JP5235661B2 - 安定化ポリペプチド製剤 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、改善された化学的安定性を備えた薬学的製剤と、精製過程中の又は薬学的製剤中のポリペプチドの化学的安定性を改善するための方法に関する。

（発明の背景）
薬学的製剤の貯蔵や製造の間や精製過程の間のポリペプチドの不安定性はよく知られた問題である。ポリペプチドの可溶性凝集体（共有結合二量体及び多量体）の形成、脱アミド化、酸化、異性化等々の形態での化学的不安定性は、殆どのポリペプチドの比較的不安定な性質のために避けることが困難なよく知られた問題である。従って、薬学的製剤中のポリペプチドの化学的不安定性はポリペプチド医薬の製造と貯蔵に対して重大な問題を引き起こし、この問題を低減し又は排除する方法には製薬業界は強い関心を持っている。かかる化学的変性産物の形成はしばしば温度の上昇で加速される；よって、流通、貯蔵、使用の際に高い温度（つまり例えば８℃以上）への暴露を制限することが、医薬用ポリペプチドの十分な品質を確保するためにしばしば必要である。そのため、患者は、室温での避けられない加速された化学的変性を低下させるため、タンパク質／ペプチド医薬をしばしば冷蔵庫に貯蔵しなければならない。

医薬用ポリペプチドの様々な化学的変性経路のなかでも、凝集形態に伴う生物学的効能の減少と潜在的な抗原性のために、凝集にしばしば特別な注意が払われる。ある凝集は、例えば遊離システイン残基間のジスルフィド結合の形成、アミド基転移、ジチロシン形成又はホルムアルデヒド媒介性架橋を通して新たな共有結合の形成を含む（Wang, W. Int. J. Pharm. 289:1-30, 2005をまた参照）。アミド基転移は一つのポリペプチドの遊離アミノ基（例えばＮ末端）と別のポリペプチドのアミド基（アスパラギン又はグルタミン残基）の間の反応に関する。インスリン製剤中のアミド基転移二量体及び多量体の形成はＢｒａｎｇｅと共同研究者（Brange, J. Pharm Res 9:727-734, 1992）によって報告されている。

インスリンの薬学的製剤において、共有結合二量体及び多量体の形成を低減させることは、天然のインスリン分子と比較したその顕著に減少した生物学的効能とその潜在的な抗原性のために特に関心が高い。従って、化学的変性、特に共有結合二量体及び多量体の形成に対して安定化されたインスリン製剤は非常に望ましい。
ポリペプチドを含む薬学的溶液へのバッファーの添加は、精製中又は薬学的溶液のｐＨを所望のｐＨ範囲内に安定化させるために必須である。従来は、ポリペプチドを含む薬学的製剤に対する好適なバッファー剤としてホスフェートバッファーが使用されていた。

ＵＳ２００３０１２５２３４は多荷電化合物によるタンパク質の物理的安定性（不溶性凝集体又はフィブリルの形成）の修正を開示している。エチレンジアミンとインスリンが示されているが、インスリンの物理的安定性に対する有意な好ましい効果は、エチレンジアミンの存在下では観察されていない。本発明の主題である化学的安定性（例えば可溶性凝集体、例えば共有結合二量体及び多量体の形成）は評価されていない。

（発明の概要）
化学的安定性が増大した薬学的ポリペプチド製剤は、バッファーとしてエチレンジアミン又はその塩を上記製剤に添加することによって得ることができることが見出された。
よって、一態様では、本発明は、ポリペプチドと、エチレンジアミン又はその塩と、抗菌保存剤とを含有する薬学的製剤に関する。
他の態様では、本発明は、精製過程中のポリペプチドの安定性を改善するための方法に関する。該方法は、精製されるポリペプチドを含む溶液にバッファーとして十分量のエチレンジアミン又はその塩を添加することを含む。

（発明の説明）
本発明は薬学的ペプチド製剤及びペプチド含有溶液の安定化に関する。「安定化溶液」なる用語は、増加した化学的安定性を有するポリペプチド溶液を意味する。薬学的製剤及び様々な処理工程（例えば精製工程）からのポリペプチドの溶液がそのような溶液の例である。

ここで使用されるタンパク質溶液の「化学的安定性」という用語は、天然タンパク質構造と比較して潜在的に少ない生物学的能力及び／又は潜在的に増加した免疫原性を持つ化学的変性産物の形成に至るポリペプチド構造中の化学共有結合変化を意味する。天然ポリペプチドのタイプと性質及びポリペプチドがさらされる環境に応じて、様々な化学的変性産物が形成されうる。最も可能性が高いことは化学的変性は完全には避けることができないことであり、当業者にはよく知られているように、化学的変性産物の量の増加がポリペプチド溶液の貯蔵や使用中にしばしば見られる。殆どのポリペプチドは、脱アミド化を受ける傾向があり、これはグルタミニル又はアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて遊離のカルボキシレートを形成するプロセスである。他の変性経路は、アミド基転移及び／又はジスルフィド相互作用を通して二以上のタンパク質分子が互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及び多量体変性産物の形成に至る高分子量転換産物の形成を含む（Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahem. T. J. & Manning M. C., Plenum Press, New York 1992）。アミド基転移は一つのポリペプチドの遊離アミノ基（例えばＮ末端）と別のポリペプチドのアミド基（例えばアスパラギン又はグルタミン残基）の間の反応に関する。インスリン製剤中のアミド基転移二量体及び多量体の形成はＢｒａｎｇｅと共同研究者（Brange, J. Pharm Res 9:727-734, 1992）によって報告されている。（例えばメチオニン残基の）酸化は化学的変性の他の変形例として挙げることができる。ポリペプチド溶液の化学的安定性は、異なった環境条件への暴露後に様々な時点において化学的変性産物の量を測定することによって評価することができる（変性産物の形成は例えば温度の上昇によってしばしば加速され得る）。それぞれ個々の変性産物の量は、様々なクロマトグラフィー法（例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ）を使用して分子サイズ及び／又は「疎水性」に応じて変性産物を分離することにより決定されることが多い。

よって、上に概説したように、「安定化ポリペプチド溶液」は増加した化学的安定性を有する溶液を意味する。更に、上に概説したように、「安定化製剤」は増加した化学的安定性を有する製剤を意味する。一般に、製剤は、有効期限に達するまで（推奨された使用及び貯蔵条件に応じて）使用及び貯蔵中に安定でなければならない。

上記安定化は、問題のポリペプチドを含有する薬学的製剤又は溶液にエチレンジアミンを添加することによって達成される。あるポリペプチドの十分な化学的安定化を達成するためのエチレンジアミンの最適濃度は、ポリペプチドの濃度や構造（例えばポリペプチド当たりのＡｓｎ及びＧｌｎ残基の数）などの様々なパラメータに依存する。よって、エチレンジアミンとポリペプチドの間のモル比は十分な化学的安定化を達成するために任意には選択することはできない。一般に、エチレンジアミンとポリペプチドのモル比（エチレンジアミン：ポリペプチド）は少なくとも１：１０、好ましくは少なくとも１：５、より好ましくは少なくとも２：１、より好ましくは少なくとも４：１でなければならない。明らかに、最適比は特定のポリペプチドに依存し、上述の比と比較して変わりうる。
しかして、エチレンジアミン濃度は、問題のポリペプチドと薬学的製剤中の他の成分に依存し、比較的広い範囲内で変化しうる。エチレンジアミン濃度は典型的には０．０１〜１００ｍＭの範囲にある。

他の実施態様では、エチレンジアミン濃度は１〜５０ｍＭの間又は３〜２５ｍＭの間にある。
更なる実施態様では、エチレンジアミン濃度は３〜２０ｍＭの間、４〜２０ｍＭの間、５〜２０ｍＭの間、５〜１８ｍＭの間、５〜１７ｍＭの間、５〜１６ｍＭの間にある。
薬学的製剤のｐＨは、約２から約１０の範囲にありうるが、典型的には約４から約８．５の範囲にある。
更なる実施態様では、ｐＨは４．５〜６．５、５．５〜６．５、６．５〜９、６．５〜８．５又は７〜８である。

本発明の一目的は、エチレンジアミン又はその塩をバッファー化合物として含有する薬学的製剤であって、ポリペプチド化合物が０．０１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する製剤を提供することにある。
薬学的製剤は水性製剤又は凍結乾燥製剤であり得、医療提供者又は患者が使用前に溶媒及び／又は希釈剤を添加するか、又は事前の溶解の必要がない使用準備が整った乾燥製剤（例えば凍結乾燥又はスプレードライ）でありうる。

本発明の一実施態様では、薬学的製剤は水性製剤、つまり水を含有する製剤である。かかる製剤は典型的には溶液又は懸濁液である。本発明の更なる実施態様では、薬学的製剤は水溶液である。「水性製剤」なる用語は少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する製剤として定義される。同様に、「水溶液」なる用語は少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する溶液として定義され、「水性懸濁液」なる用語は少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含有する懸濁液として定義される。
本発明に係る薬学的製剤の非限定的な例は、エチレンジアミン濃度が０．０１〜１００ｍＭの範囲にあり、特にエチレンジアミン濃度がせいぜい５０ｍＭ、例えば１〜５０ｍＭ、より特定的には３〜２５ｍＭ、更により特定的には５〜１６ｍＭである水性製剤である。

一実施態様では、薬学的製剤は、エチレンジアミン又はその塩に加えて、一又は複数の一般的なバッファー又はバッファー系を更に含有しうる。そのような一般的なバッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、及び／又はそれらの混合物及び／又は塩からなる群から選択されうる。その一般的なバッファー又はバッファー系は典型的にはホスフェートバッファーを含む。

一実施態様では、薬学的製剤は、エチレンジアミン又はその塩に加えて、ジエチルマロン酸、トリメリット酸、シキミ酸、グリシンアミド塩酸塩、２-アミノ-２-メチル-１,３-プロパンジオール（ＡＭＰＤ）及び塩化テトラエチルアンモニウム（塩化Ｔ.Ｅ.Ａ.）又はそれらの塩からなる群から選択される一又は複数のバッファー又はバッファー系を更に含有する。
一実施態様では、バッファーの全濃度は０．０１〜１００ｍＭの範囲にあり得、特にバッファーの全濃度はせいぜい５０ｍＭ、例えば１〜５０ｍＭである。最適なバッファー濃度は、例えば異なったバッファー間での異なったバッファー容量の結果として、バッファーの特定の組合せに依存して僅かに変わりうる。

本発明に係る薬学的組成物は一又は複数の抗菌保存料を更に含有する。適切な薬学的に許容可能な保存料は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール）又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。
本発明の一実施態様では、保存料はフェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール及びｐ-クレゾール及びそれらの混合物からなる群、特にフェノール及びｍ-クレゾールから選択される。

本発明の更なる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌ又は１０ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これら特定の保存料の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
薬学的製剤は、安定剤、アミノ酸塩基、抗菌保存料、キレート剤、界面活性剤、等張化剤からなる群から選択される成分を更に含有しうる。

薬学的組成物中における安定剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19版, 1995が参照される。一実施態様では、本発明の組成物は、液体薬学的製剤としての貯蔵中に変性産物の形成をおそらくは示すポリペプチドをその治療的活性成分が含む安定化液体薬学的組成物である。「貯蔵中」とは、ひとたび調製された液体薬学的組成物又は製剤が直ぐには患者に投与されないことを意図する。むしろ調製後に、液体形態か、凍結状態か、又は後で液体形態もしくは患者への投与に適した他の形態へ再構成するための乾燥形態の何れかで貯蔵するために包装される。「乾燥形態」とは、液体薬学的組成物又は製剤が、フリーズドライ（つまり凍結乾燥；例えばWilliams及びPolli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59）、スプレードライ（Masters (1991), Spray-Drying Handbook (5版; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676；Broadhead等 (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206；及びMumenthaler等 (1994) Pharm. Res. 11:12-20を参照）又はエアードライ（Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25:459-470；及びRoser (1991) Biopharm. 4:47-53）の何れかによって乾燥されていることを意図する。

液体薬学的組成物の貯蔵中におけるポリペプチドの変性産物の形成はそのポリペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼし得、薬学的組成物の治療効果を消失させる。
本発明の薬学的組成物は組成物の貯蔵の間のポリペプチドによる凝集体形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を更に含みうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せのことであり、任意の与えられたアミノ酸はその遊離塩基形態又はその塩形態で存在する。アミノ酸の組合せが使用される場合、アミノ酸の全てがその遊離塩基形態で存在し得、全てはその塩形態で存在し得、あるいは幾つかがその塩基形態で存在し得る一方、他のものはその塩形態で存在する。一実施態様では、本発明の組成物を調製する際に使用するアミノ酸は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸のような荷電側鎖を担持しているものである。特定のアミノ酸（例えばメチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物）の任意の立体異性体（つまりＬ、Ｄ、又はその混合体）又はこれら立体異性体の組み合わせは、特定のアミノ酸がその遊離塩基形態又はその塩形態の何れかで存在している限り、本発明の薬学的組成物中に存在しうる。一実施態様では、Ｌ立体異性体が使用される。本発明の組成物はまたこれらのアミノ酸の類似体と共に製剤化されうる。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液体薬学的組成物の貯蔵中におけるポリペプチドによる凝集体形成を減少させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体のことである。適切なアルギニン類似体には、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチルＬ-アルギニンが含まれ、適切なメチオニン類似体には、エチオニン及びブチオニンが含まれ、適切なシステイン類似体にはＳ-メチル-Ｌシステインが含まれる。他のアミノ酸の場合と同様に、アミノ酸類似体はその遊離の塩基形態又はその塩形態で組成物中に導入される。本発明の更なる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を防止又は遅延させるのに十分な濃度で使用される。

本発明の更なる実施態様では、治療剤として作用するポリペプチドが酸化を受けやすい少なくとも一のメチオニン残基を含むポリペプチドである場合、メチオニン（又は他の含硫アミノ酸又はアミノ酸類似体）を添加してメチオニン残基がメチオニンスルホキシドへ酸化するのを阻害することができる。「阻害する」とは、メチオニンが酸化された種の経時的な蓄積の最小化のことである。メチオニンの酸化を阻害することはポリペプチドをその正しい分子形態により維持することになる。メチオニンの任意の立体異性体（Ｌ又はＤ）又はその組み合わせを使用することができる。付加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関に受け入れられるようにメチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量でなければならない。典型的には、これは、組成物がせいぜい約１０％以下から約３０％以下のメチオニンスルホキシドを含むことを意味する。一般に、これは、メチオニン残基に加えられるメチオニンの比が約１：１から約１０００：１、例えば１０：１から約１００：１の範囲になるようにメチオニンを添加することによって達成することができる。

本発明の更なる実施態様では、製剤は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、安定剤はポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロース又はその誘導体（例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ、ＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、モノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノールのような硫黄含有物質、及び異なった塩（例えば塩化ナトリウム）から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
薬学的組成物はまたその中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に向上させる更なる安定剤を含有しうる。本発明にとって特に興味がある安定剤には、限定するものではないが、メチオニンの酸化からポリペプチドを保護するメチオニン及びＥＤＴＡと、凍結融解又は機械的せん断に伴う凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤が含まれる。

本発明の更なる実施態様では、製剤は等張剤を更に含有する。等張剤は、塩（例えば塩化ナトリウム）、糖又は糖アルコール、アミノ酸（例えばＬ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えばグリセロール（グリセリン）、１,２-プロパンジオール（プロピレングリコール）、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ４００）、又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンブン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルセルロース-Ｎａを含む単糖類、二糖類、又は多糖類、又は水溶性グルカン類のような任意の糖を使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは少なくとも一つの-ＯＨ基を有するＣ４−Ｃ８炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、アラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖類又は糖アルコールは個々に又は組み合わせて使用することができる。糖又は糖アルコールが液体調製物中で可溶性であり、本発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を及ぼさない限り、使用される量に決まった制限はない。一実施態様では、糖又は糖アルコール濃度は約１ｍｇ／ｍｌと約１５０ｍｇ／ｍｌの間である。本発明の更なる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定の等張剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中における等張剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19版, 1995が参照される。

本発明の更なる実施態様では、製剤はキレート剤を更に含有する。キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択されうる。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は０．１ｍｇ／ｍｌから２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は２ｍｇ／ｍｌから５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物中におけるキレート剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19版, 1995が参照される。

本発明の更なる実施態様では、製剤は界面活性剤を更に含有する。界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えばプルロニック(登録商標)Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトンＸ-１００のようなポロキサマー類）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体（トゥイーン類、例えばＴｗｅｅｎ-２０、Ｔｗｅｅｎ-４０、Ｔｗｅｅｎ-８０及びＢｒｉｊ-３５）、そのモノグリセリド又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチン及びリン脂質（例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン）、リン脂質誘導体（例えばジパルミトイルホスファチジン酸）及びリゾリン脂質誘導体（例えばパルミトイルリゾホスファチジル-Ｌ-セリン及びエタノールアミン、コリン、セリンもしくはスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスフェートエステル）並びにリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及び極性頭部基、つまり、コリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、正荷電ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニンの修飾体、及びグリセロリン脂質（例えばケファリン）、グリセロ糖脂質（例えばガラクトピラノシド）、スフィンゴ糖脂質（例えばセラミド、ガングリオシド）、ドデシルホスホコリン、ニワトリ卵白リゾレシチン、フシジン酸誘導体（例えばタウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウム等々）、長鎖脂肪酸及びその塩Ｃ６−Ｃ１２（例えばオレイン酸及びカプリル酸）、アシルカルニチン及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮ^α-アシル化誘導体、又はリジンもしくはアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含むジペプチドのＮ^α-アシル化誘導体、中性アミノ酸と二つの荷電アミノ酸の任意の組合せを含むトリペプチドのＮ^α-アシル化誘導体、ＤＳＳ（ドキュセート・ナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７-１１-７］）、ドキュセート・カルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８-４９-４］、ドキュセート・カリウム、ＣＡＳ登録番号［７４９１-０９-０］、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩及びグリシンもしくはタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホネート、アニオン性（アルキル-アリール-スルホネート）一価界面活性剤、両性イオン性界面活性剤（例えばＮ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート類、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート、カチオン性界面活性剤（第４級アンモニウム塩基）（例えば臭化セチル-トリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えばドデシルβ-Ｄ-グルコピラノシド）、ポロキサミン（例えばテトロニックス(Tetronic's)）から選択することができ、あるいは該界面活性剤はイミダゾリン誘導体又はその混合物の群から選択されうる。これらの特定の界面活性剤の各一は本発明の別の実施態様を構成する。
薬学的組成物中における界面活性剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19版, 1995が参照される。

本発明の更なる実施態様では、製剤はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）やベンズアミジン塩酸塩のようなプロテアーゼ阻害剤を更に含有するが、他の市販のプロテアーゼ阻害剤もまた使用することができる。プロテアーゼ阻害剤の使用は、自触媒作用を阻害するためにプロテアーゼのチモーゲンを含有している薬学的組成物において特に有用である。
その他の成分が本発明のペプチド薬学的製剤中に存在することもありうる。そのような更なる成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張度調節剤、キレート剤、金属イオン、油性媒体、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えばベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジンのようなアミノ酸）が含まれる。そのような更なる成分は、当然ながら、本発明の薬学的製剤の全体の安定性に悪影響を及ぼしてはならない。

特に高い温度での、タンパク質／ペプチド医薬の化学的変性は、可溶性凝集体（例えば共有結合二量体及び多量体）を含む様々な変性産物の形成に至るよく知られた現象である。これは、薬学的ポリペプチドの生物学的効能を低減させ得、変性産物が望まれない抗原性を潜在的に獲得しうる。
本発明の一実施態様では、薬学的製剤は、インスリン、ヒト成長ホルモン、グルカゴン、ＧＬＰ-１、エキセンディン-４、ＦＶＩＩ、ＦＸＩＩＩ、ＦＶＩＩとＦＸＩＩＩの混合物、ＩＬ-２０、ＩＬ-２１、ＩＬ-２８ａ、ＩＬ-２９、ＩＬ-３１及び／又はそれらの類似体及び／又は誘導体からなる群から選択されるポリペプチドを含有する。
他のポリペプチドは、ＡＣＴＨ、コルチコトロピン放出因子、アンジオテンシン、カルシトニン、ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２、エンテロガストリン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、エリスロポエチン、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、エンドルフィン、エンケファリン、バソプレッシン、オキシトシン、オピオイド及びそれらの類似体、スーパーオキシドジスムターゼ、インターフェロン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ及びリボヌクレアーゼからなる群から選択されうる。

インスリンを例にとると、そのような可溶性凝集体の形成は、その生物学的効能の顕著な減少とその潜在的な抗原性のために非常に望ましくない。本発明は、インスリン製剤に（例えば二塩酸塩形態の）エチレンジアミンを添加すると、共有結合二量体及び多量体の形成が顕著に低減することを示している。共有結合二量体及び多量体の形成の実証された減少は、現在知られている製剤と比較して室温又は室温以上において更に高い化学的安定性を持つタンパク質／ペプチド医薬の製剤化の可能性を意味する。０．１ｍＭを越える濃度でエチレンジアミンが存在すると、７ｍＭのホスフェートバッファーを含有する製剤と比較して、インスリン製剤の化学的安定性を増加させることが示された。

従って、本発明の特定の実施態様では、安定化されたポリペプチドはインスリン又はその類似体もしくは誘導体である。
インスリンは、二つのジスルフィド結合によって互いに連結されたＡ鎖とＢ鎖の二つのアミン酸鎖からなるポリペプチドである。インスリンは天然に生じるインスリン、インスリン類似体、インスリン誘導体に分類できるが、その定義は互いに排他的なものではなく、様々な分子が一を越えるその定義に合致しうる。
天然に生じるインスリンとは、哺乳動物インスリン−つまり、哺乳動物源（例えばヒト、ウシ又はブタ）から得られたかそれからのインスリン分子と同一のインスリン分子のことである。天然に生じるインスリンのＡ鎖は２１のアミノ酸からなり、天然に生じるインスリンのＢ鎖は３０のアミノ酸からなる。天然に生じるインスリンは膵腺からの抽出又は様々な宿主細胞においての組換えＤＮＡ法によって産生され得る。

一実施態様では、本発明に係る薬学的製剤は、ポリペプチドがインスリン誘導体又はインスリン類似体である製剤である。
インスリン類似体は、天然に生じるインスリン、つまりヒトインスリン又は動物インスリンの類似体で、他の点は同一の対応する天然に生じるインスリンとは、他のアミノ酸残基での少なくとも一の天然に生じるアミノ酸残基の置換、及び／又は少なくとも一のアミノ酸残基の付加／欠失の点で異なる。付加されるアミノ酸残基はまた天然に生じないものでありうる。インスリン類似体の例は、Ｂ２８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａであり、Ｂ２９位がＬｙｓ又はＰｒｏであるか；又はＢ３がＬｙｓでＢ２９がＧｌｕであるか；又はＡ２１がＧｌｙで、ＡｒｇがＢ３１及びＢ３２に付加されたか；又はＢ２８−Ｂ３０のアミノ酸残基が欠失されているか；又はＢ２７のアミノ酸残基が欠失されているか；又はＢ３０のアミノ酸残基が欠失されているヒトインスリン類似体である。

インスリン誘導体は、少なくとも一つの有機分子がアミノ酸残基の一又は複数に結合している天然に生じるインスリン又はインスリン類似体の誘導体である。インスリン誘導体の例は、アミノ酸残基に結合した有機分子が脂溶性分子である天然に生じるインスリン又はインスリン類似体の誘導体である。アミノ酸残基に結合した有機分子が脂溶性分子であるインスリン誘導体の例は、Ｂ２９-Ｎ^ε-テトラデカノイル-ｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリン、Ｂ２９-Ｎ^ε-テトラデカノイルヒトインスリン、Ｂ２９-Ｎ^ε-ヘキサデカノイルヒトインスリン、Ｂ２８-Ｎ^ε-テトラデカノイル-Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリン、Ｂ２８-Ｎ^ε-ヘキサデカノイル-Ｌｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリン、Ｂ３０-Ｎ^ε-テトラデカノイル-Ｔｈｒ^Ｂ２９Ｌｙｓ^Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ３０-Ｎ^ε-ヘキサデカノイル-Ｔｈｒ^Ｂ２９Ｌｙｓ^Ｂ３０ヒトインスリン、Ｂ２９-Ｎ^ε-(Ｎ-ヘキサデカノイル-γ-グルタミル)-ｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリン、Ｂ２９-Ｎ^ε-(Ｎ-リトコリル-γ-グリタミル)-ｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリン、Ｂ２９-Ｎ^ε-(ω-カルボキシヘプタデカノイル)-ｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-テトラデカノイルｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２８-テトラデカノイルＬｙｓ^Ｂ２８Ｐｒｏ^Ｂ２９ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-テトラデカノイルＡｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリン、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-ヘキサデカンジオイル-γ-Ｇｌｕ)-ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンである。

他の実施態様では、本発明に係る薬学的製剤は、ポリペプチドがヒトインスリンのＡｓｐ^Ｂ２８類似体である製剤である。
他の実施態様では、本発明に係る薬学的製剤は、ポリペプチドがＢ２９-Ｎ^ε-テトラデカノイル-ｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリンである製剤である。
他の実施態様では、本発明に係る薬学的製剤は、ポリペプチドがＢ２９-Ｎ^ε-(Ｎ-リトコリル-γ-グリタミル)-ｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリンである製剤である。
他の実施態様では、本発明に係る薬学的製剤は、ポリペプチドがＬｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-ヘキサデカンジオイル-γ-Ｇｌｕ)-ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンである製剤である。

他の態様では、本発明は精製過程のような処理の間におけるポリペプチドの安定性を改善するための方法に関する。本方法は精製されるポリペプチドを含む溶液にエチレンジアミン又はその塩の十分量を添加することを含む。
エチレンジアミンは典型的には最後の２又は３の精製工程（ポリッシング工程）において加えられる。精製工程はイオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣクロマトグラフィー、限外濾過又は透析濾過あるいは他のバッファー交換プロセスでありうる。

実施例１
インスリンアスパルト（Ａｓｐ^Ｂ２８ヒトインスリン）を含む水溶液を、（バッファー成分を含む）個々の成分を含むサブ溶液を混合した後、希塩酸又は水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ調整することにより調製し、表１に示した組成物を得た。

本発明によってカバーされるバッファー成分を含有する組成物を、上述のようにして調製し、バッファー成分として７ｍＭのリン酸ナトリウムを含む参照組成物を並行して調製した。

実施例２
各組成物のサンプルを高い温度（３ヶ月までの間、３７℃）に配して、化学変性産物の形成を加速させた。異なった化学変性産物の量を、ゲル浸透クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＧＰＣ-ＨＰＬＣ）及び逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ-ＨＰＬＣ）よって評価した。
ＧＰＣ-ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣカラム：インスリンＨＭＷＰ（７．８×３００ｍｍ）。溶離剤：Ｌ-アルギニン０．０７％ｗ／ｗ、酢酸（氷）１５％ｗ／ｗ、アセトニトリル１５％ｗ／ｗ及び７０％ｗ／ｗ水。０．７ｍＬ／分の流量での定組成溶離。２７６ｎｍでのＵＶ検出。
ＲＰ-ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣカラム：LiChrosorb RP C18（５μｍ、２５０×４ｍｍ内径）、カラム温度：３５℃。溶離剤Ａ：アセトニトリル７．７％ｗ／ｗ、硫酸ナトリウム２．８％ｗ／ｗ、リン酸０．５０％ｗ／ｗ及び水８９％ｗ／ｗ。溶離剤Ｂ：アセトニトリル４３％ｗ／ｗ及び水５７％ｗ／ｗ。０〜３５分：Ａ／Ｂ＝５７／４３で定組成、３５〜４０分：Ａ／Ｂ＝２０／８０への線形変化、４０〜４５分：Ａ／Ｂ＝２０／８０での定組成、４５〜４６分：Ａ／Ｂ＝５７／４３への線形変化。流量１ｍＬ／分。２１４ｎｍでのＵＶ検出。

実施例３
バッファー成分としてエチレンジアミン７又は１４ｍＭ又はホスフェート７ｍＭを含有する組成物を、実施例１に従って調製し、その３種の組成物の化学的安定性を実施例２に従って調べた。ＧＰＣ-ＨＰＬＣ分析からの結果（％高分子量タンパク質（High Molecular Weight Proteins））を図１にまとめ、ＲＰ-ＨＰＬＣ分析からの結果（％関連不純物）を図２にまとめる。これから分かるように、高分子量タンパク質の形成の低減に関する７ｍＭエチレンジアミン溶液中のポリペプチドの化学的安定性は、７ｍＭホスフェートバッファーと比較して少なくとも５倍改善されている。

実施例４
バッファー成分としてエチレンジアミン０．００７ｍＭから１４ｍＭ又はホスフェート７ｍＭを含有する組成物を、実施例１に従って調製した。各組成物を３７℃に配し、化学的安定性試験のためのサンプルを、実施例２に従って０、６、１２週後に引き出した。ＨＭＷＰ及び関連不純物の形成率に関するＧＰＣ及びＲＰ-ＨＰＬＣ分析の結果をそれぞれ図３及び図４に示す。これから分かるように、ポリペプチドの化学的安定性は、エチレンジアミンの濃度が増加するにつれて増加し、従来の７ｍＭホスフェートと比較して優れた化学的安定性が０．１ｍＭ又はそれ以上のエチレンジアミンで観察された。

実施例５
ヒトインスリン又はアシル化インスリン誘導体（アシル１、アシル２及びアシル３）を含む水溶液を、（バッファー成分を含む）個々の成分を含むサブ溶液を混合した後、希塩酸又は水酸化ナトリウムの添加によるｐＨ調整によって、調製した。６．７ｍＭのバッファー（ホスフェート又はエチレンジアミン）を含むヒトインシュリンを製剤化する一方、５ｍＭのバッファー（ホスフェート又はエチレンジアミン）を含むアシル化インスリン誘導体（アシル１、アシル２及びアシル３）を製剤化した。他の製剤成分の濃度は表１に示したものと同様であった。

実施例６
実施例５からの各組成物のサンプルを高い温度（約８週までの間、３７℃）に配して、化学変性産物の形成を加速させた。異なった化学変性産物の量を、ゲル浸透クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＧＰＣ-ＨＰＬＣ）によって評価した。
ＧＰＣ-ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣカラム：インスリンＨＭＷＰ（７．８×３００ｍｍ）。溶離剤：Ｌ-アルギニン０．０６％ｗ／ｗ、酢酸（氷）１５％ｗ／ｗ、アセトニトリル２５％ｗ／ｗ及び６０％ｗ／ｗ水。０．５ｍＬ／分の流量での定組成溶離。２７６ｎｍでのＵＶ検出。

実施例７
バッファー成分としてエチレンジアミン又はホスフェートを含有する組成物を実施例５に従って調製し、組成物の化学的安定性を実施例６に従って調べた。ＧＰＣ-ＨＰＬＣ分析からの結果（形成された二量体％）を図５に示す。これから分かるように、エチレンジアミンでホスフェートを置換すると、ヒトインスリンとアシル化インスリン誘導体の双方に対して化学的安定性を増加させる。

３７℃で３ヶ月の貯蔵後に高分子量タンパク質の相対量（％ＨＭＷＰ）として測定した、エチレンジアミン二塩酸塩又はホスフェートをバッファーとして含む組成物中のポリペプチド（インスリンアスパルト）の化学的安定性のゲル浸透クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＧＰＣ-ＨＰＬＣ）分析の結果を示す。 ３７℃で３ヶ月の貯蔵後に関連不純物の相対量として測定した、エチレンジアミン二塩酸塩又はホスフェートをバッファーとして含む組成物中のポリペプチド（インスリンアスパルト）の化学的安定性の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ-ＨＰＬＣ）分析の結果を示す。 ３７℃で高分子量タンパク質の相対形成率（％ＨＭＷＰ）として測定した、０．００７ｍＭから１４ｍＭのエチレンジアミン二塩酸塩又は７ｍＭのホスフェートをバッファーとして含む組成物中のポリペプチド（インスリンアスパルト）の化学的安定性のゲル浸透クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＧＰＣ-ＨＰＬＣ）分析の結果を示す。 ３７℃で関連不純物の相対形成率として測定した、０．００７ｍＭから１４ｍＭのエチレンジアミン二塩酸塩又は７ｍＭのホスフェートをバッファーとして含む組成物中のポリペプチド（インスリンアスパルト）の化学的安定性の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ-ＨＰＬＣ）分析の結果を示す。 ３７℃でのおよそ８週間の貯蔵後に二量体の相対量として測定した、エチレンジアミン二塩酸塩又はホスフェートをバッファーとして含む組成物中のポリペプチド（ヒトインスリン及びアシル化インスリン誘導体）の化学的安定性のゲル浸透クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＧＰＣ-ＨＰＬＣ）分析の結果を示す。図５中、アシル１はアシル化インスリンＢ２９-Ｎ^ε-(Ｎ-リトコリル-γ-グリタミル)-ｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリンを意味し、アシル２はアシル化インスリンＬｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-ヘキサデカンジオイル-γ-Ｇｌｕ)-ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン)を意味し、アシル３はアシル化インスリンＢ２９-Ｎ^ε-テトラデカノイル-ｄｅｓ(Ｂ３０)-ヒトインスリンを意味する。

Claims (8)

1. インスリン、又は、対応する天然に生じるインスリンとは少なくとも一のアミノ酸残基が置換、付加及び／又は欠失している点で異なるインスリン、又は、天然に生じるインスリンアミノ酸残基に脂溶性分子が結合したインスリンと、
   エチレンジアミン又はその塩と、
   抗菌保存剤と
   を含有する薬学的製剤。
2. エチレンジアミンの濃度が１〜１００ｍＭの範囲にある請求項１に記載の薬学的製剤。
3. エチレンジアミンの濃度が１〜５０ｍＭの範囲にある請求項２に記載の薬学的製剤。
4. エチレンジアミンの濃度が３〜２５ｍＭの範囲にある請求項２に記載の薬学的製剤。
5. エチレンジアミンの濃度が５〜１６ｍＭの範囲にある請求項２に記載の薬学的製剤。
6. 抗菌保存剤が、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール）又はそれらの混合物からなる群から選択される請求項１から５の何れか一項に記載の薬学的製剤。
7. 抗菌保存剤が、フェノール、ｍ-クレゾール又はそれらの混合物からなる群から選択される請求項６に記載の薬学的製剤。
8. 抗菌保存剤が０．１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している請求項７に記載の薬学的製剤。

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