JP5110580B2 - リンパ管可視化トランスジェニックメダカ及び該メダカを用いたリンパ管新生阻害薬のスクリーニング法 - Google Patents
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Description
本発明は、リンパ管可視化トランスジェニックメダカ、該メダカを作製するためのプロモーター、ベクター、形質転換細胞及び該トランスジェニックメダカを用いたリンパ管新生阻害薬のスクリーニング法に関する。
癌の治療を困難にしている原因の一つにリンパ節転移がある。癌細胞は腫瘍内あるいは腫瘍周囲に新生リンパ管を誘導し、結果として形成された豊富なリンパ管は、癌細胞が侵入する機会を増やし、癌のリンパ節転移を促進することが分かっている。そこで、抗がん剤の新たな標的としてリンパ管新生の阻害が着目され開発が進められている。しかし、リンパ管新生の機構については、「VEGF-Cが主に静脈の内皮細胞に由来するリンパ管前駆細胞に発現しているVEGFR-3に受容され、VEGFR-3がリン酸化シグナルを発信し何らかの経路で転写因子Prox-1を発現させリンパ管を新生させる」ということ以外はっきりしていない。そのため、リンパ管新生阻害剤の探索方法としては専ら培養細胞系を用いVEGFR-3のリ
ン酸化を阻害する効果を調べるという手法以外確立されていない。
特表２００５−５３６１８６
ン酸化を阻害する効果を調べるという手法以外確立されていない。
本発明は、リンパ管新生に影響する物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法に適用するのに有用なトランスジェニックメダカを提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題に鑑み検討を重ねた結果、メダカリンパ系に発現するVascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3）遺伝子のプロモーター領域を含むDNA
断片を同定した。そして、実際にこの断片がメダカ個体内でリンパ管細胞に選択的にレポーター遺伝子を発現させ得ることを実証した。
断片を同定した。そして、実際にこの断片がメダカ個体内でリンパ管細胞に選択的にレポーター遺伝子を発現させ得ることを実証した。
本発明は、リンパ管細胞において任意の遺伝子発現を有するプロモーター活性のあるDNA断片、それを含むプラスミドベクター、およびトランスジェニックメダカ、さらにリン
パ関係性を阻害する物質のスクリーニング法に関する。
項１． メダカ由来のVascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3）遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物ないし発現ベクターで形質転換されたトランスジェニックメダカ。
項２． 項１に記載のメダカに被験物質を作用させ、該被験物質のリンパ管の成長に対する影響を評価することを特徴とする、リンパ管新生阻害薬のスクリーニング法。
パ関係性を阻害する物質のスクリーニング法に関する。
項１． メダカ由来のVascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3）遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物ないし発現ベクターで形質転換されたトランスジェニックメダカ。
項２． 項１に記載のメダカに被験物質を作用させ、該被験物質のリンパ管の成長に対する影響を評価することを特徴とする、リンパ管新生阻害薬のスクリーニング法。
本発明により、メダカのリンパ管細胞で発現可能なメダカVEGFR-3プロモーターを初め
て取得できた。
て取得できた。
本発明のプロモーターを用いることで、任意の異種遺伝子をメダカのリンパ管細胞で高発現することができ、トランスジェニックメダカを容易に得ることができるようになった。
本発明のトランスジェニックメダカは稚魚は、リンパ管全体と血管(静脈)の一部におい
てレポーター遺伝子を発現するので、この稚魚を用いてリンパ管新生阻害薬をスクリーニングすることができる。例えばメダカとして透明なメダカを使用し、プロモーターにGFP
、YFPなどの蛍光蛋白質、ルシフェラーゼを含むレポーター遺伝子を連結することで、生
きた個体内の細胞を視覚的に観察することができ、薬物候補化合物を含む生理活性物質のリンパ系形成阻害作用をリアルタイムで観察することができる。このようにして得られたリンパ管新生阻害薬は抗がん剤としてだけでなく、リンパ管腫のようなリンパ管形成異常による疾患の治療薬としても使用できる可能性がある。
てレポーター遺伝子を発現するので、この稚魚を用いてリンパ管新生阻害薬をスクリーニングすることができる。例えばメダカとして透明なメダカを使用し、プロモーターにGFP
、YFPなどの蛍光蛋白質、ルシフェラーゼを含むレポーター遺伝子を連結することで、生
きた個体内の細胞を視覚的に観察することができ、薬物候補化合物を含む生理活性物質のリンパ系形成阻害作用をリアルタイムで観察することができる。このようにして得られたリンパ管新生阻害薬は抗がん剤としてだけでなく、リンパ管腫のようなリンパ管形成異常による疾患の治療薬としても使用できる可能性がある。
レポーター遺伝子として蛍光タンパク質を組み込んだ本発明のトランスジェニックメダカは、蛍光顕微鏡で観察するだけで生きたままリンパ管を可視化することができる。このようなリンパ管可視化トランスジェニックメダカにリンパ管新生阻害薬の候補物質を投与し、そのトランスジェニックメダカのリンパ管新生を蛍光顕微鏡下で観察することで計測し、スクリーニングを行うことができる。
本発明者は、VEGFR-3がメダカのリンパ管前駆細胞に選択的に発現していると予測し、
そのプロモーターを取得した。VEGFR-3プロモーターにレポーター遺伝子を連結して導入
したトランスジェニックメダカにおいて、VEGFR-3は成熟メダカではリンパ管のみに発現
し、メダカの稚魚においては、静脈とリンパ管の両方に発現していた。この稚魚にVEGFR-3のリン酸化を阻害することが公知の3-(4-Dimethylamino-naphthalen-1-ylmethylene)-1,3-dihydro-indol-2-one（MAZ51；CALBIOCHEM社）を作用させると、リンパ管新生が選択的に阻害されることが確認された。
そのプロモーターを取得した。VEGFR-3プロモーターにレポーター遺伝子を連結して導入
したトランスジェニックメダカにおいて、VEGFR-3は成熟メダカではリンパ管のみに発現
し、メダカの稚魚においては、静脈とリンパ管の両方に発現していた。この稚魚にVEGFR-3のリン酸化を阻害することが公知の3-(4-Dimethylamino-naphthalen-1-ylmethylene)-1,3-dihydro-indol-2-one（MAZ51；CALBIOCHEM社）を作用させると、リンパ管新生が選択的に阻害されることが確認された。
このように、本発明で得たメダカVEGFR-3プロモーターとレポーター遺伝子を連結して
トランスジェニックメダカを作製することで、リンパ管新生を阻害する抗ガン剤をスクリーニングできることが、本発明の特徴である。
トランスジェニックメダカを作製することで、リンパ管新生を阻害する抗ガン剤をスクリーニングできることが、本発明の特徴である。
メダカ由来のVEGFR-3プロモーターの配列を配列番号１に示す。
本明細書において、「メダカプロモーター」とは、メダカにおいてプロモーターとして作用する能力（プロモーター機能）を有するDNA断片のことである。「プロモーター」は
、魚類、特にメダカなどの小型硬骨魚類において遺伝子発現を促進する活性を有するDNA
断片を意味する。プロモーターは、DNAを鋳型としてmRNA合成酵素（転写）を開始するDNA上の特定塩基配列を意味する。具体的には、メダカ由来のVEGFR-3遺伝子のプロモーター
およびその改変体が挙げられる。該プロモーター改変体は、メダカなどの小型硬骨魚類(
特にメダカ)においてプロモーター活性を有するプロモーター改変体を意味し、具体的に
は、以下のものが挙げられる：
（a）配列番号１の塩基配列からなるDNA又はその相補鎖
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA
（c）（a）又は（ｂ）の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
、魚類、特にメダカなどの小型硬骨魚類において遺伝子発現を促進する活性を有するDNA
断片を意味する。プロモーターは、DNAを鋳型としてmRNA合成酵素（転写）を開始するDNA上の特定塩基配列を意味する。具体的には、メダカ由来のVEGFR-3遺伝子のプロモーター
およびその改変体が挙げられる。該プロモーター改変体は、メダカなどの小型硬骨魚類(
特にメダカ)においてプロモーター活性を有するプロモーター改変体を意味し、具体的に
は、以下のものが挙げられる：
（a）配列番号１の塩基配列からなるDNA又はその相補鎖
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA
（c）（a）又は（ｂ）の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA。
ストリンジェントな条件としては、具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の1つの実施形態におけるプロモーターは、配列番号１記載の塩基配列からなるD
NAにおいて、１もしくは複数のDNAが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列から
なり、かつ、メダカプロモーターとして作用する能力を有するDNAである。本発明のメダ
カプロモーターには、配列番号１記載の塩基配列の３’または５’末端あるいは内部に、翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、３’または５’末端をプロモーター活性が有る限り、欠失したものが含まれる。
NAにおいて、１もしくは複数のDNAが欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列から
なり、かつ、メダカプロモーターとして作用する能力を有するDNAである。本発明のメダ
カプロモーターには、配列番号１記載の塩基配列の３’または５’末端あるいは内部に、翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、３’または５’末端をプロモーター活性が有る限り、欠失したものが含まれる。
本発明の「ベクター」は、上記プロモーターをクローニングベクターあるいはプロモーターを欠損したレポーターベクターに導入したものであり、例えば大腸菌由来の一般的なクローニングベクターとしてpBluescriptII, レポーターとしてルシフェラーゼを持つpGL3 Basic (Promega社)、レポーターとして蛍光蛋白質を持つpEGFPベクター（Clontech社）などが挙げられる。
ベクターはそれぞれの魚類の宿主細胞に応じて選択する。本発明のプロモーターをベクターに導入する方法は、通常の遺伝子をベクターに導入する方法に従う。
本発明の「トランスジェニックメダカ」とは、上記ベクターにレポーター遺伝子を組み込み、メダカの受精卵に導入することで得ることができる。ベクターに代えて、本発明のプロモーターに異種遺伝子を発現可能に連結して遺伝子構築物を作製し、該遺伝子構築物を同様にメダカの受精卵に導入することでトランスジェニックメダカを得ることもできる。
本発明で得られたトランスジェニックメダカは、寄託機関の寄託対象生物に含まれていないので、本出願人により分譲可能な状態に維持されている。
メダカとしては、特に限定されないが、メダカSTII系統が、本来メダカの持つ色素（黒色、白色、虹色）を欠損する透明メダカの系統で、個体内の細胞で発現するレポータータンパク質(特に蛍光蛋白質)のシグナルを容易に観察することができるために好ましい。
本発明のベクターを宿主細胞に導入する形質転換法としては、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポソームを用いる方法あるいはパーティクルガン法などを挙げることができる。
本発明のプロモーターに必要なエレメントを決定し、必須のエレメント以外の部分を改変したプロモーターを作製することができる。
本発明のプロモーター上にあるエレメント部位を決定する方法としては、例えばJoseph
Sambrook,David W. Russell Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているデリーション法やPCRを用いて長さを調節したプロモーターを作製し、メダカ細胞等に形質転
換後、目的の条件でのプロモーター活性をレポーター遺伝子を用いて調査する方法がある。さらに詳細にエレメント配列を決定する場合は、Joseph Sambrook,David W. Russell Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているようにプロモーター上にDNA変異を
導入して、またはPCR法を利用した変異の導入により、上記と同様に、メダカ細胞等に形
質転換後、プロモーター活性を調査し、もっとも重要なエレメント配列を決定する方法が挙げられる。
Sambrook,David W. Russell Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているデリーション法やPCRを用いて長さを調節したプロモーターを作製し、メダカ細胞等に形質転
換後、目的の条件でのプロモーター活性をレポーター遺伝子を用いて調査する方法がある。さらに詳細にエレメント配列を決定する場合は、Joseph Sambrook,David W. Russell Molecular Cloning 第３版のChapter13に書かれているようにプロモーター上にDNA変異を
導入して、またはPCR法を利用した変異の導入により、上記と同様に、メダカ細胞等に形
質転換後、プロモーター活性を調査し、もっとも重要なエレメント配列を決定する方法が挙げられる。
本発明のプロモーターの改変は、プロモーターのエレメントをタンデムに接続するなどの種々の方法により行うことができ、活性が変化したプロモーターを得ることができる。
本発明のプロモ−ターに接続することが好ましいレポーター遺伝子としては、蛍光タンパク質（緑色蛍光蛋白質（GFP）、黄色蛍光蛋白質（YFP）、青色蛍光蛋白質（BFP）、赤
色蛍光蛋白質（RFP）など）、エクオリン、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ 、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ノパリンシンターゼ、オクタピンシンターゼなどが挙げられるが、定性的測定を行なう場合には肉眼的な観察が容易である点で蛍光蛋白質、定量的測定を行う場合にはルシフェラーゼが好ましい。
色蛍光蛋白質（RFP）など）、エクオリン、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ 、β−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ノパリンシンターゼ、オクタピンシンターゼなどが挙げられるが、定性的測定を行なう場合には肉眼的な観察が容易である点で蛍光蛋白質、定量的測定を行う場合にはルシフェラーゼが好ましい。
以下、本発明を実施例に従いより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
実施例1
(1) Ol VEGFR-3上流領域の取得
Vascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3、別名FMS-like tyrosine kinase 4, FLT-4）遺伝子のヒト、マウス及びゼブラフィッシュのアミノ酸配列データをNCBI遺伝子データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から取得した。このうちゼブラフィッシュの配列データ（NM_130945）をクエリとし、メダカのホモログ（Ol VEGFR-3）
をメダカゲノムBLAST検索サービス（http://dolphin.lab.nig.ac.jp/medaka/srch_db/search_medaka_blastdb2.php?lang=eg&lmode=all, golw_scaffold Hd-rR (200506)）を使用
し予測した。Ol VEGFR-3の翻訳開始点から上流3787 bpまでの範囲をプロモーター領域と
予測しPCRにより増幅した。増幅に使用したプライマーはPrimer3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を用いて設計した上流gcagtccgtcaatactgagg(配列番号２)と下流ttctggactggagatctggag(配列番号３)にそれぞれKpn IとNco Iの制限酵素サイトをつなげた上流ggtaccgcagtccgtcaatactgagg(配列番号４)と下流ccatggctccagatctccagtccagaa(配列番号５)からなる配列をoperon社に合成を依頼して作製した。メダカHd-rR系統（♂）よりゲノムDNAを調製し（Dneasy tissue kit, QIAGEN社）これを鋳型として、上記プライマーを用いてGenomicDNA-PCRを行い、ゲノム断片をクローニングした。PCR
はポリメラーゼとしてEx Taq（Takara社）を使用し反応溶液組成は標準のプロトコールで、サーマルサイクラーとして GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社） を使
用し94℃ 4分、（94℃ 30秒、65℃（1回ごとに1℃下げる） 30秒、72℃ 4分）を７回、（94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 4分）を28回、72℃ 5分の温度変化によって増幅した。PCR
産物をアガロースゲル電気泳動により分離したところ、目的のサイズのバンドを確認した。ゲルより反応産物を抽出・精製した（Mini-elute kit, QIAGEN社）。精製したPCR産物
をTA-cloning法によってpGEM-Teasyベクター（Promega社）にクローニングした。こうし
て作成されたプラスミドベクターをMini-prep kit (QIAGEN社)を用いて調製した。取得した遺伝子配列が予測したOl VEGFR-3上流領域であることを検証するために、精製したプラスミドベクターを鋳型とし、DyeTerminator法を用いてDNAシーケンシングを行なった（BigDyeTerminator, ABI3130, AppliedBiosystemns社)。以上により、3787 bpのOl VEGFR-3
プロモーターを取得した。以下、当該塩基配列のことをpFLT4-4.0kと呼ぶ。
実施例1
(1) Ol VEGFR-3上流領域の取得
Vascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3、別名FMS-like tyrosine kinase 4, FLT-4）遺伝子のヒト、マウス及びゼブラフィッシュのアミノ酸配列データをNCBI遺伝子データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）から取得した。このうちゼブラフィッシュの配列データ（NM_130945）をクエリとし、メダカのホモログ（Ol VEGFR-3）
をメダカゲノムBLAST検索サービス（http://dolphin.lab.nig.ac.jp/medaka/srch_db/search_medaka_blastdb2.php?lang=eg&lmode=all, golw_scaffold Hd-rR (200506)）を使用
し予測した。Ol VEGFR-3の翻訳開始点から上流3787 bpまでの範囲をプロモーター領域と
予測しPCRにより増幅した。増幅に使用したプライマーはPrimer3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）を用いて設計した上流gcagtccgtcaatactgagg(配列番号２)と下流ttctggactggagatctggag(配列番号３)にそれぞれKpn IとNco Iの制限酵素サイトをつなげた上流ggtaccgcagtccgtcaatactgagg(配列番号４)と下流ccatggctccagatctccagtccagaa(配列番号５)からなる配列をoperon社に合成を依頼して作製した。メダカHd-rR系統（♂）よりゲノムDNAを調製し（Dneasy tissue kit, QIAGEN社）これを鋳型として、上記プライマーを用いてGenomicDNA-PCRを行い、ゲノム断片をクローニングした。PCR
はポリメラーゼとしてEx Taq（Takara社）を使用し反応溶液組成は標準のプロトコールで、サーマルサイクラーとして GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社） を使
用し94℃ 4分、（94℃ 30秒、65℃（1回ごとに1℃下げる） 30秒、72℃ 4分）を７回、（94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 4分）を28回、72℃ 5分の温度変化によって増幅した。PCR
産物をアガロースゲル電気泳動により分離したところ、目的のサイズのバンドを確認した。ゲルより反応産物を抽出・精製した（Mini-elute kit, QIAGEN社）。精製したPCR産物
をTA-cloning法によってpGEM-Teasyベクター（Promega社）にクローニングした。こうし
て作成されたプラスミドベクターをMini-prep kit (QIAGEN社)を用いて調製した。取得した遺伝子配列が予測したOl VEGFR-3上流領域であることを検証するために、精製したプラスミドベクターを鋳型とし、DyeTerminator法を用いてDNAシーケンシングを行なった（BigDyeTerminator, ABI3130, AppliedBiosystemns社)。以上により、3787 bpのOl VEGFR-3
プロモーターを取得した。以下、当該塩基配列のことをpFLT4-4.0kと呼ぶ。
(2) 導入遺伝子の作製
Ol VEGFR-3プロモーターの下流でレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターを以下のように作成した。緑色蛍光蛋白質EGFP（Clontech社）の蛋白質をコードする領域を含む配列をNcoI／XbaI部位で切断し、pGL3 Basicベクター（Promega社）のルシフェラーゼ
遺伝子と置換した。また、マルチクローニングサイト（MCS）の内部の制限酵素配列を欠
損させるために、最も５’側のKpnI部位、および３’側のNcoI部位に上記でクローニングしたpFLT4-4.0kをサブクローニングした。構築したOl VEGFR-3プロモーターの下流でEGFPレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターをpFLT4:EGFPと呼ぶ。この発現プラスミドベクターを大腸菌DH5αにトランスフォーメンションし、QIAprep Mini kit（QIAGEN社
）を用いて精製した。
Ol VEGFR-3プロモーターの下流でレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターを以下のように作成した。緑色蛍光蛋白質EGFP（Clontech社）の蛋白質をコードする領域を含む配列をNcoI／XbaI部位で切断し、pGL3 Basicベクター（Promega社）のルシフェラーゼ
遺伝子と置換した。また、マルチクローニングサイト（MCS）の内部の制限酵素配列を欠
損させるために、最も５’側のKpnI部位、および３’側のNcoI部位に上記でクローニングしたpFLT4-4.0kをサブクローニングした。構築したOl VEGFR-3プロモーターの下流でEGFPレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターをpFLT4:EGFPと呼ぶ。この発現プラスミドベクターを大腸菌DH5αにトランスフォーメンションし、QIAprep Mini kit（QIAGEN社
）を用いて精製した。
(3) 遺伝子の導入
上記で作成した発現ベクターを用いて、トランスジェニックメダカ系統の作成と樹立を行なった。遺伝子を導入するメダカは透明メダカであるSTII系統を使用した。メダカSTII系統は本来メダカの持つ色素（黒色、白色、虹色）を欠損する透明メダカの系統で、個体内の細胞で発現する蛍光蛋白質のシグナルを容易に観察することができる実験用メダカである（名古屋大学・若松教授より分与）。親メダカは循環型水槽(IWAKI pomp社)において２７℃、14時間の明期、10時間の暗期によるライトサイクル下で飼育した。性成熟したメダカSTIIをペアリングし、産卵したメダカ受精卵を採卵し、氷冷したハンクス液に入れ、発生の進行を一時的に止めた。卵塊を形成する付着糸を実体顕微鏡下でピンセットを用いて丁寧に取り除き、一個一個ばらばらにした。未受精および未成熟卵はこの時点で取り除いた。注入する発現ベクター溶液はVector DNA, 30ng/μl, K2PO4(pH8.0), 0.1M, フェノールレッド（Sigma社、cell culture grade）, 0.02%）と調整した。ガラス電極（外径1.0 mmφ, 内径0.85 mmφ ハーバード社）に注入DNA溶液を充填し、気泡を取り除いた後、
マイクロインジェクター（フェムトジェット、エッペンドルフ社）に接続し、実体顕微鏡下(オリンパス社)で１−２細胞期のメダカ受精卵内の細胞に0.2 pl〜0.5 pl注入した。DNA注入の終わった受精卵はembryonic solution (0.03% Red Sea Salt溶液)に移し、28℃でインキュベーションした。発生の進んだ胚（Ｇ０）において注入した発現プラスミドベクターに由来する蛍光蛋白質のシグナルを実体顕微鏡下（MZ-FLIII,ライカ社）で観察し、
ディジタルCCDカメラ（DP70, オリンパス社）で記録した。一次スクリーニングとして、
個体群の中で蛍光蛋白質の発現が認められたものだけを抽出し、次世代のために飼育した。
上記で作成した発現ベクターを用いて、トランスジェニックメダカ系統の作成と樹立を行なった。遺伝子を導入するメダカは透明メダカであるSTII系統を使用した。メダカSTII系統は本来メダカの持つ色素（黒色、白色、虹色）を欠損する透明メダカの系統で、個体内の細胞で発現する蛍光蛋白質のシグナルを容易に観察することができる実験用メダカである（名古屋大学・若松教授より分与）。親メダカは循環型水槽(IWAKI pomp社)において２７℃、14時間の明期、10時間の暗期によるライトサイクル下で飼育した。性成熟したメダカSTIIをペアリングし、産卵したメダカ受精卵を採卵し、氷冷したハンクス液に入れ、発生の進行を一時的に止めた。卵塊を形成する付着糸を実体顕微鏡下でピンセットを用いて丁寧に取り除き、一個一個ばらばらにした。未受精および未成熟卵はこの時点で取り除いた。注入する発現ベクター溶液はVector DNA, 30ng/μl, K2PO4(pH8.0), 0.1M, フェノールレッド（Sigma社、cell culture grade）, 0.02%）と調整した。ガラス電極（外径1.0 mmφ, 内径0.85 mmφ ハーバード社）に注入DNA溶液を充填し、気泡を取り除いた後、
マイクロインジェクター（フェムトジェット、エッペンドルフ社）に接続し、実体顕微鏡下(オリンパス社)で１−２細胞期のメダカ受精卵内の細胞に0.2 pl〜0.5 pl注入した。DNA注入の終わった受精卵はembryonic solution (0.03% Red Sea Salt溶液)に移し、28℃でインキュベーションした。発生の進んだ胚（Ｇ０）において注入した発現プラスミドベクターに由来する蛍光蛋白質のシグナルを実体顕微鏡下（MZ-FLIII,ライカ社）で観察し、
ディジタルCCDカメラ（DP70, オリンパス社）で記録した。一次スクリーニングとして、
個体群の中で蛍光蛋白質の発現が認められたものだけを抽出し、次世代のために飼育した。
成長したＧ０個体を個別に野生型の相手と交配し、得られた受精卵（Ｆ１）を個別に採卵した。もし、交配したＧ０個体の生殖系列細胞のゲノムに注入した発現ベクターが挿入されていれば、二次スクリーニングとしてＦ１個体を蛍光顕微鏡下で観察することにより、ある割合で（１細胞期にゲノムに挿入された場合５０％）蛍光蛋白質を発現する個体が得られるはずである。その結果、生殖系列を介したトランスジェニック個体を得ることができた。以下同様にＦ１トランスジェニック個体を飼育し、野生型と交配しＦ２系統を得た。得られたトランスジェニックメダカの稚魚を図1に示し、成魚を図2に示す。また、血球可視化トランスジェニックメダカ（独立行政法人 放射線医学総合研究所から分与）と
交配させたメダカの写真を図3に示す。図3に示されるように、血管とリンパ管は明確に相違しており、本発明のトランスジェニックメダカが、リンパ管を特異的に標識できることが明らかにされた。
交配させたメダカの写真を図3に示す。図3に示されるように、血管とリンパ管は明確に相違しており、本発明のトランスジェニックメダカが、リンパ管を特異的に標識できることが明らかにされた。
(4) リンパ管新生阻害薬の候補物質の投与
VEGFR-3のリン酸化を阻害することが公知の3-(4-Dimethylamino-naphthalen-1-ylmethylene)
-1,3-dihydro-indol-2-one; MAZ51（CALBIOCHEM社）を使用した。これをメダカの飼育水
（0.03 % 海水塩水）に50 μMの終濃度になるように溶かす。MAZ51は疎水性の物質であるため、まずMAZ51をDMSOに10 mMの濃度になるように溶かした後、0.03 % 海水塩水で200倍希釈することで水溶液を作製した。この水溶液中で卵膜除去した受精後２〜３日目胚を３日間培養した。得られたトランスジェニックメダカは、MAZ51を作用させていないメダカ
と比較して、リンパ管の形成が阻害されていた(図4)。
VEGFR-3のリン酸化を阻害することが公知の3-(4-Dimethylamino-naphthalen-1-ylmethylene)
-1,3-dihydro-indol-2-one; MAZ51（CALBIOCHEM社）を使用した。これをメダカの飼育水
（0.03 % 海水塩水）に50 μMの終濃度になるように溶かす。MAZ51は疎水性の物質であるため、まずMAZ51をDMSOに10 mMの濃度になるように溶かした後、0.03 % 海水塩水で200倍希釈することで水溶液を作製した。この水溶液中で卵膜除去した受精後２〜３日目胚を３日間培養した。得られたトランスジェニックメダカは、MAZ51を作用させていないメダカ
と比較して、リンパ管の形成が阻害されていた(図4)。
(5) リンパ管新生阻害薬の候補物質の評価
この胚のリンパ管の形成結果を蛍光実体顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡などを使用し蛍光観察し、その画像データを通常のものと比較することでリンパ管形成阻害効果を評価することができる。また、このトランスジェニックメダカは発生期においては血管にもGFPを
発現しているため血管新生を阻害することを目的とした抗がん剤の効果を評価することも可能である。
この胚のリンパ管の形成結果を蛍光実体顕微鏡、共焦点レーザ顕微鏡などを使用し蛍光観察し、その画像データを通常のものと比較することでリンパ管形成阻害効果を評価することができる。また、このトランスジェニックメダカは発生期においては血管にもGFPを
発現しているため血管新生を阻害することを目的とした抗がん剤の効果を評価することも可能である。
Claims (2)
- メダカ由来のVascular endothelial growth factor receptor 3（VEGFR-3）遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を連結した遺伝子構築物ないし発現ベクターで形質転換され、VEGFR-3遺伝子のプロモーターが、下記の(a)〜(b)：
（a）配列番号１の塩基配列からなるDNA又はその相補鎖
（b）（a）の塩基配列において１もしくは複数の塩基配列が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列からなり、かつメダカプロモーターとして作用する能力を有するDNA
のいずれかである、トランスジェニックメダカ。 - 請求項１に記載のメダカに被験物質を作用させ、該被験物質のリンパ管の成長に対する影響を評価することを特徴とする、リンパ管新生阻害薬のスクリーニング法。
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| JP2007318067A JP5110580B2 (ja) | 2007-12-10 | 2007-12-10 | リンパ管可視化トランスジェニックメダカ及び該メダカを用いたリンパ管新生阻害薬のスクリーニング法 |
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