水性材料からなる膜厚１０ｎｍ〜１００ｎｍの不撓性膜を有するものであることが望ましい。この場合、不撓性膜は、ポリマー材料から構成されるものであることが望ましい。ここで、本発明において「不撓性」とは、検出装置を普通に使用しているうちに膜厚が変わってしまうほどに変形することが無い程度の剛性を意味するものとする。

上記微小開孔の径は、５ｎｍ〜２００ｎｍであることが望ましい。

また、微小開孔金属薄膜の開口率は、５％〜５０％であることが望ましい。

さらに、本発明による蛍光検出装置に使用される微小開孔金属薄膜の作製方法は、
静電荷を表面に有する基板を用意する工程（Ａ）と、
該基板が有する静電荷とは逆の静電荷を付与された微粒子を含む分散液を作成する工程（Ｂ）と、
前記基板を該分散液に浸漬して前記微粒子を該基板の表面に吸着させる工程（Ｃ）と、
前記微粒子が吸着した前記基板の表面を乾燥させる工程（Ｄ）と、
前記微粒子が吸着した前記基板の表面上に、作製すべき微小開孔金属薄膜の構成元素からなる金属材料を堆積させる工程（Ｅ）と、
粘着シートを前記基板の表面に吸着した前記微粒子の上から貼着し、次いで剥離することにより、前記微粒子を除去する工程（Ｆ）と
を有し、前記工程（Ａ）および（Ｂ）の実施後、前記工程（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）を順次実施することを特徴とするものである。

この場合、微粒子はポリマー微粒子であることが望ましい。そしてさらに工程（Ｃ）と工程（Ｄ）の間に、基板に吸着した微粒子を溶媒中にて加熱する工程（Ｇ）を有することが望ましい。また分散液は、水混和性有機溶媒を含むものであることが望ましい。ここで、「水混和性」とは、水と無制限に混じり合う性質のことを示す。そしてさらに、工程（Ｃ）と工程（Ｄ）の間に、微粒子が吸着した基板を、残留溶媒よりも表面張力の小さい有機溶媒に浸漬し、残留溶媒を有機溶媒に置換する工程（Ｈ）を有することが望ましい。この工程（Ｈ）は、工程（Ｇ）と組み合わせて実施することもできるが、この場合、必ず工程（Ｇ）、（Ｈ）の順に実施する。

なお、粘着シートの粘着力は、０．１Ｎ／ｃｍ〜５Ｎ／ｃｍであることが望ましい。

本発明による蛍光検出装置によれば、微小開孔金属薄膜を用いているため、プリズム光学系を使わずとも基板と微小開孔金属薄膜の界面に向けて励起光が基板を通して入射されれば、近接場光を生じさせることが可能である。よって、基板に特殊な形状加工を施す必要が無く単純形状のもの、例えば平板状のもの等が随意に適用可能となり、同時に光学系も簡素化される。

また、上記のように生じた近接場光および／または近接場光により微小開孔金属薄膜に誘起される表面プラズモンによって、その電場増強効果により蛍光強度が増幅される。

そして近接場光は、基板と試料との界面から数百ｎｍ程度の領域にしか到達しないため、試料中の不純物からの散乱や意図しない浮遊蛍光標識からの発光等の影響を皆無とすることができる。それに加えて、励起光そのものや基板中の不純物等で散乱した光（これは通常の伝搬光である）は、微小開孔金属薄膜の微小開孔を通過することができないため、微小開孔を有しない金属薄膜で遮断される場合と同様な効果により光検出器に到達できない。これらにより、光ノイズを皆無にまでに低減することができる。これにより、蛍光法において簡易な光学系を用いてＳ／Ｎ比の向上を可能にし、安価に高感度検出を行うことを可能にすることができる。

さらに、本発明による微小開孔金属薄膜の作製方法によれば、浸漬吸着法において、微粒子および基板に相補的な静電気力を持たせることにより、微粒子同士を反発させ、微粒子と基板の相互作用を高めることが可能となる。これにより、微粒子の凝集を防ぎ、かつ乾燥時に生じるキャピラリーフォース（毛管力）に対抗することができ、均一な分散を実現することが可能となる。

また、粘着シートを基板の表面に吸着した微粒子の上から貼着した場合には、微粒子が基板上に密に分散し吸着しているため、粘着シートの粘着層は微粒子上部の薄膜にのみ貼着する。これにより、次いでこの粘着シートを剥離することで、微粒子周辺の薄膜すなわち微小開孔金属薄膜の構造を破壊することなく微粒子を除去することが可能となる。

以上により、安定かつ密着性の良い薄膜の作製と良質かつ均一性の良い微小開孔の作製との両立を可能とすることができる。

以下、本発明による実施形態について図面を用いて説明するが、本発明はこれに限られるものではない。

「蛍光検出装置」
＜第１の実施形態＞
図１は、被検出物質としての抗原２を含む試料１から、抗原抗体反応を利用して抗原２を検出する場合に用いる、本実施形態による蛍光検出装置を示す概略側面図である。図示の通り、この蛍光検出装置は、所定波長の励起光９を発する光源８と、この励起光９を片面から透過させるように配された、励起光９を透過させる材料からなる平板状の基板６と、この基板６の他面に成膜された、径が励起光９の波長以下である微小開孔２４ａを有する微小開孔金属薄膜２４と、微小開孔２４ａを覆うように微小開孔金属薄膜２４上に形成された不撓性膜２５と、不撓性膜２５に試料１が接するように、試料１を保持する試料保持部７と、試料保持部７の外側から試料１中の蛍光標識５の発光を検出可能な位置に配された光検出器１０とを備えてなるものである。そして、図中に、蛍光標識５と、この蛍光標識５に標識され抗原２に対する特異的結合性を有する二次抗体４も同時に示している。

励起光９は、例えばレーザ光源等から得られる単波長光でも白色光源等から得られるブロード光でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。

光源８は、例えばレーザ光源等でもよく、特に制限はないが、検出条件に応じて適宜選択することができる。また必要に応じて、光源８は、励起光９を基板６と微小開孔金属薄膜２４の界面２４ｂに向けて、任意の方向から基板６を通して照射するために、光源８の可動手段、および励起光９を導光するための簡易的なミラーやレンズ等の導光系等を適宜組み合わせることができる。

基板６は、例えば透明樹脂やガラス等の透明材料から形成されたものである。基板６は樹脂から形成することが望ましく、この場合は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることがより望ましい。

微小開孔金属薄膜２４は、その薄膜材料として特に制限はなく、検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点からＡｕ、Ａｇ、Ｐｔ等を用いることが望ましい。一方その膜厚も、特に制限はなく検出条件に応じて適宜選択することができるが、表面プラズモンの発生条件等の観点から２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲にあることが望ましい。微小開孔金属薄膜２４の作製方法は、特に制限はなく検出条件や使用する材料に応じて適宜選択することができるが、安定かつ密着性の良い薄膜の作製と良質かつ均一性の良い微小開孔の作製との両立を実現するため、後述する本発明による微小開孔金属薄膜の作製方法を用いることが望ましい。この場合、基板の上に付着させた微粒子をマスクとして微小開孔金属薄膜を作製するため、微粒子の径や分散液中の微粒子濃度を調節することにより、基板の大きさに制限されず微小開孔の径および開口率を自由に制御することを可能とする。微小開孔２４aの径は、５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲にあることが望ましい。この場合は、染み出しによる近接場光を効果的に発生させると同時に、検出を行う抗体やタンパクなどの生物試料サイズが数ｎｍ〜数十ｎｍであることから、これらを効率的かつ確実に微小開孔２４ａに補足できるという効果が期待できる。また、蛍光強度を稼ぐ観点からでは、微小開孔金属薄膜２４の開口率はある程度大きい方が望ましい。しかしながら、開口率５０％を超える微小開孔金属薄膜２４は、安定かつ密着性の良い薄膜の作製と良質かつ均一性の良い微小開孔の作製との両立が困難となる場合があるため、微小開孔金属薄膜２４の開口率の上限を５０％にするのが望ましい。

不撓性膜２５は、その薄膜材料として、例えばシリコン酸化膜やポリマー材料等を用いる事ができる。この場合、特に成膜条件や表面処理条件等の観点からポリマー材料が望ましい。例えばこの場合、スピンコート等の簡便な方法により作成することができる。また、本発明のように不撓性膜２１が疎水性材料から形成されている場合には、試料液中に存在する金属イオンや溶存酸素のような消光の原因となる因子が不撓性膜の内部にまで入り込むことが無く、これらの消光因子によって蛍光標識の励起エネルギーが奪われることが防止される。

不撓性膜２５の具体的な材料は、基板６に用いられている材料と比して線（熱）膨張係数の差が３５×１０^−６以内にあるものを選択することが望ましく、例えば表１に挙げたものの中から適宜選択することができる。

ここで、上記のように線（熱）膨張係数の差を３５×１０^−６以内と規定したのは以下の理由による。

環境、特に温度の変動に対する安定性を高める上では、不撓性膜２５と基板６は互いに熱膨張係数が近い方が望ましい。つまり、それら両者の熱膨張係数が大きくかけ離れていると、温度変動が生じた際に両者の剥離や密着度の低下等の問題を招きやすい。具体的には、それら両者の線（熱）膨張係数の差が３５×１０^−６以内の範囲にあることが望ましい。なお、不撓性膜２５と基板６との間には微小開孔金属薄膜２４が存在しているが、この微小開孔金属薄膜２４は温度変動が有ったとき、上下の不撓性膜２５と基板６に追随して伸縮するので、結局、不撓性膜２５と基板６の熱膨張係数が近い方が望ましいことに変わりは無い。以上の点を考慮すると、不撓性膜２５をポリマー材料から形成する場合、基板６の材料としても一般にはガラスより樹脂を選択する方がより望ましいと言える。

一方、不撓性膜２５の膜厚は１０ｎｍ〜１００ｎｍとする。上記膜厚の下限値および上限値をそれぞれ１０ｎｍ、１００ｎｍと規定したのは、以下の理由による。金属の近傍に存在する蛍光体は、金属へのエネルギー移動により消光を起こす。エネルギー移動の程度は、金属が半無限の厚さを持つ平面なら距離の３乗に反比例して、金属が無限に薄い平板なら距離の４乗に反比例して、また、金属が微粒子なら距離の６乗に反比例して小さくなる。そして、金属薄膜の場合は、金属と蛍光体との間の距離は少なくとも 数ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上確保しておくことが望ましい。それにより、本発明では薄膜の下限値を１０ｎｍとする。一方、蛍光体は主に、表面プラズモンによって増強された、金属薄膜表面に染み出した近接場光によって励起される。近接場光の到達範囲（金属薄膜表面からの距離）は高々波長程度であり、その電界強度は金属薄膜表面からの距離に応じて指数関数的に急激に減衰することが知られている。実際に、波長６３５ｎｍの可視光について両者の関係を計算によって求めると、近接場光の染み出しが生じているのは波長（６３５ｎｍ）程度であり、１００ｎｍを超えるとその電界強度が急激に減衰する。蛍光体を励起する電界強度は大きいほど望ましいので、効果的な励起を行なうためには、金属薄膜表面と蛍光体との距離を１００ｎｍより小さくすることが望ましい。それにより、本発明では薄膜の上限値を１００ｎｍとする。

なお、ポリマーからなる不撓性膜２５を用いた場合、被検出物質２がタンパク等であれば容易に非特異的吸着しやすくなっている。これは、ポリマーとタンパク等が疎水性を有することに起因する疎水性効果による。この場合、非特異的吸着したタンパク等が蛍光検出を行う上で定量性を損なう要因となってしまうため、不撓性膜２５の表面に親水性表面修飾を施すことが望ましい。さらに、この表面修飾は上記のような機能の他に、特異的結合物質を固定するリンカーとしての機能も持たせることができる。

光検出器１０は、蛍光標識５が発する特定波長の微弱な蛍光を定量的に検出するもので、例えば富士フイルム株式会社製 LAS-1000 plus（商品名）を好適に用いることができるが、これに限らず検出条件に応じて適宜選択することができ、ＣＣＤ、ＰＤ（フォトダイオード）、光電子増倍管、ｃ−ＭＯＳ等を用いることができる。

蛍光標識５は、励起光９によって励起されて所定波長の蛍光を発するものであり、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、励起光９の波長が６５０ｎｍの場合、Ｃｙ５色素等を用いることができる。この場合、蛍光標識５をモノクロナール抗体等（二次抗体４）に修飾することにより、抗原抗体反応を用いて、蛍光標識５を抗原２と特異的に結合可能にすることができる。

以下、上記蛍光検出装置の作用について説明する。

試料保持部７の中に蛍光標識５に標識された試料１が供給され（図２ａ）、その後励起光９が、基板６と微小開孔金属薄膜２４の界面２４ｂに向けて微小開孔金属薄膜２４に対して垂直方向から照射される。このとき、微小開孔金属薄膜２４の微小開孔２４ａに近接場光２３が染み出すようになる。この近接場光２３により、微小開孔２４ａの直近に存在する蛍光標識５は励起される。さらに、この近接場光２３に誘起されて、微小開孔２４ａ付近の微小開孔金属薄膜２４の表面にはプラズモンが発生するため、このプラズモンによる電場増強効果によりこの近接場光２３の強度が増強される（図中２３’）。この電場増強された近接場光２３’により、近接場光２３に励起されない蛍光標識５も励起されることとなる。励起された蛍光標識５は所定波長の蛍光を発し、この蛍光検出によって抗原２の検出を行うことができる（図２ｂ）。

ここで、以上の例では、蛍光検出によって実際に存在が確認されるのは蛍光標識５であるが、基本的に前処理によって、この蛍光標識５には抗原２が結合しているものと考えて、この蛍光標識５の存在を確認することにより、間接的に抗原２の存在を確認している。

上記のように本発明による蛍光検出装置は、微小開孔金属薄膜２４を使用することで、微小開孔２４ａで生じた近接場光２３によってその表面にプラズモンを誘起し、このプラズモンの電場増強効果により近接場光２３’を発生させ、蛍光標識５から発せられる蛍光の強度を増強することが可能となる。この電場増強効果により増強された蛍光強度は、金属材料を用いない微小開孔薄膜すなわち近接場光のみを利用した場合に比べ、およそ２桁増強する。

さらに、基板６中の不純物９１等で散乱した光（通常の伝搬光）は、微小開孔２４ａを通過することができないので、微小開孔金属薄膜２４で遮断され、光検出器１０に到達することがない。以上により、本発明による蛍光検出装置は、蛍光強度を大幅に増幅して光ノイズを殆ど皆無にまで低減することができるため、極めて高い感度による蛍光検出を可能とする。

また、励起光９を界面２４ｂで全反射させる必要がないため、基板６に特殊な形状加工を施す必要が無く単純形状のもの、例えば平板状のもの等が随意に適用可能となり、同時に光学系の簡素化も可能となり、蛍光検出装置を安価に提供することを可能とする。

さらに、本実施形態による蛍光検出装置は、不撓性膜２５を設けることによって、試料１中の蛍光標識５が微小開孔金属薄膜２４に対して金属消光が起きる程度にまで接近することを防ぐことができるため、励起した蛍光標識５を効率よく発光へ導き、高い感度による蛍光検出を可能とする。

なお、近接場光２３・２３’は、界面２４ｂから数百ｎｍ程度の領域にしか到達しないため、本実施形態においては、実際にこの近接場光２３・２３’により励起される蛍光標識５の割合は少ないと考えられる。これは、蛍光標識５と抗原２との対が試料１中をブラウン運動し均一に分散しているため、近接場光２３・２３’の微小な到達距離ではこれらを捕らえることに限界があるためである。この問題を解決するのが、次に挙げる第２の実施形態である。

＜第２の実施形態＞
図３は、被検出物質としての抗原２を含む試料１から、抗原抗体反応を利用して抗原２を検出する場合に用いる、本実施形態による蛍光検出装置を示す概略側面図である。本実施形態において使用する蛍光検出装置は、図１に示す第１の実施形態で説明した蛍光検出装置において、不撓性膜２５上に施された親水性表面修飾（図省略）とこの表面修飾に固定された特異的結合物質としての一次抗体３を追加したものである。その他の構成は、第１の実施形態の場合と同様であり、図１に示す第１の実施形態と同等の要素についての説明は、特に必要のない限り省略する。

一次抗体３は、特に制限なく、検出条件（特に被検出物質）に応じて適宜選択することができる。例えば、抗原２がＣＲＰ抗原（分子量１１万 Ｄａ）の場合、この抗原２と特異的に結合するモノクロナール抗体等を用いることができ、例えば末端をカルボキシル基化したＰＥＧを介して、アミンカップリング法により、ポリマーからなる場合の不撓性膜２５に固定することができる。これにより、抗原抗体反応を用いて、抗原２を特異的に結合し検出部に固定することができる。上記アミンカップリング法は一例として下記（１）〜（３）のステップからなるものである。なおこれは、３０ｕｌ（マイクロ・リットル）のキュベット／セルを用いた場合の例である。

（１）リンカー部先端（末端）の−ＣＯＯＨ基を活性化
０．１ＭのＮＨＳと０．４ＭのＥＤＣとを等体積混合した溶液を３０ｕｌ加え、３０分間室温静置する。

NHS:N-hydrooxysuccinimide
EDC：1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
（２）一次抗体の固定化
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、一次抗体溶液（５００ｕｇ／ｍｌ）を３０ｕｌ加え、３０〜６０分間室温静置する。

（３）未反応の−ＣＯＯＨ基をブロッキング
ＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）を３０ｕｌ加え、２０分間室温静置する。さらにＰＢＳバッフア（ｐＨ７．４）で５回洗浄する。

以下、上記蛍光検出装置の作用について説明する。

不撓性膜２５上には、抗原２と特異的に結合する一次抗体３が固定化されている。そして試料保持部７の中において試料１が流され（図４ａ）、試料１中の抗原２は一次抗体３に結合し固定される（図４ｂ）。次いで同様に、抗原２と特異的に結合し一次抗体３とは少なくともエピトープが異なる二次抗体４で修飾された蛍光標識５が流され（図４ｃ）、先ほどの一次抗体３に固定された抗原２に結合し固定される（サンドイッチ方式、図４ｄ）。

その後、第１の実施形態と同様に、励起光９が入射され、近接場光２３・２３’が生じて、蛍光標識５が励起発光する（図４ｅ）。この蛍光検出によって抗原２の検出を行うことができるため、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。

さらに、上記近接場光２３・２３’は界面２４ｂから数百ｎｍ程度の領域にしか到達しないため蛍光量を稼げないという課題も本実施形態では解決できる。つまり、本実施形態のように、上記一次抗体３を用いて蛍光標識５と抗原２の対を検出部に集約させることにより、近接場光２３・２３’により励起される蛍光標識５の量を増やすことが可能である。これにより、多くの蛍光量を得ることができ、結果としてより定量性の高い蛍光検出が可能となる。この場合、近接場光２３・２３’の微小な到達距離は、試料中の不純物９０からの散乱や意図しない浮遊蛍光標識５’からの発光等の影響を低減する観点からも、さらなるＳ／Ｎ比の向上に有用である。

また、一般的に不撓性膜２５がポリマー材料からなる場合、試料１中に含まれる抗原２（特にタンパク等）が容易に非特異的吸着するようになるため、本実施形態のような場合、特異的吸着によって固定された抗原２と非特異的吸着によって固定された抗原２の区別ができず、それが誤検出を招くことになる。しかしながら、本発明による蛍光検出装置において特にポリマー材料からなる不撓性膜２５が適用される場合、不撓性膜２５の表面上に親水性表面修飾を施しているため、上記タンパク等の不撓性膜２５への非特異的吸着を防ぎ上述のような誤検出が防止される。

なお、上記第１および第２の実施形態において、励起光９の照射方向を微小開孔金属薄膜２４に対して垂直方向からと設定したが、これに限られるものではない。これは上述したように、本発明による蛍光検出装置は、微小開孔金属薄膜２４を用いているため、基板６と微小開孔金属薄膜２４の界面２４ｂに向けて基板６を通れば、励起光９は任意の方向から入射されても、微小開孔２４ａに近接場光が発生するためである。また、抗原抗体反応を用いて説明してきたが、本発明はこれに限られるものではなく、他の特異的結合性を利用した反応を用いても本発明の課題を解決することができる。

「微小開孔金属薄膜の作製方法」
次に、本発明の一実施形態による微小開孔金属薄膜の作製方法について説明する。

本実施形態による微小開孔金属薄膜の作製方法は、
静電荷を表面に有する基板３６を用意する工程（Ａ）（図５）と、基板３６が有する静電荷とは逆の静電荷を付与されたポリマー微粒子３０を用意し、このポリマー微粒子３０と水混和性有機溶媒３２を含む分散液３１を作成する工程（Ｂ）（図６）と、基板３６を分散液３１に浸漬し、ポリマー微粒子３０を基板３６の表面に吸着させ、リンス溶媒にて液中リンスする工程（Ｃ）（図７）と、ポリマー微粒子３０が吸着した基板３６を、残留溶媒３３（この場合、リンス溶媒）よりも表面張力の小さい有機溶媒３５に浸漬し、残留溶媒３３を有機溶媒３５に置換する工程（Ｈ）（図８）と、ポリマー微粒子３０が吸着した基板３６の表面に残る残留溶媒３３’（この場合、置換に用いた有機溶媒３５）を乾燥させる工程（Ｄ）（図９）と、ポリマー微粒子３０が吸着した基板３６の表面上に、作製すべき微小開孔金属薄膜３４の構成元素からなる材料を堆積させる工程（Ｅ）（図１０）と、粘着シート４２を基板３６の表面に吸着したポリマー微粒子３０の上から貼着し、次いで剥離することにより、ポリマー微粒子３０を除去する工程（Ｆ）（図１１）とを順次実施するものである。

＜工程（Ａ）＞
基板３６は、本発明においては透明材料からなりその表面に静電荷を持っていれば特に制限なく、例えばガラスや、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）フィルムおよびポリカーボネート等のプラスティックフィルムを適宜選択することができる。基板３６自身が、その表面に静電荷を持っていない、或いは持っていても電荷量が充分でない場合は、基板３６の表面修飾によってこれを補うことができる。

基板３６表面の親疎水性、静電荷、凹凸等はポリマー微粒子３０の吸着に影響を与えるので、これらを制御することが望ましい。基板３６表面の処理は、これらの性質も考慮し適宜選択し行うことが望ましい。望ましい前処理方法としては、ＵＶオゾン処理、表面修飾剤（例えば、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）（ＰＤＤＡ）、ポリ（スチレンスルホン酸ナトリウム）、ポリ（３，４−オキシエチレンオキシチオフェン））による表面修飾などが挙げられる。

＜工程（Ｂ）＞
本工程により、ポリマー微粒子３０を分散液３１中に分散させる。さらに、この分散液３１に一定の割合で水混和性有機溶媒３２を加え、室温で１時間撹拌し、ポリマー微粒子３０に水混和性有機溶媒３２を含浸させ膨潤させる（図６）。

微粒子の材質は特に制限されないが、表面に静電荷を持つ、または容易に付与することができるものがよく、これらの条件を満たすものとしてポリマー微粒子３０が望ましい。ポリマー微粒子３０として、例えば、ポリスチレン微粒子、ポリメタクリル酸メチル微粒子、ポリメタクリル酸ベンジル微粒子などがあげられ、粒径が単分散で表面官能基の自由度が高く、入手も容易なことから、ポリスチレン微粒子がより望ましい。基板３６との静電的相互作用を利用するため、ポリマー微粒子３０は基板３６が有している静電荷とは逆の静電荷を持っている必要があり、仮にそうでない場合、ポリマー微粒子３０の表面処理法によって制御することができる。ポリマー微粒子３０の形状や表面処理方法は、特に制限なく適宜選択することができるが、微小開孔金属薄膜３４の形成後にポリマー微粒子３０を除去することにも適した形状、表面処理法を選択することがより望ましい。ポリマー微粒子３０の形状は球状、楕円球状、多面体等が望ましく、球状がより望ましい。ポリマー微粒子３０の表面修飾としては、微粒子のコアシェル化、化学修飾、プラズマ処理、界面活性剤の添加、置換基（例えば、カルボキシル基、トリアルキルアンモニウム基、アミノ基、水酸基、スルホン酸基）の付加などが望ましい。さらに、微小開孔金属薄膜３４に形成される微小開孔３４ａの径は、ポリマー微粒子３０の粒径（本発明において、粒径とは微粒子の投影面積と等価な円の直径をいう）によって制御できるので、所望の設計に適したサイズの粒子を選択することが望ましく、本発明において粒径は、５ｎｍ〜２００ｎｍが望ましい。ポリマー微粒子３０の粒径分布に特に制限はないが、単分散であることが望ましい。

分散液３１は、ポリマー微粒子３０と基板３６の静電的相互作用を妨げず、処理プロセス中、ポリマー微粒子３０を安定して分散させることができる溶媒が望ましい。分散液３１は、水でも有機溶媒でもよいが、分散液３１の調製の容易さや、静電的相互作用を強く働かせるという観点からは水が望ましい。ポリマー微粒子３０の分散性を良くするため適当な界面活性剤を添加してもよい。ポリマー微粒子３０の分散濃度は、ポリマー微粒子３０または基板３６の性質、意図するポリマー微粒子３０の設置密度によって適宜制御することができ、望ましくは０．０１質量％〜１０質量％であり、０．１質量％〜１質量％がより望ましい。

水混和性有機溶媒３２は、ポリマー微粒子３０を効果的に膨潤軟化させるためのものである。水混和性有機溶媒３２は、ポリマー微粒子３０を構成するポリマーと馴染むものであることが望ましい。ポリマーと有機溶媒の親和性の指標の一つとしてＳＰ値（溶解度パラメーター）が挙げられ、使用するポリマーに対してＳＰ値の差が小さくなるように水混和性有機溶媒３２を適宜選択することができる。例えば、ポリスチレン微粒子を用いた場合、アセトン等を用いることができる。この方法を用いた場合、必ずしも工程（Ｇ）は必要ではない。

＜工程（Ｃ）＞
本工程により、ポリマー微粒子３０を基板３６に分散させ吸着させる（図７）。さらに、リンス溶媒にて液中リンスすることにより、基板３６上の余分なポリマー微粒子３０を洗い流す。

ポリマー微粒子３０の基板３６への分散方法は、バーコート法、スキージ塗布法、スピンコート法、インクジェット法、スプレー法、浸漬吸着法などを用いることができるが、均一で良質な微小開孔３４ａを有する微小開孔金属薄膜３４を形成する観点から、浸漬吸着法を用いるのが望ましい。浸漬吸着法とは、微粒子を分散した分散液中に基板を浸漬し、基板と粒子の相互作用により、微粒子を基板に吸着させる方法である。

ポリマー微粒子３０の吸着において、残留溶媒３３乾燥時のキャピラリーフォースに対向するため、基板３６との密着性を充分に高めることが望ましい。そこで本実施形態において、ポリマー微粒子３０と基板３６との静電的な相互作用を利用することにより、密着性を高めている。また、ポリマー微粒子３０に水混和性有機溶媒３２を含浸させ、ポリマー微粒子３０を膨潤させたことにより、ポリマー微粒子３０と基板３６との吸着面積が増加し、より密着性を高めている。ただし、この方法では、基板３６にポリマー微粒子３０が吸着する時点で、ポリマー微粒子３０が膨潤して粒径が増大しているため、基板３６上の粒子密度は水混和性有機溶媒３２を含浸させない場合に比べて低下するため、これを考慮しておく必要がある。

ポリマー微粒子３０を吸着させ分散液３１から引き上げた後に、基板３６上の余分なポリマー微粒子３０をリンス溶媒にて液中リンスすることが望ましい。この処理をしない場合、ポリマー微粒子３０が単粒子層にならず、ポリマー微粒子３０が積み重なった領域ができてしまうためである。リンス溶媒としては、水系溶媒（例えば、蒸留水、超純水、イオン交換水など）、有機溶媒（例えば、アルコール、アセトンなど）、またはそれらの混合液が望ましく用いられ、取り扱い性や工業性の点からは、水系溶媒がより望ましい。

＜工程（Ｈ）＞
本工程により、ポリマー微粒子３０が吸着した基板３６の表面に残留する残留溶媒３３（本実施形態においては、リンス溶媒）を、残留溶媒３３よりも表面張力の小さい有機溶媒３５に浸漬し、残留溶媒３３を有機溶媒３５に置換する（図８）。

分散液３１またはリンス溶媒から引き上げた微粒子吸着基板は、残留溶媒３３を有するため、これらを乾燥する際、微粒子の間には微小なメニスカスが形成され、微粒子間にキャピラリーフォース３７が働くことによって微粒子が凝集してしまう問題が生じる。そこで、残留溶媒３３を乾燥させる前に残留溶媒３３よりも表面張力の小さい有機溶媒３５に基板３６を浸漬し、基板３６表面の残留溶媒３３を有機溶媒３５によって置き換えることが望ましい。これにより、メニスカスを形成する媒体（残留溶媒３３）を表面張力の大きなものからより小さな有機溶媒３５に置換することで、二次的凝集の要因となるキャピラリーフォース３７自体を低減することが可能となる。これは、基板を大面積化した場合に特に有用であると考えられる。

置換に用いられる有機溶媒３５は、水と親和性のあるものが望ましい。また、微粒子を溶解させてしまうものは不適である。従って、例えばポリスチレン微粒子を用いた場合、ＭｅＯＨ等の極性の強いアルコール類などが望ましい。

一方、工程（Ｇ）と組み合わせて行う場合、工程（Ｈ）の前に以下の工程を実施する。なお、水混和性有機溶媒３５によりポリマー微粒子を軟化させた場合、必ずしも工程（Ｇ）は必要ではない。

（工程（Ｇ））
本工程により、ポリマー微粒子３０を加熱し軟化させる。

加熱する方法は、基板を劣化させず、設置した微粒子を適度に軟化できればどのような方法でもよいが、液中リンス時にリンス溶媒を加熱する方法、加熱した微粒子分散液中に基板を浸漬する方法、ホットプレートなどを用いて基板を直接加熱する方法などが望ましい。液中リンスによる加熱時間は適宜設定できるが、１秒〜１０分が望ましく、１０秒〜1分がより望ましい。加熱する温度は、微粒子が基板に固着するように、適度に軟化する温度が望ましく、用いられる微粒子によって適宜設定することができる。例えば、ポリマー微粒子３０を用いた場合、そのポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ）付近で加熱し軟化させることが望ましく、ガラス転移温度より３０℃高い温度以下、３０℃低い温度以上が望ましく、ガラス転移温度より１０℃高い温度以下、１０℃低い温度以上がより望ましい。さらに、加熱温度は、水系溶媒による液中リンスによる加熱、および有機半導体の製造を考慮すると、７０℃〜１００℃が望ましく、８０℃〜１００℃がより望ましい。加熱後は、凝集を確実に防ぐため、冷却することが望ましく、例えば、冷却水（例えば室温以下の水）でリンスすることが望ましい。

＜工程（Ｄ）＞
本工程により、残留溶媒３３の置換工程（Ｈ）を経て最終的に残こる残留溶媒３３’（本実施形態においては、有機溶媒３５）を乾燥する（図９）。

乾燥方法は、室温での自然乾燥、圧縮空気による送風乾燥、減圧乾燥、昇温、およびこれらの組み合わせなどを用いることでき、特に制限はない。例えば、工程（Ｈ）でＭｅＯＨを用いた場合、圧縮空気で余分なＭｅＯＨを取り除き、その後室温で減圧乾燥を３時間行う、等の方法を用いることができる。

＜工程（Ｅ）＞
本工程により、作製すべき微小開孔金属薄膜３４の構成元素からなる材料を堆積する（図１０）。

薄膜堆積方法は、例えば、スパッタリング法、蒸着法、めっき法、金属コロイドを用いた塗布法やスプレー法などの各種の薄膜作製方法によって形成することができ、これらの方法は使用する材料に応じて適宜選択することができる。本発明による蛍光検出装置において微小開孔金属薄膜２４の厚さは、励起光の遮断および表面プラズモンの発生条件等の観点から、材料ごとに設定することができ、２０ｎｍ〜６０ｎｍが望ましい。ただし、設置した微粒子を除去する観点から、微小開孔を形成する薄膜の厚さは、粒径と同等以下が望ましく粒径の１／２以下がより望ましい。なお、薄膜の堆積を複数回繰り返すことにより、多積層膜への応用も可能である。

＜工程（Ｆ）＞
本工程により、ポリマー微粒子３０を除去し、薄膜中に微小開孔３４ａを形成する（図１１）。

基板に設置した微粒子の除去方法は、例えば液中超音波処理による除去などが挙げられる。しかし、この方法では基板中央部の微粒子は除去されにくい。また、薄膜の膜厚が増すとさらに微粒子が除去されにくくなるため、薄膜の膜厚が十分薄いときのみに有効である。膜厚が厚い場合においても、長時間の超音波照射により微粒子の除去を行うことも可能であるが、堆積した金属薄膜が破壊されてしまうため望ましくない。従って、これらの問題を解消する方法として、粘着シートにより微粒子を除去するのが望ましい。（特開２００５−７９３５２号公報、特開２００７−８７９７４号公報、特開２００７−８７９７６号公報）
ポリマー微粒子３０および／またはその上の金属薄膜３４に接するように、支持体４０と粘着層４１から構成される粘着シート４２を貼り付け（図１１ｂ）、これを剥がす（図１１ｃ）ことにより、ポリマー微粒子３０がその上の薄膜ごと粘着層４１に粘着し除去される。本方法においては、ポリマー微粒子３０が基板上に密に設置されているため、粘着シート４２は微粒子の上部にのみ粘着し基板３６上のポリマー微粒子３０周辺の金属薄膜３４とは粘着せず、良質な微小開孔３４ａを有する微小開孔金属薄膜３４を容易に作製することができる。

このような微粒子の除去に用いられる粘着シート４２は、微粒子の形状および粒径、金属薄膜の材質および膜厚などによって適宜選択することができ、特に制限されるものではない。これらの条件を満たせば、市販のものを用いることができる。微粒子のみを選択的均一的に除去するために、粘着面は平滑であることが望ましい。粘着面の平滑性は、目視において凹凸が認められないことが望ましい。また、支持体４０にエンボス加工等を施してあったり、クレープ紙等の支持体４０自身が凹凸を有する場合、粘着層４１もその凹凸を反映するため、支持体４０も目視において凹凸が認められないことが望ましい。また、微粒子上の薄膜材料に対して適度な粘着力を有することが望ましく、例えば、粘着力を示すＪＩＳ Ｚ−０２３７の値において、０．１Ｎ／ｃｍ〜５Ｎ／ｃｍが望ましく、０．３Ｎ／ｃｍ〜３Ｎ／ｃｍがより望ましい。

支持体４０を構成する材料は特に制限されないが、ポリ塩化ビニル系フィルム、ポリエステル系フィルム、ポリオレフェン系白色フィルム、アセテートフィルム、およびこれらのコポリマーやブレンドポリマーなどが挙げられる。粘着層４１に用いられる材料は、適度な粘着力があり薄膜上を汚染しなければ特に制限されないが、ゴム系粘着剤、アクリル系粘着剤、ウレタン系粘着剤等が挙げられる。粘着シート４２の厚さは、柔軟性（例えば、伸びなど）や強度（例えば、引張強度など）に応じて選択することができ特に制限されないが、１０ｕｍ〜１ｍｍが望ましく、５０ｕｍ〜３００ｕｍがより好ましい。

また、貼り付け、剥離時に基板３６表面をイオン性化合物等の有害物質や微粒子で汚染しないことが望ましく、総合的に好ましい粘着シート４２として、例えば、シリコン半導体のバックグラインディング時に用いる保護フィルム等が挙げられる。（特開２００４−９１５６３号公報参照）
粘着シート４２の貼り付けは、貼り付け時に気泡を巻き込むことを避けるのが望ましい。また剥離する方法は、微粒子を確実に除去し、堆積した薄膜を損傷しない方法が望ましく、例えば、緩やかな速度で目視により確認しながら剥離を行っても良い。さらに貼り付けおよび剥離時における、圧着する圧力、圧着および剥離する速度、剥離時の基板とシートの角度（例えば、１８０°の方向へ折り返して剥がす、または直角の方法へ折り曲げて剥がす）などを制御し、圧着器具（例えば、平滑な面を有するゴムローラー等、０．１ｋｇ〜５ｋｇ程度の適当な重さを有するものが望ましい）なども適宜選択できる。

また、粘着シート４２の支持体面をローラーに巻きつけたものや、ローラーの表面が粘着性を有しているものを用いても良い。

以上により、本発明による微小開孔金属薄膜の作製方法を用いて、安定かつ密着性の良い薄膜の作製と良質かつ均一性の良い微小開孔の作製との両立が可能となる。さらに、上記方法を用いて、微小開孔金属薄膜を蛍光法へ応用することにより、簡易的光学系を用いた安価で高感度検出を可能とする蛍光検出装置の実現が可能となる。なお、上記微小開孔金属薄膜の作製方法は、薄膜材料として金属を用いているが、金属材料以外のもの、例えば、半導体材料、誘電体材料、ポリマー材料等を用いることもできる。

第１の実施形態における蛍光検出装置を概略的に示す部分断面図 第１の実施形態における蛍光検出工程を概略的に示す部分断面図 第２の実施形態における蛍光検出装置を概略的に示す部分断面図 第２の実施形態における蛍光検出工程を概略的に示す部分断面図 工程（Ａ）の一例を概略的に示す部分断面図 工程（Ｂ）の一例を概略的に示す部分断面図 工程（Ｃ）の一例を概略的に示す部分断面図 工程（Ｈ）の一例を概略的に示す部分断面図 工程（Ｄ）の一例を概略的に示す部分断面図 工程（Ｅ）の一例を概略的に示す部分断面図 工程（Ｆ）の一例を概略的に示す部分断面図

符号の説明

１ 試料
２ 抗原
３ 検出部の表面修飾
４ 蛍光標識に施された修飾 （２次抗体など）
５、５’ 蛍光標識
６ 透明基板
７ 試料保持部
８ 光源
９ 励起光
１０ 光検出器
２３、２３’ 近接場光
２４ 金属薄膜
２４ａ、３４ａ 微小開孔
３０ 微粒子
３１ 分散液
３２ 水混和性有機溶媒
３３、３３’ 残留溶媒
３４ 薄膜
３６ 基板
３７ キャピラリーフォース
４０ 支持体
４１ 粘着層
４２ 粘着シート
９０ 試料中の不純物
９１ 基板中の不純物

Claims (12)

1. 励起光を発する光源と、
   該励起光を受ける位置に配された、該励起光を透過させる材料からなる基板と、
   該基板の前記励起光入射面とは異なる一面に形成された、径が前記励起光の波長以下である微小開孔を有する微小開孔金属薄膜を含む検出部と、
   該検出部に、蛍光標識にて標識された被検出物質を含む試料を接触させるように供給する試料供給手段と、
   前記蛍光標識からの蛍光を検出する位置に配された光検出器と
   を備えてなり、
   前記検出部における前記基板と前記微小開孔金属薄膜の界面に対して、前記基板を通し入射された前記励起光により、前記微小開孔において発生せしめられた近接場光および／または該近接場光により前記微小開孔金属薄膜に誘起された表面プラズモンによって、前記蛍光標識を励起し、該蛍光標識から発せられる蛍光を検出するように構成されていることを特徴とする蛍光検出装置。
2. 励起光を発する光源と、
   該励起光を受ける位置に配された、該励起光を透過させる材料からなる基板と、
   該基板の前記励起光入射面とは異なる一面に形成された、径が前記励起光の波長以下である微小開孔を有する微小開孔金属薄膜を含む検出部と、
   該検出部表面に固定された特異的結合物質と、
   前記検出部に、蛍光標識と被検出物質を含む試料を接触させるように供給する試料供給手段と、
   前記蛍光標識からの蛍光を検出する位置に配された光検出器と
   を備えてなり、
   前記検出部における前記基板と前記微小開孔金属薄膜の界面に対して、前記基板を通し入射された前記励起光により、前記微小開孔において発生せしめられた近接場光および／または該近接場光により前記微小開孔金属薄膜に誘起された表面プラズモンによって、前記蛍光標識を励起し、該蛍光標識から発せられる蛍光を検出するように構成されていることを特徴とする蛍光検出装置。
3. 前記検出部が、前記微小開孔金属薄膜上に、疎水性材料からなる膜厚１０ｎｍ〜１００ｎｍの不撓性膜を含むものであることを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
4. 前記不撓性膜が、ポリマー材料から構成されるものであることを特徴とする請求項３に記載の蛍光検出装置。
5. 前記微小開孔の径が、５ｎｍ〜２００ｎｍであることを特徴とする請求項１から４いずれかに記載の蛍光検出装置。
6. 前記微小開孔金属薄膜の開口率が、５％〜５０％であることを特徴とする請求項１からは５に記載の蛍光検出装置。
7. 請求項１から６に記載の蛍光検出装置に使用される微小開孔金属薄膜の作製方法であって、
   静電荷を表面に有する基板を用意する工程（Ａ）と、
   該基板が有する静電荷とは逆の静電荷を付与された微粒子を含む分散液を作成する工程（Ｂ）と、
   前記基板を該分散液に浸漬して前記微粒子を該基板の表面に吸着させる工程（Ｃ）と、
   前記微粒子が吸着した前記基板の表面を乾燥させる工程（Ｄ）と、
   前記微粒子が吸着した前記基板の表面上に、作製すべき微小開孔金属薄膜の構成元素からなる金属材料を堆積させる工程（Ｅ）と、
   粘着シートを前記基板の表面に吸着した前記微粒子の上から貼着し、次いで剥離することにより、前記微粒子を除去する工程（Ｆ）と
   を有し、前記工程（Ａ）および（Ｂ）の実施後、前記工程（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）を順次実施することを特徴とする微小開孔金属薄膜の作製方法。
8. 前記微粒子が、ポリマー微粒子であることを特徴とする請求項７に記載の微小開孔金属薄膜の作製方法。
9. さらに、前記工程（Ｃ）と前記工程（Ｄ）の間に、前記基板に吸着した前記微粒子を溶媒中にて加熱する工程（Ｇ）を有することを特徴とする請求項７または８に記載の微小開孔金属薄膜の作製方法。
10. 前記分散液が、水混和性有機溶媒を含むものであることを特徴とする請求項７から９いずれかに記載の微小開孔金属薄膜の作製方法。
11. さらに、前記工程（Ｃ）と前記工程（Ｄ）の間に、前記微粒子が吸着した前記基板を、残留溶媒よりも表面張力の小さい有機溶媒に浸漬し、前記残留溶媒を前記有機溶媒に置換する工程（Ｈ）を有することを特徴とする請求項７から１０いずれかに記載の微小開孔金属薄膜の作製方法。
12. 前記粘着シートの粘着力が、０．１Ｎ／ｃｍ〜５Ｎ／ｃｍであることを特徴とする請求項７から１１いずれかに記載の微小開孔金属薄膜の作製方法。

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