JP5308055B2 - β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ - Google Patents

Description

本発明は、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼをコードするＤＮＡ、及び前記ＤＮＡを含有した組換えベクター、前記組換えベクターを含む形質転換体、及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの製造方法に関するものである。

従来から、カイコは、絹糸タンパク質を大量に産生する能力を有していることから、この優れたタンパク質合成能力を利用したヒト型タンパク質産生系として注目されている。

一方で、カイコを含む昆虫において産生されるタンパク質には、昆虫特有の糖鎖構造が付加されたものが多く含まれる。これは、糖鎖プロセシングがヒトのものとは異なるためである。そしてこの糖鎖プロセシングに関与する酵素の一つとして、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼがある。

このβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、昆虫培養細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来Ｓｆ−２１細胞）でその活性が検出され（非特許文献１）、ショウジョウバエではその存在が確認されている（非特許文献２）。また非特許文献１、２では、この酵素はゴルジ体に局在し、糖鎖プロセシング経路においてＭａｎα１，３−側鎖上のアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基特異的に作用することが開示されている。すなわち、この酵素が作用することによって、産生される糖タンパク質にはヒト型糖タンパク質の糖鎖に見られるような非還元末端へのガラクトース残基などの糖鎖伸長が形成されず、このように産生された糖タンパク質は、活性や安定性に問題が生じる可能性がある。

従って、カイコを利用してヒト型糖鎖を有する組換えタンパク質を産生する際には、非還元末端に糖鎖を付加させることが重要であり、そのためにはこの酵素の機能を積極的に抑制することが必要である。

このような問題に対して、例えば、哺乳類ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩを異種的に過剰発現させる方法（非特許文献３）や、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの阻害剤を添加する方法（特許文献１）などが種々提案されている。

Ａｌｔｍａｎｎ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎ ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ，ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｂｅｔａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５，２７０（２９）；１７３４４−９． Ｌｅｏｎａｒｄ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｆｕｓｅｄ ｌｏｂｅｓ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｓ ａｎ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｎ−ｇｌｙｃａｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００６，２８１（８）；４８６７−７５． Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ ｏｆ ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９） ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ １，２−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｉ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９６，６，１６５−１７５． 特開２００３−７０４６９

しかしながら、ヒト型糖タンパク質を量産するには上記した方法では未だ解決すべき課題が残されている。例えば、非特許文献３に開示されている哺乳類ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩを異種的に過剰発現させる方法では、昆虫培養細胞（Ｓｆ−９細胞）の内因性ヘキソサミニダーゼと競合するため、ほとんどのＮ型糖鎖では、ＧｌｃＮＡｃの付加が起こらず、ガラクトース残基などの糖鎖伸張が形成されない恐れがある。また、特許文献１で開示された方法では、対象とするＮ−アセチルヘキソサミニダーゼだけでなく、脱皮時に必要なヘキソサミニダーゼなど、翻訳後修飾に関わらない他のヘキソサミニダーゼも阻害してしまうため、カイコに悪影響を及ぼす可能性が高い。さらに、この方法で使用される阻害剤は非常に高価であり、且つ当該阻害剤の投与時期・投与方法・投与量などを常に制御しなくてはならないため、ヒト型タンパク質を量産する場合、現実的ではなかった。

この問題に対して、本発明者らは、ヒト型タンパク質を量産するためには、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを特異的にノックダウン或いはノックアウトすることが有効であると考えた。そのためには、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼをコードする遺伝子配列が必要である。

本発明は上述のような課題に鑑みてなされたものであり、カイコのβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含有した組換えベクター、前記組換えベクターを含む形質転換体、及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの製造方法を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、カイコから前記酵素をコードする遺伝子を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の第１の主要な観点によれば、カイコのβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。

本発明の別の一実施形態によれば、以下（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ；（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが提供される。

また、本発明の第２の主要な観点によれば、以下（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド；（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するポリペプチド、（ｄ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡにコードされるポリペプチドであり、且つβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。

本発明の第３の主要な観点によれば、前記ＤＮＡを有する組換えベクターが提供される。さらに、第４の主要な観点によれば、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞が提供される。さらに、本発明の第５の主要な観点によれば、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体が提供されるものである。さらに、本発明の第６の主要な観点によれば、前記形質転換体の子孫またはクローンである形質転換体が提供されるものである。

本発明の第７の観点によれば、鱗翅目のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを有する組換えベクターを作製する工程と、前記組換えベクターを宿主細胞に導入する工程とを有する形質転換体の製造方法が提供される。

さらに、本発明の第８の観点によれば、鱗翅目のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを有する組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞を培養する工程と、前記細胞またはその培養上清からβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを回収する工程とを有するβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの製造方法が提供される。

この発明の更なる特徴及び顕著な効果は次に記載する発明の最良の実施形態の項の記載から当業者にとって明らかになるものである。

上述したように本発明によれば、カイコβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質、前記タンパク質をコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含有した組換えベクター、前記組換えベクターを含む形質転換体、及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの製造方法が提供される。

まず、本明細書における用語を以下のように定義する。

本明細書における「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列」とは、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を失わない限り、その置換等されるアミノ酸数は限定されるものではない。例えば、３０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、特により好ましくは３個以下である。

また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、相同遺伝子をコードするＤＮＡを単離するために行うハイブリダイゼーション反応・洗浄条件を指し、このハイブリダイゼーション反応は、当業者にとって公知である方法に準じて行うことができる。

また、本明細書における「ヒト型糖タンパク質」とは、ガラクトースやシアル酸などの残基によって伸長した糖鎖を有するタンパク質であり、この糖鎖がヒトタンパク質糖鎖と同等の構造であるものをいう。

次に、本発明の一実施形態における構成要素について詳細に説明する。

まず、本発明者らは、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを得るために、ショウジョウバエで報告された新規のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであるＦＤＬ（ｆｕｓｅｄ ｌｏｂｅ遺伝子）のアミノ酸配列をソースとしてカイコデータベース（ＫＡＩＫＯＢＬＡＳＴ）検索を行い、相同性の高い候補ゲノム配列を得た。

この相同性の高い候補ゲノム配列の調製は、当業者にとって既知の手段を利用して行うことができる。例えば、カイコデータベース中のゲノムデータから推定されるアミノ酸配列をＦＤＬのアミノ酸配列と比較して、相同性が高いものを選抜する。または、既存のヘキソサミニダーゼ遺伝子の保存領域の配列を基にゲノムデータを検索し、相同性が高いものを選抜するなどの方法が挙げられる。

その後、前記候補ゲノム配列を基にカイコβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ塩基配列をクローニングした。このクローニング方法としては、当業者に既知である方法を利用することが可能であり、例えば、ＲＡＣＥ法、ｃＤＮＡライブラリからの候補配列をプローブとしたスクリーニングなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

さらに、クローニングした配列が、プロセシング経路に関与することを検証した。この方法としては、クローニングした配列の発現と基質特異性の詳細な検討、抗体による局在の検討、抗体を用いた活性吸収法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

このようにして得られたカイコβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、カイコの糖鎖プロセシング経路に関与する、Ｍａｎα１，３−側鎖上のアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を特異的に切断する酵素であり、本発明によって初めて見出されたものである。

本発明のカイコβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、Ｍａｎα１，３−側鎖上のＧｌｃＮＡｃ残基を特異的に欠失した形状の糖鎖を作製するために使用することができ、このような非還元末端がＧｌｃＮＡｃである２本鎖Ｎ型糖鎖からＭａｎα１，３−側鎖側のＧｌｃＮＡｃを削除した糖鎖は、糖鎖構造を解析する上での標準糖鎖として利用ができる。また、この特異的な活性により、マンノースに結合しているＧｌｃＮａｃが、α１，３側なのかα１，６側なのか、切断の有無により識別することが可能となる。

さらに、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、例えばアンチセンス法、リボザイム法、或いはｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉法などにおいて利用し、前記β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性の発現を抑制することができる。

具体的には、本発明のカイコβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を基にして、（ｉ）前記ＤＮＡの転写産物と相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ、（ｉｉ）前記ＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ、さらには（ｉｉｉ）前記ＤＮＡの転写産物を特異的に切断するＲＮＡｉ活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを設計・調製する。次に前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のＤＮＡのいずれかを有するベクターを、例えばカイコを含む昆虫培養細胞を用いる場合、ベクターをトランスフェクションすることにより、カイコを用いる場合、ベクターを用いて組換えバキュロウイルスを作製しカイコに感染させるなどの手法により、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの発現を抑制することができる。これにより、非還元末端に糖鎖伸長を有するヒト型糖鎖を付加したタンパク質を産生することが可能となる。

さらに、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを適切なベクターに挿入し、カイコのβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを産生するための組換えベクターを作製することができる。

本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ型、ＹＣｐ型等）、一過性発現用のプラスミド、トランスジェニック用の各種プラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターも用いることができる。例えば、宿主を昆虫細胞とした場合、バキュロウイルスを作製するためのｐＢＡＣ系やｐＢｌｕｅＢａｃなどのプラスミドベクターを利用し、宿主をカイコ（虫体）とした場合、バキュロウイルスを作製するためのｐＢＭ系やｐＭ系などのプラスミドベクターを利用することができる。

ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが利用される。本発明のＤＮＡは、そのＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーなどを連結することができる。例えば、本発明のベクターに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を連結させた場合、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとの融合タンパク質として発現させ、その有無を蛍光により確認するために利用することができる。また、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼと抗原性のあるエピトープとの融合タンパク質として発現させ、抗体で固定化するために利用することも可能である。

前記プロモーターとしては、宿主中で本発明のＤＮＡを発現できるものであればいずれを用いてもよく、例えば宿主が昆虫細胞の場合はＩＥ１プロモーター、バキュロウイルス発現系の場合はポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター、ＩＥ１プロモーターなど、哺乳類由来の細胞ではＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーターなどが挙げられる。

また、前記選択マーカーとしては、宿主の種類に応じて当業者によって適宜変更されるが、例えば、宿主が大腸菌の場合はカナマイシン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子などであり、バキュロウイルスを使用した場合、ポリヘドリン遺伝子など、カイコの場合は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子などが挙げられる。

本発明の形成転換体は、本発明の組換えベクターを本発明のＤＮＡが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されず、例えば、微生物、例えば大腸菌などの細菌、酵母などの真菌、バキュロウイルスなどのウイルス、コケ類や植物などが挙げられる。動物細胞、例えばカイコガ由来のＢｍＮ細胞やＳｆ−９、Ｓｆ−２１などの昆虫細胞、哺乳動物由来のＣＯＳ−１、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。

前記組換えベクターを宿主に導入する方法は、当業者においては公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームを用いる方法、遺伝子銃を用いる方法、マイクロインジェクションする方法などを用いることができる。なお、宿主が昆虫細胞やカイコを含む虫体である場合、前記組換えベクターを用いて作製されたバキュロウイルスを感染させる方法も利用することができる。

なお、このような形質転換細胞中に導入されたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼをコードするＤＮＡの存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、また前記形質転換体中のＤＮＡの塩基配列を解析することによって確認することができる。このような形質転換細胞からのＤＮＡ抽出方法は、公知の方法に従って実施することができる。

前記形質転換細胞の培養方法は、使用された宿主細胞に応じて当業者によって適宜選択されるものである。

本発明のカイコのβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質を精製する方法に特に限定はなく、当業者にとって公知なタンパク質の精製方法で実施することができる。例えば、本発明のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが本来有する機能を指標として、シリカゲル単体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担体などを用いたクロマトグラフィー、限界濾過、ゲル濾過、透析等を組み合わせることができる。さらに、ストレプタグ、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグなどの精製用タグを用いる方法も好ましい。

次に本発明の効果に関して、実施例を示して説明する。しかし、本発明は以下に記載された実施例に限定されるものではなく、様々な変更及び修飾は当業者によってその点になされることが理解されるであろう。

（実施例）
実施例に記載の操作のうち、プラスミド調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ発行、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．に記載の方法に従って行った。プラスミドの構築に使用した制限酵素および他の酵素は、タカラバイオ、東洋紡のいずれかから入手した。

プラスミドの構築は、特に記載が無い限りライゲーションはベクターを５ｆｍｏｌ、インサートを１５ｆｍｏｌとし、同量（５〜１０μＬ）のライゲーションキット（タカラバイオ社製）のソリューションＩ液を加え、１６℃、１時間反応した。反応液を全て使用し、大腸菌ＤＨ５αをアンピシリンの含むＬＢ培地上で形質転換した。クローンを選抜後、プラスミドを精製した。この精製物をＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）で下記の条件でシークエンス反応を行い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３１００−ａｖａｎｔ（アプライドバイオシステムズ社製）にて解析した。
シークエンス反応：
１．９６．０℃ １分
２．９６．０℃ １０秒
３．５０．０℃ ５秒
４．６０．０℃ ４分
５．２．〜４．を２５回繰り返した。

ＰＣＲは、特に記載がない限りＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡社製）を用いて下記の条件でＤＮＡ−Ｅｎｇｉｎｅ（バイオラッド社製）により反応を行った後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）により精製した。
ＰＣＲ反応：
１．９４．０℃ ２分
２．９４．０℃ １５秒
３．５０．０℃ ３０秒
４．６８．０℃ １ｋｂｐにつき１分
５．２．〜４．を３０回繰り返し。

ＲＡＣＥ法による蚕由来の新規β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ塩基配列の決定

（１）ショウジョウバエで報告された新規のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであるＦＤＬ（ｆｕｓｅｄ ｌｏｂｅｓ）のアミノ酸配列をソースとしてＫＡＩＫＯＢＬＡＳＴ検索をおこない、相同性の高いゲノム由来の配列（Ｃｏｎｔｉｇ５８１７４５）を選抜した。この配列を元に
プライマー１（５’−ｇｔａｃｃａｇｇｃｇｔｃｃａｃｇｔｇｃｇａｇａｔ−３’）、
プライマー２（５’−ｃｃａｇａｇｃｔｃａｃｔｃｔｇｃｔｔｔｇｇｔｃａｔｃｇ−３’）、
プライマー３（５’−ｃｇａａｃｇａｇｃｇａａｔｇｇｇｇｇｔａａａｇｃ−３’）を設計した。

（２）５令３日目のカイコ幼虫（品種：ｗ１ｐｎｄ）の脂肪体より、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ −ｍＲＮＡ−（東洋紡社製）を使用してｍＲＮＡを調製した。これをＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（クローンテック社製）を使用して、逆転写によりｃＤＮＡを合成後、プライマー１をＦｉｎａｌ ４％ ＤＭＳＯを含む反応液に加え、下記の条件にてＲＡＣＥ法を行い、約２０００ｂｐのＲＡＣＥ断片（以下、ＲＡＣＥ５’末端断片という）を得た。なお、プロトコールは上記キット付属の取り扱い説明書によった。このＲＡＣＥ５’末端断片をＥｘ−ＴａｑとｄＡＴＰによって末端にアデニンを１つ突出させて、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）とライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてＭ１３．ｆｏｒ（５’−ａｃｇａｃｇｔｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇ−３’）およびＭ１３．ｒｅｖ（５’−ｔｃａｃａｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇ−３’）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜した。
５’末端ＲＡＣＥ条件：
１．９４．０℃ ３０秒
２．７２．０℃ ３分
３．１．〜２．を５回繰り返し
４．９４．０℃ ３０秒
５．７０．０℃ ３０秒
６．７２．０℃ ３分
７．４．〜６．を５回繰り返し
８．９４．０℃ ３０秒
９．６５．０℃ ３０秒
１０．７２．０℃ ３分
１１．２．〜４．を２５回繰り返し。

（３）５令３日目のカイコ幼虫ｗ１ｐｎｄの脂肪体を鋳型として、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｍＲＮＡ−（東洋紡社製）を使用してｍＲＮＡを作製した。これをＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（クローンテック社製）を使用して、逆転写によりｃＤＮＡを合成後、プライマー２を用いて下記の条件にてＲＡＣＥ法を行った。このＲＡＣＥ反応液を鋳型として、プライマー３を用いて下記の条件にてＲＡＣＥ法を行い、約６５０ｂｐのＲＡＣＥ断片（以下、ＲＡＣＥ３’末端断片という）を得た。なお、プロトコールは上記キット付属の取り扱い説明書によった。このＲＡＣＥ３’末端断片をＥｘ−ＴａｑとｄＡＴＰによって末端にアデニンを１つ突出させて、ｐＴ７−Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）とライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローンを、プラスミド精製、Ｍ１３．ｆｏｒ（５’−ａｃｇａｃｇｔｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇ−３’）およびＭ１３．ｒｅｖ（５’−ｔｃａｃａｃａｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇ−３’）のプライマーを用いた塩基配列確認により選抜した。
３’末端ＲＡＣＥ条件：
１．９４．０℃ ３０秒
２．７２．０℃ ３分
３．１．〜２．を５回繰り返し
４．９４．０℃ ３０秒
５．７０．０℃ ３０秒
６．７２．０℃ ３分
７．４．〜６．を５回繰り返し
８．９４．０℃ ３０秒
９．６９．０℃ ３０秒
１０．７２．０℃ ３分
１１．２．〜４．を２５回繰り返し。

（４）ＲＡＣＥ５’末端断片およびＲＡＣＥ３’末端断片配列をＡｕｔｏ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）にてアライメントして、図．１の配列を得た。この配列をＧＥＮＴＥＸ ｖｅｒ．７（ゼネティックス社製）によるＯＲＦ解析を行い、ＯＲＦを決定した。

β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子のベクターへの組込み

（１）上記１で得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマー４（５’−ｇｔｔａｇａｔｃｔａｔｇａａｇａｔｇａｔｇｔｃｇｔｇｇｇｇｔｇ−３’）およびプライマー５（５’−ｔｃｔｃｇａｇａｃｔａｇａｇｇｃａｃｇｃｇｔｇｃｇｇ−３’）を用いてＰＣＲを行い、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子断片を取得した。制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩを用いてこれを消化し、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子断片を切り出した。一方、ｐＭ０１プラスミド（片倉工業社製）を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏ Ｉを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ断片と線状化したプラスミドをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてＶＰ．ｆｏｒ（５’−ａａｔｃａｔａａａａｔｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃｃ−３’）およびｐＭ．ｒｅｖ（５’−ｃａａｃｇｃａｃａｇａａｔｃｔａａｃｇｃ−３’）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜し、Ｃｏｎｔｉｇ５８１７４５／ｐＭＶＰＬＲとした。

（２）また、上記１で得られたｃＤＮＡを鋳型として、プライマー６（５’−ｇｇａｇａｔｃｔａｇｃｔｇｔａｃｔｃｔａｃｔｇｇａａａｃａｇｃ−３’）およびプライマー５（５’−ｔｃｔｃｇａｇａｃｔａｇａｇｇｃａｃｇｃｇｔｇｃｇｇ−３’）を用いてＰＣＲを行い、シグナル配列欠損β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子断片を取得した。制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩを用いてこれを消化し、シグナル配列欠損β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ遺伝子断片を切り出した。一方、Ｎ末にｓｔｒｅｐタグを付加するプラスミドベクターを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏ Ｉを用いて消化し、アルカリフォスファターゼにより切断面を脱リン酸化した。シグナル配列欠損β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ断片と線状化したプラスミドをライゲーションして、大腸菌を形質転換した。この形質転換体のクローンをプラスミド精製、そしてＶＰ．ｆｏｒ（５’−ａａｔｃａｔａａａａｔｔｇｃｃｇｔｇｇｔｃｃ−３’）およびｐＭ．ｒｅｖ（５’−ｃａａｃｇｃａｃａｇａａｔｃｔａａｃｇｃ−３’）のプライマーを用いて塩基配列確認を行って選抜し、Ｃｏｎｔｉｇ５８１７４５（−ｓｉｇ）／ｐＭＶＰＬＲ−Ｎｓｔｒｅｐ（＋ｓｉｇ）とした。

組換えβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ発現バキュロウイルスの作製

（１）３５ｍｍ細胞培養用ディッシュを用いて、約１×１０^６個のＢｍＮ細胞を準備した。ウイルスＤＮＡ２００μｇに対して、制限酵素Ｅｃｏ ８１Ｉの３０ｕｎｉｔｓを用いて、３７℃で２０時間の処理条件で反応させることにより線状化したＡＢｖバキュロウイルス（片倉工業社製：特開２００３−５２３７１）０．２μｇと、外来遺伝子導入バキュロウイルス転移ベクター０．５μｇを１．５ｍｌチューブ中で１００μｌのＴＣ−１００（無血清）に混合し、室温で１５分間静置した。ＴＣ−１００（無血清）１００μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）を４μｌ混合し、室温で１５分間静置した。次に２つの溶液を混合し、さらに室温で１５分間静置した後に８００μｌのＴＣ−１００（無血清）を加えた。
（２）準備したＢｍＮ細胞に混合液を加え、２５℃で１６時間培養後に混合液を除去し、新たなＴＣ−１００（１０％ＦＢＳを含む）を２ｍｌ添加して、２５℃で７日間静置培養した。その培養上清を組換えウイルス原液とした。

蚕で発現させたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの精製

（１）上記で作製した、Ｓｔｒｅｐタグ付きβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ発現組換えウイルスを、５令１日目のカイコ幼虫に接種し、ウイルス感染後６日後にカイコの足を傷つけ、体液を回収した。

（２）この体液を低速遠心機（日立社製）により３，０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心し、低速遠心上清を得た。さらにこの低速遠心上清を超遠心により１時間遠心し、超遠心上清を得た。

（３）直径２．５ｃｍカラムに２０ｍＬのＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ ５０％ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（ＩＢＡ社製）を充填し、ゲルの５倍量のＴＢＳｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ．８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ β−ＭＥ）にて平衡化を行った。

（４）ゲルにＴＢＳｂｕｆｆｅｒにて５倍希釈した組換えウイルス感染カイコ幼虫の体液の超遠心上清をロードした。これをゲルの１０倍量のＴＢＳｂｕｆｆｅｒで洗浄し、Ｂｕｆｆｅｒ−Ｅ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ．８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ １ｍＭ ＥＤＴＡ−ＮａＯＨ ｐＨ．８．０、２０ｍＭ β−ＭＥ、２．５ｍＭ ｄｅｓｔｈｉｏｂｉｏｔｉｎ）にて溶出した。なお、流速は１ ｍｌ／ｍｉｎとした。

（５）Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ ５ｍｌカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に取り付け、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で平衡化した。

（６）Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎカラム溶出物３０ｍｌをＤＷで１０倍に希釈したものをカラムにアプライし、２５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で洗浄した。流速は５ｍｌ／ｍｌ。

（７）流速を変えずに、０〜２０分間でＮａＣｌ濃度０〜１Ｍのグラジェント溶出をおこない、５ｍｌずつ溶出物を回収した。溶出を２８０ｎｍの吸光度で検出し、最大ピークを含むフラクションを精製サンプルとした。

（８）精製サンプル１μｌに対し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パジェル１０〜２０％使用、アトー社製）を行い、ゲルをＣＢＢ染色した。スタンダードとしてＭａｇｉｃＭａｒｋ ＸＰ（インビトロジェン社製）を使用した。

（９）泳動の結果、予想分子量に相当する箇所にシングルバンドが確認され、精製がなされたことが分かった（図１）。

Ｎ型糖鎖を基質としたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの活性測定

（１）β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは実施例４で精製した物、基質としてＰＡ−Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ０１２（タカラバイオ社製）を用いた。

（２）以下の反応液を作製し、３０℃で反応させた。

（３）一定時間後（０、３、６、９、２３時間後）、試料を５０μｌ取り、９８℃で３分加熱し、氷上で冷却した。１２,０００ｒｐｍ ４℃ ５分の遠心をおこない、上清を解析用試料とした。

（４）解析は逆相ＨＰＬＣでおこなった。カラムはＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲ２（４．６ｍｍＩ.Ｄ.×２５０ｍｍ、ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製）を使用。溶媒Ａ＝ＤＷ、溶媒Ｂ＝２０％ アセトニトリル、溶媒Ｃ＝０．２％ ＴＦＡを９０：０：１０でＭｉｘしたものを、流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで流し、平衡化した。カラム温度は３０℃。

（５）解析用試料を１０μｌインジェクションし、５〜４０分でＢ ０〜２０％、Ａ ９０〜７０％のグラジェント溶出をおこない、溶出の様子を蛍光（Ｅｘ３１０ｎｍ、Ｅｍ３８０ｎｍ）により検出した。

（６）実験の結果、時間の経過に従い、糖鎖のα１，３−Ｍａｎ側のＮ−アセチルグルコサミンのみが切断されていく様相が示された（図２）。

Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｅを基質としたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの活性測定

（１）β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは実施例４に従い精製し、実施例５で活性を確認した標品、基質としてＣｈｉｔｏｔｒｉｏｓｅ（生化学工業社製）を、Ｈａｓｅらの方法(Ｈａｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.（Ｔｏｋｙｏ）,９５，１９７−２０３（１９８４））によりＰＡ化したものを用いた。さらにＧｌｃＮＡｃ−ＰＡは市販品（ＴａＫａＲａ社製）を、Ｃｈｉｔｏｂｉｏｓｅ−ＰＡはＣｈｉｔｏｂｉｏｓｅ（生化学工業社製）をＰｙｒｉｄｙｌａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）でＰＡ化したものを用いた。

（２）以下の反応液を作製し、３０℃で反応をおこなった。

（３）一定時間後（０、３、６、９、２４時間後）、試料を５０μｌ取り、９８℃で３分加熱し、氷上で冷却した。１２,０００ｒｐｍで５分の遠心をおこない、上清を解析用試料とした。

（４）解析は順相ＨＰＬＣでおこなった。カラムはＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０（４．６ｍｍＩ.Ｄ.×２５０ｍｍ、東ソー社製）を使用。溶媒Ａ＝アセトニトリル、溶媒Ｂ＝ＤＷ、溶媒Ｃ＝５００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ７．３）を８０：１０：１０で混合したものを、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで流し、平衡化した。カラム温度は４０℃とした。

（５）解析用試料と５００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン（ｐＨ７．３）を９：１で混ぜたものを、１０μｌインジェクションし、５〜３５分でＢ １０〜２５％、Ａ ８０〜６５％のグラジェント溶出をおこない、溶出の様子を蛍光（Ｅｘ３１０ｎｍ、Ｅｍ３８０ｎｍ）により検出した。

（６）実験の結果、Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｅに対するヘキソサミニダーゼ活性は確認できなかった（図３）。

図１は、精製したβ―Ｎ―アセチルヘキソサミニダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。 図２は、Ｎ型糖鎖を基質としたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの活性測定結果を示したグラフである。 図３は、Ｃｈｉｔｏｔｒｉｏｓｅを基質としたβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの活性測定結果を示したグラフである。

Claims (8)

1. カイコのβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、以下（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ；
   （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ、
   （ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
2. 以下（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチド；
   （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１〜１０のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、且つβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有するポリペプチド。
3. 請求項１記載のＤＮＡを有する組換えベクター。
4. 請求項３記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
5. 請求項３記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換体。
6. 請求項５記載の形質転換体の子孫またはクローンである、形質転換体。
7. 形質転換体の製造方法であって、
   請求項３記載の組換えベクターを作製する工程と、
   前記組換えベクターを宿主細胞に導入する工程と
   を有する、形質転換体の製造方法。
8. β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの製造方法であって、
   請求項４記載の形質転換細胞を培養する工程と、
   前記細胞またはその培養上清からβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを精製する工程と
   を有する、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの製造方法。

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