JP4758915B2

JP4758915B2 - 多重層リポソームおよびその製造方法

Info

Publication number: JP4758915B2
Application number: JP2006553042A
Authority: JP
Inventors: パク，ドク−フン; リー，ジョン−ソン; ジュン，クァン−ソン
Original assignee: バイオスペクトラム，インコーポレイテッド
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2024-08-06
Also published as: US20070082042A1; JP2007522205A; EP1773298A1; WO2006014035A1

Description

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は、経皮吸収用多重層リポソームに関する。より具体的には、本発明は、スクアレン、ステロール、セラマイド、中性脂質または油、脂肪酸およびレシチンを含む油相成分の混合物を用いて製造され、粒子サイズが２００〜５０００ｎｍであり、内部に生理活性有効成分を捕集することができる、経皮吸収用多重層リポソームおよびその製造方法に関する。

〔背景技術〕
細胞水準における効能があると知られている物質を、複雑な構造を持つ皮膚に適用するとき、度々その効果が全く現れない場合が多いため、機能性化粧品または関連機能性原料を製造するには皮膚構造に対する理解を必要とする。実際、大部分の皮膚科学者と皮膚科医師も、試験管で効能を示す物質が人体では効能を示さない場合があることを経験的に知っている。このような根源的な理由は、皮膚細胞の構造とこれを構成する皮膚細胞の存在様相により、有効成分が皮膚細胞に到達する場合にのみ効果を期待することができるためである。

皮膚は、人体器官の中でも最も大きい器官であって、表皮、真皮および皮下脂肪から構成されている。皮膚は、いろいろの役割を担当しているが、その主要機能としては、人体の臓器保護機能、障壁機能、温度調節機能、排泄機能、および呼吸機能などがある。表皮と真皮の厚さは部位によって異なるが、約２〜５ｍｍ程度であり、皮膚脂肪の厚さは人によって大きく異なる。真皮の外側にある表皮は、その厚さが平均０．１ｍｍ程度にしかならないが、主に角質形成細胞という皮膚細胞から作られており、この角質形成細胞の間に、茶色の色素を作る色素細胞、および皮膚免疫と関係のある細胞が散在している。表皮はさらに下から基底層、有棘層、顆粒層、角質層に区分されるが、表皮を構成する角質形成細胞は、基底層から発生し、ケラチン繊維が発達する有棘層、および顕微鏡でみたとき細胞内に顆粒が形成される顆粒層を経て、皮膚の最外郭で前記ケラチン繊維と顆粒が堅く結合した状態の死細胞からなる角質層を形成する。１０〜２０層程度の平らな角質細胞からなる角質層は、水和すると、乾燥重量の数倍に達する水を含有することができ、約１０μｍ程度の厚さを持つが、皮膚疾患の治療を目的とする薬物や美容を目的とする化粧料などの適用の際に最も大きい障壁として作用する。このような角質層における細胞間隙の占有割合が１０〜３０％であって一般組織における細胞間隙の占有割合よりは大きい方であり、多層の中性脂質または油の二重膜で充填されているため、角質層の障壁機能に重要な役割をする。このような皮膚、特に角質層の障壁機能のため、治療用薬物または化粧料の開発の際に、経皮吸収性は非常に重要な検討事項の一つとなっている。

したがって、試験管試験で効能があると知られている物質の皮膚に対する効能は、実際、動物の皮膚または人間の皮膚を用いて物質の浸透程度をまず考察すべきである。韓国の場合、機能性化粧品は、皺の改善、美白およびＵＶカットに関連した製品に限られている。ＵＶカット製品の場合は、皮膚の表面に二酸化チタンなどの紫外線を散乱することが可能な化学成分を使用することができ、あるいは皮膚の表面で紫外線を吸収することが可能な吸収特性の化学物質を使用することができる。皺改善の場合は、皮膚の最外郭層である角質層または表皮層では、その効果を期待することが難しく、コラーゲンの生合成に関連した細胞が集中的に集まっている真皮層で効能を示さなければ実際的な皺改善効果を期待することができない。また、美白効果は、特に細胞の中でもメラニン生成細胞に対する効果を示さなければならないことにより、メラニン生成細胞が存在する表皮層の最下部でその効能を示すことができなければならない。結論的に、試験管試験で効能があると知られている物質が人体を対象とした皮膚に対する効能程度は、その物質自体の皮膚浸透力と密接な相関関係を持つ。よって、ある物質の皺改善または美白に対する機能性を示そうとする場合、皮膚においてその物質の効能を及ぼすことが可能な部位まで一定の水準浸透することができる能力が重要である。このような物質自体の皮膚に対する浸透力は、その物質の物理化学的特性によって決定されるが、通常、油溶性成分が水溶性成分より、分子量の小さい物質が分子量の高い物質より、そして物質量の多い場合が物質量の少ない場合よりよく浸透すると知られている。

浸透が難しい場合、特定の剤形または特定の技術を用いてその物質の皮膚浸透性を高めることが可能であれば、皮膚への適用の際に実際的な効能を期待することができる。また、皮膚浸透試験で得られた基本資料に基づいてその物質の使用濃度および剤形を定めることにより、実際製品化の際に使用物質を用いた機能性製品が最も良い効能を示すことができるようにする。

皮膚は、皮膚細胞間の間隙がまるで層状構造のように水層−油層−水層−油層などの反復的な層からなっており、油層の特性は、細胞膜の構造と類似の物理化学的性質を示すため（図１）、アデノシンまたはビタミンＣ等の親水性物質は大分通過し難い。皮膚を介しての有効成分の主要通路は、皮膚細胞を直接通る方法、皮膚細胞の間隙を通る方法、毛穴などを通る方法などが知られている。一般に、毛穴が大きいため、毛穴を介して主に浸透するものと推定されるが、実際皮膚を介しての有効成分の浸透は約１％程度に止まる。実際には、大部分の有効成分が皮膚細胞の間隙を介して浸透するものと知られている。皮膚の間隙は、その大きさが３０〜９０ｎｍ以下であり、その間隙を通過するためには、その間隙よりも小さいサイズが必須的に要求される。このような理由により、大部分の化粧業界で１００ｎｍ以下の小さいサイズのカプセルやミセルなどを製造するために様々な技術を開発してきた。また、このような皮膚浸透技術としては、皮膚間隙を拡張させるアルコール、イソプロピルアルコールおよびいろいろの皮膚間隙拡張剤を用いる方法、細胞膜と同様の構造を持つ膜を用いたナノサイズのカプセルであるリポソームを用いる方法、ナノ炭素原子を用いた人工ナノカプセルまたはナノチューブを用いる方法など、様々な方法が使用されてきた。ところが、皮膚が生体構造であり、同時に数多くの神経と皮膚細胞から構成された状態であって、人工化合物に対して大部分の場合には刺激を感じるか、激しい場合には炎症反応が誘発されるため、副作用を伴っても必ず皮膚を介しての浸透が必要な場合にのみ限定的に人工化合物を皮膚間隙拡張剤として使用することができる。また、人工のナノ構造体を用いる方法も、人工炭素または各種人工素材を用いるため、人体内への流入の際に予測可能な十分な量の安全性資料を現在までは確保していない。よって、皮膚を介しての有効成分の浸透のために、人体細胞膜とほぼ類似の構造で出来ているリポソームを用いることが最も有利であろう(PSIT Vol. 3, No.12, 2000, 417-425)。

化粧料用乳化組成物は、比較的皮膚刺激の少ない非イオン性界面活性剤、水相成分および油相成分と共に、安定性を増加させるための粘増剤として主に水溶性ポリマーを使用し、これを有効成分と共にホモミキサーで均質化する方法によって製造されたが、各成分の含量は粘度に応じてまたは所望の使用感に応じて適切に調整される。ところが、このようにホモミキサーで乳化させて製造した乳化組成物の場合、２μｍ以下の微小な乳化粒子を作ることが難しく、低粘度の乳化製品類には適用することが難しい。

一般に、リポソームの皮膚に対する有用性はよく知られており、特に親水性物質の皮膚内浸透のための長所がよく知られている。ところが、リポソームの大きさと浸透させようとする物質の特性との関係については、知られていることが殆どない。実際、皮膚細胞の間隙が３０〜６０ｎｍ程度と非常に小さいため(Journal of controlled release, 32, 1994, 249)、１００ｎｍ以下のリポソームのみが通過できるという主張に説得力があると思われてきた。また、韓国登録特許第１０−４２２７６３号でも、同じ論理で主張しており、皮膚間隙と同じサイズのリポソームまたはサイズ４０〜６０ｎｍ程度のナノエマルジョンの製造法について開示している。ところが、最近発表された論文(J. of Controlled Release 59, 1999, 87-97)によれば、リポソームのサイズが１００ｎｍ以下になると、角質部通過の際に細胞の張力によって細胞膜に融合してしまうことにより、実際真皮層まで到達し難くて浸透できないようなピックサイズ（５００〜１５００ｎｍ）のリポソームが真皮層に到達することができる。根本的な皮膚浸透原理は、今までも完全に明らかになっていないが、リポソームは、他のミセル構造とは異なり、水風船のようにその構造が柔軟であって狭い隙間をも通過することができるものと思われている（図２）。本発明者らは、この点に着眼し、皮膚内への浸透が容易であり、その大きさが既存の単一膜リポソームより相対的に大きく、安定したリポソームの容易な製造法を開発しようとした。

リポソームの構造によるリポソーム製造技術を分類すると、単一膜リポソームの製造方法、多重層リポソームの製造方法、多重液晶リポソームの製造方法などに分けられる。

大部分の商業的なリポソームは、１００ｎｍ内外またはそれ以下の小さいサイズの単一膜リポソームである。このようなリポソームは、その大きさが均一であって熱力学的に安定であり、剤形安定度にも一層優れる。また、使用感および性状が良いため、既存の細胞間隙に対するサイズ対比浸透力などに対する根拠に基づいて様々な製品が商業化に成功した。単一膜リポソームの製造と関連し、韓国公開特許第１０−２００４−１２１１３号では、水添レシチンを乳化剤と使用し、高圧ホモジナイザーを用いて高圧で乳化させることにより、乳化粒子を１００ｎｍ程度の微細で均一なサイズにし、これにより生理活性有効成分の経皮吸収率を向上させようとした。

多重液晶リポソーム製造方法は、一般に使用されていない方法であって、韓国登録特許第１０−０２２２０００号に詳しく開示されている。この特許によれば、この方法によって高圧ホモジナイザーを用いることなくリポソームと液晶の長所を生かしてリポソームの内外郭を液晶が包んでいる形であって、多重液晶という名称を使用した。その証拠として、特定の物理化学的物性または皮膚に対する透過性または平均サイズなどに対する何の証拠を提示することなく、単に大きさの類推が不可能な写真のみを証拠として提出した。ところが、写真で提示されたリポソームは、リポソームとして確認することが可能な何の証拠も持っていない。むしろ多重液晶の製造に使用された非イオン界面活性剤、すなわちステアリン酸ポリオキシエチレンによって生じた水中油エマルジョン液晶であると思われる。前記登録特許の発明者らは、液晶形成乳化剤であるステアリン酸ポリオキシエチレンがリポソームを構成する膜を内側と外側で強化すると記述した。ところが、大部分のリポソームは、どんなタイプの界面活性剤に対してもその構造が容易に和解できるという脆弱さを持っていることは公知の事実なので、リポソームを強化するために使用された界面活性剤がむしろリポソームの構造を和解し、かつ使用された界面活性剤によって水中油液晶が生じたものと見られる。したがって、この発明で得られた多重液晶リポソームは、ステアリン酸ポリオキシエチレンと付加的に使用されたいろいろの乳化剤の反応によって生じた水中油液晶であると判断される（図３）。

多重層リポソームは、その大きさが均一でなく、標準製造技術が確立されていないため、製造過程を標準化することが難しく、特にその大きさが多様であって、時間経過に伴って沈澱、層分離、および相対的に小さいリポソームの大きいリポソームへの融合及び成長などが観察された。しかも、このように大きさが成長するリポソームは、一定の水準に成長した以後、破れながらリポソーム内に封入されていた成分または膜に含有されていた油成分が露出して水層上に浮き上がりながら上層部に薄い油帯が形成されるという問題が発生する。このような多重層リポソームの問題点と単一膜リポソームの成功により、多重層リポソームに対する実際的研究開発が殆ど行われていない。

最近、皮膚浸透に対する新しい学説と立証が提示されることにより、多重層リポソームについての研究開発が行われている。

多重層リポソームの製造と関連して当業界に公知になっている方法として、脂質組成物を有機溶媒に溶解させた後、この有機溶媒を真空乾燥させて脂質組成物層を形成し、超温波などを用いて水和させて多重層リポソームを製造する技術がある。また、韓国登録特許第１０−０１１５０７６号は、天然脂質および天然乳化剤を含有させて高圧ホモジナイザーによって粒子サイズ０．０３５〜２μｍの微細多重膜小球体を製造する方法について開示している。

この他にも、米国特許登録第４７６１２８８号は、多重層リポソームを伝統的な高圧均質化条件で製造するのではなく、約５００ｐｓｉの低圧で高圧ホモジナイザーを通過させて製造する方法について開示している。ところが、このような方法は、１次的に溶媒に溶かしたホスファチジルコリンを乾燥させて薄いフィルムを作った後、水層を添加してリポソームを製造する方法であって、その工程が複雑である。また、米国登録特許第４４８５０５４号でも、乳化済みの層状のリポソームに超音波を加えて球状のリポソームを誘導して多重層リポソームを製造する方法について開示している。これらの場合、いずれも特殊な機器または特殊でややこしい条件の下でリポソームを製造しなければならないので、大量のリポソームを作るための商業的な方法にはなり難い。

一般に、リポソームの製造には必須的に高圧ホモジナイザーが使用されるが、その代表的なものとしては、マイクロフルイダイザーが挙げられる。マイクロフルイダイザーは、高圧を用いて乳化を行う機械であって、２００〜２０００気圧の高圧を用いて常圧１気圧で乳化物が流出するときに発生する圧力変動によるギャビテーション(cavitation)および衝突力によって乳化粒子を微細にする原理を利用する。このような機械を導入することにより、ナノ水準の乳化ミセルを容易に製造することができるが、高圧ホモジナイザーの使用には熟練技術が要求されるうえ、高圧均質化条件にリポソームの性状が大きく影響されるため、一般的な化粧品、医薬関連会社では接近し難い技術的限界を持っている。

本発明者らは、これに対する解決方案として、誰でも容易に既存の製造設備（例えば一般ホモミキサー）のみで皮膚浸透と安定性に優れるうえ、有効成分の封入量が多い多重層リポソームを製造しようと試みた。このような過程でリポソームの製造に使用される誘導剤として、ホスファチジルコリンを単独で使用せず、生体膜と類似の組成を持つ油相成分の混合物を特定の組成比で使用することにより、高圧ホモジナイザーを使用しなくても低い攪拌速度の一般ホモジナイザーを用いて、皮膚細胞間隙より大きいサイズを有し、皮膚浸透能に優れるうえ、生理活性有効成分の封入量も多い、安定な多重層リポソームを作ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

〔発明の開示〕
本発明は、上述したような従来の問題点を解決するためのもので、その目的は、皮膚浸透能に優れ、封入された生理活性有効成分の含量が高く、封入された有効成分の安定性が増進するうえ、製造工程が簡単であって製造コストが低い、経皮吸収用多重層リポソームを提供することにある。

本発明の他の目的は、前記経皮吸収用多重層リポソームの製造方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、前記経皮吸収用多重層リポソームに生理活性有効成分が捕集された経皮吸収用組成物を提供することにある。

〔発明を実施するための最良の様態〕
一つの様態において、本発明は、スクアレン、ステロール、セラマイド、中性脂質または油、脂肪酸およびレシチンを含む油相成分の混合物を用いて製造され、粒子サイズが２００〜５０００ｎｍであり、内部に生理活性有効成分を捕集することができる、経皮吸収用多重層リポソームに関する。

リポソームとは、一般に疎水性部分と親水性部分を有する脂質が水に分散して高配列、板状ミセルまたは密閉型膜を形成することにより、水と平衡状態を成す脂質二重膜をいい、本願に使用された多重層リポソームは、脂質二重膜が（水層−脂質二重膜層）−（水層−脂質二重膜層）のように反復される円形の多数の同心膜からなるリポソームをいう。

本発明は、単一膜リポソームではなく、多重層リポソームを形成させることにより、単一膜リポソームに比べて多層の膜が層状に積んでいて体積が飛躍的に増加するため、封入可能な有効成分の量が単一膜リポソームに比べて１００倍〜１０００倍に達する。また、単一膜に比べて油相成分が最外郭層を除いては直ちに外部水層に露出されないことにより、内部層に属した油相部と水相部の物質は、単一膜に比べて酸化的ストレスまたは光による影響、金属イオンおよびいろいろの外部環境に対する影響をより少なく受ける。したがって、多重層リポソームは、不安定な物質の捕集に特に有利である。

好適な様態において、本発明の多重層リポソームは、０．１〜１５．０重量％のスクアレン、０．１〜１０．０重量％のステロール、０．１〜１５重量％のセラマイド、０．１〜３０．０重量％の中性脂質または油、０．１〜３０．０重量％の脂肪酸、および０．１〜１０．０重量％のレシチンを含む油相成分の混合物を用いて製造される。より好適な様態において、本発明の多重層リポソームは、０．１〜１０．０重量％のスクアレン、０．１〜５．０重量％のステロール、０．１〜１０重量％のセラマイド、０．１〜２０．０重量％の中性脂質または油、０．１〜２０．０重量％の脂肪酸、および０．１〜５．０重量％のレシチンを含む油相成分の混合物を用いて製造される。最も好適な様態において、本発明の多重層リポソームは、０．１〜５．０重量％のスクアレン、０．１〜２．５重量％のステロール、０．１〜５．０重量％のセラマイド、０．１〜１０．０重量％の中性脂質またはオイル、０．１〜１０．０重量％の脂肪酸、および０．１〜２．５重量％のレシチンを含む油相成分の混合物を用いて製造される。

本発明の多重層リポソームの製造に用いられたスクアレンは、安全性が高く、化学的に不活性な油性原料であって、鮫の肝油、いろいろの動物の肝、ヒトの皮脂、オリーブ脂、ゴマ油、糠油、酵母などにも含有されている。スクアレン（Ｃ_３０Ｈ_５０）にニッケル触媒存在の下で水素を添加して得たスクアレン（Ｃ_３０Ｈ_６２）は、皮膚に親和的であり、経皮吸収率を増大させるので、有利に使用できる。本発明の多重層リポソームの製造の際、動物性または植物性スクアレンまたはその誘導体を単独で使用し、或いはこれらの混合物を使用することができる。

ステロールは、皮膚浸透性がよく、刺激も少なくて柔軟剤、乳化剤、乳化安定剤などとして用いられ、小胞(vesicle)を安定化させる効果を持っている。動物性ステロールおよび植物性ステロールの両方ともを使用することができ、その例としては、コレステロール、キャンペステロール(campesterol)、スチグマステロール(stigmasterol)、βシトステロール(β sitosterol)、フコステロール(fucosterol)などを例示することができる。本発明の多重層リポソームの製造の際、前述したステロールを単独で使用しあるいはこれらの混合物も使用することができる。

セラマイドは、スフィンゴリピドの一種であって、スフィンゴシンとリノール酸などの様々な脂肪酸から製造される。長鎖塩基であるスフィンゴシンのアミノ基に脂肪酸がアミド結合した構造を有し、１次的に障壁機能を行い、これと同時に水分と結合する機能、免疫調節の機能も持っている。動物および植物起源の全てのセラマイドを使用することができ、フィトスフィンゴシンやセラマイドIIIなどを例示することができる。本発明の多重層リポソーム製造の際、１種のセラマイドを単独で使用し、あるいは２種以上のセラマイドを共に使用することができる。

中性脂質はトリグリセリドを意味し、油は植物性油および動物性油の両方ともを含む。その例として、植物性油はオリーブ油、椿油、玄米油、マカデミアナッツ油などを使用することができ、動物性油はタロウ(tallow)、ラード(lard)、ダチョウ油などを使用することができる。本発明の多重層リポソーム製造の際、中性脂質、植物性油および動物性油を単独で使用し、あるいはこれらの混合物を使用することができる。

脂肪酸は、化粧品または医薬原料として用いられる全ての脂肪酸を使用することができ、炭素数６〜２０の脂肪酸が好ましく、このような脂肪酸は、直鎖または側鎖の形態を持つことができる。好適な脂肪酸の例としては、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、リノレン酸、ミリスチン酸などがあり、これらに限定されない。

レシチンは、燐脂質の一種であって、グリセロールの一側にリン酸およびコリンなどの親水性成分が結合し、グリセロールの他側には疎水性のアシル基が結合した構造をしているため、その特性上、水相部または油相部の両方ともに含有可能である。レシチンは、炭素数１２〜２４の脂肪酸鎖を有し、ホスファチジルコリン含量２０％以上のものが好ましい。本発明の多重層リポソームの製造の際、誘導体形態のレシチンが好ましく使用でき、そのような例示としては、レシチン分子内の不飽和二重結合を飽和させた水素添レシチン(hydrogenated lecithin)、燐脂質の脂肪酸鎖を部分的に加水分解して製造されたリソレシチン、レシチンにヒドロキシ基を導入した水酸化レシチンなどを挙げることができる。前述したレシチンおよびその誘導体は、動物または植物に由来するものが全て使用できる。本発明の多重層リポソーム製造の際、前述した植物性または動物性起源のレシチンまたはその誘導体を単独で使用し、あるいはこれらの混合物を使用することができる。

本発明の多重層リポソームは、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、粘増剤などをさらに含んでその安定度を改善することができる。防腐剤は、合成または天然由来の防腐剤が使用可能であり、これらの混合物も使用可能である。一般に、防腐剤は、０．０１％〜２０％の範囲内で添加できる。抗酸化剤は、ＢＨＴ、エルソルベート、トコフェロール、アスタキサンチン、植物性フラボノイドなどとその誘導体、および様々な植物由来の抗酸化物質が添加できる。安定化剤は、リポソームの性状を安定化するためのものであって、リポソーム製造の後に添加でき、ポリオール系列や糖類などが使用できる。ポリオール系列としては、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、エチルカルビトールなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。糖類としては、トレハロース、砂糖、マンニトール、ソルビトール、キトサンなどを含んで単糖類、オリゴ糖類、高分子澱粉なども使用できる。製造されたリポソームの水分散安定度をより向上させるための粘増剤は、天然由来の様々な粘増剤を含んでアクリルアミド類および合成高分子粘増剤が使用できる。例えば、アカシアガム、キサンタンガム、ゲランガム(gellan gum)、ローカストビーンガム、澱粉などの天然高分子とヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどの合成高分子、これらの共重合体、及び架橋された形態の物質が使用でき、これらに限定されるものではない。

本発明の多重層リポソームの内部に生理活性有効成分を含む。このような生理活性有効成分は、リポソームに捕集されて生理機能を増進させることが可能な全ての物質を含み、特定のものに限定されない。生理活性有効成分には、タンパク質、ペプチド、核酸、合成化合物、天然抽出物、糖類、ビタミン、無機質などが含まれ、これらは天然で分離しあるいは化学的に合成しあるいは組み換え的に生産することができる。一つの例として、生理活性有効成分には、毒素、酵素、ホルモン、神経伝達物質、免疫グロブリン、多糖類などがある。別の例示として、生理活性有効成分は、免疫調節剤、抗生剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤、解熱剤、鎮痛剤、抗浮腫剤、鎮咳きょ痰剤、鎮静剤、筋肉弛緩剤、抗癲癇剤、抗潰瘍剤、抗憂鬱剤、抗アレルギー剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、血圧降下剤、糖尿治療剤、恒常性製剤、ホルモン剤、抗酸化剤、肉毛剤、養毛剤、抗菌剤、美白剤、コラーゲン合成促進剤、皺除去・緩和剤、皮膚障壁強化剤、皮膚保湿力増強剤または皮膚美容剤などを含み、これらに限定されない。

本発明の多重層リポソームは、好ましくは３個〜２０個の膜からなり、前記膜には疎水性有効成分が存在し、前記膜の内部中央部と膜間隙には親水性有効成分が存在し、陽極性物質は膜と内部中央部または膜間隙にわたっている形で存在する。このような本発明の多重層リポソームの粒子サイズは、２００ｎｍ〜５０００ｎｍであり、好ましくは２００ｎｍ〜３０００ｎｍであり、より好ましくは８００ｎｍ〜１０００ｎｍである。

別の様態において、本発明は、前記多重層リポソームに生理活性有効成分が捕集された経皮吸収用組成物に関する。

このような組成物の適用には特別な制限はなく、例えば柔軟化粧水、栄養化粧水、クリーム、パック、ゲル、パッチなどの基礎化粧料、リップスティック、メイクアップベース、ファウンデーションなどの色調化粧料、シャンプー、リンス、ボディクレンザーなどの洗浄料、歯磨き、口腔清浄剤などの口腔用組成物、ヘアトニック、ゲル、ムースなどの整髪剤、養毛剤、染毛剤などの毛髪用組成物、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチまたは噴霧剤などの医薬品および医薬外品などに幅広く適用可能である。

別の様態において、本発明は、（ａ）スクアレン、ステロール、セラマイド、中性脂質または油、脂肪酸およびレシチンを含む油相成分を５０℃〜７５℃に加温して溶解させる段階と、（ｂ）水相成分を５０℃〜７５℃に加温して溶解させる段階と、（ｃ）前記（ａ）段階および（ｂ）段階で溶解された成分を混合して５００〜９０００ｒｐｍ(revolutions per minute)の速度で攪拌して粒子サイズ２００〜５０００ｎｍの多重層リポソームを形成させる段階とを含むことを特徴とする、経皮吸収用多重層リポソームの製造方法に関する。

本発明の多重層リポソームの製造に使用される油相成分は、前述した通りであり、これらは、最終リポソーム組成物を基準として１〜３０重量％、好ましくは１．０〜５．０重量％を占める。

水相成分は、水の他にブチレングリコール、プロピレングリコールなどのポリオール類が含まれ、さらに親水性植物性フラボノイドやローズマリー抽出物などの抗酸化効能付き成分が含まれる。

本発明の多重層リポソームの製造の際、油相成分および水相成分は、それぞれの溶解槽でホモミキサーまたはパドルミキサーによって混合および溶解させる。油相成分は、有機溶媒、好ましくはメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソ−プロパノール、ブタノールなどのアルコール、より好ましくはエタノールを添加して溶解させる。油相成分をアルコールに溶解させる場合、６０℃程度の比較的低温で容易に溶解され、完全溶解が可能である。

前記別途の溶解槽で製造された油相成分の混合物を水相成分の混合物に投入し、５００ｒｐｍ〜９０００ｒｐｍ、好ましくは２０００〜４０００ｒｐｍ、より好ましくは３０００ｒｐｍの速度で１〜３０分、好ましくは３〜１０分、より好ましくは４〜６分間攪拌する。このような乳化方法は、当業界で水中油型のエマルジョンを作るために通常使用する方式なので、特別な技術習得を必要としない。前述した攪拌乳化は、プロペラミキサー、ディスパー、ホモミキサー、ホモジナイザー、コロイド粉砕機、超音波乳化機などの当業界で広く用いられる多様な分散乳化機を用いて達成することができる。特に、ホモミキサーは、医薬品、化粧品および食品で均質な混合のために一般的に用いられる攪拌装置であって、攪拌速度および攪拌時間を調節して適正サイズのリポソームを調節することができる。

上述したように、本発明では、多重層リポソームの製造過程に高圧ホモジナイザーを全く使用せず、一般的な低速ホモジナイザーを使用することにより、一般的な医薬原料製造会社又は化粧品関連会社で容易に本発明の多重層リポソームを製造することが可能である。

本発明によって製造された多重層リポソームは、粒子サイズが好ましくは２００〜５０００ｎｍ、より好ましくは２００〜１５００ｎｍ、さらに好ましくは８００ｎｍ〜１０００ｎｍであり、粘度が１ｃｐｓ〜５０００ｃｐｓである、微細且つ均一な粒子である。

本発明の多重層リポソームに含まれる生理活性有効成分が疎水性の場合は、油相成分に、この生理活性有効成分が親水性の場合は、水相成分にそれぞれ予め溶解させて添加することができる。生理活性有効成分が熱に弱い場合は、乳化が完了した後、４５℃以下の温度で乳化物に添加して攪拌することにより作られたリポソーム内に導入できる。

本発明で得られたリポソームをより均一に製造しようとする場合には、２次加工過程が利用できる。１次に製造された多重層リポソームを高圧ホモジナイザーまたはマイクロフルイダイザーなどを用いて高圧で通過させることにより、より均一な多重層リポソームを得ることができる。

本発明によって別途の溶解槽で製造された油相成分の混合物と水相成分の混合物を一般的なホモミキサーを用いて形成した本発明の多重層リポソームは、１２ヶ月後にも粒子サイズが一定に維持される優れた安定性を示した。また、本発明の経皮吸収効果は、高圧ホモジナイザーを用いて製造した多重層リポソームと類似の透過速度と透過量を示した。すなわち、本発明は、高圧ホモジナイザーなどの高価の装備を使用しなくても、このような高価の装備を用いて製造された多重層リポソームと類似の経皮吸収効果を示した。また、本発明の多重層リポソームは、ヒトを相手とした刺激試験においても皮膚に刺激を誘発しない優れた人体安全性を示した。

したがって、本発明に係るリポソームの製造は、製造工程が簡単で製造コストが低いうえ、生理活性有効成分を内部に捕集している多重層リポソーム、バイオカプセルまたは粒子を用いて、向上した経皮吸収能力を与えることにより、人体における治癒、緩和、管理などを目的とする化粧品、食品および医薬品に応用できる。

以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。

〔実施例〕
<実施例１>一般ホモミキサーを用いた多重層リポソームの製造
本発明に係る製造方法は、比較的短時間内に特殊機器、例えばマイクロフルイダイザーなどの高圧ホモジナイザーの助けなしに一般的に用いられる低速ホモジナイザーを用いて製造可能である。本発明の多重層リポソームは、次の順序とおりに製造した。

１）精製水を５０℃の温度に昇温した後、アデノシンを入れてパドルミキサーで混合攪拌して完全に溶解させた。

２）下記表１に示した油相成分を別途の溶解槽に投入して７０℃〜７５℃に加温して完全に溶解させた。

３）前記２）の油相成分を前記１）項の溶解槽に投入して攪拌速度３０００ｒｐｍのホモミキサーで５分間混合することによりリポソームを製造した。

４）リポソームの保存性を増進させるために、４５℃で３）項の攪拌液を冷却させた後、抗酸化剤、粘増剤および防腐剤などを添加した。

本発明の多重層リポソームの製造に用いられた成分の割合は、下記表１の通りである。

<比較例１>高圧ホモジナイザーを用いたナノサイズのリポソーム製造
韓国公開特許第１０−２００４−００１２１１３号に提示された方法によって製造した。但し、比較試験のために、前記特許で提示された有効成分であるアルブチンの代わりに、本発明で指標物質として用いるためのアデノシンを有効成分として使用した。
成分％
植物性スクアレン 6.0
フェニルトリメチコン 3.0
シクロペンタシロキサン 2.0
メドウフォームシードオイル 0.1
酢酸トコフェリル 0.1
グリセリン 4.0
アデノシン 0.04
３ナトリウムＥＤＴＡ 0.01
ジプロピレングリコール 5.0
水添レシチン 1.0
エタノール 3.0
防腐剤適量
香適量
色素適量
精製水 Up to 100ml

<比較例２>有機溶媒を用いた薄膜(thin film)法によるリポソームの製造
米国特許第４７６１２８８号の実施例１に提示された方法によって製造した。但し、比較試験のために、前記特許で提示された有効成分であるミノキシジル(Minoxidil)の代わりに、本発明で指標物質として用いるためのアデノシンを有効成分として使用した。
成分
ジ−アルファジパルミトイルホスファチジルコリン 400mg
コレステロール 200mg
アデノシン 40mg
エタノール 1ml
プロピレングリコール 0.7ml
塩化カルシウム（８ｍＭ） 8.3ml

<比較例３>一般ホモミキサーを用いた多重液晶リポソーム
韓国登録特許第１０−０２２２０００号の実施例１に提示された方法によって製造した。但し、添加剤としてアデノシンを代替して添加した。
成分％
ステアリン酸ポリオキシエチレン 3.15
ポリオキシエチレンジヒドロキシステアレート 0.64
ヘプタメチルノナン 5.00
酢酸トコフェロール 0.50
高級アルコール 1.50
高級脂肪酸 1.50
マイクロクリスタリンワックス 0.50
脂肪酸グリセリド 6.00
精製水 10.00
ブチレングリコール 1.50
濃グリセリン 2.00
防腐剤 0.40
尿素 0.30
リン脂質 0.50
精製水 56.61
合成香料 0.20
アデノシン 0.04
シリコンオイル 1.00

<比較例４>高圧ホモジナイザーを用いた多重層リポソームの製造
１９９５年に韓国で発行された化粧品学会誌第２１−１号（３８巻）にキムインヨン等によって発表された論文に提示された方法によって製造した。有効成分として水層にアデノシンを添加して使用した。
成分％
脂質 15.0〜20.0
プロピレングリコール 5.0
リン酸セチル 0.5
精製水適量
リンゴ酸 1.0
酒石酸 1.0
乳酸 1.0
精製水 Up to 100

<実施例２>リポソームのサイズ決定
前記実施例１及び比較例１〜４で製造されたリポソームに対して粒子測定器(Particle size analyzer)（Ｍｏｄｅｌ３７０Ｎｉｃｏｍｐ社、米国）を用いて各試料別に３回ずつ乳化粒子のサイズを測定し、その結果の平均値と６００Ｘ倍率の顕微鏡の下で観察された結果を下記表２に示した。

前記表２の結果から分かるように、高圧ホモジナイザーを用いてリポソームを作る場合、単一膜（比較例１）と多重層（比較例４）の両方ともでは高圧ホモジナイザーを使用しない場合より大きさが一定で小さい。この両方の場合とも、高圧ホモジナイザーの通過圧力、通過温度、通過回数などに大きさが影響されることは公知の事実である。有機溶媒を用いて薄い二重膜を作った後、水和させて多重層リポソームを作る場合（比較例２）には、その大きさが非常に様々であって１μｍ〜１５μｍの広範囲なサイズのリポソームが作られる。この場合は、大きさがあまり不規則なので、熱力学的に不安定であるうえ、相対的に小さいサイズのリポソーム粒子が大きいリポソーム粒子の張力の下に置かれて接近した後最終的には融合し、このような過程を繰り返すと、リポソームが成長し、風船のように限界点を超えると破裂し、時間経過に伴って性状が不安定になり、割れたリポソームのため、捕集されていたオイル類が水層に露出してしまい、結局エマルジョンの最上層に上がって分離されてオイル層を形成する。したがって、比較例２は、製造方法が比較的容易なリポソーム製造法であるが、商業的に使用するには無理があると思われる。

これに対し、試験例１、２および３では、粒子の分布が全て２００〜１５００ｎｍ程度と一定であり、平均サイズは８００〜１０００ｎｍ程度であった。また、顕微鏡の判読結果、全て多重層リポソームであることが分かった。その層の数は３個〜２０個以上に達するものと明らかになった（図４）。図４は試験例１のリポソームを電子顕微鏡で撮った写真である。

<実施例３>リポソームの安定度
試験例１、比較例１、２、３および４から得られた粒子サイズを相対湿度７０％＋／−５、温度２５℃に調節される恒温器内に保管して安定度を考察した結果をまとめて表３に示した。表３において、リポソーム粒子のサイズは全てｎｍで示す。

前記表３の結果から分かるように、比較例１に提示されたナノサイズ１００ｎｍ程度のリポソームは、熱力学的に安定であり、1ヶ月間その大きさに変化が殆どなく、３ヶ月、１２ヶ月に達して始めてその大きさが約２倍程度大きくなるのに止まった。比較例３の多重液晶は、リポソームではない水中油液晶と判断され、その大きさが１年以上安定な状態に維持された。比較例２の有機溶媒を用いた多重層リポソームは、その大きさが４０００〜６０００ｎｍ程度に維持された。比較例４から得られたリポソームは、時間経過に伴ってリポソームサイズの変化が激しかった。一方、試験例１、２および３の全てではその大きさが比較的一定に維持されたが、特に試験例１では最も優れた安定化程度を示した。

<実施例４>リポソームの経皮吸収試験
本発明の試験例１、比較例３および４を用いて経皮吸収程度を試験した。経皮吸収は、毛を除去したギニアピッグ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）皮膚を対象としてフランツ透過セル（ＰｅｒｍｅＧｅａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。試験の直前、毛を除去したギニアピッグの腹部の皮膚を採取し、平方１ｃｍ^２の面積に切断した後、これを透過鏡直径０．９ｃｍの透過セルに装着し、クランプで固定した。皮膚の一側面（ドナー容器）は前記比較例３、４及び試験例１のリポソームを０．５ｍＬ入れた。皮膚の反対側面（レセプター容器）は、精製水とエタノールが４：１の重量比で混合された溶媒と接触するようにした。試験時の温度は、実際皮膚温度３２℃を維持した。試験の開始後、一定の時間間隔で溶媒の一部を採取した後、皮膚を通過したアデノシンの量を測定し、塗布濃度当たり皮膚吸収量（μｇ／ｃｍ^２／重量％）で示し、その結果を下記表４に示した。

アデノシンの定量分析は、ガスクロマトグラフィー方法と高速液体クロマトグラフィー方法で行い、その条件はそれぞれ次のとおりである。
［ガスクロマトグラフィー方法］
注入器：分割比１：５０
検出器：ＦＩＤ(Flame Ionization Detector)
カラム：３０ｍＤＢＷＡＸ０．２５ｍｍＬＤ
カラムの圧力：１０ｐｓｉ
注入器の温度：２５０℃
検出器の温度：２５０℃
オーブン温度プログラム
開始：２００℃
加熱速度：４℃／分、２５０℃まで
［高速液体クロマトグラフィー方法］
機器：ＤｉｏｎｅｘＰ５３０ｐｕｍｐ、ＡＳＩ−１００ａｕｔｏｍａｔｅｄｓａｍｐｌｅｉｎｊｅｃｔｏｒ
カラム：ＰｈｏｎｏｍｅｎｅｘＬｕｎａ５ｕ（Ｃ１８（２））、１５０×４．６ｍｍ
移動相：１０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４：ｗａｔｅｒ＝９２：８（０〜６．５ｍｉｎ）−４０：６０（７．５〜１２ｍｉｎ）−９２：８（１２．５〜１５ｍｉｎ）ｇｒａｄｉｅｎｔｓｙｓｔｅｍ
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ／ＶｉｓＤｅｔｅｃｔｏｒＵＶＤ３４０Ｓ２６０ｎｍ
注入体積：１０μＬ
稼働時間：２５ｍｉｎ

前記表４の結果から分かるように、一般液晶と判明された比較例３の水中油液晶は、皮膚内にアデノシンを殆ど移送できない。これに対し、マイクロフルイダイザーを用いて製造した比較例４の多重層リポソームは、比較例３に比べて時間依存的にアデノシンを皮膚内に吸収させて通過させた。本発明に係る多重層リポソームは、比較例４と比較して殆ど同様の透過速度と透過量を示した。したがって、本発明の一般低速ホモミキサーを用いたリポソーム製造技術は、高価の装備を必要とせず、既存の高価の装備を用いて製造されたリポソームと類似の性能を示した。

<実施例５>人体安全性試験
人を相手とした刺激試験としてパッチテスト(patch test)を行って刺激有無を判断し、刺激があればどの程度であるか、他の鎮静成分で緩和可能なのかを点検した。試験は、臨床専門機関であるＤｅｒｍａｐｒｏ（株）で行い、少なくとも３０名の人員が参加した。その試験結果に基づき、化粧品原料として不適な場合は脱落させた。貼布部位は、ヒトの上背部（正中線の部分は除外）または前腕部など人体使用試験の評価に適正な部位を閉鎖貼布した。原則的に、貼布４８時間後にパッチを除去し、除去による一過性紅斑の消失を待った後観測して判定した。判定は、皮膚科専門医５年以上同種業界の専門従事者の責任の下に行われた。

具体的に、パッチテストは下記の方法によって行った。３０名の被検者を対象として、ヒトの正常皮膚（背または前腕部）にフィンチャンバー(Finn Chamber)（直径５ｍｍ）を用いてパッチテストを行った。フィンチャンバーに試料を少量入れた後、皮膚にスキャンポーテープ(Scanpor tape)を用いて貼った。パッチを２日間貼布した後、パッチを除去し、３０分後貼布部位の皮膚状態を判読した。二日後、同一部位をもう１回判読した。判読基準は、次のような国際接触皮膚炎研究委員会が推薦したパッチテスト結果の判読基準を利用した。被験者がパッチテスト３日前から判読終了時まで（総１週間）一切の抗ヒスタミン剤の服用を禁止した。３０名の被検者を対象として行ったパッチテストを判読してＩＲ反応（刺激反応）およびアレルギー性反応生成有無を確認した。

［国際接触皮膚炎研究委員会が推薦したパッチテスト結果の判読基準］
± 擬陽性
１＋弱陽性（非水泡性）
２＋強陽性（水泡性）
３＋超強陽性
４＋刺激性
人体安定性試験の結果、本発明の多重層リポソームは、７２時間経過後にも皮膚に刺激を誘発しない優れた安全性があると立証された（表５）。

〔産業上の利用可能性〕
本発明によって提供される多重層リポソームは、単一層リポソームに比べて有効成分の封入量が多く、構造的に封入された有効成分が安定であるうえ、高圧ホモジナイザーではなく一般的に利用可能なホモミキサーを用いて製造可能であって製造工程が簡単で経済的であり、皮膚角質細胞間隙より大きいサイズに製造され、ナノサイズの単一膜リポソームに比べて細胞間隙通過の際に周囲細胞に対する張力から外れて真皮層まで浸透できるため、生理活性有効成分の経皮吸収を促進させることに利用できる。

生理活性有効成分が皮膚の細胞間隙を介して真皮層に移動する様子を示す図である。リポソームによる生理活性有効成分の皮膚内真皮層への浸透を示す図である。水中油液晶の顕微鏡写真を示す図である。本発明によって製造された多重層リポソームの電子顕微鏡写真を示す図である。

Claims

スクアレン、ステロール、セラマイド、中性脂質または油、脂肪酸およびレシチンを含む油相成分の混合物を用いて製造され、リポソーム全体重量を基準としてスクアレンが０．１〜１０．０重量％、ステロールが０．１〜５．０重量％、セラマイドが０．１〜１０重量％、中性脂質または油が０．１〜２０．０重量％、脂肪酸が０．１〜２０．０重量％、レシチンが０．１〜５．０重量％含有され、製造された粒子のサイズが８００〜１０００ｎｍである、内部に生理活性有効成分を捕集することができる経皮吸収用多重層リポソーム。
（ａ）スクアレン、ステロール、セラマイド、中性脂質または油、脂肪酸およびレシチンを含む油相成分を５０℃〜７５℃に加温して溶解させる段階と、（ｂ）水相成分を５０℃〜７５℃に加温して溶解させる段階と、（ｃ）前記（ａ）段階及び（ｂ）段階で溶解された成分を混合して５００〜９０００ｒｐｍの速度で攪拌し、粒子サイズ８００〜１０００ｎｍの多重層リポソームを形成させる段階とを含む、経皮吸収用多重層リポソームの製造方法。
前記リポソームの全体重量を基準とし、スクアレンが０．１〜１０．０重量％、ステロールが０．１〜５．０重量％、セラマイドが０．１〜１０重量％、中性脂質または油が０．１〜２０．０重量％、脂肪酸が０．１〜２０．０重量％、レシチンが０．１〜５．０重量％である、請求項２に記載の方法。
攪拌速度が２０００〜４０００ｒｐｍである、請求項２に記載の方法。
前記多重層リポソームを高圧ホモジナイザーを通過させて２次的に粉砕および混合する段階をさらに含む、請求項２に記載の方法。
請求項２に記載の方法によって製造された経皮吸収用多重層リポソーム。
請求項１または６に記載の多重層リポソームに生理活性有効成分が捕集された経皮吸収用組成物。
生理活性有効成分がタンパク質、ペプチド、核酸、天然抽出物、合成化合物、糖、ビタミンまたは無機質である、請求項７に記載の組成物。