JP4445765B2 - 細胞培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、種々の形状や大きさの三次元基材上に播種された細胞を、高い効率で、しかも高密度に培養することができる細胞培養装置に関する。

近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントである。通常、このような生体組織様構造体を製造する場合、組織又は器官の再生の足場になる三次元基材上に細胞を播種し、培養することが行われる。このようにして得られた生体組織様構造体を患者に移植すれば、生体組織様構造体が組織又は器官と同様の機能を発揮したり、生体組織様構造体を足場にして患者自身の組織又は器官が再生したりする。
一般に、ヒトの組織又は器官は、種々の細胞が細胞間物質を介して極めて高密度に集積した構造を有しており、再生医療に用いる生体組織様構造体でも、このような組織又は器官にできる限り近い構造が形成されていることが重要である。

一方、再生医療分野に限らず、例えば、化粧品や医薬品の研究等の用途にも大量の動物細胞が必要とされており、このような大量の細胞を得る手段として、三次元基材上に播種した細胞を高密度に培養した後、該三次元基材から細胞を剥離して回収することが試みられている。

これらのいずれの用途においても、三次元基材に播種された細胞を高密度に培養する方法が求められている。
従来の細胞培養法としては、例えば、細胞培養用フラスコの底面に細胞を接着させ、この細胞培養用フラスコに所定量の培養液を添加し、ＣＯ_２インキュベータ等内で静置して培養する静置培養法が挙げられる。しかし、静置培養法は、細胞培養用フラスコの底面を覆い尽くす程度までの細胞数を培養する場合しか想定していないものであった。細胞密度が極めて高く、大量の細胞を含有する生体組織様構造体を従来の静置培養法により培養すると、ごく短時間の間に培養液中に含まれる栄養成分が不足したり、細胞の分泌する老廃物によって培養液のｐＨが変動してしまい、細胞増殖速度が著しく制限されたり、場合によっては細胞が死滅してしまうことがあった。
これに対して、大量の培養液を用いたり、培養液の交換サイクルを短くしたりする等が考えられるが、このような方法によれば、大型の装置を要したり、微生物による汚染の生じる確率が格段に高くなる等の問題点があった。

また、三次元基材に播種された細胞は、最も環境の良い基材表面に付着し増殖した後に、コラーゲン等の細胞外マトリックスを分泌して三次元基材の表面を覆ってしまうことが多い。このように細胞外マトリックスにより覆われた三次元基材においては、培養液が三次元基材の内部にまでは供給されにくくなることから、細胞は基材の表面のみに留まって基材の内部にまでは侵入しなかったり、播種の段階では三次元基材の内部にまで均一に侵入していた細胞も培地からの栄養や酸素を受け取ることができず充分に増殖できなかったりして、期待したほどの高密度培養はできないという問題があった。

更に、とりわけ再生医療に用いるための生体組織様構造体を製造する場合には、移植の部位や目的によって種々の形状や大きさの三次元基材上で細胞を培養する必要があるところ、従来は画一的な形状、大きさのものを培養できる細胞培養装置しかないのが現状であった。従って、形状や大きさが異なる三次元基材上で細胞を培養をする場合には、各三次元基材ごとに細胞培養装置を新たに製造する必要があり、極めてコストパフォーマンスが悪い状況にあった。

本発明は、上記現状に鑑み、種々の形状や大きさの三次元基材上に播種された細胞を、高い効率で、しかも高密度に培養することができる細胞培養装置を提供することを目的とする。

本発明は、系内を循環する培養液を用いて三次元基材上に播種した細胞を培養する細胞培養装置であって、細胞が接着した三次元基材を担持する手段、培養液を循環させる手段、培養液中の気泡を脱泡する手段、並びに、培養液のｐＨ、溶存酸素濃度及び温度を調製する手段を有し、前記細胞が接着した三次元基材を担持する手段がユニット化されており、複数のユニットを着脱可能とした細胞培養装置である。
以下に本発明を詳述する。

本発明の細胞培養装置は、少なくとも、細胞が接着した三次元基材を担持する手段（以下、基材担持手段ともいう）、培養液を循環させる手段（以下、循環手段ともいう）、培養液中の気泡を脱泡する手段（以下、脱泡手段ともいう）、及び、培養液のｐＨ、溶存酸素濃度、温度を調製する手段（以下、培養液調整手段ともいう）を有する。

上記基材担持手段は、三次元基材が型崩れしないように保持できるものであれば特に限定されないが、目的とする細胞が播種された三次元基材と形状及び大きさが略同じである空隙部と、前記空隙部を挟んだ両端に培養液流入口と培養液流出部とが配置された構造を有するものが好ましい。基材保持手段の空隙部と三次元基材との形状及び大きさが同じでないと、培養液が選択的に基材保持手段と三次元基材との間にできた隙間を流れてしまうため、三次元基材内に充分に培養液が循環しなくなってしまうことがある。
このような基材担持手段の１態様の断面を示す模式図を図１に示した。

図１に示した基材担持手段１は、三次元基材を配置するための空隙部２を有し、この空隙部２の両側にそれぞれ培養液流入口３と培養液流出口４とが配置されたホルダー状のものである。図１に示した基材担持手段は、ネジ構造等により嵌合する構造となっており、これを開閉することにより細胞を播種した三次元基材を空隙部２中に配置することができる。また、空隙部２においては、配置した三次元基材が型崩れしないようにスペーサ１０を介して２枚のサポートフィルタ１１に三次元基材を挟み込めるようにしておいてもよい。
図１に示した基材担持手段１において、空隙部２の形状及び大きさを目的とする三次元基材と同一とすれば、培養液流入口３から流入した培養液は、強制的に三次元基材の内部を通過して培養液流出口４から流出する。従って、三次元基材の内部にまで確実に培養液が循環することから、高い効率で、しかも高密度に細胞を増殖させることができる。

なお、本発明の細胞培養装置において、上記基材担持手段はいずれの向きに配置しても構わないが、上記培養液流入口が下部に、上記培養液流出口が上部になるように配置することが好ましい。このように配置した場合には、より確実に三次元基材の内部に培養液を通過させることができる。

本発明の細胞培養装置は、上記基材担持手段がユニット化されており、複数のユニットが着脱可能である。これにより、形状や大きさの異なる複数の三次元基材に接着した細胞を、１つの装置で同時に培養することができる。また、特殊な形状の三次元基材上で細胞を培養する場合でも、この基材担持手段のみを作製すれば直ちに本発明の細胞培養装置で培養することができ、極めてコストパフォーマンスに優れる。
上記ユニット化された基材担持手段の１例を示す模式図を図２に示した。
図２に示したユニット５では、基材担持手段１の他、後述する脱泡手段６も含まれる。培養液は脱泡手段６を通して脱泡された後、培養液流入口３を通って基材担持手段１に流入し、空隙部２に設置された細胞が播種された三次元基材中を通過した後、培養液流出口４から流出する。図２に示したユニット５は、スライド式に細胞培養装置に装着できるようになっていることから、装着操作も極めて容易である。
本発明の細胞培養装置は、このようなユニットを複数着脱することができる。

上記循環手段としては、一定量の培養液を正確に循環させることができるものであれば特に限定されないが、低流量の培養液を安定して循環させることができることからチューブポンプが好適である。上記チューブポンプとしては、通常市販されているものを用いることができる。また、脈流等の規則的な変動流で培養液を循環させるために、プログラマブルポンプやダブルプランジャータイプのポンプを用いることもできる。
なお、チューブポンプを用いて培養液を循環させる場合、各々のチューブは上記基材担持手段に１つずつ接続されることが好ましい。これにより、上記基材担持手段に供給される培養液の流量をより正確に制御することができる。

上記脱泡手段としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、適当な容量の液溜まり部分に培養液を導き、液溜まりの上部に溜まった気泡を外部に放出させる方法等が簡便で好ましい。

上記培養液調整手段としては特に限定されないが、例えば、二酸化炭素及び酸素濃度が調整されたガスを供給する手段等が好ましい。通常、培養液は緩衝機能を有する緩衝液とされていることから、細胞の分泌する老廃物によって培養液のｐＨが変動したり、細胞によって培養液中の酸素が消費されてしまったりした場合でも、二酸化炭素及び酸素濃度が調整されたガスを供給することにより容易にそのｐＨを生理的なｐＨに調整し、また、酸素を溶解することができる。特に、二酸化炭素及び酸素濃度が調整されたガスとして加湿されたガスを用いれば、培養液からの水分の蒸発を抑制することができることから好ましい。
また、培養液の温度を調整する手段としては、培養液のみをヒーター等を用いて加温してもよいが、装置自体を極めてコンパクトにできることから、装置全体を市販のインキュベータ中に設置することにより温度調整してもよい。

上記培養液調整手段が二酸化炭素及び酸素濃度が調整されたガスを供給する手段である場合、循環している培養液に直接二酸化炭素及び酸素濃度が調整され、加湿されたガスを吹き込んでもよいが、培養液に大量の気泡が発生してしまうことがある。そこで、本発明の細胞培養装置に、培養液貯留槽を設け、この培養液貯留槽の気相中に二酸化炭素及び酸素濃度が調整されたガスを吹き込みようにすれば、培養液の気液界面においてガス交換して、気泡を生じることなく培養液のｐＨを調整することができることから好ましい。

本発明の細胞培養装置は、更に、培養液の流量を測定する流量計、培養液中の固体状の老廃物を取り除くためのフィルタ、培養液の流れを制御する集合管や分配管；培養液のｐＨ、溶存酸素濃度、温度等をモニターするためのセンサー；培養液交換を容易にするための予備培養液貯留槽及びその流路切り替え弁、培養液サンプリングポート、運転中に基材担持手段を交換するためのバイパス切替バブル等を有していてもよい。

本発明の細胞培養装置の概念図を図３に示した。
図３に示した細胞培養装置では、培養液貯留槽８に貯留された培養液をチューブポンプ７により輸液して、脱泡手段６を通した後、基材担持手段１中の細胞が播種された三次元基材に供給する。基材担持手段１から流出した培養液は、再び培養液貯留槽８に戻される。培養液貯留槽８では、二酸化炭素含有ガスが吹き込まれ、老廃物等により変動した培養液のｐＨが調製される。

本発明の細胞培養装置の一実施態様を示す模式図を図４に示した。
図４に示した本発明の細胞培養装置では、基材担持手段と脱泡手段（フィルタ）とを有するユニット５が６ユニット装着されており、チューブポンプ７により培養液が循環されている。細胞培養装置全体はインキュベータ９中に設置されていることから、全体の温度を極めて正確に制御することができる。

本発明の細胞培養装置によれば、三次元基材に播種された細胞を極めて高い効率で、しかも高密度に培養することが可能である。また、用いる三次元基材の形状及び大きさにあわせて基材担持手段を準備するだけで、種々の形状、大きさを有する三次元基材に播種された細胞を培養することができる。更に、ユニット化された基材担持手段を着脱するだけで、複数の形状等の異なる三次元基材に播種された細胞を自由に培養することができる。
本発明の細胞培養装置は、全体を一括して、又は、ユニット毎にオートクレーブ滅菌することができることから、滅菌等の保守も容易である。更に、装置全体を極めてコンパクトにまとめることができる。

本発明によれば、種々の形状や大きさの三次元基材上に播種された細胞を、高い効率で、しかも高密度に培養することができる細胞培養装置を提供することができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
空隙部２が直径１５ｍｍ、厚さ２ｍｍの円盤状となるように図１に示したような基材担持手段１を作製し、これと孔径３２０μｍのサポートフィルタとを組み合わせて図２に示したようなユニットを作製し、このユニットが６つ装着された図４に示した細胞培養装置を作製した。なお、細胞培養装置は、全体をインキュベータ中に置き、３７℃の温度に保温した。

繊維径１２μｍのポリグリコール酸（ＰＧＡ）からなる不織布を、直径１５ｍｍ、厚さ２ｍｍの円盤状に加工し、これを三次元培養基材として、ラット骨髄未分化間葉系幹細胞約８８００００ｃｅｌｌｓを震盪法（１２時間）により播種した。このような細胞が播種された三次元基材を５つ準備した。
細胞は、震盪播種法により基材に完全に接着させた後、各々を基材担持手段１の空隙部２中に配置して細胞培養装置に供した。

培養液貯留槽８に貯留した培養液（α−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）＋１５％ウシ胎児血清(ハイクローン・ラボラトリーズ社製)）１２５ｍＬを輸液ポンプ７により分割輸液して細胞が播種された三次元基材に供給しながら、３日間培養を行った。

培養終了後、各三次元基材を取り出し、その4つについてＤＮＡ定量法により三次元基材中の細胞数を測定した。結果を表１に示した。
また、三次元基材の１つをホルマリン固定した後、パラフィン包埋し、その中央部を切断した切片を作製した。この切片のヘマトキシリン−エオシン染色像を図５ａに示した。図５ａより、細胞は三次元基材の内部にまで均一に増殖していることが判った。

（比較例１）
実施例１と同様の方法によりラット骨髄未分化間葉系幹細胞を播種した三次元基材（ＰＧＡ不織布）を5つ準備した。
これらの三次元基材を、培養液（α−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）＋１５％ウシ胎児血清(ハイクローン・ラボラトリーズ社製)）２５ｍＬを入れた細胞培養用１００ｍｍディッシュに個々に入れ、５％ＣＯ_２、３７℃に調整したインキュベータ中で３日間静置培養した。

培養終了後、各三次元基材を取り出し、その4つについてＤＮＡ定量法により三次元基材中の細胞数を測定した。結果を表１に示した。
また、三次元基材の１つをホルマリン固定した後、パラフィン包埋し、その中央部を切断した切片を作製した。この切片のヘマトキシリン−エオシン染色像を図５ｂに示した。図５ｂより、細胞は三次元基材の表面でのみ増殖しており、基材の内部にはほとんど侵入していないことが判った。

本発明によれば、種々の形状や大きさの三次元基材上に播種された細胞を、高い効率で、しかも高密度に培養することができる細胞培養装置を提供することができる。

基材担持手段の１態様の断面を示す模式図である。 ユニット化された基材担持手段の１例を示す模式図である。 本発明の細胞培養装置の概念図である。 本発明の細胞培養装置の一実施態様を示す模式図である。 実施例１（ａ）及び比較例１（ｂ）で得られた細胞を播種した三次元基材の断面のＨＥ染色像である。

符号の説明

１ 基材担持手段
２ 空隙部
３ 培養液流入口
４ 培養液流出口
５ ユニット
６ 脱泡手段
７ チューブポンプ
８ 培養液貯留槽
９ インキュベータ
１０ スペーサ
１１ サポートフィルタ

Claims (2)

1. 系内を循環する培養液を用いて三次元基材上に播種した細胞を培養する細胞培養装置であって、
   細胞が接着した三次元基材を担持する手段、培養液を循環させる手段、培養液中の気泡を脱泡する手段、並びに、培養液のｐＨ、溶存酸素濃度及び温度を調整する手段を有し、
   前記細胞が接着した三次元基材を担持する手段は、ユニット化されており、複数のユニットを着脱可能とし、かつ、
   前記細胞が接着した三次元基材を担持する手段は、目的とする細胞が接着した三次元基材と形状及び大きさが略同じである空隙部と、前記空隙部を挟んで両端に配置された培養液流入口と培養液流出部とを有する
   ことを特徴とする細胞培養装置。
2. 培養液のｐＨ、溶存酸素濃度を調整する手段は、二酸化炭素及び酸素濃度が調整され、加湿されたガスを供給する手段であることを特徴とする請求項１記載の細胞培養装置。

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