JP4546029B2 - 植物における対象とする核酸配列の増幅及び発現に用いる方法及びベクター - Google Patents

Description

本発明は、植物細胞における対象とする１つ又は複数の核酸配列の増幅又は発現をもたらす方法及びベクターに関する。

過去２０年間における植物生物工学の著しい進歩により、植物における商業規模の分子農業の機会が開かれた。植物における組換えタンパク質の生産は、細菌及び酵母に基づくより伝統的なシステムの魅力的な代替手段である。これは、費用がより低いためと単に植物バイオマスの収穫量を増大することにより生産規模を容易に拡大できるため、発酵そう生産に基づいて構築された既存のシステムと比べて明らかな利点を有している。

一般的に、植物における分子農業は、対象とする組換えタンパク質の安定又は一時的発現により達成することができる（フランケンら（Ｆｒａｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第８巻、４１１〜４１６ページ、フィッシャーら（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｐｔ２、１０１〜１０８ページ、ハーバーズ及びソンワルド（Ｈｅｒｂｅｒｓ ＆ Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ、１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１０巻、１６３〜１６８ページ）。安定トランスジェニック植物を用いて、組換えタンパク質に富む野菜組織又は種子を生産することが可能である。野菜組織は処理に直接使用することが可能であるのに対して、種子は長期保存により適している。しかし、特に植物の成長を損なうタンパク質の生産のために、植物における高いレベルのタンパク質発現を達成することは、通常の課題ではない。このためには、植物の成長の適切な段階でタンパク質生産に切り換えることを可能にする適切に調節された発現システムの開発が必要である。

植物における遺伝子発現を制御する既存の技術は、通常組織特異的及び誘導プロモーターに基づくものであり、実質的にそれらのすべてが、非誘導性、すなわち「漏出性」である場合でさえも、基礎発現活性を欠点とする。組織特異的プロモーター（米国特許第０５９５５３６１号、国際出願第０９８２８４３１号）は、強力なツールであるが、それらの使用は非常に特異的な適用分野、例えば、無菌植物の生産（国際出願第９８３９４６２号）又は種子における対象とする遺伝子の発現（国際出願第０００６８３８８号、米国特許第０５６０８１５２号）に限られている。誘導プロモーターは、それらの誘導条件によって２つのカテゴリー、すなわち、無生物因子（温度、光、化学物質）に誘導されるものと生物因子、例えば、病原体又は疫病攻撃により誘導される可能性のあるものに分類することができる。第１のカテゴリーの例は、熱誘導（米国特許第０５１８７２８７号）及び寒冷誘導（米国特許第０５８４７１０２号）プロモーター、銅誘導システム（メットら（Ｍｅｔｔ ｅｔ ａｌ．）、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９０巻、４５６７〜４５７１ページ）、ステロイド誘導システム（アオヤマおよびチュア（Ａｏｙａｍａ ＆ Ｃｈｕａ）、１９９７年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、第１１巻、６０５〜６１２ページ、マクネリスら（ＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、第１４巻、２４７〜２５７ページ、米国特許第０６０６３９８５号）、エタノール誘導システム（カディックら（Ｃａｄｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第１６巻、１７７〜１８０ページ、国際出願第０９３２１３３４号）及びテトラサイクリン誘導システム（ワインマンら（Ｗｅｉｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、第５巻、５５９〜５６９ページ）である。植物における化学的誘導システムの分野における最近の開発例の１つは、グルココルチコイドデキサメタゾンによりスイッチを入れ、テトラサイクリンによりスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（ボーナーら（Ｂｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、第１９巻、８７〜９５ページ）。化学的誘導システムに関する総説については、ズオ及びチュア（Ｚｕｏ ＆ Ｃｈｕａ）、（２０００年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１１巻、１４６〜１５１ページ）を参照のこと。誘導プロモーターの他の例は、植物における発病関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターである。これらの遺伝子は、病原体攻撃に反応する植物シナリング経路の重要な成分であるサリチル酸又はＰＲ遺伝子発現を誘発することができる他の化合物（ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール又はイソニコチン酸）による植物の処理により誘導することができる（米国特許第０５９４２６６２号）。

ウイルス感染によってもたらされるウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを用いる制御可能トランス遺伝子発現システムの報告が存在する（例えば、米国特許第６０９３５５４号、米国特許第５９１９７０５号を参照）。これらのシステムでは、組換え植物ＤＮＡ配列はウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるウイルスゲノムからのヌクレオチド配列を含む。ウイルスポリメラーゼが機能をトランスで与える能力が低く、ＲＮＡ増幅以外の過程を制御することが不可能であるので、このシステムの有効性は限定されたものである。

上記のシステムは、トランス遺伝子発現の所望のパターンを得る可能性のあるものとしてかなり興味深いものであるが、誘導物質（銅）又はそれらの類縁体（ステロイドで制御可能なシステムの場合、ブラシノステロイド）が残余発現を誘発するに十分なレベルで植物組織に存在し得るので、発現パターンにわたる厳密な制御を可能にするものでない。さらに、化学的誘導物質としての抗体及びステロイドの使用は、大規模適用に望ましいものではない。ＰＲ遺伝子やウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをトランス遺伝子の制御手段として使用する場合、原因病原体感染やストレスが発現を誘発し得るので、トランス遺伝子発現に対する厳密な制御の要件も満たされない。組織又は器官特異的プロモーターは、非常に狭い適用分野に限定される。その理由は、それらが発現を特定の器官や植物の発達の段階に限定するが、トランス遺伝子を自在にスイッチオンとすることができないためである。

高レベルのタンパク質生産を達成する１つの方法は、植物の成長の所望の段階でトランス遺伝子を送達し、発現させることが可能で、植物資源を十分に活用し、所望の産物の高収量を可能にする一時的発現である。大規模生産のための培地に最も適した一時的発現アプローチとしては、アグロバクテリウム媒介（カピラら（Ｋａｐｉｌａ ｅｔ ａｌ．）、１９９６年、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、第１２２巻、１０１〜１０８ページ）及び植物ウイルスベクター媒介システム（総説については、ポルタ及びロモノッソフ（Ｐｏｒｔａ ＆ Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ）、１９９６年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第５巻、２０９〜２２１ページ、ユシボフら（Ｙｕｓｉｂｏｖ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２４０巻、８１〜９４ページを参照）などがある。ウイルスベクターを用いる発現システムは、植物核トランス遺伝子よりも有意に高い収量のトランス遺伝子産物の生産をもたらす。例えば、ウイルスベクターから発現させた場合、トランスジェニックタンパク質のレベルは、総細胞植物タンパク質含量の５〜１０％に達し得る（クマガイら（Ｋｕｍａｇａｉ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｇｅｎｅ、第２４５巻、１６９〜１７４ページ、シブプラサドら（Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２５５巻、３１２〜３２３ページ）。ＲＮＡウイルスは、ＤＮＡウイルスと比べて高い発現レベルをもたらすので、最も適している。植物におけるトランスジェニック物質の全系発現に適したウイルスベクターを記述しているいくつかの公表特許が存在する（米国特許第５３１６９３１号、米国特許第５５８９３６７号、米国特許第５８６６７８５号）。一般的に、これらのベクターは、別のサブゲノムプロモーター（米国特許第５４６６７８８号、米国特許第５６７０３５３号、米国特許第５８６６７８５号）又は非依存性タンパク質翻訳のためのＩＲＥＳエレメントを用いたポリシストロン性ウイルスＲＮＡ（ドイツ特許出願第１００４９５８７．７号、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／１１６２９）からのウイルスタンパク質との翻訳融合としての外来遺伝子を発現し得る（米国特許第５４９１０７６号、米国特許第５９７７４３８号）。第１のアプローチ、すなわち、組換えタンパク質のウイルス構造タンパク質との翻訳融合（ハマモトら（Ｈａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．）、１９９３年、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１１巻、９３０〜９３２ページ、ゴピナスら（Ｇｏｐｉｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２６７巻、１５９〜１７３ページ、日本国特許第６１６９７８９号、米国特許第５９７７４３８号）は、有意な収量をもたらす。しかし、組換えタンパク質はウイルスタンパク質と容易に分離することができないので、そのようなアプローチの使用は限定される。このアプローチの変形形態の１つでは、ウイルス部位特異的プロテアーゼにより認識されるペプチド配列を介しての、又は触媒性ペプチドを介しての翻訳融合を用いる（ドルジャら（Ｄｏｌｊａ ｅｔ ａｌ．）、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、１０２０８〜１０２１２ページ、ゴピナスら（Ｇｏｐｉｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２６７巻、１５９〜１７３ページ、米国特許第５１６２６０１号、米国特許第５７６６８８５号、米国特許第５４９１０７６号）。

異種サブゲノム上に構築されたウイルスベクターを用いた発現方法は、現在までのところ最高レベルのタンパク質生産をもたらす（米国特許第５３１６９３１号）。そのようなベクター及び他の多くのものの重大な欠点は、増幅されるＤＮＡの大きさに関してそれらの能力が限られていることである。通常、安定な構築物は１ｋｂ以下の挿入断片を収容する。ジー デラシオッパら（Ｇ．ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．）（国際出願第９９３６５１号）は内因性遺伝子を発現抑制する目的で植物ｃＤＮＡライブラリーを発現させるためのＴＭＶに基づくウイルスベクターの使用を述べたことから、植物機能ゲノム科学のいくつかの分野では、これはそのような重大な限界ではないかもしれない。ヘルパーウイルスを用いる２成分増幅システムは、わずかにより良好な能力をもたらす可能性がある（米国特許第５８８９１９１号）。しかし、植物におけるタンパク質又は低分子量化合物の生産を含むほとんどの適用例において、これらの限界を既存の方法の範囲内で改善することは不可能である。例えば、植物における生分解性プラスチックの生産のためには、最大４つの組換え遺伝子を発現させなければならず（ハンレイら（Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、第５巻、４５〜４６ページ）、植物におけるメバロン酸生合成経路のモジュレーションには少なくとも７つの細菌遺伝子が必要である（デウイック ピー（Ｄｅｗｉｃｋ,Ｐ．）、１９９９年、Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．、第１６巻、９７〜１３０ページ）。

従来技術のウイルスを用いる植物発現システムに関するさらなる重大な問題は、生物学的安全性である。一方では、植物体内及び隣接する植物へのウイルスの広がりを促進し、それにより所望の遺伝子産物の収量を増大させるために、組換えウイルスの高い感染力が高度に望まれる。他方では、望まれていない植物への広がりが容易に起こり得るので、そのような高い感染力は組換え物質の閉じ込めを損なう。

したがって、上記の欠点を有さず、特に対象とする配列の大きさの限界を有さない、植物細胞内の対象とする核酸配列の増幅又は発現の方法を提供することが本発明の目的である。

植物細胞内の対象とする複数の核酸配列の増幅又は発現を可能にする新規な方法を提供することが本発明の他の目的である。

さらに、生態学的及び生物学的安全性が向上した、植物細胞内の対象とする核酸配列の増幅又は発現の方法を提供することが本発明の目的である。

ここに、我々は、上記の限界のない、すなわち、発現させるＤＮＡのサイズに関する検出できる限界を有さず、同じ細胞内で複数の遺伝子を発現させることを可能にし、高い内在性バイオセーフティーパラメーターを有するシステムを記述する。

本発明は、植物、植物組織、植物細胞又は細胞培養における対象とする１つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現をもたらす方法であって、植物細胞に、前記細胞内で処理を受けるように設計されている少なくとも１つのベクター前駆体を供給し、前記処理により前記植物細胞に前記増幅及び／又は発現を可能にする少なくとも１つのレプリコンを与え、前記の少なくとも１つのレプリコンが、好ましくは前記処理により前記の少なくとも１つのベクター前駆体のそれぞれに構造的に関連することを特徴とする方法を提供する。

本発明はさらに、植物、植物組織、植物細胞又は細胞培養における対象とする１つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現をもたらす方法であって、植物細胞に、前記細胞内で処理を受けるように設計されている少なくとも１つのベクター前駆体を供給し、前記処理により前記植物細胞に、
（ａ）前記処理のため相互に構造的に関連しており、
（ｂ）相互に機能的に異なっていて、
（ｃ）前記増幅及び／又は発現を可能にする、
少なくとも２つのレプリコンを与えることを特徴とする方法を提供する。

さらに、本発明は、植物、植物組織、植物細胞又は細胞培養における対象とする１つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現をもたらす方法であって、植物細胞に、前記細胞内で部位特異的な組換えによる処理を受けるように設計されている少なくとも２つのベクター前駆体を供給し、前記処理により前記植物細胞が前記増幅及び／又は発現を可能にする少なくとも１つのレプリコンを与えることを特徴とする方法。好ましくは、前記処理により、前記の少なくとも１つのレプリコンが前記の少なくとも２つのベクター前駆体のそれぞれと構造的に関連している。

本発明はさらに、それぞれが増幅及び／又は発現をもたらす上記の方法の１つを含む、生化学的産物を生産する方法、遺伝子の機能を確定する方法及び人工的又は誘導的進化の方法を記述する。

さらに、この方法のためのベクター又はベクター前駆体及びウイルス材料を提供し、この方法を実施することによりウイルス材料、レプリコン及び植物材料が得られ、又は得ることが可能である。ウイルス材料は、植物細胞内で複製することができる核酸を含む。それは、感染性ＤＮＡ又はＲＮＡを含む。ウイルス材料は、裸又はコートタンパク質でコートされている。

さらに、（ｉ）植物細胞、種子又は植物並びに（ｉｉ）上記のベクター、ベクター前駆体、ウイルス材料又はレプリコンを含むパーツキットを提供する。（ｉ）植物細胞、種子又は植物並びに（ｉｉ）上記のベクター、ベクター前駆体、ウイルス材料又はレプリコンを含むアグロバクテリウムを含むさらなるパーツキットを提供する。

本発明の方法は、植物細胞内の問題となる１つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現をもたらす。増幅とは、ＤＮＡ又はＲＮＡの生産を指す（例えばアンチセンス技術）。発現とは、ポリペプチド又はタンパク質の形成を指す。両方の場合に、最終目的は、その生産が前記ＤＮＡ又はＲＮＡの増幅及び／又はポリペプチド又はタンパク質の発現を必要とする生化学的産物であろう。

本発明の方法は、植物、植物組織、植物細胞又は細胞培養において実施することができる。前記方法を植物細胞内で実施することが好ましい。前記方法を植物体内で実施することがより好ましい。

本発明によれば、植物細胞へのベクター前駆体の供給は、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム媒介送達、非生物学的送達、若しくはベクター前駆体又は複数のベクター前駆体を形成するために植物核ＤＮＡにあらかじめ組み込んだ前ベクター前駆体ＤＮＡの変換を含んでいてよい。しかし、植物細胞へのベクター前駆体の前記供給はさらに、トランスフェクション又は形質転換に加えて、細胞作用を含んでいてよい。例えば、ＲＮＡウイルスに基づくベクター前駆体の場合、形質転換又はトランスフェクションされた一次ＤＮＡは、細胞内でＲＮＡベクター前駆体を生成させるために転写を必要とするであろう。アグロバクテリウム媒介送達の場合、ベクター前駆体は、アグロバクテリウムにより送達されるＴ−ＤＮＡから切り出すか、転写しなければならないであろう。

レプリコンは、前記植物の細胞内で自律複製の能力があるＤＮＡ又はＲＮＡである。例としては、細菌及び酵母プラスミド、色素体及びミトコンドリアＤＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルス、ウイロイド、ファージなどがある。レプリコンは、複製起点を有さなければならない。複製起点は、レプリコンがＤＮＡ又はＲＮＡレプリコンであるかどうかによって、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼにより、あるいは、例えば、ウイルスの起点の異種ポリメラーゼにより認識される。この場合、植物細胞は、例えば、前記レプリコンのうちの１つにより前記異種ポリメラーゼが供給されなければならない。植物細胞内のレプリコンの自律複製は、対象とする配列の発現レベルを増加させ、細胞間及び植物体内の広がりを支える、それらの濃度が増加するという効果をおそらく有すると思われる。レプリコンは、ベクター前駆体と比べて高い感染力及び拡大能力を有することが好ましい。

前記少なくとも１つ又は前記少なくとも２つのレプリコンは、ウイルス粒子集合、感染力、遺伝子発現抑制の抑制、逆転写、宿主染色体への組込み、細胞間移動又は長距離移動のような付加的なウイルス能力を保持していてよい。前記レプリコンのうちの１つは、他の１つのレプリコン又は複数のレプリコンの複製に必要な機能をトランスで与える本質的にヘルパー型ウイルスであってよい。さらに、前記レプリコンのうちの１つが、他の１つのレプリコン又は複数のレプリコンの複製、逆転写、宿主染色体への組み込みに必要な機能をトランスで与える本質的に野生型レトロウイルス又はレトロトランスポゾンであってよい。

前記少なくとも１つ又は前記少なくとも２つのレプリコンが、対象とする前記核酸配列の増幅及び／又は発現をともに可能にすることが好ましい。もし対象とする１つの配列が前記レプリコンのうちの１つから増幅又は発現される場合、他のレプリコンは、例えば、前記レプリコンの複製、若しくは前記方法が細胞培養又は植物において実施する場合には隣接する細胞への少なくとも１つのレプリコンの広がりに必要な機能を必要とする。この場合、レプリコンは相互に機能的に協同する。

対象とする複数の配列を増幅又は発現させる場合、各配列を１つのレプリコンから発現させ、それによりレプリコンが（ともに）前記増幅又は発現を可能にすることが好ましい。この場合においても、レプリコンが相互に機能的に協同することが好ましい。例として、前記レプリコンの複製又は広がりのための機能は、対象とする前記配列を増幅又は発現させる１つ又はいくつかの前記レプリコンから、若しくは別のレプリコンから発現させることができる。機能的協同がない場合、増幅又は発現レベルは、はるかに低いか、若しくはもし増幅又は発現が植物細胞内又は植物において望まれるならば、前記ベクター前駆体を供給された細胞に限定されるであろう。

前記少なくとも１つ又は前記少なくとも２つのレプリコンは、それらが対象とする前記配列の増幅及び／又は発現のための異なる機能を備えているという点で、機能的に相互に異なっている。そのような機能の例としては、対象とする前記核酸配列のコーディングに加えて、レプリコンの複製に必要な産物の発現、前記レプリコンを得るためのベクター前駆体の処理を促進する因子又は産物（好ましくは酵素）の発現、前記レプリコンの細胞間又は長距離又は植物間移動（例えば、タンパク質又はコートタンパク質の移動）に必要な産物の発現などがある。これらの産物は、トランス又はシスで機能してよい。機能の差異は、植物細胞内の処理の過程で進化する可能性があるランダム突然変異を含まない。

前記処理により、前記の少なくともレプリコンが互いに配列の一部を共有しているという点で、相互に構造的に関連している。関連性の種類は、処理（修飾過程）の種類に依存する。前記方法において１つのレプリコンが生産されるならば、前記レプリコンは、前記処理により、前記の少なくとも１つ又は前記の少なくとも２つのベクター前駆体と構造的に関連する。

本発明のベクター前駆体は、細胞に本発明による１つのレプリコン又は複数のレプリコンを与える、以下のＤＮＡ又はＲＮＡ修飾過程の１つによる植物細胞内の処理を受ける。植物細胞内の処理は、ＤＮＡ組換え、挿入又は除去等のＤＮＡ修飾を含んでいてよい。あるいは、それは、ＲＮＡスプライシング、連結反応又は組換え等のＲＮＡ修飾を含んでいてよい。本発明の範囲内では、前記処理は転写を含まない。ベクター前駆体はそれ自体、前記植物の細胞内で自律複製の能力があるＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。

本発明のベクター前駆体は、好ましくは植物ウイルス起源のものであり、より好ましくはＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルス起源のものである。特定のウイルスの例を下に示す。ベクター前駆体は、レプリコンのような植物細胞内で自律複製の能力があるものであってよい。

植物細胞には、１つ又は複数のベクター前駆体を供給することができる。細胞に１つのベクター前駆体のみを供給する場合、この前駆体は細胞に少なくとも２つのレプリコンを与える。細胞に２つ又はそれ以上のベクター前駆体供給する場合、前記ベクター前駆体間の相互作用、例えば組換えを含む処理により、細胞に好ましくは前記の少なくとも１つ又は前記の少なくとも２つのレプリコンを与える。植物細胞に２つ又はそれ以上のベクター前駆体供給することにより、本発明の１つのレプリコン又は複数のレプリコンを進化する可能性が著しく増加する。ベクター前駆体の設計によっては、植物細胞内でいくつかの異なるＤＮＡ又はＲＮＡ修飾が起こることがある。

本発明による方法は、野生型植物細胞若しくは前記処理に必要な機能を与え、あるいは感染力、レプリコンの複製、ウイルス粒子集合、宿主による遺伝子発現抑制の抑制、宿主染色体への組込み、逆転写、前記の得られたレプリコンの細胞間又は長距離移動に必要な機能を与えるために遺伝子工学により処理した植物細胞の使用に基づいている。前記植物細胞の前記遺伝子工学による処理は、一時的発現、ウイルス又はアグロバクテリウム媒介トランスフェクション、前記植物細胞の核又は小器官のゲノムへの若しくは自律的に複製するプラスミドへの安定な組込みにより行う。本発明の方法に用いる植物細胞又は植物は、好ましくはより高等な植物又はその細胞である。

本発明による増幅又は発現をもたらす方法は、従来技術と比べていくつかの重要な優位性を特徴として有している。増幅又は発現に必要な機能は少なくとも２つのレプリコンにより共有され、それにより、レプリコンの大きさは従来技術のベクターよりも小さいので、増幅又は発現させるべき対象とする核酸配列の大きさは、従来技術におけるよりもはるかに制限が少ない。したがって、増幅又は発現の効率がより高い。

さらに、本発明の方法は、対象とする複数の核酸配列の増幅及び／又は発現を可能にする。対象とする２つの遺伝子の発現の例を記載する。しかし、対象とする３、４又はそれ以上の核酸配列の発現は、本発明の範囲内で実現可能である。これは、全生化学的経路又はカスケード若しくは多サブユニットタンパク質の発現を可能にするものである。対象とする各配列は、１つのレプリコンから発現させることが好ましい。下記のような方法の効率のよい実施のための付加的な機能を付加的なレプリコンに加えることができる。あるいは、レプリコンはこれらの複数の機能をコードすることができる。

本発明の第３の重要な利点は、従来技術の方法と比べて生物学的安全性が向上しているいくつかの可能性が存在することである。複数のベクター前駆体を用いる実施形態において、すべての前駆体が植物に入る場合、方法は機能的であるにすぎない。そして、付加的成分が細胞内に供給される場合、又は前記成分を発現するトランスジェニック細胞を使用する場合、系は機能的であるにすぎない。一実施形態において、対象とする配列を発現するレプリコンは、一次感染細胞から植物体全体に広がる可能性があるが、他の植物に広がる可能性はない。

対象とする核酸配列の例としては、コーディング配列又はその一部若しくは遺伝要素などがある。本願明細書では、遺伝要素は遺伝子の構造部分のコーディング以外の明確な遺伝機能を有するＤＮＡ又はＲＮＡ要素である。例としては、転写エンハンサー、プロモーター、翻訳エンハンサー、組換え部位、転写終結配列、ＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）、制限部位などが挙げられる。好ましい遺伝要素は、対象とするタンパク質をコードする異種核酸配列に作動可能なように連結された翻訳エンハンサーとして使用されるトバモウイルスＩＲＥＳ_ｍｐ７５である。

本発明の好ましい実施形態において、前記植物細胞に少なくとも１つの（種類の）レプリコンを与える。前記の１つのレプリコンは、少なくとも２つのベクター前駆体間の部位特異的組換えにより形成させることが好ましい。前記部位特異的組換えは、ＤＮＡレベルで行うことが好ましい。したがって、前記の１つのレプリコンはＤＮＡであってよい。あるいは、前記の１つのレプリコンは、部位特異的組換えの後に転写により形成させてもよい。この実施形態において、前記ベクター前駆体は、前記植物細胞内で自律的複製の能力がないことが好ましい。生物学的安全性の観点から、この実施形態は特に好ましい。

本発明の他の好ましい実施形態において、植物細胞にベクター前駆体のｃＤＮＡを供給する（図２及び４）。ベクター前駆体を生成させる転写後に、スプライシングによる細胞内の処理により、対象とする配列を増幅又は発現させることができるＲＮＡウイルス起源のレプリコンが細胞に与えられる。スプライシングは遅く、かつ／又は細胞内のすべてのベクター前駆体分子で進化するわけではないので、スプライシングされていない前駆体分子は細胞内に留まるであろう。本発明の目的のために、これらの残りのスプライシングされていないベクター前駆体は、自律的複製の能力があるならば、レプリコンでもある。本発明では、それらを、対象とする前記配列の増幅又は発現に必要な機能、例えば、隣接細胞にレプリコンを広げる機能の発現のために用いる。

他の好ましい実施形態において、ＡＢ_１、ＡＢ_２、．．．、ＡＢ_ｎ型又はＢ_１Ａ、Ｂ_２Ａ、．．．、Ｂ_ｎＡ型のレプリコンの組を一次ベクター前駆体（Ａ）と少なくとも２つの二次ベクター前駆体の組（Ｂ_１、Ｂ_２、．．．、Ｂ_ｎ）［ｎは２以上の整数］との部位特異的組換えにより生成させる。図８に示す実施形態において、発現又は増幅させるべき配列を含むベクター前駆体（二次ベクター）を他のベクター前駆体（一次ベクター前駆体）で組換えて、これらの配列を増幅又は発現することができるＡＢ_１、ＡＢ_２、およびＡＢ_３型のレプリコンを生成させる。細胞に少なくとも２つのレプリコンを与えるには、少なくとも３つのベクター前駆体が必要である。レプリコンを広げる機能を１つ又は複数の前記レプリコンから発現させることが好ましい。

本発明の方法を実施するために、植物又は植物細胞を形質転換又はトランスフェクションするのにベクター前駆体を直接用いることができる。これは、特にＲＮＡウイルス起源のレプリコンについて当てはまる。ＲＮＡウイルス起源のレプリコンの場合、形質転換又はトランスフェクションに用いるＤＮＡベクターは、細胞内にベクター前駆体を生成させるための転写を必要とする。

本発明の方法は、植物、植物組織、植物細胞又は細胞培養における多量の１つ又は複数の核酸配列を環境的に安全な方法で生成させるのに用いることができる。特に、前記方法を多量の前記の少なくとも１つ又は前記の少なくとも２つのレプリコンを生成させるのに用いることができる。前記レプリコンは、植物材料から精製又は濃縮することができる。前記レプリコンは、別の植物、植物組織、植物細胞又は細胞培養を形質転換又はトランスフェクションするのに、場合によっては濃縮又は精製後に、用いることができるベクター又はウイルス材料であってよい。この実施形態において、本発明の方法は、植物を形質転換又はトランスフェクションするための感染性ウイルス材料又はベクターを農業又は農作規模のような大規模に生成させる生物学的に安全な方法であると言える。前記感染性ウイルス材料又は前記ベクターは、パッケージング又はコートされたウイルス材料であってよい。前記ウイルス材料をパッケージングするのに必要なタンパク質材料は、前記レプリコンから発現させることができる。

本発明の方法は、生化学的産物の生産に用いることができる。前記生化学的産物は、好ましくはタンパク質、より好ましくは薬剤タンパク質である。前記薬剤タンパク質は、機能抗体であってよい。

本発明の方法はさらに、遺伝子機能確定、特に迅速遺伝子機能確定又は機能ゲノム分析に用いることができる。

本発明の方法はさらに、人工的又は誘導的進化に、特に人工的又は誘導的遺伝子進化又は遺伝要素の人工的又は誘導的進化に用いることができる。

本発明では、ウイルスベクターシステムのすべての可能性を有し、不十分な能力のようなそれらの短所を欠く、対象とする１つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現のためのアプローチを記述する。さらに、本発明はより良好なバイオセイフティー特性を提供する。異なる分類学的群に属するウイルスを本発明の原理に従ってウイルス起源のベクターの構築に用いることができる。これは、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むウイルスについて当てはまる。その例を以下に示す（本文書を通して、各代表種の名称の前にそれが属する目、科及び属の名称を付す。目、科及び属の名称は、ＩＣＴＶにより承認されている場合、イタリック体で記す。引用符でくくった（そしてイタリック体でない）分類名は、この分類名がＩＣＴＶ国際承認名を有さないことを示している。種（通俗名）名は通常の書体で示す。属又は科への正式の指定がなされていないウイルスが示されている。）。

ＤＮＡウイルス：
環状ｄｓＤＮＡウイルス：科：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ、代表種：ツユクサ黄色斑紋ウイルス、属：Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：カリフラワーモザイクウイルス、属：「ＳｂＣＭＶ様ウイルス」、代表種：ダイズ退緑斑紋ウイルス、属：「ＣｓＶＭＶ様ウイルス」、代表種：キャッサバ葉脈ウイルス、属：「ＲＴＢＶ様ウイルス」、代表種：イネツングロ病ウイルス、属：「ペチュニア葉脈透化様ウイルス」、代表種：ペチュニア葉脈透化ウイルス；
環状ｓｓＤＮＡウイルス：科：ジェミニウイルス（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）、属：Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ（ジェミニウイルスサブグループＩ）、代表種：トウモロコシ条斑ウイルス、属：Ｃｕｒｔｏｖｉｒｕｓ（ジェミニウイルスサブグループＩＩ）、代表種：ビートカーリートップウイルス、属：Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ（ジェミニウイルスサブグループＩＩＩ）、代表種：マメゴールデンモザイクウイルス；

ＲＮＡウイルス：
ｓｓＲＮＡウイルス：科：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：アルファルファマメゴールデンモザイクウイルス、属：ｌｌａｒｖｉｒｕｓ、代表種：タバコ条斑ウイルス、属：Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：スズメノチャヒキモザイクウイルス、属：Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：キュウリモザイクウイルス；
科：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、代表種：ビート黄化ウイルス、属：Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ、代表種：レタス感染黄化ウイルス、科：Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：ササゲモザイクウイルス、属：Ｆａｂａｖｉｒｕｓ、代表種：ソラマメウイルトウイルス１、属：Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ、代表種：タバコ輪点ウイルス；
科：Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ、代表種：ジャガイモウイルスＹ、属：Ｒｙｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：ライグラスモザイクウイルス、属：Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：オオムギ黄化モザイクウイルス；
科：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓ、代表種：パースニップ斑紋ウイルス、属：Ｗａｉｋａｖｉｒｕｓ、代表種：イネわい化ウイルス、科：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：カーネーション斑紋ウイルス、属：Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ、代表種：カーネーション輪点ウイルス、属：Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：トウモロコシ退緑斑紋ウイルス、属：Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓ、代表種：タバコえそウイルス、属：Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ、代表種：トマトブッシースタントウイルス、属未指定のｓｓＲＮＡウイルス、属：Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ、代表種：ステムグルービングウイルス、
属：Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ、代表種：カーネーション潜在ウイルス、属：Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：カーネーション隆起成長モザイクウイルス、
属：Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓ、土壌コムギモザイクウイルス、属：Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ、代表種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：Ｉｄａｅｏｖｉｒｕｓ、代表種：ラズベリーブッシー萎縮ウイルス；
属：Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ、代表種：オオムギ黄萎ウイルス、属：Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ、代表種：トウモロコシラヤドフィノ（ｒａｙａｄｏ ｆｉｎｏ）ウイルス、属：Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ、代表種：ジャガイモウイルスＸ；属：Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：インゲンマメ南部モザイクウイルス、属：Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ、代表種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：タバコモザイクウイルス、
属：Ｔｏｂｒａｖｉｒｕｓ、代表種：タバコ茎えそウイルス、
属：Ｔｒｉｃｈｏｖｉｒｕｓ、代表種：リンゴクロロティックリーフスポットウイルス；属：Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓ、代表種：カブラ黄化モザイクウイルス；属：Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓ、代表種：ニンジン斑紋ウイルス、
ネガティブｓｓＲＮＡウイルス：目：Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ、科：Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、代表種：レタスｎｅｃｒｏｔｉｃ ｙｅｌｌｏｗウイルス、属：Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ、代表種：ジャガイモ黄化えそウイルス、
ネガティブｓｓＲＮＡウイルス：科：Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ、代表種：トマト黄化えそウイルス；
ｄｓＲＮＡウイルス：科：Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ、代表種：シロクローバ潜伏ウイルス１、属：Ｂｅｔａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ、代表種：シロクローバ潜伏ウイルス２、科：Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ、代表種：フィジー病ウイルス、属：Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓ、代表種：創傷腫瘍ウイルス、属：Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓ、代表種：イネラッギドスタントウイルス；

未指定ウイルス：ゲノムｓｓＤＮＡ：種：バナナバンチートップ（ｂｕｎｃｈｙ ｔｏｐ）ウイルス、種：ココナツ葉腐れ（ｆｏｌｉａｒ ｄｅｃａｙ）ウイルス、種：地下クローバースタント（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃｌｏｖｅｒ ｓｔｕｎｔ）ウイルス、
ゲノム：ｄｓＤＮＡ、種：キュウリ葉脈黄化ウイルス、ゲノム：ｄｓＲＮＡ、種：タバコスタントウイルス、
ゲノム：ｓｓＤＮＡ、種：ニンニクウイルスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、種：ブドウのつる斑紋ウイルス、種：トウモロコシ白線モザイクウイルス、種：オリーブ潜在ウイルス２、種：ウルミアメロンウイルス、種：ゼラニウム輪紋ウイルス；
サテライト及びウイロイド：サテライト：ｓｓＲＮＡサテライトウイルス：サブグループ２サテライトウイルス、代表種：タバコえそサテライト、
サテライトＲＮＡ、サブグループ２Ｂ型ｍＲＮＡサテライト、サブグループ３Ｃ型線状ＲＮＡサテライト、サブグループ４Ｄ型環状ＲＮＡサテライト、
ウイロイド、代表種：ジャガイモ紡・型塊茎（ｓｐｉｎｄｌｅ ｔｕｂｅｒ）ウイロイド。

概ね、植物ウイルス起源のベクターは、植物における自律的複製の能力を有するプラスミド（レプリコン）として用いられている。しかし、非ウイルス要素を用いてそのようなプラスミドを遺伝子工学により創製するのに必要な原理は知られている。例えば、植物細胞からのレプリコンの多くの推定上の起源が記載された（バーラニら（Ｂｅｒｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、１９８８年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１１巻、１６１〜１６２ページ、ヘルナンデスら（Ｈｅｒｎａｎｄｅｓ ｅｔ ａｌ．）、１９８８年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１０巻、４１３〜４２２ページ、バーラニら（Ｂｅｒｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、１９８８年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１１巻、１７３〜１８２ページ、エクダールら（Ｅｃｋｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．）、１９８９年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１２巻、５０７〜５１６ページ）。高等植物のゲノムからの自律的に複製する配列（ＡＲＳ要素）は、酵母及び高等動物からのＡＲＳ要素と共通の構造上及び配列の特徴を有することが示された（エクダールら（Ｅｃｋｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．）、１９８９年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１２巻、５０７〜５１６ページ）。植物ＡＲＳ要素は、サッカロミセスセレビシエにおけるプラスミドに自律複製能力を与えることができる。酵母におけるプラスミドの自律複製を促進することができるトウモロコシ核ＤＮＡ配列の試験で、それらがトウモロコシゲノム内の高度に反復性配列の２つのファミリーであることが示された。それらの配列は、特徴的なゲノムハイブリッド形成パターンを有する。一般的に各１２〜１５ｋｂのゲノム断片上にＡＲＳ相同配列の１つのコピーが存在するにすぎなかった（バーラニら（Ｂｅｒｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．）、１９８８年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１１巻、１６１〜１６２ページ）。植物起源のレプリコンの他の源は、植物における異種遺伝子の増幅及び発現を刺激することができる植物リボソームＤＮＡスペーサー要素である（ボリスジュクら（Ｂｏｒｉｓｊｕｋ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第１８巻、１３０３〜１３０６ページ）。

したがって、本発明において意図するレプリコン又はベクター前駆体は、必ずしも植物ウイルスに由来するものではない。植物ＤＮＡウイルスは標的ＤＮＡ形質転換に特に有用であると思われるレプリコン（ベクター）を遺伝子工学により創製する容易な方法を提供するが、植物ＲＮＡウイルス又は非植物ウイルスからの要素から完全又は部分的に作られているベクターが可能である。植物ウイルス起源のレプリコンは、明らかに有利である。そのようなレプリコンは、複製に加えて、例えば、細胞間及び長距離移動のための別の有用な機能を提供する可能性がある。さらに、それらは、感染植物からのウイルス根絶の既知の方法を用いて植物細胞から帰納的により容易に除去することが可能であることが多い。

本発明の一般的原理を図１に示す。最も簡単な例において、１種類のベクター前駆体（プロベクター）（Ａ）を植物細胞内に供給し、前記細胞内でのその処理により、それが、対象とする配列の増幅及び／又は発現をもたらすことができる少なくとも１つ又は少なくとも２つの構造的に関連し、機能的に異なるレプリコン（Ｆ及びＧ）を生ずる。複数のベクター前駆体を植物細胞に導入することができる［Ａ（＋Ｃ、Ｄ、Ｅ．．．）］。場合によっては、前記細胞は形質転換したもので、ベクター前駆体の処理及び／又は発現、複製、細胞間又は植物体全体にわたる移動に必要な他の別の成分（Ｂ）を含んでいてよい。

本発明の一実施形態において、我々は植物核におけるプロベクターＲＮＡのスプライシングに基づくプロベクター（ベクター前駆体）システムを記述する。このシステムは、植物ウイルスゲノムｃＤＮＡの一部、対象とする遺伝子及び植物細胞内の機能し得るスプライシング部位を含むプロベクターのＤＮＡ分子を含む（例については図２又は４を参照）。トランスフェクションされた植物細胞内での転写後に、一次ＲＮＡ産物（プロベクター又はベクター前駆体）をスプライシングにより処理することができる。プロベクター（ベクター前駆体）の設計のせいで、対象とする遺伝子（例えば、ＧＦＰ）はこのスプライシングされた形態におけるウイルス遺伝子の１つ（例えば、ＣＰ）を置換する。これにより、対象とする遺伝子（ＧＦＰ）が、置換ウイルスタンパク質の代わりに、正常なウイルス経路を経て発現することが可能になる。しかし、スプライシングは１００％の効率で進行することはあり得ないので、一次転写物の一部がスプライシングされずに残り、スプライシングされたのものと同様に核から輸出される。その結果、２種類の自己複製性ウイルスベクターＲＮＡｓ（レプリコン）がトランスフェクションされた植物細胞の細胞質に出現する。これは、１つのベクター前駆体を用いて進化させたレプリコンからのＧＦＰとＣＰの発現をもたらす。例示した事例において、ＧＦＰの発現のレベルはＣＰの発現のレベルよりもはるかに高い可能性があることを言及しなければならない。トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）について、感染時に生産されたウイルスタンパク質の量がこのタンパク質をコードする遺伝子とウイルスの３’末端との間の距離に依存することが示された。ＧＦＰはＲＮＡのスプライシングされたものから発現するので、対応するサブゲノムＲＮＡは、ＣＰが発現するＲＮＡよりも有意に短い（図４、合成又は遺伝子工学により生産されたＧＦＰのｓＧＦＰ鎖）。

この実施形態を例示するものとして、我々は、２つのよく知られている植物ウイルスであるジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）とアブラナ科草本感染ウイルス（ＣｒＴＭＶ）に基づいて２つのプロベクター（ベクター前駆体）を構築した。両事例において、ＣＰ遺伝子が供与（上流）及び受容（下流）スプライシング部位（それぞれＳＡ及びＳＤ）に隣接している。ＧＦＰは、スプライシングされた転写物においてのみ発現する受容部位の下流にクローンされた。ＰＶＸ及びＣｒＴＭＶにおけるＣＰの生理学的役割は異なっている。ＰＶＸの場合、ＣＰはウイルスの細胞間移動に必要である。ＣｒＴＭＶでは、ＣＰは、主としてウイルスの長距離拡大（植物体全体の感染）に関与し、隣接細胞の感染に必須のものではない。これらの例は、リポーター遺伝子（ＧＦＰ）発現の２種のパターンを提供している。ＰＶＸに基づくシステムの場合、ウイルスの広がりは、必要な量のＣＰがスプライシングされていないＲＮＡから生成した効率の低いレプリコンから発現するまで、トランスフェクトされた初代細胞に留められる。これが、同じ細胞内ではるかに速やかに合成されるＧＦＰの超生産をもたらす。最終的に、必要な量のＣＰが蓄積され、両レプリコンが隣接細胞に浸透し、そこでこの過程が繰り返される。これに反して、ＣｒＴＭＶに基づくプロベクターの場合、ウイルスの広がりは細胞間移動に限定されない。両ベクターが独立して作用し、それにより感染部位のより速やかな増大がもたらされる。

本発明によりレプリコンを進化させる機構としてのＲＮＡ修飾を記述する特定の例はＲＮＡスプライシングに基づいているが、他のＲＮＡ修飾機構も本発明の方法に用いることができる。これは、とりわけＲＮＡ連結反応又はＲＮＡ組換えのような修飾を含む。ＲＮＡリガーゼのような酵素による異なるＲＮＡ分子の連結反応は、植物細胞の内部酵素活性に基づく、あるいは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（ニシガキら（Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．）、１９９８年、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．、第４巻、１８７〜１９０ページ）又はＬｅｉｓｈｍａｎｉａからのＲＮＡリガーゼ（ブランクら（Ｂｌａｎｃ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７４巻、２４２８９〜２４２９６ページ）のようなよく知られているリガーゼの発現に基づく細胞内の多数の異なるＲＮＡレプリコンを生産することを可能にする。ＲＮＡ−ＲＮＡ組換えは、十分に研究されている現象である。これは、植物宿主内で特定の程度の相同性を有するウイルスＲＮＡ分子間で容易に起こる（アリソンら（Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８７巻、１８２０〜１８２４ページ、ラオら（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第７１巻、１４０３〜１４０７ページ、米国特許第５，８７７，４０１号）。

他の実施形態において、ベクター前駆体を部位特異的ＤＮＡ組換えにより処理して、ｉｎ ｖｉｖｏでレプリコン又は部分的に異なるレプリコンを生成させるか、１つのレプリコンを集合させる。この場合、分子の再配列がＤＮＡレベルで進行する。いくつかの分子（プロベクター）が組換えにより組み換えられて、１つ又はいくつかのベクター分子（レプリコン）が生ずる。システムの第１のＤＮＡ成分は、ＣｒＴＭＶゲノムの主な部分、すなわちポリメラーゼ遺伝子＋ＭＰ遺伝子と、続いて特異的組換え部位に融合された植物プロモーター（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ａｃｔｉｎ ２）を含むことがある。第２の成分は、同じ組換え部位と、続いて対象とする遺伝子（いずれかのリポーター遺伝子）又はウイルスＣＰ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡｓである。ＣｒＴＭＶの３’−ＵＴＲは、対象とする遺伝子の下流にクローンすべきである。システムの最後の成分は、Ｃｒｅレコンビナーゼ又はインテグラーゼ発現ＤＮＡである。これらの酵素は、プロベクター成分の活性ベクター分子（レプリコン）への再構成を促進する。いずれのプロベクター成分も、システムの生物学的安全性の点で重要である、感染性でないことを強調しなければならない。

述べた多成分システムのすべての成分を植物細胞に供給した後に、組換えが起こり、１つ又はいくつかのレプリコンを生成させることが可能である（図８のＡ、Ｂ、Ｃを参照）。これらの再配列されたＤＮＡ分子は、核内で転写させ（それらがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ａｃｔｉｎ ２プロモーターを運ぶため）、細胞質に輸出させることが可能である。最後に、ＲＮＡスプライシングの場合と同様に、いくつかの複製ベクターＲＮＡｓがトランスフェクションされた細胞の細胞質に出現する。この実施形態において、我々は、機能ＭＰ遺伝子と下流に位置する遺伝子を含むシステムを記述する。これは、各ベクターＲＮＡが機能ＭＰ遺伝子と下流に位置する遺伝子を発現させ、隣接する細胞内に浸透することを可能にする。他の組合せも可能であり、本発明の範囲内にあると考えられることを述べなければならない。

本発明においてリコンビナーゼの供給の２種のアプローチを例示する。リコンビナーゼは、共衝撃の方法又はシステムの他のＤＮＡ成分とともにアグロバクテリウム媒介の一時的発現により、細胞に送り込むことができる。他のアプローチとして、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現する形質転換した植物が得られた。これにより、細胞に供給しなければならない成分の数が低減し、その結果、システムの総合的効率が上昇する。さらに、それが方法を支持するために遺伝的に操作された植物の外部では起こり得ないので、これにより方法の安全性がさらに改善される。

プロベクター成分のクローニング中に、ＬｏｘＰ組換え部位が対象とする遺伝子の上流にクローンされた。ＬｏｘＰ部位は、いくつかのヌクレオチドにより隔てられた２つの小逆方向反復配列を含み、ステムループ構造をなしている。ステムは、４ＧＣ対のみを含み、そのためあまり安定でない。しかし、このステムは、下流遺伝子の翻訳の効率を低下させる可能性がある。この問題を解決するために、ＬｏｘＰと対象とする遺伝子との間に翻訳エンハンサーをクローンすることが可能である。Ｃｒｅレコンビナーゼに関する実施例において、我々はＴＭＶ Ｕ１のオメガリーダーを用いた。しかし、他のいずれかの翻訳促進配列（例えば、ＣｒＴＭＶ又はＴＭＶ Ｕ１からのＩＲＥＳ_ｍｐ７５）ならびにＩＲＥＳｅｓを用いることが可能である。ＩＲＥＳ_ｍｐ７５エレメントは、ファージＰｈｉＣ３１のインテグラーゼに関する実施例と同様に、翻訳エンハンサーとして用いることが好ましいと思われる。この場合、一連のプロベクターにおいてＬｏｘＰ組換え部位が、組換え酵素インテグラーゼの標的配列であるストレプトミセスファージＰｈｉＣ３１からのａｔｔ部位（付着部位）（ソープ及びスミス（Ｔｈｏｒｐｅ ＆ Ｓｍｉｔｈ）、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９５巻、５５０５〜５５１０ページ、グロスら（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９７巻、５９９５〜６０００ページ）により置換された。２種のａｔｔ部位がプロベクターにクローンされた。すなわち、ａｔｔＰが基準ポリメラーゼ−ＭＰ−ＬｏｘＰのベクターに挿入されたのに対して、ａｔｔＢ組換え部位は、対象とする遺伝子と続く３’ＮＴＲ及びｎｏｓ−ターミネーターを運ぶプロベクターにクローンされた。Ｃｒｅシステムと同様に、ａｔｔ組換え部位は、下流に位置する遺伝子の翻訳の効率を制限する。したがって、このシステムにおいても翻訳エンハンサー配列がａｔｔＢ部位と対象とする遺伝子との間にクローンされた。ＩＲＥＳ_ｍｐ７５配列は、ＴＭＶ Ｕ１のオメガリーダーと比較して、翻訳エンハンサーとして同等又は良好な作用を有することが示された。

適切なレコンビナーゼ／組換え部位システムはとりわけ、バクテリオファージＰ１からのＣｒｅ−Ｌｏｘ（オースチンら（Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．）、１９８１年、Ｃｅｌｌ、第２５巻、７２９〜７３６ページ）、サッカロミセスセレビシエからのＦｌｐ−Ｆｒｔシステム（ブローチら（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．）、１９８２年、Ｃｅｌｌ、第２９巻、２２７〜２３４ページ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉからのＲ−Ｒｓシステム（アラキら（Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．）、１９８５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１８２巻、１９１〜２０３ページ）、ストレプトミセスファージＰｈｉＣ３１からのインテグラーゼ（ソープ及びスミス（Ｔｈｏｒｐｅ ＆ Ｓｍｉｔｈ）、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９５巻、５５０５〜５５１０ページ、グロスら（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９７巻、５９９５〜６０００ページ）及びリゾルベースなどである。さらに、ＤＮＡ再配列の他の方法は、本発明の範囲内であると考えられる。制限エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、一般的又は特異的リコンビナーゼ等の他のＤＮＡ修飾酵素系をすべて用いて、関連性があるが、機能的に異なるレプリコンを野生型又は遺伝子工学的に処理した植物細胞の内部に進化させることができる。

植物細胞にベクター前駆体を供給するために異なる方法を用いることができる。ＤＮＡを、アグロバクテリウムにより運ばれるＴｉプラスミドベクター（米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許第４，９４０，８３８号、米国特許第５，４６４，７６３号）若しくは粒子又は微粒子銃（米国特許第０５１００７９２号、欧州特許第００４４４８８２Ｂ１号、欧州特許第００４３４６１６Ｂ１号）により植物細胞内に導入して形質転換することができる。マイクロインジェクション（国際出願第０９２０９６９６号、国際出願第０９４００５８３Ａ１号、欧州特許第１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポレーション（欧州特許第００５６４５９５Ｂ１号、欧州特許第００２９０３９５Ｂ１号、国際出願第０８７０６６１４Ａ１号）又はプロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換のような他の植物形質転換法も用いることができる。形質転換法の選択は、形質転換する植物種による。例えば、微粒子銃は一般的に単子葉植物の形質転換に好ましく、一方、双子葉植物については、アグロバクテリウム媒介形質転換が一般的により良好な結果をもたらす。ベクター前駆体のアグロバクテリウム媒介送達が好ましい。

植物における非ウイルス遺伝子の発現のための植物ウイルスベクターの構成は、数報の論文に記載されており（ドーソンら（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９８９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１７２巻、２８５〜２９３ページ、ブリッソンら（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、１９８６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１１８巻、６５９ページ、マクファーレン及びポポビッチ（ＭａｃＦａｒｌａｎｅ ＆ Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）、２０００年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２６７巻、２９〜３５ページ、ゴピナスら（Ｇｏｐｉｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２６７巻、１５９〜１７３ページ、ボイネットら（Ｖｏｉｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．）、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、第９６巻、１４１４７〜１４１５２ページ）、当業者が容易に実施することが可能である。

本発明は、植物における外来遺伝子を発現させるためのウイルスを用いる既存の戦略と比べて多くの利点を有する。

非常に重要なことに、方法は、対象とする複数のヌクレオチド配列の発現に用いることができ、したがって、生化学的経路又はカスケードの同義遺伝子の発現に用いることができる。この点に関しては、本発明の方法は、遺伝子機能の確定の目的のため又は生化学的生産の目的のための遺伝子の発現に効果的に使用することが可能な唯一の利用可能な方法である。

本発明は、あらゆる種類の生物学的カスケードの構築の広範囲の機会も開く。１つの例を図１３に示す。このシステムは、３ベクター前駆体成分の２レプリコンへの組換えを用いる。第１に、レプリコンＡはＭＰ及び対象とする遺伝子（例ではＧＦＰ）を発現させる。移動タンパク質（ＭＰ）の発現により、このベクターは接種された葉における細胞間を移動することができる。しかし、これは、感染植物の植物体全体に広がることはできず、コートタンパク質（ＣＰ）が存在しないため、他の植物に伝達されることはあり得ない。言い換えれば、このレプリコンは、人工的に植物細胞内に送達される場合にのみ、感染性である。第２のレプリコンはＣＰのみを発現させる。そのＲＮＡがウイルス集合の源（ＭＰ遺伝子内にある）を欠くため、それはウイルス粒子を形成することができないことを注意すること。しかし、それは有意な量でＣＰを発現させない。

提案する方法は、すべてのベクター前駆体が存在する場合にのみ作動可能であるので、本質的により安全である。上記のレプリコンの両方が同じ細胞内に存在する場合、それらは互いに補い合って、両成分が隣接する細胞に移動することができる。しかし、ベクターＡのみがＣＰでコートされて、ウイルスを形成することができ、したがって、この成分のみが感染した葉から植物全体に輸出される。そのようなウイルス粒子が未感染の葉に浸透する場合、感染性成分Ａのみを排出するが、Ｂは排出しない。これは、感染の植物全体への広がりをもたらすが、ウイルスは他の植物に感染することができない。その理由は、ウイルス粒子は接種された最初の葉においてのみ形成される可能性があり、これらの粒子は他の植物の全体にわたる感染に十分でない１つのレプリコン成分のみを含むからである。このシステムは、非感染性ウイルスベクターを介しての植物全体におけるトランス遺伝子の高度に効率のよい発現の独特な例を提示する。

さらに、部位特異的ＤＮＡ組換えによる少なくとも２つのレプリコン前駆体からの１つのウイルスレプリコンの集合の方法は、植物細胞を感染させるのに用いられている従来のウイルスベクターと比較して高いレベルの安全性を保証する。少なくとも２つの成分からのウイルスレプリコンの集合の前記方法は、同じ植物細胞内に存在すべき前記２つの成分と部位特異的レコンビナーゼの存在を必要とする。前記レコンビナーゼは、前記成分の１つとともにシスで送達することができる。レコンビナーゼを別個に送達することができることが好ましい。前記レコンビナーゼを発現させるように宿主植物を遺伝子工学により改良できることがより好ましい。後者の場合、プロベクターエレメントからの機能ベクターの集合は、遺伝子工学により改良した宿主植物に特異的に制限されるであろう。

記述した技術は、従来のシステムと比較して高い効率の遺伝子発現を可能にする。これは、遺伝子を発現するレプリコンの大きさを減少させることにより達成される。我々のシステムでは、ベクター前駆体がシステムの機能に必要なウイルス遺伝子を別の成分又はベクター（レプリコン）からトランスで発現させる余裕があるので、その大きさは他のウイルスベクターと比較して有意に少ない。上記のように、ウイルスＲＮＡはトランス遺伝子発現のレベルに劇的に影響しない。

当システムの他の技術的利点は、その使用者が何かをウイルスの全長ｃＤＮＡコピーにクローンする必要がないことである。プロモーター、ウイルスレプリカーゼ遺伝子及び（場合によっては）移動タンパク質遺伝子を含むあらかじめ調製した構成体（ｐＩＣ３４６１と類似した、図９）を使用することが可能であるため、この困難かつ時間のかかる方法を避けることができる。この構成体は、応用のためのさらなる修飾を必要としない。使用者が行わなければならない唯一のクローニングは、対象とする遺伝子を、何らかの種類の高コピープラスミドにおけるいくつかの別の小配列（組換え部位、ウイルスの３’−ＵＴＲ及び転写ターミネーターシグナル（全サイズが１ｋｂ未満））と融合させることである。この利点は、産物が細菌に対して有毒で、クローニング中に特別な取扱いを必要とする遺伝子並びに高処理能力の方法の場合に特に重要である。

スプライシング可能なＰＶＸ起源のベクターの構成
３５−ＰＶＸ起源の２つのベクターを構成した。プラスミドＰＶＸ−２０１をクローニングの基本構成体として用いた（チャップマン エスら（Ｃｈａｐｍａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｌａｎｔ Ｊ １９９２年７月、第２巻４号、５４９〜５７ページ）。このプラスミドは、３５Ｓプロモーター及びｎｏｓターミネーターに融合させたジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）ゲノムの全長ｃＤＮＡ（遺伝子バンク受入れ番号ＮＣ ００１４５５、ＡＦ１７２２５９）を含む。ＣＰサブゲノムプロモーター領域が重複しており、いくつかのクローニング部位がＰＶＸ−２０１における重複した領域の間に挿入されている（図３を参照）。

第１段階において、中間構成体ｐＩＣ２５１８が得られた。したがって、このプラスミドは、ＸｈｏＩから終結コドンの直後に導入されたＨｉｎｄＩＩＩ部位を伴うターミネーターまでのＣＰのＣ末端（６２ｂｐ）、増強ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子（ＮｃｏＩ部位に含められている開始コドン）及びＣＰのＣ末端を含むＰＶＸの３’末端（６２ｎｔ）、３’−ＵＴＲ及びＳａｃＩ部位が後続するｓポリ（Ａ）配列を含む（図３）。

供与／受容スプライシング部位の２種の対をクローンするために、以下の２組のオリゴヌクレオチドを合成した。

互いにアニーリングした後、対応するオリゴヌクレオチドが以下の２本鎖ＤＮＡ断片を形成する。

Ｄ１及びＤ２の場合、５’突出端がＣＩａＩ／ＳａＩＩ制限ＤＮＡに付着する。断片Ａ１及び断片Ａ２は、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｃｏＩ部位に連結反応させることができる。

上記（図３）のプラスミドＰＶＸ−２０１をＣｌａＩ及びＳａｌＩで消化した。次いで、Ｄ１又はＤ２断片を消化したベクターに結合させて、構成体ｐＩＣ３０３３（Ｄ１の場合）又はｐＩＣ３０５３（Ｄ２の場合）を得た。

プラスミドｐＩＣ２５１８（図３）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化した。断片Ａ１又はＡ２の連結反応により、それぞれ構成体ｐＩＣ３０４１（Ａ１）又はｐＩＣ３０６８（Ａ２）を得た。

スプライシング可能なＰＶＸプロベクタープラスミドの２つの変異体を、ｐＩＣ３０４１からのＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片のｐＩＣ３０３３への、ｐＩＣ３０６８からのＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片のｐＩＣ３０５３へのクローニングにより得た。得られたプラスミドをｐＩＣ３２４２（スプライス部位Ｄ１＋Ａ１）及びｐＩＣ３２５８（スプライス部位Ｄ２＋Ａ２）と名付けた（図２）。

微粒子銃（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達系（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を用いて微粒子銃を実施した。マクロキャリア発射点から停止スクリーンまでの距離を１５ｍｍ、停止スクリーンから標的組織までの距離を６０ｍｍとして、別個のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に６３．３ｋｇ／ｃｍ^２（９００ｐｓｉ）で衝撃を与えた。破裂板とマクロキャリアの発射点との間の距離は１２ｍｍであった。浸透前処理の４時間後に細胞をボンバードした。

ＤＮＡの金コーティング処置（ＰＥＧ／Ｍｇ）を次のように実施した。２５μｌの金懸濁液（５０％グルセロール中６０ｍｇ／ｍｌ）をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ中で１０μｌのプラスミドＤＮＡ（最高１μｇ／μｌ）と混合し、その後、１０μｌの１．０Ｍ ＭｇＣｌ_２中４０％ＰＥＧを加えた。混合物をボルテックス混合機で２分間混合し、次いで、混合せずに室温で３０分間インキュベートした。遠心分離（２０００ｒｐｍ、１分間）の後、ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで２回、１ｍｌの９９．５％エタノールで１回洗浄し、最後に３０μｌの９９．５％エタノールに分散させた。エタノール中ＤＮＡ−金懸濁液の分割量（６μｌ）をマクロキャリアディスクにのせ、５〜１０分間乾燥した。

プラスミドＤＮＡの調製
プラスミドを大腸菌株ＤＨ１０Ｂ及びＪＭ１０９に導入して形質転換し、できるだけ多量の調整物をＬＢ培地中で増殖させ、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キットを用いてＤＮＡを精製した。

植物へのプロベクタープラスミドＤＮＡの機械的接種
５〜７週齢のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の十分に発育した葉に機械的創傷形成によりプラスミドＤＮＡを接種した。この目的のために、１０〜５０μｇのＤＮＡを３×ＧＫＰ緩衝液（５０ｍＭグリシン、３０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、３％セライト、３％ベントナイト）と混合し、葉の上側に緩やかにこすりつけた。

変換した（スプライシングした）ＰＶＸ起源プロベクターによる植物細胞におけるリポーター遺伝子の発現
十分に発育したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉にプラスミドｐＩＣ３２４２及びｐＩＣ３２５８で衝撃を与えた。これらのプラスミド（完全なもの及びスプライシングしたもの）（図２を参照）のそれぞれから２種のＲＮＡ転写物を合成することが可能であると予想された。

第２の転写物の存在は、プロベクターでトランスフェクションした細胞におけるＧＦＰ蛍光により検出することができる。

強いＧＦＰ蛍光がｐＩＣ３２４２の衝撃を受けた多数の葉細胞に認められた（衝撃の４８時間後）。ｐＩＣ３２５８の場合にはＧＦＰ発現は検出されなかった。したがって、この構成体はこの実験における陰性対照とすることができる。この差異は、構成体で用いられている供与／受容部位が異なっているために進化した（実施例１を参照）。ｐＩＣ３２５８の場合、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのスプライス部位共通配列に相当する９−ｎｔ配列を用いた。ｐＩＣ３２４２の場合、供与及び受容部位をヌッサウメら（Ｎｕｓｓａｕｍｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｍｏｌ．ｇｅｎ．ｇｅｎｅｔ、１９９５年、第２４９巻、９１〜１０１ページに記載されているように設計した。それらは、試験され、植物において活性であることが証明された。

数名の研究者ら（フェドーキンら（Ｆｅｄｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ２００１年、第８２巻（Ｐｔ２）、４４９〜５８ページ、クルツら（Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ．）、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １９９８年、第１０巻４号、４９５〜５１０ページ）によれば、ウイルスの細胞間輸送にＰＶＸのＣＰが必要である。ｐＩＣ３２４２の場合、ＣＰ遺伝子をＲＮＡからスプライシングしなければならない。これは、転写物のスプライシングされたもの（図３）はＣＰを発現することができず、ウイルスの細胞間移動をもたらすことを意味する。しかし、ｐＩＣ３２４２に関するいくつかの実験で、ＧＦＰを発現した単一細胞だけなく、多細胞座（１０〜１０００細胞）も検出された。これは、プロベクター転写物のスプライシングは１００％の効率で起こらないことを示している。全長ＲＮＡのうちの小部分はスプライシングされておらず、したがって、ＣＰはこの形態の転写物から発現させることができるが、ＧＦＰ遺伝子はこのＲＮＡ中で発現を抑制されたままである（ｐＩＣ３２５８の場合、ＧＦＰの発現は検出されなかったので）。

Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する形質転換したＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の進化
ｐＩＣ１３２１からのアクチン２プロモーター−ＬｏｘＰ−Ｃｒｅ Ｏｒｆ−Ｎｏｓターミネーター断片をＮｏｔ１ブラント−ＳａｃＩ断片としてバイナリーベクターｐＢＩＮ１９のＳｍａＩ及びＳａｃＩ部位にサブクローンし、構成体ｐＩＣ１５９３（図１４）を得た。

プラスミドｐＩＣ１５９３をアグロバクテリウム株ＡｇＩ１にエレクトロポレーションにより導入し、形質転換したアグロバクテリアを用いてＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａを形質転換した。１０形質転換体から抽出したＤＮＡを用いて、トランス遺伝子の存在の有無についてＰＣＲにより試験した。カナマイシン形質転換マーカー又はＣｒｅ遺伝子のプライマーを用いてＰＣＲを実施したとき、すべての植物が陽性であることが認められた。

部位特異的組換えを用いたプロベクターからの機能ベクターの進化
ａ）システムの一般的説明
記述するシステムは、以下のＬｏｘＰ組換え部位を運ぶ２つのコアタイプのＣｒＴＭＶ起源ベクターからなっている（図８）。
ｉ）ベクタータイプ：ポリメラーゼ−ＭＰ−ＬｏｘＰ：ベクターはＣｒＴＭＶのＲｄＲＰ、及びウイルスを細胞から細胞へと移動させるが、植物体全体に移動させない移動タンパク質（ＭＰ）をコードする。ウイルス転写は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ−Ａｃｔｉｎ２プロモーターにより制御されている。
ｉｉ）ベクタータイプ：ＬｏｘＰ−対象とする遺伝子−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ−ターミネーター（図８ａ〜ｃを参照）：このクラスのベクターはリポーター遺伝子（ｓＧＦＰ又はＧＵＳ）及び調節エレメントをコードする（ｎｏｓ：ノパリンシンターゼターミネーター、３’ＮＴＲ：ＣｒＴＭＶの非翻訳領域、シュードノット及びｔＲＮＡ様構造）。コートタンパク質（ＣＰ、図８ｂを参照）の発現はベクターが宿主植物全体に広がることを可能にする。
ｉｉｉ）ベクタータイプ：ポリメラーゼ−ＭＰ−ａｔｔＰ：ｉ）を参照、ａｔｔＰ−組換え部位を含む。
ｉｉｉｉ）ベクタータイプ：ａｔｔＢ−対象とする遺伝子−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ−ターミネーター（図１５ａ〜ｃを参照）：ｉｉ）を参照、ａｔｔＢ−組換え部位を含む。

Ｃｒｅレコンビナーゼ又はインテグラーゼにより触媒される組換え（Ｃｒｅ又はインテグラーゼをコードするウイルス構成体の同時感染による）の後に、リポーター遺伝子を効率よく発現することができ、細胞間（図８Ａ〜Ｃ、図１５Ａ〜Ｃ）又は植物体全体（図８Ｂ）にわたり移動することができる機能ユニット（レプリコン）が形成される。

ｂ）プラスミドの構成
Ａ．ベクタータイプポリメラーゼ−ＭＰ−ＬｏｘＰのクローニング（図９）
ＭＰのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩの断片をプラスミドｐＩＣ３３１２から取り（図５）、反対の配向の２つのＬｏｘＰ部位を運ぶプラスミドｐＩＣ１２１２にクローンした。プラスミドｐＩＣ３３４２のＭＰ遺伝子は、自然停止の前に２５ＡＡを導入された終止コドンを含む。得られた産物ｐＩＣ３４３１において、ＭＰ遺伝子の一部を含む断片がＬｏｘＰ部位の次に位置している。両エレメントは、ＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ制限により分離される。ＳａｃＩ制限部位を平滑化した後、断片を、ＭＰ遺伝子における単一ＥｃｏＲＩ制限部位を含むプラスミドｐＩＣ３３０１のベクター含有部分にクローンした。ＮｏｔＩ（平滑化した）を第２の制限部位として選択した。得られる連結反応産物（ｐＩＣ３４６１）においては、ＣＰ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、ｓＧＦＰの遺伝子及びｐＩＣ３３０１の３’非翻訳領域がＬｏｘＰによって置換されている（図９）。

Ｂ．ＬｏｘＰ−リポーター遺伝子−ｎｏｓ−ターミネーターベクターのクローニング
ａ）構成体ＬｏｘＰ−ｓＧＦＰ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ（図８ａ）
Ωリーダー配列に隣接するＬｏｘＰ部位を運ぶＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ断片をベクターｐＩＣ２７４４から取った。配列をリポーター遺伝子に隣接させるために、断片を、ｓＧＦＰの遺伝子及び３’ＮＴＲ配列に隣接する適切な制限部位を含むプラスミドｐＩＣ１７２１にクローンした。ＩＲＥＳ配列を断片で置換することにより、プラスミドｐＩＣ３４２１が得られる。ｎｏｓターミネーター配列を加えるために、プラスミドｐＩＣ３４２１をＫｐｎＩ及びＮｏｔＩで切断した。断片を、プラスミドｐＩＣ３２３２のベクター含有部分に導入して、最終構成体ｐＩＣ３４４１を得ることができた（図１０及び８ａを参照）。

ｂ）構成体ＬｏｘＰ−ＣＰ−ｓＧＦＰ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ（図８ｂ）
上述のプラスミドｐＩＣ３３４２及びｐＩＣ１２１２を開始ベクターとして用いた。ＣＰ及びｓＧＦＰの遺伝子を含むｐＩＣ３３４２のＰｓｔＩ−ＳａｃＩ断片をｐＩＣ１２１２にクローンした。その結果、ＬｏｘＰ部位が、産物ｐＩＣ３４５１におけるＣＰ及びｓＧＦＰに隣接して位置している。ｎｏｓターミネーター配列を加えるために、ａ）の場合と同様なアプローチを用いた。すなわち、ｐＩＣ３４５１のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＩＣ３２３２のベクター含有部分に導入して、プラスミドｐＩＣ３４９１を得た（図１１を参照）。

ｃ）構成体ＬｏｘＰ−ＣＰ−ＧＵＳ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ（図８ｃ）
プラスミドｐＩＣ７５１は、ｐＩＣ１７２１に類似しており、ｓＧＦＰの代わりにＧＵＳリポーター遺伝子を運ぶ。ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、ＧＵＳ遺伝子及び３’非翻訳領域をｐＩＣ３４４１に直接クローンして、最終構成体ｐＩＣ３５２１を得ることができる（図１２）。

変換（組換え）ＣｒＴＭＶ起源プロベクターによる植物葉における単一リポーター遺伝子の発現
別個のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に、ｐＩＣ３４４１（ＬｏｘＰ−ＧＦＰ、図１０）、ｐＩＣ３４６１（アクチン２プロモーター−ＣｒＴＭＶ ＲｄＲｐ−ＭＰ−ＬｏｘＰ、図９）及びｐＩＣ２７２１（ｈｂｔプロモーターの制御下のＣｒｅ−レコンビナーゼ）の３種のプラスミド混合物で粒子衝撃を加えた。衝撃の３８時間後にＧＦＰ蛍光がいくつかの多細胞座に検出された。蛍光及び感染領域の大きさの著しい増加が翌日認められた（湿潤ろ紙上２５℃でインキュベートした衝撃済みの葉）。ｐＩＣ３４６１を用いず、ｐＩＣ３４４１とｐＩＣ２７２１で衝撃を加えた対照葉では、ＧＦＰ蛍光は検出されなかった。

変換（組換え）ＣｒＴＭＶ起源プロベクターによる植物葉におけるいくつかの遺伝子の発現
別個のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに、以下のいくつかのプラスミドの混合物で粒子衝撃を加えた。
ａ）ｐＩＣ３４４１（ＬｏｘＰ−ＧＦＰ、図１０）、ｐＩＣ３４６１（アクチン２プロモーター−ＣｒＴＭＶ ＲｄＲｐ−ＭＰ−ＬｏｘＰ、図９）及びｐＩＣ２７２１（ｈｂｔプロモーターの制御下のＣｒｅ−レコンビナーゼ）、ｐＩＣ３５２１（ＬｏｘＰ−ＧＵＳ、図１２）。
ｂ）ｐＩＣ３４４１（ＬｏｘＰ−ＧＦＰ、図１０）、ｐＩＣ３４６１（アクチン２プロモーター−ＣｒＴＭＶ ＲｄＲｐ−ＭＰ−ＬｏｘＰ、図９）及びｐＩＣ２７２１（ｈｂｔプロモーターの制御下のＣｒｅ−レコンビナーゼ）、ｐＩＣ３４９１（ＬｏｘＰ−ＣＰ、図１１）。

ａ）の場合、両リポーター遺伝子ＧＦＰ及びＧＵＳが衝撃済みの葉で強く発現した。ｂ）の場合、ウイルス粒子形成とウイルスの植物体全体にわたる移動が起こる。

スプライシング可能なＣｒＴＭＶ起源プロベクターの構成
ＣｒＴＭＶウイルスに基づくスプライシング可能なプロベクターは、ＰＶＸ起源のものと比べて確かな利点を有する。図４に示すシステムは、感染した葉において十分に機能できるウイルスのリポーター遺伝子発現システムを創製することを可能にする。ＰＶＸと異なり、ＣｒＴＭＶのコートタンパク質はウイルスの細胞間移動に必要でなく、したがって、スプライシングは感染した葉におけるウイルスの広がりに影響を及ぼさない。

Ａ．中間構成体ｐＩＣ３３１２のクローニング
ＣｒＴＭＶのクローン化ｃＤＮＡ及び以下のプライマーを用いてＰＣＲ断片を得た。
ＭＰＥＲＩ＋（ＥｃｏＲＩ部位を含むＭＰの中間領域に対応する−ＣｒＴＭＶゲノムにおける位置５４５５）：ＧＴＧＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣ
ＭＰ−（下流ＣｌａＩ及びＸｈｏＩ部位を含む人工ターミネーターを導入する自然終止コドンの上流のＭＰ１７ａａのＣ末端と相補的。また、このプライマーは、ＭＰにおけるアミノ酸の変化を伴わない、ＣＰ遺伝子の自然の開始を除くＣＰ ＡＴＧのＡＣＧへの点突然変異も含む）：ＧＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＧＡＴＴＡＴＴＣＧＧＧ−ＴＴＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＡＣＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣ

同じ鋳型と以下のプライマーを用いて、他のＰＣＲ断片を得た。
ＣＰ＋（ＡＴＧの上流に導入されたＸｈｏＩ及びＰｓｔＩを含むＣＰ遺伝子の始まりに対応する）：ＴＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＡＣＣ−ＣＧＡＡＴＣＡＧ
ＣＰ−（ＣＰ遺伝子におけるＮｃｏＩ部位を除去するための単一ヌクレオチド置換を導入するＣＰのＣ末端と相補的。また、このプライマーはＣＰ遺伝子の下流にＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩも導入する）：ＣＴＡＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＧＴＡＧＣ−ＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＧＣＡＣＣ

第１に、ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ酵素で消化した。第２に、ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ消化断片を一緒にＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ部位によりベクターｐＩＣ１７２１（図５）に結合させて、プラスミドｐＩＣ３１５１（図５）を得た。次いで、ｐＩＣ３１５１をＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶで消化し、ＫｐｎＩ部位をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、カットされたプラスミドを自己連結させて、ＫｐｎＩとＥｃｏＲＶとの間の部位を除去した。得られたプラスミドをｐＩＣ３３１２と名付けた（図５を参照）。

Ｂ．スプライシング可能なプロベクターｐＩＣ３３９３及び対照構成体ｐＩＣ３４０１のクローニング
供与及び受容スプライス部位を含む実施例１で述べたｄｓＤＮＡ断片を、供与スプライス部位の場合にはＣｌａＩ及びＸｈｏＩを、受容スプライス部位の場合にはＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩを用いて、ｐＩＣ３３１２にクローンした（図６を参照）。得られたプラスミドをｐＩＣ３３７８（供与部位）及びｐＩＣ３３８２（受容部位）と名付けた。

ネガティブ対照構成体ｐＩＣ３４０１を得るために、ｐＩＣ３３８２からのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＩＣ３３０１にクローンした（図７）。

最終構成体ｐＩＣ３３９３は、ｐＩＣ３３７８からのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片とｐＩＣ３３８２からのＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片並びにベクターとしてのＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化したｐＩＣ３３０１を用いた２断片クローニングにより得た（図７）。

変換ＣｒＴＭＶ起源のスプライシング可能なプロベクターによる植物葉におけるリポーター遺伝子の発現
別個のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉に、ｐＩＣ３３９３及びｐＩＣ３４０１で粒子衝撃を加えた。ｐＩＣ３３９３の場合、衝撃の４８時間後にＧＦＰ蛍光がいくつかの多細胞座に検出された。対照構成体ｐＩＣ３４０１で衝撃を加えた葉では、ＧＦＰ蛍光は認められなかった。

部位特異的ａｔｔ／インテグラーゼに基づく組換えシステムによる２ＣｒＴＭＶ起源プロベクターから集合させたウイルスベクターからの対象とする１つの遺伝子の発現
ａ）システムの一般的説明
記述するシステムは、以下のａｔｔＢ又はａｔｔＰ組換え部位を運ぶ２つのコアタイプのＣｒＴＭＶ起源ベクターからなっている（図１５）。
ｉ）ベクタータイプ：ポリメラーゼ−ＭＰ−ａｔｔＰ：ベクターはＣｒＴＭＶのＲｄＲｐ、及びウイルスを細胞から細胞へと移動させるが、植物体全体に移動させない移動タンパク質（ＭＰ）をコードする。ウイルス転写は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ−Ａｃｔｉｎ２プロモーターにより制御されている。
ｉｉ）ベクタータイプ：ａｔｔＢ−対象とする遺伝子−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ−ターミネーター（図１５ａ〜ｂ）：このクラスのベクターはレポーター遺伝子（ｓＧＦＰ又はＧＵＳ）及び調節要素をコードする（ｎｏｓ：ノパリンシンターゼターミネーター、３’ＮＴＲ：ＣｒＴＭＶの非翻訳領域、シュードノット及びｔＲＮＡ様構造）。
ｉｉｉ）ベクタータイプ：ａｔｔＢ−ユビキチン−対象とする遺伝子−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ−ターミネーター（図１５ｃ）：植物から分離することができる定義されているタンパク質を得るために、ユビキチン切断シグナル配列をａｔｔＢ組換え部位と下流に位置する対象とする遺伝子（例えば、ＧＦＰ、インターフェロンａ２Ｂ、インスリン又はソマトトロピン）との間に導入した。このシステムを用いて、プロリンを除くあらゆるアミノ酸を合成されるアミノ酸の最初のアミノ酸として選択することが可能である。

インテグラーゼ酵素により触媒される組換え（インテグラーゼをコードするウイルス構成体の同時感染による）の後に、対象とする遺伝子を効率よく発現することができ、細胞間移動することができる機能ユニット（レプリコン）が形成される（図８Ａ〜Ｃ）。

ｂ）プラスミドの構成
Ａ）ベクタータイプ：ポリメラーゼ−ＭＰ−ａｔｔＰのクローニング（図１６）
ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片をプラスミドｐＩＣ３４６１から取った（図１６）。ＸｈｏＩ制限部位を平滑化した後、断片を、直進配向の２つのａｔｔＢ部位、左右のＴ−ＤＮＡボーダー（ＬＢ及びＲＢ）及び植物形質転換のマーカーとしてのカナマイシン発現カセットを運ぶバイナリーベクターｐＩＣ３９９４にクローンした。Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステムからの類似のクローンと同様に、得られたプラスミドｐＩＣ４８５１は、自然停止の前に２５ＡＡを導入された終止コドンを含むＭＰを運ぶ。

Ｂ．ベクタータイプ：ａｔｔＢ−対象とする遺伝子−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ−ターミネーターのクローニング（図１７〜２０）
ａ）構成体ａｔｔＢ−ｓＧＦＰ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ
プライマーの組合せＡ）
ａｔｔＢ Ｘｈｏ（＋）：ＡＴＣＡＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＴ：ａｔｔＢの５’部分と相補的で、５’末端におけるＸｈｏＩ制限部位を運ぶ。
ａｔｔＢ Ω（−）：ＧＧＴＡＡＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＣＧＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＧ：プライマーの３’部分はａｔｔＢ配列の３’領域に対応し、５’部分はΩ要素の５’部分と相補性を有する２０ヌクレオチドを含む。

完全なａｔｔＢ配列、２０ＮｔのΩリーダー配列及び５’末端におけるＸｈｏＩ制限部位からなるＰＣＲ産物を作るために、ａｔｔＢを含む鋳型に対してプライマーの組合せＡを用いた。

プライマーの組合せＢ）
ａｔｔＢ Ω（＋）：ＣＧＴＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣ：プライマーの３’部分はΩ配列の５’領域に対応し、５’部分はａｔｔＢ要素の５’部分と相補性を有する２０ヌクレオチドを含む。
Ω ＮｃｏＩ（−）：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＡＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＧＴＴ：Ωの３’部分に相同的で、５’末端におけるＮｃｏＩ制限部位を運ぶ。

Ωリーダーの完全な配列、２０ＮｔのａｔｔＢ組換え部位及び３’末端におけるＮｃｏＩ制限部位を含むＰＣＲ産物を作るために、Ω配列を含む鋳型に対してプライマーの組合せＢを用いた。

プライマーの組合せＡ）及びＢ）よるＰＣＲ産物を得た後、分離されたオリゴヌクレオチドをともに、プライマーａｔｔＢ ＸｈｏＩ（＋）及びΩ ＮｃｏＩ（−）を用いるＰＣＲ反応の鋳型として用いた。最終ＰＣＲ産物として、ａｔｔＢ組換え及びΩリーダー配列の融合体を合成することができた。この断片は、その末端にＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ制限部位を含む。ＬｏｘＰ−Ω融合体を置換するために、ＰＣＲ産物を分離し、消化し、プラスミドｐＩＣ３４４１のＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ部位にクローンした。中間プラスミドをＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理した。この断片をバイナリーベクターＢＶ１０の対応する部位に挿入することにより、アグロバクテリウムに形質転換可能であるａｔｔＢ−ｓＧＦＰ−３’ＮＴＲ−ｎｏｓベクターを得ることができた（ｐＩＣＨ５１５１、図１７を参照）。

リポーター遺伝子ＧＵＳを含む類似のベクターのクローニングに同様な手法を用いた。上記のＰＣＲ断片を、ＧＵＳを含むプラスミドｐＩＣＨ３５２１のＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ部位にクローンして、プラスミドｐＩＣＨ４０６１を得た。最後に、プラスミドｐＩＣＨ４０６１のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をバイナリーベクターＢＶ１０に連結させて、安定なアグロバクテリウム形質転換が可能な最終ベクターｐＩＣＨ５１６１を得た（ｐＩＣＨ５１６１、図１８を参照）。

Ｃ）ａｔｔＢ−ユビキチン−インターフェロンを含む３’−プロベクターの構成
ユビキチン配列とインターフェロンα２Ｂとの融合体をａｔｔＢ−３’−プロベクターにクローンするために、両配列を融合体として合成し、ｐＵＣ１９にクローンした（プラスミドｐＵＣ５７６０を得る）。ベクターをＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化し、プラスミドｐＩＣＨ５７８１の対応する制限部位に連結させた。得られたプラスミドｐＩＣＨ５９５１は、ａｔｔＢ組換え部位、ユビキチン−インターフェロン融合、３’非翻訳領域、ｎｏｓプロモーター及びカナマイシン発現カセットを含む。前記の全配列にはＴ−ＤＮＡボーダー（ＬＢ及びＲＢ、図１９を参照）が両端に隣接する。

Ｄ）Ω配列を、翻訳エンハンサーとしての役割を果たし得る種々のＩＲＥＳ要素で置換するために、ＣｌａＩ／ＡｐａＩ断片をそれぞれプラスミドｐＩＣ１７０１（ＩＲＥＳ_ｍｐ７５（Ｕ１）を含む）又はｐＩＣＨ１７３１（ＩＲＥＳ_ｍｐ７５（ｃｒ）を含む）から取った。断片をプラスミドｐＩＣＨ５９３９（プラスミドｐＩＣＨ５７８１と類似しているが、転写開始コドンとしてのＡＴＧ配列を含むＮｃｏＩ制限部位を含まない）にクローンした。最終バイナリーベクター（ｐＩＣＨ６８７１、ｐＩＣＨ６８９１）内では、ａｔｔＢ組換え部位が７５ｂｐのＩＲＥＳ配列（６８７１：Ｕ１起源、６８９１：ＣｒＴＭＶ起源）、ｓＧＦＰリポーター遺伝子並びに調節要素３’ＮＴＲ及びｎｏｓに隣接して位置する。

Ｅ）ベクタータイプポリメラーゼ−ＭＰ−ＬｏｘＰのバイナリーベクターへのクローニング
ポリメラーゼ−ＭＰを運ぶＬｏｘＰプロベクターをバイナリーベクターにクローンするために、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ及びＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片をともに、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩで消化したベクターｐＩＣＢＶ１０に連結させた。得られたプラスミドｐＩＣＨ４３７１は、アグロバクテリウムに安定に形質転換させることが可能である（図２１）。

Ｆ）ベクタータイプＬｏｘＰ−対象とする遺伝子−３’ＮＴＲ−ｎｏｓ−ターミネーターのバイナリーベクターへのクローニング
Ｅ）と同様のクローニング戦略を用いて、ＬｏｘＰリポーター遺伝子ベクターをバイナリーベクターにクローンした。プラスミドｐＩＣＨ３４４１を酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた断片をｐＩＣＢＶ１０の対応する側に挿入して、バイナリープラスミドｐＩＣＨ４４６１を得た（図２２を参照）。

アグロバクテリウムチュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）懸濁液のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及びＮ．ｔａｂａｃｕｍの植物葉への浸透によるウイルスベクターの送達
Ｃｒｅ／Ｌｏｘ及びインテグラーゼ／ａｔｔシステムのすべてのプロベクターを、アグロバクテリアに安定に形質転換させることができるバイナリーベクターにクローンした。したがって、記述した技術の代わりのＤＮＡ送達法が利用可能である。

非常に簡単な送達法は、アグロバクテリア懸濁液の無傷の葉への浸透である。このいわゆるアグロインフィルトレーション（ａｇｒｏｎｉｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、最初に植物における外来遺伝子発現及び遺伝子発現抑制を分析するために開発された（カプリアら（Ｋａｐｌｉａ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１２２巻、１０１〜１０８ページ、シェブら（Ｓｃｈｏｂ ｅｔ ａｌ．）、１９９７年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２５６巻、５８１〜５８８ページ）。形質転換したタバコ植物のアグロインフィルトレーションは、ヤングら（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、２０００年、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、第２２巻６号、５４３〜５５１ページにより記載された修正プロトコールに従って実施した。アグロバクテリウムチュメファシエンス株ＧＶ３１０１を個々の構成体（ｐＩＣＨ４８５１、ｐＩＣＨ５１５１、ｐＩＣＰ１０１０、図２３）で形質転換し、リファンピシン５０ｍｇ／ｌ、カルベンシリン５０ｍｇ／ｌ及び１００μＭアセトシリンゴンを補足したＬＢ培地中２８℃で生育させた。一夜培養のアグロバクテリウム細胞（５ｍｌ）を遠心分離（１０分間、４５００ｇ）により収集し、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４及び１００μＭアセトシリンゴンを補足した１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）緩衝液に懸濁した。細菌懸濁液を０．８の最終ＯＤ_６００に調整した。数種の構成体を送達する場合、浸透の前に異なる構成体のアグロバクテリア懸濁液を混合した。

アグロインフィルトレーションは、完全な植物にまだ付着していたほぼ十分に拡大した葉について実施した。細菌懸濁液を５ｍｌ注射器を用いて浸透させた。１００μｌの細菌懸濁液を各スポット（一般的に浸透部位における３〜４ｃｍ^２）に浸透させることにより、葉脈で隔てられた８〜１６スポットを１枚のタバコ葉に配置することができた。浸透後、植物を２２℃で１６時間の照明の温室条件下でさらに生育させた。

構成体を浸透させたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ及びＮ．ｔａｂａｃｕｍの葉は、浸透８〜１２日後に強いＧＦＰ発現の拡大セクターを示す。発現は、浸透させた葉でＵＶ光のもとで直接検出することができた。対照（インテグラーゼクローンを伴わないプロベクターの組合せ）の場合、ＧＦＰ発現は検出されなかった。

アグロバクテリウムチュメファシエンス懸濁液の、Ｃｒｅレコンビナーゼを発現する形質転換したタバコ植物（ｐＩＣＨ１７５４）の植物葉への浸透によるウイルスベクターの送達
構成体ｐＩＣＨ４３７１及びｐＩＣＨ４４６１を浸透させた、形質転換したタバコ植物（形質転換した構成体：ｐＩＣＨ１７５４、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ種）の葉は、浸透１６日後に完全な植物について顕微鏡を用いずにＵＶ光のもとで観察することができた強いＧＦＰ発現の成長しつつあるセクターを示した。同じアグロバクテリア懸濁液混合物を浸透させた野生型の葉ではＧＦＰ発現は見られなかった。

翻訳エンハンサー配列としてのウイルス起源のＩＲＥＳ配列（ＣｒＴＭＶからのＩＲＥＳｍｐ _７５ 又はＵ１）の使用
プロモーターと下流にある遺伝子との間のａｔｔ及びＬｏｘＰ組換え部位の存在は、翻訳の効率を制限する。したがって、ほとんどの場合、プロベクターシステムにおける適切なレベルのリポーター遺伝子発現を達成するために翻訳促進要素を使用する必要がある。ａｔｔＢ組換え部位とＧＦＰとの間のそれぞれウイルスＩＲＥＳ配列ＩＲＥＳ_ｍｐ７５（Ｕ１）又はＩＲＥＳ_ｍｐ７５（ｃｒ）のクローニングは、明らかにリポーター遺伝子の発現を増大させる。翻訳エンハンサーを運ばないＧＦＰ含有プロベクターを浸透させた植物は１０日後に検出可能なＧＦＰ発現をほとんど示さないのに対して、前記ＩＲＥＳ配列の使用により、５日後に顕微鏡を用いずにＵＶ光のもとで検出することができるＧＦＰの発現がもたらされた。ＩＲＥＳ_ｍｐ７５に基づく翻訳エンハンサー活性によりもたらされる対象とする遺伝子の発現のレベルは、「オメガ」翻訳エンハンサーによりもたらされる発現のレベルと同等又は高い。

植物においてベクター前駆体からレプリコンを生成させる一般的原理を示す図である。 ＰＶＸ起源のベクター前駆体の構造、完全な形の転写物を得るための転写によるその生成及びそのスプライシングを示す図である。 基本的構成体及びＰＶＸ起源のベクター前駆体のｃＤＮＡのクローニングに用いるクローニング戦略を示す図である。 ＣｒＴＭＶ起源のスプライシング可能なベクター前駆体（プロベクター）を用いる２つの遺伝子（ＣＰ及びＧＦＰ）の発現の一般的スキームを示す図である。 中間構成体ｐＩＣ３３４２のクローニング戦略を示す図である。 中間構成体ｐＩＣ３３７８及びｐＩＣ３３８２のクローニング戦略を示す図である。 プラスミドｐＩＣ３３９３のクローニングの最終段階を示す図である。 ＣｒＴＭＶ起源のベクター前駆体（ａ〜ｃ及び上に示すベクター）を介してのいくつかの遺伝子の発現並びにＣｒｅレコンビナーゼ酵素により触媒されるＬｏｘＰ部位における部位特異的組換えによるレプリコン（Ａ〜Ｃ）の生成の一般的スキームを示す図である。 組換えシステムの主要な成分である構成体ｐＩＣ３４６１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣ３４４１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣ３４９１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣ３５２１のクローニングスキームを示す図である。 非感染性ウイルスベクターを介してのトランス遺伝子発現の主要なスキームを示す図である。 Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａのゲノムへのＣｒｅ組換え遺伝子を導入するために用いるプラスミドｐＩＣ１５９３の構造を示す図である。 ＣｒＴＭＶ起源のベクター前駆体（ａ〜ｃ及び上に示すベクター）を介してのいくつかの遺伝子の発現並びに部位特異的組換えのためのインテグラーゼ／ａｔｔシステムを用いるレプリコン（Ａ〜Ｃ）の生成の一般的スキームを示す図である。ベクター前駆体はＴ−ＤＮＡボーダー（ＬＢ及びＲＢ）を有するバイナリーベクターにクローンされる。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣＨ４８５１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣＨ５１５１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣＨ５１６１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣＨ５９５１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の２つである構成体ｐＩＣＨ６８７１及びｐＩＣＨ６８９１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣＨ４３７１のクローニングスキームを示す図である。 組換えシステムの副次的成分の１つである構成体ｐＩＣＨ４４６１のクローニングスキームを示す図である。 ａｔｔプロベクターシステムにインテグラーゼ源として用いたプラスミドｐＩＣＰ１０１０を示す図である。

Claims (24)

1. 植物、植物組織、植物細胞又は細胞培養において、対象とする１つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現をもたらす方法であって、植物細胞に、前記細胞内で少なくとも２つのベクター前駆体間の部位特異的な組換えを受けるように設計されている少なくとも２つのベクター前駆体を供給し、前記部位特異的な組換えにより前記植物細胞が前記増幅及び／又は発現を可能にする少なくとも１つのレプリコンを与えることを特徴とする、当該ベクター前駆体が植物ウイルス起源である上記方法。
2. 植物細胞へのベクター前駆体の前記供給を、ウイルストランスフェクション、アグロバクテリウム媒介送達、非生物学的送達、若しくは１つのベクター前駆体又は複数のベクター前駆体を形成するために植物核ＤＮＡ中にあらかじめ組み込んだベクター前駆体の前駆体ＤＮＡの変換によって行う請求項１に記載の方法。
3. 前記ベクター前駆体がＤＮＡウイルス起源のものである請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記ベクター前駆体がＲＮＡウイルス起源のものである請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記部位特異的組換えが、一次ベクター前駆体（Ａ）と少なくとも２つの二次ベクター前駆体の組（Ｂ_１、Ｂ_２、．．．、Ｂ_ｎ）［ｎは２以上の整数］との部位特異的組換えによるＡＢ_１、ＡＢ_２、．．．、ＡＢ_ｎ型又はＢ_１Ａ、Ｂ_２Ａ、．．．、Ｂ_ｎＡ型の少なくとも２つのレプリコンの組の生成を含む請求項１に記載の方法。
6. 前記植物細胞が野生型である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 植物細胞内の前記スプライシング又は部位特異的組換えに必要な機能を与えるために、前記植物細胞を遺伝子操作された請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
8. レプリコン複製、ウイルス粒子集合、感染力、宿主による発現抑制の抑制、逆転写、宿主染色体への組込み、前記レプリコンの細胞間又は長距離移動若しくは組換え又はスプライシングに必要な１つ又は複数の機能をトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）与えるように、前記植物細胞を遺伝子操作された請求項７記載の方法。
9. 前記植物細胞の前記遺伝子操作を、一時的発現、ウイルス又はアグロバクテリウム媒介トランスフェクション又は前記植物細胞の核若しくは細胞小器官のゲノムへの安定な組込みにより行う請求項７又は８に記載の方法。
10. 少なくとも２つのベクター前駆体分子の前記組換えが、レプリコン内の発現可能な遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ集合をもたらし、それにより、プロモーター、転写エンハンサー、ターミネーター、対象とするタンパク質のコーディング部分、シグナル又は輸送又は膜輸送ペプチドのような異なる機能遺伝子モジュールの結合をもたらし、前記異なる機能遺伝子モジュールが最初に２つ又は複数の前記前駆体分子上にある請求項１に記載の方法。
11. 対象とする２つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現をもたらす請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記方法が、１つの生化学的経路又はカスケードの同義遺伝子の増幅及び／又は発現をもたらす請求項１１記載の方法。
13. １つ又は複数の前記レプリコンが、ウイルス粒子集合、感染力、遺伝子発現抑制の抑制、逆転写、宿主染色体への組込み、細胞間移動又は長距離移動等の付加的なウイルス能力を保持している請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記レプリコンのうちの１つが、他の１つのレプリコン又は複数のレプリコンの複製に必要な条件をトランスで与える野生型ウイルスである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記レプリコンのうちの１つが、他の１つのレプリコン又は複数のレプリコンの複製に必要な機能をトランスで与えるヘルパー型ウイルスである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記レプリコンの１つが、他の１つのレプリコン又は複数のレプリコンの複製、逆転写、宿主染色体への組込みに必要な機能をトランスで与える野生型のレトロウイルス又はレトロトランスポゾンである請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記レプリコンの少なくとも２つが相互に機能的に協同している請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記レプリコンの少なくとも１つがさらに、前記レプリコンを複製するのに必要な産物の発現をもたらす請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記レプリコンの少なくとも１つがさらに、細胞間、長距離又は植物間移動、遺伝子発現抑制の抑制、逆転写、宿主染色体への組込みに必要な産物の発現をもたらす請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記レプリコンの１つが、対象とするタンパク質をコードする異種核酸配列に作動可能なように連結された翻訳エンハンサーとしてのＩＲＥＳ_ｍｐ７５を含む請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 植物細胞に、前記細胞内でスプライシング又は部位特異的組換えを受けるように設計されている少なくとも２つのベクター前駆体を供給する請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の対象とする１つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現を含む、生化学的産物を生産する方法。
23. 生化学的産物がタンパク質である請求項２２記載の方法。
24. 請求項１〜２１のいずれか一項に記載の対象とする１つ又は複数の核酸配列の増幅及び／又は発現を含む、遺伝子の機能を確定する方法。

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