JP4975031B2 - 薬物リン酸化酵素 - Google Patents

Description

本発明は、生体内で薬物をリン酸化する酵素に関する。更に、本発明は、上記酵素を用いた化合物のリン酸化方法、該酵素によってリン酸化される化合物のスクリーニング方法、及び被験者の被験化合物のリン酸化能を判定する方法等に関する。

医薬品の中には、患者に投与する段階では実際の薬効を有する化合物とは構造を異にし、患者に投与すると生体内で代謝され構造が変化し、その薬効を発揮するものがある。このような生体内で代謝される前の化合物はプロドラッグと呼ばれ、プロドラッグを薬効を示す化合物に代謝する酵素についても種々のものが知られている。

アミノアルコール誘導体の中には生体内でリン酸化されることによって免疫抑制活性を示すものがある。例えば、FTY720（2-Amino-2-[2-(4-octylphenyl)ethyl]propane-1,3-diol hydrochloride）は、生体内でスフィンゴシンキナーゼ１及び２によってリン酸化を受けて、FTY720-phosphate [i.e., (:)2-amino- 2 phosphoryloxymethyl-4-(4-octylphenyl)butanol],になり、免疫抑制作用を示すと考えられている（The Journal of Biological Chemistry, (2003), 278, p.47408−47415）。

一方、一般式（Ｉ）（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、水素原子である。Ｒ^３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基である。Ｒ^４は、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基である。Ｒ^５は、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、Ｘは、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基である。Ｙは、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基である。Ｚは、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基である。ｎは、２又は３である。）で表される化合物についても生体内でリン酸化されることによって活性体に変化し、免疫抑制活性を示すと考えられているが（日本国特許公開公報：特開2005-46141号公報）、生体内におけるリン酸化機構は不明であった。

これらの化合物のリン酸化機構を解明することは、生体内でリン酸化されることによって活性を示す化合物の探索や、活性発現の機構の解明、更には薬剤に対して感受性を有する患者の選択等に有効であると考えられた。

ヒト フルクトサミン−３−キナーゼ関連タンパク質（human fructosamine-3-kinase-related protein：以下、「ヒトＦＮ３ＫＲＰ」ともいう。）はリブロサミンやサイコサミンのようなケトサミンの３位をリン酸化する活性を持つことが報告されている（Diabetes, (2003), 52, p.2888−2895）が、生体内における役割は不明であった。

本発明者は、生体内におけるリン酸化機構を解明するために鋭意研究をしたところ、ヒトＦＮ３ＫＲＰ又はフルクトサミン−３−キナーゼ（human fructosamine−3−kinase 、以下、「ヒトＦＮ３Ｋ」ともいう。）と呼ばれているタンパク質が上記一般式（Ｉ）で示される化合物のリン酸化に関与していることを見出し、本発明を完成させた。

本発明の１つの課題は、例えば、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのような、上記一般式（Ｉ）で示される化合物を生体内でリン酸化する酵素を明らかにすることである。更に、本発明の１つの課題は、上記化合物をリン酸化する酵素を用いた該化合物のリン酸化方法を提供することである。更に本発明の１つの課題は該酵素によってリン酸化される化合物をスクリーニングする方法を提供することである。更に本発明の１つの課題は、被験者の被験化合物のリン酸化能を判定する方法を提供すること等である。

本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行ったところ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのような、上記一般式Ｉで示される化合物をリン酸化する酵素がフルクトサミン−３−キナーゼ関連タンパク質（fructosamine-3-kinase-related protein：以下、「ＦＮ３ＫＲＰ」ともいう。）及び／又はフルクトサミン−３−キナーゼ（fructosamine−3−kinase、以下、「ＦＮ３Ｋ」ともいう。）と呼ばれるタンパク質であることを見出し本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、
（１）下記の工程１）乃至３）を含む、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋによってリン酸化される物質のスクリーニング方法：
１）以下のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させる工程；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
２）被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
３）被験物質を上記ａ）乃至ｃ）から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定された、被験物質のリン酸エステルの量と上記２）で測定されたリン酸エステルの生成量を比較する工程、
（２）下記の工程１）乃至４）を含む、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋによってリン酸化される物質のスクリーニング方法：
１）以下のａ）乃至ｃ）からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させる工程；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
２）被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
３）被験物質を上記ａ）乃至ｃ）から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定された、被験物質のリン酸エステルの量と上記２）で測定されたリン酸エステルの生成量を比較する工程；
４）被験物質を上記ａ）乃至ｃ）から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定された、リン酸エステルの量と比較して、上記２）で測定されたリン酸エステルの量が多い場合に被験物質がリン酸化されたと判定する工程。
（３）下記の工程１）乃至３）を含む、免疫抑制活性を有する物質のスクリーニング方法：
１）以下のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させる工程；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
２）被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
３）被験物質を上記ａ）乃至ｃ）から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定された、被験物質のリン酸エステルの量と上記２）で測定されたリン酸エステルの生成量を比較する工程、
（４）下記の工程１）乃至４）を含む、免疫抑制活性を有する物質のスクリーニング方法：
１）以下のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリペプチドと被験物質を接触させる工程；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
２）被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
３）被験物質を上記ａ）乃至ｃ）から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定された、被験物質のリン酸エステルの量と上記２）で測定されたリン酸エステルの生成量を比較する工程。
４）被験物質を上記ａ）乃至ｃ）から選択されるポリペプチドと接触させない場合に測定された、リン酸エステルの量と比較して、上記２）で測定されたリン酸エステルの量が多い場合に被験物質が免疫抑制活性を有すると判定する工程、
（５）被験物質が、下記一般式（Ｉ）（式中、Ｒ^１及びＲ^２は、水素原子である。Ｒ^３は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基である。Ｒ^４は、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基である。Ｒ^５は、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、Ｘは、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基である。Ｙは、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基である。Ｚは、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基である。ｎは、２又は３である。）で表される化合物であることを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれか１項に記載のスクリーニング方法、

（６）以下の工程１）及び２）を含む、リン酸エステルの製造方法
１）一般式（Ｉ）を有する化合物と以下のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリペプチドとを接触させる工程；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
２）１）における反応溶液から一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを取得する工程、
（７）下記の工程１）乃至３）を含む、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを生成する能力を判定する方法
１）被験者より採取した検体より全ＲＮＡを抽出する工程；
２）全ＲＮＡにおける、下記のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
ａ) 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号６乃至９３５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２７から９５６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
c）上記ａ)又はｂ）に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
３）２）で測定されたポリヌクレオチドの発現量と一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリヌクレオチドの発現量を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程、
（８）下記の工程１）及び２）を含む、患者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを生成する能力を判定する方法
１）被験者より採取した検体における、下記のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリペプチドの発現量を測定する工程；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
２）１）で測定されたポリペプチドの発現量と一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリペプチドの発現量を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程、
（９）下記の工程１）及び２）を含む、患者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを生成する能力を判定する方法
１）被験者より採取した検体における、下記のａ)乃至ｃ)からなる群から選択されるポリペプチドの酵素活性を測定する工程；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
２）１）で測定されたポリペプチドの酵素活性と一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリペプチドの酵素活性を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程、
（１０）下記の工程１）乃至３）を含む、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを生成する能力を判定する方法
１）被験者より採取した検体における以下のａ)乃至ｃ)からなる群から選択されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を調べる工程；
ａ) 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至１４６６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から１７８１に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
c）上記ａ)又はｂ）に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
２） 上記ポリヌクレオチドにおける酵素活性に影響のあるヌクレオチド配列の変異の有無を調べる工程；
３) 該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのリン酸化活性を低下させるヌクレオチド配列の変異がある被験者は一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能が低いと判定し、該ポリペプチドのリン酸化活性を低下させるヌクレオチド配列の変異がない被験者は一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を有すると判定する工程、
（１１）下記の工程１）乃至３）を含む、以下のａ)乃至ｃ)からなる群から選択されるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのリン酸化活性に影響のあるヌクレオチド配列の変異を同定する方法。
ａ) 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至１４６６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から１７８１に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
c）上記ａ)又はｂ）に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
１）被験者より採取した検体における上記ａ)乃至ｃ)からなる群から選択されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を調べる工程；
２）上記ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列の変異の有無を調べる工程；
３) 該ポリヌクレオチド配列の変異と該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのリン酸化活性の関連を調べ、リン酸化活性に影響のある、ポリヌクレオチド配列の変異を同定する工程、
（１２）検体が、末梢血であることを特徴とする、（７）乃至（１１）のいずれか１項に記載の方法、
（１３）下記の１)乃至５）からなる群から選択される少なくとも１以上を含む薬物代謝能診断用キット
１）配列表の配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５から３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）上記１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたは上記２）に記載のポリヌクレオチドプローブのいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
４）下記のａ)乃至c)から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検出するための抗体；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
５）上記４）に記載の抗体に結合する二次抗体、
からなる。

本発明により、ヒト フルクトサミン−３−キナーゼ関連タンパク質（human fructosamine-3-kinase-related protein：以下、「ヒトＦＮ３ＫＲＰ」ともいう。）及び／又はヒト フルクトサミン−３−キナーゼ（human fructosamine−3−kinase、以下、「ヒトＦＮ３Ｋ」ともいう。）を用いた該化合物のリン酸化方法を提供することができた。更に本発明により、該酵素によってリン酸化される化合物をスクリーニングする方法を提供することができた。更に本発明により、被験者の被験化合物のリン酸化能を判定する方法を提供すること等ができた。

１．定義
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのｃＲＮＡも含まれるものとする。また、本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。また、本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。また、本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。本明細書中における「全ＲＮＡ画分」とは、全ＲＮＡを含む画分をいい、血液、各種臓器、各種組織、培養細胞等からＲＮＡの抽出用の溶媒等、通常の方法によって抽出された全RNAが含まれている画分のことをいう。本明細書中において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ExpressHyb Hybridization Solution（クロンテック社製）中、68℃でハイブリダイズすること、または、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて0.7-1.0MのNaCl存在下68℃でハイブリダイゼーションを行なった後、0.1-2倍濃度のSSC溶液（１倍濃度ＳＳＣとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。

２．ヒトＦＮ３ＫＲＰ及びヒトＦＮ３Ｋ
本発明で用いるヒト フルクトサミン−３−キナーゼ（human fructosamine-3-kinase： ヒトＦＮ３Ｋ）及びヒト フルクトサミン−３−キナーゼ関連タンパク質（human fructosamine-3-kinase-related protein：ヒトＦＮ３ＫＲＰ）はその全長タンパク質に限らず、本発明で用いることができる化合物のリン酸化反応を行うことができる限りにおいて、その一部の配列からなる部分ペプチドでも良い。また、ヒト由来細胞より取得された天然のタンパク質でもよいし、ＰＣＲ法等によってクローニングされた遺伝子によって当該タンパク質を発現するように遺伝子組換えされた細胞より取得されたタンパク質でもよい。また、これらのタンパク質は、精製されたものの他に、部分精製されたものでもよい。

ヒトＦＮ３ＫのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は例えば、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至１４６６に示されている。また、ヒトＦＮ３Ｋのアミノ酸配列は、例えば、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されている。ヒトＦＮ３ＫのｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿０２２１５８で登録されている。

また、ヒトＦＮ３ＫＲＰのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は例えば、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１乃至１７８１に示されている。また、ヒトＦＮ３ＫＲＰのアミノ酸配列は、例えば、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されている。ヒトＦＮ３ＫＲＰのｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿０２４６１９で登録されている。

本明細書中において、「ヒトＦＮ３Ｋ遺伝子」とは、ヌクレオチド配列が、配列表の配列番号１のヌクレオチド番号６乃至９３５からなる遺伝子、または該ヌクレオチド配列からなる遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ヒトＦＮ３Ｋと同一の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる遺伝子をいう。

本明細書中において、「ヒトＦＮ３Ｋ」とは、アミノ酸配列が、配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＦＮ３Ｋと同一の生物活性を有する蛋白質をいう。

本明細書中において、「ヒトＦＮ３ＫＲＰ遺伝子」とは、ヌクレオチド配列が、配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２７乃至９５６からなる遺伝子、または該ヌクレオチド配列からなる遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ヒトＦＮ３ＫＲＰと同一の生物活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列からなる遺伝子をいう。本明細書中において、「ヒトＦＮ３ＫＲＰ」とは、アミノ酸配列が、配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、または、該蛋白質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ヒトＦＮ３ＫＲＰと同一の生物活性を有する蛋白質をいう。

ヒトＦＮ３Ｋ及びヒトＦＮ３ＫＲＰ、並びにその部分ペプチドに他のアミノ酸配列を付加した融合タンパク質も、ヒトＦＮ３Ｋ及びヒトＦＮ３ＫＲＰ、並びにその部分ペプチドに含まれる。融合タンパク質としてはヒスチジンタグ融合タンパク質、ＦＬＡＧ融合タンパク質、ＧＦＰ等の蛍光色素融合タンパク質等を挙げることができるが、これらに限定されない。

ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰの酵素活性はヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰ、基質になる物質を適当なバッファーでインキュベートし、生成物であるリン酸化化合物を定量することによって測定することが出来る。例えばヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰを（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールとインキュベートし、生成されるリン酸エステルをHPLCで定量することによって、酵素活性を測定することが出来る。

３．ヒトＦＮ３Ｋ ｃＤＮＡ及びヒトＦＮ３ＫＲＰ ｃＤＮＡの取得
（１）ヒトＦＮ３Ｋ ｃＤＮＡ
ヒトＦＮ３Ｋ ｃＤＮＡは市販品を用いることができ、例えばGeneCopoeia社より入手できる（カタログＮo. GC-W1392）。

また、ヒトＦＮ３Ｋ ｃＤＮＡは ヒトＦＮ３Ｋ遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーを用いて以下のようにして取得することもできる。

ヒトＦＮ３Ｋ遺伝子を発現しているｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を用いてヒトＦＮ３Ｋ ｃＤＮＡを取得する。ｃＤＮＡライブラリーは例えば、ヒト骨髄由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることができる。市販のヒトｃＤＮＡライブラリーとしては例えば、クロンテック社のCreator SMART Human ｃＤＮＡ Librariesを用いることもできるし、また自らｃＤＮＡライブラリーを調製することもできる。

なお、コロニーハイブリダイゼーションを行わずに、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として直接ＰＣＲを行なってヒトＦＮ３Ｋ ｃＤＮＡを取得することもできる。

ＰＣＲプライマーとしてはヒトＦＮ３Ｋ ｃＤＮＡを増幅することができればよく、公知の方法で適当なプライマーを選択することができる。ヒトＦＮ３Ｋ ｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ用プライマーとしては例えば以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを選択することができる。
5’- atggagcagctgctgcgcgccgagctgcgc -3’（プライマー１：配列表の配列番号：５）及び、
5’- ctacttgagcagccttcgcatggtgcccaa -3’（プライマー２：配列表の配列番号：６）。

（２）ヒトＦＮ３ＫＲＰ ｃＤＮＡ
ヒトＦＮ３ＫＲＰ遺伝子を発現しているｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を用いてヒトＦＮ３ＫＲＰ ｃＤＮＡを取得できる。ｃＤＮＡライブラリーは例えば、ヒト骨髄由来のｃＤＮＡライブラリーを用いることができる。市販のヒトｃＤＮＡライブラリーとして例えば、クロンテック社のCreator SMART Human cDNA Librariesを用いることもできるし、自らｃＤＮＡライブラリーを調製することもできる。

なお、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として直接ＰＣＲを行なってヒトＦＮ３ＫＲＰ ｃＤＮＡを取得することもできる。

ＰＣＲプライマーとしてはヒトＦＮ３ＫＲＰ ｃＤＮＡを増幅することができればよく、公知の方法で適当なプライマーを選択することができる。ヒトＦＮ３ＫＲＰ ｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ用プライマーとしては例えば以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを選択することができる。
5’- ataagaatgcggccgccaccatggaggagctgctgaggcg -3’（プライマー３：配列表の配列番号：7）及び、
5’- atagtttagcggccgctcacttgaccagattcctcat-3’（プライマー４：配列表の配列番号：8）。

なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、ヒトＦＮ３Ｋ遺伝子及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰ遺伝子の天然型のヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型のヒトＦＮ３Ｋ遺伝子及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰ遺伝子と同等の生物活性を有するポリヌクレオチドを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型のヒトＦＮ３Ｋ遺伝子及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰ遺伝子と同等の生物活性を示すポリヌクレオチドもまた本発明に用いることができる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはDNAエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。また、ヒトＦＮ３Ｋ遺伝子又はヒトＦＮ３ＫＲＰ遺伝子と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ヒトＦＮ３Ｋ又はヒトＦＮ３ＫＲＰと同様の生物活性を有するポリヌクレオチドを使用することもできる。

４．ヒトＦＮ３Ｋ及びヒトＦＮ３ＫＲＰの発現
（１）ヒトＦＮ３Ｋ及びヒトＦＮ３ＫＲＰ発現ベクターの構築
ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰはin vitroにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって生産することができる。具体的には、ヒトＦＮ３Ｋ遺伝子及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰ遺伝子を発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰを発現させることにより、ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰを得ることが出来る。

原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。

例えば、大腸菌としてはＫ１２株、ＤＨ５α株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系、ｐｃＤＮＡ３．１(＋)(インビトロジェン社)等のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。

枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ohmura、K．et al．（1984）J．Biochem．95、87−93）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするDNA配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。

真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman、Y．（1981）Cell 23、175−182、ATCC：CRL−1650）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub、G．and Chasin、L．A．（1980）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77、4126−4220）等がよく用いられているが、これらに限定されない。

宿主細胞として、HEK293細胞を用いる場合を例に取ると、例えば、ベクターとしてｐｃＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴ（インビトロジェン社）を用いることが出来る。

上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記HEK293細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。

上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。また、精製したポリペプチドの分子量は質量分析器、SDS−PAGE等通常の方法で決定することができる。

ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰの精製に際しては酵素活性を指標にすることができる。

５．リン酸化酵素によってリン酸化を受ける化合物
本発明においてヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰの基質として用いることができる化合物は、ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰによってリン酸化される限りにおいて特に制限はないが例えば、下記一般式（Ｉ）を有する化合物である。

また、上記一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体は、例えば、国際公開第９４／０８９４３号パンフレット（ＦＴＹ７２０）、国際公開第９６／０６０６８号パンフレット（ＦＴＹ類似化合物）、国際公開第９８／４５２４９号パンフレット（ＦＴＹ類似化合物）、国際公開第０３／０２９１８４号パンフレット（ＲＯＸ−２１２７： ＫＲＰ−２０３類似化合物）、国際公開第０３／０２９２０５号パンフレット（ＫＲＰ−２０３）、国際公開第０２／０６２６８号パンフレット（チオフェン誘導体）、国際公開第０３／０５９８８０号パンフレット（ピロール誘導体）、国際公開第０５／００５３８３号パンフレット（置換ピロール誘導体）、国際公開第０５／０６３６７１号パンフレット（ベンゼン環のエーテル誘導体）等に記載する方法に従って製造することができる。

本発明における上記一般式（I）有するアミノアルコール誘導体を医薬組成物の有効成分として用いるときの置換基として、好適な置換基を以下に示す。

Ｒ^１及びＲ^２は、好適には、水素原子である。

Ｒ^３は、好適には、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基であり、更に好適には、メチル基又はヒドロキシメチル基である。

Ｒ^４は、好適には、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基であり、更に好適には、水素原子、塩素原子又はメチル基であり、特に更に好適には、水素原子又は塩素原子である。

Ｒ^５は、例えば、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、好適には、水素原子、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、メチル基、メトキシ基、シクロプロピル基、トリフルオロメチル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、フッ素原子又は水素原子であり、更に好適には、水素原子、メチル基、メトキシ基、トリフルオロメチル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、フッ素原子又は水素原子であり、特に更に好適には、フェニル基、４−メチルフェニル基、４−メトキシフェニル基、３−メトキシ−４−メチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、３−ベンジルオキシフェニル基、フッ素原子又は水素原子である。

Ｘは、好適には、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基であり、更に好適には、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）又はメチルアミノ基である。

Ｙは、好適には、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基であり、更に好適には、単結合、酸素原子、又はカルボニル基である。

Ｚは、好適には、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基であり、更に好適には、単結合、トリメチレン、テトラメチレン又はオクタメチレンである。

ｎは、好適には、２又は３であり、更に好適には、２である。

本発明におけるヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰの基質として用いることができる化合物のうち、一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体として好適な化合物は、
２−アミノ−２−メチル−４−[1−メチル−５−（５−フェニルペンタノイル）ピロール−２−イル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（２−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（４−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（２，３−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（２，４−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（２，５−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３，４−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３，５−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３−メチル−４−メトキシフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３−メトキシ−４−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（４−シアノフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（２−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（２，３−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（２，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（２，５−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，５−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メチル−４−メトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メトキシ−４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール及び
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−シアノフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール並びに、
２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール、
２−アミノ−２−［２−（４−ヘプチルオキシフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール、
２−アミノ−２−｛２−［４−（５−フェニルペンタノイル）フェニル］エチル｝プロパン−１，３−ジオール、
２−アミノ−２−｛２−［４−（５−シクロヘキシルペンタノイル）フェニル］エチル｝プロパン−１，３−ジオール、
２−アミノ−２−｛２−［４−（７−フェニルヘプタノイル）フェニル］エチル｝プロパン−１，３−ジオール、
２−アミノ−２−（２−｛４−［２−（４−メトキシフェニル）エトキシ］フェニル｝エチル）プロパン−１，３−ジオール、
２−アミノ−２−（２−｛４−［２−（４−エトキシフェニル）エトキシ］フェニル｝エチル）プロパン−１，３−ジオール、
２−アミノ−２−（２−｛４−［２−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）エトキシ］フェニル｝エチル）プロパン−１，３−ジオール、
２−アミノ−２−メチル−４−［４−（４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンチルオキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［４−（３−ビフェニル−４−イルプロポキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［４−（３−ビフェニル−４−イルプロピオニル）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［３−メトキシ−４−（４−フェニルブトキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［４−（５−フェニルペンチルオキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［４−（５−フェニルペンタノイル）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−（４−ヘキシルオキシフェニル）ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［４−（３−フェニルプロポキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［４−（３−シクロヘキシルプロポキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［４−（５−シクロヘキシルペンタノイル）フェニル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−（４−ヘプチルオキシフェニル）ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェノキシ）−２−クロロフェニル］プロピル−１，３−プロパンジオール、
２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］プロピル−１，３−プロパンジオール、
２−アミノ−２−メチル−５−［４−（３−ベンジルオキシフェノキシ）−２−クロロフェニル］ペンタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−５−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］ペンタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］プロピル−１，３−プロパンジオール（ＲＯＸ−２１２７）、
２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］エチル−１，３−プロパンジオール（ＫＲＰ−２０３）、
２−アミノ−２−メチル−４−［1−メチル−５−（５−フェニルペンタノイル）ピロール−２−イル］ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛３−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛３−メチル−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛３−クロロ−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛１，３−ジメチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛１−メチル−３−クロロ−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−４−｛１，３−ジメチル−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−３−（４−ヘプタノイルフェノキシ）プロパン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−５−｛１−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ペンタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−５−｛５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ペンタン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−３−｛４−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］フェニルメトキシ｝プロパン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−３−｛２−クロロ−４−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］フェニルメトキシ｝プロパン−１−オール、
２−アミノ−２−メチル−３−｛５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イルメトキシ｝プロパン−１−オール、及び
２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール（ＦＴＹ７２０）
であり、
更に好適な化合物は、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［1−メチル−５−（５−フェニルペンタノイル）ピロール−２−イル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（２−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（４−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（２，３−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（２，４−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（２，５−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３，４−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３，５−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３−メチル−４−メトキシフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３−メトキシ−４−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（４−シアノフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（２−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（２，３−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（２，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（２，５−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，５−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メチル−４−メトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メトキシ−４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール及び
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−シアノフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール並びに、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［２−（４−ヘプチルオキシフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−｛２−［４−（５−フェニルペンタノイル）フェニル］エチル｝プロパン−１，３−ジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−｛２−［４−（５−シクロヘキシルペンタノイル）フェニル］エチル｝プロパン−１，３−ジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−｛２−［４−（７−フェニルヘプタノイル）フェニル］エチル｝プロパン−１，３−ジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−（２−｛４−［２−（４−メトキシフェニル）エトキシ］フェニル｝エチル）プロパン−１，３−ジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−（２−｛４−［２−（４−エトキシフェニル）エトキシ］フェニル｝エチル）プロパン−１，３−ジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−（２−｛４−［２−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）エトキシ］フェニル｝エチル）プロパン−１，３−ジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［４−（４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンチルオキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［４−（３−ビフェニル−４−イルプロポキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［４−（３−ビフェニル−４−イルプロピオニル）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［３−メトキシ−４−（４−フェニルブトキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［４−（５−フェニルペンチルオキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［４−（５−フェニルペンタノイル）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−（４−ヘキシルオキシフェニル）ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［４−（３−フェニルプロポキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［４−（３−シクロヘキシルプロポキシ）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［４−（５−シクロヘキシルペンタノイル）フェニル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−（４−ヘプチルオキシフェニル）ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェノキシ）−２−クロロフェニル］プロピル−１，３−プロパンジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］プロピル−１，３−プロパンジオール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−５−［４−（３−ベンジルオキシフェノキシ）−２−クロロフェニル］ペンタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−５−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］ペンタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］プロピル−１，３−プロパンジオール（ＲＯＸ−２１２７）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］エチル−１，３−プロパンジオール（ＫＲＰ−２０３）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［1−メチル−５−（５−フェニルペンタノイル）ピロール−２−イル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛３−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛３−メチル−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛３−クロロ−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛１，３−ジメチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛１−メチル−３−クロロ−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛１，３−ジメチル−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−３−（４−ヘプタノイルフェノキシ）プロパン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−５−｛１−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ペンタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−５−｛５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ペンタン−１−オール、
（２Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−３−｛４−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］フェニルメトキシ｝プロパン−１−オール、
（２Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−３−｛２−クロロ−４−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］フェニルメトキシ｝プロパン−１−オール、
（２Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−３−｛５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イルメトキシ｝プロパン−１−オール、及び
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール（ＦＴＹ７２０）
であり、
更に特に好適な化合物は、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［1−メチル−５−（５−フェニルペンタノイル）ピロール−２−イル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（４−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３，４−ジメチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３−メチル−４−メトキシフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（３−メトキシ−４−メチルフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［５−（４−シアノフェニル）ペンタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メチル−４−メトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メトキシ−４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール及び
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−シアノフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール並びに、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオールであり、
更に好適には、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［1−メチル−５−（５−フェニルペンタノイル）ピロール−２−イル］ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メチル−４−メトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３−メトキシ−４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール及び
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−シアノフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール並びに、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオールである。

以下に一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体として好適な化合物の構造式を示す。

上記Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４及びＲ^５の定義における「Ｃ１−Ｃ６アルキル基」とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、２−メチルプロピル基、３−メチルプロピル基、２，２，２−トリメチルメチル基、ペンチル基又はヘキシル基であり得、好適には、メチル基、エチル基又はプロピル基であり、更に好適には、メチル基又はエチル基である。

上記Ｒ^４及びＲ^５の定義における「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子であり、好適には、フッ素原子又は塩素原子である。

上記Ｒ^４及びＲ^５の定義における「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基」とは、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、２−メチルプロポキシ基、３−メチルプロポキシ基、２，２，２−トリメチルメトキシ基、ペンチルオキシ基又はヘキシルオキシ基であり、好適には、メトキシ基又はエトキシ基である。

上記Ｒ^５の定義における、「Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基」とは、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基であり得、好適には、シクロプロピル基又はシクロヘキシル基である。

上記Ｒ^５の定義における、「ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基」とは、上記Ｃ１−Ｃ６アルキル基にハロゲン原子が置換した基であり、例えば、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、フルオロエチル基、ジフルオロエチル基、トリフルオロエチル基、フルオロプロピル基、ジフルオロプロピル基、トリフルオロプロピル基、フルオロブチル基、ジフルオロブチル基、トリフルオロブチル基、フルオロペンチル基、ジフルオロペンチル基、トリフルオロペンチル基、フルオロヘキシル基、ジフルオロヘキシル基、トリフルオロヘキシル基、ペンタフルオロエチル基、ヘキサフルオロプロピル基、ノナフルオロブチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、クロロエチル基、ジクロロエチル基、トリクロロエチル基、クロロプロピル基、ジクロロプロピル基、トリクロロプロピル基、クロロブチル基、ジクロロブチル基、トリクロロブチル基、クロロペンチル基、ジクロロペンチル基、トリクロロペンチル基、クロロヘキシル基、ジクロロヘキシル基、トリクロロヘキシル基、ペンタクロロエチル基、ヘキサクロロプロピル基、ノナクロロブチル基であり得、好適には、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、フルオロエチル基、ジフルオロエチル基、トリフルオロエチル基、フルオロプロピル基、ジフルオロプロピル基又はトリフルオロプロピル基であり、更に好適には、トリフルオロメチル基又はトリフルオロエチル基である。

上記Ｚの定義における「Ｃ１−Ｃ８アルキレン基」とは、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基又はオクタメチレン基であり得、好適には、炭素数２乃至８のアルキレン基であり、更に好適には、エチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基、ヘプタメチレン基又はオクタメチレン基である。

上記Ｚの定義における「フッ素原子で２乃至８個置換されたＣ１−Ｃ８アルキレン基」とは、例えば、ジフルオロメチレン基、１，１−ジフルオロエチレン基、１，１，２，２−テトラフルオロエチレン基、１，１−ジフルオロプロピレン基、１，１，２，２−テトラフルオロプロピレン基、１，１−ジフルオロテトラメチレン基、１，１，２，２−テトラフルオロテトラメチレン基、１，１−ジフルオロペンタメチレン基又は１，１，２，２−テトラフルオロペンタメチレン基であり得、好適には、１，１−ジフルオロプロピレン基、１，１，２，２−テトラフルオロプロピレン基、１，１−ジフルオロテトラメチレン基、１，１，２，２−テトラフルオロテトラメチレン基、１，１−ジフルオロペンタメチレン基又は１，１，２，２−テトラフルオロペンタメチレン基である。

上記における塩とは、上記一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体が、塩基性基としてアミノ基を有するため、酸と反応させることにより得られる塩であり、例えば、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；又は、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩であり得、好適には、塩酸塩、酢酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩又はマレイン酸塩である。

本発明における一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体及びその薬理上許容される塩は、その分子内に不斉炭素原子を有する場合には、光学異性体が存在する。一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体のうち不斉炭素原子を有する化合物は、単一の式、即ちＲ体として示されているが、製造方法等の都合により、Ｓ体が副生成物として混入する場合が考えられる。従って、そのような場合には、一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体は光学異性体として、主にＲ体を含有するものであるが、一部にＳ体を含有する混合物をも含むものである。

一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体及びその薬理上許容される塩は、大気中に放置したり、又は、再結晶をすることにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があり、そのような水和物も本発明の一般式（Ｉ）を有するアミノアルコール誘導体の薬理上許容される塩に包含される。

６．ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／またはヒトＦＮ３Ｋを用いた化合物（I）のリン酸エステルの製造方法
上記一般式（Ｉ）を有する化合物からヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋを用いて下記一般式（II）を有する化合物を製造することができる。

（式中Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｘ、Ｙ及びＺは前掲の化合物（Ｉ）と同じである。以下、一般式（ＩＩ）で表される化合物を「化合物（ＩＩ）」ともいう。）
化合物（Ｉ）並びに、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／またはヒトＦＮ３Ｋを接触させることによって上記化合物のリン酸エステルである化合物（ＩＩ）を製造することができる。

化合物（ＩＩ）の製造方法としては具体的には以下の方法を挙げることができるが化合物（ＩＩ）を製造できる限りにおいてこれらに限定されない。
（１）ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ
化合物（ＩＩ）の製造に用いることができるヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋは上記「４」の項目に記載した方法によって赤血球から取得したものを用いることができるし、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋを発現する細胞から取得したものを用いることもできる。ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰは精製したものを用いることもできるし、粗精製のもの、細胞抽出液そのままを用いることもできる。また、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋを発現する細胞をそのまま用いることもできる。
(2) 酵素反応
本発明の製造方法は、種々の態様で実施することができる。例えば、(ａ）ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰを発現する細胞に化合物（Ｉ）を接触させる、（ｂ）ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰを発現する細胞からの抽出物と化合物（Ｉ）を接触させる、（ｃ）精製又は粗精製ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰと化合物（Ｉ）を接触させる等の方法を挙げることができる。

なお、ヒトＦＮ３Ｋ及びヒトＦＮ３ＫＲＰによって化合物（Ｉ）から化合物（ＩＩ）を製造するに際しては、該酵素反応が起こるような条件とするのが望ましい。

酵素反応産物は酵素反応後に、酵素反応産物である化合物（ＩＩ）の生成量を測定することによって分析することができる。化合物（ＩＩ）の生成量は化合物(ＩＩ)の生成を測定できる限りにおいて特に制限はないが、例えば、反応産物をＨＰＬＣに供して、化合物（ＩＩ）のピークを測定することによって測定することができる。

また、酵素反応産物である化合物（ＩＩ）は反応系より精製することができる。

７．ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋによってリン酸化される物質のスクリーニング方法
以下の方法によってヒトＦＮ３ＫＲＰまたはヒトＦＮ３Ｋによってリン酸化される物質を同定することができる。本方法は以下の工程を含む。
１）
ｉ）ヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋを被験物質と接触させる工程；
ｉｉ）被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
ｉｉｉ）被験物質をヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋと接触させない場合に測定された、被験物質のリン酸エステルの量と上記ｉｉ）で測定されたリン酸エステルの生成量を比較する工程。

２）
ｉ）ヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋを被験物質と接触させる工程；
ｉｉ）被験物質のリン酸エステルの生成量を測定する工程；
ｉｉｉ）被験物質をヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋと接触させない場合に測定された、被験物質のリン酸エステルの量と上記ｉｉ）で測定されたリン酸エステルの生成量を比較する工程。
ｉｖ）被験物質をヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋと接触させない場合に測定された、リン酸エステルの量と比較して、上記ｉｉ）で測定されたリン酸エステルの量が多い場合に被験物質がリン酸化されたと判定する工程。
以下、各工程を説明する。

１）について
１）−ｉ）について
本工程で用いるヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋとしては特に制限はないが、ヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋを発現している細胞をそのまま用いることが出来るし、これらの細胞の破砕液、これらの細胞から粗精製したヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋ、精製したヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋを用いることも出来る。また、上記「４．ヒトＦＮ３Ｋ及びヒトＦＮ３ＫＲＰの発現」の項に記載の方法によって取得されたものを用いることも出来る。

被験物質としては、上記「５．リン酸化酵素によってリン酸化を受ける化合物」の項に記載した物質を用いることができるし、その他の化合物を用いることもできる。その他の化合物の例としては、一般式（Ｉ）を有する化合物以外の化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよく、個体、液体等適当な状態で投与することができ、適当なバッファーに溶解したり、安定化剤等を加えたりしてもよい。培養細胞を用いるスクリーニング方法の場合には、培地に添加して培養することができる。培地に添加する場合には培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても良く、また、添加の回数も１回に限らない。被験物質存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分乃至４８時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。また、投与から、検体を得るまでの時間は適当に選択することができる。

その他、反応液には、必要に応じ、ｐＨ調整のための緩衝液が添加され得る。

これらの材料を混合し、例えば以下に示す反応を行う。

温度条件：０℃〜４５℃、好適には３７℃
反応液のｐＨ：６〜９、好適には７．４
反応時間：３０秒〜２４時間、好適には３時間
反応は、例えば、３８４穴アッセイプレートを用いて行うことができる。

１）−ｉｉ）について
被験物質のリン酸エステルの量を測定する方法としては例えばHPLCを用いて生成物を分離定量する方法を挙げることができる。そのような方法としては例えば以下の方法を挙げることが出来るがこの方法に限定されない。
カラム：YMC−Pack ODS−A A−312（直径６．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、粒子径５μｍ、（株）ワイ・エム・シー）
移動相：４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
流速：1ｍＬ／分
溶出方法：イソクラティック溶出
カラム温度：４０℃
検出波長：２９５ｎｍ
１）−ｉｉｉ）について
被験物質をヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋと接触させない場合に測定された被験物質のリン酸エステルの量は、上記１）−ｉｉ）に記載した方法と同様の方法によって測定することが出来る。そして、ヒトＦＮ３ＫＲＰ又はヒトＦＮ３Ｋと接触させた場合と接触させない場合の被験物質のリン酸エステルの生成量を比較することが出来る。

２）について
２）−ｉ)乃至ｉｉｉ）について
これらの工程は上記１）−ｉ）乃至ｉｉｉ）と同様の方法によって行うことが出来る。
２）−ｉｖ） について
上記２）−ｉｉｉ)による比較の結果、上記ｉｉ）における被験物質のリン酸エステルの生成量がｉｉｉ）に比べて多い場合に被験物質がリン酸化されたと判定することが出来る。

８．リン酸化能を利用した患者の薬物代謝能を調べる方法
ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋは一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化して、一般式（ＩＩ）を有するリン酸エステルに変換する機能を有する。

以下の方法によって、一般式（Ｉ）を有する薬剤の患者における代謝能を調べることが出来る。
１）ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ遺伝子の発現量を指標とした方法
以下の工程ｉ)乃至ｉｉｉ)を含む：
ｉ）被験者より採取した検体より全ＲＮＡを抽出する工程；
ｉｉ）全RNAにおけるヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ遺伝子の発現量を測定する工程；
ｉｉｉ）ｉｉ)で測定されたヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ遺伝子の発現量と一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ遺伝子の発現量を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程。
２）ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋタンパク質の発現量を指標とした方法
以下の工程ｉ)乃至ｉｉ)を含む：
ｉ）被験者より採取した検体中におけるヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋタンパク質の発現量を該タンパク質に特異的に結合する抗体又はリガンドを用いて測定する工程；
ｉｉ)ｉ)で測定されたタンパク質の発現量と、一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋタンパク質の発現量を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程。
３）ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋタンパク質の酵素活性を指標とした方法
ｉ)被験者より採取した検体中におけるヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋタンパク質の酵素活性を測定する工程；
ｉｉ) ｉ)で測定されたタンパク質の酵素活性と、一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋタンパク質の酵素活性を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程。

４）遺伝子の変異を利用した方法
ｉ）被験者より採取した検体におけるヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ遺伝子におけるヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋのヌクレオチド配列を調べる工程；
ｉｉ）ｉ) ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ遺伝子における酵素活性に影響のあるヌクレオチド配列の変異の有無を調べる工程；
iii) ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ遺伝子の活性を低下させるヌクレオチド配列の変異がある被験者は一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能が低いと判定し、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及び／又はヒトＦＮ３Ｋ遺伝子の活性を低下させるヌクレオチド配列の変異がない被験者は一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を有すると判定する工程。

９．診断用キット
ヒトＦＮ３Ｋ及び／又はヒトＦＮ３ＫＲＰは生体内においてリン酸化されることによって活性を有する化合物のリン酸化能を有する。したがって、以下のキットを用いることで、被験者の薬物代謝能を調べることが出来る。該キットは具体的には以下のものである。

下記の１)乃至５）からなる群から選択される少なくとも１以上を含む薬物代謝能診断用キット
１）配列表の配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５から３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）上記１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたは上記２）に記載のポリヌクレオチドプローブのいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
４）下記のａ）乃至ｃ）から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検出するための抗体；
ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
５）上記４）に記載の抗体に結合する二次抗体。

ヒト血液中の各構成成分による化合物１のリン酸化 各分画における反応産物濃度 化合物１のリン酸化活性 （A）FTY720のリン酸化、（B）スフィンゴシンのリン酸化

以下実施例によって本発明を説明するが本発明は実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Molecular Cloning）」（Sambrook, J.,Fritsch, E.F.およびManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊、1989年）、その他の実験書に記載されている方法、及び当業者に知られている方法により行った。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施した。
（参考例）
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールの取得
以下の実験で用いる式（I）で示される、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オール（以下、「化合物１」ともいう。）は、例えば、国際公開第９４／０８９４３号パンフレット、国際公開第９６／０６０６８号パンフレット、国際公開第９８／４５２４９号パンフレット、国際公開第０３／０２９１８４号パンフレット、国際公開第０３／０２９２０５号パンフレット、国際公開第０２／０６２６８号パンフレット（実施例１９）、国際公開第０３／０５９８８０号パンフレット、国際公開第０５／００５３８３号パンフレット、国際公開第０５／０６３６７１号パンフレット等に記載する方法に従って製造することができる。

（Ｉ）（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オール（化合物１）

（実施例１）ヒト全血の調製
匿名化された２名の供血者から約100ｍＬずつ末梢血を採血し、抗凝固剤として３．２％（ｗ／ｖ）クエン酸３ナトリウム２水和物溶液をヒト末梢血１００ｍＬ当り約１１ｍＬ添加してヒト全血とし、常法に従って、全血から赤血球、血漿、血小板、リンパ球の各画分に分画した。

（実施例２）リン酸化活性の確認及びリン酸化活性の局在
実施例１で得た各種構成成分について化合物１に対するリン酸化活性を測定した。反応基質には化合物１を使用し、反応産物である化合物１のリン酸エステルである、リン酸 モノ（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブチル エステル（化合物１のリン酸エステル）の生成量を定量することによりリン酸化活性を測定した。

リン酸 モノ（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブチル エステル

１．５ｍＬ容ポリプロピレンチューブを１３本用意し、それぞれに実施例１で得た全血、血漿、赤血球、血小板、またはリンパ球を、全血、血漿、赤血球、血小板、リンパ球、赤血球＋血漿、血小板＋血漿、リンパ球＋血漿、赤血球＋血小板＋リンパ球＋血漿、赤血球＋血小板＋リンパ球、赤血球＋血小板＋血漿、赤血球＋リンパ球＋血漿、血小板＋リンパ球＋血漿の組み合わせで分注し氷冷した。何れのチューブの分注量も５００μＬとし、２種類以上の構成成分を混ぜる場合は、各々等量を混合した上で５００μＬとした。即ち２種類混合の場合は２５０μＬずつ、３種類混合の場合は１６６．７μＬずつ、四種類混合の場合は１２５μＬずつ分注し、総分注量を５００μＬとした。各チューブに１００ｍｇ／ｍＬ 化合物１／ジメチルスルホキシド溶液を０．５μＬ加えて混合（終濃度１００μｇ／ｍＬ）した後氷冷し、これを３７℃の湯浴中で３０分間インキュベーションした後、氷上に移した。各チューブに１ｍＬのメタノールを加えて混合後、ＨＰＬＣ測定時まで−２０℃で保存した。

反応産物であるリン酸 モノ（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブチル エステル（化合物１のリン酸エステル）の生成量は以下の装置及び条件下で測定した。
ＨＰＬＣ：ＬＣ−１０Ａ_ＶＰシステム（（株）島津製作所）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａ Ａ−３１２（直径６．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、粒子径５μｍ、（株）ワイ・エム・シー）
移動相：４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸
流速：１ｍＬ／分
溶出方法：イソクラティック溶出
カラム温度：４０℃
検出波長：２９５ｎｍ
保持時間：６．７分（化合物１のリン酸エステル）、１１．１分（化合物1）、１４．２分（１−ナフトール、内部標準物質）

反応終了後のチューブに１０μｇ／ｍＬの１−ナフトール／メタノール溶液を、終濃度２．５μｇ／ｍＬとなるように添加した後混合し、２１，６００×ｇ、３分間、４℃で遠心分離した。その上清３０μＬを上記ＨＰＬＣ装置にロードし、各保持時間に出現するピークのＡＵＣ値を測定した。化合物のＡＵＣ値を内部標準物質である１−ナフトールのＡＵＣ値で補正した後、別途作成した検量線に外挿して化合物の濃度を得た。

測定の結果、図１に示したように、反応系に赤血球が存在する場合に化合物１のリン酸エステルの生成量が多く、化合物１がリン酸化されていることが判明し、全血中の構成成分の内、赤血球が化合物１をリン酸化する主たる存在であることが明らかになった。

（実施例３）ヒト赤血球中における化合物１をリン酸化する酵素の局在
赤血球より常法に従って、可溶性画分と膜画分を分画した。実施例２と同様の方法で化合物１のリン酸化反応を調べたところ、図２に示すように、赤血球の可溶性画分に強いリン酸化活性が存在することが確認され、化合物１をリン酸化する酵素は主に赤血球の可溶性画分に存在することが明らかになった。

（実施例４）ヒト赤血球可溶性画分からの化合物１をリン酸化する酵素の精製（１）
以下の方法により、ヒト赤血球の可溶性画分から化合物１をリン酸化する酵素を精製した。
（１）酵素活性測定方法
酵素活性測定用の検体４５μＬに対して、それぞれ終濃度で１００μｇ／ｍＬ 化合物１、１ｍＭ ＡＴＰ、０．５％ ＣＨＡＰＳ及び１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ ７．０、総量７５μＬとなるように添加した。１−デオキシ−１−モルフォリノフルクトース（１−ｄｅｏｘｙ−１−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｆｒｕｃｔｏｓｅ；ＤＭＦ、シグマ社）を加える場合は終濃度で１ｍＭとなるように反応液に加えた。３７℃にて１時間保温することにより化合物１をリン酸化した後、１５０μＬのメタノールを添加し、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過することにより反応停止及び蛋白質除去を行った。１０μＬの濾液を逆相クロマトグラフィーカラム（ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−１００Ｓ、 直径４．６ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、東ソー社）に供し、流速１ｍＬ／分、カラム温度４０℃において０．１％ トリフルオロ酢酸を含む４０％ アセトニトリルによりイソクラティック溶出した。化合物１及び化合物１のリン酸エステルの検出は２９５ｎｍで行い、ピーク面積により化合物１のリン酸エステルの生成量を測定した。上記条件で１μｇ／ｍＬの化合物１のリン酸エステルを生成する活性を１Ｕ／ｍＬと定義した。以降の精製過程において、化合物１をリン酸化する酵素の活性の測定には本測定法を使用した。
（２）ヒト赤血球可溶性画分からの化合物１をリン酸化する酵素の精製
匿名化されたボランティア５名から各１００ｍＬずつ、計５００ｍＬ採血し、常法に従って調製した赤血球可溶性画分から、化合物１のリン酸化活性を指標に、硫酸アンモニウム塩析、疎水性相互作用カラム（HiTrap Phenyl HP 5ｍＬ、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）、色素結合アフィニティカラム（HiTrap Blue HP １ｍＬ、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）、陰イオン交換カラム（Resource Ｑ １ｍＬ、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）、陽イオン交換カラム（Resource Ｓ １ｍＬ、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）、陽イオン交換カラム（Mono Ｓ ＰＣ １．６／５、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）、及びゲル濾過カラム（Superdex 75 PC 3.2/30、GEヘルスケア バイオサイエンス社）によって精製した。その結果、ヒト赤血球可溶性画分中の化合物１のリン酸化活性は、表１に示した通り約10,000倍まで濃縮された。

（表1）

（実施例５）質量分析による化合物１をリン酸化する酵素の同定（１）
実施例４で得られた活性画分をSDS−PAGEに供し、SDS−PAGEゲル上の各バンドをゲルより切出し、常法に従い、トリプシン（モディファイドトリプシン、プロメガ社）を加え３７℃にて１２時間消化反応を行った。生成した消化ペプチドは液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／タンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）に供した。得られた質量スペクトルデータは、データベース検索ソフトウェア（Ｍａｓｃｏｔ、マトリクスサイエンス社）により解析した。データベースはNational Center for Biotechnology Informationにより編纂されたGenBank nrデータベースを用いた。

その結果、化合物１をリン酸化する酵素は、ヒト配列fructosamine-3-kinase（ＦＮ３Ｋ、GenBank accession number NP＿071441 ）であることが明らかになった。

（実施例６）ヒト赤血球可溶性画分からの化合物１をリン酸化する酵素の精製（２）
ヒトＦＮ３Ｋが化合物１をリン酸化する酵素であることを確認するために、ヒトＦＮ３Ｋの競合阻害剤として知られているDMF（Biochem. Ｊ．（2000）vol. 352，p.835−839）を用いた阻害実験を行った。実施例４における第２精製段階の疎水性相互作用カラムの活性分画はDMFにより顕著に阻害され、そのＩＣ_５０値は約１μＭであった。これにより、ヒトＦＮ３Ｋが化合物１をリン酸化する酵素であることが確認された。

一方、可溶性画分及び第１精製段階である硫酸アンモニウム沈殿を再可溶化したサンプルではDMFによる阻害はほとんど観察されず、ヒトＦＮ３Ｋとは異なる化合物１をリン酸化する酵素の存在もまた強く示唆された。ＤＭＦの阻害の程度から考えて、この、ヒトＦＮ３Ｋとは異なる酵素が、化合物１をリン酸化する主な酵素であると推定された。そこでこの酵素の精製を行った。

精製にあたっては常に１ｍＭ DMF存在下、非存在下で酵素活性測定を行い、DMFにより阻害されない活性を指標に精製を進めた。

実施例４で得た硫酸アンモニウム沈殿を陰イオン交換カラム（HiPrep Q 16／10 XL、ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）、色素結合アフィニティカラム（HiTrap Blue HP １ｍＬ）、陽イオン交換カラム（Mono S PC 1.6／5）、ゲル濾過カラム（Superdex 75 PC 3.2／30）により分画した。

以上５段階の精製過程を経た結果、表２に示すように、第２精製段階以降の酵素活性はＤＭＦにより阻害されず、最終的にこの精製法により化合物１をリン酸化する酵素の比活性は約１６，０００倍に上昇した。

（表2）

（実施例７）質量分析による化合物１をリン酸化する酵素の同定（２）
精製された活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して得られた33kDa付近のバンドを質量分析にかけてこのバンドの蛋白質の同定を行った。その結果、いずれのバンドもヒト配列hypothetical fructosamine kinase−like protein（ＦＮ３ＫＲＰ、GenBank のprotein databaseにAccession No. Q9HA64で登録されている。）と同一であることが確認された。

ヒトＦＮ３ＫＲＰの配列から予想された分子量は３５ｋＤａとＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定分子量（３３ｋＤａ）及びゲル濾過による推定分子量（２４−３８ｋＤａ）と一致した。

従って、本実施例により精製された化合物１をリン酸化する酵素はヒトＦＮ３ＫＲＰであることが明らかになった。
（実施例８）ヒトＦＮ３ＫＲＰ発現ベクターの構築
インビトロジェン社より購入したヒトＦＮ３ＫＲＰのｃＤＮＡクローン（クローンＩＤ：3351601）を制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで処理してｃＤＮＡを取り出し、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで処理したプラスミドベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｎｅｏ （インビトロジェン社）と結合した。結合反応産物であるプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を大量培養し、ヒトＦＮ３ＫＲＰのｃＤＮＡを含む発現プラスミドベクター、ｈＦＮ３ＫＲＰ／ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｎｅｏを得た。
（実施例９）ヒトＦＮ３Ｋ発現ベクターの構築
ゲートウエイテクノロジー（インビトロジェン社）を用いて、GeneCopoeia社より購入したヒトＦＮ３ＫのｃＤＮＡクローン（カタログNo. GC-W1392）から、哺乳類細胞用の発現プラスミドベクター、ｐｃＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴにｃＤＮＡを移し替えた。反応後のDNA溶液を用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。得られた形質転換体を大量培養し、ヒトＦＮ３ＫのｃＤＮＡを含む発現プラスミドベクター、hＦＮ３Ｋ／ｐｃＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴを得た。

（実施例１０）ヒトＦＮ３ＫＲＰ／ＦＮ３Ｋ発現ベクターの遺伝子導入及び一過的発現細胞からの細胞質画分の調製
ヒトＦＮ３ＫＲＰ及びヒトＦＮ３Ｋが実際に化合物１のリン酸化活性を有するか確認する為、両遺伝子の発現ベクターを培養細胞に導入して一過的に発現させ、その細胞質画分を調製した。

75ｃｍ^２培養フラスコ３枚にＨＥＫ２９３細胞を播種し、８０％コンフルエントとなるまで培養した。リポフェクタミンプラス試薬（インビトロジェン社）を用いて、フラスコごとにプラスミドＤＮＡなし、または４μｇのｈＦＮ３ＫＲＰ／pcDNA3.1（＋）neo、または４μｇのhＦＮ３Ｋ／ｐｃＤＮＡ３．２−ＤＥＳＴで遺伝子導入し、約２７時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、２．５ｍＬの細胞溶解液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ７．４、８０％（ｖ／ｖ） ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ（シグマ社）、１ｍＭ ジチオスレイトール、５０ｍＬ当り１個のプロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ロシュ社））を添加し、細胞が全て剥がれるまで４℃で強く振盪した。剥がれた細胞及び上清を回収し、２０，０００×ｇ、１５分間、４℃で超遠心分離した。上清を回収し、２００μＬずつ小分けして液体窒素中で凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。また上清の一部を取り蛋白質濃度を測定した。

（実施例１１）細胞質画分の化合物１をリン酸化する活性の測定
１．５ｍＬ容ポリプロピレンチューブに、以下の終濃度となるように各成分を添加し、総量を２５０μＬとして氷上に静置した（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ ＣＨＡＰＳ、１００μｇ／ｍＬ 化合物１、実施例１０で得た各々の細胞質画分：１８．２、５４．６、１６３．８μｇ相当量または無添加）。これを３７℃の湯浴中で３時間インキュベーションした後、氷上に移した。各チューブに０．５ｍＬのメタノールを加えて混合後、ＨＰＬＣ測定時まで−２０℃で保存した。

実施例２に従って化合物１のリン酸エステルの生成量を測定した結果、図３に示したように、ヒトＦＮ３ＫＲＰまたはヒトＦＮ３Ｋを発現させた細胞質画分を用いた場合のみ化合物１のリン酸エステルの生成が見られた。以上の結果より、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及びヒトＦＮ３Ｋが実際に化合物１をリン酸化する活性を有することが明らかとなった。
（実施例１２）ＦＴＹ７２０及びスフィンゴシンに対するリン酸化能の確認
スフィンゴシンキナーゼ１及び２は、生体内においてスフィンゴシンをスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に変換する酵素であるが、ＦＴＹ７２０をリン酸化してＦＴＹ７２０リン酸エステルを生成することが知られている

ＦＴＹ７２０

ＦＴＹ７２０リン酸エステル

（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （２００３） ｖｏｌ．２７８， ｐ．４７４０８−４７４１５）（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． （２００３） ｖｏｌ．５５４， ｐ．１８９−１９３）。そこで逆に、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及びヒトＦＮ３ＫがＦＴＹ７２０またはスフィンゴシンをリン酸化するか否かを検討した。

１．５ｍＬ容ポリプロピレンチューブを１８本用意し、それぞれに以下の終濃度となるように各成分を添加し、総量を２５０μＬとして氷上に静置した（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４、５ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ ＣＨＡＰＳ、１０μＭ ＦＴＹ７２０またはスフィンゴシン、実施例１０で得た各々の細胞質画分：９１μｇ相当量）。これを３７℃の湯浴中で３時間インキュベーションした後、氷上に移した。各チューブに０．５ｍＬのメタノールを加えて混合後、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定時まで−２０℃で保存した。

ＦＴＹ７２０リン酸エステルまたはＳ１Ｐの生成量を下記のＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムで分析した。

ＬＣシステム：
ＨＰＬＣ装置名：アジレント １１００シリーズ（アジレント テクノロジーズ社）
オートサンプラー名：ＨＴＣ ＰＡＬ（ＣＴＣ アナリティクス社）
ＭＳ／ＭＳシステム：
装置名：ＡＰＩ４０００（アプライド バイオシステムズ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ社）
その結果、ヒトＦＮ３ＫＲＰ及びヒトＦＮ３Ｋの両者共、ＦＴＹ７２０をわずかにリン酸化するが、スフィンゴシンに対するリン酸化能は有さないことが明らかとなった（図４）。よってヒトＦＮ３ＫＲＰ及びヒトＦＮ３Ｋは、化合物１及びＦＴＹ７２０をリン酸化する酵素であることが明らかになった。

（実施例１３）ヒトＦＮ３ＫＲＰ発現細胞質画分による化合物１及び化合物１の類縁体のリン酸化反応
実施例１０で調製したヒトＦＮ３ＫＲＰ発現細胞質画分を用いて、以下の化合物のリン酸化反応を行った。
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オール（化合物１）、
２−アミノ−２−［４−（３−ベンジルオキシフェニルチオ）−２−クロロフェニル］プロピル−１，３−プロパンジオール（ＲＯＸ−２１２７）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［1−メチル−５−（５−フェニルペンタノイル）ピロール−２−イル］ブタン−１−オール（化合物２）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール（化合物３）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛３−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール（化合物４）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛３−メチル−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール（化合物５）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛1−メチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール（化合物６）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛３−クロロ−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ブタン−１−オール（化合物７）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛１，３−ジメチル−５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール（化合物８）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛１−メチル−３−クロロ−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール（化合物９）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−｛１，３−ジメチル−５−［４−（３，４−ジメトキシフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ブタン−１−オール（化合物１０）、
２−アミノ−２−メチル−３−（４−ヘプタノイルフェノキシ）プロパン−１−オール（化合物１１）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−５−｛１−メチル−５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］ピロール−２−イル｝ペンタン−１−オール（化合物１２）、
（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−５−｛５−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イル｝ペンタン−１−オール（化合物１３）、
２−アミノ−２−メチル−３−｛４−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］フェニルメトキシ｝プロパン−１−オール（化合物１４）、
２−アミノ−２−メチル−３−｛２−クロロ−４−［４−（４−メチルフェニル）ブタノイル］フェニルメトキシ｝プロパン−１−オール（化合物１５）、
２−アミノ−２−メチル−３−｛５−［４−（３，４−ジメチルフェニル）ブタノイル］チオフェン−２−イルメトキシ｝プロパン−１−オール（化合物１６）
反応溶液：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４、５ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ ＣＨＡＰＳ、０．３２８ｍｇ／ｍＬ ヒトＦＮ３ＫＲＰ発現細胞質画分
反応容量：１００μＬ
反応基質：１００μＭ
反応条件：３７℃、３時間
反応終了後、メタノール２００μＬを加えて攪拌し、遠心分離（１６，０００×ｇ、１０分間、４℃）を行い、上清２０μＬをＨＰＬＣに供して以下に示す条件で分析を行った。

ＨＰＬＣ装置：ＨＰ１１００（アジレント・テクノロジーズ社）
カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ ＯＤＳ Ａ−３１２
カラム温度：４０℃
流速：１ｍＬ／分
移動相：３０％ アセトニトリル（０．１％ トリフルオロ酢酸）→
９０％ アセトニトリル（０．１％ トリフルオロ酢酸）
溶出方法：グラジエント溶出を実施。初期アセトニトリル濃度及びグラジエント勾配は化合物により変更した。典型的な方法は、
３０％ アセトニトリル（０．１％ トリフルオロ酢酸）→
９０％ アセトニトリル（０．１％ トリフルオロ酢酸）、
グラジエント勾配：２％アセトニトリル／分
検出波長：２９５ｎｍ 又は２５４ｎｍ 又は２３０ｎｍ
各化合物のリン酸化効率は、以下の式に示すようにリン酸エステル及び未反応基質のピーク面積を用いて算出した。

リン酸化効率（％）＝リン酸エステルのピーク面積／（リン酸エステルのピーク面積＋未反応基質のピーク面積）×１００
以上の測定の結果、ヒトＦＮ３ＫＲＰが種々の化合物をリン酸化する酵素であることが確認された（表３）。

（表３）

（実施例１４）ヒトＦＮ３Ｋ発現細胞質画分による、化合物１及び化合物１の類縁体のリン酸化反応
実施例１０で調製したヒトＦＮ３Ｋ発現細胞質画分を用いて、以下に示す条件で実施例1３と同じ化合物１及び化合物１の類縁体のリン酸化反応を行った。

反応溶液：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４、５ｍＭ 塩化マグネシウム、
５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ジチオスレイトール、０．５％ ＣＨＡＰＳ、
０．３ｍｇ／ｍＬ ヒトＦＮ３Ｋ発現細胞質画分
反応容量：１００μＬ
反応基質：１００μＭ
反応条件：３７℃、３時間
反応終了後、メタノール２００μＬを加えて攪拌し、遠心分離（１６，０００×ｇ、１０分間、４℃）を行い、上清２０μＬをＨＰＬＣに供して、実施例１３に示した条件で分析を行った。各類縁体のリン酸化効率は実施例１３に示した式を用いて算出した。

その結果、ヒトＦＮ３Ｋは化合物１及び化合物１の類縁体をリン酸化する酵素であることが確認された（表４）。

（表４）

（実施例１５）ラット赤血球による化合物１及び化合物１の類縁体のリン酸化反応
Ｗｉｓｔａｒ−Ｉｍａｍｉｃｈｉラット（財団法人動物繁殖研究所より購入）から実施例１と同様にして赤血球を調製し、以下に示す条件で実施例１３と同じ化合物１及び化合物１の類縁体のリン酸化反応を行った。

反応溶液：ラット赤血球
反応容量：５００μＬ
反応基質：１００μｇ／ｍＬ
反応条件：３７℃、３時間
反応終了後、メタノール１ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離（１６，０００×ｇ、５分間、４℃）を行った。上清を再度遠心分離し（１６，０００×ｇ、１０分間、４℃）、改めて得た上清２０μＬをＨＰＬＣに供して、実施例１３に示した条件で分析を行った。各類縁体のリン酸化効率は実施例１３に示した式を用いて算出した。

その結果、ラット赤血球は化合物１及びその類縁体をリン酸化することが明らかになった（表５）。

（表５）

以上、実施例１から実施例１５までの一連の実験により、ヒト赤血球中にはヒトＦＮ３ＫＲＰ及びヒトＦＮ３Ｋが存在すること、またそれらが化合物１、化合物１の類縁体及びＦＴＹ７２０をリン酸化する酵素であることが示された。

本発明により、例えば、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのような化合物を生体内でリン酸化する酵素を明らかにすることができ、該酵素を用いた該化合物のリン酸化方法を提供することができた。更にまた、該酵素によってリン酸化される物質のスクリーニング方法を提供することができた。更に、被験者の被験化合物のリン酸化能を判定する方法を提供することができた。また、本酵素のリン酸化能を指標にして被験者の薬物代謝能を判定する方法を提供した。

Claims (6)

1. 以下の工程１）及び２）を含む、リン酸エステルの製造方法。
   １）下記一般式（Ｉ）を有する化合物と以下のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリペプチドとを接触させる工程；
   ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
   ２）１）における反応溶液から一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを取得する工程
   

   

   ――――――――――――――――――――――――――
   （式中、Ｒ ^１ 及びＲ ^２ は、水素原子である。Ｒ ^３ は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基である。Ｒ ^４ は、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基である。Ｒ ^５ は、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、Ｘは、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基である。Ｙは、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基である。Ｚは、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基である。ｎは、２又は３である。）
2. 下記の工程１）乃至３）を含む、被験者の下記一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを生成する能力を判定する方法。
   １）被験者より採取した検体より全ＲＮＡを抽出する工程；
   ２）全ＲＮＡにおける、下記のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
   ａ) 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号６乃至９３５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
   ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号２７から９５６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
   c）上記ａ)又はｂ）に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
   ３）２）で測定されたポリヌクレオチドの発現量と一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリヌクレオチドの発現量を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程
   

   

   ――――――――――――――――――――――――――
   （式中、Ｒ ^１ 及びＲ ^２ は、水素原子である。Ｒ ^３ は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基である。Ｒ ^４ は、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基である。Ｒ ^５ は、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、Ｘは、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基である。Ｙは、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基である。Ｚは、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基である。ｎは、２又は３である。）
3. 下記の工程１）及び２）を含む、患者の下記一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを生成する能力を判定する方法。
   １）被験者より採取した検体における、下記のａ)乃至c)からなる群から選択されるポリペプチドの発現量を測定する工程；
   ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
   ２）１）で測定されたポリペプチドの発現量と一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリペプチドの発現量を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程
   

   

   ――――――――――――――――――――――――――
   （式中、Ｒ ^１ 及びＲ ^２ は、水素原子である。Ｒ ^３ は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基である。Ｒ ^４ は、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基である。Ｒ ^５ は、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、Ｘは、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基である。Ｙは、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基である。Ｚは、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基である。ｎは、２又は３である。）
4. 下記の工程１）及び２）を含む、患者の下記一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを生成する能力を判定する方法。
   １）被験者より採取した検体における、下記のａ)乃至ｃ)からなる群から選択されるポリペプチドの酵素活性を測定する工程；
   ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
   ２）１）で測定されたポリペプチドの酵素活性と一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有することが確認されている検体における、該ポリペプチドの酵素活性を比較し、被験者の一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を検定する工程
   

   

   ――――――――――――――――――――――――――
   （式中、Ｒ ^１ 及びＲ ^２ は、水素原子である。Ｒ ^３ は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基である。Ｒ ^４ は、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基である。Ｒ ^５ は、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、Ｘは、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基である。Ｙは、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基である。Ｚは、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基である。ｎは、２又は３である。）
5. 下記の工程１）乃至３）を含む、被験者の下記一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸エステルを生成する能力を判定する方法。
   １）被験者より採取した検体における以下のａ)乃至ｃ)からなる群から選択されるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を調べる工程；
   ａ) 配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１乃至１４６６に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
   ｂ）配列表の配列番号３のヌクレオチド番号１から１７８１に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド
   c）上記ａ)又はｂ）に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、一般式（Ｉ）を有する化合物を生体内でリン酸化する能力を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
   ２） 上記ポリヌクレオチドにおける酵素活性に影響のあるヌクレオチド配列の変異の有無を調べる工程；
   ３) 該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのリン酸化活性を低下させるヌクレオチド配列の変異がある被験者は一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能が低いと判定し、該ポリペプチドのリン酸化活性を低下させるヌクレオチド配列の変異がない被験者は一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能を有すると判定する工程
   

   

   ――――――――――――――――――――――――――
   （式中、Ｒ ^１ 及びＲ ^２ は、水素原子である。Ｒ ^３ は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基である。Ｒ ^４ は、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基である。Ｒ ^５ は、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、Ｘは、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基である。Ｙは、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基である。Ｚは、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基である。ｎは、２又は３である。）
6. 下記の１)乃至５）からなる群から選択される少なくとも１以上を含む下記一般式（Ｉ）を有する化合物のリン酸化能診断用キット。
   １）配列表の配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５から３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
   ２）配列表の配列番号１または３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
   ３）上記１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたは上記２）に記載のポリヌクレオチドプローブのいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
   ４）下記のａ)乃至c)から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検出するための抗体；
   ａ）配列表の配列番号２のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   ｂ）配列表の配列番号４のアミノ酸番号１乃至３０９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
   ｃ）上記ａ）又はｂ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−［５−（５−フェニルペンタノイル）チオフェン−２−イル］ブタン−１−オールのリン酸化能を有するポリペプチド；
   ５）上記４）に記載の抗体に結合する二次抗体
   

   

   ――――――――――――――――――――――――――
   （式中、Ｒ ^１ 及びＲ ^２ は、水素原子である。Ｒ ^３ は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基又はヒドロキシメチル基である。Ｒ ^４ は、水素原子、ハロゲン原子又はＣ１−Ｃ６アルキル基である。Ｒ ^５ は、水素原子、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ハロゲノＣ１−Ｃ６アルキル基、フェニル基及びベンジルオキシ基からなる群より選択される基で１乃至３個置換されたフェニル基、ハロゲン原子又は水素原子であり、Ｘは、ビニレン基（ＣＨ＝ＣＨ基）、酸素原子、硫黄原子又はメチルアミノ基である。Ｙは、単結合、酸素原子、硫黄原子又はカルボニル基である。Ｚは、単結合又はＣ１−Ｃ８アルキレン基である。ｎは、２又は３である。）

Images