JP4575595B2 - 新規グリコサミノグリカン及び該物質を有効成分とする医薬組成物 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリコサミノグリカンを構成するグルコサミン残基の6位に結合した硫酸基のみを実質的に完全に脱離し、他の硫酸基の脱離を最小限に止めた、硫酸基を有するグリコサミノグリカン、それを有効成分として含有する医薬、及び、そのグリコサミノグリカンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリンは、ウロン酸（イズロン酸(IdoA)又はグルクロン酸(GlcA)）残基とグルコサミン（GlcN)）残基とから成る二糖単位の繰り返し構造を基本骨格として有するグリコサミノグリカンの一種であり、ウロン酸残基の2位の水酸基並びにグルコサミン残基の6位の水酸基及び2位のアミノ基において、様々な程度に硫酸化されているグリコサミノグリカンである。ヘパリンはアンチトロンビンIII(以下「ATIII」とも記載する)結合部位を有し（FEBS Lett.(1980) 117, 203-206）、ATIIIとの結合の結果としてトロンビン活性を阻害して抗凝固活性を発現するため、古くから透析治療等の成果を向上させるための抗血液凝固剤などの医薬品として盛んに用いられている。最近では、ヘパリンがリポプロテインリパーゼと相互作用すること（J. Biol. Chem.(1981) 256, 12893-12898）、塩基性線維芽細胞増殖因子と親和性を有すること（J. Cell Biol.(1990) 111, 1651-1659）等、様々な生理活性因子と相互作用することがわかってきている。
【０００３】
このような状況の下、特定の細胞増殖因子やサイトカインとヘパリンとの結合に関与する、ヘパリン中のドメイン構造が着目されつつある。さらに、ATIII結合部位が存在することに由来する抗凝固活性を低減させた上で、生理活性因子との相互作用を増強させることを目的として、ヘパリンの脱硫酸化を中心とした化学修飾に関する研究が盛んに行われている（J. Carbohydr. Chem.(1993) 12, 507-521; Carbohydr. Res.(1989) 193, 165-172; Carbohydr. Res.(1976) 46, 87-95; WO 95/30424等）。
【０００４】
上記のヘパリンの脱硫酸化に関し、ヘパリン中のグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基の脱離（6位の脱硫酸化）が近年着目されている。その脱硫酸化方法としては、ソルボリシスを用いる方法（WO 95/30424号公報）及びシリル化剤を用いる方法（WO96/01278号公報）が挙げられる。
【０００５】
前者の方法では、ヘパリン分子中のグルコサミン残基の6位水酸基に結合した硫酸基（6-O-硫酸基）と共にウロン酸残基の2位水酸基に結合した硫酸基（2-O-硫酸基）及びグルコサミン残基の2位アミノ基に結合した硫酸基（N-硫酸基）も同時に脱離するため、当該方法を用いてヘパリンのグルコサミン残基の6-O-硫酸基をほぼ完全に脱離させた際には、グルコサミン残基のN-硫酸基及びウロン酸残基の2-O-硫酸基もほとんど失われる。該修飾ヘパリンのグルコサミン残基の2位アミノ基を再硫酸化することはできるが、グルコサミン残基の6位を硫酸化することなしに、ウロン酸残基の２位を再硫酸化することは困難である。
【０００６】
また後者の方法は、グルコサミン残基の6-O-硫酸基をより特異的に脱離させることが可能である点で前者の方法と比して優れているが、当該方法により得られる修飾ヘパリンは酵素的二糖分析法による有効二糖収率が低く、構造の特定を必ずしも十分に行えないものである点で医薬としての利用に課題が残されている。さらに、上記修飾ヘパリンは抗凝固活性が大幅に低減されてはいるが、完全には抗凝固活性を失ってはおらず、抗凝固活性を完全に消失させた修飾ヘパリンは得られていない。
【０００７】
ヘパリン又はその断片が様々な生理活性物質との親和性を有し、該親和性がその機能と密接に関係があることから、ヘパリン又は修飾ヘパリンを利用した医薬の探索、開発の試みは盛んになされているにも拘わらず、未だ抗血液凝固剤以外には医薬としては有効に使用されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち抗血液凝固剤以外の目的に利用する際には、ヘパリンが有する抗凝固活性及び出血活性を実質的に消失させること、及び医薬とする際には「物質としての構造の特定」が可能であることが重要であり、これらの点に関してはなお改善が必要である。これらの残された課題を解決し、ヘパリンが有する生理活性物質との親和性を生かした有用で安全な医薬の提供が期待されている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ね、特定の方法によりヘパリン等の硫酸基を有するグリコサミノグリカンを脱硫酸化することにより、生理活性物質との親和性などの、生体に対して有利な効果を維持しつつ、抗凝固活性及び出血活性を実質的に消失し、さらに医薬として利用する上で重要である、「物質の構造特定」が容易かつ可能な程度に、特定不能な構造を大幅に減少した新規グリコサミノグリカンを製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、硫酸基を有するグリコサミノグリカンを、シリル化剤であるN-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（以下「MTSTFA」とも記載する）存在下においてピリジン中１００℃以上で加熱処理してグルコサミン残基の6-O-硫酸基をほぼ完全に脱離させ、その後反応混液中からピリジンを留去した後、水を添加して減圧濃縮することにより得られるグリコサミノグリカンが、優れた皮膚創傷治癒促進効果、糖尿病性皮膚潰瘍治療効果、及びフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ阻害活性を有し、また抗凝固活性及び出血活性が消失していることを確認した。
【００１１】
さらに、一般に種々の化学的処理を施した修飾ヘパリンの構造の特定は困難であったが、上記方法により調製したグリコサミノグリカンは、グリコサミノグリカン分解酵素による良好な消化率を示すため、グリコサミノグリカン分解酵素による消化を用いた酵素的二糖分析法によって、正確な構造の特定が容易かつ可能なことを確認した。さらに、上記の構造の特定が可能であるグリコサミノグリカンを医薬として用いることで、有用で安全性が高い医薬を提供することを可能とした。
【００１２】
また更に、本発明者らは上記グリコサミノグリカンが、解糖系におけるキーエンザイムであるフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼに対して高い親和性を有し、しかも本発明グリコサミノグリカンが該酵素の強力な阻害剤として利用可能であることを発見し、新規なフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤を提供することを可能とした。
【００１３】
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
１．ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p-ニトロフェニルヒドラジンを反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法において、上記基本骨格中のグルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されず、かつ該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成から算出される、２位に硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル％が45％以上であることを特徴とするグリコサミノグリカン。
２．ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース、2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース及び2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースの合計が１０モル％以下であり、かつ2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースが１．５モル％以下であり、さらに有効二糖収率が60％以上であることを特徴とするグリコサミノグリカン。
３．上記酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース、2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース及び2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースの合計が45モル％以上である２記載のグリコサミノグリカン。
４． ５%濃度のグリコサミノグリカンの重水溶液を用い、3-(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウムを基準物質とした¹³C-核磁気共鳴分光法による分析において、66.5〜67.5 ppmに実質的にピークが検出されず、且つ98.3 ppm付近のシグナル強度よりも100 ppm付近及び102 ppm付近のシグナル強度が高いことを特徴とする１〜３のいずれかに記載のグリコサミノグリカン。
５．１〜４のいずれかに記載のグリコサミノグリカン（以下、本発明グリコサミノグリカンともいう）を有効成分とするフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤。
６．本発明グリコサミノグリカンを有効成分とする医薬組成物。
７．組織創傷・潰瘍治療剤である６記載の医薬組成物。
８．皮膚疾患治療剤である６記載の医薬組成物。
９．皮膚疾患治療剤が皮膚創傷治癒促進剤又は皮膚潰瘍治療剤である８記載の医薬組成物。
１０．以下の工程を含む本発明グリコサミノグリカンの製造法。
（ａ）ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸
基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩を、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p-ニトロフェニルヒドラジンを反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法においてグルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間、MTSTFA存在下においてピリジン中100℃以上で加熱する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた反応混液からピリジンを留去する工程、及び、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応混液に水を添加してその後常温で減圧する工程。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
【００１５】
本発明において「ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカン」とは、ウロン酸残基とグルコサミン残基の繰り返しの構造であるヘパリン骨格を有するグリコサミノグリカンのうち、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、ヘパリン、ヘパラン硫酸及び硫酸化ヒアルロン酸を包含する。また、「グルコサミン残基」は、アミノ基がアセチル化されているもの及びアミノ基が硫酸化されているものも包含する。
【００１６】
１．本発明グリコサミノグリカン
本発明グリコサミノグリカンの一態様は、ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、p-ニトロフェニルヒドラジン（paranitrophenyl hydrazine: PNP-ヒドラジンとも記載する）を反応させて高速液体クロマトグラフィー（以下「HPLC」とも記載する）により分析を行う化学的二糖分析法において、上記基本骨格中のグルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されず、かつ該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成から算出される、２位に硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル％が45％以上であることを特徴とし、さらに後述の有効二糖収率が60％以上であることが好ましい。
【００１７】
上記化学的二糖分析法は、後記試験法１に記載したとおり、測定の対象となる物質を亜硝酸によって分解後、p-ニトロフェニルヒドラジンを反応させHPLCを用いて分析する化学的二糖分析法を意味するものである。
【００１８】
グルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されないとは、通常には、上記化学的二糖分析法において、上記化学的処理によって生じるISMS（IdoA(2S)α1→4AnMan(6S)-PNP：ここで、AnMan(6S)-PNPはAnMan(6S)−CH=N-NH-PNPを、AnMan(6S)は2,5-アンハイドロマンノース-6-硫酸を示す）のピークが通常のHPLCにおいて検出できないことを意味する。具体的には、ISM（IdoA(2S)α1→4AnMan-PNP：ここで、AnMan-PNPはAnMan−CH=N-NH-PNPを、AnManは2,5-アンハイドロマンノースを示す）のピーク面積及びISMSのピーク面積から算出した、本発明グリコサミノグリカンにおける全グルコサミン残基数に対する6位に硫酸基を有しないグルコサミン残基数の割合（％）を指標として判定することができ、95％以上であるときに「実質的に検出されない」とみなすことができ、100％であることが最も好ましい。本発明グリコサミノグリカンの構造中にグルコサミン残基の6-O-硫酸基が実質的に存在しないことは、抗凝固活性を減少させるために好ましい。以後便宜上、グルコサミン残基の6位の脱硫酸化率を「6位脱硫酸化率」と記載する。
【００１９】
上記「6位脱硫酸化率」は、例えば実施例に記載の核磁気共鳴分光法のシグナル強度からも算出することが可能であり、上述の化学的二糖分析法によって得られる「6位脱硫酸化率」とほぼ一致した測定値が得られる。
【００２０】
本発明グリコサミノグリカンにおいてヘパリン骨格中の構成糖残基への硫酸基の結合位置及び結合した硫酸基の量は、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法（グリコサミノグリカン分解酵素による消化とHPLCとを組み合わせた酵素的二糖分析法）を用いて検出される、不飽和二糖の組成（二糖組成）から算出することが可能である。
【００２１】
「2位に硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル％」とは、グリコサミノグリカン分解酵素による消化とHPLCとを組み合わせた酵素的二糖分析法による分析において、下記一般式（１）で表される不飽和二糖の総量[2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース（以下ΔDiHS-0Sと記載する）、2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース（以下ΔDiHS-NSと記載する）、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-6Sと記載する）、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース（以下ΔDiHS-USと記載する）、2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-di(6,N)Sと記載する）、2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-D-グルコース（以下ΔDiHS-di(U,N)Sと記載する）、2-アセトアミド-2-デオキシ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-di(U,6)Sと記載する）、2-デオキシ-2-スルファミノ-4-O-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-tri(U,6,N)Sと記載する）の合計（モル数）]を100％として、ウロン酸残基の2位に硫酸基を有する上記不飽和二糖（ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、及びΔDiHS-tri(U,6,N)Sの合計（モル数））の割合を百分率で示したものであり、特に本発明グリコサミノグリカンの皮膚疾患治療効果を高く保つためには、この値が、通常には45％以上であり、50％以上であることが好ましく、60％以上であることがより好ましい。なお、酵素消化とHPLCを組み合わせた酵素的二糖分析法とは後記の試験法２の酵素消化とHPLCとを組み合わせた酵素的二糖分析法を意味する。
【００２２】
【表１】

【００２３】
また、上記略号の示す構造は以下の通り表記されることもある。
ΔDiHS-0S：ΔHexA1→4GlcNAc、ΔDiHS-NS：ΔHexA1→4GlcNS、ΔDiHS-6S：ΔHexA1→4GlcNAc(6S)、ΔDiHS-US：ΔHexA(2S)1→4GlcNAc、ΔDiHS-di(6,N)S：ΔHexA1→4GlcNS(6S)、ΔDiHS-di(U,N)S：ΔHexA(2S)1→4GlcNS、ΔDiHS-di(U,6)S：ΔHexA(2S)1→4GlcNAc(6S)、ΔDiHS-tri(U,6,N)S：ΔHexA(2S)1→4GlcNS(6S)。
【００２４】
上記式中、ΔHexAは不飽和ヘキスロン酸、GlcNAcはN-アセチルグルコサミン、GlcNSはN-硫酸化グルコサミン、カッコ内は硫酸基の結合位置を示す。
【００２５】
上記酵素的二糖分析法による分析で得られる数値は酵素消化前のグリコサミノグリカンが有する硫酸基の位置及び数を反映するものであるが、前記硫酸基の位置及び数をより正確に反映するためには、酵素によって均一に消化されかつその消化率（酵素消化率（後記試験法４））がより高いことが必要であり、通常には60%以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上である。
【００２６】
また、本発明グリコサミノグリカンは、酵素的二糖分析法により算出され、分析対象のグリコサミノグリカン中の該方法で特定可能な二糖単位の割合を示し、さらに構造の特定の容易さの指標となる有効二糖収率が、通常には60%以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上である。
【００２７】
上記「有効二糖収率」とは、上記二糖分析法におけるHPLC分析において検出される全ピークの面積に対する、特定可能な不飽和二糖（ΔDiHS-0S、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、及びΔDiHS-tri(U,6,N)S）のピーク面積の合計の割合に、酵素消化率を乗じた値を百分率で示した値を指称する。
【００２８】
本発明グリコサミノグリカンは、上記酵素的二糖分析法による分析（二糖組成）において、6位に硫酸基を有するグルコサミン残基を含む不飽和二糖（ΔDiHS-6S、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S及びΔDiHS-tri(U,6,N)Sの合計）が10モル％以下、好ましくは5モル％以下であり、ΔDiHS-tri(U,6,N)Sが1.5モル％以下、好ましくは1モル％以下、最も好ましくは検出不能である。
【００２９】
また、通常には、酵素的二糖分析法によって分析した後述の標準ヘパリンを基準として算出すると、本発明グリコサミノグリカンの6位脱硫酸化率は90％以上である。
【００３０】
ところで、ヘパリンは様々なサイトカイン（例えば線維芽細胞増殖因子、肝細胞成長因子、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子、上皮細胞成長因子、ミッドカイン、インターロイキン８、ビトロネクチン、ヘパリン結合性脳細胞分裂誘発因子、ヘパリン結合性神経突起伸長促進因子等）との相互作用（親和性）を有することが知られており、その相互作用にはヘパリン骨格に結合した硫酸基が大きく関与していることが知られている。本発明グリコサミノグリカンは、グルコサミン残基の6-O-硫酸基を実質的に有しないため、抗凝固活性、この活性に大きく関与するATIIIとの親和性、あるいは出血活性を失っている以外は、ヘパリンの上述のサイトカインとの相互作用（親和性）を保持している。従って、該親和性を保持するためには、本発明グリコサミノグリカンは上述の酵素的二糖分析による不飽和二糖の組成（二糖組成）において、2位アミノ基に硫酸基が結合したグルコサミン残基を有する不飽和二糖（ΔDiHS-NS、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,N)S及びΔDiHS-tri(U,6,N)Sの合計）のモル％が65％以上であることが好ましく、更に75％以上であることがより好ましく、上述の通り2-O-硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル％が通常には45％以上、好ましくは50％以上であり、更に60％以上であることが最も好ましい。
【００３１】
また、上述のサイトカインとの親和性を保つためには、後述の実施例３に記載された重水溶液を使用した¹³C-核磁気共鳴分光(NMR)法による構造解析において、3-(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウム（sodium 3-(trimethylsilyl)-propionate; 以下「TSP」と略記する）を基準物質（0 ppm）とした際に、66.5〜67.5 ppmに実質的にピークが観察されず、且つ70.0〜71.0 ppmにピークを有することが好ましく、98.3 ppm付近のシグナル強度、100 ppm付近のシグナル強度、及び102 ppm付近のシグナル強度を比較した際に、100 ppm付近及び102 ppm付近のシグナル強度がいずれも98.3 ppm付近のシグナル強度よりも高いことが更に好ましい。最も好ましい本発明グリコサミノグリカンの態様としては、上記に加え更に96.5〜97.0 ppmに連続したピークが観察されないことが挙げられる。
【００３２】
本発明グリコサミノグリカンは、上述のサイトカイン、その中でも特に塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)が有する活性（細胞増殖促進活性）を促進する働きが高いことが好ましく、NaClO₃を使用して細胞増殖阻害を行った培養細胞に対するbFGF活性の促進効果を測定する方法（実施例中の試験法９：bFGF活性促進効果の測定１参照）において、標準ヘパリン又は市販のヘパリンと比較して80%以上、より好ましくは90%以上のbFGF活性促進効果を有していることが好ましい。更に、本発明グリコサミノグリカンは、NaClO₃を使用せずに培養した培養細胞に対するbFGF活性の促進効果を測定する方法（実施例中の試験法９：bFGF活性促進効果の測定２参照）においても、標準ヘパリン又は市販のヘパリンと比較してbFGF活性促進効果が通常には70%以上、好ましくは80%以上であり、90%以上のbFGF活性促進効果も有していることが最も好ましい。
【００３３】
ヘパリン骨格において、抗凝固活性及び出血活性に強く関わる、該骨格中の多硫酸化領域（硫酸化クラスター）は、上記二糖分析法においては、ΔDiHS-tri(U,6,N)Sとして検出されるため、本発明グリコサミノグリカンは上記酵素的二糖分析法による不飽和二糖の組成（二糖組成）においてΔDiHS-tri(U,6,N)Sのモル％が1.5％以下、好ましくは1％以下であり、最も好ましくは検出不能である。このような本発明グリコサミノグリカンは抗凝固活性及び出血活性を実質的に失っている。
【００３４】
本発明グリコサミノグリカンの平均分子量は、ゲル濾過を用いて測定した場合において、3,000〜30,000であることが好ましく、5,000〜20,000であることが更に好ましく、7,000〜16,000であることが最も好ましいが、特に限定はされない。
【００３５】
本発明グリコサミノグリカンは上述の通り、抗凝固活性及び出血活性を実質的に失っている。すなわち、活性化部分トロンボプラスチン時間（以下「APTT」とも記載する）及びトロンボプラスチン時間（以下「TT」とも記載する）の測定法（試験法５及び６）において、終濃度30μg/mlとなるように本発明グリコサミノグリカンを該測定の反応混液に添加した際にAPTTが50秒を超過することがなく、また終濃度100μg/mlで添加した際にTTが50秒を超過することがない。
【００３６】
更に、ウシATIIIを用いた抗トロンビン活性の測定（例えば後述の試験法に記載の[抗トロンビン活性の測定法]に記載の方法（試験法７）など）において50％阻害率を示す濃度（IC₅₀）が50μg/ml以上であることが好ましく、100μg/ml以上であることがより好ましい。
【００３７】
本発明グリコサミノグリカンは上述の通り、抗凝固活性及び出血活性を実質的に失っており、また、後述の実施例に記載の通り、優れた創傷治癒促進活性及び皮膚潰瘍治療活性を有しているため、医薬の有効成分として有用である。
【００３８】
本発明グリコサミノグリカンは、遊離型でも使用することが可能であるが、薬理学的に許容し得る塩として得ることが好ましい。塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリブチルアミン塩などのアミン塩のうち薬理学的に許容されるものが挙げられるが、アルカリ金属塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。
【００３９】
２．本発明阻害剤
本発明阻害剤は、本発明グリコサミノグリカンを有効成分として含有することを特徴とするフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤である。
【００４０】
本発明阻害剤の有効成分として使用しうる上述の本発明グリコサミノグリカンは、解糖系酵素の反応速度を律する酵素として知られているフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ（以下「FPA」と略記する）に高い親和性を有しており、当該酵素の反応を阻害する活性を有している。従って、本発明グリコサミノグリカンは解糖系全体を阻害することが可能であるため、解糖系阻害剤、特にFPA阻害剤の有効成分として使用することが可能である。
【００４１】
後述の実施例に示すとおり、(i)本発明グリコサミノグリカン、(ii)ヘパリンのウロン酸残基の2位水酸基にエステル結合した硫酸基のみを脱離させた誘導体（2ODSH）、及び(iii)ヘパリンのグルコサミン残基の2位アミノ基に結合した硫酸基のみを脱離させた誘導体（NDSH）が、いずれもFPAに対して親和性を有するとともに、FPAの活性を阻害することが明らかとなった。この結果から、ヘパリンが最も高いFPA阻害活性を有することが示されたが、(i)、(ii)、及び(iii)の物質の中では、特に本発明グリコサミノグリカンがFPAの阻害活性が高く、次に(ii)の誘導体の阻害活性が高く、そして(iii)の誘導体が最も阻害活性は弱いことが示された。したがって、ヘパリン骨格中にグルコサミン残基の2位アミノ基に結合した硫酸基を有することがFPA活性に対して最も重要であり、次にウロン酸残基の2位水酸基にエステル結合した硫酸基が重要であり、FPA活性に対して最も関与していない硫酸基はグルコサミン残基の6位水酸基にエステル結合した硫酸基であることを上記実験結果は示している。本発明はこれらの知見に基づく発明であり、FPA阻害活性においてヘパリンに匹敵する程度に高く、ヘパリンの有する出血活性などの副作用を軽減した本発明グリコサミノグリカンを有効成分とするFPA阻害剤である。
【００４２】
FPA阻害剤の有効成分として用いられる本発明グリコサミノグリカンは、好ましくは、グリコサミノグリカンの基本骨格を構成するグルコサミン残基量に対し、2位アミノ基が硫酸化されたグルコサミン残基のモル％が40％以上である。より具体的には、上記酵素的二糖分析法による分析（二糖組成）において、2位に硫酸基を有するグルコサミン残基を含む不飽和二糖（ΔDiHS-NS、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-tri(U,6,N)S）が好ましくは40モル％以上、より好ましくは50モル％以上である。また、FPA阻害剤の有効成分として用いられる本発明グリコサミノグリカンは、好ましくは、グリコサミノグリカンの基本骨格を構成するウロン酸残基量に対し、2位水酸基が硫酸化されたウロン酸残基のモル％が45％以上である。より具体的には、上記酵素的二糖分析法による分析（二糖組成）において、2位に硫酸基を有するウロン酸残基を含む不飽和二糖（ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U,6)S、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-tri(U,6,N)S）が通常には45モル％以上、好ましくは50モル％以上である。
【００４３】
FPA阻害剤の有効成分として用いられる本発明グリコサミノグリカンは、ウシ脳由来のフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼのA4及びC4アイソザイムに対し、後記実施例１５の条件で測定して、それぞれ0.4μg/ml未満及び2.5μg/ml未満のKi値を有することが好ましい。
【００４４】
本発明阻害剤は、解糖系の亢進を伴う疾病又は障害の治療剤及び予防剤として使用することが可能であり、解糖系の亢進を伴う疾病又は障害としては、例えばマラリアへの感染などが挙げられ、本発明阻害剤を含む医薬がこの様な疾病又は障害に対して治療又は予防効果を示すと考えられる。
【００４５】
３．本発明医薬組成物
本発明医薬組成物は、本発明グリコサミノグリカンを有効成分として含有することを特徴とする。
【００４６】
上述の本発明グリコサミノグリカンは、副作用として問題となると考えられる抗凝固活性及び出血活性を実質的に有しないため、医薬として生体に投与することが可能である。
【００４７】
本発明グリコサミノグリカンが有する生理活性のうち特に顕著な活性としては、組織の創傷及び潰瘍に対する治癒促進活性が挙げられ、本発明グリコサミノグリカンは組織創傷・潰瘍治療剤（予防剤も含む）として利用できる。上記組織としては、動物（ヒトを含む）の皮膚、角膜、鼻腔粘膜及び口腔粘膜を含む粘膜等の上皮組織、軟骨及び骨等の結合組織、及び神経組織の他、消化管や血管等が挙げられ、創傷とは前述の組織に生じた傷害（例えば外的な力によって生じた傷害及び火傷の傷等）を包含する。その中でも特に皮膚に生じた創傷又は潰瘍の治癒促進剤（皮膚疾患治療剤）が本発明医薬組成物の好ましい態様として挙げられ、本発明医薬組成物の態様としては皮膚創傷治癒促進剤又は皮膚潰瘍治療剤が最も好ましい。前記皮膚潰瘍としては、一般的な潰瘍の他に、例えば下肢潰瘍及び褥創などの難治性の皮膚潰瘍（糖尿病性皮膚潰瘍も包含される）が挙げられる。
【００４８】
本発明グリコサミノグリカンは、後述の実施例に示すとおり、bFGFとの親和性が高く、その活性を促進する効果が高いため、本発明医薬組成物は上述の態様以外にも、bFGFが治癒に関与していると考えられる傷害や疾病へ適用することを目的とする態様として利用することが可能であり、公知のヘパリンの修飾体を有効成分とする医薬と比してより優れた治癒効果を示す。そのような傷害や疾病の例としては、例えば歯周病、再狭窄、癌、血管新生を伴う疾病（増殖性網膜症、慢性関節リウマチ、乾癬など）、虚血再潅流傷害、炎症、及び各種循環器病が挙げられる。
【００４９】
また、本発明阻害剤に関して説明したように、本発明グリコサミノグリカンはFPA阻害活性を有するので、解糖系の亢進を伴う疾病又は障害の治療剤及び予防剤として利用できる。
【００５０】
従って、本発明グリコサミノグリカンを、皮膚疾患の治療又は解糖系の亢進を伴う疾病もしくは障害の治療もしくは予防を必要とする対象に、有効量投与することにより、皮膚疾患の治療又は解糖系の亢進を伴う疾病もしくは障害の治療もしくは予防を行うことができる。
【００５１】
本発明医薬組成物を生体に投与する際の剤形及び投与経路は、適用の対象とする疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。例えば、上記本発明グリコサミノグリカンをそのままの形態で、又は他の薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤等と共に医薬組成物（例えば液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、リニメント剤、貼付剤などの外用製剤の他、注射剤、坐剤、錠剤、カプセル剤など）として、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ等）に対して、非経口的又は経口的に安全に投与することができる。
【００５２】
本発明グリコサミノグリカンを皮膚疾患治療剤として利用する場合は、特に非経口投与が好ましく、その投与に適した剤形としては、上記外用製剤が挙げられ、その投与方法は滴下、塗布、貼付等が好ましい態様として挙げられるがこれらに限定はされない。
【００５３】
本発明医薬組成物の有効成分である本発明グリコサミノグリカンの、組成物中の配合量及び投与量は、その製剤の投与方法、剤形、患者の具体的症状、及び患者の体重に応じて個別的に決定されるべき事項であり、特に限定はされないが、一般に本発明グリコサミノグリカンの投与量としては１日あたり概ね100μg/kg〜100 mg/kg程度を例示することができる。また、上記製剤の投与回数は、1日1回程度でも可能であり、1日2〜4回、又はそれ以上の回数に分けて投与することもできる。
【００５４】
本発明医薬組成物に含まれる本発明グリコサミノグリカンの量は、その製剤の剤形によって異なる。一般に一製剤あたり10μg〜50 mg程度と例示することが可能であるが、投与形態、患者の具体的症状等に応じて適宜調整することが必要である。
【００５５】
ところで、通常のヘパリンのマウス（雄、雌）に対する急性毒性試験による50％致死量（LD₅₀）は、経口投与で5,000 mg/kg以上、皮下又は腹腔内投与で2,500 mg/kg以上、静注で1,000 mg/kg以上であることが知られており、現在医薬品（抗血液凝固剤）として一般に使用されているので、その安全性は既に裏付けられている。
【００５６】
一方、本発明医薬組成物に使用する本発明グリコサミノグリカンは、後述の実施例にも示すとおり、健常ラット及び遺伝的糖尿病マウスに投与した際に、死亡例が見られなかったこと、及び本発明グリコサミノグリカンは、ヘパリンを基に製造された物質であって、ヘパリンと比較して抗凝固活性及び出血活性がきわめて低いか、これらを実質的に失っているため、本発明グリコサミノグリカンを含む本発明医薬組成物は温血動物に対する安全性が高いと言える。
【００５７】
４．本発明製造方法
本発明製造方法は上記本発明グリコサミノグリカンの製造方法であって、以下の工程を含む。
（ａ）ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩をMTSTFA存在下においてピリジン中100℃以上で、化学的二糖分析法においてグルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間、加熱する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた反応混液からピリジンを留去する工程、及び、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応混液に水を添加してその後常温で減圧する工程。
【００５８】
以下に本発明製造方法の一例を示す。
【００５９】
（ａ）ヘパリンのピリジン可溶性塩をMTSTFA存在下においてピリジン中100℃以上で加熱する工程
本発明製造方法における「ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンのピリジン可溶性塩」とは、ピリジンに可溶なヘパリンの塩であれば特に限定はされないが、特にヘパリンのピリジニウム塩が好ましい。ヘパリンのピリジニウム塩は、例えばヘパリンのナトリウム塩を蒸留水で平衡化した陽イオン交換カラム（例えばアンバーライト(Amberlite)IR-120B(H⁺型)樹脂（オルガノ社製）を充填したカラム等）に通塔して、遊離型とし、得られた酸性画分に過剰のピリジンを添加してpHを5〜7、好ましくは5.5〜6.5に調整し、凍結乾燥することにより得ることが可能であり、また市販のヘパリンピリジニウム塩を使用しても良い。
【００６０】
上記ヘパリンのピリジン可溶性塩をMTSTFAの存在下においてピリジン中で反応させるが、反応に用いるMTSTFAは、通常には、ヘパリンのピリジン可溶性塩の6〜12倍量（w/w）、好ましくは8〜11倍量（w/w）添加することが好ましい。また反応に用いるピリジンの量は上記ヘパリンのピリジン可溶性塩の５〜150倍量（v/w）であることが好ましく、10〜120倍量(v/w)であることがより好ましく、最も好ましくは15〜110倍量(v/w)であるが、これに限定されない。
【００６１】
上記反応温度は、100〜115℃が好ましく、108〜112℃が最も好ましい。上記化学的二糖分析法においてグルコサミン残基の6位硫酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されなくなるのに十分な時間とは、上述の好ましい温度に保持する場合は、90〜150分であることが好ましく、100〜130分が最も好ましい。また、上記の温度に保持する時間を例えば10〜20分とすることで6位脱硫酸化率が約50％のグリコサミノグリカンを調製することも可能であり、同様に25〜35分とすることで、前記6位脱硫酸化率が約70％のグリコサミノグリカンを製造することが可能であり、50〜70分とすることで、前記6位脱硫酸化率が約90％のグリコサミノグリカンを製造することが可能である。すなわち、本発明製造方法において上記のように反応時間制御を行うことで、正確な6位脱硫酸化率の制御を行うことも可能である。
【００６２】
上記反応終了後、反応混液を冷却して反応を停止することが好ましく、冷却の方法としては、反応混液を含む容器を室温に放置するか、流水又は氷で冷却する方法などが挙げられ、特に限定はされないが、氷冷が好ましい。
【００６３】
（ｂ）ピリジンを留去する工程
冷却した反応混液から、ピリジンの留去を行う。ピリジンの留去の方法としては、一般に知られた有機溶媒の留去方法を使用することができるが、25〜37℃において、減圧下でエバポレーターを使用して行うことが簡便なため好ましい。当該留去によって反応混液が濃縮されるが、反応混液に対する濃縮度は7〜25倍が好ましく、8〜20倍濃縮が最も好ましい。
「減圧下」とは、通常には10^-2〜10^-4 Torrの圧力下を示す。
【００６４】
（ｃ）水を添加後常温で減圧する工程
ピリジンを留去して濃縮した反応混液に対し、水酸基に結合したMTSTFA及び遊離のMTSTFAを分解するために水を添加する。添加する水の量は濃縮した反応混液の1.5〜3倍量が好ましく、1.8〜2.5倍量が最も好ましい。前記の濃縮した反応混液に上述の通り水を添加する場合、反応混液に白濁が生じるが、当該白濁を解消するために上記水を添加した濃縮反応混液を常温で減圧する。当該常温での減圧は、エバポレーターを用いて行うことが可能であり、通常は25〜37℃において上述の白濁を消失するまで継続することが好ましいが、通常5〜10分程度である。当該「減圧」は上述の「減圧下」と同様に通常には10^-2〜10^-4Torrの圧力下であることが好ましく、上記水を添加した濃縮反応混液が減圧により沸騰する圧力下であることが好ましい。
【００６５】
（ｄ）その他の工程
上記（ｃ）の処理後、反応混液中のMTSTFAの分解物及び有機溶媒を除去することが好ましく、そのために行われる公知の方法を適用することが可能であり、その方法の例としては透析、エタノール沈殿、陽イオン交換カラムを用いる方法などが挙げられる。
【００６６】
透析を用いる場合は、透析外液として、流水のみを用いるか、流水と蒸留水を併用して行うことができる。流水に対して透析する場合、通常には24時間以上、好ましくは40時間以上、最も好ましくは48時間透析を行う。流水と蒸留水を併用して透析を行う場合は、流水に対する透析に続いて更に蒸留水による透析を行えばよく、上述の流水に対する透析を行った後、蒸留水に対する透析を通常には1時間以上、好ましくは1.5〜2.5時間行う。
【００６７】
MTSTFAの分解物及び有機溶媒を除去した反応混液から、グリコサミノグリカンを析出させる通常の方法によって本発明グリコサミノグリカンをその塩の形態で得ることが可能である。
【００６８】
本発明グリコサミノグリカンを塩として得る方法は、例えば、透析内液を蒸留水で平衡化した陽イオン交換カラム（例えばアンバーライトIR-120B(H⁺型)樹脂（オルガノ社製）を充填したカラム等）を使用して分画し、酸性画分を回収して、アルカリ性水溶液（例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、又は水酸化カルシウム水溶液等の、アルカリ金属水酸化物溶液又はアルカリ土類金属水酸化物溶液：0.1〜2 Nが好ましい）を添加してpHを8〜10、好ましくは8.5〜9.5に調整した後、流水に対して通常には15時間以上、好ましくは18時間程度、その後、蒸留水に対して通常には1.5〜2.5時間程度透析を行った後、透析内液を凍結乾燥処理する方法が挙げられ、本発明グリコサミノグリカンの塩の凍結乾燥物を得ることが可能である。
【００６９】
グルコサミン残基の2位及びウロン酸残基の2位の硫酸化の程度の異なる本発明グリコサミノグリカンの修飾体は、必要により、その基本骨格を構成するグルコサミン残基の2位アミノ基又はウロン酸残基の2位水酸基を硫酸化する方法、及び、基本骨格を構成するウロン酸残基の2位硫酸基を脱離させる方法等を適宜組み合わせて用いることにより、上述の本発明グリコサミノグリカンの硫酸化度を変化させることで調製することが可能である。
【００７０】
グルコサミン残基の2位アミノ基を硫酸化する方法としては、例えばNagasawaら（Carbohydr. Res.(1989) 193, 165-172）の方法を改変した方法が挙げられる。すなわち、本発明グリコサミノグリカン又はその塩を、pH９〜10程度のアルカリ溶液（例えば炭酸ナトリウム溶液、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液など）に溶解して、固体スルホン酸トリメチルアンモニウム又はスルホン酸トリエチルアンモニウムを50〜55℃において６〜24時間、追加的に添加する。
【００７１】
また、ウロン酸残基の2位水酸基を硫酸化する方法としては、例えば上記同様Nagasawaら（Carbohydr. Res.(1989) 193, 165-172）の方法を改変した方法が挙げられる。すなわち、本発明グリコサミノグリカンを常法による塩交換でトリブチルアンモニウム塩とし、得られた本発明グリコサミノグリカンのトリブチルアンモニウム塩を、N,N-ジメチルホルムアミドに、完全に溶解させた後、５〜20モル当量／遊離水酸基モル量の硫酸化ピリジンと−10〜０℃において１時間反応させる。しかし、当該方法は、ウロン酸残基の2位水酸基を硫酸化すると共に、グルコサミン残基の6位硫酸基を硫酸化するため、当該方法を用いた場合には、再度、本発明グリコサミノグリカンの製造法に付して、グルコサミン残基の6位硫酸基を脱離させることが好ましい。
【００７２】
ウロン酸残基の2位硫酸基を脱離させる方法としては、例えばJasejaら（Can. J. Chem.(1989) 67, 1449-1456）の方法を部分的に改変した方法により行うことができる。すなわち、本発明グリコサミノグリカンのナトリウム塩をNaOH溶液に溶解し、直ちに凍結乾燥処理を行う。得られた凍結乾燥パウダーを蒸留水に溶解した後、酢酸を添加することによりpH６〜８、好ましくは6.5〜7.5に調整する。次いで、この溶液を透析処理及び凍結乾燥処理する。
【００７３】
本発明グリコサミノグリカンの調製物は、エンドトキシンの混入量が少ないことが好ましく、特に本発明グリコサミノグリカンの調製物1 mgあたりのエンドトキシンの混入量（エンドトキシン活性）は0.2 USPエンドトキシン単位（EU）以下、より好ましくは0.1 EU以下、0.05 EU未満であることが最も好ましいが、これに限定はされない。
【００７４】
また、本発明グリコサミノグリカンの調製物は、ピリジン含量が200 ppm以下であることが好ましく、150 ppm以下であることがより好ましく、100 ppm以下であることが、本発明グリコサミノグリカンの調製物を医薬の原体とした際の安全性を担保する上で最も好ましい。日本国薬局方における製剤中のピリジン含量の規制値は200 ppmと定められている。
【００７５】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳説する。
先ず、試験法について説明する。
【００７６】
試験法１
[化学的二糖分析法を用いたグルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基の検出及び6位脱硫酸化率の算出]
苅谷らの方法（Kariya et al.(1998) J. Biochem., 123, 240-246）に従い、被検物質の６位脱硫酸化率の算出を行った。すなわち、1 mgの試料に100μlの亜硝酸溶液（pH 1.5）を添加し、10分間室温で保温した。1 Nの炭酸ナトリウムでpH 7.5に調整した後、不活化ガスを吹き付けて乾固した。この乾固物に、200μlの蒸留水と、1％PNP-ヒドラジンを含む200μlのアセトニトリルとを添加し、37℃で30分間保温することによりグリコサミノグリカンとPNPを反応させて結合（カップリング）させ、その後SepPak C-18 カートリッジカラム（Waters社製）で部分精製を行った。得られた部分精製物をIPRP-HPLC（ion-pairing reversed-phase HPLC）で分析することによりISMS（IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP）のピークの有無を確認した。さらに、ISM（IdoA(2S)-AnMan-PNP）とISMS（IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP）のピーク面積を算出し、これらの値より6位脱硫酸化率を次式により算出した。
【００７７】
6位脱硫酸化率＝（B₀×A₁−A₀×B₁）／（B₀(A₁＋B₁)）×100(％)
但し、A₀：下記標準ヘパリンを試料とした際のISMのピーク面積
B₀：下記標準ヘパリンを試料とした際のISMSのピーク面積
A₁：被検物質（標準ヘパリン、本発明グリコサミノグリカンなどの測定対象となる物質の総称として使用する）を試料とした際のISMのピーク面積
B₁：被検物質を試料とした際のISMSのピーク面積
【００７８】
試験法２
[グリコサミノグリカン分解酵素による消化と高速液体クロマトグラフィーとを組み合わせた酵素的二糖分析法]
（１）グリコサミノグリカン分解酵素による消化
被検物質1.0 mgを、2 mM酢酸カルシウムを含む20 mM酢酸ナトリウム（pH 7.0）220μlに溶解して、グリコサミノグリカン分解酵素（各20 mUのヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びII）を加えて、37℃で2時間反応させた。
【００７９】
（２）HPLCによる分析
上記（１）による酵素消化を行った後の溶液20μlを、HPLC（島津製作所社製、LC6AD型）を用いて以下の条件で分析した。イオン交換カラム（Dionex社製、CarboPac PA-1カラムφ4.0×250 mm）を使用し、公知の方法（Kariya, et al.(1992) Comp. Biochem. Physiol., 103B, 473-479）に準拠し、流速1 ml／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（50 mM→2.5 M）で溶出し、232 nmでの吸光度を測定した。
【００８０】
（３）二糖組成、2-O-硫酸化ウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル％、及び、有効二糖収率の算出
上記（２）のHPLCにおいて検出されるピーク面積から、特定可能な不飽和二糖（ΔDiHS-0S、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、及びΔDiHS-tri(U,6,N)S）の各々の量を求め、各不飽和二糖の割合（モル％）を算出することにより二糖組成を得た。2-O-硫酸化ウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル％は、HPLCで特定可能な不飽和二糖の総量[ΔDiHS-0S、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、ΔDiHS-tri(U,6,N)Sのピーク面積の合計]を100％として、上記ウロン酸残基の2位に硫酸基を有する不飽和二糖（ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、及びΔDiHS-tri(U,6,N)Sのピーク面積の合計）の割合として算出した。
【００８１】
有効二糖収率は、上記二糖分析法におけるHPLC分析において検出される全ピークの面積に対する、特定可能な不飽和二糖（ΔDiHS-0S、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6,N)S、ΔDiHS-di(U,N)S、ΔDiHS-di(U,6)S、及びΔDiHS-tri(U,6,N)S）のピーク面積の合計の割合に、下記試験法４により測定される酵素消化率を乗じた値を百分率で示した。
【００８２】
試験法３
[分子量測定]
被検物質の3％（w/w）溶液10μlにつきHPLCによってゲル濾過分析した。カラムはTSKgel-(G4000+G3000+G2500)PW_XL（東ソー社製：φ7.8×300 mm）を用い、溶出液に0.2 M塩化ナトリウムを使用して、0.6 ml／分の流速で溶出した。被検物質の検出には、示差屈折計（島津製作所社製：AID-2A型）を用いた。分子量は予め分子量（重量平均分子量）が特定されているヘパリンを対照として算出した（Kaneda et al.(1996) Biochem. Biophys. Res. Comm., 220, 108-112）。
【００８３】
試験法４
[酵素消化率の測定法]
（１）グリコサミノグリカン分解酵素による消化
被検物質1.0 mgを、2 mM酢酸カルシウムを含む20 mM酢酸ナトリウム（pH 7.0）220μlに溶解して、グリコサミノグリカン分解酵素（各20 mUのヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼI及びII）を加えて、37℃で2時間反応させた。
【００８４】
（２）ゲル濾過による分析
上記（１）による酵素消化を行った後の溶液20μlを、HPLCによってゲル濾過分析した。カラムはTSKgel-(G4000+G3000+G2500)PW_XL（東ソー社製：φ7.8×300 mm）を用い、溶出液に0.2 M塩化ナトリウムを使用し、0.6 ml／分の流速で溶出した。被検物質の検出には、示差屈折計（島津製作所社製：AID-2A型）を用いた。酵素消化率は保持時間40分のピーク（不飽和四糖）、41.5分のピーク（三硫酸化不飽和二糖）、42分のピーク（二硫酸化不飽和二糖）、43分のピーク（一硫酸化不飽和二糖）及び45分のピーク（硫酸基を有さない不飽和二糖）の面積の合計に対する、41.5分のピーク（三硫酸化不飽和二糖）、42分のピーク（二硫酸化不飽和二糖）、43分のピーク（一硫酸化不飽和二糖）及び45分のピーク（硫酸基を有さない不飽和二糖）の面積の合計の百分率で算出した。
【００８５】
試験法５
[活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定法]
ラット下大動脈より3.2 wt％クエン酸ナトリウム水溶液を含む注射筒を用意し、該注射筒を用いて該クエン酸ナトリウム水溶液の9倍量の血液を採取した。該混合物を4℃、1,000×gで10分間遠心処理して血漿を得た。血漿100μlと既知濃度の被検物質を含む生理食塩水100μlを測定用カップへ分注し、37℃で1分間保温した。その後、予め37℃で5分間保温しておいたアクチン（商品名：吉富製薬社製）100μlを添加して37℃にて更に2分間保温した。次いで予め37℃に保温しておいた0.02M塩化カルシウム溶液100μlを添加して凝固を開始させ、凝固時間を血液凝固自動測定装置（バクスター社製、AMELUNG KC10A型）で測定した。
【００８６】
試験法６
[トロンビン時間(TT)の測定法]
上記APTTの測定法で記載した方法により調製した血漿100μlと既知濃度の被検物質を含む生理食塩水100μlとを測定用カップへ分注し、37℃で1分間保温した。その後、予め37℃で5分間保温しておいたトロンビン（10 U／ml：吉富製薬社製）100μlを添加して凝固を開始させ、凝固時間を血液凝固自動測定装置（バクスター社製、AMELUNG KC10A型）で測定した。
【００８７】
試験法７
[抗トロンビン活性の測定法]
150 mM 塩化ナトリウム、10 mM塩化カルシウム及び0.1％ウシ血清アルブミンを含む20 mMトリス緩衝液（pH7.4）350μl、ウシATIII溶液（1 U/ml同緩衝液）100μl及び被検物質の倍数希釈水溶液（試料）100μlの3液を冷却した状態で混合し、37℃で2分間保温した。この溶液にウシトロンビン溶液（50 mU/ml蒸留水）50μlを加え、37℃で5分間保温後、基質溶液（Boc-Val-Pro-Arg-MCA（ペプチド研究所製：Bocは第三ブチルオキシカルボニル、MCAは7-アミノ-4-メチルクマリンを示す）、70μM水溶液）100μlを加えて撹拌し、37℃で3分間保温し、30％酢酸300μlを加えて反応を停止した。反応液の蛍光強度を励起波長350 nm、蛍光波長444 nmにて測定した。上記反応液組成の試料の代わりに蒸留水を用いた反応混液のブランク１と、基質及び緩衝液のみの反応混液のブランク２を同様に処理し、蛍光強度を測定した。
【００８８】
トロンビン活性阻害率を次式から算出し、被検物質濃度に対するそれぞれの阻害率を片対数グラフにプロットし、50％阻害率を示す濃度（IC₅₀）を算出した。
【００８９】
トロンビン活性阻害率＝（１−（ΔFs／ΔFb））×１００（％）
但し、ΔFs：試料の蛍光強度−ブランク１の蛍光強度
ΔFb：ブランク２の蛍光強度−ブランク１の蛍光強度
【００９０】
試験法８
[出血活性の測定法]
ラットをエーテル麻酔後、背部に、一ヶ所あたり、各被検物質の0.2 mg、0.4 mg、0.8 mgを含む生理食塩水溶液0.4 mlを皮下投与した。陰性対照には生理食塩水を１箇所あたり0.4 mlで皮下投与した。24時間後にラットを失血死させ、投与部周囲の皮膚を剥離し、皮下出血斑の長短径をノギスで測定し、面積を算出した。陰性対照群との差の検定はDunnettの多重比較検定を用いた。
【００９１】
試験法９
[bFGF活性促進効果の測定１（NaClO₃添加）]
10%の牛血清を含んだDMEM培地（旭テクノグラス社製）で継代維持されたA31細胞(BALB/cマウス 3T3細胞)を、20 mMのNaClO₃、2 ng/mlのヒト組換塩基性線維芽細胞増殖因子（hrbFGF:プロメガ社製）を含んだDMEM-ITS培地（ITS:GIBCO BRL社製、インスリン10 mg/l、トランスフェリン5.5 mg/l、亜セレン酸6.7μg/l）に、5×10⁴個/mlになるように懸濁し、各被検物質を最終濃度1μg/mlになるように添加した後、100μlを96穴マイクロプレートに撒き、培養した。３日間の培養の後、20μlのセルタイター96AQノンラジオアクティブ細胞増殖アッセイ溶液（プロメガ社製）を各ウェルに添加し、37℃で２時間培養し、吸光光度計によって492 nmの波長の吸光度を測定することで、それぞれのウェルの細胞増殖を定量した。標準ヘパリンを添加した際の細胞増殖率を100とし、陰性対照（被検物質は添加せず、溶媒であるPBS(リン酸緩衝生理食塩水)のみを添加した）の細胞増殖率を0として、各被検物質を添加した際の細胞増殖率を算出した。
【００９２】
[bFGF活性促進効果の測定２（NaClO₃非添加）]
10%の牛血清を含んだDMEM培地（旭テクノグラス社製）で継代維持されたA31細胞(BALB/cマウス 3T3細胞)を、2 ng/mlのhrbFGF（プロメガ社製）を含んだDMEM-ITS培地（ITS:GIBCO BRL社製、インスリン10 mg/l、トランスフェリン5.5 mg/l、亜セレン酸6.7μg/l）に、5×10⁴個/mlになるように懸濁し、各被検物質を最終濃度20μg/mlになるように添加した後、100μlを96穴マイクロプレートに撒き、培養した。３日間の培養の後、20μlのセルタイター96AQノンラジオアクティブ細胞増殖アッセイ溶液（プロメガ社製）を各ウェルに添加し、37℃で２時間培養し、吸光光度計によって492 nmの波長の吸光度を測定することで、それぞれのウェルの細胞増殖を定量した。標準ヘパリンを添加した際の細胞増殖率を100とし、陰性対照（被検物質は添加せず、溶媒であるPBSのみを添加した）の細胞増殖率を0として、各被検物質を添加した際の細胞増殖率を算出した。
【００９３】
［bFGF活性促進効果の測定３（NaClO₃非添加／初代培養細胞）］
エーテル麻酔下でC57BL/6マウス（９週齢：雌、チャールスリバー）の背部を剃毛し、予め滅菌した綿球を皮下に埋め込み（２箇所／匹）、10日後に肉芽組織ごと綿球を摘出した。ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ペニシリン：200 U/ml、ストレプトマイシン：200μg/ml）で２回、PBSで1回洗浄した後、綿球を覆っている被膜を取り除き、0.1%コラゲナーゼ／0.25%トリプシン溶液の入ったチューブに移し、37℃の恒温槽中で1時間振盪処理した。処理液をセルストレーナー（φ=70μm）に通し、牛血清を10%含むRPMI1640培地（イワキ社製）を加え、軽く攪拌した後に、2,000×gで3分間遠心した。得られた細胞は同培地で３回洗浄し、1×10⁵ cells/mlになるように同培地で再懸濁後、10 cmシャーレに捲き込んだ。翌日、未接着細胞を取り除き、サブコンフルエントに達するまで、37℃のCO₂インキュベーターで培養した。
【００９４】
サブコンフルエントに達した細胞を0.25%トリプシン／0.05% EDTA溶液を用いてシャーレから剥離した。細胞は遠心洗浄後、5×10⁴ cells/mlになるように、透析処理をした牛血清を0.1%含むBasal ME/S-MEM培地（ギブコ）で懸濁した。96穴マイクロプレートにウエル当たり100μlの細胞懸濁液を分注し、更に4μg/mlのhrbFGF（プロメガ社製）を溶解したBasal ME/S-MEM培地50μl及び本発明２を溶解したBasal ME/S-MEM培地50μlを分注し、37℃のCO₂インキュベーターで3日間培養した。培養終了後、Cell Counting溶液（ドージン社製）を15μl加え、さらに3時間培養した後、450 nmの吸光度を測定した。陰性対照としては、本発明２を加えずに、溶媒のBasal ME/S-MEM培地のみを添加した検体、陽性対照として、本発明２に代えて標準ヘパリンを溶解したBasal ME/S-MEM培地を添加した検体を使用した。
【００９５】
参考例１
[本実施例中の対照として用いた標準ヘパリン]
標準ヘパリンとしてブタ小腸由来のヘパリン（市販品：SPL社製）を使用した。このヘパリンは以下に示す物性を有していた。
【００９６】
（１）上記試験法２の二糖分析法による二糖組成値（モル％）（有効二糖収率：85.5％）は以下の通りである。
【００９７】
【表２】

【００９８】
（２）抗凝固活性が160 IU/mgである。
【００９９】
（３）上記試験法３の方法による平均分子量が13,000〜15,000 Daの範囲内である。
【０１００】
（４）上記試験法４の方法による酵素消化率が89.8％である。
【０１０１】
（５）上記試験法５のAPTT測定法により測定したAPTTが、溶液中3μg/mlで標準ヘパリンを添加した際に200秒以上である。
【０１０２】
（６）上記試験法６のTT測定法により測定したTTが、溶液中1μg/mlで標準ヘパリンを添加した際に600秒以上である。
【０１０３】
以下、当該標準ヘパリンを単に「標準H」と記載する。
【０１０４】
参考例２
対照グリコサミノグリカン１の調製（公知例１）
WO96/01278の実施例に記載された方法に基づいて対照グリコサミノグリカン１（以下、単に「対照１」と記載する）を調製した。すなわち標準Hから常法によりピリジニウム塩として調製したヘパリンピリジニウム塩（以下「HepP」と記載する）200 mgを、脱水した20 mlのピリジンに添加、溶解した。４ ml（約４ g）（HepPの20倍重量）のMTSTFAを加え、95℃で2時間攪拌した。その後、20 mlの水を加え、ミリポア限外濾過膜（ミリポア社製）を用いて透析した。この透析内液を100℃で白濁が消失するまで加熱した。その後、NaOH（1 N）を添加してpHを9に調整し、流水に対して18時間、蒸留水に対して2時間透析を行い、透析内液を凍結乾燥処理することにより対照１（ナトリウム塩）の粉末130 mgを調製した。
【０１０５】
参考例３
対照グリコサミノグリカン２の調製（公知例２；ソルボリシス+N-再硫酸化）
WO95/30424の実施例１の記載に基づいて対照グリコサミノグリカン２（以下単に「対照２」と記載する）を調製した。すなわちHepP 50 mgを10 mlの水に添加、溶解し、90 mlのジメチルスルフォキシドで希釈した。この溶液を100℃の湯浴中で72時間攪拌した。その後、50 mlの5%重炭酸ナトリウムを加えて冷却した後、0.1 Mの1リットルの酢酸ナトリウム溶液に対する12時間の透析を2回繰り返し、次いで蒸留水に対して徹底的に透析した。
【０１０６】
この透析内液に水性炭酸ナトリウムを0.1 Mとなるように加え、更に５モル当量のピリジン／SO₃を加えて60℃で24時間攪拌した。24時間の間に、8時間毎に2回、5モル等量のピリジン／SO₃を添加した。その後、流水に対して18時間、蒸留水に対して2時間透析を行い、透析内液を濾過した後、ろ液を凍結乾燥処理することにより対照２（ナトリウム塩）の粉末47.5 mgを調製した。
【０１０７】
実施例１
[本発明グリコサミノグリカン等の調製]
下記表３記載の反応条件で、HepP及びMTSTFAをピリジンに添加、撹拌後、一定時間加熱・保持した。反応混液を含む容器を氷冷後、減圧下ロータリーエバポレーターを用いて10倍に濃縮し、2倍量の蒸留水を添加した。更に、白濁が消失するまでロータリーエバポレーターを使用して減圧した後、流水に対して48時間、蒸留水に対して2時間、透析を行った。透析内液を蒸留水で平衡化したアンバーライト IR-120B(H⁺型)樹脂（オルガノ社製）を充填したカラムに通塔し、回収した画分のうちの酸性画分のみをプールした。この酸性画分にNaOH（1 N）を添加してpHを9に調整し、流水に対して18時間、蒸留水に対して2時間透析を行い、透析内液を凍結乾燥処理することにより目的の調製物（ナトリウム塩）を粉末として調製した。
【０１０８】
得られた調製物（本発明グリコサミノグリカン１〜４（本発明１〜４）及び対照グリコサミノグリカン３〜６（対照３〜６））と各種条件を表３に示す。
【０１０９】
【表３】

【０１１０】
本発明１〜４は、反応スケールが異なっており、対照３〜５は、本発明２と反応スケールは同じであるが、反応時間を変化させて対照とした。また、対照６は、本発明２と反応に使用したHepP量は同じであるが、シリル化剤であるMTSTFAの量を20倍量とし、反応温度を下げて対照とした。
【０１１１】
いずれの物質も、試験法３に従って平均分子量を測定した結果、約12,500Daであり、実質的に低分子化は起こっていないことが明らかとなった。
【０１１２】
実施例２
(1) 酵素消化率
標準H、本発明１、本発明２、本発明３、本発明４、対照１、対照２及び対照６について酵素消化率を試験法４に記載した方法により測定した。また、標準H以外の物質について、試験法１に記載した方法により6位脱硫酸化率を算出した（表４）。表４中の対照１の6位脱硫酸化率はWO96/01278に記載された6位脱硫酸化率を引用した。
【０１１３】
【表４】

【０１１４】
本発明グリコサミノグリカン（本発明１、本発明２、本発明３、及び本発明４）及び対照２において高い酵素消化率と高い6位脱硫酸化率が達成されていることが明らかとなった。
【０１１５】
(2) 二糖組成
標準H、本発明１、本発明２、本発明３、本発明４、対照１、対照２、及び対照６について、試験法２記載の酵素的二糖分析法に従って二糖組成値を算出した（表５）。
【０１１６】
【表５】

【０１１７】
その結果、ソルボリシス法による脱硫酸化手法を用いて調製した対照２は明らかに他の物質と異なる二糖組成値を示し、また本発明グリコサミノグリカンは、標準H、対照１、及び対照６と比較して6位硫酸基が減少していることが明かとなった。また、三硫酸化不飽和二糖（ΔDiHS-(U,6,N)triS）が検出されない点で特徴づけられた。
【０１１８】
実施例３
エンドトキシン濃度の測定
本発明グリコサミノグリカンの調製物へ混入したエンドトキシンの測定はトキシカラ-LS-50Mセット（生化学工業（株）製）による比色定量で行った。標準エンドトキシンとしてはトキシカラーEt-2（生化学工業（株）製）を用いた。
【０１１９】
すなわち実施例１に記載した本発明２の調製方法に従って、エンドトキシンフリーの器具、ピリジン、及び蒸留水を用いて本発明５を調製し、(i)本発明５を2 mg/mlの濃度に希釈した水溶液、(ii)エンドトキシンを0.212 EU/mLで含む(i)を各々50μLずつエンドトキシンフリーマイクロプレートに分注した。標準液として(iii)Et-2を0.424 EU/mLで含む水溶液50μLを、ブランクとして(iv)蒸留水（エンドトキシンフリー）50μLを同様にエンドトキシンフリーマイクロプレートに分注した。トキシカラーLS-50Mセットに含まれる主剤を(i)〜(iv)が注入されたウェルにそれぞれ50μL加え、直ちにウェルリーダーSK601（生化学工業（株）販売）にセットし、測定波長405 nm、対照波長492 nm、37℃、30分間反応での吸光度の経時変化率（mAbs/min）を測定し、絶対検量線を作成してエンドトキシンの濃度を算出した。
【０１２０】
本発明５自体が、LAL試薬に対する阻害あるいは活性亢進を有している可能性もあるため、添加したエンドトキシン単位量に相当する測定値から、添加回収率を以下の式で求め、実際の測定値に乗じることで補正をおこなった。
｛（添加時の測定値）-（無添加時の測定値）｝/（添加エンドトキシン濃度）
【０１２１】
このようにして求められた本発明５の10 mg/mL水溶液中のエンドトキシン活性は、0.427 EU/mLであった。すなわち、本発明５のエンドトキシンの混入量は0.0427 EU/mgであり、本発明調製法を用いて本発明グリコサミノグリカンを調製するのみで医薬品として充分対応しうる程度の、エンドトキシン混入量が低い本発明グリコサミノグリカンの調製物が得られることが明らかとなった。
【０１２２】
実施例４
ピリジン含量の測定
本発明グリコサミノグリカンに残留したピリジンの含量を測定した。すなわち、本発明３（20 mg）を5 NのNaOH（1 ml）に添加し、この溶液に5分間超音波処理を行った。この溶液に1 mlのジメチルエーテルを添加し、2分間、激しく撹拌を行った。その後、3,000×gで10分間遠心処理を行い、上層(i)（有機層）と下層(i)（水層）に分離した。1 mlのジメチルエーテルを下層(i)に添加し、再度激しく撹拌し、上記と同様の条件で遠心処理を行い、上層(ii)（有機層）と下層(ii)（水層）を分離した。下層(ii)は廃棄し、上層(i)及び上層(ii)を合わせて2 mlの抽出液(i)とした。
【０１２３】
上記で得られた抽出液(i)に2 NのHClを400μl添加し、2分間激しく撹拌した。この混合液を3,000×gで10分間遠心処理を行い、上層(iii)（有機層）と下層(iii)（水層）に分離し、上層は廃棄した。下層(iii)に5 NのNaOH（800μl）を添加し、更に300μlのジクロロメタンを添加した後、2分間激しく撹拌し、3,000×gで10分間遠心処理を行った。上層(iv)（水層）と下層(iv)（有機層）に分離し、上層(iv)は廃棄した。下層(iv)のうち1μlをガスクロマトグラフィーで分析した。
【０１２４】
ガスクロマトグラフィーはGC-18APFSC（島津社製）を使用し、カラムはDB-5ms（φ0.25 mm(I.D. 0.5μm)×30 m：J&W社製）を用いた。移動層はヘリウムを使用し、流速を80℃において22 cm/secに設定して80℃に1分保持し、その後120℃まで10℃/分でカラムオーブン温度を上昇させて溶出を行った。検出はFID（Flamed Ionized Detection）を用い300℃で行った。検量線は20、40、60、80、及び100 ppm濃度のピリジンを含むメタノールを1μlずつ分析することにより作成した。本発明３の水分含量は10%で算出した。本発明３について２回、抽出及びピリジン含量の定量を行った。その結果、二回のピリジン含量の測定値はそれぞれ73.1 ppm及び70.3 ppmであった。いずれも、製剤中のピリジン含量の規制値である200 ppmを大きく下回る数値であった。
【０１２５】
実施例５
[¹³C-核磁気共鳴分光法による構造解析]
標準H、本発明１、本発明２、本発明３、本発明４、対照３、対照４、及び対照５について¹³C-核磁気共鳴分光法（¹³C-NMR法）により分析を行った（標準H：図１（１）、本発明１：図２、本発明２：図１（５）、本発明３：図３、本発明４：図４、対照３：図１（２）、対照４：図１（３）、対照５：図１（４））。¹³C-NMR法は、GE社製QE300型NMRスペクトロメーターを用い、被検物質につき５％濃度(w/v)の重水溶液を調製したうえ、TSP(和光純薬工業社製)を基準物質(0 ppm)としたときのケミカルシフトが51.66 ppmのメタノールを内部標準とし、測定温度80℃、パルス幅60°、積算回数90,000回の条件にて行った。標準H、本発明１、本発明２、本発明３及び本発明４のシグナルのケミカルシフトは以下の通りであった（表６）。
【０１２６】
【表６】

【０１２７】
上記¹³C-NMRの結果から、グルコサミン残基のC-6のシグナルは、69.1 ppm（硫酸基を有する６位炭素原子のシグナル）及び62.6〜63.0 ppm（硫酸基を有しない６位炭素原子のシグナル）に現れることが分かる。これらのシグナル強度並びにシグナル強度の比から６位が硫酸化されていないグルコサミン残基の比率(6位非硫酸化GlcN率)及び標準Hを基準とした各試料（本発明１〜４及び対照３〜５）のグルコサミン残基の６位脱硫酸化率（脱6S率）を算出した結果を以下に示す（表７）。
【０１２８】
【表７】

【０１２９】
この結果から明らかなように、上記の脱硫酸化の条件では、110℃での保持で実質２時間の反応によりほぼ100％の6位脱硫酸化がなされていることが分かる。
【０１３０】
対照１および対照２につき、上記と同様に¹³C-NMR法を用いて解析した。対照１は、各炭素原子のピーク位置は本発明１〜４と近接した位置に検出されたが、67 ppm、96.5〜97.0 ppm（連続している）に本発明１〜４および標準Hのいずれにも観察されることのない特徴的なピークが現れた（図５）。これら特徴的なピークは、対照３、対照４、及び対照５（本発明２の調製において反応時間を変化させることで得られた物質）のいずれにも観察されなかったため、対照１は本発明グリコサミノグリカンや、その6位脱硫酸化反応の時間を変えて得られる物質とは異なる構造を有することが示された。
【０１３１】
また、対照２においては、上述のウロン酸の３位の炭素原子のピークが、標準Hや本発明１〜４で観察された70.0〜71.0 ppmの範囲には観察されないことも明らかとなった（図６）。更にヘパリン骨格が有する98.3 ppm付近のピーク、100 ppm付近のピーク、及び102 ppm付近のピークを比較した際に98.3 ppm付近のピークが最も大きい特徴的なチャートが得られた。これらのことからも、対照２も本発明グリコサミノグリカンとは構造が異なることが明確に示された。
【０１３２】
実施例６
[抗凝固活性の測定]
（１）活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）の測定
標準H、本発明２、対照４、及び対照５を使用して試験法５に記載の方法に従ってAPTTの測定を行った（表８）。その結果、標準H、対照４及び対照５においてはAPTTが延長する結果が得られたが、本発明２においてはAPTTを延長する作用がほとんど見られなかった。対照１及び対照６は6位脱硫酸化率がいずれも対照４と対照５の間の値となるため、対照４及び対照５の中間的な抗凝固活性を示すと予想される。
【０１３３】
【表８】

【０１３４】
（２）トロンビン時間（TT）の測定
標準H、本発明２、対照４及び対照５を使用して試験法６に記載の方法に従ってTTの測定を行った（表９）。その結果、標準H、対照４及び対照５においてはTTが延長する結果が得られたが、本発明２はTTを延長する作用が全く見られなかった。対照１及び対照６はそれぞれ6位脱硫酸化率が対照４及び対照５の間の値となるため、対照４及び対照５の中間的な抗凝固活性を示すと予想される。
【０１３５】
【表９】

【０１３６】
（３）抗トロンビン活性の測定
試験法７に記載の方法に従って、標準H、本発明２、および対照１の抗トロンビン活性の測定を行った（表１０）。その結果、本発明２の抗トロンビン活性が標準Hおよび対照１と比較して大幅に低下していることが明らかとなった。
【０１３７】
【表１０】

【０１３８】
実施例７
[本発明グリコサミノグリカンの出血活性]
標準H及び本発明２を使用して試験法８に記載の方法に従って出血活性の測定を行った（表１１）。その結果、本発明２が出血活性を完全に失っていることが明らかとなった。
【０１３９】
【表１１】

【０１４０】
実施例８
[健常皮膚創傷に対する本発明グリコサミノグリカンの治癒促進効果]
健常ラットを用いて、本発明グリコサミノグリカンの皮膚創傷促進効果を検討した。すなわち、健常ラットの背部を剃毛後、φ8 mmの眼科用トレパンで皮膚を皮下まで切開し、眼科用ハサミとピンセットを用いて剥離して皮膚欠損創を背部に２カ所作成した。そして標準H、本発明２又は対照４を0.5 wt％含む油性軟膏を調製して、該軟膏を、毎日0.1 gずつ塗布し、創傷の治癒の程度を治癒面積で比較した。測定は、ラットをエーテル麻酔下で静置した上、欠損部位につき常に焦点距離を一定として写真撮影し、皮膚欠損部位を画像解析装置を用いて、写真プリント上から測定した。治癒面積は、欠損部作成直後の面積から、各測定時点の面積を差し引いた値とした。統計処理はTukeyの多重比較検定により行った。その結果、本発明２を使用して製造した軟膏を塗布した動物群で顕著な皮膚創傷治癒促進活性が観察された（図７）。
【０１４１】
実施例９
[糖尿病性皮膚潰瘍に対する本発明グリコサミノグリカンの治癒促進効果]
遺伝的糖尿病マウス（db/dbマウス(雌)：日本クレア社）を用いて、本発明グリコサミノグリカンの糖尿病性皮膚潰瘍治癒促進効果を検討した。すなわち、遺伝的糖尿病マウスの背部を剃毛後、φ8 mmの眼科用トレパンで皮膚を皮下まで切開し、眼科用ハサミとピンセットを用いて剥離して皮膚欠損創を作成した。そして標準H、本発明２又は対照４を1％濃度(w/w)で溶解した生理食塩水を、毎日50μlずつ滴下して、創傷の治癒の程度を比較した。測定は、マウスをエーテル麻酔下で静置した上、欠損部位につき常に焦点距離を一定として写真撮影し、皮膚欠損部位を、画像解析装置を用いて、写真プリント上から測定した。治癒面積は、欠損部作成直後の面積から、各測定時点の面積を差し引いた値とした。統計処理はTukey検定により行った。その結果、投与開始後7日間は各被検物質で顕著な差はみられなかったが、投与開始後11日目以降は本発明２が統計的に有意に治癒を促進することが明らかとなった（図８）。
【０１４２】
実施例１０
[本発明グリコサミノグリカンのbFGFに対する親和性の測定]
本発明グリコサミノグリカンの細胞増殖因子との親和性を測定した。すなわち、本発明２ 0.2 mgを100μlの50 mMの重炭酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）に溶解し、さらに74μgのNHS-LC-ビオチン（Succinimidyl-6-(biotineamide)-hexanoate：Pierce社製）を含む水溶液を添加した後、室温で30分間反応させた。次いで、2.5倍量のエタノールを添加し、沈殿した、ビオチン化された本発明２を遠心分離により回収した。このビオチン化された本発明２をアビジン化センサーチップ（BIAcore AB社製: SA）に固定化した。本発明２とbFGFとの相互作用は、液相中に可溶化したbFGFをセンサーチップ表面に接触させた後、表面プラスモン効果を利用してAffinity and kinetics 分析法及びSteady-state分析法の2通りの手法にて解析した。
【０１４３】
その結果、前者の分析法で得られた結合速度定数（K_a）は、対照として用いた標準H及び本発明２で、それぞれ1.3(M^-1S^-110^-6)及び1.0(M^-1S^-110^-6)、解離速度定数（K_d）は、標準H及び本発明２で、それぞれ4.8(S^-110³)及び5.3(S^-110³)であった。これらの結果から計算された解離定数は（K_D）は、標準H及び本発明２で、それぞれ4.1 nM及び4.3 nMであった。
【０１４４】
また、後者の分析法により得られた解離定数（K_D）は、標準H及び本発明２でそれぞれ23 nM及び24 nMであった。
【０１４５】
これらの結果から、本発明２のbFGFに対する親和性は標準Hと比較して同程度であることが明らかである。
【０１４６】
実施例１１
[本発明グリコサミノグリカンのbFGF活性促進効果の測定１（NaClO₃添加）]
試験法９に記載した[bFGF活性促進効果の測定１]に基づき、本発明２のbFGF活性促進効果を測定した。同様に対照１及び対照２についても同様の方法に従ってbFGF活性促進効果を測定した。その結果、本発明２は標準Hと同等のbFGF活性促進効果を有していることが明らかとなった（表１２）。対照１は、標準Hの26%程度すなわち本発明２の４分の１以下のbFGF活性促進効果を有していることが明らかとなった。このことは、¹³C-NMRによって明確となった構造的差異がbFGFの活性の促進効果の差異となっていることを示している。
【０１４７】
【表１２】

【０１４８】
実施例１２
[本発明グリコサミノグリカンのbFGF活性促進効果の測定２（NaClO₃非添加）]
試験法９に記載した[bFGF活性促進効果の測定２]に基づき、本発明グリコサミノグリカン（本発明２）のbFGF活性促進効果を測定した。比較の対照として対照２を使用した。その結果、本発明２は標準Hと同等のbFGF活性促進効果を有していることが明らかとなった（表１３）。対照２の、bFGF活性促進効果は本発明２と比較して半分以下であることが明らかとなった。
【０１４９】
【表１３】

【０１５０】
実施例１３
［本発明グリコサミノグリカンのbFGF活性促進効果の測定３（NaClO₃非添加／初代培養細胞）］
試験法９に記載した［bFGF活性促進効果の測定３］に基づき、本発明グリコサミノグリカン（本発明２）の初代培養細胞に対するbFGF活性促進効果を測定した。比較の対照として標準Hを使用した。その結果、本発明２は標準Hの75%のbFGF活性促進効果を初代培養細胞に対して示すことが明らかとなった（表１４）。
【０１５１】
【表１４】

【０１５２】
実施例１４
[本発明グリコサミノグリカンのフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ親和性の測定]
呼吸における解糖系のキーエンザイムであるフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ（以下「FPA」と記載する）と本発明グリコサミノグリカンとの親和性の測定は、Sasakiらの方法（J. Chromatogr.(1987) 400, 123-132）に従って調製したアフィニティーゲル担体をFPLC用カラムに詰め、アフィニティークロマトグラフィーによって行った。アフィニティーゲル担体の調製は以下の様に行った。本発明２ 200 mgを5 mlの2 Mリン酸緩衝液（pH 7.2）に溶解し、次いで5gのアミノアガロースゲル粉末を懸濁し、15 mgのNaB(CN)H₃を添加して充分撹拌しながら室温にて24時間反応させ、反応終了後、カップリング産物を含有したゲルを濾過し、更に水洗処理を3回行い完全に脱塩した。脱塩後のゲルを5 mlの0.2 M CH₃COONa溶液に懸濁させ、2.5 mlの無水酢酸を添加して0℃にて30分間、次いで室温にて30分間反応させ、反応終了後、生成したゲルを水洗して完全に脱塩した。
【０１５３】
A₄アルドラーゼ、C₄アルドラーゼ、及びこれらのハイブリッド型のアルドラーゼの混合物を、1 mM EDTA、0.5 mM 2-メルカプトエタノールを含む10 mM Tris-HCl（pH 7.5）で平衡化した本発明グリコサミノグリカン固定化ゲル担体を充填したカラムに負荷した。吸着画分につき、15 mlの1 mM EDTA、0.5 mM 2-メルカプトエタノールを含む10 mM Tris-HCl（pH 7.5）および15 mlの1.0 M NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM 2-メルカプトエタノールを含む10 mM Tris-HCl（pH 7.5）の二種の溶液によるNaClの直線的濃度勾配（0〜1.0 M）を用いて溶出した。なお、検出は220 nmの吸光度により行い、溶出ピークのピークトップに相当するNaCl濃度を測定した。
【０１５４】
同様に、本発明２に代えて、(i)標準H、(ii)標準HをJasejaらの方法（Can. J. Chem.(1989) 67, 1449-1456）を部分的に改変した方法によって処理することによって、標準Hの基本骨格を構成するウロン酸残基の2位水酸基にエステル結合した硫酸基を脱離させたヘパリン誘導体（以下「2ODSH」とも記載する）、及び(iii)標準HをInoue & Nagasawaの方法（Carbohydr. Res.(1976) 46, 87-95）に従って処理することにより、標準Hの基本骨格を構成するグルクロン酸の2位アミノ基にエステル結合した硫酸基を脱離させた後、N-アセチル化反応を施したヘパリン誘導体（以下「NDSH」とも記載する）を使用して上述のように調製した担体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、溶出ピークのピークトップとなるNaCl濃度を測定し、親和性の強弱を比較した。
【０１５５】
その結果、FPA活性画分は標準H固定化ゲル担体からは約0.37 Mで溶出されたのに対し、本発明２、2ODSH、及びNDSHを固定化したゲル担体からは、0.31〜0.33 Mで溶出され、各々の物質は標準Hと殆ど同程度のFPA親和性を有することが明らかとなった。
【０１５６】
実施例１５
[本発明グリコサミノグリカンのフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ阻害活性の測定]
FPAに対する、本発明グリコサミノグリカンの阻害活性を測定した。前記酵素は、フルクトース1,6-ビスリン酸（以下「F-1,6-P2」と記載する)を基質として作用させた場合、ジヒドロキシアセトンリン酸（以下「DHAP」と記載する）とグリセルアルデヒド３ーリン酸（GAL-3-P）に分解する。また、フルクトース-1-リン酸（以下「F-1-P」と記載する）を基質として作用させた場合、DHAPとグリセルアルデヒド（GAL）に分解する。したがって、F-1,6-P2およびF-1-Pを基質として、トリオースリン酸イソメラーゼ存在下で、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ系を共役させ、生じたDHAPがグリセロール-3-リン酸に還元される際のNADH(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)量の変化を、340 nmの吸光度の変化により測定した。
【０１５７】
Blostein & Rutterの方法（J. Biol. Chem.(1963) 238, 3280-3285）に従って測定を行った。すなわち、50 mM F-1,6-P2ナトリウム塩、0.1 M F-1-Pモノシクロヘキシルアンモニウム塩、4 mgのNADH及び500μgのグリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼ／トリオースリン酸イソメラーゼ複合体溶液を含む0.1 Mグリシルグリシン緩衝液（pH 7.5）20 mlに終濃度0.4〜４μg/ml（[I]）となるように本発明２を添加し、更に5〜50μlのFPA（FPAの５種のアイソフォームのうち、A₄アルドラーゼ(A₄アイソフォーム)およびC₄アルドラーゼ(C₄アイソフォーム)：ウシ脳由来）（0.005〜0.02 unit）を添加することにより反応を開始させた。単位時間あたりの340 nmの吸光度の減少量につき、25℃の温度条件下で測定して反応速度（v）を算出した。これらの結果より、[I]に対して 1/vをプロットし（Dixonプロット）、[I]切片の値から各場合の Ki値を算出した。
【０１５８】
FPAの単位（活性：unit）は、上記の反応系において25℃にて1μmolの基質を１分間で開裂する酵素量を1 unitと定義した。比活性は、1 mgのタンパク質あたりのunit数として定義した。
【０１５９】
上記阻害活性測定の陰性対照として、本発明２に替えて上記実施例１４記載の2ODSH、NDSH、コンドロイチン硫酸A（生化学工業（株）製）、及びコンドロイチン硫酸C（生化学工業(株)製）を用いて上記と同様に阻害活性を測定した。
【０１６０】
その結果、本発明２はFPAの阻害活性を示した（表１５）。また本発明２の阻害様式は競合阻害であることが明らかとなった。
【０１６１】
これらの結果から、本発明２は強力なFPA活性阻害剤として利用することが可能であり、更に例えば解糖系の亢進を抑制する働きにより、マラリア病原虫感染抑制剤等の医薬としても使用できる可能性が示唆された。
【０１６２】
【表１５】

【０１６３】
実施例１６
[製剤例]
（１）注射剤（液剤）
本発明２（ナトリウム塩）の凍結乾燥物（30 mg/ml）を、終濃度5 mg/mlとなるように5％マンニトール水溶液に溶解し、これを無菌濾過した後、2 mlずつアンプルに分注して注射剤（液剤）を製造した。
【０１６４】
（２）軟膏剤
本発明２（ナトリウム塩）の凍結乾燥物100 mg、鉱油4 g、石油ゼリー8 g、混合メチル／プロピルパラバン60 mg、非イオン性界面活性剤1 g及び精製水30 gを均一に混合し、この混合物を容器に充填して軟膏剤を製造した。
【０１６５】
産業上の利用可能性
従来のヘパリンの修飾体と比較して構造の特定が格段に容易であり、生体に対して優れた活性を有すると共に、抗凝固活性及び出血活性を有しない新規グリコサミノグリカンが本発明により提供される。また、前記グリコサミノグリカンの生体に対する活性を生かした医薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明グリコサミノグリカン（本発明２）調製時の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの経時変化を示す。（１）は、標準ヘパリン（標準Ｈ）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、（２）、（３）、（４）及び（５）は、１１０℃での保持時間をそれぞれ１５分、３０分、６０分及び１２０分として得られたグリコサミノグリカン（対照３、対照４、対照５及び本発明２）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。図中、６Ｓは、６−Ｏ−硫酸基を有するグルコサミン残基の６位炭素原子のシグナル、６は６−Ｏ−硫酸基を有さないグルコサミン残基の６位炭素原子のシグナルを示す。
図２は、本発明グリコサミノグリカン（本発明１）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図３は、本発明グリコサミノグリカン（本発明３）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図４は、本発明グリコサミノグリカン（本発明４）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図５は、対照グリコサミノグリカン（対照１）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図６は、対照グリコサミノグリカン（対照２）の^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
図７は、本発明グリコサミノグリカン（本発明２）の健常皮膚創傷治癒促進活性を示す。
図８は、本発明グリコサミノグリカン（本発明２）の糖尿病性皮膚潰瘍治癒促進活性を示す。

Claims (4)

1. ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンを亜硝酸により分解後、ｐ−ニトロフェニルヒドラジンと反応させて高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う化学的二糖分析法において、上記基本骨格中のグルコサミン残基の６位水酸基に結合した硫酸基が実質的に検出されず、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成から算出される、２位に硫酸基を有するウロン酸残基の全ウロン酸残基に対するモル％が４５％以上であり、かつ該グリコサミノグリカンをヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩ及びＩＩで消化し、得られた酵素消化液をゲルろ過により分析する測定法で測定される、グリコサミノグリカンの酵素消化率が６０％以上であることを特徴とするグリコサミノグリカンを有効成分とするフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤。
2. ウロン酸残基及びグルコサミン残基の二糖の繰り返し構造を基本骨格とする、硫酸基を有するグリコサミノグリカンであって、該グリコサミノグリカンをグリコサミノグリカン分解酵素により消化して高速液体クロマトグラフィーにより分析を行う酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース及び２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースの合計が１０モル％以下であり、かつ２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースが１．５モル％以下であり、さらに有効二糖収率が６０％以上であり、かつ該グリコサミノグリカンをヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼＩ及びＩＩで消化し、得られた酵素消化液をゲルろ過により分析する測定法で測定される、グリコサミノグリカンの酵素消化率が６０％以上であることを特徴とするグリコサミノグリカンを有効成分とするフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤。
3. 前記グリコサミノグリカンは、前記酵素的二糖分析法で得られる二糖組成において、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコース、２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース及び２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースの合計が４５モル％以上であることを特徴とする、請求項２記載のフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤。
4. 前記グリコサミノグリカンは、５％濃度のグリコサミノグリカンの重水溶液を用い、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウムを基準物質とした¹³Ｃ−核磁気共鳴分光法による分析において、６６．５〜６７．５ｐｐｍに実質的にピークが観察されず、且つ１００ｐｐｍ付近及び１０２ｐｐｍ付近のシグナル強度がいずれも９８．３ｐｐｍ付近のシグナル強度よりも高いことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載のフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ阻害剤。

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