JP4838961B2 - トランスポーター遺伝子ｏａｔｐ−ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、細胞外から細胞内へ、あるいは細胞内から細胞外への物質の輸送に関与するトランスポーターファミリーに関する。
背景技術
栄養素や内因性物質の細胞内への取り込み機構において、生体膜に存在する多種の輸送担体（トランスポーター）の関与と、その輸送機構が最近明らかになりつつある（Ｔｓｕｊｉ，Ａ．ａｎｄ Ｔａｍａｉ，Ｉ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１３，９６３−９７７，１９９６．）。これらのトランスポーターには、輸送される物質の構造認識能が備わっており、物質を選択的に輸送するが、比較的その構造認識が広いトランスポーターの場合、本来は生体異物である医薬品などについても誤認識し、積極的に細胞内へ輸送してしまうと考えられる。基本的に薬物の生体膜透過は、その分子サイズ、脂溶性、水素結合能などの物理化学的特性に依存する単純拡散に従っており、特にイオン性薬物の場合には、非解離型分子のみがｐＨ−分配仮説に従って生体膜を透過すると考えられていた。しかし、細胞内外の効率的な物質交換活性が必要な小腸、腎尿細管、胎盤、脳脈絡叢の上皮細胞や、肝実質細胞、血液脳関門などでは、多くの薬物は単純拡散以外の特異的機構、つまりトランスポーターによる能動的な輸送により細胞膜を透過することが明らかとなってきた（玉井郁巳、辻彰：ファルマシア、３１、４９３−４９７、１９９５．、齋藤秀之、乾賢一：医学のあゆみ、１７９、３９３−３９７、１９９６．、玉井郁巳：薬物動態、１１、６４２−６５０、１９９６．）。例えば、非エステル型の経口用β−ラクタム抗生物質は生理的ｐＨにおいては両性または負に荷電し、脂溶性は極めて低いにも関わらず、腸管からの吸収は良好であることが知られている。単離膜小胞系を用いた輸送研究により、これらの薬物の吸収過程には、刷子縁膜に局在するＨ＋駆動型ペプチドトランスポーターが関与していることが示されるようになった（Ｏｋａｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１４１３０−１４１３４，１９８６．）。ペプチド輸送系は、ジあるいはトリペプチドを認識するが、テトラペプチド以上は認識できず、ペプチドサイズについては極めて厳密であるものの、非天然のアミノ酸からなるペプチドは認識するといった比較的広い基質認識性を持つ。β−ラクタム抗生物質のペプチドトランスポーターによる輸送も、やはりこの広い基質認識性ゆえの誤認識による輸送であり、臨床的にはそれを図らずも利用していたことになる（Ｔｓｕｊｉ，Ａ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ｅｄｓ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｄ．，Ａｍｉｄｏｎ，Ｇ．Ｌ．），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１０１−１３４，１９９５．）。さらには、脂溶性の高い脂肪酸のような物質の生体膜透過においても、トランスポーターが関与している可能性が報告されている（Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊ．ａｎｄ Ｌｏｄｉｓｈ，Ｈ．，Ｃｅｌｌ，７９，４２７−４３６，１９９４．）。
ところで、様々なトランスポーターは各臓器、細胞が持つ生理的役割に応じて備わっているはずであり、その分布や機能には臓器特異性が期待される。従って、薬物動態に臓器選択性をもたらす手法としてトランスポーターを利用することが期待できる。すなわち、トランスポーターを利用した臓器特異的薬物デリバリー（ＤＤＳ）が可能であると考えられる。また、脂溶性をあげることによる単純拡散に頼った薬物の吸収性改善は、肝臓における初回通過効果を増大させたり、臓器移行性を非特異的に増大させる可能性が高い。しかし、トランスポーターの基質特異性を利用したドラッグデザインを行うことにより、脂溶性とは無関係に薬物の吸収性を高めることも可能であると考えられる（林喜代美 他：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ、１１、２０５−２１３、１９９６．）。このような目的のためには、多くのトランスポーターを分子レベルで同定し、その性質についての詳細な解析を行うことが必須であるが、トランスポーターはその生化学的な取り扱いの難しさと、機能測定の複雑さから、膜生理学的な研究の多さに比較し、分子レベルでの同定が非常に遅れている。
最近になり、外来遺伝子発現系であるアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞を用いた発現クローニング法によりいくつかのトランスポーターのｃＤＮＡがクローニングされるようになり、構造上の類似性が存在することが明らかになってきた（Ｆｅｉ，Ｙ．−Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，５６３−５６６，１９９４．）。例えば、１９９４年にＫｏｅｐｓｅｌｌらによって、基底膜型と推定される有機カチオントランスポーターＯＣＴ１が発現クローニング法によってクローニングされた（Ｇｒｕｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７２，５４９−５５２，１９９４．）。その後、ＯＣＴ１の配列をもとにしたホモロジークローニングによってＯＣＴ２が同定された（Ｏｋｕｄａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２４，５００−５０７，１９９６．）。ＯＣＴ１とＯＣＴ２はお互いに６７％という非常に高い相同性を示す（Ｇｒｕｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１０４０８−１０４１３，１９９７．）。両者とも腎臓に強い発現が見られるが、ＯＣＴ１の場合はそれ以外にも肝臓、結腸、小腸に発現が存在するのに対し、ＯＣＴ２は腎臓に特異的であり、組織分布も異なっている。
また、別のトランスポーターとしては、ヒトＯＡＴＰトランスポーター（以降、「ＯＡＴＰ−Ａ」と称する。Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０９（４），１２７４−１２８２（１９９５））が知られている。このトランスポーターはナトリウムイオン非依存的に様々な内因物質や外来異物を輸送する能力を持つタンパクである。ＯＡＴＰ−Ａによって輸送される物質にはブロモスルフォフタレイン（ｂｒｏｍｏｓｕｌｆｏｐｈｔｈａｌｅｉｎ）、胆汁酸、ステロイドホルモンなどがあることが知られている。また、プロスタグランジンを輸送する能力を持つＰＧＴもＯＡＴＰ−Ａに有意な相同性を示し、これらは遺伝子ファミリー（ＯＡＴＰファミリー）を形成していると考えられる。
トランスポーターについての分子レベルでの同定については、これら報告例を含めわずかであり、いまだ臨床上有用な多くの未知のトランスポーターが存在していると考えられる。
発明の開示
本発明は、ＯＡＴＰファミリーに属する新規なトランスポーター遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質、並びにそれらの用途を提供することを課題とする。
本発明者らは、新規トランスポーターをコードする遺伝子を見いだす目的で、ヒトＯＡＴＰトランスポーター（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０９（４），１２７４−１２８２（１９９５））（以下ＯＡＴＰ−Ａとする）の配列をクエリーとし、アメリカＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）のヒトＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）データベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）に対してｔＢＬＡＳＴｎサーチを試みた。その結果、ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を有するアミノ酸配列をコードし得るＥＳＴがいくつか見いだされた。次に、これらのＥＳＴの配列をクエリーとし再度データベースをサーチしたところ、既知であるヒトＯＡＴＰ−Ａ遺伝子、およびヒトプロスタグランジントランスポーター遺伝子（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８（５），１１４２−１１４９（１９９６））（以下ＰＧＴとする）由来のＥＳＴであると明らかに判定されるもの以外はいずれも未知の遺伝子由来でありることが明らかとなり、それらは未同定のトランスポーター遺伝子由来のＥＳＴであると考えられた。そこで、これらのＥＳＴの配列を用い、その全長ｃＤＮＡのクローニングを、ＰＣＲ法、およびプラークハイブリダイゼーション法によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより試みた。その結果、４つの新規なトランスポーター様タンパクをコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。これらの遺伝子がコードするタンパクはいずれもヒトＯＡＴＰ−Ａに有意な相同性を示すことから、これらの遺伝子をそれぞれＯＡＴＰ−Ｂ，Ｃ，Ｄ，およびＥと命名した。ｔＢＬＡＳＴｎサーチで見いだされていたＥＳＴは、全てヒトＯＡＴＰ−Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥおよびヒトＰＧＴ遺伝子由来のＥＳＴであることが判明した。
上述のように、ヒトＯＡＴＰ−Ａはナトリウムイオン非依存的に様々な内因物質や外来異物を輸送する能力を持つトランスポータータンパク質であり、ブロモスルフォフタレイン（ｂｒｏｍｏｓｕｌｆｏｐｈｔｈａｌｅｉｎ）、胆汁酸、ステロイドホルモンなどを輸送することが知られている。また、プロスタグランジンを輸送する能力を持つＰＧＴもＯＡＴＰ−Ａに有意な相同性を示す。これらのトランスポーター遺伝子は遺伝子ファミリー（ＯＡＴＰファミリー）を形成していると考えられ、生体にとって不要な物質の除去や、様々な物質の生体内濃度の調節などに関与している可能性が推測されている（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８ Ａｕｇ ２８；２７３（３５）：２２３９５−４０１）。
本発明において見いだされた新規ＯＡＴＰファミリーメンバーにおいても同様に、生体にとって必要な物質や、あるいは不要な物質の生体内濃度を調節する機能を持つことが推測される。また、本発明者らは、ＯＡＴＰ−Ｃが医薬品であるβラクタム系の抗生物質を輸送する能力を持つことを明らかにした。このことから、本来は生体外異物である薬物もＯＡＴＰファミリータンパク質によって細胞内へ取り込まれたり、あるいは排出されている可能性が推測される。従って、ＯＡＴＰファミリータンパク質の基質特異性などの輸送特性やその生体内分布を利用することにより、薬物動態を制御したり、より吸収性の高い薬物を迅速に設計、あるいはスクリーニングすることが可能であると考えられる。特に、ＲＴ−ＰＣＲ法による解析から、ＯＡＴＰ−Ｅは様々な固形癌細胞に高発現しているが、血球系細胞では極めて発現が少ないことが判明した。ＯＡＴＰ−Ｅ遺伝子を用いたスクリーニング系を構築し、これを用いたスクリーニングを行うことによりＯＡＴＰ−Ｅにより特異的に細胞内へ取り込まれる抗癌剤を得ることができれば、それは血球系細胞に対する障害が軽減された抗癌剤となり得ることが期待される。
また、ＯＡＴＰファミリータンパク質が薬物の生体内動態の制御に関与しているとすると、その遺伝的多型性により、薬物動態が変化することが予想される。既に、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）などの遺伝子多型により、遺伝子の発現量や、コードされるアミノ酸配列に個人差が生じることが知られている（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｊｕｌ；２２（３）：２３１−８；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｊｕｌ；２２（３）：２３９−４７）。ＯＡＴＰファミリー遺伝子における遺伝子多型により、輸送活性や基質特異性などの輸送特性に個人差が生じ、ひいてはＯＡＴＰファミリーによって制御されている薬物などの生体内動態に個人差が生じることが予想される。この様な個人差により、実際には、特定の薬物の有効性、反応性の差が生じることが推測される。よって、ＯＡＴＰファミリー遺伝子におけるＳＮＰなどの多型を詳細に調べ、遺伝型と表現形質（薬物に対する反応性）との関連に関する情報が蓄積されたならば、遺伝型を遺伝診断により調べることによって、その個人の薬物に対する反応性を推測することが可能になると考えられる。
実際、本発明者らは、ＯＡＴＰファミリー遺伝子のクローニング過程において、以下の３種のアミノ酸変化を伴うＳＮＰを健常人中に見いだした。
ＯＡＴＰ−Ｂ遺伝子４８６番目のコドンにおける多型（ｔｃｔ：Ｓｅｒ、あるいはｔｔｔ：ｐｈｅ）
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子１３０番目のコドンにおける多型（ａａｔ：Ａｓｎ、あるいはｇａｔ：Ａｓｐ）
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子１７４番目のコドンにおける多型（ｇｔｇ：Ｖａｌ、あるいはｇｃｇ：Ａｌａ）
これら以外にもＯＡＴＰファミリー遺伝子中に多型が存在し、表現形質と関連している可能性が推測される。
また、この様な生体内におけるＯＡＴＰファミリータンパク質の重要な役割を鑑みると、その遺伝子変異による輸送機能の欠損に起因する疾患が存在することが推測される。実際、有機カチオントランスポーターの一つであるＯＣＴＮ２トランスポーターにおいては、その遺伝子変異が全身性カルニチン欠乏症（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ；ＳＣＤ）の原因となっていることが明らかとなっており（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｊａｎ；２１（１）：９１−４）、トランスポーター遺伝子の変異に起因する遺伝性疾患が実際に存在することがわかっている。この様なトランスポーター遺伝子の変異に起因する遺伝性疾患については、その原因となるトランスポーター遣伝子を直接調べる遺伝子診断が臨床上非常に重要である。
本発明により明らかとなったＯＡＴＰファミリー遺伝子の構造を利用して、以上のようなＯＡＴＰファミリー遺伝子の多型や変異を検出する遺伝子診断を行うことが可能となった。具体的には、ＯＡＴＰファミリー遺伝子そのものを利用すること、あるいはその塩基配列から作製される合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーなどとして利用することにより遺伝子診断を実施することが可能である。また、最近ではＤＮＡチップ技術、あるいはＤＮＡアレイ技術と呼ばれる技術（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ ｖｏｌｕｍｅ ２１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｐｐ １−６０；Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ Ｊａｎ １；２８３（５３９８）：８３−７）により、遺伝子の構造や発現量をより簡便に検出することが可能になっている。これらの方法も、ＯＡＴＰファミリー遺伝子そのものを用いること、あるいはその塩基配列から作製される合成オリゴヌクレオチドを用いることにより実施することが可能である。
本発明は、新規なトランスポーターＯＡＴＰ−Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、およびその遺伝子、並びにそれらの用途に関し、より具体的には、
１． トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ。
２． 配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
３． （１）または（２）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
４． （１）若しくは（２）に記載のＤＮＡまたは（３）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
５． （１）または（２）に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド、
６． （４）に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（５）に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
７． （５）に記載のタンパク質に結合する抗体、
８． 配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
９． （５）に記載のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（５）に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、標識された披検化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された披検化合物を検出する工程、および（ｄ）該細胞内に取り込まれる化合物を選択する工程、を含む方法、
１０． （５）に記載のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（５）に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、被検化合物および（５）に記載のタンパク質により輸送される標識された有機化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された有機化合物の量を測定する工程、および
（ｄ）被検化合物非存在下において測定した場合（対照）と比較して、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する工程、を含む方法、を提供するものである。
本発明者等により単離された新規なヒトトランスポーター「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、および「ＯＡＴＰ−Ｅ」ｃＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号：１、３、５、および７に、また、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２、４、６、および８に示す。これらタンパク質は、ともにヒトＯＡＴＰ−Ａトランスポーターと構造上の類似性を有しており、互いにファミリー（「ＯＡＴＰ」ファミリー）を形成していると考えられる。
本発明のトランスポーターは、生体にとって必要な物質や不要な物質の生体内濃度を調節する機能を持つことが推測される。また、様々な薬物もＯＡＴＰファミリータンパク質によって細胞内へ取り込まれたり、あるいは排出されている可能性が推測される。従って、ＯＡＴＰファミリータンパク質を利用して薬物動態を制御したり、より吸収性の高い薬物を迅速に設計、あるいはスクリーニングすることが可能であると考えられる。
本発明のトランスポータータンパク質には、上記ヒトトランスポーター「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、および「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質の変異体が含まれる。「変異体」とは、配列番号：２、４、６、または８に記載の天然型の「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質のアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加、挿入などにより変異したアミノ酸配列を有するが、トランスポーター活性を有しているタンパク質を指す。タンパク質のアミノ酸の変異は人工的に行われたものでも、自然界において生じたものでもよい。
本発明において「トランスポーター活性を有する」とは、タンパク質が有機化合物を輸送する活性を有していることを指す。有機化合物としては、例えば、エストラジオール−１７Ｂ−グルクロナイド、エストロン−３−スルフェート、ベンジルペニシリン、プロスタグランジンＥ２などが挙げられるが、これらに制限されない。
また、「輸送する活性」には、細胞外から細胞内へ有機化合物を輸送する活性のみならず、細胞内から細胞外へ有機化合物を輸送する活性をも含む意である。本発明のトランスポータータンパク質には、これら活性の双方を有するものおよびいずれか一方を有するものが含まれる。タンパク質の有機化合物を輸送する活性は、例えば、標識した有機化合物を細胞に添加して、その取りこみまたは排出を検出することにより測定することができる。例えば、実施例記載の方法により検出することが可能である。
本発明者らは、ＯＡＴＰファミリー遺伝子のクローニング過程において、以下の３種のアミノ酸変化を伴うＳＮＰを健常人中に見いだした。
ＯＡＴＰ−Ｂ遺伝子４８６番目のコドンにおける多型（ｔｃｔ：Ｓｅｒ、あるいはｔｔｔ：Ｐｈｅ）
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子１３０番目のコドンにおける多型（ａａｔ：Ａｓｎ、あるいはｇａｔ：Ａｓｐ）
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子１７４番目のコドンにおける多型（ｇｔｇ：Ｖａｌ、あるいはｇｃｇ：Ａｌａ）
本発明のトランスポーターには、上記の変異を有するタンパク質、すなわち、配列番号：２の４８６位のアミノ酸がＰｈｅに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：４の１３０位のアミノ酸がＡｓｐに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号：４の１７４位のアミノ酸がＡｌａに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、および「ＯＡＴＰ−Ｅ」には、上記以外にも多型が存在していると考えられ、本発明には、これら「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、および「ＯＡＴＰ−Ｅ」の多型が含まれる。これらの多型は、トランスポーターの発現量または活性に影響を及ぼし、その表現形質と関連している可能性が推測される。、ＯＡＴＰファミリー遺伝子とその表現形質との関係がさらに明らかとなれば、ＯＡＴＰファミリー遺伝子の多型や変異を検出することにより遺伝子診断を行うことが可能となると考えられる。
人為的にアミノ酸を改変する場合、当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発システム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３５０−３６７）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６（１９８８））などが挙げられる。アミノ酸の変異数および変異部位は本発明のタンパク質のトランスポーター活性が保持される限り特に制限はない。変異数は、置換であれば、通常、１０アミノ酸以内であり、好ましくは６アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２、４、６、または８）に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明のヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質をコードするＤＮＡと他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、特に限定されない。
本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
また、本発明のトランスポータータンパク質には、上記ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質と構造上高い相同性を有し、トランスポーター活性を有するタンパク質が含まれる。このようなタンパク質としては、例えば、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質に対応する他の哺乳動物由来のタンパク質が含まれる。ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質と構造上高い相同性を有するタンパク質を単離するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）が挙げられる。即ち、上記ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１、３、５、もしくは７）またはその一部を基に、これと相同性の高い他の哺乳動物由来のＤＮＡを、ＤＮＡ同士の親和性を利用して単離し、単離したＤＮＡから目的のタンパク質を調製することができる。ＤＮＡの単離に用いる他の生物としては、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。このようなＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件（ストリンジェントな条件）の例を示せば、以下の如くである。即ち、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、３７℃から５５℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行う。
より好ましい条件（よりストリンジェントな条件）としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６０℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６０℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。
さらに好ましい条件（さらにストリンジェントな条件）としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術以外にも、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用した技術により、同様に、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」遺伝子と高い相同性を有する遺伝子を単離し、該遺伝子から目的のタンパク質を得ることが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応技術を利用して単離されるタンパク質は、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性は、アミノ酸レベルにおいて、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性である。配列の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質がトランスポーター活性を有している限り、本発明に含まれる。
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明のタンパク質をグルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなる部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の機能ドメインからなる部分ペプチドなどが挙げられる。また、疎水性プロット解析から推定される疎水性領域や親水性領域の１つあるいは複数の領域を含む部分ペプチドが挙げられる。これらの部分ペプチドは１つの疎水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよいし、１つの親水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよい。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、上述したような本発明のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏやｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明のタンパク質により治療可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１、３、５、または７）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のタンパク質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によってｃＤＮＡにした後、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１、３、５、または７）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、組織、臓器から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）にしたがい、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において１７９位の塩基Ａから２３０５位の塩基ＧからなるＤＮＡ、配列番号：３の塩基配列において１００位の塩基Ａから２１７２位の塩基ＴからなるＤＮＡ、配列番号：５の塩基配列において１位の塩基Ａから２１３０位の塩基ＡからなるＤＮＡ、および配列番号：７の塩基配列において９２位の塩基Ａから２２５７位の塩基ＣからなるＤＮＡを包含する。
また、本発明のＤＮＡは、配列番号：１の１７９位の塩基Ａから２３０５位の塩基Ｇの塩基配列において１６３５位のＣがＴに置換された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：３の１００位の塩基Ａから２１７２位の塩基Ｔの塩基配列において４８７位のＡがＧに置換された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：３の１００位の塩基Ａから２１７２位の塩基Ｔの塩基配列において６２０位のＴがＣに置換された塩基配列からなるＤＮＡを包含する。
本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１、３、５、または７に示す塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであり、トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。ハイブリダイゼーションの条件としては、上記の条件が挙げられる。ハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくは天然由来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡである。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明のトランスポーター遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のＤＮＡまたは本発明のベクターが導入された形質転換細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、常法、例えば、文献「Ｔｈｅ Ｑｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ」記載の方法を用いて行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ Ｋ．−Ｃ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明のタンパク質は、形質転換細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。 本発明は、また、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質であってもよいし、また、タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該形質転換細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のタンパク質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片あるいはＮ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明のタンパク質の検出又は測定方法を実施することができる。本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１、３、５、または７）またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなＤＮＡには、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、本発明のタンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム等）が含まれる。また、このようなＤＮＡは、ＤＮＡチップの作製に利用することもできる。
プライマーとして用いる場合、３’側の領域を相補的にして、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１、３、５、または７の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１、３、５、または７の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１、３、５、または７に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のタンパク質の産生細胞に作用して、該タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害し、従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を利用した、薬物の体内吸収、体内動態の制御が挙げられる。本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を詳細に解析することにより、このトランスポーターによって輸送され得る薬剤のドラッグデザインが可能であり、これにより本発明のトランスポータータンパク質を介して薬物の体内吸収を高めることができると考えられる。デザインされる薬物には従来の脂溶性をあげるような修飾は不要であるため、水溶性の扱いやすい薬物が迅速かつ効率的に開発できるようになると考えられる。また開発された薬物の吸収は基本的に本発明のトランスポータータンパク質の生体内分布に従うと考えられるため、臓器特異的な薬物の送達が可能である。特に本発明のトランスポータータンパク質の体内分布が、標的臓器と一致するような薬物の場合、理想的なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）となると考えられる。また、他のトランスポーターによる薬物の吸収を期待しているが、本発明のトランスポータータンパク質による吸収は望ましくない場合、本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を考慮に入れたドラッグデザインを行うことにより、他のトランスポータータンパク質に選択的な薬物の創造が行えると考えられる。例えば、ＯＡＴＰ−Ｅは様々な固形癌細胞に高発現しているが、血球系細胞では極めて発現が少ないことが判明した。ＯＡＴＰ−Ｅ遺伝子を用いたスクリーニング系を構築し、これを用いたスクリーニングを行うことによりＯＡＴＰ−Ｅにより特異的に細胞内へ取り込まれる抗癌剤を得ることができれば、それは血球系細胞に対する障害が軽減された抗癌剤となり得ることが期待される。
本発明のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物のスクリーニングは、例えば、以下のように行うことができる。まず、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する。例えば、本発明のタンパク質を発現するベクターを構築し、これを適当な細胞に導入すればよい。次いで、該細胞に対し、標識された被検化合物を接触させる。被検化合物としては、例えば、低分子化合物を用いることができる。被検化合物の標識としては、検出可能であれば特に制限はなく、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられる。次いで、該細胞内に取り込まれた、標識された被検化合物を検出する。検出は、放射標識化合物の場合は、液体シンチレーションカウンターなどによる放射活性の測定、蛍光標識化合物の場合は蛍光光度計などによる蛍光光度の測定により行うことができる。また、標識化合物を使わない場合においても、本発明のタンパク質により細胞内へ取り込まれた化合物の生物活性（例えば細胞毒性、細胞増殖促進活性）などを指標にしたバイオアッセイにより輸送量を測定することができる。次いで、上記検出の結果、該細胞内に取り込まれる化合物を選択する。具体的には、このスクリーニングは、例えば、実施例３に記載の輸送活性の検出系を利用して行うことができる。これにより単離された化合物は、上述した薬物の創造に利用することができる。
また、他の本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を標的とした薬物の開発が考えられる。栄養物質や薬物の吸収機構として、あるいは薬物や生体内代謝物の排泄機構としてのトランスポーターの重要性を考えると、その機能が損なわれること、または異常に亢進することに起因する疾患が存在すると考えられる。そのような疾患に対しては、本発明のトランスポータータンパク質の機能を阻害、あるいは亢進する化合物や、本発明のトランスポーター遺伝子の発現量や、タンパク量を調節するするような化合物を薬剤として用いると効果的であると考えられる。
本発明のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害する化合物のスクリーニングは、例えば、以下のように行うことができる。まず、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する。次いで、該細胞に対し、被検化合物および本発明のタンパク質により輸送される標識された有機化合物を接触させる。用いられる有機化合物としては、例えば、エストラジオール−１７Ｂ−グルクロナイド、エストロン−３−スルフェート、ベンジルペニシリン、プロスタグランジンＥ２などが挙げられるが、これらに制限されない。次いで、該細胞内に取り込まれた、標識された有機化合物の量を測定する。次いで、被検化合物非存在下において同様に測定した場合（対照）と比較して、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する。具体的には、このスクリーニングは、例えば、実施例３に記載の輸送活性の検出系を利用して行うことができる。この結果、被検化合物の接触により、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量が増加すれば、該化合物は本発明のタンパク質の有機化合物を輸送する活性を促進すると判定される。一方、被検化合物の接触により、該細胞内に取り込まれた標識された有機化合物の量が減少すれば、該化合物は本発明のタンパク質の有機化合物を輸送する活性を阻害すると判定される。
本発明のスクリーニングにより得られる化合物は、本発明タンパク質を利用した薬剤治療や、本発明のタンパク質による物質輸送の制御を介した治療などへの応用が考えられる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、その構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換してもよい。
本発明のタンパク質に結合する化合物や本発明のタンパク質およびその部分ペプチドをヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、タンパク質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患に対する遺伝子治療への応用も考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のＤＮＡをアデノウイルスベクター（例えば、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。また、アンチセンス合成ＤＮＡを生体内に直接、または上記ベクターに挿入して投与して治療を行うことも考えられる。また、本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患の診断への応用も考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。一般的な分子生物学的な実験操作に関しては、基本的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９８９）などの一般的な実験書に記載の方法に従った。
［実施例１］ ＯＡＴＰ−Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥ遺伝子の全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｃＤＮＡのクローニング
ＯＡＴＰ−Ｂ
ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るＥＳＴであるＷ１９５０４およびＡＩ０５２５０１の塩基配列をもとに、それぞれＯＡＢＥ−１プライマー（５’ｇａｔ ａａｇ ｃｔｔ ｃｔｇ ｔｇｔ ｇｇｃ ｃｃａ ａｇａ ａｇａ ａｃｔ ｇａｃ ３’／配列番号：９）およびＯＡＢＥ−６プライマー（５’ｇａｔ ａａｇ ｃｔｔ ｔａｃ ｔｇｃ ｔｇｔ ｇｇｃ ｔｇｃ ｔａｃ ｔｃｔ ｔｇｇ ３’／配列番号：１０）を作製した。これらのプライマーを用い、ヒト成体脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、全ＯＲＦを含むＯＡＴＰ−Ｂ ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲにより増幅したＯＡＴＰ−Ｂ ｃＤＮＡをプライマーに付加したＨｉｎｄ ＩＩＩサイトにより切断し、哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＨｉｎｄ ＩＩＩサイトに組み込んだ。複数のクローンをシークエンシングすることによりＰＣＲエラーの無いクローン（ｐｃＤＮＡ３／ＯＡＴＰ−Ｂ）を選択し、発現実験に用いた。
ＯＡＴＰ−Ｃ
ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得る以下のＥＳＴの塩基配列からそれぞれのプライマーを作製した。
ＥＳＴ Ｈ６２８９３；２８９３−４プライマー（５’ａａｇ ｃｔｔ ｃｃｇ ｔｃａ ａｔａ ａａａ ｃｃａ ａｃａ ３’／配列番号：１１）および２８９３−１プライマー（５’ｃｔｔ ｃｔｃ ｔｔｇ ｔｔｇ ｇｔｔ ｔｔａ ｔｔｇ ａｃｇ ３’／配列番号：１２）
ＥＳＴ Ｒ２９４１４；９４１４−２プライマー（５’ｔｇｔ ａａｇ ｔｔａ ｔｔｃ ｃａｔ ｔｇｔ ｔｔｃ ｃａｃ ３’／配列番号：１３）
ＥＳＴ Ｔ７３８６３；３８６３−１プライマー（５’ｔｔｇ ｇｔｇ ｃｔｔ ｔｔａ ｃｔｔ ａｔｇ ｔｃｔ ｔｃａ ３’／配列番号：１４）
これらのプライマーを用い、３つの断片に分けヒトＯＡＴＰ−Ｃのクローニングを行った。
５’側断片は、５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）法によりクローニングした。すなわち、ヒト胎児肝臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、キットに附属のリンカープライマーであるＡＰ１プライマーと２８９３−４プライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、ヒトＯＡＴＰ−Ｃ ｃＤＮＡの５’側断片、約４００ｂｐを増幅した。このｃＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＴＡクローニング法により組み込み、得られたサブクローンを複数シークエンシングすることによりヒトＯＡＴＰ−Ｃ ｃＤＮＡの５’側の配列を決定した。また、３’側も同様に３’ＲＡＣＥ法によりクローニングした。すなわち、ヒト胎児肝臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡを鋳型とし、キットに附属のリンカープライマーであるＡＰ１プライマーと３８６３−１プライマーとの組み合わせのＰＣＲによりヒトＯＡＴＰ−Ｃ ｃＤＮＡの３’側断片、約１．５ｋｂｐを増幅した。このｃＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターにＴＡクローニング法により組み込み、得られたサブクローンを複数シークエンシングすることによりヒトＯＡＴＰ−Ｃ ｃＤＮＡの３’側の配列を決定した。さらにこれらの間に挟まれる中央部は、ヒト成体肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型とし、２８９３−１プライマーと９４１４−２プライマーとの組み合わせによるＰＣＲにより増幅した。得られた役１．２ｋｂｐの断片をゲル濾過法により精製し、直接シークエンシングすることにより配列を決定した。この様にして得られた配列を組み合わせることにより、ヒトＯＡＴＰ−Ｃの全ＯＲＦを含むｃＤＮＡの配列を決定した。
発現用のプラスミドは以下のようにして構築した。すなわち、ヒト成体肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーの組み合わせによるＰＣＲによりヒトＯＡＴＰ−Ｃを２つの断片に分け増幅した。
５’側
ＯＡＨＣ１７プライマー（５’ｇａｔ ｇｇｔ ａｃｃ ａａａ ｃｔｇ ａｇｃ ａｔｃ ａａｃ ａａｃ ａａａ ａａｃ ３’／配列番号：１５）
ＯＡＨＣ１８プライマー（５’ｇａｔ ｇｇｔ ａｃｃ ｃａｔ ｃｇａ ｇａａ ｔｃａ ｇｔａ ｇｇａ ｇｔｔ ａｔｃ ３’／配列番号：１６）
３’側
ＯＡＨＣ２１プライマー（５’ｇａｔ ｇｇｔ ａｃｃ ｔａｃ ｃｃｔ ｇｇｇ ａｔｃ ｔｃｔ ｇｔｔ ｔｔｃ ｔａａ ３’／配列番号：１７）
ＯＡＨＣ２２プライマー（５’ｇａｔ ｇｇｔ ａｃｃ ｇｔｔ ｔｇｇ ａａａ ｃａｃ ａｇａ ａｇｃ ａｇａ ａｇｔ ３’／配列番号：１８）
これらの断片をそれぞれｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクターにサブクローニングし、ＰＣＲエラーのないクローンを選択した。重なり合う領域に存在するＢｇｌ ＩＩサイトで両者を連結した後、両端に存在するＫｐｎ Ｉサイトで切断し、ｐｃＤＮＡ３ベクターのＫｐｎ Ｉサイトに組み込み、発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３／ＯＡＴＰ−Ｃを得た。
ＯＡＴＰ−Ｄ
ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るＥＳＴ ＡＡ２８０２２４から０２２４−３プライマー（５’ｃｇｃ ｃｃｔ ｃｇｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｔｇａ ｔｇｔ ａｇｃ ３’／配列番号：１９）を作製した。さらに、ヒト第１５番染色体ｑ２６．１領域由来のＰＡＣクローン（ｐＤＪ４３０ｉ１９）の配列の一部もヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得ることを見いだした。この配列からＰＡＣ１５１−２プライマー（５’ｇｃｇ ｇｔｇ ｃｃｔ ｔａｃ ｔｃｔ ｔｃｔ ｔｃｔ ｃｔｔ ３’／配列番号：２０）を作製した。ヒト成体脳由来ｃＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いたＰＣＲを行ったところ約１．１ｋｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。これをプローブとし、ヒト成体腎臓由来５’−ＳＴＲＥＴＣＨ ＰＬＵＳ ｃＤＡＮライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対しプラークハイブリダイゼーション法によるスクリーニングを行った。得られたポジティブクローンのファージ懸濁液を鋳型とし、上記のプライマー、あるいは明らかになった配列から作製したＯＡＴＰ−Ｄ遺伝子特異的なプライマーと、λｇｔ−１０ベクターの配列から作製したＧＴ１０ Ｓ１プライマー（５’ｃｔｔ ｔｔｇ ａｇｃ ａａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ｃｔ ３’／配列番号：２１）、あるいはＧＴ１０ Ａ１プライマー（５’ａｇａ ｇｇｔ ｇｇｃ ｔｔａ ｔｇａ ｇｔａ ｔｔｔ ｃｔｔ ３’／配列番号：２２）との組み合わせによるＰＣＲを行い、増幅断片を直接シークエンシングすることにより配列を決定した。さらに、新たに得られた領域を含むＤＮＡ断片をプローブとして用いスクリーニングを行うことにより、ファージクローンによりカバーされる領域を延長していき、全ＯＲＦの配列を決定した。
ＯＡＴＰ−Ｅ
ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るＥＳＴ ＡＩ３４７１３０から、７１３０−１プライマー（５’ｔｇｔ ａｃａ ａｇｇ ｔｇｃ ｔｇｇ ｇｃｇ ｔｃｃ ｔｃｔ ３’／配列番号：２３）、および７１３０−４プライマー（５’ｃｇａ ｔｃｇ ｇｇｔ ａｔａ ａａａ ｃａｃ ａｔｔ ｃｔａ ３’／配列番号：２４）を作製した。ヒト成体肺由来ｃＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いたＰＣＲを行ったところ約４００ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。これをプローブとし、ヒト成体腎臓由来５’−ＳＴＲＥＴＣＨ ＰＬＵＳ ｃＤＡＮライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対しプラークハイブリダイゼーション法によるスクリーニングを行った。得られたポジティブクローンのファージ懸濁液を鋳型とし、上記のプライマー、あるいは明らかになった配列から作製したＯＡＴＰ−Ｅ遺伝子特異的なプライマーと、λｇｔ−１０ベクターの配列から作製したＧＴ１０ Ｓ１プライマー、あるいはＧＴ１０ Ａ１プライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、増幅断片を直接シークエンシングすることにより配列を決定した。さらに、新たに得られた領域を含むＤＮＡ断片をプローブとして用いスクリーニングを行うことにより、ファージクローンによりカバーされる領域を延長していき、全ＯＲＦの配列を決定した。
発現用のプラスミドは以下のようにして構築した。すなわち、以下のプライマーの組み合わせによるＰＣＲによりヒトＯＡＴＰ−Ｅを５’側および３’側の２つの断片に分け増幅した。５’側断片はヒト成体肺由来ｃＤＮＡを、また３’側断片はヒト胎児肺由来ｃＤＮＡを鋳型とし増幅した。
５’側
ＯＡＥ１７プライマー（５’ｇａｔ ａａｇ ｃｔｔ ｔｇｃ ｇｔｇ ｇｃｔ ｇａａ ｇｃｃ ｔｃｇ ａａｇ ｔｃａ ３’／配列番号：２５）
ＯＡＥ１８プライマー（５’ｇａｔ ｇｇａ ｔｃｃ ａｃｔ ｇｇｔ ｇｃａ ｔｔｔ ｃｃｇ ｃｃｇ ｃｔｃ ｔｃａ ３’／配列番号：２６）
３’側
ＯＡＥ２１プライマー（５’ｇａｔ ａａｇ ｃｔｔ ｔｃｔ ｔｃａ ｃｃｇ ｃｃｇ ｔｔｃ ｃｃａ ｔｃｃ ｔｔｇ ３’／配列番号：２７）
ＯＡＥ２２プライマー（５’ｇａｔ ｇｇａ ｔｃｃ ａｃｔ ｇｔｔ ｃｔｇ ｔｃａ ｔｃａ ｇｇａ ａａｔ ｇｃｔ ３’／配列番号：２８）
これらの断片をそれぞれｐｃＤＮＡ３ベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＢａｍＨ Ｉサイトにサブクローニングし、ＰＣＲエラーのないクローンを選択した。重なり合う領域に存在するＢｓｔＰ Ｉサイトで両者を連結し、発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３／ＯＡＴＰ−Ｅを得た。
ＰＣＲ
ＰＣＲは基本的に以下に示す条件を基本とし、適宜変更を加えて行った。
＜反応液組成＞
鋳型ＤＮＡ
１０ ｘ ＥｘＴａｑバッファー（ＴａＫａＲａ社）５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社）４μｌ
ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社）０．５μｌ
ＴａｑＳｔａｒｔＴＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．５μｌ
センスプライマー １０〜２０ｐｍｏｌ
アンチセンスプライマー １０〜２０ｐｍｏｌ
／全量５０μｌ
＜反応条件＞
一般的なＰＣＲ
９４℃、２分→（９４℃、３０秒→５５℃〜６２℃、３０秒→７２℃、２〜３分） ｘ２５〜４０サイクル→７２℃、１０分
ＲＡＣＥ法
９４℃、２分→（９４℃、３０秒→６８℃、４分） ｘ５サイクル→（９４℃、３０秒→６２℃、３０秒→７２℃、２分） ｘ３０サイクル→７２℃、１０分
ｃＤＮＡの合成
ＰＣＲの鋳型として用いるｃＤＮＡは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、メーカー推奨の一般的な方法に従って作製した。すなわち、１０μｇの全ＲＮＡ、あるいは２μｇのポリＡ＋ＲＮＡと、約１μｇのオリゴｄＴプライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、あるいは約０．５μｇのランダムヘキサマープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を混合し、７０℃で１０分加温した後氷冷した。これにｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ緩衝液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、終濃度１０ｍＭのＤＴＴ、終濃度０．５ｍＭのｄＮＴＰｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、および４００Ｕ〜８００ＵのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素を加え、４２℃で１時間保温することによりｃＤＮＡ合成を行った。次いで７０℃で１５分間加温し、その一部を鋳型として使用した。
ハイブリダイゼーション
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片、あるいはアガロース電気泳動後のゲルから精製したＤＮＡ断片などを、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ Ｇｏ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いたランダムプライマー法により［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルし、プローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用い、メーカー推奨の方法に従い、６８℃で２時間以上保温することにより行った。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２ ｘ ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ溶液中、室温で、２０分、２回洗浄し、次いで、０．１ Ｘ ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ溶液中、５０℃で、２０分、２回の洗浄を行った。
［実施例２］ ＲＴ−ＰＣＲ法による解析
以下に示すそれぞれの遺伝子に特異的なプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法による各遺伝子発現の組織分布の解析を行った。
ＯＡＴＰ−Ａ
ＯＡＡ−１プライマー（５’ａａｇ ａａｇ ａｇｇ ｔｃａ ａｇａ ａｇｇ ａａａ ａａｔ ３’／配列番号：２９）
ＯＡＡ−２プライマー（５’ｇｇａ ｇｃａ ｔｃａ ａｇｇ ａａｃ ａｇｔ ｃａｇ ｇｔｃ ３’／配列番号：３０）
ＯＡＴＰ−Ｂ
４７４２−１プライマー（５’ｃｇｔ ｇｃｇ ｇｃｃ ａａｇ ｔｇｔ ｇｔｔ ｃｃａ ｔａａ ３’／配列番号：３１）
４７４２−２プライマー（５’ｇａａ ｇｇａ ｇｔａ ｇｃｃ ｃｃａ ｔａｇ ｃｃａ ａｔｃ ３’／配列番号：３２）
ＯＡＴＰ−Ｃ
９４１４−１プライマー（５’ｔｇｔ ｃａｔ ｔｇｔ ｃｃｔ ｔｔｔ ａｃｃ ｔａｔ ｔａｔ ３’／配列番号：３３）
９４１４−２プライマー（前出 ５’ｔｇｔ ａａｇ ｔｔａ ｔｔｃ ｃａｔ ｔｇｔ ｔｔｃ ｃａｃ ３’／配列番号：１３）
ＯＡＴＰ−Ｄ
０２２４−２プライマー（５’ｃｔｃ ａａａ ｔｃｃ ｔｔｃ ｇｃｃ ｔｔｃ ａｔｃ ｃｔｇ ３’／配列番号：３４）
０２２４−４プライマー（５’ａｇｇ ｇｔｃ ａｇａ ｇｔａ ｇａｇ ｇｃａ ａａｇ ａａｃ ３’／配列番号：３５）
ＯＡＴＰ−Ｅ
７１３０−２プライマー（５’ｃａｃ ｇｇｃ ｇｇｇ ｃａｃ ｔｃａ ｇｃａ ｔｔｔ ｃｃｔ ３’／配列番号：３６）
７１３０−４プライマー（前出 ５’ｃｇａ ｔｃｇ ｇｇｔ ａｔａ ａａａ ｃａｃ ａｔｔ ｃｔａ ３’／配列番号：２４）
Ｇ３ＰＤＨ
Ｕｐｓｔｒｅａｍプライマー（５’ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ ３’／配列番号：３７）
Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍプライマー（５’ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ ３’／配列番号：３８）
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＴＣＴＭ）Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる、各種臓器、細胞由来のｃＤＮＡの適当量を鋳型として用い、上記プライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅産物をアガロース電気泳動し解析を行った（図１、図２）。ＯＡＴＰ−Ａは脳、肝臓に比較的局限した発現パターンを示した。また、ＯＡＴＰ−Ｃは胎児組織においても成体組織においても、肝臓に発現が局限していることが明らかとなった。ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅは比較的広範囲の組織において発現が見られたが、特に、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｅにおいては末梢血白血球や、胸腺、脾臓において発現が極めて低いことが明らかとなった。このことから、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｅは血球系細胞における発現が低いことが強く示唆される。一方、癌細胞における発現を調べたところ（図２）、ＯＡＴＰ−ＤおよびＯＡＴＰ−Ｅは癌細胞において高頻度で発現していることが明らかとなった。この結果から、ＯＡＴＰ−Ｅによって特異的に細胞に取り込まれる抗癌剤を作ることが可能であれば、それは造血細胞に対する副作用（骨髄抑制など）が軽減した抗癌剤となり得ることが期待される。
［実施例３］ トランスポート実験
ｐｃＤＮＡ３／ＯＡＴＰ−Ｃ、及びコントロールとしてインサートを含まないｐｃＤＮＡ３ベクター（モック）を、リン酸カルシウム法によりヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞に導入した。すなわち、プラスミドＤＮＡ１０μｇ、ヘペス緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース、２１ｍＭヘペスｐＨ７．１）１ｍｌ、２Ｍ ＣａＣｌ２６２．５μｌを混合し、３０分以上室温で静置する事によりリン酸カルシウム共沈物を生成させた。１０ｃｍプレート１枚あたり１．５ｘ１０６個の細胞を蒔き、２４時間培養した後、先のリン酸カルシウム共沈物を加え２４時間培養し、その後ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）でプレートを洗浄し、培地を加えさらに２４時間培養した。
プラスミドＤＮＡを導入した細胞を用いて以下の手順に従ってトランスポート実験を行った。プレートからラバーポリスマンを用いて細胞をはがし、トランスポート緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭ（＋）−グルコース、１．２ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭヘペスｐＨ７．４）に懸濁し、２０分間プレインキュベーションを行った。ついで各種基質のラベル体（［３Ｈ］メトトレキセート、［３Ｈ］ジゴキシン、［３Ｈ］ウワバイン、［３Ｈ］プロスタグランジンＥ２、［３Ｈ］エストラジオール−１７β−グルクロナイド、［３Ｈ］エストロン−３−スルフェート、［１４Ｃ］ＰＣＧ＜ベンジルペニシリン＞など）を適当量添加し、３７℃にて一定時間インキュベートを行った。これを、３Ｍ ＫＣｌ層の上にシリコンオイルと液体パラフィンの混合物（比重＝１．０２２）を重層して作製したシリコンレイヤー上に重層し、遠心する事により細胞を分離した。細胞の放射活性を測定し、細胞内へのトランスポート能とした。なおこの際、１ｘ１０６個の細胞を１ポイントとして用いた。
また、ＨＥＫ２９３細胞の培養は、ダルベッコＭＥＭ，１０％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を培地とし、５％二酸化炭素中、３７℃で行った。
ＯＡＴＰ−Ｃを発現させたＨＥＫ２９３細胞における輸送活性を測定したところ、エストラジオール−１７β−グルクロナイド、エストロン−３−スルフェート、ＰＣＧにおいて明らかな輸送が観察された。また、メトトレキセート、ウワバイン、プロスタグランジンＥ２においても弱い活性が観察された（図３）。
次に、ＯＡＴＰ−ＣのＰＣＧ輸送におけるＫｍ（ミカエリス定数）値を求めるために、様々な濃度の［１４Ｃ］ＰＣＧを加えた場合の取り込み量を測定した（図４）。ＯＡＴＰ−Ｃを発現させた細胞におけるＰＣＧの取り込み量をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ逆数プロットすることにより、Ｋｍ値は９８３±２８９μＭであることが求められた。また反応の最大速度Ｖｍａｘは５．４５±０．６３（ｎｍｏｌ／ｍｇ／１５ｍｉｎ）であることが求められた。
次に、ＯＡＴＰ−ＣによるＰＣＧの輸送に対する、各種βラクタム系抗生物質の影響を調べた（図５）。４μＭの［１４Ｃ］ＰＣＧに対して各種βラクタム系抗生物質を１ｍＭ添加してその輸送活性への影響を調べたところ、セファゾリン、セフォペラゾン、セフピラミド、ナフシリンにおいて顕著な阻害活性が観察された。また、セファロリジン、セファレキシンによっても弱い阻害活性が観察された。この結果より、これらのβラクタム系抗生物質も、同じβラクタム系抗生物質であるＰＣＧと同様に、ＯＡＴＰファミリータンパクにより輸送され得ることが強く示唆される。
次に、ＯＡＴＰ−Ｃによるエストラジオール−１７β−グルクロナイドの輸送におけるナトリウムイオン、および塩素イオンの要求性を調べた（図６）。トランスポート緩衝液におけるナトリウムイオンをＮ−メチルグルカミンに変更した場合においても、また、塩素イオンをグルコネートに変更した場合においても、エストラジオール−１７β−グルクロナイドの輸送は変化を受けなかった。このことから、ＯＡＴＰ−Ｃによる輸送はナトリウムイオン非依存的であることがわかった。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規なトランスポータータンパク質およびその遺伝子が提供された。これらは、本発明のトランスポータータンパク質を介して輸送される新規なデザインの薬物の開発や本発明のトランスポータータンパク質の発現異常や機能異常などに起因する疾患の治療薬の開発に利用することが可能である。さらには遺伝子診断などの診断や遺伝子治療への応用も考えられる。例えば、本発明のトランスポーター遺伝子のＳＮＰ診断などにより、薬物の有効性に関する個人差を考慮したテーラーメイドの治療計画が可能になる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒト胎児組織、および成体組織における各ＯＡＴＰファミリー遺伝子の発現を調べた結果を示す写真である。１．胎児脳、２．胎児心臓、３．胎児腎臓、４．胎児肝臓、５．胎児肺、６．胎児骨格筋、７．胎児脾臓、８．胎児胸腺、９．成体膵臓、１０．成体腎臓、１１．成体骨格筋、１２．成体肝臓、１３．成体肺、１４．成体胎盤、１５．成体脳、１６．成体心臓、１７．成体末梢血白血球、１８．成体大腸、１９．成体小腸、２０．成体卵巣、２１．成体精巣、２２．成体前立腺、２３．成体胸腺、２４．成体脾臓、２５．成体骨髄、２６．成体リンパ節、２７．成体扁桃腺。
図２は、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒト癌細胞における各ＯＡＴＰファミリー遺伝子の発現を調べた結果を示す写真である。１．乳癌細胞（ＧＩ−１０１）、２．肺癌細胞（ＬＸ−１）、３．大腸腺腫細胞（ＣＸ−１）、４．肺癌細胞（ＧＩ−１１７）、５．前立腺腫細胞（ＰＣ３）、６．大腸腺腫細胞（ＧＩ−１１２）、７．卵巣癌細胞（ＧＩ−１０２）、８．膵臓腺腫細胞（ＧＩ−１０３）。
図３は、各種ラベル体に対するトランスポート実験の結果を示す図である。ＯＡＴＰ−Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞（ＯＡＴＰ−Ｃ）、およびベクターのみを導入したＨＥＫ２９３細胞（モック）における各種ラベル体の輸送活性を表す。
図４は、ＯＡＴＰ−Ｃを発現させたＨＥＫ２９３細胞の各種濃度におけるＰＣＧの輸送活性を示す図である。
図５は、ＯＡＴＰ−Ｃを発現させたＨＥＫ２９３細胞のＰＣＧ輸送活性に対する各種βラクタム系抗生物質の影響を示す図である。コントロール（阻害剤無し）における活性を１００％として表してある。
図６は、エストラジオール−１７β−グルクロナイド輸送活性におけるナトリウムイオン、および塩素イオンの要求性を示す図である。「ＯＡＴＰ−Ｃ」はＯＡＴＰ−Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞、および「モック」はベクターのみを導入したＨＥＫ２９３細胞におけるエストラジオール−１７β−グルクロナイドの輸送活性をそれぞれ表す。
本発明は、細胞外から細胞内へ、あるいは細胞内から細胞外への物質の輸送に関与するトランスポーターファミリーに関する。
背景技術
栄養素や内因性物質の細胞内への取り込み機構において、生体膜に存在する多種の輸送担体（トランスポーター）の関与と、その輸送機構が最近明らかになりつつある（Ｔｓｕｊｉ，Ａ．ａｎｄ Ｔａｍａｉ，Ｉ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１３，９６３−９７７，１９９６．）。これらのトランスポーターには、輸送される物質の構造認識能が備わっており、物質を選択的に輸送するが、比較的その構造認識が広いトランスポーターの場合、本来は生体異物である医薬品などについても誤認識し、積極的に細胞内へ輸送してしまうと考えられる。基本的に薬物の生体膜透過は、その分子サイズ、脂溶性、水素結合能などの物理化学的特性に依存する単純拡散に従っており、特にイオン性薬物の場合には、非解離型分子のみがｐＨ−分配仮説に従って生体膜を透過すると考えられていた。しかし、細胞内外の効率的な物質交換活性が必要な小腸、腎尿細管、胎盤、脳脈絡叢の上皮細胞や、肝実質細胞、血液脳関門などでは、多くの薬物は単純拡散以外の特異的機構、つまりトランスポーターによる能動的な輸送により細胞膜を透過することが明らかとなってきた（玉井郁巳、辻彰：ファルマシア、３１、４９３−４９７、１９９５．、齋藤秀之、乾賢一：医学のあゆみ、１７９、３９３−３９７、１９９６．、玉井郁巳：薬物動態、１１、６４２−６５０、１９９６．）。例えば、非エステル型の経口用β−ラクタム抗生物質は生理的ｐＨにおいては両性または負に荷電し、脂溶性は極めて低いにも関わらず、腸管からの吸収は良好であることが知られている。単離膜小胞系を用いた輸送研究により、これらの薬物の吸収過程には、刷子縁膜に局在するＨ＋駆動型ペプチドトランスポーターが関与していることが示されるようになった（Ｏｋａｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１４１３０−１４１３４，１９８６．）。ペプチド輸送系は、ジあるいはトリペプチドを認識するが、テトラペプチド以上は認識できず、ペプチドサイズについては極めて厳密であるものの、非天然のアミノ酸からなるペプチドは認識するといった比較的広い基質認識性を持つ。β−ラクタム抗生物質のペプチドトランスポーターによる輸送も、やはりこの広い基質認識性ゆえの誤認識による輸送であり、臨床的にはそれを図らずも利用していたことになる（Ｔｓｕｊｉ，Ａ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ｅｄｓ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｄ．，Ａｍｉｄｏｎ，Ｇ．Ｌ．），Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１０１−１３４，１９９５．）。さらには、脂溶性の高い脂肪酸のような物質の生体膜透過においても、トランスポーターが関与している可能性が報告されている（Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊ．ａｎｄ Ｌｏｄｉｓｈ，Ｈ．，Ｃｅｌｌ，７９，４２７−４３６，１９９４．）。
ところで、様々なトランスポーターは各臓器、細胞が持つ生理的役割に応じて備わっているはずであり、その分布や機能には臓器特異性が期待される。従って、薬物動態に臓器選択性をもたらす手法としてトランスポーターを利用することが期待できる。すなわち、トランスポーターを利用した臓器特異的薬物デリバリー（ＤＤＳ）が可能であると考えられる。また、脂溶性をあげることによる単純拡散に頼った薬物の吸収性改善は、肝臓における初回通過効果を増大させたり、臓器移行性を非特異的に増大させる可能性が高い。しかし、トランスポーターの基質特異性を利用したドラッグデザインを行うことにより、脂溶性とは無関係に薬物の吸収性を高めることも可能であると考えられる（林喜代美 他：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ、１１、２０５−２１３、１９９６．）。このような目的のためには、多くのトランスポーターを分子レベルで同定し、その性質についての詳細な解析を行うことが必須であるが、トランスポーターはその生化学的な取り扱いの難しさと、機能測定の複雑さから、膜生理学的な研究の多さに比較し、分子レベルでの同定が非常に遅れている。
最近になり、外来遺伝子発現系であるアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞を用いた発現クローニング法によりいくつかのトランスポーターのｃＤＮＡがクローニングされるようになり、構造上の類似性が存在することが明らかになってきた（Ｆｅｉ，Ｙ．−Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，５６３−５６６，１９９４．）。例えば、１９９４年にＫｏｅｐｓｅｌｌらによって、基底膜型と推定される有機カチオントランスポーターＯＣＴ１が発現クローニング法によってクローニングされた（Ｇｒｕｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７２，５４９−５５２，１９９４．）。その後、ＯＣＴ１の配列をもとにしたホモロジークローニングによってＯＣＴ２が同定された（Ｏｋｕｄａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２４，５００−５０７，１９９６．）。ＯＣＴ１とＯＣＴ２はお互いに６７％という非常に高い相同性を示す（Ｇｒｕｎｄｅｍａｎｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１０４０８−１０４１３，１９９７．）。両者とも腎臓に強い発現が見られるが、ＯＣＴ１の場合はそれ以外にも肝臓、結腸、小腸に発現が存在するのに対し、ＯＣＴ２は腎臓に特異的であり、組織分布も異なっている。
また、別のトランスポーターとしては、ヒトＯＡＴＰトランスポーター（以降、「ＯＡＴＰ−Ａ」と称する。Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０９（４），１２７４−１２８２（１９９５））が知られている。このトランスポーターはナトリウムイオン非依存的に様々な内因物質や外来異物を輸送する能力を持つタンパクである。ＯＡＴＰ−Ａによって輸送される物質にはブロモスルフォフタレイン（ｂｒｏｍｏｓｕｌｆｏｐｈｔｈａｌｅｉｎ）、胆汁酸、ステロイドホルモンなどがあることが知られている。また、プロスタグランジンを輸送する能力を持つＰＧＴもＯＡＴＰ−Ａに有意な相同性を示し、これらは遺伝子ファミリー（ＯＡＴＰファミリー）を形成していると考えられる。
トランスポーターについての分子レベルでの同定については、これら報告例を含めわずかであり、いまだ臨床上有用な多くの未知のトランスポーターが存在していると考えられる。
発明の開示
本発明は、ＯＡＴＰファミリーに属する新規なトランスポーター遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質、並びにそれらの用途を提供することを課題とする。
本発明者らは、新規トランスポーターをコードする遺伝子を見いだす目的で、ヒトＯＡＴＰトランスポーター（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０９（４），１２７４−１２８２（１９９５））（以下ＯＡＴＰ−Ａとする）の配列をクエリーとし、アメリカＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）のヒトＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）データベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）に対してｔＢＬＡＳＴｎサーチを試みた。その結果、ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を有するアミノ酸配列をコードし得るＥＳＴがいくつか見いだされた。次に、これらのＥＳＴの配列をクエリーとし再度データベースをサーチしたところ、既知であるヒトＯＡＴＰ−Ａ遺伝子、およびヒトプロスタグランジントランスポーター遺伝子（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８（５），１１４２−１１４９（１９９６））（以下ＰＧＴとする）由来のＥＳＴであると明らかに判定されるもの以外はいずれも未知の遺伝子由来でありることが明らかとなり、それらは未同定のトランスポーター遺伝子由来のＥＳＴであると考えられた。そこで、これらのＥＳＴの配列を用い、その全長ｃＤＮＡのクローニングを、ＰＣＲ法、およびプラークハイブリダイゼーション法によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより試みた。その結果、４つの新規なトランスポーター様タンパクをコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。これらの遺伝子がコードするタンパクはいずれもヒトＯＡＴＰ−Ａに有意な相同性を示すことから、これらの遺伝子をそれぞれＯＡＴＰ−Ｂ，Ｃ，Ｄ，およびＥと命名した。ｔＢＬＡＳＴｎサーチで見いだされていたＥＳＴは、全てヒトＯＡＴＰ−Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥおよびヒトＰＧＴ遺伝子由来のＥＳＴであることが判明した。
上述のように、ヒトＯＡＴＰ−Ａはナトリウムイオン非依存的に様々な内因物質や外来異物を輸送する能力を持つトランスポータータンパク質であり、ブロモスルフォフタレイン（ｂｒｏｍｏｓｕｌｆｏｐｈｔｈａｌｅｉｎ）、胆汁酸、ステロイドホルモンなどを輸送することが知られている。また、プロスタグランジンを輸送する能力を持つＰＧＴもＯＡＴＰ−Ａに有意な相同性を示す。これらのトランスポーター遺伝子は遺伝子ファミリー（ＯＡＴＰファミリー）を形成していると考えられ、生体にとって不要な物質の除去や、様々な物質の生体内濃度の調節などに関与している可能性が推測されている（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８ Ａｕｇ ２８；２７３（３５）：２２３９５−４０１）。
本発明において見いだされた新規ＯＡＴＰファミリーメンバーにおいても同様に、生体にとって必要な物質や、あるいは不要な物質の生体内濃度を調節する機能を持つことが推測される。また、本発明者らは、ＯＡＴＰ−Ｃが医薬品であるβラクタム系の抗生物質を輸送する能力を持つことを明らかにした。このことから、本来は生体外異物である薬物もＯＡＴＰファミリータンパク質によって細胞内へ取り込まれたり、あるいは排出されている可能性が推測される。従って、ＯＡＴＰファミリータンパク質の基質特異性などの輸送特性やその生体内分布を利用することにより、薬物動態を制御したり、より吸収性の高い薬物を迅速に設計、あるいはスクリーニングすることが可能であると考えられる。特に、ＲＴ−ＰＣＲ法による解析から、ＯＡＴＰ−Ｅは様々な固形癌細胞に高発現しているが、血球系細胞では極めて発現が少ないことが判明した。ＯＡＴＰ−Ｅ遺伝子を用いたスクリーニング系を構築し、これを用いたスクリーニングを行うことによりＯＡＴＰ−Ｅにより特異的に細胞内へ取り込まれる抗癌剤を得ることができれば、それは血球系細胞に対する障害が軽減された抗癌剤となり得ることが期待される。
また、ＯＡＴＰファミリータンパク質が薬物の生体内動態の制御に関与しているとすると、その遺伝的多型性により、薬物動態が変化することが予想される。既に、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）などの遺伝子多型により、遺伝子の発現量や、コードされるアミノ酸配列に個人差が生じることが知られている（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｊｕｌ；２２（３）：２３１−８；Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｊｕｌ；２２（３）：２３９−４７）。ＯＡＴＰファミリー遺伝子における遺伝子多型により、輸送活性や基質特異性などの輸送特性に個人差が生じ、ひいてはＯＡＴＰファミリーによって制御されている薬物などの生体内動態に個人差が生じることが予想される。この様な個人差により、実際には、特定の薬物の有効性、反応性の差が生じることが推測される。よって、ＯＡＴＰファミリー遺伝子におけるＳＮＰなどの多型を詳細に調べ、遺伝型と表現形質（薬物に対する反応性）との関連に関する情報が蓄積されたならば、遺伝型を遺伝診断により調べることによって、その個人の薬物に対する反応性を推測することが可能になると考えられる。
実際、本発明者らは、ＯＡＴＰファミリー遺伝子のクローニング過程において、以下の３種のアミノ酸変化を伴うＳＮＰを健常人中に見いだした。
ＯＡＴＰ−Ｂ遺伝子４８６番目のコドンにおける多型（ｔｃｔ：Ｓｅｒ、あるいはｔｔｔ：ｐｈｅ）
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子１３０番目のコドンにおける多型（ａａｔ：Ａｓｎ、あるいはｇａｔ：Ａｓｐ）
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子１７４番目のコドンにおける多型（ｇｔｇ：Ｖａｌ、あるいはｇｃｇ：Ａｌａ）
これら以外にもＯＡＴＰファミリー遺伝子中に多型が存在し、表現形質と関連している可能性が推測される。
また、この様な生体内におけるＯＡＴＰファミリータンパク質の重要な役割を鑑みると、その遺伝子変異による輸送機能の欠損に起因する疾患が存在することが推測される。実際、有機カチオントランスポーターの一つであるＯＣＴＮ２トランスポーターにおいては、その遺伝子変異が全身性カルニチン欠乏症（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ；ＳＣＤ）の原因となっていることが明らかとなっており（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ Ｊａｎ；２１（１）：９１−４）、トランスポーター遺伝子の変異に起因する遺伝性疾患が実際に存在することがわかっている。この様なトランスポーター遺伝子の変異に起因する遺伝性疾患については、その原因となるトランスポーター遣伝子を直接調べる遺伝子診断が臨床上非常に重要である。
本発明により明らかとなったＯＡＴＰファミリー遺伝子の構造を利用して、以上のようなＯＡＴＰファミリー遺伝子の多型や変異を検出する遺伝子診断を行うことが可能となった。具体的には、ＯＡＴＰファミリー遺伝子そのものを利用すること、あるいはその塩基配列から作製される合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲのプライマーなどとして利用することにより遺伝子診断を実施することが可能である。また、最近ではＤＮＡチップ技術、あるいはＤＮＡアレイ技術と呼ばれる技術（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９９ ｖｏｌｕｍｅ ２１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｐｐ １−６０；Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９ Ｊａｎ １；２８３（５３９８）：８３−７）により、遺伝子の構造や発現量をより簡便に検出することが可能になっている。これらの方法も、ＯＡＴＰファミリー遺伝子そのものを用いること、あるいはその塩基配列から作製される合成オリゴヌクレオチドを用いることにより実施することが可能である。
本発明は、新規なトランスポーターＯＡＴＰ−Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ、およびその遺伝子、並びにそれらの用途に関し、より具体的には、
１． トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ。
２． 配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
３． （１）または（２）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
４． （１）若しくは（２）に記載のＤＮＡまたは（３）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
５． （１）または（２）に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド、
６． （４）に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（５）に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
７． （５）に記載のタンパク質に結合する抗体、
８． 配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
９． （５）に記載のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（５）に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、標識された披検化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された披検化合物を検出する工程、および（ｄ）該細胞内に取り込まれる化合物を選択する工程、を含む方法、
１０． （５）に記載のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（５）に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、被検化合物および（５）に記載のタンパク質により輸送される標識された有機化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された有機化合物の量を測定する工程、および
（ｄ）被検化合物非存在下において測定した場合（対照）と比較して、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する工程、を含む方法、を提供するものである。
本発明者等により単離された新規なヒトトランスポーター「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、および「ＯＡＴＰ−Ｅ」ｃＤＮＡの塩基配列をそれぞれ配列番号：１、３、５、および７に、また、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２、４、６、および８に示す。これらタンパク質は、ともにヒトＯＡＴＰ−Ａトランスポーターと構造上の類似性を有しており、互いにファミリー（「ＯＡＴＰ」ファミリー）を形成していると考えられる。
本発明のトランスポーターは、生体にとって必要な物質や不要な物質の生体内濃度を調節する機能を持つことが推測される。また、様々な薬物もＯＡＴＰファミリータンパク質によって細胞内へ取り込まれたり、あるいは排出されている可能性が推測される。従って、ＯＡＴＰファミリータンパク質を利用して薬物動態を制御したり、より吸収性の高い薬物を迅速に設計、あるいはスクリーニングすることが可能であると考えられる。
本発明のトランスポータータンパク質には、上記ヒトトランスポーター「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、および「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質の変異体が含まれる。「変異体」とは、配列番号：２、４、６、または８に記載の天然型の「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質のアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加、挿入などにより変異したアミノ酸配列を有するが、トランスポーター活性を有しているタンパク質を指す。タンパク質のアミノ酸の変異は人工的に行われたものでも、自然界において生じたものでもよい。
本発明において「トランスポーター活性を有する」とは、タンパク質が有機化合物を輸送する活性を有していることを指す。有機化合物としては、例えば、エストラジオール−１７Ｂ−グルクロナイド、エストロン−３−スルフェート、ベンジルペニシリン、プロスタグランジンＥ２などが挙げられるが、これらに制限されない。
また、「輸送する活性」には、細胞外から細胞内へ有機化合物を輸送する活性のみならず、細胞内から細胞外へ有機化合物を輸送する活性をも含む意である。本発明のトランスポータータンパク質には、これら活性の双方を有するものおよびいずれか一方を有するものが含まれる。タンパク質の有機化合物を輸送する活性は、例えば、標識した有機化合物を細胞に添加して、その取りこみまたは排出を検出することにより測定することができる。例えば、実施例記載の方法により検出することが可能である。
本発明者らは、ＯＡＴＰファミリー遺伝子のクローニング過程において、以下の３種のアミノ酸変化を伴うＳＮＰを健常人中に見いだした。
ＯＡＴＰ−Ｂ遺伝子４８６番目のコドンにおける多型（ｔｃｔ：Ｓｅｒ、あるいはｔｔｔ：Ｐｈｅ）
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子１３０番目のコドンにおける多型（ａａｔ：Ａｓｎ、あるいはｇａｔ：Ａｓｐ）
ＯＡＴＰ−Ｃ遺伝子１７４番目のコドンにおける多型（ｇｔｇ：Ｖａｌ、あるいはｇｃｇ：Ａｌａ）
本発明のトランスポーターには、上記の変異を有するタンパク質、すなわち、配列番号：２の４８６位のアミノ酸がＰｈｅに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：４の１３０位のアミノ酸がＡｓｐに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号：４の１７４位のアミノ酸がＡｌａに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、および「ＯＡＴＰ−Ｅ」には、上記以外にも多型が存在していると考えられ、本発明には、これら「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、および「ＯＡＴＰ−Ｅ」の多型が含まれる。これらの多型は、トランスポーターの発現量または活性に影響を及ぼし、その表現形質と関連している可能性が推測される。、ＯＡＴＰファミリー遺伝子とその表現形質との関係がさらに明らかとなれば、ＯＡＴＰファミリー遺伝子の多型や変異を検出することにより遺伝子診断を行うことが可能となると考えられる。
人為的にアミノ酸を改変する場合、当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、ＰＣＲによる部位特異的変異誘発システム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３５０−３６７）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６（１９８８））などが挙げられる。アミノ酸の変異数および変異部位は本発明のタンパク質のトランスポーター活性が保持される限り特に制限はない。変異数は、置換であれば、通常、１０アミノ酸以内であり、好ましくは６アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内であると考えられる。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２、４、６、または８）に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明のヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質をコードするＤＮＡと他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、特に限定されない。
本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
また、本発明のトランスポータータンパク質には、上記ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質と構造上高い相同性を有し、トランスポーター活性を有するタンパク質が含まれる。このようなタンパク質としては、例えば、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質に対応する他の哺乳動物由来のタンパク質が含まれる。ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質と構造上高い相同性を有するタンパク質を単離するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）が挙げられる。即ち、上記ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１、３、５、もしくは７）またはその一部を基に、これと相同性の高い他の哺乳動物由来のＤＮＡを、ＤＮＡ同士の親和性を利用して単離し、単離したＤＮＡから目的のタンパク質を調製することができる。ＤＮＡの単離に用いる他の生物としては、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。このようなＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件（ストリンジェントな条件）の例を示せば、以下の如くである。即ち、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、３７℃から５５℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行う。
より好ましい条件（よりストリンジェントな条件）としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６０℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６０℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。
さらに好ましい条件（さらにストリンジェントな条件）としては、「ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用い、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術以外にも、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用した技術により、同様に、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」遺伝子と高い相同性を有する遺伝子を単離し、該遺伝子から目的のタンパク質を得ることが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応技術を利用して単離されるタンパク質は、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性は、アミノ酸レベルにおいて、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性である。配列の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質がトランスポーター活性を有している限り、本発明に含まれる。
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明のタンパク質をグルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなる部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の機能ドメインからなる部分ペプチドなどが挙げられる。また、疎水性プロット解析から推定される疎水性領域や親水性領域の１つあるいは複数の領域を含む部分ペプチドが挙げられる。これらの部分ペプチドは１つの疎水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよいし、１つの親水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよい。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、上述したような本発明のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏやｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明のタンパク質により治療可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１、３、５、または７）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のタンパク質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によってｃＤＮＡにした後、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１、３、５、または７）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、組織、臓器から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）にしたがい、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において１７９位の塩基Ａから２３０５位の塩基ＧからなるＤＮＡ、配列番号：３の塩基配列において１００位の塩基Ａから２１７２位の塩基ＴからなるＤＮＡ、配列番号：５の塩基配列において１位の塩基Ａから２１３０位の塩基ＡからなるＤＮＡ、および配列番号：７の塩基配列において９２位の塩基Ａから２２５７位の塩基ＣからなるＤＮＡを包含する。
また、本発明のＤＮＡは、配列番号：１の１７９位の塩基Ａから２３０５位の塩基Ｇの塩基配列において１６３５位のＣがＴに置換された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：３の１００位の塩基Ａから２１７２位の塩基Ｔの塩基配列において４８７位のＡがＧに置換された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号：３の１００位の塩基Ａから２１７２位の塩基Ｔの塩基配列において６２０位のＴがＣに置換された塩基配列からなるＤＮＡを包含する。
本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１、３、５、または７に示す塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであり、トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。ハイブリダイゼーションの条件としては、上記の条件が挙げられる。ハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくは天然由来のＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ又は染色体ＤＮＡである。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明のトランスポーター遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のＤＮＡまたは本発明のベクターが導入された形質転換細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、常法、例えば、文献「Ｔｈｅ Ｑｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ」記載の方法を用いて行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ Ｋ．−Ｃ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明のタンパク質は、形質転換細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。 本発明は、また、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質であってもよいし、また、タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該形質転換細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のタンパク質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばそのＣ末端からなる断片あるいはＮ末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明のタンパク質の検出又は測定方法を実施することができる。本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、ヒト「ＯＡＴＰ−Ｂ」、「ＯＡＴＰ−Ｃ」、「ＯＡＴＰ−Ｄ」、または「ＯＡＴＰ−Ｅ」タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１、３、５、または７）またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。
このようなＤＮＡには、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、本発明のタンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム等）が含まれる。また、このようなＤＮＡは、ＤＮＡチップの作製に利用することもできる。
プライマーとして用いる場合、３’側の領域を相補的にして、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１、３、５、または７の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１、３、５、または７の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１、３、５、または７に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のタンパク質の産生細胞に作用して、該タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害し、従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を利用した、薬物の体内吸収、体内動態の制御が挙げられる。本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を詳細に解析することにより、このトランスポーターによって輸送され得る薬剤のドラッグデザインが可能であり、これにより本発明のトランスポータータンパク質を介して薬物の体内吸収を高めることができると考えられる。デザインされる薬物には従来の脂溶性をあげるような修飾は不要であるため、水溶性の扱いやすい薬物が迅速かつ効率的に開発できるようになると考えられる。また開発された薬物の吸収は基本的に本発明のトランスポータータンパク質の生体内分布に従うと考えられるため、臓器特異的な薬物の送達が可能である。特に本発明のトランスポータータンパク質の体内分布が、標的臓器と一致するような薬物の場合、理想的なドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）となると考えられる。また、他のトランスポーターによる薬物の吸収を期待しているが、本発明のトランスポータータンパク質による吸収は望ましくない場合、本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を考慮に入れたドラッグデザインを行うことにより、他のトランスポータータンパク質に選択的な薬物の創造が行えると考えられる。例えば、ＯＡＴＰ−Ｅは様々な固形癌細胞に高発現しているが、血球系細胞では極めて発現が少ないことが判明した。ＯＡＴＰ−Ｅ遺伝子を用いたスクリーニング系を構築し、これを用いたスクリーニングを行うことによりＯＡＴＰ−Ｅにより特異的に細胞内へ取り込まれる抗癌剤を得ることができれば、それは血球系細胞に対する障害が軽減された抗癌剤となり得ることが期待される。
本発明のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物のスクリーニングは、例えば、以下のように行うことができる。まず、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する。例えば、本発明のタンパク質を発現するベクターを構築し、これを適当な細胞に導入すればよい。次いで、該細胞に対し、標識された被検化合物を接触させる。被検化合物としては、例えば、低分子化合物を用いることができる。被検化合物の標識としては、検出可能であれば特に制限はなく、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられる。次いで、該細胞内に取り込まれた、標識された被検化合物を検出する。検出は、放射標識化合物の場合は、液体シンチレーションカウンターなどによる放射活性の測定、蛍光標識化合物の場合は蛍光光度計などによる蛍光光度の測定により行うことができる。また、標識化合物を使わない場合においても、本発明のタンパク質により細胞内へ取り込まれた化合物の生物活性（例えば細胞毒性、細胞増殖促進活性）などを指標にしたバイオアッセイにより輸送量を測定することができる。次いで、上記検出の結果、該細胞内に取り込まれる化合物を選択する。具体的には、このスクリーニングは、例えば、実施例３に記載の輸送活性の検出系を利用して行うことができる。これにより単離された化合物は、上述した薬物の創造に利用することができる。
また、他の本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を標的とした薬物の開発が考えられる。栄養物質や薬物の吸収機構として、あるいは薬物や生体内代謝物の排泄機構としてのトランスポーターの重要性を考えると、その機能が損なわれること、または異常に亢進することに起因する疾患が存在すると考えられる。そのような疾患に対しては、本発明のトランスポータータンパク質の機能を阻害、あるいは亢進する化合物や、本発明のトランスポーター遺伝子の発現量や、タンパク量を調節するするような化合物を薬剤として用いると効果的であると考えられる。
本発明のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害する化合物のスクリーニングは、例えば、以下のように行うことができる。まず、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する。次いで、該細胞に対し、被検化合物および本発明のタンパク質により輸送される標識された有機化合物を接触させる。用いられる有機化合物としては、例えば、エストラジオール−１７Ｂ−グルクロナイド、エストロン−３−スルフェート、ベンジルペニシリン、プロスタグランジンＥ２などが挙げられるが、これらに制限されない。次いで、該細胞内に取り込まれた、標識された有機化合物の量を測定する。次いで、被検化合物非存在下において同様に測定した場合（対照）と比較して、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する。具体的には、このスクリーニングは、例えば、実施例３に記載の輸送活性の検出系を利用して行うことができる。この結果、被検化合物の接触により、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量が増加すれば、該化合物は本発明のタンパク質の有機化合物を輸送する活性を促進すると判定される。一方、被検化合物の接触により、該細胞内に取り込まれた標識された有機化合物の量が減少すれば、該化合物は本発明のタンパク質の有機化合物を輸送する活性を阻害すると判定される。
本発明のスクリーニングにより得られる化合物は、本発明タンパク質を利用した薬剤治療や、本発明のタンパク質による物質輸送の制御を介した治療などへの応用が考えられる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、その構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換してもよい。
本発明のタンパク質に結合する化合物や本発明のタンパク質およびその部分ペプチドをヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、タンパク質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患に対する遺伝子治療への応用も考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のＤＮＡをアデノウイルスベクター（例えば、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。また、アンチセンス合成ＤＮＡを生体内に直接、または上記ベクターに挿入して投与して治療を行うことも考えられる。また、本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患の診断への応用も考えられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。一般的な分子生物学的な実験操作に関しては、基本的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．（１９８９）などの一般的な実験書に記載の方法に従った。
［実施例１］ ＯＡＴＰ−Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥ遺伝子の全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｃＤＮＡのクローニング
ＯＡＴＰ−Ｂ
ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るＥＳＴであるＷ１９５０４およびＡＩ０５２５０１の塩基配列をもとに、それぞれＯＡＢＥ−１プライマー（５’ｇａｔ ａａｇ ｃｔｔ ｃｔｇ ｔｇｔ ｇｇｃ ｃｃａ ａｇａ ａｇａ ａｃｔ ｇａｃ ３’／配列番号：９）およびＯＡＢＥ−６プライマー（５’ｇａｔ ａａｇ ｃｔｔ ｔａｃ ｔｇｃ ｔｇｔ ｇｇｃ ｔｇｃ ｔａｃ ｔｃｔ ｔｇｇ ３’／配列番号：１０）を作製した。これらのプライマーを用い、ヒト成体脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ由来ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、全ＯＲＦを含むＯＡＴＰ−Ｂ ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲにより増幅したＯＡＴＰ−Ｂ ｃＤＮＡをプライマーに付加したＨｉｎｄ ＩＩＩサイトにより切断し、哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＨｉｎｄ ＩＩＩサイトに組み込んだ。複数のクローンをシークエンシングすることによりＰＣＲエラーの無いクローン（ｐｃＤＮＡ３／ＯＡＴＰ−Ｂ）を選択し、発現実験に用いた。
ＯＡＴＰ−Ｃ
ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得る以下のＥＳＴの塩基配列からそれぞれのプライマーを作製した。
ＥＳＴ Ｈ６２８９３；２８９３−４プライマー（５’ａａｇ ｃｔｔ ｃｃｇ ｔｃａ ａｔａ ａａａ ｃｃａ ａｃａ ３’／配列番号：１１）および２８９３−１プライマー（５’ｃｔｔ ｃｔｃ ｔｔｇ ｔｔｇ ｇｔｔ ｔｔａ ｔｔｇ ａｃｇ ３’／配列番号：１２）
ＥＳＴ Ｒ２９４１４；９４１４−２プライマー（５’ｔｇｔ ａａｇ ｔｔａ ｔｔｃ ｃａｔ ｔｇｔ ｔｔｃ ｃａｃ ３’／配列番号：１３）
ＥＳＴ Ｔ７３８６３；３８６３−１プライマー（５’ｔｔｇ ｇｔｇ ｃｔｔ ｔｔａ ｃｔｔ ａｔｇ ｔｃｔ ｔｃａ ３’／配列番号：１４）
これらのプライマーを用い、３つの断片に分けヒトＯＡＴＰ−Ｃのクローニングを行った。
５’側断片は、５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）法によりクローニングした。すなわち、ヒト胎児肝臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、キットに附属のリンカープライマーであるＡＰ１プライマーと２８９３−４プライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、ヒトＯＡＴＰ−Ｃ ｃＤＮＡの５’側断片、約４００ｂｐを増幅した。このｃＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＴＡクローニング法により組み込み、得られたサブクローンを複数シークエンシングすることによりヒトＯＡＴＰ−Ｃ ｃＤＮＡの５’側の配列を決定した。また、３’側も同様に３’ＲＡＣＥ法によりクローニングした。すなわち、ヒト胎児肝臓由来Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡを鋳型とし、キットに附属のリンカープライマーであるＡＰ１プライマーと３８６３−１プライマーとの組み合わせのＰＣＲによりヒトＯＡＴＰ−Ｃ ｃＤＮＡの３’側断片、約１．５ｋｂｐを増幅した。このｃＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＴベクターにＴＡクローニング法により組み込み、得られたサブクローンを複数シークエンシングすることによりヒトＯＡＴＰ−Ｃ ｃＤＮＡの３’側の配列を決定した。さらにこれらの間に挟まれる中央部は、ヒト成体肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型とし、２８９３−１プライマーと９４１４−２プライマーとの組み合わせによるＰＣＲにより増幅した。得られた役１．２ｋｂｐの断片をゲル濾過法により精製し、直接シークエンシングすることにより配列を決定した。この様にして得られた配列を組み合わせることにより、ヒトＯＡＴＰ−Ｃの全ＯＲＦを含むｃＤＮＡの配列を決定した。
発現用のプラスミドは以下のようにして構築した。すなわち、ヒト成体肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーの組み合わせによるＰＣＲによりヒトＯＡＴＰ−Ｃを２つの断片に分け増幅した。
５’側
ＯＡＨＣ１７プライマー（５’ｇａｔ ｇｇｔ ａｃｃ ａａａ ｃｔｇ ａｇｃ ａｔｃ ａａｃ ａａｃ ａａａ ａａｃ ３’／配列番号：１５）
ＯＡＨＣ１８プライマー（５’ｇａｔ ｇｇｔ ａｃｃ ｃａｔ ｃｇａ ｇａａ ｔｃａ ｇｔａ ｇｇａ ｇｔｔ ａｔｃ ３’／配列番号：１６）
３’側
ＯＡＨＣ２１プライマー（５’ｇａｔ ｇｇｔ ａｃｃ ｔａｃ ｃｃｔ ｇｇｇ ａｔｃ ｔｃｔ ｇｔｔ ｔｔｃ ｔａａ ３’／配列番号：１７）
ＯＡＨＣ２２プライマー（５’ｇａｔ ｇｇｔ ａｃｃ ｇｔｔ ｔｇｇ ａａａ ｃａｃ ａｇａ ａｇｃ ａｇａ ａｇｔ ３’／配列番号：１８）
これらの断片をそれぞれｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクターにサブクローニングし、ＰＣＲエラーのないクローンを選択した。重なり合う領域に存在するＢｇｌ ＩＩサイトで両者を連結した後、両端に存在するＫｐｎ Ｉサイトで切断し、ｐｃＤＮＡ３ベクターのＫｐｎ Ｉサイトに組み込み、発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３／ＯＡＴＰ−Ｃを得た。
ＯＡＴＰ−Ｄ
ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るＥＳＴ ＡＡ２８０２２４から０２２４−３プライマー（５’ｃｇｃ ｃｃｔ ｃｇｔ ｇｇｔ ｔｔｔ ｔｇａ ｔｇｔ ａｇｃ ３’／配列番号：１９）を作製した。さらに、ヒト第１５番染色体ｑ２６．１領域由来のＰＡＣクローン（ｐＤＪ４３０ｉ１９）の配列の一部もヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得ることを見いだした。この配列からＰＡＣ１５１−２プライマー（５’ｇｃｇ ｇｔｇ ｃｃｔ ｔａｃ ｔｃｔ ｔｃｔ ｔｃｔ ｃｔｔ ３’／配列番号：２０）を作製した。ヒト成体脳由来ｃＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いたＰＣＲを行ったところ約１．１ｋｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。これをプローブとし、ヒト成体腎臓由来５’−ＳＴＲＥＴＣＨ ＰＬＵＳ ｃＤＡＮライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対しプラークハイブリダイゼーション法によるスクリーニングを行った。得られたポジティブクローンのファージ懸濁液を鋳型とし、上記のプライマー、あるいは明らかになった配列から作製したＯＡＴＰ−Ｄ遺伝子特異的なプライマーと、λｇｔ−１０ベクターの配列から作製したＧＴ１０ Ｓ１プライマー（５’ｃｔｔ ｔｔｇ ａｇｃ ａａｇ ｔｔｃ ａｇｃ ｃｔ ３’／配列番号：２１）、あるいはＧＴ１０ Ａ１プライマー（５’ａｇａ ｇｇｔ ｇｇｃ ｔｔａ ｔｇａ ｇｔａ ｔｔｔ ｃｔｔ ３’／配列番号：２２）との組み合わせによるＰＣＲを行い、増幅断片を直接シークエンシングすることにより配列を決定した。さらに、新たに得られた領域を含むＤＮＡ断片をプローブとして用いスクリーニングを行うことにより、ファージクローンによりカバーされる領域を延長していき、全ＯＲＦの配列を決定した。
ＯＡＴＰ−Ｅ
ヒトＯＡＴＰ−Ａと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るＥＳＴ ＡＩ３４７１３０から、７１３０−１プライマー（５’ｔｇｔ ａｃａ ａｇｇ ｔｇｃ ｔｇｇ ｇｃｇ ｔｃｃ ｔｃｔ ３’／配列番号：２３）、および７１３０−４プライマー（５’ｃｇａ ｔｃｇ ｇｇｔ ａｔａ ａａａ ｃａｃ ａｔｔ ｃｔａ ３’／配列番号：２４）を作製した。ヒト成体肺由来ｃＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いたＰＣＲを行ったところ約４００ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。これをプローブとし、ヒト成体腎臓由来５’−ＳＴＲＥＴＣＨ ＰＬＵＳ ｃＤＡＮライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に対しプラークハイブリダイゼーション法によるスクリーニングを行った。得られたポジティブクローンのファージ懸濁液を鋳型とし、上記のプライマー、あるいは明らかになった配列から作製したＯＡＴＰ−Ｅ遺伝子特異的なプライマーと、λｇｔ−１０ベクターの配列から作製したＧＴ１０ Ｓ１プライマー、あるいはＧＴ１０ Ａ１プライマーとの組み合わせによるＰＣＲを行い、増幅断片を直接シークエンシングすることにより配列を決定した。さらに、新たに得られた領域を含むＤＮＡ断片をプローブとして用いスクリーニングを行うことにより、ファージクローンによりカバーされる領域を延長していき、全ＯＲＦの配列を決定した。
発現用のプラスミドは以下のようにして構築した。すなわち、以下のプライマーの組み合わせによるＰＣＲによりヒトＯＡＴＰ−Ｅを５’側および３’側の２つの断片に分け増幅した。５’側断片はヒト成体肺由来ｃＤＮＡを、また３’側断片はヒト胎児肺由来ｃＤＮＡを鋳型とし増幅した。
５’側
ＯＡＥ１７プライマー（５’ｇａｔ ａａｇ ｃｔｔ ｔｇｃ ｇｔｇ ｇｃｔ ｇａａ ｇｃｃ ｔｃｇ ａａｇ ｔｃａ ３’／配列番号：２５）
ＯＡＥ１８プライマー（５’ｇａｔ ｇｇａ ｔｃｃ ａｃｔ ｇｇｔ ｇｃａ ｔｔｔ ｃｃｇ ｃｃｇ ｃｔｃ ｔｃａ ３’／配列番号：２６）
３’側
ＯＡＥ２１プライマー（５’ｇａｔ ａａｇ ｃｔｔ ｔｃｔ ｔｃａ ｃｃｇ ｃｃｇ ｔｔｃ ｃｃａ ｔｃｃ ｔｔｇ ３’／配列番号：２７）
ＯＡＥ２２プライマー（５’ｇａｔ ｇｇａ ｔｃｃ ａｃｔ ｇｔｔ ｃｔｇ ｔｃａ ｔｃａ ｇｇａ ａａｔ ｇｃｔ ３’／配列番号：２８）
これらの断片をそれぞれｐｃＤＮＡ３ベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＢａｍＨ Ｉサイトにサブクローニングし、ＰＣＲエラーのないクローンを選択した。重なり合う領域に存在するＢｓｔＰ Ｉサイトで両者を連結し、発現用プラスミドｐｃＤＮＡ３／ＯＡＴＰ−Ｅを得た。
ＰＣＲ
ＰＣＲは基本的に以下に示す条件を基本とし、適宜変更を加えて行った。
＜反応液組成＞
鋳型ＤＮＡ
１０ ｘ ＥｘＴａｑバッファー（ＴａＫａＲａ社）５μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社）４μｌ
ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社）０．５μｌ
ＴａｑＳｔａｒｔＴＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．５μｌ
センスプライマー １０〜２０ｐｍｏｌ
アンチセンスプライマー １０〜２０ｐｍｏｌ
／全量５０μｌ
＜反応条件＞
一般的なＰＣＲ
９４℃、２分→（９４℃、３０秒→５５℃〜６２℃、３０秒→７２℃、２〜３分） ｘ２５〜４０サイクル→７２℃、１０分
ＲＡＣＥ法
９４℃、２分→（９４℃、３０秒→６８℃、４分） ｘ５サイクル→（９４℃、３０秒→６２℃、３０秒→７２℃、２分） ｘ３０サイクル→７２℃、１０分
ｃＤＮＡの合成
ＰＣＲの鋳型として用いるｃＤＮＡは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用い、メーカー推奨の一般的な方法に従って作製した。すなわち、１０μｇの全ＲＮＡ、あるいは２μｇのポリＡ＋ＲＮＡと、約１μｇのオリゴｄＴプライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、あるいは約０．５μｇのランダムヘキサマープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を混合し、７０℃で１０分加温した後氷冷した。これにｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ緩衝液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、終濃度１０ｍＭのＤＴＴ、終濃度０．５ｍＭのｄＮＴＰｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）、および４００Ｕ〜８００ＵのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素を加え、４２℃で１時間保温することによりｃＤＮＡ合成を行った。次いで７０℃で１５分間加温し、その一部を鋳型として使用した。
ハイブリダイゼーション
ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片、あるいはアガロース電気泳動後のゲルから精製したＤＮＡ断片などを、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ Ｇｏ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｂｅａｄｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いたランダムプライマー法により［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルし、プローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用い、メーカー推奨の方法に従い、６８℃で２時間以上保温することにより行った。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２ ｘ ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ溶液中、室温で、２０分、２回洗浄し、次いで、０．１ Ｘ ＳＳＣ，０．１％ ＳＤＳ溶液中、５０℃で、２０分、２回の洗浄を行った。
［実施例２］ ＲＴ−ＰＣＲ法による解析
以下に示すそれぞれの遺伝子に特異的なプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法による各遺伝子発現の組織分布の解析を行った。
ＯＡＴＰ−Ａ
ＯＡＡ−１プライマー（５’ａａｇ ａａｇ ａｇｇ ｔｃａ ａｇａ ａｇｇ ａａａ ａａｔ ３’／配列番号：２９）
ＯＡＡ−２プライマー（５’ｇｇａ ｇｃａ ｔｃａ ａｇｇ ａａｃ ａｇｔ ｃａｇ ｇｔｃ ３’／配列番号：３０）
ＯＡＴＰ−Ｂ
４７４２−１プライマー（５’ｃｇｔ ｇｃｇ ｇｃｃ ａａｇ ｔｇｔ ｇｔｔ ｃｃａ ｔａａ ３’／配列番号：３１）
４７４２−２プライマー（５’ｇａａ ｇｇａ ｇｔａ ｇｃｃ ｃｃａ ｔａｇ ｃｃａ ａｔｃ ３’／配列番号：３２）
ＯＡＴＰ−Ｃ
９４１４−１プライマー（５’ｔｇｔ ｃａｔ ｔｇｔ ｃｃｔ ｔｔｔ ａｃｃ ｔａｔ ｔａｔ ３’／配列番号：３３）
９４１４−２プライマー（前出 ５’ｔｇｔ ａａｇ ｔｔａ ｔｔｃ ｃａｔ ｔｇｔ ｔｔｃ ｃａｃ ３’／配列番号：１３）
ＯＡＴＰ−Ｄ
０２２４−２プライマー（５’ｃｔｃ ａａａ ｔｃｃ ｔｔｃ ｇｃｃ ｔｔｃ ａｔｃ ｃｔｇ ３’／配列番号：３４）
０２２４−４プライマー（５’ａｇｇ ｇｔｃ ａｇａ ｇｔａ ｇａｇ ｇｃａ ａａｇ ａａｃ ３’／配列番号：３５）
ＯＡＴＰ−Ｅ
７１３０−２プライマー（５’ｃａｃ ｇｇｃ ｇｇｇ ｃａｃ ｔｃａ ｇｃａ ｔｔｔ ｃｃｔ ３’／配列番号：３６）
７１３０−４プライマー（前出 ５’ｃｇａ ｔｃｇ ｇｇｔ ａｔａ ａａａ ｃａｃ ａｔｔ ｃｔａ ３’／配列番号：２４）
Ｇ３ＰＤＨ
Ｕｐｓｔｒｅａｍプライマー（５’ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ ３’／配列番号：３７）
Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍプライマー（５’ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ ３’／配列番号：３８）
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＴＣＴＭ）Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる、各種臓器、細胞由来のｃＤＮＡの適当量を鋳型として用い、上記プライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅産物をアガロース電気泳動し解析を行った（図１、図２）。ＯＡＴＰ−Ａは脳、肝臓に比較的局限した発現パターンを示した。また、ＯＡＴＰ−Ｃは胎児組織においても成体組織においても、肝臓に発現が局限していることが明らかとなった。ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅは比較的広範囲の組織において発現が見られたが、特に、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｅにおいては末梢血白血球や、胸腺、脾臓において発現が極めて低いことが明らかとなった。このことから、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｅは血球系細胞における発現が低いことが強く示唆される。一方、癌細胞における発現を調べたところ（図２）、ＯＡＴＰ−ＤおよびＯＡＴＰ−Ｅは癌細胞において高頻度で発現していることが明らかとなった。この結果から、ＯＡＴＰ−Ｅによって特異的に細胞に取り込まれる抗癌剤を作ることが可能であれば、それは造血細胞に対する副作用（骨髄抑制など）が軽減した抗癌剤となり得ることが期待される。
［実施例３］ トランスポート実験
ｐｃＤＮＡ３／ＯＡＴＰ−Ｃ、及びコントロールとしてインサートを含まないｐｃＤＮＡ３ベクター（モック）を、リン酸カルシウム法によりヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞に導入した。すなわち、プラスミドＤＮＡ１０μｇ、ヘペス緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、６ｍＭデキストロース、２１ｍＭヘペスｐＨ７．１）１ｍｌ、２Ｍ ＣａＣｌ２６２．５μｌを混合し、３０分以上室温で静置する事によりリン酸カルシウム共沈物を生成させた。１０ｃｍプレート１枚あたり１．５ｘ１０６個の細胞を蒔き、２４時間培養した後、先のリン酸カルシウム共沈物を加え２４時間培養し、その後ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）でプレートを洗浄し、培地を加えさらに２４時間培養した。
プラスミドＤＮＡを導入した細胞を用いて以下の手順に従ってトランスポート実験を行った。プレートからラバーポリスマンを用いて細胞をはがし、トランスポート緩衝液（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭ（＋）−グルコース、１．２ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２５ｍＭヘペスｐＨ７．４）に懸濁し、２０分間プレインキュベーションを行った。ついで各種基質のラベル体（［３Ｈ］メトトレキセート、［３Ｈ］ジゴキシン、［３Ｈ］ウワバイン、［３Ｈ］プロスタグランジンＥ２、［３Ｈ］エストラジオール−１７β−グルクロナイド、［３Ｈ］エストロン−３−スルフェート、［１４Ｃ］ＰＣＧ＜ベンジルペニシリン＞など）を適当量添加し、３７℃にて一定時間インキュベートを行った。これを、３Ｍ ＫＣｌ層の上にシリコンオイルと液体パラフィンの混合物（比重＝１．０２２）を重層して作製したシリコンレイヤー上に重層し、遠心する事により細胞を分離した。細胞の放射活性を測定し、細胞内へのトランスポート能とした。なおこの際、１ｘ１０６個の細胞を１ポイントとして用いた。
また、ＨＥＫ２９３細胞の培養は、ダルベッコＭＥＭ，１０％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を培地とし、５％二酸化炭素中、３７℃で行った。
ＯＡＴＰ−Ｃを発現させたＨＥＫ２９３細胞における輸送活性を測定したところ、エストラジオール−１７β−グルクロナイド、エストロン−３−スルフェート、ＰＣＧにおいて明らかな輸送が観察された。また、メトトレキセート、ウワバイン、プロスタグランジンＥ２においても弱い活性が観察された（図３）。
次に、ＯＡＴＰ−ＣのＰＣＧ輸送におけるＫｍ（ミカエリス定数）値を求めるために、様々な濃度の［１４Ｃ］ＰＣＧを加えた場合の取り込み量を測定した（図４）。ＯＡＴＰ−Ｃを発現させた細胞におけるＰＣＧの取り込み量をＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ逆数プロットすることにより、Ｋｍ値は９８３±２８９μＭであることが求められた。また反応の最大速度Ｖｍａｘは５．４５±０．６３（ｎｍｏｌ／ｍｇ／１５ｍｉｎ）であることが求められた。
次に、ＯＡＴＰ−ＣによるＰＣＧの輸送に対する、各種βラクタム系抗生物質の影響を調べた（図５）。４μＭの［１４Ｃ］ＰＣＧに対して各種βラクタム系抗生物質を１ｍＭ添加してその輸送活性への影響を調べたところ、セファゾリン、セフォペラゾン、セフピラミド、ナフシリンにおいて顕著な阻害活性が観察された。また、セファロリジン、セファレキシンによっても弱い阻害活性が観察された。この結果より、これらのβラクタム系抗生物質も、同じβラクタム系抗生物質であるＰＣＧと同様に、ＯＡＴＰファミリータンパクにより輸送され得ることが強く示唆される。
次に、ＯＡＴＰ−Ｃによるエストラジオール−１７β−グルクロナイドの輸送におけるナトリウムイオン、および塩素イオンの要求性を調べた（図６）。トランスポート緩衝液におけるナトリウムイオンをＮ−メチルグルカミンに変更した場合においても、また、塩素イオンをグルコネートに変更した場合においても、エストラジオール−１７β−グルクロナイドの輸送は変化を受けなかった。このことから、ＯＡＴＰ−Ｃによる輸送はナトリウムイオン非依存的であることがわかった。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規なトランスポータータンパク質およびその遺伝子が提供された。これらは、本発明のトランスポータータンパク質を介して輸送される新規なデザインの薬物の開発や本発明のトランスポータータンパク質の発現異常や機能異常などに起因する疾患の治療薬の開発に利用することが可能である。さらには遺伝子診断などの診断や遺伝子治療への応用も考えられる。例えば、本発明のトランスポーター遺伝子のＳＮＰ診断などにより、薬物の有効性に関する個人差を考慮したテーラーメイドの治療計画が可能になる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒト胎児組織、および成体組織における各ＯＡＴＰファミリー遺伝子の発現を調べた結果を示す写真である。１．胎児脳、２．胎児心臓、３．胎児腎臓、４．胎児肝臓、５．胎児肺、６．胎児骨格筋、７．胎児脾臓、８．胎児胸腺、９．成体膵臓、１０．成体腎臓、１１．成体骨格筋、１２．成体肝臓、１３．成体肺、１４．成体胎盤、１５．成体脳、１６．成体心臓、１７．成体末梢血白血球、１８．成体大腸、１９．成体小腸、２０．成体卵巣、２１．成体精巣、２２．成体前立腺、２３．成体胸腺、２４．成体脾臓、２５．成体骨髄、２６．成体リンパ節、２７．成体扁桃腺。
図２は、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒト癌細胞における各ＯＡＴＰファミリー遺伝子の発現を調べた結果を示す写真である。１．乳癌細胞（ＧＩ−１０１）、２．肺癌細胞（ＬＸ−１）、３．大腸腺腫細胞（ＣＸ−１）、４．肺癌細胞（ＧＩ−１１７）、５．前立腺腫細胞（ＰＣ３）、６．大腸腺腫細胞（ＧＩ−１１２）、７．卵巣癌細胞（ＧＩ−１０２）、８．膵臓腺腫細胞（ＧＩ−１０３）。
図３は、各種ラベル体に対するトランスポート実験の結果を示す図である。ＯＡＴＰ−Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞（ＯＡＴＰ−Ｃ）、およびベクターのみを導入したＨＥＫ２９３細胞（モック）における各種ラベル体の輸送活性を表す。
図４は、ＯＡＴＰ−Ｃを発現させたＨＥＫ２９３細胞の各種濃度におけるＰＣＧの輸送活性を示す図である。
図５は、ＯＡＴＰ−Ｃを発現させたＨＥＫ２９３細胞のＰＣＧ輸送活性に対する各種βラクタム系抗生物質の影響を示す図である。コントロール（阻害剤無し）における活性を１００％として表してある。
図６は、エストラジオール−１７β−グルクロナイド輸送活性におけるナトリウムイオン、および塩素イオンの要求性を示す図である。「ＯＡＴＰ−Ｃ」はＯＡＴＰ−Ｃを導入したＨＥＫ２９３細胞、および「モック」はベクターのみを導入したＨＥＫ２９３細胞におけるエストラジオール−１７β−グルクロナイドの輸送活性をそれぞれ表す。
Claims (1)
- メトトレキセート、ウワバイン、ＰＣＧ及びβラクタム系抗生物質から選ばれる有機化合物のトランスポーター活性を有するタンパク質をコードする下記（１）から（４）のいずれかに記載のDNA、
（１）配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（２）配列番号：３に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA、
（３）配列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、若しくは
（４）配列番号：３に記載の塩基配列からなるDNAと、６８℃で２時間以上ハイブリダイゼーションを行い、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液中、室温で、２０分、２回洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液中、５０℃で、２０分、２回の洗浄を行うハイブリダイズ条件でハイブリダイズするDNA、または、
配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドであって、メトトレキセート、ウワバイン、ＰＣＧ及びβラクタム系抗生物質から選ばれる有機化合物のトランスポーター活性を有する部分ペプチドをコードするDNA
によりコードされるタンパク質またはペプチドのメトトレキセート、ウワバイン、ＰＣＧ及びβラクタム系抗生物質から選ばれる有機化合物のトランスポーター活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記タンパク質またはペプチドを細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、被検化合物および前記タンパク質またはペプチドにより輸送される標識された、メトトレキセート、ウワバイン、ＰＣＧ及びβラクタム系抗生物質から選ばれる有機化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された有機化合物の量を測定する工程、および
（ｄ）被検化合物非存在下において測定した場合（対照）と比較して、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する工程、を含む方法。
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