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CN109906267B - 微型生物反应器组件 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于细胞(特别是干细胞)的三维培养的微型生物反应器组件。所述微型生物反应器旨在一次性使用，在本发明的一个实施方案中，可以用作多微型生物反应器。

Description

微型生物反应器组件
背景技术
干细胞的使用在医学研究中(特别是在再生医学领域)变得越来越重要。在药物研究和化妆品工业中，干细胞的培养也用于一些领域以进行例如ADME/Tox研究，即测试新的潜在活性物质在吸收、分布、代谢、排泄和毒性方面的性质。
胚胎和所谓的诱导多能干细胞的特征在于它们几乎无限的自我更新、增殖和分化潜力，在细胞培养中同样。然而，用于培养的专门方法和装置在可靠地指导分化成某种组织类型并且同时防止不期望的恶性肿瘤形成中起决定性作用(参见Lutolf，M.P.；Gilbert，P.M.；Blau，H.M.，Designing materials to direct stem-cell fate.Nature 2009,462(7272),433-441)。
特别是对于在再生医学中的使用，对体外获得的表现出高度一致的质量的细胞材料有很高的兴趣，因此对保证干细胞在控制的条件下长期培养和长期分化以及理想地实现过程自动化或至少使过程并行化的标准化细胞培养方法有很大的需求。
因此，人们强烈地寻求从多能干细胞靶向培养不同细胞类型的解决方案。首先，已经开发了用于组织生产的部分非常复杂的可能性和装置。特别地，使用所谓的器官芯片，其能够培养例如肺、肝、心脏、皮肤或支气管组织(参见Lang,Q.；Ren,Y.；Wu,Y.；Guo,Y.；Zhao,X.；Tao,Y.；Liu,J.；Zhao,H.；Lei,L.；Jiang,H.,A multifunctional resealableperfusion chip for cell culture and tissue engineering.RSC Advances 2016,6(32),27183-27190)。
在体内，可以在身体的组织特异性干细胞龛(niche)中发现干细胞。在这样的龛中，干细胞不仅是物理结合的，而且龛的特殊微环境通过其生化过程的调节网络和趋化因子、细胞因子、生长因子、跨膜受体以及细胞外基质诱导的信号决定干细胞的发育。因此，对于体外培养干细胞，正在尝试人工模拟干细胞龛的微环境(参见Lutolf,M.P.；Gilbert,P.M.；Blau,H.M.，Designing materials to direct stem-cell fate.Nature 2009,462(7272)，433-441)。
当模拟干细胞龛的自然环境时，除了细胞微环境之外，其他细胞类型以及培养基中的梯度和浓度梯度对于该过程的有效性起着至关重要的作用。
EP 2 181 188 B1公开了一种微型生物反应器，其被布置为微流体系统并且适合于培养高级细胞培养物，尤其是3D细胞培养物和干细胞培养物。一个特殊的特征是构建用于灌注微型生物反应器的培养基回路。其上发生细胞生长的样品载体是一个或多个堆叠在一起的3D细胞芯片。在微量滴定板上布置几个相互独立的微型生物反应器使得可以使用多微型生物反应器，尤其是用于高通量筛选。
US2011/0136226A1公开了一种人造干细胞龛，其包括旋转培养室，其中附连有带有间充质结缔组织干细胞的支架，在所述支架上培养脐带血干细胞。培养室通过流体供应系统供应，其中营养物供应和气体和废物交换通过透析膜发生，第二流体系统使得能够从培养室内的悬浮液中收获细胞。
US2011/0207166A1公开了一种人造微环境，其相当于骨髓微环境中的龛的复制品，其由包覆有间充质干细胞的支架和能够使干细胞增殖进入培养物的培养基组成。人工龛适用于培养造血细胞和白血病细胞。支架由网状、可膨胀基质组成，该基质由弹性体材料制成，例如，聚碳酸酯或聚氨酯。
然而，上述公知的生物反应器都具有其结构非常复杂的缺点，因此在容易处理、生产和特别是用作一次性系统的用途方面受到限制。
DE 10 2014 001 615.3公开了一种用于培养贴壁细胞的装置，其在连续过程中作为一次性系统操作。该装置的一个特殊特征是通过水平和垂直的垫形泵元件使反应器容器中的培养基均质化，每个泵元件由压缩空气操作。相应的流动分布器确保均匀混合。培养基的气体处理通过半透膜软管进行。然而，该装置的缺点在于它仅设计用于培养贴壁细胞，而不是具有特殊要求的干细胞。
US4649117A公开了一种反应器，其可用作用于培养细胞的发酵罐，其中通过使反应器由内室和外室组成并且从下面中央引入温和气流来实现特别地无剪切力混合。然而，该反应器不适合培养贴壁细胞或干细胞，因为没有提供相应的生长区域。
发明内容
本发明的目的是利用已知装置的优点，以避免缺点并为干细胞培养的问题提供更简单、灵活可用的解决方案。根据本发明的微型生物反应器组件可以有利地用作一次性系统。在共同的或分开的培养室中平行布置几个组件允许用作多微型生物反应器。在作为多微型生物反应器的布置中，根据本发明的微型生物反应器组件由于其限定和可控的微环境而特别适用于筛选和选择最佳培养条件。
附图说明
为了更好地理解本发明，将使用以下附图中所示的实施方案更详细地解释本发明。相同的部件设有相同的参考标记和相同的部件名称。此外，来自所示出和描述的不同实施方案的一些特征或特征组合可以表示根据本发明的独立解决方案、发明解决方案或解决方案。
相关附图显示于：
图1是微型生物反应器组件的示意图，其中干细胞的培养在培养容器(1)中进行。
图2是多微型生物反应器的示意图，其中根据DE 10 2014 001 615.3将几个微型生物反应器组件引入培养室。
图3是盖(11)的平面图的示意图，其中除了向上开口的数量的组件槽(17)之外，还有用于探针(18)的多个连接选项，这使得能够在反应器容器(12)中的多个位置处进行在线过程控制。
图4是微型生物反应器组件的示意图，其中通过对应于鼓泡塔或环管反应器的装置确保反应器容器(12)中的培养基的混合。
图5是包含根据本发明的组件的按比例放大的生物反应器的示意图。
图6是按比例放大的生物反应器的侧视图的示意图，其中透气气囊位于培养容器的内部。
图7是按比例放大的生物反应器的正视图和侧视图的示意图。
图8是按比例放大的生物反应器的示意图，其中，左图显示了没有主动式空气供给的状态(在反应器中超压)，右图显示了具有主动式空气供给的状态，其可以用于尤其是模拟血压(心脏收缩和心脏舒张)。
图9显示了具有大生长表面的按比例放大的培养单元的示意图。
具体实施方式
图1显示了微型生物反应器组件，其中干细胞培养在模拟干细胞龛的微环境的培养容器(1)中进行。微型生物反应器组件的培养容器(1)由半渗透性天然或合成膜材料的一个袋组成，因此可以与环境交换小分子，例如氨基酸或葡萄糖，但细胞培养物是物理固定的。培养容器(1)配备有生物相容性载体材料或支架(优选有机或无机聚合物材料)，并且还可以用于与间充质干细胞共培养，例如，通过适当定植的载体。
培养容器(1)连接到优选由塑料制成的透气安装管(2)上，该透气安装管(2)另一端终止于由塑料、橡胶或硅树脂制成的塞(3)中。塞(3)的厚度不对称。在一个优选的实施方案中，透气安装管(2)由弹性或半弹性材料制成。
在安装管(2)内部有排放和供应管线(4)，其允许接种细胞、提供生物活性分子和营养物以及取样。在一个优选的实施方案中，排放和供应管线(4)由弹性或半弹性材料制成。
管线(4)在塞(3)的上侧上在带有螺纹的连接件(5)中终止，该连接件(5)用作用于安装的适配器，例如用于安装注射器(6)，通过其控制物质、培养基和细胞的供应和排放。连接件(5)中的管线(4)的开口设置有弹性闭合材料，该弹性闭合材料允许用安装的注射器(6)刺穿并在移除注射器(6)时闭合。
将芯片与塞一起插入向下开口的护套(7)中。护套(7)在侧壁上总共具有三个开口。两个开口位于塞(3)的高度处，另一个位于护套(7)的下三分之一处。通流开口(8)设置有挡板(9)，挡板(9)根据外部培养基的流动方向打开或关闭。第三个开口没有这样的挡板，并且用作产生废物(例如，不需要的代谢物)的排放口(10)。塞(3)的不对称厚度及其状况允许通过旋转护套(7)中的塞(3)来有目的地打开或关闭通流开口(8)或废物排放口(10)。护套(7)优选地由半弹性塑料材料构成。
可以通过经由排放和供应管线(4)的部分移出来收获培养的细胞以进行连续过程控制，或者可以通过将培养容器(1)与安装管(2)分离来收获培养的细胞。
根据本发明的微型生物反应器单元可以用于各种培养系统。该单元平行于装置的相应主流动方向插入，以确保通流开口(8)根据本发明起作用。
图2显示了多微型生物反应器，其中根据DE 10 2014 001 615.3将几个微型生物反应器组件放置在培养室中。在该优选的实施方案中，将根据本发明的一个或多个不同的微型生物反应器组件平行地固定在塑料盖(11)中设有密封件的开口中，并插入可更换的反应器容器(12)中。在填充有培养基的反应器容器(12)中，通过位于底部的压缩空气驱动的泵元件(13)实现均匀、温和且无剪切力的均质化。均质化的流动方向平行于微型生物反应器组件的方向延伸，均质化由作为流动分布器(14)的孔板加强。半透膜软管(15)能够使反应器容器中的培养基无气泡化气体处理。通过将反应器容器(12)引入加热元件(16)中可以实现温度控制，其中加热元件(16)优选仅覆盖反应器容器(12)的下端，从而在反应器容器(12)内发生最小的垂直温度梯度。
各个微型生物反应器组件中的生长条件可以单独调整。各个培养容器(1)中的营养物的组成可以通过各个组件的各自的排放和供应管线(4)来调整，各个培养容器(1)可以配备不同载体材料和细胞培养物。微型生物反应器组件的长度可以变化，因此可以实现在反应器容器(12)中的培养基中的不同浸入深度。因此，可以用探针测量关于温度(对应于垂直温度梯度)和压力(对应于流体静压力)的生长条件并且生长条件可以个性化。
图3示出了盖(11)的顶视图，其中除了向上开口的数量的组件槽(17)之外，还设置有用于探针(18)的多个连接选项，使得能够在反应器容器(12)中的多个位置处进行在线过程控制。
单个反应器容器(12)中的个体微型生物反应器组件的数量仅受反应器容器的尺寸限制，其中单个组件的体积也可以从微升级到毫升级变化。
图4显示了用于应用根据本发明的微型生物反应器组件的反应器容器的另一种可能的设计，其中通过对应于鼓泡塔或环管反应器的装置确保反应器容器(12)中的培养基的混合。具有布置成栅格样的小开口的向上开口的板用作气泡发生器(19)，压缩空气通过压缩空气源(20)脉动地流过该气泡发生器。盖(11)在密封件(24)处连接到反应器容器(12)并且对应于图1-3中的布置，但另外包含减压阀(23)。由气泡发生器(19)产生的气泡在垂直方向上产生混合流，该混合流在内部反应器壳体(21)内向上流动，该内部反应器壳体(21)在顶部和底部开口并通过安装支架(22)固定到反应器容器上。在内部反应器壳体(21)和反应器容器(12)之间的空间中，发生相应的逆流。多余的空气通过减压阀(23)传递到外面。减压阀(23)的打开和关闭伴随着压缩空气的脉动供应，使得在供应空气期间增加的压力被松弛阶段所取代。通过类似于图1-3中所示的优选实施方案，将一个或多个微型生物反应器组件平行于流动方向引入到盖(11)中。
在一个优选的实施方案中，微型生物反应器组件用于筛选适合于待培养的各自细胞类型的微环境。优化了不同生长因子的组成和浓度、细胞外基质因子的存在、溶解氧浓度、pH值、渗透压和营养物的连续供应以及代谢物的去除。
另一个优选的实施方案是按比例放大版本的生物反应器，其允许在优化条件下大规模培养所需的细胞类型。图5-9显示了按比例放大的生物反应器的示意图。按比例放大的生物反应器包含一个或多个根据本发明的组件，其包含更大的体积，因此能够在优化的、受控的和可再现的条件下实现高的细胞产量。微型生物反应器中的三维培养允许快速转化为生产和简单的放大工艺。此外，培养期间的可控参数允许容易和温和的细胞收获。
在另一个实施方案中，由于可控的培养条件，按比例放大的生物反应器能够进行连续发酵。在一个实施方案中，按比例放大的生物反应器在培养容器(1)的上方和下方具有气泡发生器(19)。
一般的微型生物反应器组件和特别是按比例放大的生物反应器的另一个优点是可以改变培养容器中的压力，从而模拟例如个体体内随着心脏收缩和心脏舒张(血压120/60mmHg，即1160/60毫巴)变化的血压。在微型生物反应器组件中，这可以通过压缩空气供应源(20)和气泡发生器(19)实现。在按比例放大的生物反应器中，在培养容器中有透气气囊(25)，其通过改变气囊中的体积和压力在培养容器中模拟脉动血液的脉动物理特性。这伴随着培养容器内的均质化。此外，通过在培养容器的表面上产生的压力梯度促进物质交换以及氧交换。气囊还具有能够进行二氧化碳(CO2)和铵(NH4)的气体交换的优点。
参考数字列表
1：培养容器
2：安装管
3：塞
4：排放和供应管线
5：连接件
6：注射器
7：护套
8：通流开口
9：挡板
10：排放口
11：盖
12：反应器容器
13：泵元件
14：流动分布器
15：膜软管
16：加热元件
17：组件槽
18：探针
19：气泡发生器
20：压缩空气源
21：内部反应器壳体
22：安装支架
23：减压阀
24：密封件
25：透气气囊

Claims (12)

1.微型生物反应器组件，其包括培养容器(1)、安装管(2)、不对称塞(3)和护套(7)，所述微型生物反应器组件的特征在于：
·所述培养容器(1)具有包围生物相容性载体材料或支架的半透膜材料的外壳，
·所述安装管(2)连接到所述培养容器上并包围排放和供应管线，所述排放和供应管线允许取样并且允许将细胞或生物活性分子和营养物供应到所述培养容器，
·所述不对称塞(3)具有不对称长度，突出到所述微型生物反应器组件的护套(7)内部，将所述安装管(2)固定在护套(7)上端的开口中，并通过与所述护套(7)接触将所述微型生物反应器组件相对于外部密封，并且根据定位打开或关闭所述护套的壁上的开口。
2.根据权利要求1所述的微型生物反应器组件，其特征在于：所述培养容器(1)的外壳由半渗透天然或合成膜材料的袋组成。
3.根据权利要求1或2所述的微型生物反应器组件，其特征在于：所述培养容器(1)配备有生物相容性载体材料或支架。
4.根据权利要求3所述的微型生物反应器组件，其特征在于：所述安装管(2)、所述排放和供应管线(4)以及所述护套(7)由弹性、透气的材料组成，并且所述护套包括多个通流开口(8)，所述通流开口(8)能够通过挡板(9)关闭。
5.根据权利要求4所述的微型生物反应器组件，其特征在于：所述载体材料或所述支架包覆有干细胞。
6.根据权利要求5所述的微型生物反应器组件，其特征在于：所述载体材料或所述支架包覆有间充质干细胞。
7.根据权利要求1至2和4至6中任一项所述的微型生物反应器组件，其特征在于：所述培养容器包含透气气囊。
8.多微型生物反应器，其包括一个或多个根据权利要求1-7中任一项所述的微型生物反应器组件，所述微型生物反应器组件平行布置并引入共同的培养室；各个微型生物反应器组件中的生长条件能够通过所述培养容器中的组成和供应以及所述组件的长度分别调整。
9.根据权利要求8所述的多微型生物反应器，其特征在于：一个或多个微型生物反应器组件固定在共同的塑料盖(11)中，所述盖(11)中还设置有用于测量探针(18)的连接选项和任选的减压阀(23)。
10.根据权利要求8或9所述的多微型生物反应器，其特征在于：所述共同的培养室是填充有培养基的反应器容器(12)，其中通过由压缩空气操作的泵元件(13)结合流动分布器(14)确保均质化。
11.根据权利要求10所述的多微型生物反应器，其特征在于：所述共同的培养室是填充有培养基的反应器容器，其中通过使脉动压缩空气穿过以栅格样模式布置的孔的方式向上开口的板以此通过气泡发生器(19)实现均质化。
12.根据权利要求8、9和11中任一项所述的多微型生物反应器，其特征在于：通过安装支架(22)将向上和向下开口的内部反应器壳体(21)固定在所述反应器容器(12)的内部，从而实现在培养基中的流动循环。
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