JP2011015694A

JP2011015694A - トランスポーター遺伝子ｏａｔｐ−ｂ、ｃ、ｄ、およびｅ

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Publication number: JP2011015694A
Application number: JP2010197853A
Authority: JP
Inventors: Junichi Nezu; 淳一根津; Asuka Ose; 飛鳥大瀬; Akira Tsuji; 彰辻
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-09-21
Filing date: 2010-09-03
Publication date: 2011-01-27
Anticipated expiration: 2020-09-20
Also published as: US8748128B2; EP2316848A1; EP1223217A1; US7045316B2; EP1223217A4; JP5395767B2; DE60042220D1; AU7317400A; US20030022199A1; US20100196960A1; US20060121523A1; EP1486510B1; JP4838961B2; EP2030985A1; ATE431361T1; EP1486510A1; WO2001021792A1

Abstract

【課題】OATPファミリーに属する新規なトランスポーター遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質、並びにそれらの用途を提供する。
【解決手段】ヒトOATPトランスポーターの遺伝子配列を基に新規なトランスポーター遺伝子のスクリーニングを行い、４つの新たなトランスポーターの遺伝子をクローニングすることに成功した。これらのトランスポーターは、生体物質や様々な薬物に対する輸送活性を利用したドラッグの開発に有用である。また、これらトランスポーター遺伝子には一塩基多型（SNP）が存在していることを見出した。これらトランスポーター遺伝子の多型（SNP等）を基にした遺伝子診断により、例えば薬物治療の有効性を判断することが可能になる。
【選択図】なし

Description

本発明は、細胞外から細胞内へ、あるいは細胞内から細胞外への物質の輸送に関与するトランスポーターファミリーに関する。

栄養素や内因性物質の細胞内への取り込み機構において、生体膜に存在する多種の輸送担体（トランスポーター）の関与と、その輸送機構が最近明らかになりつつある(Tsuji, A. and Tamai, I., Pharm. Res., 13, 963-977, 1996.（非特許文献１）)。これらのトランスポーターには、輸送される物質の構造認識能が備わっており、物質を選択的に輸送するが、比較的その構造認識が広いトランスポーターの場合、本来は生体異物である医薬品などについても誤認識し、積極的に細胞内へ輸送してしまうと考えられる。基本的に薬物の生体膜透過は、その分子サイズ、脂溶性、水素結合能などの物理化学的特性に依存する単純拡散に従っており、特にイオン性薬物の場合には、非解離型分子のみがpH-分配仮説に従って生体膜を透過すると考えられていた。しかし、細胞内外の効率的な物質交換活性が必要な小腸、腎尿細管、胎盤、脳脈絡叢の上皮細胞や、肝実質細胞、血液脳関門などでは、多くの薬物は単純拡散以外の特異的機構、つまりトランスポーターによる能動的な輸送により細胞膜を透過することが明らかとなってきた(玉井郁巳、辻彰：ファルマシア、31、493-497、1995.（非特許文献２）、齋藤秀之、乾賢一：医学のあゆみ、179、393-397、1996.（非特許文献３）、玉井郁巳：薬物動態、11、642-650、1996.（非特許文献４）)。例えば、非エステル型の経口用β-ラクタム抗生物質は生理的pHにおいては両性または負に荷電し、脂溶性は極めて低いにも関わらず、腸管からの吸収は良好であることが知られている。単離膜小胞系を用いた輸送研究により、これらの薬物の吸収過程には、刷子縁膜に局在するH^＋駆動型ペプチドトランスポーターが関与していることが示されるようになった(Okano, T. et al., J. Biol. Chem. 261, 14130-14134, 1986.（非特許文献５）)。ペプチド輸送系は、ジあるいはトリペプチドを認識するが、テトラペプチド以上は認識できず、ペプチドサイズについては極めて厳密であるものの、非天然のアミノ酸からなるペプチドは認識するといった比較的広い基質認識性を持つ。β-ラクタム抗生物質のペプチドトランスポーターによる輸送も、やはりこの広い基質認識性ゆえの誤認識による輸送であり、臨床的にはそれを図らずも利用していたことになる(Tsuji, A., American Chemical Society (eds. Taylor, M. D., Amidon, G. L.),Washington, D. C., 101-134, 1995.（非特許文献６）)。さらには、脂溶性の高い脂肪酸のような物質の生体膜透過においても、トランスポーターが関与している可能性が報告されている(Schaffer, J. and Lodish, H., Cell, 79, 427-436, 1994.（非特許文献７）)。

ところで、様々なトランスポーターは各臓器、細胞が持つ生理的役割に応じて備わっているはずであり、その分布や機能には臓器特異性が期待される。従って、薬物動態に臓器選択性をもたらす手法としてトランスポーターを利用することが期待できる。すなわち、トランスポーターを利用した臓器特異的薬物デリバリー(DDS)が可能であると考えられる。また、脂溶性をあげることによる単純拡散に頼った薬物の吸収性改善は、肝臓における初回通過効果を増大させたり、臓器移行性を非特異的に増大させる可能性が高い。しかし、トランスポーターの基質特異性を利用したドラッグデザインを行うことにより、脂溶性とは無関係に薬物の吸収性を高めることも可能であると考えられる(林喜代美他：Drug Delivery System、11、205-213、1996.（非特許文献８）)。このような目的のためには、多くのトランスポーターを分子レベルで同定し、その性質についての詳細な解析を行うことが必須であるが、トランスポーターはその生化学的な取り扱いの難しさと、機能測定の複雑さから、膜生理学的な研究の多さに比較し、分子レベルでの同定が非常に遅れている。

最近になり、外来遺伝子発現系であるアフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞を用いた発現クローニング法によりいくつかのトランスポーターのcDNAがクローニングされるようになり、構造上の類似性が存在することが明らかになってきた(Fei, Y. -J. et al., Nature, 368, 563-566, 1994.（非特許文献９）)。例えば、1994年にKoepsellらによって、基底膜型と推定される有機カチオントランスポーターOCT1が発現クローニング法によってクローニングされた(Grundemann, D. et al., Nature, 372, 549-552, 1994.（非特許文献１０）)。その後、OCT1の配列をもとにしたホモロジークローニングによってOCT2が同定された(Okuda, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 500-507, 1996.（非特許文献１１）)。OCT1とOCT2はお互いに67%という非常に高い相同性を示す (Grundemann, D. et al., J. Biol. Chem. 272, 10408-10413, 1997.（非特許文献１２）)。両者とも腎臓に強い発現が見られるが、OCT1の場合はそれ以外にも肝臓、結腸、小腸に発現が存在するのに対し、OCT2は腎臓に特異的であり、組織分布も異なっている。

また、別のトランスポーターとしては、ヒトOATPトランスポーター（以降、「OATP-A」と称する。Gastroenterology 109 (4), 1274-1282 (1995)（非特許文献１３））が知られている。このトランスポーターはナトリウムイオン非依存的に様々な内因物質や外来異物を輸送する能力を持つタンパクである。OATP-Aによって輸送される物質にはブロモスルフォフタレイン（bromosulfophthalein）、胆汁酸、ステロイドホルモンなどがあることが知られている。また、プロスタグランジンを輸送する能力を持つPGTもOATP-Aに有意な相同性を示し、これらは遺伝子ファミリー（OATPファミリー）を形成していると考えられる。

トランスポーターについての分子レベルでの同定については、これら報告例を含めわずかであり、いまだ臨床上有用な多くの未知のトランスポーターが存在していると考えられる。

Tsuji, A. and Tamai, I., Pharm. Res., 13, 963-977, 1996. 玉井郁巳、辻彰：ファルマシア、31、493-497、1995. 齋藤秀之、乾賢一：医学のあゆみ、179、393-397、1996. 玉井郁巳：薬物動態、11、642-650、1996. Okano, T. et al., J. Biol. Chem. 261, 14130-14134, 1986. Tsuji, A., American Chemical Society (eds. Taylor, M. D., Amidon, G. L.),Washington, D. C., 101-134, 1995. Schaffer, J. and Lodish, H., Cell, 79, 427-436, 1994. 林喜代美他：Drug Delivery System、11、205-213、1996. Fei, Y. -J. et al., Nature, 368, 563-566, 1994. Grundemann, D. et al., Nature, 372, 549-552, 1994. Okuda, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 500-507, 1996. Grundemann, D. et al., J. Biol. Chem. 272, 10408-10413, 1997. Gastroenterology 109 (4), 1274-1282 (1995)

本発明は、OATPファミリーに属する新規なトランスポーター遺伝子および該遺伝子がコードするタンパク質、並びにそれらの用途を提供することを課題とする。

本発明者らは、新規トランスポーターをコードする遺伝子を見いだす目的で、ヒトOATPトランスポーター（Gastroenterology 109 (4), 1274-1282 (1995)）（以下OATP-Aとする）の配列をクエリーとし、アメリカNCBI (National Center for Biotechnology Information, URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/index.html)のヒトEST（Expressed Sequence Tag）データベース（URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)に対してtBLASTnサーチを試みた。その結果、ヒトOATP-Aと有意な相同性を有するアミノ酸配列をコードし得るESTがいくつか見いだされた。次に、これらのESTの配列をクエリーとし再度データベースをサーチしたところ、既知であるヒトOATP-A遺伝子、およびヒトプロスタグランジントランスポーター遺伝子（J. Clin. Invest. 98 (5), 1142-1149 (1996)）（以下PGTとする）由来のESTであると明らかに判定されるもの以外はいずれも未知の遺伝子由来でありることが明らかとなり、それらは未同定のトランスポーター遺伝子由来のESTであると考えられた。そこで、これらのESTの配列を用い、その全長cDNAのクローニングを、PCR法、およびプラークハイブリダイゼーション法によるcDNAライブラリーのスクリーニングにより試みた。その結果、4つの新規なトランスポーター様タンパクをコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。これらの遺伝子がコードするタンパクはいずれもヒトOATP-Aに有意な相同性を示すことから、これらの遺伝子をそれぞれOATP-B, C, D, およびEと命名した。tBLASTnサーチで見いだされていたESTは、全てヒトOATP-A, B, C, D, EおよびヒトPGT遺伝子由来のESTであることが判明した。

上述のように、ヒトOATP-Aはナトリウムイオン非依存的に様々な内因物質や外来異物を輸送する能力を持つトランスポータータンパク質であり、ブロモスルフォフタレイン（bromosulfophthalein）、胆汁酸、ステロイドホルモンなどを輸送することが知られている。また、プロスタグランジンを輸送する能力を持つPGTもOATP-Aに有意な相同性を示す。これらのトランスポーター遺伝子は遺伝子ファミリー（OATPファミリー）を形成していると考えられ、生体にとって不要な物質の除去や、様々な物質の生体内濃度の調節などに関与している可能性が推測されている（J Biol Chem. 1998 Aug 28;273(35):22395-401）。

本発明において見いだされた新規OATPファミリーメンバーにおいても同様に、生体にとって必要な物質や、あるいは不要な物質の生体内濃度を調節する機能を持つことが推測される。また、本発明者らは、OATP-Cが医薬品であるβラクタム系の抗生物質を輸送する能力を持つことを明らかにした。このことから、本来は生体外異物である薬物もOATPファミリータンパク質によって細胞内へ取り込まれたり、あるいは排出されている可能性が推測される。従って、OATPファミリータンパク質の基質特異性などの輸送特性やその生体内分布を利用することにより、薬物動態を制御したり、より吸収性の高い薬物を迅速に設計、あるいはスクリーニングすることが可能であると考えられる。特に、RT-PCR法による解析から、OATP-Eは様々な固形癌細胞に高発現しているが、血球系細胞では極めて発現が少ないことが判明した。OATP-E遺伝子を用いたスクリーニング系を構築し、これを用いたスクリーニングを行うことによりOATP-Eにより特異的に細胞内へ取り込まれる抗癌剤を得ることができれば、それは血球系細胞に対する障害が軽減された抗癌剤となり得ることが期待される。

また、OATPファミリータンパク質が薬物の生体内動態の制御に関与しているとすると、その遺伝的多型性により、薬物動態が変化することが予想される。既に、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism; SNP）などの遺伝子多型により、遺伝子の発現量や、コードされるアミノ酸配列に個人差が生じることが知られている（Nat Genet. 1999 Jul;22(3):231-8; Nat Genet. 1999 Jul;22(3):239-47）。OATPファミリー遺伝子における遺伝子多型により、輸送活性や基質特異性などの輸送特性に個人差が生じ、ひいてはOATPファミリーによって制御されている薬物などの生体内動態に個人差が生じることが予想される。この様な個人差により、実際には、特定の薬物の有効性、反応性の差が生じることが推測される。よって、OATPファミリー遺伝子におけるSNPなどの多型を詳細に調べ、遺伝型と表現形質（薬物に対する反応性）との関連に関する情報が蓄積されたならば、遺伝型を遺伝診断により調べることによって、その個人の薬物に対する反応性を推測することが可能になると考えられる。

実際、本発明者らは、OATPファミリー遺伝子のクローニング過程において、以下の3種のアミノ酸変化を伴うSNPを健常人中に見いだした。
OATP-B遺伝子 486番目のコドンにおける多型（tct：Ser、あるいはttt：Phe）
OATP-C遺伝子 130番目のコドンにおける多型（aat：Asn、あるいはgat：Asp）
OATP-C遺伝子 174番目のコドンにおける多型（gtg：Val、あるいはgcg：Ala）

これら以外にもOATPファミリー遺伝子中に多型が存在し、表現形質と関連している可能性が推測される。

また、この様な生体内におけるOATPファミリータンパク質の重要な役割を鑑みると、その遺伝子変異による輸送機能の欠損に起因する疾患が存在することが推測される。実際、有機カチオントランスポーターの一つであるOCTN2トランスポーターにおいては、その遺伝子変異が全身性カルニチン欠乏症（Systemic Carnitine Deficiency; SCD）の原因となっていることが明らかとなっており（Nat Genet. 1999 Jan;21(1):91-4）、トランスポーター遺伝子の変異に起因する遺伝性疾患が実際に存在することがわかっている。この様なトランスポーター遺伝子の変異に起因する遺伝性疾患については、その原因となるトランスポーター遺伝子を直接調べる遺伝子診断が臨床上非常に重要である。

本発明により明らかとなったOATPファミリー遺伝子の構造を利用して、以上のようなOATPファミリー遺伝子の多型や変異を検出する遺伝子診断を行うことが可能となった。具体的には、OATPファミリー遺伝子そのものを利用すること、あるいはその塩基配列から作製される合成オリゴヌクレオチドをPCRのプライマーなどとして利用することにより遺伝子診断を実施することが可能である。また、最近ではDNAチップ技術、あるいはDNAアレイ技術と呼ばれる技術（Nat Genet. 1999 volume 21 Supplement pp 1 - 60; Science 1999 Jan 1;283(5398):83-7）により、遺伝子の構造や発現量をより簡便に検出することが可能になっている。これらの方法も、OATPファミリー遺伝子そのものを用いること、あるいはその塩基配列から作製される合成オリゴヌクレオチドを用いることにより実施することが可能である。

本発明は、新規なトランスポーターOATP-B、C、D、およびE、およびその遺伝子、並びにそれらの用途に関し、より具体的には、
１．トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｃ）配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNA。
２．配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするDNA、
３．（１）または（２）に記載のDNAが挿入されたベクター、
４．（１）若しくは（２）に記載のDNAまたは（３）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
５．（１）または（２）に記載のDNAによりコードされるタンパク質またはペプチド、
６．（４）に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（５）に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
７．（５）に記載のタンパク質に結合する抗体、
８．配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、
９．（５）に記載のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（５）に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、標識された披検化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された披検化合物を検出する工程、および
（ｄ）該細胞内に取り込まれる化合物を選択する工程、を含む方法、
１０．（５）に記載のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（５）に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、被検化合物および（５）に記載のタンパク質により輸送される標識された有機化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された有機化合物の量を測定する工程、および
（ｄ）被検化合物非存在下において測定した場合（対照）と比較して、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する工程、を含む方法、を提供するものである。

本発明者等により単離された新規なヒトトランスポーター「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、および「OATP-E」cDNAの塩基配列をそれぞれ配列番号：１、３、５、および７に、また、該cDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２、４、６、および８に示す。これらタンパク質は、ともにヒトOATP-Aトランスポーターと構造上の類似性を有しており、互いにファミリー(「OATP」ファミリー)を形成していると考えられる。

本発明のトランスポーターは、生体にとって必要な物質や不要な物質の生体内濃度を調節する機能を持つことが推測される。また、様々な薬物もOATPファミリータンパク質によって細胞内へ取り込まれたり、あるいは排出されている可能性が推測される。従って、OATPファミリータンパク質を利用して薬物動態を制御したり、より吸収性の高い薬物を迅速に設計、あるいはスクリーニングすることが可能であると考えられる。

本発明のトランスポータータンパク質には、上記ヒトトランスポーター「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、および「OATP-E」タンパク質の変異体が含まれる。「変異体」とは、配列番号：２、４、６、または８に記載の天然型の「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質のアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加、挿入などにより変異したアミノ酸配列を有するが、トランスポーター活性を有しているタンパク質を指す。タンパク質のアミノ酸の変異は人工的に行われたものでも、自然界において生じたものでもよい。

本発明において「トランスポーター活性を有する」とは、タンパク質が有機化合物を輸送する活性を有していることを指す。有機化合物としては、例えば、エストラジオール-17B-グルクロナイド、エストロン-3-スルフェート、ベンジルペニシリン、プロスタグランジンE2などが挙げられるが、これらに制限されない。

また、「輸送する活性」には、細胞外から細胞内へ有機化合物を輸送する活性のみならず、細胞内から細胞外へ有機化合物を輸送する活性をも含む意である。本発明のトランスポータータンパク質には、これら活性の双方を有するものおよびいずれか一方を有するものが含まれる。タンパク質の有機化合物を輸送する活性は、例えば、標識した有機化合物を細胞に添加して、その取りこみまたは排出を検出することにより測定することができる。例えば、実施例記載の方法により検出することが可能である。

本発明者らは、OATPファミリー遺伝子のクローニング過程において、以下の3種のアミノ酸変化を伴うSNPを健常人中に見いだした。
OATP-B遺伝子 486番目のコドンにおける多型（tct：Ser、あるいはttt：Phe）
OATP-C遺伝子 130番目のコドンにおける多型（aat：Asn、あるいはgat：Asp）
OATP-C遺伝子 174番目のコドンにおける多型（gtg：Val、あるいはgcg：Ala）

本発明のトランスポーターには、上記の変異を有するタンパク質、すなわち、配列番号：２の486位のアミノ酸がPheに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号：４の130位のアミノ酸がAspに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号：４の174位のアミノ酸がAlaに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。

「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、および「OATP-E」には、上記以外にも多型が存在していると考えられ、本発明には、これら「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、および「OATP-E」の多型が含まれる。これらの多型は、トランスポーターの発現量または活性に影響を及ぼし、その表現形質と関連している可能性が推測される。、OATPファミリー遺伝子とその表現形質との関係がさらに明らかとなれば、OATPファミリー遺伝子の多型や変異を検出することにより遺伝子診断を行うことが可能となると考えられる。

人為的にアミノ酸を改変する場合、当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、PCRによる部位特異的変異誘発システム（GIBCO-BRL,Gaithersburg,Maryland）、オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発法（Kramer,W.and Fritz,HJ (1987) Methods in Enzymol.,154:350-367）、Kunkel法（Methods Enzymol.85,2763-2766(1988)）などが挙げられる。アミノ酸の変異数および変異部位は本発明のタンパク質のトランスポーター活性が保持される限り特に制限はない。変異数は、置換であれば、通常、10アミノ酸以内であり、好ましくは6アミノ酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内であると考えられる。

変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。

あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、 Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。

ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２、４、６、または８）に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明のヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質をコードするDNAと他のペプチド又はタンパク質をコードするDNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、特に限定されない。

本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。

市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードするDNAを本発明のタンパク質をコードするDNAと融合させ、これにより調製された融合DNAを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。

また、本発明のトランスポータータンパク質には、上記ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質と構造上高い相同性を有し、トランスポーター活性を有するタンパク質が含まれる。このようなタンパク質としては、例えば、ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質に対応する他の哺乳動物由来のタンパク質が含まれる。ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質と構造上高い相同性を有するタンパク質を単離するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.press,1989）が挙げられる。即ち、上記ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質をコードするDNA配列（配列番号：１、３、５、もしくは７）またはその一部を基に、これと相同性の高い他の哺乳動物由来のDNAを、DNA同士の親和性を利用して単離し、単離したDNAから目的のタンパク質を調製することができる。DNAの単離に用いる他の生物としては、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。このようなDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件（ストリンジェントな条件）の例を示せば、以下の如くである。即ち、「ExpressHyb Hybridization Solution」(CLONTECH社製)を用い、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、37℃から55℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20分の洗浄を3回、次いで、1xSSC、0.1% SDS中、37℃で20分の洗浄を1回行う。

より好ましい条件（よりストリンジェントな条件）としては、「ExpressHyb Hybridization Solution」(CLONTECH社製)を用い、60℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、60℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20分の洗浄を3回、次いで、1xSSC、0.1% SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行う。

さらに好ましい条件（さらにストリンジェントな条件）としては、「ExpressHyb Hybridization Solution」(CLONTECH社製)を用い、68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、68℃で1時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後、2xSSC、0.1% SDS中、室温で20分の洗浄を3回、次いで、0.1xSSC、0.1% SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行う。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

また、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術以外にも、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を利用した技術により、同様に、ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」遺伝子と高い相同性を有する遺伝子を単離し、該遺伝子から目的のタンパク質を得ることが可能である。

このようなハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応技術を利用して単離されるタンパク質は、ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性は、アミノ酸レベルにおいて、少なくとも80％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相同性である。配列の相同性を決定するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。

本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質がトランスポーター活性を有している限り、本発明に含まれる。

本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするDNA(例えば配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列を有するDNA)を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。

また、本発明のタンパク質をグルタチオンSトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。

融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。

天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。

本発明は、また、本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなる部分ペプチドは、少なくとも7アミノ酸、好ましくは8アミノ酸以上、さらに好ましくは9アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、配列番号：２、４、６、または８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の機能ドメインからなる部分ペプチドなどが挙げられる。また、疎水性プロット解析から推定される疎水性領域や親水性領域の１つあるいは複数の領域を含む部分ペプチドが挙げられる。これらの部分ペプチドは１つの疎水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよいし、１つの親水性領域の一部あるいは全部を含んでいてもよい。

本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。

本発明のタンパク質をコードするDNAは、上述したような本発明のタンパク質の in vivo や in vitroにおける生産に利用される他、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明のタンパク質により治療可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のDNAは、本発明のタンパク質をコードしうるものであればいかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するDNAが含まれる。

本発明のDNAは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、本発明のDNAの配列（例えば、配列番号：１、３、５、または７）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。cDNAライブラリーは、例えばSambrook, J. et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法により調製してもよいし、市販の DNAライブラリーを用いてもよい。また、本発明のタンパク質を発現している細胞よりRNAを調製し、逆転写酵素によってcDNAにした後、本発明のDNAの配列（例えば、配列番号：１、３、５、または７）に基づいてオリゴDNAを合成し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、本発明のタンパク質をコードするcDNAを増幅させることにより調製することも可能である。

また、得られたcDNAの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。

具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、組織、臓器から、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) 、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit (Pharmacia) 等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。

得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction; PCR）を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) にしたがい、cDNAの合成および増幅を行うことができる。

得られたPCR産物から目的とするDNA断片を調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。

また、本発明のDNAにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R. et al., Nucelic Acids Research (1981) 9, r43-74）。また、本発明のDNAは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTAG）の挿入等が挙げられる。

本発明のDNAは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において179位の塩基Ａから2305位の塩基ＧからなるDNA、配列番号：３の塩基配列において100位の塩基Ａから2172位の塩基ＴからなるDNA、配列番号：５の塩基配列において１位の塩基Ａから2130位の塩基ＡからなるDNA、および配列番号：７の塩基配列において92位の塩基Ａから2257位の塩基ＣからなるDNAを包含する。

また、本発明のDNAは、配列番号：１の179位の塩基Ａから2305位の塩基Ｇの塩基配列において1635位のＣがＴに置換された塩基配列からなるDNA、配列番号：３の100位の塩基Ａから2172位の塩基Ｔの塩基配列において487位のＡがＧに置換された塩基配列からなるDNA、配列番号：３の100位の塩基Ａから2172位の塩基Ｔの塩基配列において620位のＴがＣに置換された塩基配列からなるDNAを包含する。

本発明のDNAはまた、配列番号：１、３、５、または７に示す塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAであり、トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするDNAを含む。ハイブリダイゼーションの条件としては、上記の条件が挙げられる。ハイブリダイズするDNAは、好ましくは天然由来のDNA、例えばcDNA又は染色体DNAである。

本発明は、また、本発明のDNAが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のDNAを保持したり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。

ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（Qiagen社製）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。

また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。

大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovirus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（In vitrogen社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。

CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。

さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。

一方、動物の生体内で本発明のDNAを発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明のトランスポーター遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAdexlcw）やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning ,5.61-5.63）。生体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。

また、本発明は、本発明のDNAまたは本発明のベクターが導入された形質転換細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS 、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞としては、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。得られた形質転換体からの組換えタンパク質の精製は、常法、例えば、文献「The Qiaexpressionist handbook,Qiagen,Hilden,Germany」記載の方法を用いて行うことが可能である。

植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。

これらの細胞を目的とするDNAにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

一方、in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするDNAを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。

例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。

また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。

さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。

これにより得られた本発明のタンパク質は、形質転換細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。

クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。

なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。

本発明は、また、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。

抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。

本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質であってもよいし、また、タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。

本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該形質転換細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。

げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をPBS (Phosphate-Buffered Saline) や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、4〜21日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。

ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインAあるいはプロテインGカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンGあるいはMを調製することができる。

モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。

前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法(Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭63-17688号公報）。

次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。

例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号WO92-03918、WO93-2227、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735およびWO96-34096参照）。

ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子 (oncogene) により不死化させた細胞を用いてもよい。

このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照)。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。

さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。

抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のCDR（相補性決定領域）とヒト抗体由来のFR（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。

前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) が、これらに限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）等により行うことができる。

アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) 等が挙げられる。

アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる(Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーはHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。

また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ELISAを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のタンパク質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばそのC末端からなる断片あるいはN末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、BIAcore(Pharmacia製)を使用することができる。

これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明のタンパク質の検出又は測定方法を実施することができる。本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。

本発明はまた、ヒト「OATP-B」、「OATP-C」、「OATP-D」、または「OATP-E」タンパク質をコードするDNA（配列番号：１、３、５、または７）またはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。

ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。

このようなDNAには、本発明のタンパク質をコードするDNAの検出や増幅に用いるプローブやプライマー、本発明のタンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム等）が含まれる。また、このようなDNAは、DNAチップの作製に利用することもできる。

プライマーとして用いる場合、3'側の領域を相補的にして、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１、３、５、または７の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１、３、５、または７の塩基配列中の連続する少なくとも15個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも15個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA又はmRNAの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、DNA またはmRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１、３、５、または７に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、1又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のタンパク質の産生細胞に作用して、該タンパク質をコードするDNA又はmRNAに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、mRNAの分解を促進したりして、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質の作用を抑制する効果を有する。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。

また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ-L-リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、0.1 〜100mg/kg、好ましくは0.1 〜50mg/kg の範囲で投与することができる。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害し、従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。

本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を利用した、薬物の体内吸収、体内動態の制御が挙げられる。本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を詳細に解析することにより、このトランスポーターによって輸送され得る薬剤のドラッグデザインが可能であり、これにより本発明のトランスポータータンパク質を介して薬物の体内吸収を高めることができると考えられる。デザインされる薬物には従来の脂溶性をあげるような修飾は不要であるため、水溶性の扱いやすい薬物が迅速かつ効率的に開発できるようになると考えられる。また開発された薬物の吸収は基本的に本発明のトランスポータータンパク質の生体内分布に従うと考えられるため、臓器特異的な薬物の送達が可能である。特に本発明のトランスポータータンパク質の体内分布が、標的臓器と一致するような薬物の場合、理想的なドラッグデリバリーシステム(DDS)となると考えられる。また、他のトランスポーターによる薬物の吸収を期待しているが、本発明のトランスポータータンパク質による吸収は望ましくない場合、本発明のトランスポータータンパク質の基質特異性を考慮に入れたドラッグデザインを行うことにより、他のトランスポータータンパク質に選択的な薬物の創造が行えると考えられる。例えば、OATP-Eは様々な固形癌細胞に高発現しているが、血球系細胞では極めて発現が少ないことが判明した。OATP-E遺伝子を用いたスクリーニング系を構築し、これを用いたスクリーニングを行うことによりOATP-Eにより特異的に細胞内へ取り込まれる抗癌剤を得ることができれば、それは血球系細胞に対する障害が軽減された抗癌剤となり得ることが期待される。

本発明のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物のスクリーニングは、例えば、以下のように行うことができる。まず、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する。例えば、本発明のタンパク質を発現するベクターを構築し、これを適当な細胞に導入すればよい。次いで、該細胞に対し、標識された被検化合物を接触させる。被検化合物としては、例えば、低分子化合物を用いることができる。被検化合物の標識としては、検出可能であれば特に制限はなく、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられる。次いで、該細胞内に取り込まれた、標識された被検化合物を検出する。検出は、放射標識化合物の場合は、液体シンチレーションカウンターなどによる放射活性の測定、蛍光標識化合物の場合は蛍光光度計などによる蛍光光度の測定により行うことができる。また、標識化合物を使わない場合においても、本発明のタンパク質により細胞内へ取り込まれた化合物の生物活性（例えば細胞毒性、細胞増殖促進活性）などを指標にしたバイオアッセイにより輸送量を測定することができる。次いで、上記検出の結果、該細胞内に取り込まれる化合物を選択する。具体的には、このスクリーニングは、例えば、実施例３に記載の輸送活性の検出系を利用して行うことができる。これにより単離された化合物は、上述した薬物の創造に利用することができる。

また、他の本発明の応用としては、本発明のトランスポータータンパク質を標的とした薬物の開発が考えられる。栄養物質や薬物の吸収機構として、あるいは薬物や生体内代謝物の排泄機構としてのトランスポーターの重要性を考えると、その機能が損なわれること、または異常に亢進することに起因する疾患が存在すると考えられる。そのような疾患に対しては、本発明のトランスポータータンパク質の機能を阻害、あるいは亢進する化合物や、本発明のトランスポーター遺伝子の発現量や、タンパク量を調節するするような化合物を薬剤として用いると効果的であると考えられる。

本発明のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害する化合物のスクリーニングは、例えば、以下のように行うことができる。まず、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する。次いで、該細胞に対し、被検化合物および本発明のタンパク質により輸送される標識された有機化合物を接触させる。用いられる有機化合物としては、例えば、エストラジオール-17B-グルクロナイド、エストロン-3-スルフェート、ベンジルペニシリン、プロスタグランジンE2などが挙げられるが、これらに制限されない。次いで、該細胞内に取り込まれた、標識された有機化合物の量を測定する。次いで、被検化合物非存在下において同様に測定した場合（対照）と比較して、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する。具体的には、このスクリーニングは、例えば、実施例３に記載の輸送活性の検出系を利用して行うことができる。この結果、被検化合物の接触により、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量が増加すれば、該化合物は本発明のタンパク質の有機化合物を輸送する活性を促進すると判定される。一方、被検化合物の接触により、該細胞内に取り込まれた標識された有機化合物の量が減少すれば、該化合物は本発明のタンパク質の有機化合物を輸送する活性を阻害すると判定される。

本発明のスクリーニングにより得られる化合物は、本発明タンパク質を利用した薬剤治療や、本発明のタンパク質による物質輸送の制御を介した治療などへの応用が考えられる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、その構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換してもよい。

本発明のタンパク質に結合する化合物や本発明のタンパク質およびその部分ペプチドをヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、タンパク質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

本発明のDNAは、本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患に対する遺伝子治療への応用も考えられる。遺伝子治療に用いる場合には、本発明のDNAをアデノウイルスベクター（例えば、pAdexLcw）やレトロウイルスベクター（例えば、pZIPneo）などに挿入して、生体内に投与する。投与方法は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。また、アンチセンス合成DNAを生体内に直接、または上記ベクターに挿入して投与して治療を行うことも考えられる。また、本発明のタンパク質の活性異常や発現量異常に起因する疾患の診断への応用も考えられる。

図１は、RT-PCR法により、ヒト胎児組織、および成体組織における各OATPファミリー遺伝子の発現を調べた結果を示す写真である。１．胎児脳、２．胎児心臓、３．胎児腎臓、４．胎児肝臓、５．胎児肺、６．胎児骨格筋、７．胎児脾臓、８．胎児胸腺、９．成体膵臓、１０．成体腎臓、１１．成体骨格筋、１２．成体肝臓、１３．成体肺、１４．成体胎盤、１５．成体脳、１６．成体心臓、１７．成体末梢血白血球、１８．成体大腸、１９．成体小腸、２０．成体卵巣、２１．成体精巣、２２．成体前立腺、２３．成体胸腺、２４．成体脾臓、２５．成体骨髄、２６．成体リンパ節、２７．成体扁桃腺。図２は、RT-PCR法により、ヒト癌細胞における各OATPファミリー遺伝子の発現を調べた結果を示す写真である。１．乳癌細胞（GI-101）、２．肺癌細胞（LX-1）、３．大腸腺腫細胞（CX-1）、４．肺癌細胞（GI-117）、５．前立腺腫細胞（PC3）、６．大腸腺腫細胞（GI-112）、７．卵巣癌細胞（GI-102）、８．膵臓腺腫細胞（GI-103）。図３は、各種ラベル体に対するトランスポート実験の結果を示す図である。OATP-Cを導入したHEK293細胞（OATP-C）、およびベクターのみを導入したHEK293細胞（モック）における各種ラベル体の輸送活性を表す。図４は、OATP-Cを発現させたHEK293細胞の各種濃度におけるPCGの輸送活性を示す図である。図５は、OATP-Cを発現させたHEK293細胞のPCG輸送活性に対する各種βラクタム系抗生物質の影響を示す図である。コントロール（阻害剤無し）における活性を100%として表してある。図６は、エストラジオール-17β-グルクロナイド輸送活性におけるナトリウムイオン、および塩素イオンの要求性を示す図である。「OATP-C」はOATP-Cを導入したHEK293細胞、および「モック」はベクターのみを導入したHEK293細胞におけるエストラジオール-17β-グルクロナイドの輸送活性をそれぞれ表す。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。一般的な分子生物学的な実験操作に関しては、基本的に、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.、Maniatis, T.著「Molecular Cloning」Cold Spring Harbor Lab.（1989）などの一般的な実験書に記載の方法に従った。

[実施例１] OATP-B, C, DおよびE遺伝子の全オープンリーディングフレーム(ORF)を含むcDNAのクローニング
OATP-B
ヒトOATP-Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るESTであるW19504およびAI052501の塩基配列をもとに、それぞれOABE-1プライマー（5' gat aag ctt ctg tgt ggc cca aga aga act gac 3'／配列番号：９）およびOABE-6プライマー（5' gat aag ctt tac tgc tgt ggc tgc tac tct tgg 3'／配列番号：１０）を作製した。これらのプライマーを用い、ヒト成体脳polyA⁺ RNA由来cDNAを鋳型としてPCRを行い、全ORFを含むOATP-B cDNAを増幅した。PCRにより増幅したOATP-B cDNAをプライマーに付加したHind IIIサイトにより切断し、哺乳動物細胞用発現ベクターであるpcDNA3ベクター(Invitrogen社)のHind IIIサイトに組み込んだ。複数のクローンをシークエンシングすることによりPCRエラーの無いクローン（pcDNA3/OATP-B）を選択し、発現実験に用いた。

OATP-C
ヒトOATP-Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得る以下のESTの塩基配列からそれぞれのプライマーを作製した。
EST H62893；2893-4プライマー（5' aag ctt ccg tca ata aaa cca aca 3'／配列番号：１１）および2893-1プライマー（5' ctt ctc ttg ttg gtt tta ttg acg 3'／配列番号：１２）
EST R29414；9414-2プライマー（5' tgt aag tta ttc cat tgt ttc cac 3'／配列番号：１３）
EST T73863；3863-1プライマー（5' ttg gtg ctt tta ctt atg tct tca 3'／配列番号：１４）
これらのプライマーを用い、3つの断片に分けヒトOATP-Cのクローニングを行った。

5'側断片は、5' RACE（Rapid Amplification cDNA Ends）法によりクローニングした。すなわち、ヒト胎児肝臓由来 Marathon-Ready^TM cDNA（CLONTECH社）を鋳型とし、キットに附属のリンカープライマーであるAP1プライマーと2893-4プライマーとの組み合わせによるPCRを行い、ヒトOATP-C cDNAの5'側断片、約400bpを増幅した。このcDNA断片をpT7Blue-Tベクター（Novagen社）にTAクローニング法により組み込み、得られたサブクローンを複数シークエンシングすることによりヒトOATP-C cDNAの5'側の配列を決定した。また、3'側も同様に3' RACE法によりクローニングした。すなわち、ヒト胎児肝臓由来Marathon-Ready^TM cDNAを鋳型とし、キットに附属のリンカープライマーであるAP1プライマーと3863-1プライマーとの組み合わせのPCRによりヒトOATP-C cDNAの3'側断片、約1.5kbpを増幅した。このcDNA断片をpT7Blue-TベクターにTAクローニング法により組み込み、得られたサブクローンを複数シークエンシングすることによりヒトOATP-C cDNAの3'側の配列を決定した。さらにこれらの間に挟まれる中央部は、ヒト成体肝臓由来cDNAを鋳型とし、2893-1プライマーと9414-2プライマーとの組み合わせによるPCRにより増幅した。得られた役1.2kbpの断片をゲル濾過法により精製し、直接シークエンシングすることにより配列を決定した。この様にして得られた配列を組み合わせることにより、ヒトOATP-Cの全ORFを含むcDNAの配列を決定した。

発現用のプラスミドは以下のようにして構築した。すなわち、ヒト成体肝臓由来cDNAを鋳型とし、以下のプライマーの組み合わせによるPCRによりヒトOATP-Cを2つの断片に分け増幅した。
5'側
OAHC17プライマー（5' gat ggt acc aaa ctg agc atc aac aac aaa aac 3'／配列番号：１５）
OAHC18プライマー（5' gat ggt acc cat cga gaa tca gta gga gtt atc 3'／配列番号：１６）
3'側
OAHC21プライマー（5' gat ggt acc tac cct ggg atc tct gtt ttc taa 3'／配列番号：１７）
OAHC22プライマー（5' gat ggt acc gtt tgg aaa cac aga agc aga agt 3'／配列番号：１８）

これらの断片をそれぞれpT7Blue-Tベクターにサブクローニングし、PCRエラーのないクローンを選択した。重なり合う領域に存在するBgl IIサイトで両者を連結した後、両端に存在するKpn Iサイトで切断し、pcDNA3ベクターのKpn Iサイトに組み込み、発現用プラスミドpcDNA3/OATP-Cを得た。

OATP-D
ヒトOATP-Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るEST AA280224から0224-3プライマー（5' cgc cct cgt ggt ttt tga tgt agc 3'／配列番号：１９）を作製した。さらに、ヒト第15番染色体 q26.1 領域由来のPACクローン（pDJ430i19）の配列の一部もヒトOATP-Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得ることを見いだした。この配列からPAC151-2プライマー（5' gcg gtg cct tac tct tct tct ctt 3'／配列番号：２０）を作製した。ヒト成体脳由来cDNAを鋳型とし、これらのプライマーを用いたPCRを行ったところ約1.1kbpのcDNA断片が増幅された。これをプローブとし、ヒト成体腎臓由来5'-STRETCH PLUS cDANライブラリー（CLONTECH社）に対しプラークハイブリダイゼーション法によるスクリーニングを行った。得られたポジティブクローンのファージ懸濁液を鋳型とし、上記のプライマー、あるいは明らかになった配列から作製したOATP-D遺伝子特異的なプライマーと、λgt-10ベクターの配列から作製したGT10 S1プライマー（5' ctt ttg agc aag ttc agc ct 3'／配列番号：２１）、あるいはGT10 A1プライマー（5' aga ggt ggc tta tga gta ttt ctt 3'／配列番号：２２）との組み合わせによるPCRを行い、増幅断片を直接シークエンシングすることにより配列を決定した。さらに、新たに得られた領域を含むDNA断片をプローブとして用いスクリーニングを行うことにより、ファージクローンによりカバーされる領域を延長していき、全ORFの配列を決定した。

OATP-E
ヒトOATP-Aと有意な相同性を示すアミノ酸配列をコードし得るEST AI347130から、7130-1プライマー（5' tgt aca agg tgc tgg gcg tcc tct 3'／配列番号：２３）、および7130-4プライマー（5' cga tcg ggt ata aaa cac att cta 3'／配列番号：２４）を作製した。ヒト成体肺由来cDNAを鋳型とし、これらのプライマーを用いたPCRを行ったところ約400bpのcDNA断片が増幅された。これをプローブとし、ヒト成体腎臓由来5'-STRETCH PLUS cDANライブラリー（CLONTECH社）に対しプラークハイブリダイゼーション法によるスクリーニングを行った。得られたポジティブクローンのファージ懸濁液を鋳型とし、上記のプライマー、あるいは明らかになった配列から作製したOATP-E遺伝子特異的なプライマーと、λgt-10ベクターの配列から作製したGT10 S1プライマー、あるいはGT10 A1プライマーとの組み合わせによるPCRを行い、増幅断片を直接シークエンシングすることにより配列を決定した。さらに、新たに得られた領域を含むDNA断片をプローブとして用いスクリーニングを行うことにより、ファージクローンによりカバーされる領域を延長していき、全ORFの配列を決定した。

発現用のプラスミドは以下のようにして構築した。すなわち、以下のプライマーの組み合わせによるPCRによりヒトOATP-Eを5'側および3'側の2つの断片に分け増幅した。5'側断片はヒト成体肺由来cDNAを、また3'側断片はヒト胎児肺由来cDNAを鋳型とし増幅した。
5'側
OAE17プライマー（5' gat aag ctt tgc gtg gct gaa gcc tcg aag tca 3'／配列番号：２５）
OAE18プライマー（5' gat gga tcc act ggt gca ttt ccg ccg ctc tca 3'／配列番号：２６）
3'側
OAE21プライマー（5' gat aag ctt tct tca ccg ccg ttc cca tcc ttg 3'／配列番号：２７）
OAE22プライマー（5' gat gga tcc act gtt ctg tca tca gga aat gct 3'／配列番号：２８）

これらの断片をそれぞれpcDNA3ベクターのHind III / BamH Iサイトにサブクローニングし、PCRエラーのないクローンを選択した。重なり合う領域に存在するBstP Iサイトで両者を連結し、発現用プラスミドpcDNA3/OATP-Eを得た。

PCR
PCRは基本的に以下に示す条件を基本とし、適宜変更を加えて行った。
<反応液組成>
鋳型DNA
10 x ExTaqバッファー (TaKaRa社) 5μl
2.5mM dNTPs (TaKaRa社) 4μl
ExTaq (TaKaRa社) 0.5μl
TaqStart^TM Antibody (CLONTECH) 0.5μl
センスプライマー 10〜20pmol
アンチセンスプライマー 10〜20pmol
／全量 50μl
<反応条件>
一般的なPCR
94℃、2分→（94℃、30秒→55℃〜62℃、30秒→72℃、2〜3分） x 25〜40サイクル→72℃、10分
RACE法
94℃、2分→（94℃、30秒→68℃、4分） x 5サイクル→（94℃、30秒→62℃、30秒→72℃、2分） x 30サイクル→72℃、10分

cDNAの合成
PCRの鋳型として用いるcDNAは、SUPERSCRIPT^TM II RNase H^- 逆転写酵素（GIBCO BRL社）を用い、メーカー推奨の一般的な方法に従って作製した。すなわち、10μgの全RNA、あるいは2μgのポリA⁺ RNAと、約1μgのオリゴdTプライマー（GIBCO BRL社）、あるいは約0.5μgのランダムヘキサマープライマー（GIBCO BRL社）を混合し、70℃で10分加温した後氷冷した。これにfirst strand緩衝液（GIBCO BRL社）、終濃度10mMのDTT、終濃度0.5mMのdNTPs（GIBCO BRL社）、および400U〜800UのSUPERSCRIPT^TM II RNase H^- 逆転写酵素を加え、42℃で1時間保温することによりcDNA合成を行った。次いで70℃で15分間加温し、その一部を鋳型として使用した。

ハイブリダイゼーション
PCRにより増幅したDNA断片、あるいはアガロース電気泳動後のゲルから精製したDNA断片などを、Ready-to Go DNA labelling beads (Pharmacia社)を用いたランダムプライマー法により[α-³²P]dCTPでラベルし、プローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは、ExpressHyb Hybridization Solution (CLONTECH社)を用い、メーカー推奨の方法に従い、68℃で2時間以上保温することにより行った。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを、2 x SSC, 0.1% SDS溶液中、室温で、20分、2回洗浄し、次いで、0.1 X SSC, 0.1% SDS溶液中、50℃で、20分、2回の洗浄を行った。

[実施例２] RT-PCR法による解析
以下に示すそれぞれの遺伝子に特異的なプライマーを用い、RT-PCR法による各遺伝子発現の組織分布の解析を行った。
OATP-A
OAA-1プライマー（5' aag aag agg tca aga agg aaa aat 3'／配列番号：２９）
OAA-2プライマー（5' gga gca tca agg aac agt cag gtc 3'／配列番号：３０）
OATP-B
4742-1プライマー（5' cgt gcg gcc aag tgt gtt cca taa 3'／配列番号：３１）
4742-2プライマー（5' gaa gga gta gcc cca tag cca atc 3'／配列番号：３２）
OATP-C
9414-1プライマー（5' tgt cat tgt cct ttt acc tat tat 3'／配列番号：３３）
9414-2プライマー（前出 5' tgt aag tta ttc cat tgt ttc cac 3'／配列番号：１３）
OATP-D
0224-2プライマー（5' ctc aaa tcc ttc gcc ttc atc ctg 3'／配列番号：３４）
0224-4プライマー（5' agg gtc aga gta gag gca aag aac 3'／配列番号：３５）
OATP-E
7130-2プライマー（5' cac ggc ggg cac tca gca ttt cct 3'／配列番号：３６）
7130-4プライマー（前出 5' cga tcg ggt ata aaa cac att cta 3'／配列番号：２４）
G3PDH
Upstreamプライマー（5' TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT 3'／配列番号：３７）
Downstreamプライマー（5' CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 3'／配列番号：３８）

Multiple Tissue cDNA（MTC^TM）Panel（CLONTECH社）に含まれる、各種臓器、細胞由来のcDNAの適当量を鋳型として用い、上記プライマーを用いてPCRを行った。増幅産物をアガロース電気泳動し解析を行った（図１、図２）。OATP-Aは脳、肝臓に比較的局限した発現パターンを示した。また、OATP-Cは胎児組織においても成体組織においても、肝臓に発現が局限していることが明らかとなった。OATP-B、OATP-D、OATP-Eは比較的広範囲の組織において発現が見られたが、特に、OATP-B、OATP-Eにおいては末梢血白血球や、胸腺、脾臓において発現が極めて低いことが明らかとなった。このことから、OATP-B、OATP-Eは血球系細胞における発現が低いことが強く示唆される。一方、癌細胞における発現を調べたところ（図２）、OATP-DおよびOATP-Eは癌細胞において高頻度で発現していることが明らかとなった。この結果から、OATP-Eによって特異的に細胞に取り込まれる抗癌剤を作ることが可能であれば、それは造血細胞に対する副作用（骨髄抑制など）が軽減した抗癌剤となり得ることが期待される。

[実施例３] トランスポート実験
pcDNA3/OATP-C、及びコントロールとしてインサートを含まないpcDNA3ベクター（モック）を、リン酸カルシウム法によりヒト胎児腎臓由来細胞株HEK293細胞に導入した。すなわち、プラスミドDNA10μg、ヘペス緩衝液(137mM NaCl、5mM KCl、0.7mM Na₂HPO₄、6mMデキストロース、21mMヘペス pH7.1) 1ml、2M CaCl₂ 62.5μlを混合し、30分以上室温で静置する事によりリン酸カルシウム共沈物を生成させた。10cmプレート1枚あたり1.5 x 10⁶個の細胞を蒔き、24時間培養した後、先のリン酸カルシウム共沈物を加え24時間培養し、その後PBS（Phosphate buffered saline）でプレートを洗浄し、培地を加えさらに24時間培養した。

プラスミドDNAを導入した細胞を用いて以下の手順に従ってトランスポート実験を行った。プレートからラバーポリスマンを用いて細胞をはがし、トランスポート緩衝液（125mM NaCl、4.8mM KCl、5.6mM (+)-グルコース、1.2mM CaCl₂、1.2mM KH₂PO₄、1.2mM MgSO₄、25mMヘペス pH7.4）に懸濁し、20分間プレインキュベーションを行った。ついで各種基質のラベル体（[³H]メトトレキセート、[³H]ジゴキシン、[³H]ウワバイン、[³H]プロスタグランジンE2、[³H]エストラジオール-17β-グルクロナイド、[³H]エストロン-3-スルフェート、[¹⁴C]PCG<ベンジルペニシリン>など）を適当量添加し、37℃にて一定時間インキュベートを行った。これを、3M KCl層の上にシリコンオイルと液体パラフィンの混合物（比重=1.022）を重層して作製したシリコンレイヤー上に重層し、遠心する事により細胞を分離した。細胞の放射活性を測定し、細胞内へのトランスポート能とした。なおこの際、1 x 10⁶個の細胞を1ポイントとして用いた。

また、HEK293細胞の培養は、ダルベッコMEM, 10% FCS（ウシ胎児血清）を培地とし、5%二酸化炭素中、37℃で行った。

OATP-Cを発現させたHEK293細胞における輸送活性を測定したところ、エストラジオール-17β-グルクロナイド、エストロン-3-スルフェート、PCGにおいて明らかな輸送が観察された。また、メトトレキセート、ウワバイン、プロスタグランジンE2においても弱い活性が観察された（図３）。

次に、OATP-CのPCG輸送におけるKm（ミカエリス定数）値を求めるために、様々な濃度の[¹⁴C]PCGを加えた場合の取り込み量を測定した（図４）。OATP-Cを発現させた細胞におけるPCGの取り込み量をLineweaver-Burk逆数プロットすることにより、Km値は983±289μMであることが求められた。また反応の最大速度Vmaxは5.45±0.63（nmol/mg/15 min）であることが求められた。

次に、OATP-CによるPCGの輸送に対する、各種βラクタム系抗生物質の影響を調べた（図５）。4μMの[¹⁴C]PCGに対して各種βラクタム系抗生物質を1mM添加してその輸送活性への影響を調べたところ、セファゾリン、セフォペラゾン、セフピラミド、ナフシリンにおいて顕著な阻害活性が観察された。また、セファロリジン、セファレキシンによっても弱い阻害活性が観察された。この結果より、これらのβラクタム系抗生物質も、同じβラクタム系抗生物質であるPCGと同様に、OATPファミリータンパクにより輸送され得ることが強く示唆される。

次に、OATP-Cによるエストラジオール-17β-グルクロナイドの輸送におけるナトリウムイオン、および塩素イオンの要求性を調べた（図６）。トランスポート緩衝液におけるナトリウムイオンをN-メチルグルカミンに変更した場合においても、また、塩素イオンをグルコネートに変更した場合においても、エストラジオール-17β-グルクロナイドの輸送は変化を受けなかった。このことから、OATP-Cによる輸送はナトリウムイオン非依存的であることがわかった。

本発明により、新規なトランスポータータンパク質およびその遺伝子が提供された。これらは、本発明のトランスポータータンパク質を介して輸送される新規なデザインの薬物の開発や本発明のトランスポータータンパク質の発現異常や機能異常などに起因する疾患の治療薬の開発に利用することが可能である。さらには遺伝子診断などの診断や遺伝子治療への応用も考えられる。例えば、本発明のトランスポーター遺伝子のSNP診断などにより、薬物の有効性に関する個人差を考慮したテーラーメイドの治療計画が可能になる。

Claims

トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
（ｃ）配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｄ）配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNA。
配列番号：２、４、６、または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするDNA。
請求項１または２に記載のDNAが挿入されたベクター。
請求項１若しくは２に記載のDNAまたは請求項３に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
請求項１または２に記載のDNAによりコードされるタンパク質またはペプチド。
請求項４に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項５に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法。
請求項５に記載のタンパク質に結合する抗体。
配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
請求項５に記載のタンパク質により細胞外から細胞内へ輸送される化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項５に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、標識された披検化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された披検化合物を検出する工程、および
（ｄ）該細胞内に取り込まれる化合物を選択する工程、を含む方法。
請求項５に記載のタンパク質のトランスポーター活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項５に記載のタンパク質を細胞膜上に発現する細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に対し、被検化合物および請求項５に記載のタンパク質により輸送される標識された有機化合物を接触させる工程、
（ｃ）該細胞内に取り込まれた、標識された有機化合物の量を測定する工程、および
（ｄ）被検化合物非存在下において測定した場合（対照）と比較して、該細胞内に取り込まれる標識された有機化合物の量を増加または減少させる化合物を選択する工程、を含む方法。