DE10143205A1

DE10143205A1 - Verfahren zur Proteinproduktion in Pflanzen

Info

Publication number: DE10143205A1
Application number: DE10143205A
Authority: DE
Inventors: Yurii Dorokhov; Eugene Skurat; Victor Klimyuk; Yuri Gleba
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2001-09-04
Publication date: 2003-03-20
Also published as: EP1423524A2; JP4401772B2; CA2455882A1; ATE338138T1; CA2455882C; IL160338A0; EP1423524B1; DE60214400D1; DE60214400T2; AU2002331090B2; US20050015830A1; WO2003020938A2; IL160338A; WO2003020938A3; MXPA04001871A; JP2005501558A; DE60214400T8

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen, umfassend DOLLAR A (i) Transformieren oder Transfizieren einer Pflanze oder von Pflanzenzellen mit einer Nukleotidsequenz, die eine kodierende Region aufweist, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein das gewünschte Protein oder Polypeptid, ein Signalpeptid, welches das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann, und ein Polypeptid umfasst, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, DOLLAR A (ii) Anreichern von Zellwandkomponenten, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen, und DOLLAR A (iii) Abtrennen des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewüpnschte Protein oder Polypeptid umfasst.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Vektoren für die Herstellung eines gewünschten Proteins in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen sowie so erhaltene Proteine und Polypeptide. Ferner betrifft die Erfindung Vektoren für dieses Verfahren und Pflanzen oder Pflanzenzellen, die damit transformiert werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die rekombinante Herstellung von Proteinen in pflanzlichen Systemen ist sehr erfolgreich für viele verschiedene Produkte, darunter Proteine für industrielle Anwendungen, Nahrungsmittel- und Futterzusätze, tiermedizinische Produkte und Pharmazeutika für Menschen, wie Antigene und Proteine der Immunantwort.
Es gibt viele Übersichtsartikel, die dieses Feld beschreiben (Daniell et al., 2001, Trends Plant Sci., 6, 219-226; Larrick & Thomas, 2001, Curr. Opin. Biotech., 12, 411-418; Doran, 2000, Curr. Opin. Biotech., 11, 199-204; Hood & Jilka, 1999, Curr. Opin. Biotech., 10, 382-386). Pflanzen werden für wirtschaftliche Produktionssysteme für Proteine gehalten, die im Vergleich mit Produktionssystemen auf der Grundlage von Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen deutlich billiger sind. Jedoch wurde den technischen Herausforderungen der Proteinreinigung aus pflanzlichen Materialien wenig Beachtung geschenkt. Die Isolierung und Reinigung von Proteinen aus Biomasse ist ein teurer und technisch komplizierter Prozess, der mehr als 90% der Gesamtproduktionskosten ausmachen kann, insbesondere bei billigen Produktionssystemen wie in Hefe- oder Bakterienzellen. Die Reinigung aus pflanzlicher Biomasse ist a priori sogar noch schwieriger und kann bei der industriellen Entwicklung von pflanzenbasierten Produktionsplattformen den schwierigsten Flaschenhals (Engpass) darstellen. Die verfügbaren Daten bestätigen das Gesagte. Zum Beispiel macht die Extraktion von β-Glucuronidase aus transgenen Maiskörnern 94% der Produktionskosten aus (Evangelista et al., 1998, Biotechnol. Prog., 14, 607-614).
Eine Anzahl von Verfahren wurden entwickelt, um dieses Problem anzupacken. Die Kompartimentalisierung des rekombinanten Proteins in der Pflanzenzelle gefolgt von seiner Sekretion ist eine Vorbedingung dafür, dass das Produkt leicht zu reinigen ist. Die Rhizosekretion von rekombinanten Proteinen wurde in genetisch verändertem Tabak demonstriert (Borisjuk et al., 1999, Nat. Biotechnol., 17, 466-469; US 6 096 546). Es wurde gezeigt, dass das Targeting (Leiten, Einschleusen) eines Proteins in das endoplasmatische Retikulum durch Verwendung einer Fusion mit einem Signalpeptid es erlaubt, das sekretierte Protein in bereits teilweise gereinigter Form zu erhalten (in der Sekretionsflüssigkeit mit nur rund einem Dutzend von Proteinen, die normalerweise von der Pflanze sekretiert werden), sowie in deutlich höheren Mengen im Vergleich mit einer Isolierung aus homogenisiertem Pflanzengewebe, das eine sehr komplizierte Mischung tausender Proteine und anderer Moleküle ist. Ein ähnlicher Ansatz wurde mit pflanzlichen viralen Expressionsvektoren gewählt, wobei das Protein in den Apoplast geleitet wurde, so dass die Reinigung mit einem stark angereicherten Produkt beginnt (für eine Übersicht siehe: Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94). Eine andere, von M. Moloney (US 5 650 554) entwickelte Technik löst das Problem durch Targeting des gewünschten Proteins als Teil einer Oleosinfusion in Ölkörper, d. h. eine Zellfraktion, die leicht abtrennbar ist.
Eine weitere wichtige Strategie besteht darin, das rekombinante Protein mit einem Affinitäts-Tag (affinity tag) zu versehen, das die Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie erleichtert. Dies ist ein weit verbreiteter Ansatz für die Proteinreinigung unter Verwendung verschiedener Affinitäts-Tags wie z. B. Polyhistidin, Flag, Protein A, Gluthation-S-Transferase, Cellulose-bindende Domänen (CBD) usw. (Sassenfeld, 1990, TIBTECH, 8, 88-93). Im Fall von CBD-Fusionsprotein wird das gewünschte Protein an eine substratbindende Region einer Polysaccharidase (Cellulasen, Chitinasen und Amylasen sowie Xylanasen und β-1,4-Glycanasen) gekoppelt. Eine Affinitätsmatrix, die das Substrat, wie z. B. Cellulose, enthält, kann zur Immobilisierung des Polypeptids verwendet werden. Das Polypeptid oder Fusionsprotein kann von der Matrix durch Verwendung einer Proteasen-Spaltstelle entfernt werden. Verschiedene Varianten dieses Verfahrens unter Verwendung von CBD pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs werden in mehreren Publikationen und Patenten beschrieben (Ong et al., 1991, Enzyme Microb. Technol., 13, 59-65; Linder et al., 1998, Biotechnol. Bioeng., 60, 642-647; US 5 137 819; US 5 202 247; US 5 670 623; US 5 719 044; US 5 962 289; US 6 060 274). Diese Reinigungsweise wurde mit Pflanzen noch nie getestet wegen Befürchtungen, dass das gewünschte Material an die cellulosehaltige pflanzliche Zellwand anhaftet und nicht mehr gereinigt werden kann.
Die oben beschriebenen Ansätze beruhen entweder auf dem Targeting (Einschleusen) eines rekombinanten Proteins in einen Sekretionsweg oder auf der Verwendung von Affinitäts-Tags, wie Cellulose-bindenden Domänen für ein in-vitro-Reinigungsverfahren. Es gibt auch Erfindungen, die das subzelluläre Targeting von cellulolytischen Enzymen für die Cellulaseproduktion und den Celluloseabbau in großem Maßstab beschreiben (WO 9811235) oder für die Erzeugung transgener Pflanzen mit veränderter Struktur oder Morphologie (US 6 184 440). Keines dieser Patente beschäftigt sich mit der Verbesserung des Verfahrens der Proteinreinigung. Stattdessen beschäftigen sie sich mit Problemen der Giftigkeit cellulolytischer Enzyme bei der Herstellung in großem Maßstab und/oder mit deren Verwendung zur Modulierung der Zellwandmorphologie.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein neues Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in Pflanzen oder Pflanzenzellen bereitzustellen, das im Vergleich zu bestehenden Technologien wesentlich einfacher ist und einen ökonomischen Weg zur Proteinproduktion in Pflanzen darstellt.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen gelöst, umfassend:

a) Transformieren oder Transfizieren einer Pflanze oder von Pflanzenzellen mit einer Nucleotidsequenz, die eine kodierende Region aufweist, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein das gewünschte Protein oder Polypeptid, ein Signalpeptid, welches das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann, und ein Polypeptid umfasst, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann,
b) Anreichern von Zellwandkomponenten, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen, und
c) Abtrennen des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewünschte Protein oder Polypeptid umfasst.

Das Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids gemäß der Erfindung umfasst die Expression des gewünschten Proteins oder Polypeptids als Fusionsprotein, das aus den Zellen, die das Fusionsprotein exprimieren, mittels eines Signalpeptids sekretiert wird. Im Apoplast bindet das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente durch das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann. So wird die pflanzliche Zellwand oder ihre Komponenten als Affinitätsmatrix für die Reinigung des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewünschte Protein oder Polypeptid enthält, ausgenutzt.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Pflanze oder Pflanzenzellen mit einer Nucleotidsequenz transformiert oder transfiziert, die eine Kodierregion, die für das Fusionsprotein kodiert, aufweist. Die Transformation kann stabil transformierte Pflanzen oder Pflanzenzellen, z. B. transgene Pflanzen, hervorbringen. Alternativ kann die Pflanze oder die Pflanzenzellen für eine transiente Expression des Fusionsproteins transfiziert werden. Mehrere Transformations- oder Transfektionsmethoden für Pflanzen oder Pflanzenzellen sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele sind unter anderem die Agrobakterium-vermittelte Transformation, die Partikelbombardierung, die PEG- vermittelte Transformation von Protoplasten, virale Infektion usw.
Die Nucleotidsequenz kann DNA oder RNA sein, je nach der Transformations- oder Transfektionsmethode. In den meisten Fällen wird sie DNA sein. In einer wichtigen Ausführungsform wird die Transformation oder Transfektion jedoch mit Vektoren durchgeführt, die auf RNA-Viren beruhen, so dass in diesem Fall die Nucleotid-Sequenz RNA ist.
Die Nucleotidsequenz umfasst eine kodierende Region, die für das Fusionsprotein kodiert. Das Fusionsprotein umfasst das gewünschte Protein oder Polypeptid (im folgenden das "gewünschte Protein" genannt). Das gewünschte Protein kann irgendein Protein oder Polypeptid sein, das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und isoliert werden kann. Es kann in einem ungefalteten, falsch gefalteten oder in einem natürlichen, funktionellen Faltungszustand vorliegen. Letztere Alternative ist bevorzugt. Pharmazeutische Proteine sind besonders bevorzugt.
Das Fusionsprotein umfasst ferner ein Signalpeptid, das das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann. Dies kann mit einem Signalpeptid erreicht werden, das das Fusionsprotein in das endoplasmatische Retikulum (ER) und den sekretorischen Weg einschleust. Alle Signalpeptide von Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie sekretiert oder in den Apoplast geleitet werden, können für die Zwecke dieser Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Beispiele sind die Signalpeptide von Calreticulin aus Tabak oder der Reisamylase. Weitere Beispiele sind die Signalpeptide der Pektinmethylesterase oder des tyrosin- und lysinreichen Proteins (tyrosine and lysine rich protein) aus N. tabacco (NtTLPR). Das Signalpeptid muss so in dem Fusionsprotein enthalten sein, dass es für das Targeting (Leiten) funktionell ist. Diese Bedingung kann an jeder Stelle des Fusionsproteins erfüllt sein. Im allgemeinen ist das Signalpeptid jedoch am N-Terminus des Fusionsproteins lokalisiert, um das Fusionsprotein in den Apoplasten zu leiten.
Das Fusionsprotein umfasst ferner ein Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann. Über dieses Polypeptid wird ein Großteil des in den Apoplasten sekretierten Fusionsproteins an die Zellwand gebunden oder dort immobilisiert. Das Binden an die Zellwand kann zu irgendeiner Zellwandkomponente stattfinden. Zellwandkomponenten für die Zwecke dieser Erfindung sind unter anderem Polysaccharide wie Cellulose, Hemicellulose, β-1,4-Glycan, Pektin usw. und Nicht- Polysaccharide, wie Proteine oder Lignin. Ein Binden an die Polysaccharidkomponenten der Zellwand ist bevorzugt. Das Binden an Cellulose ist am bevorzugtesten.
Beispiele für Polypeptide, die das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden können, sind Proteine, die eine solche Zellwandkomponente als Substrat verwenden, wie Cellulasen oder Hemicellulasen. Vorzugsweise wird die Substratbindedomäne solcher Enzyme als das Polypeptid verwendet, das an die Zellwandkomponente binden kann. Weitere Beispiele sind Polysaccharid-bindende Domänen (PBD) mikrobieller Herkunft (siehe unten). Ein Beispiel, das hier besonders beschrieben ist, ist Pektinmethylesterase (Beispiele 1 bis 3). In diesen Beispielen wird das Binden an eine Zellwandkomponente im allgemeinen nicht kovalent sein. Alternativ kann das Binden eine kovalente Bindung an eine Zellwandkomponente umfassen (cross-linking). Ein Beispiel hierfür ist NtTLPR, das Disulfidbindungen mit einer Proteinzellwandkomponente ausbilden kann.
In Schritt (ii) des Verfahrens der Erfindung werden Zellwandkomponenten angereichert, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen. Dieser Schritt umfasst das Entfernen vieler Verbindungen, die in Pflanzen enthalten sind, und ergibt eine wesentliche Reinigung des herzustellenden gewünschten Proteins. Während die Sekretion des Fusionsproteins aus der exprimierenden Zelle (Protoplast) das Fusionsprotein, das das gewünschte Protein enthält, von den meisten Verbindungen des Protoplasten räumlich trennt, können diese Protoplasten-verbindungen in diesem Schritt entfernt werden. Im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Präparation von Zellwänden können in Schritt (ii) verwendet werden. Schritt (ii) kann z. B. durchgeführt werden, indem die Pflanze oder die Pflanzenzellen geerntet werden, gefolgt von einer Homogenisierung des Pflanzengewebes, das erfindungsgemäß exprimiertes Fusionsprotein enthält. Die flüssige und die feste Phase des Homogenisats sollten dann getrennt werden, z. B. durch Zentrifugation oder Filtration. Die Zellwandkomponenten können auch durch Auspressen oder Ausdrücken, z. B. zwischen Rollen, angereichert werden. Der feste Rückstand, an den das Fusionsprotein gebunden oder immobilisiert ist, wird dann vorzugsweise mit einem geeigneten Waschpuffer gewaschen, um lösliche Verunreinigungen zu entfernen, wiederum gefolgt von dem Zurückgewinnen des unlöslichen Zellwandmaterials. Die in Schritt (ii) angewandten Bedingungen werden vorzugsweise so gewählt, dass der Faltungszustand der Domäne des gewünschten Proteins in dem Fusionsprotein gewahrt bleibt. Der Waschpuffer ist vorzugsweise wässrig. Jedoch kann auch ein organisches Lösungsmittel je nach dem herzustellenden Protein vorteilhaft sein. Um die Vorteile der Erfindung am besten auszunutzen, sollte die Zellwandkomponente, die das Fusionsprotein trägt, unlöslich bleiben, vorzugsweise zumindest in der frühen Phase des Anreicherns gemäß Schritt (ii). Das Anreichern/die Reinigung kann jedoch auf viele verschiedene Arten durchgeführt werden und kann auch das Abtrennen von Zellwandkomponenten beinhalten.
Im letzten Schritt (iii) der Erfindung wird das gewünschte Protein oder ein Fusionsprotein, das das gewünschte Protein enthält, von der Zellwandkomponente, an die es in Schritt (i) gebunden hat, abgetrennt. Dieses Abtrennen kann auf viele verschiedene Arten durchgeführt werden. In einer Ausführungsform kann das Fusionsprotein von der Zellwand oder der betreffenden Zellwandkomponente abgetrennt werden. (Es wird angemerkt, dass das Fusionsprotein in den meisten Fällen das Signalpeptid infolge des Abspaltens bei der Sekretion des Fusionsproteins nicht mehr enthalten wird.) Die Art und Weise, wie dies durchgeführt werden kann, hängt von den Umständen ab, insbesondere von dem Polypeptid, das zum Binden des Fusionsproteins an die Zellwandkomponente verwendet wurde. Für viele Polypeptide, die an eine Zellwandkomponente binden, sind die Bedingungen, unter denen eine feste oder eine lose Bindung auftritt, bekannt. Alternativ können diese Bedingungen experimentell bestimmt werden. Wenn die Bindung nicht kovalent ist, kann die Bindung z. B. durch Anpassen der Ionenstärke, des pH, der Temperatur oder der Pufferkomponenten (z. B. ein chaotropisches Mittel) unterbrochen oder geschwächt werden (Greenwood et al. (1988), FEBS Lett. 224, 127-131; Shoseyov et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3483-3487). Im Falle einer kovalenten Bindung muss der Typ der kovalenten Bindung in Betracht gezogen werden. Im Falle von NtTLRP als Polypeptid, das an eine Zellwandkomponente binden kann, kann z. B. ein reduzierendes Mittel, das freie -SH-Gruppen enthält, wie z. B. Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, zum Spalten von Disulfidbindungen eingesetzt werden.
Vorzugsweise beinhaltet die Abtrennung von Schritt (iii) die Spaltung des Fusionsproteins, so dass das gewünschte Protein frei oder im wesentlichen frei von anderen Proteinkomponenten erhalten wird. Diese Ausführungsform beinhaltet die Spaltung von mindestens einer Peptidbindung. Zu diesem Zweck kann das Fusionsprotein ferner eine Spaltsequenz aufweisen, die die Spaltung des Fusionsproteins erlaubt. Die Spaltsequenz kann ein Peptid sein, das von einer ortsspezifischen Protease erkannt wird. Die Zugabe einer geeigneten Protease kann dann zum Herausschneiden des gewünschten Proteins aus dem Fusionsprotein führen, das noch immer an eine Zellwandkomponente gebunden ist. Das Entfernen der verbleibenden Zellwandkomponenten führt dann zum Erhalt des gewünschten Proteins frei von der Mehrzahl des Pflanzenmaterials. Als Spaltsequenz/Proteasesysteme können diejenigen verwendet werden, die üblicherweise zum Entfernen von Affinitäts-Tags von affinitätsgereinigten Proteinen verwendet werden. Solche Systeme sind kommerziell erhältlich, z. B. von Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden. Ein spezifisches Beispiel, das häufig zum Entfernen eines His-Tags eingesetzt wird, ist das Faktor-Xa-System. In einer anderen Ausführungsform kann Ubiquitin als Bestandteil des Fusionsproteins verwendet werden, und das Spalten kann mit einer Ubiquitin-spezifischen Hydrolase erreicht werden. Die Spaltsequenz kann auch autokatalytisch sein, wobei das Spalten durch Bereitstellen geeigneter Bedingungen für das Spalten erreicht wird. Das so erhaltene gewünschte Protein kann aufkonzentriert werden. Je nach Situation kann das gewünschte Protein weiter gereinigt werden.
Die Konstruktion der erfindungsgemäßen Nucleotidsequenz kann nach Standardverfahren der Molekularbiologie durchgeführt werden. Die Nucleotid-Sequenz enthält vorzugsweise einen pflanzenspezifischen Promotor, der operationell mit der Kodiersequenz verbunden ist, und einen Transkriptionsterminator hinter der Kodierregion. Gewebsspezifische Expression des Fusionsproteins kann, wenn gewünscht, durch geeignete Wahl des Promotors erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Vektoren auf der Basis von Viren zur Durchführung dieser Erfindung verwendet. Die Konstruktion solcher Vektoren ist in den Referenzbeispielen beschrieben.
Die Nucleotidsequenz enthält eine Kodierregion, die für das Fusionsprotein kodiert. Die Komponenten des Fusionsproteins können in verschiedenen Reihenfolgen angeordnet sein. Das Signalpeptid wird jedoch vorzugsweise an das N-terminale Ende des Fusionsproteins gesetzt, damit es für das Targeting (Leiten) funktionell ist. Das gewünschte Protein wird vorzugsweise an den C-Terminus des Fusionsproteins gesetzt, was seine Abtrennung vom Rest des Fusionsproteins über eine einzige Spaltung einer Peptidbindung erlaubt. Das Polypeptid, das an eine Zellwandkomponente binden kann, liegt dann zwischen dem Signalpeptid und dem gewünschten Protein. Andere Anordnungen sind jedoch auch von dieser Erfindung umfasst, z. B. das Setzen des Polypeptids, das an eine Zellwandkomponente binden kann, an den C-Terminus des Fusionsproteins. Weiterhin kann das gewünschte Protein auf beiden Seiten von einem Polypeptid, das an eine Zellwandkomponente binden kann, flankiert werden, wobei diese Polypeptide die gleichen oder verschieden sein können. Das gewünschte Protein kann dann durch zwei proteolytische Schnitte herausgeschnitten werden. Vorzugsweise benutzen diese beiden proteolytischen Schnitte die gleiche Spaltsequenz. Das gewünschte Protein kann ferner in einem Intein enthalten sein, um die Isolierung zu vereinfachen.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt ein allgemeines Schema zur Herstellung eines rekombinanten Proteins in Pflanzenzellen gemäß der Erfindung.
A - Einführung eines Transgens in eine Pflanzenzelle über verschiedene Methoden (virale Vektoren- RNA- oder DNA-Viren; stabile Kern- oder Plastiden-Transformation; transiente Agrobacteriumvermittelte Expression - "Agroinfiltration");
B - Rekombinante Proteinsynthese und Anhaften an die Zellwand;
C - Anreichern des Pflanzengewebes durch Auspressen des Cytosols;
D - Abtrennen des rekombinanten Proteins von dem Pflanzengewebe.
Fig. 2 zeigt die cDNA-Sequenz des Pektinmethylesterase(PME)-Gens voller Länge aus Tabak. Die Translationsstart- und -stoppkodons sind fett gezeigt.
Fig. 3 zeigt ein Alignment (Anordnung) der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen der PME-Gene aus Tabak (Zugriffsnr. AJ401158), Tomaten (Zugriffsnr. U49330) und Orange (Zugriffsnr. U82976). Das Alignment der abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen wurde mit dem Genebee-Programmpaket durchgeführt. Der Pfeil deutet den N-Termins eines prozessierten PME-Proteins an. Die Transmembran- Helix (schwarze Box) und die PME-Signaturen 1 und 2 sind eingerahmt.
Fig. 4 zeigt Klonierschemata für verschiedene Versionen von PME-GFP-Fusionen:
(A) Klonierschema für die Vektoren pIC2452 (Gesamt-PME-GFP) und pIC2462 (reifes PME);
(B) Klonierschema für die Vektoren pIC2472 (GFP-Gesamt-PME) und pIC2482 (GFP-reifes PME).
Fig. 5 zeigt in vitro RRL(Kaninchen-Reticulozytenlysat)-Translation vier verschiedener GFP-Fusionen mit dem PME-Gen. Spur 1: pIC2482, Spur 2: pIC2452, Spur 3: pIC2472 und Spur 4: pIC2462.
Fig. 6 zeigt das Klonierschema verschiedener GFP-PME-Fusionen in einer pflanzlichen Expressionskassette für transiente Expressionsexperimente.
Fig. 7 zeigt N. benthamiana-Zellen, die GFP exprimieren (helle Regionen), das in die Zellwand geleitet wurde nach der Bombardierung mit einer Gesamt-PME-GFP-Fusion unter der Kontrolle des 35S- Promotors.
Fig. 8 zeigt die T-DNA-Region eines binären Vektors, der die flPME-GFP-Fusion trägt.
Fig. 9 zeigt eine T-DNA-Region eines binären Vektors, der die NtTLPR-GFP-Fusion trägt.
Fig. 10 zeigt eine T-DNA-Region eines binären Vektors, der die NtTLPRubq-GFP-Fusion trägt.
Fig. 11 zeigt einen crTMV-Vektor, der die NtTLPR-GFP-Fusion trägt.
Fig. 12 zeigt die Vektoren T7/crTMV und SP6/crTMV.
Fig. 13 zeigt die Vektoren T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS, T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS, T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS, T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS, T7/crTMV/SPACER_CP,148 ^UI-GUS und T7/crTMV/PL-GUS.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das allgemeine Prinzip der Erfindung ist in Fig. 1 gezeigt. Ein Gen, das für ein Fusionsprotein mit einem sekretorischen Signalpeptid und eine Zellwand-bindenden Domäne kodiert, wird in eine Pflanzenzelle eingebracht, vorzugsweise mit einem DNA- oder einem RNA-Vektor. Das rekombinante Protein wird exprimiert, in den intrazellulären Raum (Apoplast) geleitet infolge der Gegenwart eines Sekretionssignalpeptids und über seine Zellwand-bindende Domäne an die Zellwand gebunden. Pflanzen, die dieses Fusionsprotein enthalten, werden dann prozessiert (Auspressen oder Homogenisieren), um die Zellwandmatrix von dem Zellinhalt zu trennen. Die Zellwandmatrix wird dann auf eine Art und Weise behandelt, die die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Matrix erlaubt.
Es gibt verschiedene Methoden, um einen DNA- oder RNA-Vektor in eine Pflanzenzelle einzuführen, darunter das direkte Einführen des Vektors in eine Pflanzenzelle mittels Mikroprojektilbombardierung, Elektroporation oder PEG-vermittelter Behandlung von Protoplasten (für eine Übersicht siehe: Gelvin, S. B., 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci., 4, 226-231). Pflanzliche RNA- und DNA-Viren stellen weitere effiziente Systeme dar (Hayes et al., 1988, Nature, 334, 179-182; Palmer et al., 1999, Arch. Virol., 144, 1345-1360; Lindbo et al., 2001, Curr. Opin. Plant. Biol., 4, 181-185). Diese Vektoren können ein Transgen entweder stabil in das Genom/Plastom einer Pflanze integrieren (direkte oder Agrobacterium-vermittelte DNA-Integration) oder für die transiente Expression des Transgens ("Agroinfiltration").
Die Nucleinsäure, die die für das gewünschte Protein kodierende Kodierregion mit einem sekretorischen Signalpeptid und einer Zellwandbindungsdomäne aufweist, kann auf viele verschiedene Arten entworfen werden. Üblicherweise ist das Signalpeptid am N-terminalen Ende des Fusionsproteins lokalisiert. Die Zellwand-bindenden Domänen können das Signalpeptid mit dem gewünschten Protein verknüpfen oder können am C-terminalen Ende des Fusionsproteins lokalisiert werden. Ferner können zwei Zellwandbindende Domänen das gewünschte Protein umschließen. In einer Ausführungsform dieser Erfindung wurde das vollständige Pektinmethylesterase-Gen aus Tabak (PME cDNA, siehe Fig. 2; PME- Proteinvorläufer, siehe Fig. 3) mit dem Gen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als gewünschtes Protein verknüpft. Pektinmethylesterase (PME) (Gaffe et al., 1997, Plant Physiol., 114, 1547-1556; Dorokhov et al., 1999, FEBS Lett., 461, 223-228) ist ein sekretorisches Protein, das im endoplasmatischen Reticulum (ER) und in der Zellwand detektiert werden kann. Die Mitglieder der PME-Multigen-Familie, die posttranslational prozessiert werden (Gaffe et al., 1997, Plant Physiol., 114, 1547-1556), sind beim Zellwand-Turnover beteiligt und scheinen beim Pflanzenwachstum und der -entwicklung beteiligt zu sein (Wen et al., 1999, Plant Cell, 11, 1129-1140). PME ist ein ubiquitäres Enzym im Pflanzenreich und reguliert den Zellwandabbau, indem es die Demethoxylierung von Pektinen katalysiert. Reifes 33 kDa-PME ist in der Zellwand lokalisiert, während der PME-Vorläufer als 70 kDa- Polyprotein synthetisiert wird. Es ist offensichtlich, dass die Prozessierung von PME und die Weiterleitung zur Zellwand vom Entfernen der N-terminalen Leader-Sequenz begleitet ist, während das Verankern von PME in der Zellwand die spezifische Pektinbindungsdomäne benötigt.
In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung (siehe Beispiele 4 und 5) wurde als Fusion mit dem gewünschten Protein das kleine Zellwandprotein NtTLPR (106 Aminosäurereste) aus Tabak verwendet, das eine Peptidsignalsequenz und eine Cysteindomäne (CD) enthält. Die CD ist beim Crosslinking des Proteins mit der Zellwand beteiligt (Domingo et al., 1999, Plant J., 20, 563-570).
Das gewünschte Protein kann mit einer Signalsequenz und Zellwand-bindenden Domänen von verschiedenen Genen, sogar von verschiedenen Organismen verknüpft werden, z. B. kann ein ER- Signalpeptid pflanzlichen Ursprungs (z. B. Tabak-Calreticulin-Signalpeptid) und eine Polysaccharidbindungsdomäne (PBD) bakteriellen Ursprungs verwendet werden. Einige Pflanzenpathogene (Bakterien und Pilze) können Polysaccharide wie Cellulose, Pektin, Xylan, und mehrere andere Kohlenstoffquellen für ihr Wachstum verwenden und synthetisieren Enzyme, die PBDs enthalten. Die Cellulosebindungsdomänen dieser Enzyme sind gut charakterisiert und finden weite Verwendung zur Proteinreinigung auf einer Cellulosematrix. Die Affinität einer bestimmten Cellulose- oder Polysaccharidbindungsdomäne für eine bestimmte Zellwandkomponente hängt von der fraglichen Domäne ab. Elutionsbedingungen für ein bestimmtes Fusionsprotein mit einer bestimmten CBD oder PBD werden vorzugsweise experimentell bestimmt. CBD zur Verwendung in dieser Erfindung sind z. B. die in US 6 174 700 genannten.
In Anbetracht der Tatsache, dass die Herstellung eines Proteins gemäß dieser Erfindung die Fusion des gewünschten Proteins mit einem Signalpeptid und einer oder mehrere Zellwand-bindenden Domänen beinhaltet, kann die Abtrennung des gewünschten Proteins aus dem Fusionsprotein ein wichtiger Punkt sein. Vektoren, die proteolytische Stellen auf beiden Seiten der gewünschten kodierenden Sequenz enthalten, erlauben die Spaltung des Fusionsproteins und die Freisetzung des gewünschten Proteins in reiner Form, wenn die Bedingungen für eine solche proteolytische Spaltung gegeben sind. Die Spaltung eines Translationsfusionsproteins kann über eine Peptidsequenz erreicht werden, die von einer viralen ortsspezifischen Protease erkannt wird oder mittels eines katalytischen Peptids (Dolja et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208-10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; US 5 162 601, US 5 766 885, US 5 491 076). Weitere Beispiele für ortsspezifische Proteasen, die für diese Erfindung verwendet werden können, sind Enterokinasen aus Säugern, wie z. B. die leichte Kette der menschlichen Enterokinase, die die Sequenz DDDK-I erkennt (Kitamoto et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 7588-7592) und spezifisch Lys-Ile-Bindungen spaltet; virale Proteasen, wie z. B. Hc-Pro (Carrington JC & Herndon KL, 1992, Virology, 187, 308-315), die die Proteolyse in dem Gly-Gly-Dipeptid katalysiert, jedoch 4 Aminosäuren für die Erkennung der Spaltstelle benötigt; ortsspezifische Proteasen des Semliki- Forest-Virus (Vasiljeva et al., 2001, J. Biol. Chem., 276, 30786-30793); und bei der Prozessierung von Polyubiquitin beteiligte Proteasen, Ubiquitin-carboxyterminale Hydrölasen (Osava et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., 283, 627-633).
Ubiquitin-spezifische Proteasen eröffnen eine weitere Möglichkeit. Die Expression von Proteinen und Polypeptiden als Fusion mit Ubiquitin hat den weiteren Vorteil, dass das Expressionsniveau häufig stark ansteigt sowie die Möglichkeit, durch Ubiquitin-Spaltung jeden gewünschten aminoterminalen Rest zu erhalten. Klonierte Ubiquitin-spaltende Enzyme sind seit kurzem erhältlich, was diese Technik sowohl für bakterielle als auch für eukaryotische Wirtssysteme gefördert hat (für eine Übersicht siehe Baker, R. T., 1996, Curr. Opin. Biotech., 7, 541-546). Expressionssysteme mit Ubiquitin-Fusionen sind bereits für Pflanzen (US 5 773 705), Hefen (US 6 068 994) und Bakterien (US 545 905) beschrieben worden. In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird das Ubiquitinpolypeptid zwischen das N-terminale NtTLPR-Protein und das GFP-Gen inseriert (Fig. 10, Beispiel 4). Dies erlaubt es, jedes gewünschte Protein mit einem natürlich vorkommenden N-Terminus nach der Spaltung des Ubiquitin-Moleküls mit einer Ubiquitin-spezifischen Protease zu erhalten. Die Genauigkeit einer solchen Spaltung hängt nicht von der N-terminalen Aminosäure-Sequenz des gewünschten Proteins ab.
Das gewünschte Gen kann in Pflanzen oder Pflanzenzellen mit Hilfe von viralen Vektoren eingeführt werden. Ein solcher Ansatz hat den offensichtlichen Vorteil im Vergleich mit der konstitutiven Expression eines Transgens in stabil transformierten Pflanzen, dass wesentlich höhere Expressionslevel erhalten werden können, sowie die Unabhängigkeit von cytotoxischen Effekten, die von großen Mengen transgenen Produkts hervorgerufen werden können. Ein virales System für diese Erfindung ist in Beispiel 5 (Fig. 11) beschrieben. Die NtTLPR-GFP-Fusion wird in einen crTMV-Expressionsvektor inseriert. Die Verwendung dieses Systems in Pflanzen wird in den Referenzbeispielen beschrieben.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Konstruktion von Vektoren, die verschiedene Fusionen von GFP mit dem Gen der Pektinmethylesterase (PME) aus Tabak enthalten für die transiente Expression und stabile Kerntransformation von Pflanzen

Eine rot-verschobene Mutante von GFP (GFPst65T) wurde zur Fusion mit PME gewählt, um die Lokalisierung von GFP in vivo zu bestimmen. Die folgenden vier Konstrukte wurden hergestellt: 1) gesamt-PME-GFP; 2) GFP-reifes PME; 3) GFP-gesamt-PME und 4) reifes PME-GFP. Das erste Konstrukt wurde entworfen, um das gewünschte Protein (GFP) zur Zellwand zu leiten. Die Konstrukte 2 bis 4 wurden als Negativkontrollen benutzt.
Das Plasmid pUC8, das die vollständige Sequenz eines unprozessierten PME-Gens mit untranslatierten 5'- und 3'-Regionen wurde zur PCR-Amplifikation mit den folgenden Primern verwendet:
a) 5'-TGACCCATGGTGGATTCCGGCAAGAACGTT-3', entsprechend dem N-terminalen Teil der PME-Kodiersequenz mit einer NcoI-Stelle.
b) 5'-TTTTGGATCCACGGAGACCAAGAGAAAAAG-3', entsprechend dem C-terminalen Teil der PME-Kodiersequenz mit einer BamHI-Stelle.
Dieses Primerpaar wurde entworfen, um PME ohne Translationsterminationssignal zu erzeugen.
c) 5'-TGACGGATCCTTGGATTCCGGCAAGAACGTTAAT-3', entsprechend dem N-terminalen Teil der PME-Kodiersequenz voller Länge mit einer BamHI-Stelle.
d) 5'-CCCCTCTAGATCAGAGACCAAGAGAAAAAGGGAA-3', entsprechend dem C-terminalen Teil von PME voller Länge mit einer XbaI-Stelle.
Dieses Primerpaar wurde entworfen, um PME ohne den ersten Methioninrest, jedoch mit einem Translationsterminationssignal zu erhalten.
e) 5'-TTTTCCATGGTGAGGCCCGACGTGGTTGTGGC-3', entsprechend dem N-terminalen Teil des reifen PME-Gens mit einem Translationsstartkodon in der NcoI-Stelle.
Dieser Primer wurde entworfen, um ein reifes PME-Gen mit einem Translationsstart, jedoch ohne einem Translationsterminationssignal zu kreieren.
f) 5'-ATAAGGATCCGTGAGGCCCGACGTGGTTGTGGC-3', entsprechend dem N-terminalen Teil des reifen PME-Gens ohne Translationsterminationssignal in der BamHI-Stelle.
Dieser Primer wurde entworfen, um ein reifes PME-Gen ohne Startkodon, jedoch mit einem Translationsstartsignal zu kreieren.
Die verschiedenen PCR-Produkte wurden in den pGEM-T-Vektor (Promega) unter die Kontrolle des T7- Promotors kloniert, was die Plasmide pIC2406 (Primer a) und b)), pIC2396 (Primer b) und c)), pIC2425 (Primer a) und f)) und pIC2415 (Primer b) und f)) ergab.
Dann wurde das GFP-Gen für eine N- oder C-terminale Translationsfusion mit PME modifiziert. Zwei Modifizierungen des GFP-Gens wurden in den pGEM-T-Vektor unter der Kontrolle des T7-Promotors kloniert. GFP mit einem Translationsstartkodon und ohne einem Translationsterminationssignal wurde mit Primern g) und h) (pIC2441) erhalten. GFP ohne einem Translationsstartkodon, jedoch mit einem Translationsterminationssignal, wurde mit dem Primern i) und j) (pIC2431) erhalten.

Verwendete GFP-Primer

g) 5'-TTTTCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3', entsprechend dem N-terminalen Teil des GFP-Gens mit einem Translationsstartkodon in der NcoI-Stelle.
h) 5'-TTTTGGATCCTATTCTTGCGGGCCCTCGCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3', entsprechend dem C-terminalen Ende des GFP-Gens mit einer BamHl-Restriktionsstelle.
i) 5'-TTTTGGATCCATAAGAACGGGGCCCAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3', entsprechend dem N-terminalen Teil des GFP-Gens mit einer BamHI-Stelle.
j) 5'-TTTTTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCA-3', entsprechend dem C-terminalen Teil des GFP-Gens und mit einem Translationsterminationssignal in der XbaI-Stelle.
Für die PME-GFP-Fusionen wurde das NcoI/BamHI-Fragment aus pIC2431 mit GFP ohne Translationsstartkodon mit den großen NcoI/BamHI-Fragmenten von pIC2406 und pIC2425 ligiert, was die Konstrukte pIC2452 bzw. pIC2462 ergab. Das allgemeine Klonierverfahren ist in Fig. 4A gezeigt. Für die GFP-PME-Fusionen wurde das kleine NcoI/BamHI-Fragment aus pIC2441 mit dem großen NcoI/BamHI-Fragment aus pIC2396 oder mit dem großen NcoI/BamHI-Fragment aus pIC2411 ligiert, was die Plasmide pIC2472 bzw. pIC2482 ergab. Das Klonierverfahren ist in Fig. 4B gezeigt.
Um die Korrektheit der PME-GFP-Fusionen zu überprüfen, wurden die Konstrukte pIC2452, 2462, 2472 und 2482 zur in-vitro-Translation in Kaninchen-Reticulozytenlysat (RRL) verwendet. Die in Fig. 5 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die verschiedenen PME-GFP-Fusionsprodukte intakt waren. Für transiente Expressionsexperimente wurden die großen NcoI-Klenow/SalI-Fragmente aus pIC2452, 2462, 2472 und 2482 mit dem großen SmaI/SaII-Fragment der pIC056-Expressionskassette zwischen dem 35S-Promotor und der Nos-Terminator-Sequenz ligiert, was Konstrukte mit den folgenden Fusionen ergab: p35S:volllänge (fl)-PME-GFP, p35S:reifes PME-GFP, p35S:GFP-flPME und p35S: GFP-mPME. Das Klonierschema ist in Fig. 6 gezeigt.

BEISPIEL 2

Transiente Expression der PME-GFP-Fusion in Nicotiana benthamiana-Blättern Präparation der Plasmid-DNA

Plasmide, die die p35S: flPME-GFP-, p35S: mPME-GFP-, p35S: GFP-flPME- und p35S: GFP-mPME- Fusionen trugen, wurden in den E. coli-Stamm DH10B transformiert, Maxipreps wurden in LB-Medium gezogen und die DNA wurde mit dem Qiagen-Kit gereinigt.

Mikroprojektilbombardierung

Die Mikroprojektilbombardierung wurde mit einem Biolistic-PDS-1000/He-Particle Delivery System (Bio-Rad) durchgeführt. Die Zellen wurden bei 900 bis 1100 psi, einem 15 mm Abstand vom Makroträgerstartpunkt zur Stoppscheibe und 60 mm Abstand von der Stoppscheibe zum Zielgewebe bombardiert. Der Abstand zwischen der Bruchscheibe und dem Startpunkt des Makroträgers betrug 12 mm. Die Zellen wurden nach 4-stündiger osmotischer Vorbehandlung bombardiert.
Die DNA-Goldbeschichtung gemäß dem originalen Bio-Rad-Protokoll (Sanford et al., 1993, in: Methods in Enzymology, Hg. R. Wu, 217, 483-509) wurde folgendermaßen durchgeführt: 25 µl Goldpulver (0,6, 1,0 mm) in 50% Glycerin (60 mg/ml) wurden mit 5 µl Plasmid-DNA in einer Konzentration von 0,2 µg/ml, 25 µl CaCl₂ (2,5 M) und 10 µl 0,1 M Spermidin gemischt. Die Mischung wurde 2 Minuten gevortext, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur, Zentrifugation (2000 U/min. 1 min) und Waschen mit 70% und 99,5% Ethanol. Schließlich wurde das Pellet in 30 µl 99,5% Ethanol (6 µl/Schuss) resuspendiert.
Ein neues DNA-Goldbeschichtungsverfahren (PEG/Mg) wurde folgendermaßen durchgeführt: 25 µl Goldsuspension (60 mg/ml in 50% Glycerin) wurden mit 5 µl Plasmid-DNA in einem Eppendorfgefäß gemischt, dann wurden 30 µl 40% PEG in 1,0 M MgCl₂ zugesetzt. Die Mischung wurde 2 Minuten lang gevortext und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur, ohne zu schütteln, inkubiert. Nach einer Zentrifugation (2000 U/min. 1 min) wurde das Pellet zweimal mit 1 ml 70% Ethanol, einmal mit 1 ml 99,5% Ethanol gewaschen und schließlich in 30 µl 99,5% Ethanol dispergiert. Aliquots von 6 µl der DNA-Goldsuspension in Ethanol wurden auf Makroträgerscheiben geladen und 5 bis 10 Minuten trocknen gelassen.
Die Blätter der Nicotiana benthamiana wurden mit diesen mit verschiedener Plasmid-DNA beschichteten Goldpartikeln beschossen. Die in Fig. 7 gezeigten Ergebnisse der Experimente zeigen, dass das flPME- GFP-Fusionsprodukt zur Zellwand geleitet wird.

BEISPIEL 3

Agrobacterium-vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana Entwurf der Konstrukte

Die großen Nhel-EcoR1-Fragmente der in Beispiel 1 beschriebenen Plasmide p35S: flPME-GFP, p35S: mPME-GFP, p35S: GFP-flPME und p35S: GFP-mPME wurden mit dem großen Xba1-EcoR1- Fragment des binären Vektors pICBV1 ligiert. Die erhaltenen Plasmide pICBV flPME-GFP, pICBV1 mPME-GFP, pICBV1 GFP-flPME und pICBV1 GFP-mPME enthielten die p35S: flPME-GFP-, p35S: mPME-GFP-, p35S: GFP-flPME- und p35S: GFP-mPME-Expressionskassetten in der T-DNA- Region mit dem BAR-Gen als Selektionsmarker. Die T-DNA-Region eines Konstrukts, pICBV flPME- GFP, ist in Fig. 8 gezeigt.

Transformation von Arabidopsis thaliana in Planta

Die Plasmide (Carbenicillin-resistent) wurden mittels Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens (Stamm GV 2260) eingebracht. Die Bakterienzellen wurden in 300 ml 2YT-Medium mit Antibiotika herangezogen, abzentrifugiert und in 5% Sucrose auf eine OD₆₀₀ = 0,8 resuspendiert.
A. thaliana-Pflanzen wurden bis zur Blüte herangezogen. Dann wurden Blüten (flowering bolts) der Arabidopsis-Pflanzen in Agrobacterium-Lösung eingetaucht, wobei für einige Sekunden Vakuum angelegt wurde. Transformierte Pflanzen wurden 24 Stunden lang an einem dunklen Ort bei hoher Luftfeuchtigkeit gehalten und dann ins Gewächshaus gebracht. Die Samen wurden 3 bis 4 Wochen später gesammelt, in Erde ausgesät und mit 100 mg/l Phosphinothricin, 0,01% Silvet, besprüht. Diese Behandlung wurde zwei- bis dreimal wiederholt, je nach der Effizienz der Selektion und der Häufigkeit von späten Keimereignissen. Transgene Arabidopsis-Pflanzen wurden zum Studium der GFP- Lokalisation in den Pflanzengeweben verwendet.

Selektion von Transformanten

Zwei bis vier Tage nach der Bombardierung wurde das Filterpapier mit den Zellen auf eine Platte mit dem geeigneten Selektionsmittel (10 bis 15 µg/ml PPT) versetzten CIM transferiert. Alle sieben Tage wurde das Material in frisches Selektionsmedium transferiert. Die Platten wurden im Dunkeln gehalten, und nach ungefähr 6 Wochen wurde das Pflanzenmaterial auf Petrischalen mit Morphogenese- induzierendem Medium (MIM) (siehe Appendix) ergänzt mit dem jeweiligen Selektionsmittel (10 bis 15 µg/ml PPT) transferiert. Die Platten wurden bei hoher Lichtintensität 16 Stunden pro Tag inkubiert.

BEISPIEL 4

Zellwand-Targeting von GFP mit einer Translationsfusion mit dem NtTLRP-Gen

Die Translationsfusion von GFP mit dem Tabak-Zellwandprotein TLPR (Domingo et al., 1999, Plant J., 20, 563-570; Zugriffsnr. Y19032) mit einem binären Vektor wurde wie für die PME-GFP-Fusion beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme von unterschiedlichen Primern.
a) 5'-TGACCCATGGGTTCTAAGGCATTTCTGTTTCTTG-3', entsprechend dem N-terminalen Teil der NtTLPR-Kodiersequenz mit einer NcoI-Stelle.
b) 5'-TTTTGGATCCTTGTGAAGGCTGAACTTCAGTAAG-3', entsprechend dem C-terminalen Teil der NtTLPR-Kodiersequenz mit einer BamHI-Stelle.
Die Klonierstrategie war ähnlich zu der für die flPME-GFP-Fusion von Beispiel 1 und 3. Das fertige Konstrukt mit der p35S:NtTLPR-GFP-Expressionskassette innerhalb der T-DNA-Grenzen ist in Fig. 9 gezeigt.
Um eine Proteinspaltstelle einzuführen, die genau an einem vorbestimmten Ort vor irgendeinem Aminosäurerest gespalten werden kann, wurde das Arabidopsis-Ubiquitin-Gen (UBA11, US 5 773 705) zwischen die NtTLPR- und GFP-Gene eingeführt. Die Primer für die UBQ11-Amplifizierung waren wie folgt:
c) 5'-TTTTGGATCCAGATCTTCGTAAAGACTTTGACCG-3', entsprechend dem N-terminalen Teil der UBQ11-Kodiersequenz mit einer BamHI-Stelle.
d) 5'-TTTTGGATCCTTGTGAAGGCTGAACTTCAGTAAG-3', entsprechend dem C-terminalen Teil von NtTLPR-Kodiersequenz mit einer BamHI-Stelle.
Das mit BamHI behandelte und gelgereinigte PCR-Fragment des IBQ11-Gens wurde mit dem BamH1- verdauten und mit alkalischer Phosphatase behandelten Vektor pICBV1 NtTLPR-GFP ligiert. Die Orientierung des klonierten Fragments wurde mittels PCR überprüft, wobei verschiedene Kombinationen von UBQ1- und GFP-Primern verwendet wurden. Die T-DNA-Region des erhaltenen Plasmids ist in Fig. 8 gezeigt.
Experimente zur transienten Expression und die stabile Transformation von Pflanzen wurde wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL 5

Expression der NtTLPR-GFP-Fusion von einem crTMV-Vektor

Das NcoI-SaII-Fragment der NtTLPR-GFP-Fusion wurde in einen crTMV-Vektor (Fig. 11) transformiert und für die Transfektion von Nicotiana benthamiana-, Nicotiana tabaccum- und Brassica-Pflanzen verwendet. Einzelheiten der Herstellung eines crTMV-basierten Vektors und der Expression eines Reportergens über ein IRES-Element sind in den Referenzbeispielen beschrieben.

REFERENZBEISPIELE

Die folgenden Referenzbeispiele zeigen die Konstruktion viraler Vektoren und die Expression des GUS- Reportergens über ein IRES-Element.

REFERENZBEISPIEL 1

Konstruktion eines Tobamovirus-Vektors, der Kreuzblütler infiziert

Virione eines bekannten Tombavirus, der Crucifer-Tombavirus (crTMV) genannt wird und der in der Lage ist, Kreuzblütler systemisch zu infizieren, wurden von Olearacia officinalis L.-Pflanzen, die Mosaik-Symptome auswiesen, isoliert. Die Resultate der Überprüfung der Wirtsspezifität sind in Tabelle 1 gezeigt.

Plasmid-Konstruktion

crTMV-cDNS wurde mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert (Dorokhov et al., 1994 FEBS Letters 350,5-8). Infektiöse voll-Länge cDNS-Klone wurden mit Hilfe des T7 RNS- Polymerase-Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit crTMV-RNS als Template erzeugt. Folgende Oligonukleotide wurden dabei benutzt: crTMV 1-Kpn (upstream) 5'-gcatggtaccccttaatacgactcactataGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAACAA
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Kpn I-Restriktionsstelle dar, unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der T7-RNS-Polymerase-Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet: crTMV2 (downstream) 5'-gcatgcggccgcTGGGCCCCTACCCGGGGTTAGGG
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Not I-Restriktionsstelle dar, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die Kpn I- und BamHI-Restriktionstelle kloniert (Fig. 12).
Für infektiöse voll-Länge cDNS-Klone, die mit Hilfe des SP6-RNS-Polymerase-Promotors in einer RT- PCR-Reaktion mit crTMV-RNS als Template erzeugt wurden, wurden folgende Oligonukleotide benutzt: crTMV 1-SP6 (stromaufwärts) 5'-gcatggtaccatttaggtgacactatagaactcGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAACAA
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Kpn I-Restriktionsstelle dar, unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der SP6-RNS-Polymerase-Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet. crTMV2-SP6 (stromabwärts) 5'-gcatgcggccgcTGGGCCCCTACCCGGGGTTAGGG
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Not I-Restriktionsstelle dar, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die Kpn I- und BamH I-Restriktionstelle kloniert (Fig. 12).
Die voll-Länge crTMV-cDNS-Klone wurden mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert. Die Fähigkeit von infektiösen crTMV-Transkripten systemisch Nicotiana- und Kreuzblütler-Arten zu infizieren, konnte in Infektionsexperimenten mit Nicotiana tabacum var. Samsun bzw. Arabidopsis thaliana bestätigt werden.

REFERENZBEISPIEL 2

Konstruktion eines Tobamovius-Vektors für die ExKression des GUS-Gens in Pflanzen der Gattung Nicotiana und der Familie der Kruziferen

Eine Serie von IRES-vermittelten Expressionsvektoren T7/crTMV/GUS wurden wie folgt konstruiert. Erstens, Hind III- und Xba I-Restriktionsstellen wurden in das CP-Gen des Sac II/Not I-Fragment des T7/crTMV-Vektors (Abb. 1) mit Hilfe einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) und zwei Paaren von spezifischen Primern inseriert. Zweitens IRES_MP,75 ^CR-GUS-, IRES_MP,75 ^UI-GUS-, IRES_MP,228 ^CR-GUS-, IRES_CP,148 ^CR-GUS-, IRES_CP,148 ^UI-GUS-, PL-GUS-cDNS, die in Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben sind, wurden in die Hind III- und Xba I-Restriktionsstellen des Sac II/Not I-Fragmentes des T7/crTMV-Vektors inseriert, so daß eine Sac I-IRES_MP,75 ^CR-GUS-Not I-, Sac II-IRES_MP,75 ^UI-GUS-Not I-, Sac II-IRES_MP,228 ^CR-GUS-Not I-, SacII-IRES_CP,148 ^CR-GUS-NotI-, Sac II-IRES_CP,148 ^UI-GUS-Not I- bzw. Sac II-PL-GUS-Not I-cDNS erhalten wurde.
Drittens ein Sac II-Not I-cDNS-Fragment des T7/crTMV-Vektors wurde durch ein Sac I-IRES_MP,75 ^CR- GUS-Not I- oder ein Sac II-IRES_MP,75 ^UI-GUS-Not I- oder ein Sac II-IRES_MP,228 ^CR-GUS-Not I- oder ein Sac II-IRES_CP,148 ^CR-GUS-Not I- oder ein Sac 11-RES_CP,148 ^UI-GUS-Not I- oder ein Sac 11-PL-GUS-NotI-cDNS- Fragment ersetzt, um die Vektoren T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (Fig. 13), T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS (Fig. 13), T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (Fig. 13), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (Fig. 13), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (Fig. 13) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (Fig. 13) zu erhalten.

REFERENZBEISPIEL 3

Expression des GUS-Gens in transfizierten Pflanzen der Gattung Nicotiana und der Familie der Kruziferen

Dieses Beispiel demonstriert die Tobamovirus IRES-vermittelte Expression des GUS-Gens in Nicotiana benthamiana- und Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die mit den auf dem crTMV-basierenden Vektoren - Vektor T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS, (Fig. 13), Vektor T7/crTMV/ IRES_MP,75 ^UI-GUS (Fig. 13), Vektor T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (Fig. 13), Vektor T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (Fig. 13), Vektor T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (Fig. 13) bzw. Vektor T7/crTMV/PL-GUS (Fig. 13) - infiziert wurden.

In vitro Transkription

Die Plasmide T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (Fig. 13), T7/crTMV/ IRES_MP,75 ^UI-GUS (Fig. 13), T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (Fig. 13), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (Fig. 13), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI- GUS (Fig. 13) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (Fig. 13) wurden mit Not I linearisiert. Die rekombinanten Plasmide wurden gemäß Dawson et al. (1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832-1836) in vitro transkribiert. Agarosegelelektrophorese der RNS-Transkripte bestätigte, daß diese intakt waren. Die RNS-Konzentration wurde mittels Agarosegelelektrophorese und Spektrophotometrie quantifiziert.

GUS-Detektion

Inokulierte Blätter wurden 10-14 Tage nach der Transfektion mit geschützten (capped) voll-Länge- Transkripten geerntet. IRES-Aktivität wurde mittels histochemischer Detektion der GUS-Expression wie bei Jefferson beschrieben verfolgt (1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387-405). Die Proben wurden mit dem kolorimetrischen GUS-Substrat infiltriert, wobei die Methode von De Block und Debrouwer (1992, Plant J. 2, 261-266) folgendermaßen modifiziert wurde, um die Diffusion der intermediären Produkte der Reaktion zu limitieren: 0,115 M Phosphatpuffer, pH 7,0 versetzt mit 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (x-Gluc) 600 µg/ml; 3 mM Kaliumferricyanid; 10 mM EDTA. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Blätter mit 70% Ethanol entfärbt und lichtmikroskopisch untersucht.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder Polypeptids in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen, umfassend

a) Transformieren oder Transfizieren einer Pflanze oder von Pflanzenzellen mit einer Nukleotidsequenz, die eine kodierende Region aufweist, die für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein das gewünschte Protein oder Polypeptid, ein Signalpeptid, welches das Fusionsprotein in den Apoplast leiten kann, und ein Polypeptid umfasst, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann,

b) Anreichern von Zellwandkomponenten, die exprimiertes und gebundenes Fusionsprotein aufweisen, und

c) Abtrennen des gewünschten Proteins oder Polypeptids oder eines Proteins, das das gewünschte Protein oder Polypeptid umfasst.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Anreichern von Zellwandkomponenten von Schritt (ii) mechanisches, physikalisches oder chemisches Abtrennen von Zellinhaltsstoffen umfasst.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an ein Polysaccharid der pflanzlichen Zellwand bindet.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an β-1,4 Glycan bindet.

5. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an Cellulose bindet.

6. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an Hemicellulose bindet.

7. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, an Pectin bindet.

8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Fusionsprotein eine Pectin- Methylesterase oder ein funktionelles Fragment derselben umfasst, die/das als das Signalpeptid und als das Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, wirkt.

9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Fusionsprotein die cysteinreiche Domäne des Proteins NtTLPR aus Tabak oder ein funktionelles Fragment desselben umfasst, das das Fusionsprotein kovalent an eine Zellwandkomponente binden kann.

10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das ferner die Spaltung des Fusionsproteins umfasst, um das gewünschte Protein oder Polypeptid frei von dem Signalpeptid und/oder dem Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, zu erhalten.

11. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Fusionsprotein eine Spaltsequenz umfasst, die die Spaltung des Fusionsproteins erlaubt.

12. Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Spaltsequenz von einer ortsspezifischen Protease erkannt wird.

13. Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Spaltsequenz den C-terminalen Bereich von Ubiquitin umfasst.

14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Fusionsprotein das Signalpeptid an seinem N-terminalen Ende enthält gefolgt von dem Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, gefolgt von dem gewünschten Protein oder Polypeptid.

15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Fusionsprotein das Signalpeptid an seinem N-terminalen Ende enthält gefolgt von dem gewünschten Protein oder Polypeptid, gefolgt.

von dem Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann.

16. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Fusionsprotein das Signalpeptid an seinem N-terminalen Ende enthält, und wobei das gewünschte Protein oder Polypeptid auf beiden Seiten von einem Polypeptid, das das Fusionsprotein an eine Zellwandkomponente binden kann, flankiert wird.

17. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Nukleotidsequenz zur Transformation oder Transfektion einer Pflanze oder von Pflanzenzellen DNA ist.

18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Nukleotidsequenz zur Transformation oder Transfektion einer Pflanze oder von Pflanzenzellen RNA ist.

19. Vektor umfassend die Nukleotidsequenz, die für das Fusionsprotein kodiert, wie in einem der Ansprüche 1 bis 18 definiert.

20. Pflanzenzellen oder Pflanzen, die mit der für das Fusionsprotein kodierenden Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18 transformiert oder transfiziert sind.

21. Gewünschtes Protein oder Fusionsprotein, erhalten oder erhältlich gemäß dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 18.