JP4328525B2 - 可溶性ｃｔｌａ４突然変異体分子およびその用途 - Google Patents
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Description
【０００１】
本願明細書では様々な刊行物を参照する。これらの刊行物の内容は、本発明が属する技術分野の水準をより詳しく説明するために、参照によりそのまま本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はCD80および/またはCD86を結合する能力が維持されるように野生型CTLA4から突然変異させた可溶性CTLA4分子の分野に関する。
【０００３】
（発明の背景）
Tリンパ球と抗原提示細胞（APC）とが抗原非特異的に細胞間相互作用すると、抗原に対するT細胞応答をもたらすT細胞共刺激シグナルが生じる（JenkinsおよびJohnson（1993）Curr.Opin.Immunol. 5:361-367）。共刺激シグナルは抗原に対するT細胞応答の強度と、その応答が抗原に対するそれ以降の応答を活性化するか不活化するかを決定する（Muellerら（1989）Annu.Rev.Immunol. 7:445-480）。
【０００４】
共刺激の不在下でT細胞の活性化が起こると、T細胞応答は中止されるか、またはアネルギー状態になる（Schwartz,R.H.（1992）Cell 71:1065-1068）。重要な共刺激シグナルの一つはT細胞表面レセプターCD28と抗原提示細胞上のB7関連分子（例えば、それぞれB7-1とB7-2またはC80とCD86と呼ばれる分子）との相互作用によって生じる（P.LinsleyおよびJ.Ledbetter（1993）Annu.Rev.Immunol. 11:191-212）。
【０００５】
現在CD80（B7-1）と呼ばれている分子は、元々はヒトB細胞関連活性化抗原として記載された分子であり（Yokochi,T.ら（1981）J.Immunol. 128:823-827；Freeman,G.J.ら（1989）J.Immunol. 143:2714-2722）、その後、関連するT細胞分子CD28およびCTLA4のカウンターレセプターであることが確認された（Linsley,P.ら（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5031-5035；Linsley,P.S.ら（1991a）J.Exp.Med. 173:721-730；Linsley,P.S.ら（1991b）J.Exp.Med. 174:561-570）。
【０００６】
さらに最近になって、CTLA4のもう一つのカウンターレセプターが抗原提示細胞上に同定された（Azuma,N.ら（1993）Nature 366:76-79；Freeman（1993a）Science 262:909-911；Freeman,G.J.ら（1993b）J.Exp.Med. 178:2185-2192；Hathcock,K.L.S.ら（1994）J.Exp.Med. 180:631-640；Lenschow,D.J.ら（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11054-11058；Ravi-Wolf,Z.ら（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11182-11186; Wu,Y.ら（1993）J.Exp.Med. 178:1789-1793）。この分子は現在、CD86（Caux,C.ら（1994）J.Exp.Med. 180:1841-1848）と呼ばれているが、B7-0（Azumaら（1993）前掲)またはB7-2（Freemanら（1993a）前掲）とも呼ばれ、その細胞外領域は、CD80と約25％の配列一致度を持っている（Azumaら（1993）前掲；Freemanら（1993a）前掲；同（1993b）前掲）。CD86トランスフェクト細胞は、C28が媒介するT細胞応答をトリガーする（Azumaら（1993）前掲；Freemanら（1993a)(1993b）前掲）。
【０００７】
CD80とCD86の発現の比較はいくつかの研究の主題になっている（Azumaら（1993）前掲；Hathcockら（1994）前掲；Larsen,C.P.ら（1994）J.Immunol. 152:5208-5219；Stack,R.M.ら（1994）J.Immunol. 152:5723-5733）。最新のデータは、CD80とCD86の発現が異なる調節を受けることを示しており、免疫応答に際してCD86発現はCD80発現に先だって起こる傾向があることを示唆している。
【０００８】
可溶型のCD28およびCTLA4は、CD28およびCTLA4の可変領域（v）様細胞外ドメインを免疫グロブリン（Ig）定常ドメインに融合してCD28IgおよびCTLA4Igを得ることによって構築されている。CTLA4IgはCD80陽性細胞にもCD86陽性細胞にもCD28Igより強く結合する（Linsley,P.ら（1994）Immunity 1:793-80）。インビトロでもインビボでも多くのT細胞依存性免疫応答がCTLA4Igによって遮断される（Linsleyら（1991b）前掲；Linsley,P.S.ら（1992a）Science 257:792-795；Linsley,P.S.ら（1992b）J.Exp.Med. 176:1595-1604；Lenschow,D.J.ら（1992）Science 257:789-792；Tan,P.ら（1992）J.Exp.Med. 177:165-173；Turka,L.A.(1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11102-11105）。
【０００９】
Peachら（J.Exp.Med.（1994）180:2049-2058）は、CTLA4の細胞外ドメインのなかで、CD80への強い結合にとって重要な領域を同定した。具体的に述べると、相補性決定領域3（CDR3）様領域中のヘキサペプチドモチーフ（MYPPPY）は、全てのCD28およびCTLA4ファミリーメンバーで、完全に保存されていることが確認された。CTLA4中のMYPPPYモチーフおよびCD28Ig中の選択した残基にアラニンスキャニング法によって突然変異を導入すると、CD80への結合が減少するか、または消失した。
【００１０】
CTLA4とCD28の相同領域を入れ替えたキメラ分子も構築された。HS4、HS4-AおよびHS4-BはCTLA4のCDR3様領域を移植することによって構築された分子である。CTLA4のCDR3様領域はカルボキシ末端に延長部分を持つので、CD28Igにいくつかの非保存アミノ酸残基が導入されることになる。これらの相同突然変異体はCD80に対してCD28Igよりも高い結合アビディティーを示した。
【００１１】
もう一つのキメラ相同突然変異体群では、空間的にCDR3様領域に隣接すると予測されCD28には保存されていないCTLA4のCDR1様領域が、HS4およびHS4-Aに移植された。これらのキメラ相同突然変異体分子（HS7およびHS8と呼ばれている）は、CD80に対してCD28Igよりもさらに高い結合アビディティーを示した。
【００１２】
HS7およびHS8にCTLA4のCDR2様領域を移植することによってさらにキメラ相同突然変異体分子が作製されたが、この組合わせではCD80に対する結合アビディティーは改善されなかった。したがって、CTLA4およびCD28のMYPPPYモチーフはCD80への結合にとって決定的な意味を持つと結論されたが、CTLA4のCDR1様領域中およびCDR3様領域中の非保存アミノ酸残基も、CTLA4のCD80との高い結合アビディティーの一因になっていた。
【００１３】
CTLA4IgはCD80に関係するT細胞共刺激を効果的に遮断することが明らかにされているが、CD86に関係する応答の遮断にはそれほど有効でない。抗原特異的活性化細胞のプライミングを遮断する能力がおそらくCTLA4Igより高い分子として、可溶性CTLA4突然変異体分子、特にCD86に対して野生型CTLA4より高いアビディティーを持つ分子を構築した。
【００１４】
既知の可溶型CTLA4より優れている免疫抑制用および癌処置用医薬組成物を得るために、改良されたCTLA4分子が依然として必要とされている。
【００１５】
（発明の要旨）
したがって本発明は、CD80および/またはCD86を結合する可溶性CTLA4突然変異体分子を提供する。本発明の突然変異体分子には、CD80もしくはCD86またはその両方を認識し結合することができるものが含まれる。一部の態様では、突然変異体分子は、CTLA4より高いアビディティーでCD80および/またはCD86を結合する。
【００１６】
CTLA4突然変異体分子の一例は本明細書に記載のL104EA29YIg（図7）である。CTLA4突然変異体分子のもう一つの例は本明細書に記載のL104EIg（図8）である。L104EA29YIgおよびL104EIgはCTLA4Igよりも強くCD80およびCD86を結合する。
【００１７】
（詳細な説明）
定義
本明細書で使用する以下の用語または表現は以下に指定する意味を持つ。
【００１８】
本明細書にいう「野生型CTLA4」は、CD80および/またはCD86を結合しかつ/またはCD80および/またはCD86がそのリガンドと結合するのを妨害する天然の完全長CTLA4（米国特許第5,434,131号、第5,844,095号、第5,851,795号）またはその細胞外ドメインのアミノ酸配列を持つ。具体的態様として、野生型CTLA4の細胞外ドメインは＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるか、または−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わる。野生型CTLA4はN末端の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびC末端の細胞質ドメインを持つ細胞表面タンパク質である。細胞外ドメインはCD80やCD86などの標的抗原に結合する。細胞では、天然の野生型CTLA4タンパク質はN末端にシグナルペプチドを持つ未成熟ポリペプチドとして翻訳される。この未成熟ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断および除去を含む翻訳後プロセシングを受けて、未成熟型のN末端とは異なる新たに生成したN末端を持つCTLA4切断産物をもたらす。さらなる翻訳後修飾が起こって、CTLA4切断産物の新たに生成したN末端から1または複数のアミノ酸が除去される場合もありうることは、当業者には理解されるだろう。成熟型のCTLA4分子にはCTLA4の細胞外ドメインまたはCD80および/またはCD86に結合するその一部が含まれる。
【００１９】
「CTLA4Ig」は、Igテールに接合された野生型CTLA4またはCD80および/またはCD86を結合するその一部を含む可溶性融合タンパク質である。ある態様は、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わる野生型CTLA4の細胞外ドメイン、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む（図9）。
【００２０】
本明細書にいう「融合タンパク質」は、米国特許第5,434,131号または第5,637,481号に記載されているような当技術分野周知の方法を使って一つに接合された1または複数のアミノ酸配列であると定義される。接合されたアミノ酸配列はその結果、一つの融合タンパク質を形成する。
【００２１】
本明細書にいう「CTLA4突然変異体分子」は、CTLA4（好ましくはCTLA4の細胞外ドメイン）に1または複数の突然変異を持っているため、野生型CTLA4分子に類似しているがもはや同一ではなく、完全長CTLA4であってもその一部（誘導体または断片）であってもよい分子である。CTLA4突然変異体分子はCD80もしくはCD86またはその両方を結合する。突然変異型CTLA4分子には、生物学的または化学的に活性な非CTLA4分子が含まれているか、または結合されていてもよい。突然変異体分子は可溶性（すなわち循環性）であってもよいし、表面に結合されていてもよい。CTLA4突然変異体分子はCTLA4の全細胞外ドメインまたはその一部、例えば断片もしくは誘導体を含むことができる。CTLA4突然変異体分子は合成法または組換え法で製造することができる。
【００２２】
本明細書で使用する用語「突然変異」とは、野生型ポリペプチドのヌクレオチド配列中またはアミノ酸配列中の変化をいう。この場合は野生型CTLA4細胞外ドメイン中の変化である。この変化は置換、欠失、付加または切断を含むアミノ酸変化であることができる。突然変異体分子は1または複数の突然変異を持つことができる。当技術分野ではよく知られているように、ヌクレオチド配列中の突然変異はアミノ酸配列の突然変異をもたらす場合もあるし、アミノ酸配列の突然変異をもたらさない場合もある。これに関連して、いくつかのヌクレオチドコドンは同じアミノ酸をコードする。例えばアミノ酸の一つアルギニン（R）をコードするヌクレオチドコドンCGU、CGG、CGCおよびCGA、またはアミノ酸の一つアスパラギン酸（D）をコードするコドンGAUおよびGACが、その例である。したがってあるタンパク質は、ヌクレオチド配列の詳細は異なっているがそれでもなお同じ配列を持つタンパク質分子をコードしている1または複数の核酸分子によってコードすることができる。アミノ酸コード配列は以下の通りである。
【表１】
【００２３】
本明細書にいう「CTLA4の細胞外ドメイン」は、CD80および/またはCD86を認識し結合するCTLA4の一部である。例えば、CTLA4のある細胞外ドメインは＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを含む（図9）。あるいは、CTLA4のある細胞外ドメインは、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを含む（図9）。細胞外ドメインにはCD80および/またはCD86を結合するCTLA4の断片または誘導体が包含される。
【００２４】
本明細書にいう「非CTLA4タンパク質配列」または「非CTLA4分子」は、CD80および/またはCD86を結合せず、CTLA4がその標的に結合するのを妨害しない任意の分子であると定義される。一例として免疫グロブリン（Ig）定常領域またはその一部が挙げられるが、これに限るわけではない。Ig定常領域は、好ましくは、ヒトまたはサルIg定常領域、例えばヒンジ、CH2およびCH3領域を含むヒトC(ガンマ)1である。Ig定常領域は、突然変異によってそのエフェクター機能を低下させることができる（米国特許第5,637,481号および第6,132,992号）。
【００２５】
本明細書にいう「CTLA4突然変異体分子の断片」は、標的（例えばCD80および/またはCD86）を認識し結合するCTLA4突然変異体分子の一部、好ましくはCTLA4の細胞外ドメインまたはその一部である。
【００２６】
本明細書にいう「CTLA4突然変異体分子の誘導体」は、CTLA4の細胞外ドメインと少なくとも70％の配列類似性を持ち、CTLA4の細胞外ドメインのように機能する（すなわちCD80および/またはCD86を認識し結合する）分子である。
【００２７】
本明細書にいう「CTLA4分子の一部」には、CD80および/またはCD86を結合するCTLA4分子の断片および誘導体が包含される。
【００２８】
本明細書に記載の発明をさらに詳しく理解することができるように、以下の説明を行う。
【００２９】
本発明の組成物
本発明はCD80および/またはCD86を認識し結合する可溶性CTLA4突然変異体分子を提供する。一部の態様では、本可溶性CTLA4突然変異体はCD80および/またはCD86に対してCTLA4Igより高いアビディティーを持つ。
【００３０】
CTLA4突然変異体分子の一例としてL104EA29YIgが挙げられる（図7）。L104EA29YIgのアミノ酸配列はアミノ酸位置−1のアラニンから始まって、アミノ酸位置＋357のリジンで終わることができる。もう一つの選択肢として、L104EA29YIgのアミノ酸配列はアミノ酸位置＋1のメチオニンから始まって、アミノ酸位置＋357のリジンで終わることもできる。L104EA29YIgのCTLA4部分はアミノ酸位置＋1のメチオニンからアミノ酸位置＋124のアスパラギン酸までを包含する。L104EA29YIgは、＋125位にある接合部アミノ酸残基グルタミンと、＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分とを含む（図7）。L104EA29YIgは野生型CTLA4Ig（以下CTLA4Igという）と比較してCD80には約2倍強く、またCD86には約4倍強く結合する。このように強く結合するため、L104EA29YIgは免疫応答の遮断にCTLA4Igより有効である。
【００３１】
CTLA4突然変異体分子は少なくともCTLA4の細胞外ドメインまたはCD80および/またはCD86を結合するその一部を含む。CTLA4突然変異体分子の細胞外部分は＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含む（図7または8）。もう一つの選択肢として、CTLA4の細胞外部分は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含んでもよい（図7または8）。
【００３２】
一態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、＋25のセリンから始まって＋33のアルギニンで終わるアミノ酸配列の一領域（S25〜R33）中に1または複数の突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば野生型CTLA4の＋29位のアラニンをチロシン（コドン：UAU、UAC）で置換することができる。あるいは、アラニンをロイシン（コドン：UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG）、フェニルアラニン（コドン：UUU、UUC）、トリプトファン（コドン：UGG）またはスレオニン（コドン：ACU、ACC、ACA、ACG）で置換することもできる。当業者には容易に理解できるだろうが、RNA配列のウラシル（U）ヌクレオチドはDNA配列のチミン（T）ヌクレオチドに相当する。
【００３３】
もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、＋97のメチオニンから始まって＋107のグリシンで終わるアミノ酸配列の一領域（M97〜G107）中またはその近傍に1または複数の突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば野生型CTLA4の＋104位にあるロイシンをグルタミン酸（コドン：GAA、GAG）で置換することができる。この置換を持つCTLA4突然変異体分子を本明細書ではL104EIgという（図8）。
【００３４】
さらにもう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、S25〜R33領域中およびM97〜G107領域中に1または複数の突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば一態様として、CTLA4突然変異体分子は＋29位にアラニンの代わりにチロシンを含み、＋104位にロイシンの代わりにグルタミン酸を含む。これらの置換を持つCTLA4突然変異体分子を本明細書ではL104EA29YIgという（図7）。L104EA29YIgをコードする核酸分子はpD16L104EA29YIgに含まれ、2000年6月19日にバージニア州20110-2209マナッサス・ユニバーシティブルバード10801のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託された（ATCC番号PTA-2104）。pD16L104EA29YIgベクターはpcDNA3ベクター（INVITROGEN）の誘導体である。
【００３５】
さらに本発明は、図7もしくは8に示すCTLA4突然変異体の細胞外ドメインまたはその一部と、CTLA4突然変異体分子の溶解性、アフィニティーおよび/または結合価を変化させる部分とを含む可溶性CTLA4突然変異体分子も提供する。
【００３６】
本発明の実施態様として、上記の部分は免疫グロブリン定常領域またはその一部とすることができる。生体内用途には、前記免疫グロブリン定常領域が対象の体内で有害な免疫応答を誘発しないことが好ましい。例えば臨床プロトコールでは、突然変異体分子がヒトまたはサル免疫グロブリン定常領域を含むことが好ましいだろう。適切な免疫グロブリン領域の一例は、ヒンジ、CH2およびCH3領域を含むヒトC(ガンマ)1である。他のアイソタイプも使用することができる。さらに他の免疫グロブリン定常領域（好ましくは免疫原性が弱いか免疫原性を持たない他の免疫グロブリン定常領域）も使用することができる。
【００３７】
上記部分の他の例として、ポリペプチドタグが挙げられる。適切なタグの例には、例えばp97分子、env gp120分子、E7分子、およびova分子などがあるが、これらに限るわけではない（Dash,B.ら（1994）J.Gen.Virol. 75:1389-97；Ikeda,T.ら（1994）Gene 138:193-6；Falk,K.ら（1993）Cell.Immunol. 150:447-52；Fujisaka,K.ら（1994）Virology 204:789-93）。他の分子をタグとして使用することもできる（Gerard,C.ら（1994）Neuroscience 62:721-739；Byrn,R.ら,J.Virol.（1989）63:4370-4375；Smith,D.ら（1987）Science 238:1704-1707；Lasky,L.（1996）Science 233:209-212）。
【００３８】
さらに本発明は、CD80および/またはCD86抗原に対して野生型CTLA4より反応性が高い可溶性突然変異型CTLA4Ig融合タンパク質を提供する。その一例は図7に示すL104EA29YIgである。
【００３９】
もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、CTLA4部分と免疫グロブリン部分との間に位置する接合部アミノ酸残基を含む。接合部アミノ酸はグルタミンを含めて、どのアミノ酸であってもよい。接合部アミノ酸は当技術分野で知られる分子法または化学合成法によって導入することができる。
【００４０】
もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、免疫グロブリン部分のヒンジドメイン内のシステイン残基の一部または全部、例えば＋130、＋136または＋139位のシステインが、セリンで置換されている免疫グロブリン部分（例えばヒンジ、CH2およびCH3ドメイン）を含む（図7または8）。突然変異体分子は図7または8に示すように＋148位のプロリンがセリンで置換されていてもよい。
【００４１】
可溶性CTLA4突然変異体分子は突然変異体分子のCTLA4部分の細胞外ドメインのN末端に結合したシグナルペプチドを持っていてもよい。シグナルペプチドは、例えばオンコスタチンM（Malikら（1989）Molec.Cell.Biol. 9:2847-2853）もしくはCD5（Jones,N.H.ら（1986）Nature 323:346-349）のシグナルペプチドまたは任意の細胞外タンパク質のシグナルペプチドなど、突然変異体分子の分泌を可能にする配列であればなんでもよい。
【００４２】
突然変異体分子は、CTLA4の細胞外ドメインのN末端に結合したオンコスタチンMシグナルペプチド、およびCTLA4の細胞外ドメインのC末端に結合したヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）を含むことができる。この分子は、−26位のメチオニンから−1位のアラニンまでのアミノ酸配列を包含するオンコスタチンMシグナルペプチド、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミンおよび＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでのアミノ酸配列を包含する免疫グロブリン部分を含む。
【００４３】
本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は分子法または化学合成法によって得ることができる。分子法には以下の工程が含まれるだろう：可溶性CTLA4突然変異体分子を発現させコードする核酸分子を適切な宿主細胞に導入する工程、核酸分子が導入された前記宿主細胞を、宿主細胞による前記突然変異体分子の発現が可能な条件で培養する工程、および発現した突然変異体分子を単離する工程。突然変異体分子のシグナルペプチド部分は、タンパク質分子が細胞表面に発現され、宿主細胞によって分泌されることを可能にする。翻訳された突然変異体分子は、シグナルペプチドの切断によるCTLA4部分および免疫グロブリン部分を持つ成熟タンパク質の生成を伴う翻訳後修飾を受けることができる。この切断が−1位のアラニンの後ろで起こると＋1位のメチオニンを第1アミノ酸とする成熟突然変異体分子が生成する（図7または8）。あるいは、この切断が−2位のメチオニンの後ろで起こると、−1位のアラニンを第1アミノ酸とする成熟突然変異体分子が生成する。
【００４４】
好ましい一態様は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）の全部または一部に結合したヒトCTLA4の細胞外ドメインを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子である。この好ましい分子は、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を包含する可溶性分子のCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋29位のアラニンがチロシンで置換され、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130、＋136および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異させてもよい。この突然変異体分子を本明細書ではL104EA29YIg（図7）と呼ぶ。
【００４５】
L104EA29YIgのもう一つの態様は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸（例えば＋126位から＋357位のリジンまで）を包含する免疫グロブリン部分を持つ突然変異体分子である。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋29位のアラニンがチロシンで置換され、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130、＋136および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異体分子を本明細書ではL104EA29YIg（図7）と呼ぶ。シグナル配列が切断されると、L104EA29YIgは＋1位のメチオニンから始まるか、または−1位のアラニンから始まることができる。
【００４６】
本発明のもう一つの突然変異体分子は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）に結合したヒトCTLA4の細胞外ドメインを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子である。この分子は、CTLA4をコードするアミノ酸配列のうち＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至る部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでのアミノ酸配列を包含する免疫グロブリン部分を含む。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子のヒンジ部分は、＋130、＋136および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異分子を本明細書ではL104EIgという（図8）。
【００４７】
もう一つの選択肢として、L104EIgの一態様は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）に結合したヒトCTLA4の細胞外ドメインを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子である。この好ましい分子は、−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至るアミノ酸配列を包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子のヒンジ部分は、＋130、＋136および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異体分子を本明細書ではL104EIgという（図8）。
【００４８】
さらに本発明は、（a）第2アミノ酸配列に融合された、T細胞増殖を遮断する膜糖タンパク質（例えばCD28、CD86、CD80、CD40およびgp39）の第1アミノ酸配列、（b）T細胞増殖を遮断する突然変異型CTLA4の細胞外ドメインの断片である第2アミノ酸配列、例えば＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを含むアミノ酸分子（図7または8）、および（c）識別タグとして働くまたは分子の溶解性を高める第3アミノ酸配列を持つ可溶性CTLA4突然変異体分子を提供する。例えば第3アミノ酸配列は、基本的に、非免疫原性免疫グロブリン分子のヒンジ、CH2およびCH3領域のアミノ酸残基からなることができる。適切な免疫グロブリン分子の例として、ヒトまたはサル免疫グロブリン、例えばC(ガンマ)1が挙げられるが、これに限るわけではない。他のアイソタイプも使用することができる。
【００４９】
さらに本発明は、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一態様として、本核酸分子はDNA（例えばcDNA）またはそのハイブリッドである。もう一つの選択肢として、本核酸分子はRNAまたはそのハイブリッドである。
【００５０】
さらに本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターも提供する。また宿主ベクター系も提供する。本宿主ベクター系は適切な宿主細胞に本発明のベクターを含んでなる。適切な宿主細胞の例としては原核細胞および真核細胞が挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００５１】
本発明は、医薬有効量のCTLA4突然変異体分子を含む免疫系疾患処置用医薬組成物を包含する。特定の態様では、免疫系疾患は、CD28陽性および/またはCTLA4陽性細胞がCD80陽性および/またはCD86陽性細胞と相互作用することによって媒介される。可溶性CTLA4突然変異体分子は、好ましくは、CTLA4の細胞外ドメイン中に1または複数の突然変異を持つCTLA4分子である。医薬組成物は可溶性CTLA4突然変異体タンパク質分子および/または前記分子をコードする核酸分子および/またはベクターを含むことができる。好ましい態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、図7または8のいずれかに示すCTLA4の細胞外ドメイン（それぞれL104EA29YまたはL104E）のアミノ酸配列を持つ。さらに好ましくは、可溶性CTLA4突然変異体分子は本明細書に開示するL104EA29YIgである。本組成物はさらに、例えば薬物毒素、酵素、抗体またはコンジュゲートなど、他の治療薬を含んでもよい。
【００５２】
また好ましくは、本医薬組成物は、本発明の分子（例えばL104EA29YまたはL104Eなどの可溶性CTLA4分子）と混合したときに本発明分子の活性を損なわず、かつ対象の免疫系と反応しない適切な担体および佐剤も含む。適切な担体および佐剤の例としてはヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、緩衝剤（リン酸塩、グリシンなど）、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、および塩類または電解質（硫酸プロタミンなど）が挙げられるが、これらに限らない。他の例としては通常の医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩溶液、水、エマルション（油/水エマルションなど）、および様々なタイプの湿潤剤が挙げられる。他の担体として、滅菌溶液、コート錠などの錠剤、カプセル剤を挙げることもできる。通例、このような担体は賦形剤、例えばデンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪、植物油、ゴム、グリコールまたは他の既知の賦形剤を含む。このような担体には香料および着色料または他の成分を含めることもできる。このような担体を含む組成物は周知の従来法によって製剤化することができる。そのような組成物は例えばリポソームなどの様々な脂質組成物およびポリマーマイクロスフェアなどのポリマー組成物中に製剤化することもできる。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、例えば静脈内（i.v.）投与、腹腔内（i.p.）投与、筋肉内（i.m.）投与、皮下投与、経口投与、坐剤としての投与、または局所接触、またはミニ浸透圧ポンプなどの徐放装置の対象への植込みなど、通常の投与法を用いて投与することができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、ポリマー製マイクロカプセル、リポソームおよび注射液または注入液など、様々な剤形をとることができる。好ましい剤形は投与形式および治療用途に依存する。
【００５５】
本発明組成物の最も有効な投与形式および用法は、疾患の重症度および経過、患者の健康状態および処置に対する反応ならびに処置を行う医師の判断に依存する。したがって本組成物の用量は患者毎に調整すべきである。
【００５６】
可溶性CTLA4突然変異体分子は、対象の体内で内因性B7（例えばCD80および/またはCD86）分子がそれぞれのリガンドと結合するのを遮断するのに十分な量および期間（例えば時間および/または複数回）対象に投与されるだろう。内因性B7/リガンド結合の遮断により、B7陽性細胞（例えばCD80陽性および/またはCD86陽性細胞）とCD28陽性および/またはCTLA4陽性細胞との相互作用が阻害される。治療薬の投与量は、例えば患部組織のタイプ、処置しようとする自己免疫疾患のタイプ、疾患の重症度、患者の健康状態、その薬剤による処置に対する患者の反応など、多くの因子に依存する。したがって薬剤の投与量は対象および投与形式に依存して変動しうる。可溶性CTLA4突然変異体分子は0.1〜20.0mg/kg-患者体重/日、好ましくは0.5〜10.0mg/kg/日の量で投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は様々な時間にわたって実施することができる。一態様として、本発明の医薬組成物は1時間以上にわたって投与することができる。また、投与は疾患の重症度および当技術分野で知られる他の因子に応じて繰り返すこともできる。
【００５７】
さらに本発明は、タンパク質を製造する方法であって、本発明の宿主ベクター系を宿主中でタンパク質が産生されるように生育することおよびそのようにして産生されたタンパク質を回収することを含む方法も提供する。
【００５８】
さらに本発明は、機能的CTLA4陽性およびCD28陽性T細胞とCD80陽性および/またはCD86陽性細胞との相互作用を調節する方法も提供する。この方法では、内因性CTLA4抗原とCD80および/またはCD86との反応を妨害しかつ/または内因性CD28抗原とCD80および/またはCD86との反応を妨害する突然変異型CTLA4/CD80複合体および/または突然変異型CTLA4/CD86複合体が形成されるように、CD80陽性および/またはCD86陽性細胞を本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子と接触させる。本発明の一態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、突然変異型CTLA4の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む融合タンパク質である。もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子には、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を有し少なくとも1つの突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを含む第1アミノ酸配列、ならびにヒト免疫グロブリンガンマ1分子のヒンジ、CH2およびCH3領域を含む第2アミノ酸配列が含まれる（図7または8）。
【００５９】
本発明の実施態様として、CD80陽性またはCD86陽性細胞を、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子の断片または誘導体と接触させる。もう一つの選択肢として可溶性CTLA4突然変異体分子は、CTLA4突然変異体レセプターの細胞外ドメインの一部に相当する第2アミノ酸配列に融合したCD28レセプターの細胞外ドメインの一部に相当する第1アミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンC-ガンマ-1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列を持つCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質である。
【００６０】
可溶性CTLA4突然変異体分子はインビボで阻害特性を示すと予想される。T細胞/APC細胞相互作用、例えばT細胞/B細胞相互作用がT細胞とAPC細胞の接触の結果として起こっているような状態では、導入されたCTLA4突然変異体分子が結合してCD80陽性および/またはCD86陽性細胞、例えばB細胞に対する反応を起こすことにより、T細胞/APC細胞相互作用が妨害、すなわち阻害され、その結果、免疫応答が調節されることになるだろう。
【００６１】
本発明は免疫応答をダウンレギュレートする方法を提供する。可溶性CTLA4突然変異体分子による免疫応答のダウンレギュレーションは、既に進行中の免疫応答を阻害または遮断する目的で行ってもよいし、免疫応答の誘導を予防するものであってもよい。本発明の可溶性CTLA4分子は、T細胞応答を抑制することによって、もしくはT細胞に特異的寛容を誘発することによって、またはその両方によって、例えばTリンパ球増殖およびサイトカイン分泌などの活性化T細胞の機能を阻害するだろう。
【００６２】
さらに本発明は、免疫系疾患を処置し寛容を誘導する方法も提供する。具体的態様では、免疫系疾患はCD28陽性および/またはCTLA4陽性細胞とCD80/CD86陽性細胞との相互作用によって媒介される。さらなる一態様では、T細胞相互作用が阻害される。免疫系疾患の例としては自己免疫疾患、免疫細胞増殖性疾患および移植関連障害が挙げられるが、これらに限るわけではない。これらの方法では、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子を投与して、T細胞とCD80陽性および/またはCD86陽性細胞との相互作用を調節する。もう一つの選択肢として、CTLA4突然変異体分子に接合した膜糖タンパク質を持つCTLA4突然変異体ハイブリッドを投与することもできる。移植関連疾患の例には、移植片対宿主疾患（GVHD）（例えば骨髄移植によって起こるもの、または寛容の誘導をもたらすもの）、移植拒絶、慢性拒絶および組織または細胞（例えば固形臓器、皮膚、島、筋、肝細胞、ニューロンなど）の同種移植もしくは異種移植に関係する免疫障害がある。免疫細胞増殖性疾患の例には、乾癬、T細胞リンパ腫、T細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性T細胞リンパ腫、良性リンパ球性血管炎、および自己免疫疾患、例えば狼蒼（例：エリテマトーデス、ループス腎炎）、橋本甲状腺腫、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例：インシュリン依存性糖尿病、I型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（例：慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病などがあるが、これらに限るわけではない。
【００６３】
さらに本発明は、移植組織のレシピエントである対象による固形臓器および/または組織移植拒絶を阻害する方法も提供する。通例、組織移植の場合、移植片の拒絶はT細胞がそれを異物と認識することによって開始され、次いで移植片を破壊する免疫応答が起こる。本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は、Tリンパ球増殖および/またはサイトカイン分泌を阻害することによって組織破壊を軽減するだろう。また、抗原特異的T細胞不応答性の誘導により、全身的な免疫抑制を行わなくても、長期にわたる移植片の受容が起こるだろう。さらに、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は、例えばコルチコステロイド、シクロスポリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、タクロリムス、バシリキシマブ、および/または他の生物製剤などといった他の医薬と共に投与することもできる。
【００６４】
また本発明は、対象における移植片対宿主病を抑制する方法も提供する。この方法では、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子が単独で、またはIL-2、IL-4またはγ-インターフェロンと反応する他の追加リガンドと共に、対象に投与される。例えば、ドナーT細胞のアロ反応性を阻害するために、本発明の可溶性CTLA突然変異体分子を骨髄移植レシピエントに投与することができる。あるいは、骨髄移植片内のドナーT細胞を、移植に先立ってエクスビボで、レシピエントのアロ抗原に対して寛容化してもよい。
【００６５】
可溶性CTLA4突然変異体分子によるT細胞応答の阻害は自己免疫障害の処置にも役立つだろう。多くの自己免疫障害は自己抗原に対して反応性を持つT細胞の不適切な活性化によって起こり、これは、その疾患の病理に関係するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自己免疫障害を患っているまたは自己免疫障害を起こしやすい対象に可溶性CTLA4突然変異体分子を投与すれば、自己反応性T細胞の活性化が妨げられ、疾患症状が軽減または除去されるだろう。この方法では、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子を単独で、またはIL-2、IL-4またはγ-インターフェロンと反応する他の追加リガンドと共に、対象に投与してもよい。
【００６６】
さらに本発明は、可溶性CTLA4突然変異体分子と他の免疫抑制剤、例えばシクロスポリン（Mathiesen「シクロスポリンA処置ラットの中枢死因軽々における異種移植ヒト膠芽腫細胞の長期生存および血管新生（Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclosporin A-Treated Rats）」（1989）Cancer Lett.,44:151-156参照）、プレドニソン、アザチオプリンおよびメトトレキセート（R.Handschumacher「第53章：免疫抑制に使用される薬物（Chapter 53: Drugs
Used for Immunosuppression）」1264〜1276頁）との併用も包含する。他の免疫抑制剤も使用することができる。例えば慢性関節リウマチの処置には、可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬/Cox-2阻害剤、メトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾピリン、金塩、エタナーセプト、インフリキシマブ、アナキンラ、アザチオプリン、および/または抗TNFのような他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。全身性エリテマトーデスの処置には、可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、サイトキサン、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキン、ミコフェノール酸モフェチルおよび/または他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。さらに、多発性硬化症の処置には、可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、酢酸グラチラマー、塩酸ミトキサントロン、および/または他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。
【００６７】
可溶性CTLA4突然変異体分子（好ましくはL104EA29YIg）は、免疫応答を調節するために、以下の薬剤の1または複数と併用することもできる：可溶性gp39（CD40リガンド（CD40L）、CD154、T-BAM、TRAPとも呼ばれる）、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD28、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、gp39と反応する抗体、CD40と反応する抗体、B7と反応する抗体、CD28と反応する抗体、LFA-1と反応する抗体、LFA-2と反応する抗体、IL-2と反応する抗体、IL-12と反応する抗体、IFN-γと反応する抗体、CD2と反応する抗体、CD48と反応する抗体、ICAM（例えばICAM-2）と反応する抗体、CTLA4と反応する抗体、Thy-1と反応する抗体、CD56と反応する抗体、CD3と反応する抗体、CD29と反応する抗体、TCRと反応する抗体、VLA-4と反応する抗体、VCAM-1と反応する抗体、LECAM-1と反応する抗体、ELAM-1と反応する抗体、CD44と反応する抗体。ある態様では、モノクローナル抗体が好ましい。また他の態様では抗体断片が好ましい。当業者には容易に理解されるように、併用には、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子と他の免疫抑制剤1種、可溶性CTLA4突然変異体分子と他の免疫抑制剤2種、可溶性CTLA4突然変異体分子と他の免疫抑制剤3種などを含めることができる。最適な組合わせおよび用量は、当技術分野で周知の方法を使って決定し、最適化することができる。
【００６８】
具体的な組合わせの例には以下の組合わせがある：L104EA29YIgおよびCD80モノクローナル抗体；L104EA29YIgおよびCD86モノクローナル抗体；L104EA29YIg、CD80モノクローナル抗体およびCD86モノクローナル抗体；L104EA29YIgおよびgp39モノクローナル抗体；L104EA29YIgおよびCD40モノクローナル抗体；L104EA29YIgおよびCD28モノクローナル抗体；L104EA29YIg、CD80およびCD86モノクローナル抗体、gp39モノクローナル；L104EA29YIg、CD80およびCD86モノクローナル抗体、およびCD40モノクローナル抗体；L104EA29YIg、抗LFA1モノクローナル抗体、および抗gp39モノクローナル抗体。gp39モノクローナル抗体の具体例はMR1である。当業者には他の組合わせもすぐにわかるだろう。
【００６９】
本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子、例えばL104EA29Yは、例えば同種または異種移植片の急性または慢性拒絶、または自己免疫障害の処置または予防のために、または寛容を誘導するために、唯一の活性物質として、または免疫調節措置に使用される他の薬物と共に、または他の抗炎症剤と共に使用することができる。例えば、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は、以下の薬物と併用することができる：カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンAまたはFK506、免疫抑制性マクロライド、例えばラパマイシンまたはその誘導体、例えば40-O-(2-ヒドロキシ)エチルラパマイシン、リンパ球ホーミング剤、例えばFTY720またはその類似体、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプレン（azathioprene）、メトトレキセート、レフルノミドまたはその類似体、ミゾリビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、15-デオキシスパガリンまたはその類似体、免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば白血球レセプター、例えばMHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BBまたはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体、または他の免疫調節化合物、例えばCTLA4/CD28-Ig、または他の接着分子阻害剤、例えばLFA-1アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびVLA-4アンタゴニストなどのモノクローナル抗体もしくは低分子量阻害剤。本化合物は、CD40およびそのリガンドを妨害する化合物、例えばCD40に対する抗体およびCD40-Lに対する抗体と併用すると、例えば上記の適応症（例：寛容の誘導）に、とりわけ有用である。
【００７０】
本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えば上述したような他の免疫抑制/免疫調節または抗炎症療法と併用して投与する場合、同時投与される免疫抑制剤、免疫調節剤または抗炎症性化合物の用量は、もちろん、使用する併用薬のタイプ（例えばステロイドかシクロスポリンか）、実際に使用する薬物、処置しようとする状態などに依存して変動する。
【００７１】
上記の説明に従って、本発明は、さらなる一側面として、遊離型または医薬的に許容できる塩型の本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子L104EA29YIgを、第2の医薬物質と同時にまたは逐次的に同時投与することを含み、前記第2の医薬物質が例えば上述の免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬薬物であるような、上に定義した方法を提供する。さらに本発明は、免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬を含む少なくも1つの医薬組成物と同時にまたは逐次的に使用される遊離型または医薬的に許容できる塩型のL104EA29YIgを含む、上に定義した方法で使用される治療的組合わせ、例えばキットも提供する。
【００７２】
本発明分子の製造方法
CTLA4突然変異体分子は原核細胞で発現させることができる。原核細胞の最も一般的な代表例は種々の細菌株である。細菌はグラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよい。典型的には大腸菌などのグラム陰性細菌が好ましい。他の微生物株も使用することができる。
【００７３】
CTLA4突然変異体分子をコードする配列は、大腸菌などの原核細胞で外来配列を発現させるために設計されたベクターに挿入することができる。これらのベクターは一般に使用される原核制御配列を含むことができる。この原核制御配列とは、本明細書では、リボソーム結合部位配列と共に転写開始用のプロモーターを含み、所望によりオペレーターを含んでもよいと定義され、例えばβ-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモーター系（Changら（1977）Nature 198:1056）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら（1980）Nucleic Acids Res. 8:4057）およびラムダ由来のPLプロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位（Shimatakeら（1981）Nature 292:128）などといった一般に使用されるプロモーターを含む。
【００７４】
このような発現ベクターは、ベクターが細菌中で複製することができるように、そしてアンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質の存在下で生育した時に当該プラスミドを保有する細胞を選択することができるように、複製起点と、抗生物質に対する耐性を付与するβ-ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの選択マーカーも含むだろう。
【００７５】
発現プラスミドは、例えばCaCl2ショック（Cohen（1972）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110およびSambrookら編「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor Press（1989））およびエレクトロポレーションなど、様々な標準的方法で原核細胞に導入することができる。
【００７６】
本発明の実施態様として、真核細胞も適切な宿主細胞である。真核細胞の例には、初代または不死化動物細胞、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシェ、シゾサッカロミセス・ポンベおよびピキア・パストリス）および植物細胞などがある。骨髄腫、COS細胞、CHO細胞は、宿主として使用することができる動物細胞の例である。CHO細胞の具体例には、例えばDG44（Chasinら,1986,Som.Cell.Molec.Genet. 12:555-556；Kolkekar,1997,Biochemistry 36:10901-10909）、CHO-K1（ATCC No.CCL-61）、CHO-K1 Tet-On細胞株（Clontech）、ECACC85050302のCHO（CAMR（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））、CHOクローン13（GEIMG（イタリア・ジェノバ））、CHOクローンB（GEIMG（イタリア・ジェノバ））、ECACC93061607のCHO-K1/SF（CAMR（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））およびECACC92052129のRR-CHOK1（CAMR（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））などがある。植物細胞の代表例としては、タバコ（全草、細胞培養またはカルス）、トウモロコシ、ダイズおよびコメ細胞などがある。トウモロコシ、ダイズおよびコメ種子も利用することができる。
【００７７】
CTLA4突然変異体分子をコードする核酸配列は、真核宿主で外来配列を発現させるために設計されたベクターに挿入することもできる。このベクターの調節要素は、使用する真核宿主に応じて様々である。
【００７８】
一般に使用されるベクター発現用の真核制御配列は、ほ乳類細胞に適合したプロモーターおよび制御配列、例えばCMVプロモーター（CDM8ベクター）およびトリ肉腫ウイルス（ASV）（πLNベクター）などを含む。他の一般に使用されるプロモーターには、例えばシミアンウイルス40（SV40）の初期および後期プロモーター（Fiersら（1973）Nature 273:113）、または他のウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウイルス2およびウシ乳頭腫ウイルス由来のものなどがある。hMTII（Karinら（1982）Nature 299:797-802）などの誘導性プロモーターも使用することができる。
【００７９】
真核生物中でCTLA4突然変異体分子を発現させるためのベクターはエンハンサー領域と呼ばれる配列を持ってもよい。これらは遺伝子発現の最適化に重要であり、プロモーター領域の上流または下流に見いだされる。
【００８０】
真核宿主細胞用の発現ベクターの例には、ほ乳類宿主細胞用のベクター（例えばBPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2（Maniatis）；pIRES（Clontech）；pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFV1（Life Technologies）；pVPakcベクター、pCMVベクター、pSG5ベクター（Stratagene））、レトロウイルスベクター（例えばpFBベクター（Stratagene））、pCDNA-3（Invitrogen）またはその修飾型、アデノウイルスベクター；アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター（例えばpSECベクター（Stratagene））などがあるが、これらに限るわけではない。
【００８１】
CTLA4突然変異体分子をコードする核酸配列は、真核宿主細胞のゲノムに組み込んで、宿主ゲノムの複製と共に複製させることができる。あるいは、CTLA4突然変異体分子を保有するベクターに複製起点を含ませて、染色体外複製を可能にすることもできる。
【００８２】
サッカロミセス・セレビシェで核酸配列を発現させるには、内因性酵母プラスミド2μ環状DNA由来の複製起点を使用することができる（Broach（1983）Meth.Enz. 101:307）。もう一つの選択肢として、自律的複製を促進する酵母ゲノム由来の配列を使用することもできる（例えばStinchcombら（1979）Nature 282:39）、Tschemperら（1980）Gene 10:157、およびClarkeら（1983）Meth.Enz. 101:300）。
【００８３】
酵母ベクター用の転写制御配列としては例えば糖分解酵素を合成するためのプロモーターが挙げられる（Hessら（1968）J.Adv.Enzyme Reg. 7:149、Hollandら（1978）Biochemistry 17:4900）。当技術分野で知られる他のプロモーターには、例えばCDM8ベクターに含まれるCMVプロモーター（ToyamaおよびOkayama（1990）FEBS 268:217-221）、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Hitzemanら（1980）J.Biol.Chem. 255:2073）および他の糖分解酵素のプロモーターなどがある。
【００８４】
その他、誘導性のプロモーターもあり、これらは環境刺激または細胞の成長培地によって調節することができる。これらの誘導性プロモーターには、例えば熱ショックタンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素異化に関係する酵素、およびマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素の遺伝子に由来するものなどがある。
【００８５】
調節配列はコード配列の3'末端にも置くことができる。これらの配列はメッセンジャーRNAを安定化するように作用するだろう。そのようなターミネーターはいくつかの酵母由来遺伝子およびほ乳類遺伝子のコード配列に続く3'非翻訳領域に見いだされる。
【００８６】
植物用ベクターおよび植物細胞の代表例には、アグロバクテリウムTiプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）およびトマトゴールデンモザイクウイルス（TGMV）などがあるが、これらに限るわけではない。
【００８７】
ほ乳類細胞宿主系形質転換の一般面は、1983年8月16日発行の米国特許第4,399,216号にAxelらが記載している。ほ乳類細胞は、例えばリン酸カルシウム存在下でのトランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの方法、またはウイルスベクターによる形質導入によって形質転換することができる。
【００８８】
植物および酵母ゲノムに外来DNA配列を導入する方法としては、（1）機械的方法、例えば単一細胞またはプロトプラストへのDNAのマイクロインジェクション、DNAの存在下で細胞をガラスビーズと共にボルテックスする方法、またはDNAで覆ったタングステンまたは金球体を細胞またはプロトプラストに撃ち込む方法など、（2）ポリエチレングリコール処理または高圧電気パルスの印加（エレクトロポレーション）によって巨大分子に対して細胞膜を透過性にすることにより、DNAを導入する方法、または（3）リポソーム（cDNAを含むもの）を使って細胞膜に融合させる方法などが挙げられる。
【００８９】
CTLA4突然変異体分子の発現は当技術分野で知られた方法によって検出することができる。例えば突然変異体分子はSDS-PAGEゲルのクーマシー染色およびCTLA4を結合する抗体を使った免疫ブロッティングによって検出することができる。タンパク質の回収は、標準的なタンパク質精製手段、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて実質的に純粋な産物を得ることによって行うことができる（R.Scopes「Protein Purification,Principles and Practice」第3版,Springer-Verlag（1994））。
【００９０】
本発明はさらに、上で製造された可溶性CTLA4突然変異体分子も提供する。
【００９１】
CTLA4Igコドンベース突然変異誘発法
一態様として、部位特異的突然変異誘発法および新規スクリーニング法を使って、CD86に対する結合アビディティーを向上させるCTLA4の細胞外ドメイン中の突然変異をいくつか同定した。この態様では、CTLA4の細胞外ドメインのうち、セリン25からアルギニン33までの領域、C'鎖（アラニン49およびスレオニン51）、F鎖（リジン93、グルタミン酸95およびロイシン96）、メチオニン97からチロシン102までの領域、チロシン103からグリシン107までの領域、そしてグルタミン111、チロシン113およびイソロイシン115のG鎖中の残基に突然変異を導入した。これらの部位は、キメラCD28/CTLA4融合タンパク質の研究（Peachら,J.Exp.Med.,1994,180:2049-2058）、どのアミノ酸残基側鎖が溶媒露出しているかを予測するモデル、およびCD28とCTLA4の間で一定の位置にアミノ酸残基同一性または相同性が欠けていることに基づいて選択した。また、特定した残基に空間的に近接（5〜20オングストローム単位）している残基も本発明の一部とみなされる。
【００９２】
CD80および/またはCD86に対するアフィニティーが変化している可溶性CTLA4突然変異体分子を合成し選別するために、2段階法を採用した。これらの実験では、まず、CTLA4の細胞外ドメインの特定コドンにおける突然変異のライブラリーを作製し、次にBIAcore解析によってそれらをスクリーニングすることにより、CD80またはCD86に対する反応性が変化している突然変異体を同定した。BIAcoreアッセイシステム（Pharmacia（ニュージャージー州ピスカタウェイ））では、検出器に配置されたデキストラン被覆センサーチップへのCD80IgまたはCD86Igの共有結合が基本的に必要な表面プラズモン共鳴検出器システムを使用する。次に、センサーチップを含むチャンバーに試験分子を注入し、結合する相補的タンパク質の量を、センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に結合している分子量の変化に基づいて評価することができ、分子量の変化は検出器システムによって測定することができる。
【００９３】
本発明の利点
CD80およびCD86へのCTLA4結合は迅速な「オン」速度と迅速な解離（「オフ」）速度とを特徴とすること、またCTLA4Ig-CD86複合体はCTLA4Ig-CD80複合体よりおよそ5〜8倍迅速に解離することから、CD80および/またはCD86からのCTLA4Igの解離速度を遅くすることにより、より強力な免疫抑制特性を持つ分子が得られるだろうと考えた。したがってCD80陽性またはCD86陽性細胞に対して野生型CTLA4または非突然変異型CTLA4Igより高いアビディティーを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子は、CTLA4または非突然変異型CTAL4Igよりも高い効率で抗原特異的活性化細胞のプライミングを遮断すると予想される。
【００９４】
さらにまたCTLA4Igの製造コストは極めて高い。より強力な免疫抑制特性を持つ高アビディティー突然変異型CTLA4Ig分子は、臨床的に非突然変異型CTLA4Igよりかなり低い用量で使用しても、ほぼ同等の免疫抑制レベルを達成することができる。したがって可溶性CTLA4突然変異体分子、例えばL104EA29YIgは費用効果が極めて高いだろう。
【００９５】
本発明を例示して、当業者がそれを製造し使用する際の助けとなるように、以下に実施例を記載する。以下の実施例は決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００９６】
実施例
実施例1
この実施例では本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子をコードするヌクレオチド配列を作製するために使用する方法を説明する。一部位突然変異体L104EIgを作製し、CD80および/またはCD86に関する結合動態を調べた。テンプレートとしてL104EIgヌクレオチド配列を使用して、二部位突然変異型CTLA4配列L104EA29YIgを作製し、CD80および/またはCD86に関する結合動態を調べた。
【００９７】
CTLA4Ig コドンベース突然変異誘発
CD80および/またはCD86分子からの解離速度（「オフ」速度）が遅くなっている突然変異型CTLA4Ig分子を同定するために、突然変異誘発およびスクリーニング方法を開発した。テンプレートとしてCTLA4Ig（米国特許第5,844,095号、第5,851,795号および第5,885,796号、ATCC受託番号68629）を使用して、一部位突然変異体ヌクレオチド配列を作製した。コドンの1位および2位は任意の塩基であってよいが3位はグアニンまたはチミンのみ（XXG/T；NNG/Tともいう）とすることにより、特定cDNAコドンのランダム突然変異誘発用の変異原オリゴヌクレオチドPCRプライマーを設計した。この方法でアミノ酸をコードする特定のコドンを、20アミノ酸のそれぞれをコードするように、ランダムに突然変異させた。このXXG/T突然変異誘発法では、20アミノ酸のそれぞれをコードする32種類のコドンが得られる。CTLA4IgのM97〜G107（図7または8参照）付近に突然変異をコードするPCR産物をSacI/XbaIで消化し、同様に切断したCTLA4IgπLN発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使って、一部位CTLA4突然変異体分子L104EIg（図8）を作製した。
【００９８】
CTLA4IgのS25〜R33付近の突然変異誘発については、PCRプライマー指定突然変異誘発法によって、まず、このループの5'側にサイレントなNheI制限部位を導入した。PCR産物をNheI/XbaIで消化し、同様に切断したCTLA4IgまたはL104EIg発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使って、二部位CTLA4突然変異体分子L104EA29YIg（図7）を作製した。具体的には、テンプレートとして一部位CTLA4突然変異体分子L104EIgをコードする核酸分子を使用して、二部位CTLA4突然変異体分子L104EA29YIgを作製した。L104EA29YIgを含むpiLNベクターを図12に示す。
【００９９】
実施例2
以下に、実施例1に記載のコンストラクトから発現された一部位および二部位突然変異型CTLA4ポリペプチドであって、CD80およびCD86抗原に対して非突然変異型CTLA4Ig分子より高い結合アビディティーを示すものを同定するために使用したスクリーニング方法を説明する。
【０１００】
最新のインビトロおよびインビボ研究により、CTLA4Ig単独では抗原特異的活性化T細胞のプライミングを完全には遮断できないことが示されている。CTLA4Igと、CD80またはCD86に特異的なモノクローナル抗体とを用いてT細胞増殖の阻害を測定したインビトロ研究では、抗CD80モノクローナル抗体がCTLA4Ig阻害を増強しなかったことが示されている。しかし、抗CD86モノクローナル抗体は阻害を増強したことから、CTLA4IgはCD86相互作用の遮断にはあまり有効でないことがわかる。これらのデータは、CD80が媒介する細胞応答の阻害に必要なCTLA4Ig濃度はCD86が媒介する細胞応答の場合の約1/100であることを示したLinsleyら（Immunity（1994）1:793-801）による初期の発見を裏付けている。これらの知見に基づいて、CD86に対して野生型CTLA4より高いアビディティーを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子は、抗原特異的活性化細胞のプライミングをCTLA4Igより良く遮断することができるはずであると推測した。
【０１０１】
そこで、新しいスクリーニング法を用いて上記実施例1に記載の可溶性CTLA4突然変異体分子をスクリーニングして、CD80およびCD86に対する結合アビディティーを向上させるCTLA4の細胞外ドメイン中の突然変異をいくつか同定した。「オフ」速度の決定は濃度に依存しないので、このスクリーニング方法は、「オフ」速度が遅くなっていると思われる突然変異体を、タンパク質精製または定量を行わずに直接同定するための効果的な方法になる（O'Shannessyら（1993）Anal.Biochem.,212：457-468）。
【０１０２】
COS細胞に個々のミニプレップ精製プラスミドDNAをトランスフェクトし、数日間増殖させた。3日調整培養培地を可溶性CD80IgまたはCD86Igで被覆したBIAcoreバイオセンサーチップ（Pharmacia Biotech AB（スウェーデン・ウプサラ）にかけた。突然変異体タンパク質の特異的結合および解離を、表面プラズモン共鳴によって測定した（O'Shannessy,D.J.ら（1993）Anal.Biochem. 212:457-468）。実験は全てBIAcore（商標）またはBIAcore（商標）2000バイオセンサーを使って25℃で行った。リガンドは一般的なN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドN-ヒドロキシスクシンイミドカップリング法を使って研究用NCM5センサーチップ（Pharmacia）に固定化した（Johnsson,B.ら（1991）Anal.Biochem. 198:268-277、Khilko,S.N.ら（1993）J.Biol.Chem 268:5425-15434）。
【０１０３】
スクリーニング法
24穴組織培養プレートで生育したCOS細胞に、突然変異型CTLA4IgをコードするDNAを一過性にトランスフェクトした。分泌された可溶性突然変異型CTLA4Igを含む培養培地を3日後に収集した。
【０１０４】
Greeneら,1996,J.Biol.Chem. 271:26762-26771に記載されているようにCD86IgまたはCD80Igで誘導体化したBIAcoreバイオセンサーチップに、COS細胞調整培養培地を流し、野生型CTLA4Igに見られる「オフ」速度より遅い「オフ」速度を持つ突然変異体分子を同定した。選択した培地試料に対応するcDNAを配列決定した。また、COS細胞一過性トランスフェクションを大量に行って、そこから培養培地のプロテインA精製によって突然変異型CTLA4Igタンパク質を調製するために、DNAを調製した。
【０１０５】
BIAcore解析条件および平衡結合データ解析はJ.Greeneら,1996,J.Biol.Chem. 271:26762-26771および本明細書に記載されているように行った。
【０１０６】
BIAcore データ解析
分析に先立ってセンサーグラムのベースラインをゼロ応答単位（RU）に標準化した。試料をモック誘導化フローセルに流して、溶液間のバルク屈折率差によるバックグラウンド応答単位（RU）値を決定した。平衡解離定数（Kd）はReq対Cのプロットから計算した。ここに、Reqは（定常状態応答）−（モック誘導化チップでの応答）であり、Cは分析物のモル濃度である。結合曲線は市販の非線形カーブフィッティングソフトウェア（Prism、GraphPAD Software）を使って解析した。
【０１０７】
実験データは、まず単一レセプターへの単一リガンド結合のモデル（1部位モデル、すなわち単純なラングミュアー系、A＋B←→AB）にあてはめ、平衡結合定数（Kd＝[A][B]/[AB]）を式：R＝Rmax・C/(Kd＋C)から計算した。次に、データを、リガンド結合の最も簡単な二部位モデル（すなわち、式：R＝Rmax1・C/(Kd1＋C)＋Rmax2・C/(Kd2＋C)で表される2つの相互作用しない独立した結合部位を持つレセプター）にあてはめた。
【０１０８】
これら2つのモデルの適合度を、実験データとの比較によって視覚的に、また平方和のF検定によって統計的に解析した。二部位モデルの方が適合度が有意に高くない限り（p＜0.1）、より単純な一部位モデルをベストフィットとして選択した。
【０１０９】
結合および解離解析はBIAevaluation2.1ソフトウェア（Pharmacia）を使って行った。結合速度定数konは均一な一部位相互作用および並行2部位相互作用の両方を仮定して2つの方法で計算した。一部位相互作用の場合は、Rt＝Req(1-exp-ks(t-t0)）［式中、Rtは時刻tにおける応答、Reqは定常状態応答、t0は注入を開始した時刻、ks＝dR/dt＝kon・Ckoffであって、Cはモノマー結合部位に関して計算した分析物の濃度である］に従ってkon値を計算した。二部位相互作用の場合は、式：Rt＝Req1(1-exp-ks1(t-t0)）＋Req2(1-expks2(t-t0)）に従ってkon値を計算した。各モデルについて、ks対Cのプロットの傾き（最大結合の約70％まで）の計算値からkonの値を決定した。
【０１１０】
解離データは一部位モデル（AB＝A＋B）または二部位モデル（AiBj＝Ai＋Bj）に従って解析し、速度定数（koff）をベストフィット曲線から計算した。誤差が機械のバックグランド（機械によって2〜10RU）より大きい場合（その場合は二結合部位モデルを使用）を除いて、上記結合部位モデルを使用した。レセプター占有の半減期はt1/2＝0.693/koffの関係を使って計算した。
【０１１１】
フローサイトメトリー
マウスモノクローナル抗体L307.4（抗CD80）はBecton Dickinson（カリフォルニア州サンホゼ）から購入し、IT2.2（抗B7-0［CD86とも呼ばれる］）はPharmingen（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。免疫染色のために、10mM EDTAを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）中でインキュベートすることによって、CD80陽性および/またはCD86陽性CHO細胞を培養器から取り出した。CHO細胞（1〜10×105個）をまずモノクローナル抗体または免疫グロブリン融合タンパク質と共に10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むDMEM中でインキュベートした後、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリン第2段階試薬と共にインキュベートした（Tago（カリフォルニア州バーリンゲーム））。細胞に最終洗浄を施し、FACScan（Becton Dickinson）で解析した。
【０１１２】
SDS-PAGE およびサイズ排除クロマトグラフィー
SDS-PAGEはトリス/グリシン4-20％アクリルアミドゲル（Novex（カリフォルニア州サンディエゴ））で行った。分析用ゲルはクーマシーブルーで染色し、デジタルスキャニングによって湿ゲルの画像を得た。0.02％NaN3を含むリン酸緩衝食塩水で平衡化したTSK-GEL G300 SWXLカラム（7.8×300mm、Tosohaas（ペンシルバニア州モントゴメリービル））を使用し、1.0ml/分の流量で、CTLA4Ig（25μg）およびL104EA29YIg（25μg）をサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【０１１３】
CTLA4X C120S および L104EA29YX C120S
一本鎖CTLA4XC120Sを先に記述されているように製造した（Linsleyら（1995）J.Biol.Chem.,270:15417-15424）。簡単に述べると、オンコスタチンM CTLA4（OMCTLA4）発現プラスミドをテンプレートとして使用し、ベクター中の配列に適合するようにフォワードプライマー：
GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG
を選択した。またリバースプライマー：
GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC
は、CTLA4の細胞外ドメインの最後の7アミノ酸（すなわちアミノ酸118〜124）に相当し、制限酵素部位および停止コドン（TGA）を含んだ。C120S（120位におけるシステインからセリンへの）突然変異はリバースプライマーによって指定された。具体的に述べると、上記リバースプライマーのヌクレオチド配列GCA（ヌクレオチド34〜36）を以下のヌクレオチドの一つで置き換える：AGA、GGA、TGA、CGA、ACTまたはGCT。当業者には理解されるであろうが、ヌクレオチド配列GCAはシステインのコドンTGCの逆相補配列である。同様に、ヌクレオチド配列AGA、GGA、TGA、CGA、ACTまたはGCTはセリンのコドンの逆相補配列である。ポリメラーゼ連鎖反応産物をHindIII/XbaIで消化し、発現ベクターπLN（Bristrol-Myers Squibb Company（ニュージャージー州プリンストン））に特定の向きでサブクローニングした。各コンストラクトをDNA配列決定によって確認した。
【０１１４】
高アビディティー突然変異体の同定および生化学的特徴づけ
24のアミノ酸を突然変異誘発用に選択し、得られた約2300の突然変異型タンパク質を、表面プラズモン共鳴法（SPR；上記の方法）により、CD86Ig結合に関してアッセイした。各部位での突然変異誘発の主な効果を表３に要約する。S25〜R33中のアミノ酸の一部にはランダム突然変異を施してもリガンド結合は変化しないようだった。E31およびR33ならびに残基M97〜Y102の突然変異誘発はリガンド結合の低下をもたらすようだった。残基S25、A29、およびT30、K93、L96、Y103、L104、およびG105の突然変異誘発は「オン」速度の低下および/または「オフ」速度の低下をもたらした。これらの結果は、S25〜R33領域中の残基およびM97〜Y102中またはその近傍にある残基がリガンド結合に影響するという先の発見を裏付けている（Peachら（1994）J.Exp.Med.,180：2049-2058）。
【０１１５】
部位S25、T30、K93、L96、Y103およびG105の突然変異誘発によって、「オフ」速度がCD86Igより遅い突然変異体がいくつか同定された。しかしこれらの例では、遅い「オフ」速度が遅い「オン」速度と相殺して、CD86Igに対して野生型CTLA4Igで見られるアビディティーと見かけ上同じ程度の総アビディティーを持つ突然変異体が得られた。また、K93の突然変異誘発はかなりの凝集をもたらしたが、これも観察された動態変化の原因になっていたのだろう。
【０１１６】
L104にランダム突然変異誘発を行った後、COS細胞のトランスフェクションおよび固定化CD86Igに対する培養培地試料のSPRによるスクリーニングを行ったところ、「オフ」速度が野生型CTLA4Igのおよそ1/2しかない突然変異体タンパク質を含む培地試料が6つ得られた。これら突然変異体の対応するcDNAを配列決定したところ、いずれもロイシンからグルタミン酸への突然変異（L104E）をコードすることがわかった。ロイシン104からアスパラギンへの置換（L104D）はCD86Ig結合に影響を及ぼさないようだった。
【０１１７】
次に、今度はPCRテンプレートとして野生型CTLA4IgではなくL104Eを使用して、表３に列挙した各部位で、上述のように突然変異誘発を繰り返した。再び固定化CD86Igを使ってSPR解析を行ったところ、アラニン29の突然変異誘発により、「オフ」速度が野生型CTLA4Igのおよそ1/4しかないタンパク質を含む培養培地試料が6つ同定された。最も遅い2つはチロシン置換（L104EA29Y）、2つはロイシン（L104EA29L）、1つはトリプトファン（L104EA29W）、そして1つはスレオニン（L104EA29T）だった。野生型CTLA4Igのアラニン29を単独でランダムに突然変異させても遅い「オフ」速度を持つ突然変異体は同定されないようだった。
【０１１８】
精製したL104EおよびL104EA29YIgの相対分子量および凝集状態をSDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。L104EA29YIg（約1μg；レーン3）およびL104EIg（約1μg；レーン2）は、還元条件（約50kDa；＋βME；＋2-メルカプトエタノール）でも非還元条件（約100kDa；−βME）でも、CTLA4Ig（約1μg；レーン1）と見かけ上同じ電気泳動移動度を持っていた（図10A）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、L104EA29YIg（図10C）はCTLA4Ig二量体（図10B）と見かけ上同じ移動度を持つことが証明された。主要ピークはタンパク質二量体に相当し、図10Bで速く溶出するマイナーピークは高分子量凝集体に相当する。CTLA4Igの約5.0％は高分子量凝集体として存在したが、L104EA29YIgまたはL104EIgの凝集を示す証拠は認められなかった。したがって、L104EIgおよびL104EA29YIgに見られたCD86Igへの強い結合は、突然変異誘発が誘発した凝集に起因するものではないと考えられる。
【０１１９】
平衡結合解析および速度論的結合解析
プロテインAで精製したCTLA4Ig、L104EIg、およびL104EA29YIgに対し、表面プラズモン共鳴法（SPR）を使って、平衡結合解析および速度論的結合解析を行った。結果を表２に示す。観察された平衡解離定数（Kd；表２）はある濃度範囲（5.0〜200nM）にわたって作成した結合曲線から計算した。L104EA29YIgはL104EIgまたはCTLA4Igより強くCD86Igに結合する。L104EA29YIgのKd（3.21nM）がL104EIg（6.06nM）またはCTLA4Ig（13.9nM）より低いことは、L104EA29YIgの方がCD86Igに対して高い結合アビディティーを持つことを示している。L104EA29YIgのKd（3.66nM）がL104EIg（4.47nM）またはCTLA4Ig（6.51nM）より低いことは、L104EA29YIgの方がCD80Igに対して高い結合アビディティーを持つことを示している。
【０１２０】
速度論的結合解析により、CD80に対するCTLA4Ig、L104EIgおよびL104EA29YIg結合の「オン」速度は同じぐらいであり、CD86Igに関する「オン」速度も同様であることがわかった（表２）。しかしこれらの分子の「オフ」速度は等しくなかった（表２）。CTLA4Igと比較すると、L104EA29YIgのCD80Igからの「オフ」速度は約1/2、CD86Igからの「オフ」速度は約1/4だった。L104Eの「オフ」速度はL104EA29YIgとCTLA4Igの中間だった。これらの突然変異の導入は「オン」速度には有意な影響を与えなかったので、L104EA29YIgで観察されたCD80IgおよびCD86Igに対するアビディティーの増加は、主として「オフ」速度の低下によると思われた。
【０１２１】
CD86IgおよびCD80Igに対するL104EA29YIgのアビディティーの増加が、各単量体の二量体としての会合の仕方に突然変異が影響を与えたためかどうか、あるいはアビディティーを増大させる構造変化が各単量体に導入されたかどうかを決定するために、CTLA4およびL104EA29Y細胞外ドメインの一本鎖コンストラクトを、上述のように、そしてLinsleyら（1995）J.Biol.Chem.,270:15417-15424に記載のように、システイン120のセリンへの突然変異誘発によって作製した。精製したタンパク質CTLA4XC120SおよびL104EA29YXC120Sが単量体であることをゲル透過クロマトグラフィーによって明らかにした後（Linsleyら（1995）前掲）、それらのリガンド結合特性をSPRによって解析した。その結果、CD86Igに対する両単量体タンパク質の結合アフィニティーはそれぞれの二量体で観察される結合アフィニティーのおよそ35〜80分の1であることがわかった（表２）。これは、高アビディティーリガンド結合にはCTLA4の二量化が必要であることを示す先に公表されたデータを裏付けている（Greeneら（1996）J.Biol.Chem.,271:26762-26771）。
【０１２２】
L104EA29YXC120SはCD80IgにもCD86IgにもCTLA4XC120Sより約2倍高いアフィニティーで結合した。このアフィニティーの増大は、どちらのリガンドからも解離速度が約1/3に低下したためだった。したがって、L104EA29Yによる強いリガンド結合は、分子の二量化に変化があったからではなく、おそらくアビディティーを増大させる構造変化が各モノマー鎖に導入されたためだろう。
【０１２３】
アビディティを増大させる突然変異の位置および構造解析
最近、CTLA4の細胞外IgV様ドメインの溶液構造がNMR分光法によって決定された（Metzlerら（1997）Nature Struct.Biol.,4:527-531）。これにより、三次元フォールドにおけるロイシン104およびアラニン29の正確な位置特定が可能になった（図11A〜B）。ロイシン104は高度に保存されたMYPPPYアミノ酸配列の近くに位置する。アラニン29は、MYPPPY領域に空間的に隣接するS25〜R33領域のC末端近くに位置する。これら2つの領域の基礎をなす残基間には有意な相互作用があるが、L104とA29の間には、どちらもタンパク質の隣接する疎水コアの一部を構成しているものの、直接的な相互作用はないようである。アビディティーを増大させる2つの突然変異が構造にもたらす結果をモデリングによって評価した。A29Y突然変異はS25〜R33領域とMYPPPY領域の間の溝に容易に収納され、MYPPPY領域のコンフォメーションを安定化する役割を果たしうる。野生型CTLA4では、L104はMYPPPY領域に近いL96およびV94と強い疎水相互作用を形成する。グルタミン酸突然変異がL104に似たコンフォメーションをとることは2つの理由からまずあり得ない。第1に、S25〜R33領域に有意な摂動を加えずに構造上長いグルタミン酸側鎖を収容するには空間が不十分である。第2に、グルタミン酸側鎖の負電荷を疎水領域に埋め込むとエネルギー損失が大きい。むしろモデリング研究によれば、グルタミン酸側鎖は表面に飛びだし、表面ではその電荷が溶媒和によって安定化されうることが予測される。このようなコンフォメーション変化は、当該領域中の他の残基に歪みをもたらすことなく、G105によって容易に調節されうる。
【０１２４】
CD80 または CD86 を発現する CHO 細胞への高アビディティー突然変異体の結合
安定にトランスフェクトされたCD80+およびCD86+CHO細胞へのCTLA4Igおよび突然変異体分子結合のFACS解析（図2）を本明細書に記載するように行った。CD80陽性およびCD86陽性CHO細胞を様々な濃度のCTLA4Ig、L104EA29YIgまたはL104EIgと共にインキュベートした後、洗浄した。結合した免疫グロブリン融合タンパク質をフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを使って検出した。
【０１２５】
図2に示すように、CD80陽性またはCD86陽性CHO細胞（1.5×105個）を、表示した濃度のCTLA4Ig（■）、L104EA29YIg（○）またはL104EIg（△）と共に23℃で2時間インキュベートし、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。合計5,000個の生細胞への結合をFACScanで解析し（単回測定）し、PC-LYSYSを使ってデータヒストグラムから平均蛍光強度（MFI）を決定した。データを、第2段階試薬のみと共にインキュベートした細胞で測定されたバックグラウンド蛍光（MFI＝7）に関して補正した。対照L6モノクローナル抗体（80μg/ml）は30未満のMFIを示した。これらの結果は4回の独立した実験の代表例である。
【０１２６】
ヒトCD80トランスフェクトCHO細胞へのL104EA29YIg、L104EIgおよびCTLA4Igの結合はほぼ同等である（図2A）。L104EA29YIgおよびL104EIgは、ヒトCD86を安定にトランスフェクトしたCHO細胞に、CTLA4Igより強く結合する（図2B）。
【０１２７】
機能アッセイ
ヒトCD4陽性T細胞を免疫磁気ネガティブ選択法によって単離した（Linsleyら（1992）J.Exp.Med. 176:1595-1604）。単離したCD4陽性T細胞を、滴定濃度の阻害剤の存在下にホルバール（phorbal）ミリステートアセテート（PMA）＋CD80陽性またはCD86陽性CHO細胞で刺激した。CD4陽性T細胞（8〜10×104個/細胞）を1nM PMAの存在下で、照射CHO細胞刺激因子と共にまたは同刺激因子なしで培養した。72時間培養の最後の7時間にわたって1μCi/ウェルの[3H]チミジンを添加することにより、増殖応答を測定した。PMA＋CD80陽性CHOまたはCD86陽性CHO刺激T細胞のL104EA29YIgおよびCTLA4Igによる阻害を行った。結果を図3に示す。L104EA29YIgはCD80陽性PMA処理CHO細胞の増殖をCTLA4Igより強く阻害した（図3A）。L104EA29YIgはCD86陽性PMA処理CHO細胞の増殖の阻害にもCTLA4Igより有効だった（図3B）。したがってL104EA29YIgは、T細胞のCD80媒介性共刺激およびCD86媒介性共刺激のどちらについても、より強力な阻害剤である。
【０１２８】
図4は、上で調製したアロ刺激ヒトT細胞を、CD80およびCD86を発現させるPMと呼ばれるヒトBリンパ芽球腫細胞株（LCL）でさらにアロ刺激した細胞のL104EA29YIgおよびCTLA4Igによる阻害を示している（3.0×104個/ウェルのT細胞および8.0×103個/ウェルのPM）。一次アロ刺激を6日間行った後、細胞に3H-チミジンを7時間パルスし、次いで放射ラベルの取込みを決定した。
【０１２９】
二次アロ刺激は以下のように行った。7日間一次アロ刺激したT細胞をリンパ球分離媒体（LSM）（ICN（オハイオ州オーロラ））上に収集し、24時間休止させた。次に、上と同じ比率のPMを加えることにより、滴定量のCTLA4IgまたはL104EA29YIgの存在下で、T細胞を再び（二次）刺激した。3日間刺激した後、細胞に放射標識をパルスし、上記のように収集した。一次アロ刺激T細胞に対するL104EA29YIgの効果を図4Aに示す。二次アロ刺激T細胞に対するL104EA29YIgの効果を図4Bに示す。L104EA29YIgは一次、二次共にT細胞増殖応答をCTLA4Igより強く阻害する。
【０１３０】
サイトカイン産生（図5）を測定するために、一対の二次アロ刺激プレートを用意した。3日後にELISAキット（Biosource（カリフォルニア州カマリロ））を使用し製造者の推奨する条件で培養培地をアッセイした。L104EA29YIgは、二次アロ刺激後のT細胞のIL-2、IL-4およびγ-IFNサイトカイン産生の遮断に関して、CTLA4Igより強力であることがわかった（図5A〜C）。
【０１３１】
サル混合リンパ球反応（MLR）に対するL104EA29YIgおよびCTLA4Igの効果を図6に示す。2匹のサルの末梢血単核細胞（PBMC；各サルから3.5×104細胞/ウェル）をリンパ球分離媒体（LSM）で精製し、2μg/mlのフィトヘマグルチニン（PHA）と混合した。細胞を3日間刺激した後、放射標識を16時間パルスしてから収集した。L104EA29YIgはサルT細胞増殖をCTLA4Igより強く阻害した。
【０１３２】
平衡定数および見かけの速度定数を以下の表に示す（値は3回の異なる実験から得た平均±標準偏差である）
【表２】
【０１３３】
以下に挙げる部位でのCTLA4Igの突然変異誘発によるCD86Ig結合に対する効果を上述のようにSPRによって決定した。主な効果を「＋」記号で示す。
【表３】
【０１３４】
本発明が関係する分野の当業者には明らかであろうが、本発明には、本発明の精神または欠くことのできない特徴から逸脱することなく、上に詳しく開示した態様以外の態様を持たせることができる。したがって上述した本発明の具体的態様は例示であって限定ではないとみなすべきである。本発明の範囲は上記の説明に含まれる実施例に限定されるのではなく特許請求の範囲に記載されているとおりである。
【０１３５】
（配列表）
<110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY
<120> SOLUBLE CTLA4 MUTANT MOLECULES AND USES THEREOF
<130> 186478
<140> 2002-500948
<141> 2001-05-23
<150> 60/287,576
<151> 2000-05-26
<150> 60/214,065
<151> 2000-06-26
<160> 9
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Oncostatin M
CTLA4 (OMCTLA4) Forward Primer
<400> 1
gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Oncostatin M
CTLA4 (OMCTLA4) Reverse Primer
<400> 2
gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42
<210> 3
<211> 1152
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:L104EA29YIg
<400> 3
atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60
agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120
ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180
acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240
gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300
gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360
gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420
attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480
acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140
ccgggtaaat ga 1152
<210> 4
<211> 383
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:L104EA29YIg
<400> 4
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 5
<211> 1152
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:L104EIg
<400> 5
atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60
agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120
ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180
acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240
gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300
gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360
gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420
attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480
acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140
ccgggtaaat ga 1152
<210> 6
<211> 383
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:L104EIg
<400> 6
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 7
<211> 1152
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:CTLA4Ig
<400> 7
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agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120
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acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240
gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300
gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360
gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420
attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480
acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140
ccgggtaaat ga 1152
<210> 8
<211> 383
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:CTLA4Ig
<400> 8
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:MYPPPY amino
acid sequence
<400> 9
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
1 5
【図面の簡単な説明】
【図１】 CD86Igに対するL104EA29YIg、L104EIgおよび野生型CTLA4Igの平衡結合解析を表す図。
【図２】 上記実施例2に記載するヒトCD80またはヒトCD86トランスフェクトCHO細胞へのL104EA29YIg、L104EIgおよびCTLA4Igの結合を示すFACSアッセイのデータを表す図。
【図３】 上記実施例2に記載するCD80陽性およびCD86陽性CHO細胞の増殖の阻害を表す図。
【図４】 上記実施例2で説明するように、L104EA29YIgが一次および二次アロ刺激T細胞の増殖の阻害に関してCTLA4Igより有効であることを示す図。
【図５】 上記実施例2で説明するように、アロ刺激ヒトT細胞におけるIL-2（図5A）、IL-4（図5B）およびγ-インターフェロン（図5C）サイトカイン産生の阻害に関して、L104EA29YIgがCTLA4Igより有効であることを示す図。
【図６】 上記実施例2で説明するように、フィトヘマグルチニン（PHA）刺激サルT細胞の増殖の阻害に関して、L104EA29YIgがCTLA4Igより有効であることを示す図。
【図７】 上記実施例1で説明するようにシグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の突然変異型細胞外ドメイン、およびIg領域を含むCTLA4突然変異体分子（L104EA29YIg）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図８】 上記実施例1で説明するようにシグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の突然変異型細胞外ドメイン、およびIg領域を含むCTLA4突然変異体分子（L104EIg）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図９】 シグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列、およびIg領域を持つCTLA4Igのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図１０】 CTLA4Ig（レーン1）、L104EIg（レーン2）およびL104EA29YIg（レーン3A）のSDSゲル（図10A）ならびにCTLA4Ig（図10B）およびL104EA29YIg（図10C）のサイズ排除クロマトグラフ。
【図１１】 NMR分光法によって決定された溶液構造から作成したCTLA4細胞外Ig V様フォールドのリボン図。図11BはS25〜R33領域およびMYPPPY領域の拡大図であって、アビディティーを増大させる突然変異L104およびA29の位置と側鎖の向きとを示している。
【図１２】 L104EA29YIgインサートを持つベクターpiLN-LEA29Yの概略図。
本願明細書では様々な刊行物を参照する。これらの刊行物の内容は、本発明が属する技術分野の水準をより詳しく説明するために、参照によりそのまま本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はCD80および/またはCD86を結合する能力が維持されるように野生型CTLA4から突然変異させた可溶性CTLA4分子の分野に関する。
【０００３】
（発明の背景）
Tリンパ球と抗原提示細胞（APC）とが抗原非特異的に細胞間相互作用すると、抗原に対するT細胞応答をもたらすT細胞共刺激シグナルが生じる（JenkinsおよびJohnson（1993）Curr.Opin.Immunol. 5:361-367）。共刺激シグナルは抗原に対するT細胞応答の強度と、その応答が抗原に対するそれ以降の応答を活性化するか不活化するかを決定する（Muellerら（1989）Annu.Rev.Immunol. 7:445-480）。
【０００４】
共刺激の不在下でT細胞の活性化が起こると、T細胞応答は中止されるか、またはアネルギー状態になる（Schwartz,R.H.（1992）Cell 71:1065-1068）。重要な共刺激シグナルの一つはT細胞表面レセプターCD28と抗原提示細胞上のB7関連分子（例えば、それぞれB7-1とB7-2またはC80とCD86と呼ばれる分子）との相互作用によって生じる（P.LinsleyおよびJ.Ledbetter（1993）Annu.Rev.Immunol. 11:191-212）。
【０００５】
現在CD80（B7-1）と呼ばれている分子は、元々はヒトB細胞関連活性化抗原として記載された分子であり（Yokochi,T.ら（1981）J.Immunol. 128:823-827；Freeman,G.J.ら（1989）J.Immunol. 143:2714-2722）、その後、関連するT細胞分子CD28およびCTLA4のカウンターレセプターであることが確認された（Linsley,P.ら（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5031-5035；Linsley,P.S.ら（1991a）J.Exp.Med. 173:721-730；Linsley,P.S.ら（1991b）J.Exp.Med. 174:561-570）。
【０００６】
さらに最近になって、CTLA4のもう一つのカウンターレセプターが抗原提示細胞上に同定された（Azuma,N.ら（1993）Nature 366:76-79；Freeman（1993a）Science 262:909-911；Freeman,G.J.ら（1993b）J.Exp.Med. 178:2185-2192；Hathcock,K.L.S.ら（1994）J.Exp.Med. 180:631-640；Lenschow,D.J.ら（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11054-11058；Ravi-Wolf,Z.ら（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11182-11186; Wu,Y.ら（1993）J.Exp.Med. 178:1789-1793）。この分子は現在、CD86（Caux,C.ら（1994）J.Exp.Med. 180:1841-1848）と呼ばれているが、B7-0（Azumaら（1993）前掲)またはB7-2（Freemanら（1993a）前掲）とも呼ばれ、その細胞外領域は、CD80と約25％の配列一致度を持っている（Azumaら（1993）前掲；Freemanら（1993a）前掲；同（1993b）前掲）。CD86トランスフェクト細胞は、C28が媒介するT細胞応答をトリガーする（Azumaら（1993）前掲；Freemanら（1993a)(1993b）前掲）。
【０００７】
CD80とCD86の発現の比較はいくつかの研究の主題になっている（Azumaら（1993）前掲；Hathcockら（1994）前掲；Larsen,C.P.ら（1994）J.Immunol. 152:5208-5219；Stack,R.M.ら（1994）J.Immunol. 152:5723-5733）。最新のデータは、CD80とCD86の発現が異なる調節を受けることを示しており、免疫応答に際してCD86発現はCD80発現に先だって起こる傾向があることを示唆している。
【０００８】
可溶型のCD28およびCTLA4は、CD28およびCTLA4の可変領域（v）様細胞外ドメインを免疫グロブリン（Ig）定常ドメインに融合してCD28IgおよびCTLA4Igを得ることによって構築されている。CTLA4IgはCD80陽性細胞にもCD86陽性細胞にもCD28Igより強く結合する（Linsley,P.ら（1994）Immunity 1:793-80）。インビトロでもインビボでも多くのT細胞依存性免疫応答がCTLA4Igによって遮断される（Linsleyら（1991b）前掲；Linsley,P.S.ら（1992a）Science 257:792-795；Linsley,P.S.ら（1992b）J.Exp.Med. 176:1595-1604；Lenschow,D.J.ら（1992）Science 257:789-792；Tan,P.ら（1992）J.Exp.Med. 177:165-173；Turka,L.A.(1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11102-11105）。
【０００９】
Peachら（J.Exp.Med.（1994）180:2049-2058）は、CTLA4の細胞外ドメインのなかで、CD80への強い結合にとって重要な領域を同定した。具体的に述べると、相補性決定領域3（CDR3）様領域中のヘキサペプチドモチーフ（MYPPPY）は、全てのCD28およびCTLA4ファミリーメンバーで、完全に保存されていることが確認された。CTLA4中のMYPPPYモチーフおよびCD28Ig中の選択した残基にアラニンスキャニング法によって突然変異を導入すると、CD80への結合が減少するか、または消失した。
【００１０】
CTLA4とCD28の相同領域を入れ替えたキメラ分子も構築された。HS4、HS4-AおよびHS4-BはCTLA4のCDR3様領域を移植することによって構築された分子である。CTLA4のCDR3様領域はカルボキシ末端に延長部分を持つので、CD28Igにいくつかの非保存アミノ酸残基が導入されることになる。これらの相同突然変異体はCD80に対してCD28Igよりも高い結合アビディティーを示した。
【００１１】
もう一つのキメラ相同突然変異体群では、空間的にCDR3様領域に隣接すると予測されCD28には保存されていないCTLA4のCDR1様領域が、HS4およびHS4-Aに移植された。これらのキメラ相同突然変異体分子（HS7およびHS8と呼ばれている）は、CD80に対してCD28Igよりもさらに高い結合アビディティーを示した。
【００１２】
HS7およびHS8にCTLA4のCDR2様領域を移植することによってさらにキメラ相同突然変異体分子が作製されたが、この組合わせではCD80に対する結合アビディティーは改善されなかった。したがって、CTLA4およびCD28のMYPPPYモチーフはCD80への結合にとって決定的な意味を持つと結論されたが、CTLA4のCDR1様領域中およびCDR3様領域中の非保存アミノ酸残基も、CTLA4のCD80との高い結合アビディティーの一因になっていた。
【００１３】
CTLA4IgはCD80に関係するT細胞共刺激を効果的に遮断することが明らかにされているが、CD86に関係する応答の遮断にはそれほど有効でない。抗原特異的活性化細胞のプライミングを遮断する能力がおそらくCTLA4Igより高い分子として、可溶性CTLA4突然変異体分子、特にCD86に対して野生型CTLA4より高いアビディティーを持つ分子を構築した。
【００１４】
既知の可溶型CTLA4より優れている免疫抑制用および癌処置用医薬組成物を得るために、改良されたCTLA4分子が依然として必要とされている。
【００１５】
（発明の要旨）
したがって本発明は、CD80および/またはCD86を結合する可溶性CTLA4突然変異体分子を提供する。本発明の突然変異体分子には、CD80もしくはCD86またはその両方を認識し結合することができるものが含まれる。一部の態様では、突然変異体分子は、CTLA4より高いアビディティーでCD80および/またはCD86を結合する。
【００１６】
CTLA4突然変異体分子の一例は本明細書に記載のL104EA29YIg（図7）である。CTLA4突然変異体分子のもう一つの例は本明細書に記載のL104EIg（図8）である。L104EA29YIgおよびL104EIgはCTLA4Igよりも強くCD80およびCD86を結合する。
【００１７】
（詳細な説明）
定義
本明細書で使用する以下の用語または表現は以下に指定する意味を持つ。
【００１８】
本明細書にいう「野生型CTLA4」は、CD80および/またはCD86を結合しかつ/またはCD80および/またはCD86がそのリガンドと結合するのを妨害する天然の完全長CTLA4（米国特許第5,434,131号、第5,844,095号、第5,851,795号）またはその細胞外ドメインのアミノ酸配列を持つ。具体的態様として、野生型CTLA4の細胞外ドメインは＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるか、または−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わる。野生型CTLA4はN末端の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびC末端の細胞質ドメインを持つ細胞表面タンパク質である。細胞外ドメインはCD80やCD86などの標的抗原に結合する。細胞では、天然の野生型CTLA4タンパク質はN末端にシグナルペプチドを持つ未成熟ポリペプチドとして翻訳される。この未成熟ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断および除去を含む翻訳後プロセシングを受けて、未成熟型のN末端とは異なる新たに生成したN末端を持つCTLA4切断産物をもたらす。さらなる翻訳後修飾が起こって、CTLA4切断産物の新たに生成したN末端から1または複数のアミノ酸が除去される場合もありうることは、当業者には理解されるだろう。成熟型のCTLA4分子にはCTLA4の細胞外ドメインまたはCD80および/またはCD86に結合するその一部が含まれる。
【００１９】
「CTLA4Ig」は、Igテールに接合された野生型CTLA4またはCD80および/またはCD86を結合するその一部を含む可溶性融合タンパク質である。ある態様は、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わる野生型CTLA4の細胞外ドメイン、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む（図9）。
【００２０】
本明細書にいう「融合タンパク質」は、米国特許第5,434,131号または第5,637,481号に記載されているような当技術分野周知の方法を使って一つに接合された1または複数のアミノ酸配列であると定義される。接合されたアミノ酸配列はその結果、一つの融合タンパク質を形成する。
【００２１】
本明細書にいう「CTLA4突然変異体分子」は、CTLA4（好ましくはCTLA4の細胞外ドメイン）に1または複数の突然変異を持っているため、野生型CTLA4分子に類似しているがもはや同一ではなく、完全長CTLA4であってもその一部（誘導体または断片）であってもよい分子である。CTLA4突然変異体分子はCD80もしくはCD86またはその両方を結合する。突然変異型CTLA4分子には、生物学的または化学的に活性な非CTLA4分子が含まれているか、または結合されていてもよい。突然変異体分子は可溶性（すなわち循環性）であってもよいし、表面に結合されていてもよい。CTLA4突然変異体分子はCTLA4の全細胞外ドメインまたはその一部、例えば断片もしくは誘導体を含むことができる。CTLA4突然変異体分子は合成法または組換え法で製造することができる。
【００２２】
本明細書で使用する用語「突然変異」とは、野生型ポリペプチドのヌクレオチド配列中またはアミノ酸配列中の変化をいう。この場合は野生型CTLA4細胞外ドメイン中の変化である。この変化は置換、欠失、付加または切断を含むアミノ酸変化であることができる。突然変異体分子は1または複数の突然変異を持つことができる。当技術分野ではよく知られているように、ヌクレオチド配列中の突然変異はアミノ酸配列の突然変異をもたらす場合もあるし、アミノ酸配列の突然変異をもたらさない場合もある。これに関連して、いくつかのヌクレオチドコドンは同じアミノ酸をコードする。例えばアミノ酸の一つアルギニン（R）をコードするヌクレオチドコドンCGU、CGG、CGCおよびCGA、またはアミノ酸の一つアスパラギン酸（D）をコードするコドンGAUおよびGACが、その例である。したがってあるタンパク質は、ヌクレオチド配列の詳細は異なっているがそれでもなお同じ配列を持つタンパク質分子をコードしている1または複数の核酸分子によってコードすることができる。アミノ酸コード配列は以下の通りである。
【表１】
本明細書にいう「CTLA4の細胞外ドメイン」は、CD80および/またはCD86を認識し結合するCTLA4の一部である。例えば、CTLA4のある細胞外ドメインは＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを含む（図9）。あるいは、CTLA4のある細胞外ドメインは、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までを含む（図9）。細胞外ドメインにはCD80および/またはCD86を結合するCTLA4の断片または誘導体が包含される。
【００２４】
本明細書にいう「非CTLA4タンパク質配列」または「非CTLA4分子」は、CD80および/またはCD86を結合せず、CTLA4がその標的に結合するのを妨害しない任意の分子であると定義される。一例として免疫グロブリン（Ig）定常領域またはその一部が挙げられるが、これに限るわけではない。Ig定常領域は、好ましくは、ヒトまたはサルIg定常領域、例えばヒンジ、CH2およびCH3領域を含むヒトC(ガンマ)1である。Ig定常領域は、突然変異によってそのエフェクター機能を低下させることができる（米国特許第5,637,481号および第6,132,992号）。
【００２５】
本明細書にいう「CTLA4突然変異体分子の断片」は、標的（例えばCD80および/またはCD86）を認識し結合するCTLA4突然変異体分子の一部、好ましくはCTLA4の細胞外ドメインまたはその一部である。
【００２６】
本明細書にいう「CTLA4突然変異体分子の誘導体」は、CTLA4の細胞外ドメインと少なくとも70％の配列類似性を持ち、CTLA4の細胞外ドメインのように機能する（すなわちCD80および/またはCD86を認識し結合する）分子である。
【００２７】
本明細書にいう「CTLA4分子の一部」には、CD80および/またはCD86を結合するCTLA4分子の断片および誘導体が包含される。
【００２８】
本明細書に記載の発明をさらに詳しく理解することができるように、以下の説明を行う。
【００２９】
本発明の組成物
本発明はCD80および/またはCD86を認識し結合する可溶性CTLA4突然変異体分子を提供する。一部の態様では、本可溶性CTLA4突然変異体はCD80および/またはCD86に対してCTLA4Igより高いアビディティーを持つ。
【００３０】
CTLA4突然変異体分子の一例としてL104EA29YIgが挙げられる（図7）。L104EA29YIgのアミノ酸配列はアミノ酸位置−1のアラニンから始まって、アミノ酸位置＋357のリジンで終わることができる。もう一つの選択肢として、L104EA29YIgのアミノ酸配列はアミノ酸位置＋1のメチオニンから始まって、アミノ酸位置＋357のリジンで終わることもできる。L104EA29YIgのCTLA4部分はアミノ酸位置＋1のメチオニンからアミノ酸位置＋124のアスパラギン酸までを包含する。L104EA29YIgは、＋125位にある接合部アミノ酸残基グルタミンと、＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分とを含む（図7）。L104EA29YIgは野生型CTLA4Ig（以下CTLA4Igという）と比較してCD80には約2倍強く、またCD86には約4倍強く結合する。このように強く結合するため、L104EA29YIgは免疫応答の遮断にCTLA4Igより有効である。
【００３１】
CTLA4突然変異体分子は少なくともCTLA4の細胞外ドメインまたはCD80および/またはCD86を結合するその一部を含む。CTLA4突然変異体分子の細胞外部分は＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含む（図7または8）。もう一つの選択肢として、CTLA4の細胞外部分は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を含んでもよい（図7または8）。
【００３２】
一態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、＋25のセリンから始まって＋33のアルギニンで終わるアミノ酸配列の一領域（S25〜R33）中に1または複数の突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば野生型CTLA4の＋29位のアラニンをチロシン（コドン：UAU、UAC）で置換することができる。あるいは、アラニンをロイシン（コドン：UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG）、フェニルアラニン（コドン：UUU、UUC）、トリプトファン（コドン：UGG）またはスレオニン（コドン：ACU、ACC、ACA、ACG）で置換することもできる。当業者には容易に理解できるだろうが、RNA配列のウラシル（U）ヌクレオチドはDNA配列のチミン（T）ヌクレオチドに相当する。
【００３３】
もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、＋97のメチオニンから始まって＋107のグリシンで終わるアミノ酸配列の一領域（M97〜G107）中またはその近傍に1または複数の突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば野生型CTLA4の＋104位にあるロイシンをグルタミン酸（コドン：GAA、GAG）で置換することができる。この置換を持つCTLA4突然変異体分子を本明細書ではL104EIgという（図8）。
【００３４】
さらにもう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、S25〜R33領域中およびM97〜G107領域中に1または複数の突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。例えば一態様として、CTLA4突然変異体分子は＋29位にアラニンの代わりにチロシンを含み、＋104位にロイシンの代わりにグルタミン酸を含む。これらの置換を持つCTLA4突然変異体分子を本明細書ではL104EA29YIgという（図7）。L104EA29YIgをコードする核酸分子はpD16L104EA29YIgに含まれ、2000年6月19日にバージニア州20110-2209マナッサス・ユニバーシティブルバード10801のAmerican Type Culture Collection（ATCC）に寄託された（ATCC番号PTA-2104）。pD16L104EA29YIgベクターはpcDNA3ベクター（INVITROGEN）の誘導体である。
【００３５】
さらに本発明は、図7もしくは8に示すCTLA4突然変異体の細胞外ドメインまたはその一部と、CTLA4突然変異体分子の溶解性、アフィニティーおよび/または結合価を変化させる部分とを含む可溶性CTLA4突然変異体分子も提供する。
【００３６】
本発明の実施態様として、上記の部分は免疫グロブリン定常領域またはその一部とすることができる。生体内用途には、前記免疫グロブリン定常領域が対象の体内で有害な免疫応答を誘発しないことが好ましい。例えば臨床プロトコールでは、突然変異体分子がヒトまたはサル免疫グロブリン定常領域を含むことが好ましいだろう。適切な免疫グロブリン領域の一例は、ヒンジ、CH2およびCH3領域を含むヒトC(ガンマ)1である。他のアイソタイプも使用することができる。さらに他の免疫グロブリン定常領域（好ましくは免疫原性が弱いか免疫原性を持たない他の免疫グロブリン定常領域）も使用することができる。
【００３７】
上記部分の他の例として、ポリペプチドタグが挙げられる。適切なタグの例には、例えばp97分子、env gp120分子、E7分子、およびova分子などがあるが、これらに限るわけではない（Dash,B.ら（1994）J.Gen.Virol. 75:1389-97；Ikeda,T.ら（1994）Gene 138:193-6；Falk,K.ら（1993）Cell.Immunol. 150:447-52；Fujisaka,K.ら（1994）Virology 204:789-93）。他の分子をタグとして使用することもできる（Gerard,C.ら（1994）Neuroscience 62:721-739；Byrn,R.ら,J.Virol.（1989）63:4370-4375；Smith,D.ら（1987）Science 238:1704-1707；Lasky,L.（1996）Science 233:209-212）。
【００３８】
さらに本発明は、CD80および/またはCD86抗原に対して野生型CTLA4より反応性が高い可溶性突然変異型CTLA4Ig融合タンパク質を提供する。その一例は図7に示すL104EA29YIgである。
【００３９】
もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、CTLA4部分と免疫グロブリン部分との間に位置する接合部アミノ酸残基を含む。接合部アミノ酸はグルタミンを含めて、どのアミノ酸であってもよい。接合部アミノ酸は当技術分野で知られる分子法または化学合成法によって導入することができる。
【００４０】
もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、免疫グロブリン部分のヒンジドメイン内のシステイン残基の一部または全部、例えば＋130、＋136または＋139位のシステインが、セリンで置換されている免疫グロブリン部分（例えばヒンジ、CH2およびCH3ドメイン）を含む（図7または8）。突然変異体分子は図7または8に示すように＋148位のプロリンがセリンで置換されていてもよい。
【００４１】
可溶性CTLA4突然変異体分子は突然変異体分子のCTLA4部分の細胞外ドメインのN末端に結合したシグナルペプチドを持っていてもよい。シグナルペプチドは、例えばオンコスタチンM（Malikら（1989）Molec.Cell.Biol. 9:2847-2853）もしくはCD5（Jones,N.H.ら（1986）Nature 323:346-349）のシグナルペプチドまたは任意の細胞外タンパク質のシグナルペプチドなど、突然変異体分子の分泌を可能にする配列であればなんでもよい。
【００４２】
突然変異体分子は、CTLA4の細胞外ドメインのN末端に結合したオンコスタチンMシグナルペプチド、およびCTLA4の細胞外ドメインのC末端に結合したヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）を含むことができる。この分子は、−26位のメチオニンから−1位のアラニンまでのアミノ酸配列を包含するオンコスタチンMシグナルペプチド、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミンおよび＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでのアミノ酸配列を包含する免疫グロブリン部分を含む。
【００４３】
本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は分子法または化学合成法によって得ることができる。分子法には以下の工程が含まれるだろう：可溶性CTLA4突然変異体分子を発現させコードする核酸分子を適切な宿主細胞に導入する工程、核酸分子が導入された前記宿主細胞を、宿主細胞による前記突然変異体分子の発現が可能な条件で培養する工程、および発現した突然変異体分子を単離する工程。突然変異体分子のシグナルペプチド部分は、タンパク質分子が細胞表面に発現され、宿主細胞によって分泌されることを可能にする。翻訳された突然変異体分子は、シグナルペプチドの切断によるCTLA4部分および免疫グロブリン部分を持つ成熟タンパク質の生成を伴う翻訳後修飾を受けることができる。この切断が−1位のアラニンの後ろで起こると＋1位のメチオニンを第1アミノ酸とする成熟突然変異体分子が生成する（図7または8）。あるいは、この切断が−2位のメチオニンの後ろで起こると、−1位のアラニンを第1アミノ酸とする成熟突然変異体分子が生成する。
【００４４】
好ましい一態様は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）の全部または一部に結合したヒトCTLA4の細胞外ドメインを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子である。この好ましい分子は、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を包含する可溶性分子のCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋29位のアラニンがチロシンで置換され、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130、＋136および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異させてもよい。この突然変異体分子を本明細書ではL104EA29YIg（図7）と呼ぶ。
【００４５】
L104EA29YIgのもう一つの態様は、−1位のアラニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸（例えば＋126位から＋357位のリジンまで）を包含する免疫グロブリン部分を持つ突然変異体分子である。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋29位のアラニンがチロシンで置換され、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子の免疫グロブリン部分は、＋130、＋136および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異体分子を本明細書ではL104EA29YIg（図7）と呼ぶ。シグナル配列が切断されると、L104EA29YIgは＋1位のメチオニンから始まるか、または−1位のアラニンから始まることができる。
【００４６】
本発明のもう一つの突然変異体分子は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）に結合したヒトCTLA4の細胞外ドメインを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子である。この分子は、CTLA4をコードするアミノ酸配列のうち＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至る部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでのアミノ酸配列を包含する免疫グロブリン部分を含む。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子のヒンジ部分は、＋130、＋136および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異分子を本明細書ではL104EIgという（図8）。
【００４７】
もう一つの選択肢として、L104EIgの一態様は、ヒト免疫グロブリン分子（例えばヒンジ、CH2およびCH3）に結合したヒトCTLA4の細胞外ドメインを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子である。この好ましい分子は、−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸に至るアミノ酸配列を包含するCTLA4部分、＋125位の接合部アミノ酸残基グルタミン、および＋126位のグルタミン酸から＋357位のリジンまでを包含する免疫グロブリン部分を含む。CTLA4の細胞外ドメインを持つ部分は、＋104位のロイシンがグルタミン酸で置換されるように突然変異している。この突然変異体分子のヒンジ部分は、＋130、＋136および＋139位のシステインがセリンで置換され、＋148位のプロリンがセリンで置換されるように突然変異している。この突然変異体分子を本明細書ではL104EIgという（図8）。
【００４８】
さらに本発明は、（a）第2アミノ酸配列に融合された、T細胞増殖を遮断する膜糖タンパク質（例えばCD28、CD86、CD80、CD40およびgp39）の第1アミノ酸配列、（b）T細胞増殖を遮断する突然変異型CTLA4の細胞外ドメインの断片である第2アミノ酸配列、例えば＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までを含むアミノ酸分子（図7または8）、および（c）識別タグとして働くまたは分子の溶解性を高める第3アミノ酸配列を持つ可溶性CTLA4突然変異体分子を提供する。例えば第3アミノ酸配列は、基本的に、非免疫原性免疫グロブリン分子のヒンジ、CH2およびCH3領域のアミノ酸残基からなることができる。適切な免疫グロブリン分子の例として、ヒトまたはサル免疫グロブリン、例えばC(ガンマ)1が挙げられるが、これに限るわけではない。他のアイソタイプも使用することができる。
【００４９】
さらに本発明は、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子に相当するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一態様として、本核酸分子はDNA（例えばcDNA）またはそのハイブリッドである。もう一つの選択肢として、本核酸分子はRNAまたはそのハイブリッドである。
【００５０】
さらに本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターも提供する。また宿主ベクター系も提供する。本宿主ベクター系は適切な宿主細胞に本発明のベクターを含んでなる。適切な宿主細胞の例としては原核細胞および真核細胞が挙げられるが、これらに限るわけではない。
【００５１】
本発明は、医薬有効量のCTLA4突然変異体分子を含む免疫系疾患処置用医薬組成物を包含する。特定の態様では、免疫系疾患は、CD28陽性および/またはCTLA4陽性細胞がCD80陽性および/またはCD86陽性細胞と相互作用することによって媒介される。可溶性CTLA4突然変異体分子は、好ましくは、CTLA4の細胞外ドメイン中に1または複数の突然変異を持つCTLA4分子である。医薬組成物は可溶性CTLA4突然変異体タンパク質分子および/または前記分子をコードする核酸分子および/またはベクターを含むことができる。好ましい態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、図7または8のいずれかに示すCTLA4の細胞外ドメイン（それぞれL104EA29YまたはL104E）のアミノ酸配列を持つ。さらに好ましくは、可溶性CTLA4突然変異体分子は本明細書に開示するL104EA29YIgである。本組成物はさらに、例えば薬物毒素、酵素、抗体またはコンジュゲートなど、他の治療薬を含んでもよい。
【００５２】
また好ましくは、本医薬組成物は、本発明の分子（例えばL104EA29YまたはL104Eなどの可溶性CTLA4分子）と混合したときに本発明分子の活性を損なわず、かつ対象の免疫系と反応しない適切な担体および佐剤も含む。適切な担体および佐剤の例としてはヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、緩衝剤（リン酸塩、グリシンなど）、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、および塩類または電解質（硫酸プロタミンなど）が挙げられるが、これらに限らない。他の例としては通常の医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩溶液、水、エマルション（油/水エマルションなど）、および様々なタイプの湿潤剤が挙げられる。他の担体として、滅菌溶液、コート錠などの錠剤、カプセル剤を挙げることもできる。通例、このような担体は賦形剤、例えばデンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、植物性脂肪、植物油、ゴム、グリコールまたは他の既知の賦形剤を含む。このような担体には香料および着色料または他の成分を含めることもできる。このような担体を含む組成物は周知の従来法によって製剤化することができる。そのような組成物は例えばリポソームなどの様々な脂質組成物およびポリマーマイクロスフェアなどのポリマー組成物中に製剤化することもできる。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、例えば静脈内（i.v.）投与、腹腔内（i.p.）投与、筋肉内（i.m.）投与、皮下投与、経口投与、坐剤としての投与、または局所接触、またはミニ浸透圧ポンプなどの徐放装置の対象への植込みなど、通常の投与法を用いて投与することができる。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、坐剤、ポリマー製マイクロカプセル、リポソームおよび注射液または注入液など、様々な剤形をとることができる。好ましい剤形は投与形式および治療用途に依存する。
【００５５】
本発明組成物の最も有効な投与形式および用法は、疾患の重症度および経過、患者の健康状態および処置に対する反応ならびに処置を行う医師の判断に依存する。したがって本組成物の用量は患者毎に調整すべきである。
【００５６】
可溶性CTLA4突然変異体分子は、対象の体内で内因性B7（例えばCD80および/またはCD86）分子がそれぞれのリガンドと結合するのを遮断するのに十分な量および期間（例えば時間および/または複数回）対象に投与されるだろう。内因性B7/リガンド結合の遮断により、B7陽性細胞（例えばCD80陽性および/またはCD86陽性細胞）とCD28陽性および/またはCTLA4陽性細胞との相互作用が阻害される。治療薬の投与量は、例えば患部組織のタイプ、処置しようとする自己免疫疾患のタイプ、疾患の重症度、患者の健康状態、その薬剤による処置に対する患者の反応など、多くの因子に依存する。したがって薬剤の投与量は対象および投与形式に依存して変動しうる。可溶性CTLA4突然変異体分子は0.1〜20.0mg/kg-患者体重/日、好ましくは0.5〜10.0mg/kg/日の量で投与することができる。本発明の医薬組成物の投与は様々な時間にわたって実施することができる。一態様として、本発明の医薬組成物は1時間以上にわたって投与することができる。また、投与は疾患の重症度および当技術分野で知られる他の因子に応じて繰り返すこともできる。
【００５７】
さらに本発明は、タンパク質を製造する方法であって、本発明の宿主ベクター系を宿主中でタンパク質が産生されるように生育することおよびそのようにして産生されたタンパク質を回収することを含む方法も提供する。
【００５８】
さらに本発明は、機能的CTLA4陽性およびCD28陽性T細胞とCD80陽性および/またはCD86陽性細胞との相互作用を調節する方法も提供する。この方法では、内因性CTLA4抗原とCD80および/またはCD86との反応を妨害しかつ/または内因性CD28抗原とCD80および/またはCD86との反応を妨害する突然変異型CTLA4/CD80複合体および/または突然変異型CTLA4/CD86複合体が形成されるように、CD80陽性および/またはCD86陽性細胞を本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子と接触させる。本発明の一態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子は、突然変異型CTLA4の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む融合タンパク質である。もう一つの態様として、可溶性CTLA4突然変異体分子には、＋1位のメチオニンから＋124位のアスパラギン酸までのアミノ酸配列を有し少なくとも1つの突然変異を持つCTLA4の細胞外ドメインを含む第1アミノ酸配列、ならびにヒト免疫グロブリンガンマ1分子のヒンジ、CH2およびCH3領域を含む第2アミノ酸配列が含まれる（図7または8）。
【００５９】
本発明の実施態様として、CD80陽性またはCD86陽性細胞を、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子の断片または誘導体と接触させる。もう一つの選択肢として可溶性CTLA4突然変異体分子は、CTLA4突然変異体レセプターの細胞外ドメインの一部に相当する第2アミノ酸配列に融合したCD28レセプターの細胞外ドメインの一部に相当する第1アミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンC-ガンマ-1のヒンジ、CH2およびCH3領域に相当する第3アミノ酸配列を持つCD28Ig/CTLA4Ig融合タンパク質である。
【００６０】
可溶性CTLA4突然変異体分子はインビボで阻害特性を示すと予想される。T細胞/APC細胞相互作用、例えばT細胞/B細胞相互作用がT細胞とAPC細胞の接触の結果として起こっているような状態では、導入されたCTLA4突然変異体分子が結合してCD80陽性および/またはCD86陽性細胞、例えばB細胞に対する反応を起こすことにより、T細胞/APC細胞相互作用が妨害、すなわち阻害され、その結果、免疫応答が調節されることになるだろう。
【００６１】
本発明は免疫応答をダウンレギュレートする方法を提供する。可溶性CTLA4突然変異体分子による免疫応答のダウンレギュレーションは、既に進行中の免疫応答を阻害または遮断する目的で行ってもよいし、免疫応答の誘導を予防するものであってもよい。本発明の可溶性CTLA4分子は、T細胞応答を抑制することによって、もしくはT細胞に特異的寛容を誘発することによって、またはその両方によって、例えばTリンパ球増殖およびサイトカイン分泌などの活性化T細胞の機能を阻害するだろう。
【００６２】
さらに本発明は、免疫系疾患を処置し寛容を誘導する方法も提供する。具体的態様では、免疫系疾患はCD28陽性および/またはCTLA4陽性細胞とCD80/CD86陽性細胞との相互作用によって媒介される。さらなる一態様では、T細胞相互作用が阻害される。免疫系疾患の例としては自己免疫疾患、免疫細胞増殖性疾患および移植関連障害が挙げられるが、これらに限るわけではない。これらの方法では、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子を投与して、T細胞とCD80陽性および/またはCD86陽性細胞との相互作用を調節する。もう一つの選択肢として、CTLA4突然変異体分子に接合した膜糖タンパク質を持つCTLA4突然変異体ハイブリッドを投与することもできる。移植関連疾患の例には、移植片対宿主疾患（GVHD）（例えば骨髄移植によって起こるもの、または寛容の誘導をもたらすもの）、移植拒絶、慢性拒絶および組織または細胞（例えば固形臓器、皮膚、島、筋、肝細胞、ニューロンなど）の同種移植もしくは異種移植に関係する免疫障害がある。免疫細胞増殖性疾患の例には、乾癬、T細胞リンパ腫、T細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性T細胞リンパ腫、良性リンパ球性血管炎、および自己免疫疾患、例えば狼蒼（例：エリテマトーデス、ループス腎炎）、橋本甲状腺腫、原発性粘液水腫、グレーヴス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（例：インシュリン依存性糖尿病、I型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（例：慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症、および混合結合組織病などがあるが、これらに限るわけではない。
【００６３】
さらに本発明は、移植組織のレシピエントである対象による固形臓器および/または組織移植拒絶を阻害する方法も提供する。通例、組織移植の場合、移植片の拒絶はT細胞がそれを異物と認識することによって開始され、次いで移植片を破壊する免疫応答が起こる。本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は、Tリンパ球増殖および/またはサイトカイン分泌を阻害することによって組織破壊を軽減するだろう。また、抗原特異的T細胞不応答性の誘導により、全身的な免疫抑制を行わなくても、長期にわたる移植片の受容が起こるだろう。さらに、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は、例えばコルチコステロイド、シクロスポリン、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、タクロリムス、バシリキシマブ、および/または他の生物製剤などといった他の医薬と共に投与することもできる。
【００６４】
また本発明は、対象における移植片対宿主病を抑制する方法も提供する。この方法では、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子が単独で、またはIL-2、IL-4またはγ-インターフェロンと反応する他の追加リガンドと共に、対象に投与される。例えば、ドナーT細胞のアロ反応性を阻害するために、本発明の可溶性CTLA突然変異体分子を骨髄移植レシピエントに投与することができる。あるいは、骨髄移植片内のドナーT細胞を、移植に先立ってエクスビボで、レシピエントのアロ抗原に対して寛容化してもよい。
【００６５】
可溶性CTLA4突然変異体分子によるT細胞応答の阻害は自己免疫障害の処置にも役立つだろう。多くの自己免疫障害は自己抗原に対して反応性を持つT細胞の不適切な活性化によって起こり、これは、その疾患の病理に関係するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する。自己免疫障害を患っているまたは自己免疫障害を起こしやすい対象に可溶性CTLA4突然変異体分子を投与すれば、自己反応性T細胞の活性化が妨げられ、疾患症状が軽減または除去されるだろう。この方法では、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子を単独で、またはIL-2、IL-4またはγ-インターフェロンと反応する他の追加リガンドと共に、対象に投与してもよい。
【００６６】
さらに本発明は、可溶性CTLA4突然変異体分子と他の免疫抑制剤、例えばシクロスポリン（Mathiesen「シクロスポリンA処置ラットの中枢死因軽々における異種移植ヒト膠芽腫細胞の長期生存および血管新生（Prolonged Survival and Vascularization of Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclosporin A-Treated Rats）」（1989）Cancer Lett.,44:151-156参照）、プレドニソン、アザチオプリンおよびメトトレキセート（R.Handschumacher「第53章：免疫抑制に使用される薬物（Chapter 53: Drugs
Used for Immunosuppression）」1264〜1276頁）との併用も包含する。他の免疫抑制剤も使用することができる。例えば慢性関節リウマチの処置には、可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬/Cox-2阻害剤、メトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾピリン、金塩、エタナーセプト、インフリキシマブ、アナキンラ、アザチオプリン、および/または抗TNFのような他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。全身性エリテマトーデスの処置には、可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、サイトキサン、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキン、ミコフェノール酸モフェチルおよび/または他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。さらに、多発性硬化症の処置には、可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えばコルチコステロイド、インターフェロンβ-1a、インターフェロンβ-1b、酢酸グラチラマー、塩酸ミトキサントロン、および/または他の生物製剤などといった医薬と共に投与することができる。
【００６７】
可溶性CTLA4突然変異体分子（好ましくはL104EA29YIg）は、免疫応答を調節するために、以下の薬剤の1または複数と併用することもできる：可溶性gp39（CD40リガンド（CD40L）、CD154、T-BAM、TRAPとも呼ばれる）、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD28、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、gp39と反応する抗体、CD40と反応する抗体、B7と反応する抗体、CD28と反応する抗体、LFA-1と反応する抗体、LFA-2と反応する抗体、IL-2と反応する抗体、IL-12と反応する抗体、IFN-γと反応する抗体、CD2と反応する抗体、CD48と反応する抗体、ICAM（例えばICAM-2）と反応する抗体、CTLA4と反応する抗体、Thy-1と反応する抗体、CD56と反応する抗体、CD3と反応する抗体、CD29と反応する抗体、TCRと反応する抗体、VLA-4と反応する抗体、VCAM-1と反応する抗体、LECAM-1と反応する抗体、ELAM-1と反応する抗体、CD44と反応する抗体。ある態様では、モノクローナル抗体が好ましい。また他の態様では抗体断片が好ましい。当業者には容易に理解されるように、併用には、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子と他の免疫抑制剤1種、可溶性CTLA4突然変異体分子と他の免疫抑制剤2種、可溶性CTLA4突然変異体分子と他の免疫抑制剤3種などを含めることができる。最適な組合わせおよび用量は、当技術分野で周知の方法を使って決定し、最適化することができる。
【００６８】
具体的な組合わせの例には以下の組合わせがある：L104EA29YIgおよびCD80モノクローナル抗体；L104EA29YIgおよびCD86モノクローナル抗体；L104EA29YIg、CD80モノクローナル抗体およびCD86モノクローナル抗体；L104EA29YIgおよびgp39モノクローナル抗体；L104EA29YIgおよびCD40モノクローナル抗体；L104EA29YIgおよびCD28モノクローナル抗体；L104EA29YIg、CD80およびCD86モノクローナル抗体、gp39モノクローナル；L104EA29YIg、CD80およびCD86モノクローナル抗体、およびCD40モノクローナル抗体；L104EA29YIg、抗LFA1モノクローナル抗体、および抗gp39モノクローナル抗体。gp39モノクローナル抗体の具体例はMR1である。当業者には他の組合わせもすぐにわかるだろう。
【００６９】
本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子、例えばL104EA29Yは、例えば同種または異種移植片の急性または慢性拒絶、または自己免疫障害の処置または予防のために、または寛容を誘導するために、唯一の活性物質として、または免疫調節措置に使用される他の薬物と共に、または他の抗炎症剤と共に使用することができる。例えば、本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子は、以下の薬物と併用することができる：カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンAまたはFK506、免疫抑制性マクロライド、例えばラパマイシンまたはその誘導体、例えば40-O-(2-ヒドロキシ)エチルラパマイシン、リンパ球ホーミング剤、例えばFTY720またはその類似体、コルチコステロイド、シクロホスファミド、アザチオプレン（azathioprene）、メトトレキセート、レフルノミドまたはその類似体、ミゾリビン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、15-デオキシスパガリンまたはその類似体、免疫抑制性モノクローナル抗体、例えば白血球レセプター、例えばMHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BBまたはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体、または他の免疫調節化合物、例えばCTLA4/CD28-Ig、または他の接着分子阻害剤、例えばLFA-1アンタゴニスト、セレクチンアンタゴニストおよびVLA-4アンタゴニストなどのモノクローナル抗体もしくは低分子量阻害剤。本化合物は、CD40およびそのリガンドを妨害する化合物、例えばCD40に対する抗体およびCD40-Lに対する抗体と併用すると、例えば上記の適応症（例：寛容の誘導）に、とりわけ有用である。
【００７０】
本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子を、例えば上述したような他の免疫抑制/免疫調節または抗炎症療法と併用して投与する場合、同時投与される免疫抑制剤、免疫調節剤または抗炎症性化合物の用量は、もちろん、使用する併用薬のタイプ（例えばステロイドかシクロスポリンか）、実際に使用する薬物、処置しようとする状態などに依存して変動する。
【００７１】
上記の説明に従って、本発明は、さらなる一側面として、遊離型または医薬的に許容できる塩型の本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子L104EA29YIgを、第2の医薬物質と同時にまたは逐次的に同時投与することを含み、前記第2の医薬物質が例えば上述の免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬薬物であるような、上に定義した方法を提供する。さらに本発明は、免疫抑制薬、免疫調節薬または抗炎症薬を含む少なくも1つの医薬組成物と同時にまたは逐次的に使用される遊離型または医薬的に許容できる塩型のL104EA29YIgを含む、上に定義した方法で使用される治療的組合わせ、例えばキットも提供する。
【００７２】
本発明分子の製造方法
CTLA4突然変異体分子は原核細胞で発現させることができる。原核細胞の最も一般的な代表例は種々の細菌株である。細菌はグラム陽性菌でもグラム陰性菌でもよい。典型的には大腸菌などのグラム陰性細菌が好ましい。他の微生物株も使用することができる。
【００７３】
CTLA4突然変異体分子をコードする配列は、大腸菌などの原核細胞で外来配列を発現させるために設計されたベクターに挿入することができる。これらのベクターは一般に使用される原核制御配列を含むことができる。この原核制御配列とは、本明細書では、リボソーム結合部位配列と共に転写開始用のプロモーターを含み、所望によりオペレーターを含んでもよいと定義され、例えばβ-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモーター系（Changら（1977）Nature 198:1056）、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら（1980）Nucleic Acids Res. 8:4057）およびラムダ由来のPLプロモーターおよびN遺伝子リボソーム結合部位（Shimatakeら（1981）Nature 292:128）などといった一般に使用されるプロモーターを含む。
【００７４】
このような発現ベクターは、ベクターが細菌中で複製することができるように、そしてアンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質の存在下で生育した時に当該プラスミドを保有する細胞を選択することができるように、複製起点と、抗生物質に対する耐性を付与するβ-ラクタマーゼまたはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの選択マーカーも含むだろう。
【００７５】
発現プラスミドは、例えばCaCl2ショック（Cohen（1972）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110およびSambrookら編「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor Press（1989））およびエレクトロポレーションなど、様々な標準的方法で原核細胞に導入することができる。
【００７６】
本発明の実施態様として、真核細胞も適切な宿主細胞である。真核細胞の例には、初代または不死化動物細胞、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシェ、シゾサッカロミセス・ポンベおよびピキア・パストリス）および植物細胞などがある。骨髄腫、COS細胞、CHO細胞は、宿主として使用することができる動物細胞の例である。CHO細胞の具体例には、例えばDG44（Chasinら,1986,Som.Cell.Molec.Genet. 12:555-556；Kolkekar,1997,Biochemistry 36:10901-10909）、CHO-K1（ATCC No.CCL-61）、CHO-K1 Tet-On細胞株（Clontech）、ECACC85050302のCHO（CAMR（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））、CHOクローン13（GEIMG（イタリア・ジェノバ））、CHOクローンB（GEIMG（イタリア・ジェノバ））、ECACC93061607のCHO-K1/SF（CAMR（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））およびECACC92052129のRR-CHOK1（CAMR（英国ウィルトシャー・ソールズベリー））などがある。植物細胞の代表例としては、タバコ（全草、細胞培養またはカルス）、トウモロコシ、ダイズおよびコメ細胞などがある。トウモロコシ、ダイズおよびコメ種子も利用することができる。
【００７７】
CTLA4突然変異体分子をコードする核酸配列は、真核宿主で外来配列を発現させるために設計されたベクターに挿入することもできる。このベクターの調節要素は、使用する真核宿主に応じて様々である。
【００７８】
一般に使用されるベクター発現用の真核制御配列は、ほ乳類細胞に適合したプロモーターおよび制御配列、例えばCMVプロモーター（CDM8ベクター）およびトリ肉腫ウイルス（ASV）（πLNベクター）などを含む。他の一般に使用されるプロモーターには、例えばシミアンウイルス40（SV40）の初期および後期プロモーター（Fiersら（1973）Nature 273:113）、または他のウイルスプロモーター、例えばポリオーマ、アデノウイルス2およびウシ乳頭腫ウイルス由来のものなどがある。hMTII（Karinら（1982）Nature 299:797-802）などの誘導性プロモーターも使用することができる。
【００７９】
真核生物中でCTLA4突然変異体分子を発現させるためのベクターはエンハンサー領域と呼ばれる配列を持ってもよい。これらは遺伝子発現の最適化に重要であり、プロモーター領域の上流または下流に見いだされる。
【００８０】
真核宿主細胞用の発現ベクターの例には、ほ乳類宿主細胞用のベクター（例えばBPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2（Maniatis）；pIRES（Clontech）；pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFV1（Life Technologies）；pVPakcベクター、pCMVベクター、pSG5ベクター（Stratagene））、レトロウイルスベクター（例えばpFBベクター（Stratagene））、pCDNA-3（Invitrogen）またはその修飾型、アデノウイルスベクター；アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、酵母ベクター（例えばpSECベクター（Stratagene））などがあるが、これらに限るわけではない。
【００８１】
CTLA4突然変異体分子をコードする核酸配列は、真核宿主細胞のゲノムに組み込んで、宿主ゲノムの複製と共に複製させることができる。あるいは、CTLA4突然変異体分子を保有するベクターに複製起点を含ませて、染色体外複製を可能にすることもできる。
【００８２】
サッカロミセス・セレビシェで核酸配列を発現させるには、内因性酵母プラスミド2μ環状DNA由来の複製起点を使用することができる（Broach（1983）Meth.Enz. 101:307）。もう一つの選択肢として、自律的複製を促進する酵母ゲノム由来の配列を使用することもできる（例えばStinchcombら（1979）Nature 282:39）、Tschemperら（1980）Gene 10:157、およびClarkeら（1983）Meth.Enz. 101:300）。
【００８３】
酵母ベクター用の転写制御配列としては例えば糖分解酵素を合成するためのプロモーターが挙げられる（Hessら（1968）J.Adv.Enzyme Reg. 7:149、Hollandら（1978）Biochemistry 17:4900）。当技術分野で知られる他のプロモーターには、例えばCDM8ベクターに含まれるCMVプロモーター（ToyamaおよびOkayama（1990）FEBS 268:217-221）、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Hitzemanら（1980）J.Biol.Chem. 255:2073）および他の糖分解酵素のプロモーターなどがある。
【００８４】
その他、誘導性のプロモーターもあり、これらは環境刺激または細胞の成長培地によって調節することができる。これらの誘導性プロモーターには、例えば熱ショックタンパク質、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素異化に関係する酵素、およびマルトースおよびガラクトース資化を担う酵素の遺伝子に由来するものなどがある。
【００８５】
調節配列はコード配列の3'末端にも置くことができる。これらの配列はメッセンジャーRNAを安定化するように作用するだろう。そのようなターミネーターはいくつかの酵母由来遺伝子およびほ乳類遺伝子のコード配列に続く3'非翻訳領域に見いだされる。
【００８６】
植物用ベクターおよび植物細胞の代表例には、アグロバクテリウムTiプラスミド、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）およびトマトゴールデンモザイクウイルス（TGMV）などがあるが、これらに限るわけではない。
【００８７】
ほ乳類細胞宿主系形質転換の一般面は、1983年8月16日発行の米国特許第4,399,216号にAxelらが記載している。ほ乳類細胞は、例えばリン酸カルシウム存在下でのトランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの方法、またはウイルスベクターによる形質導入によって形質転換することができる。
【００８８】
植物および酵母ゲノムに外来DNA配列を導入する方法としては、（1）機械的方法、例えば単一細胞またはプロトプラストへのDNAのマイクロインジェクション、DNAの存在下で細胞をガラスビーズと共にボルテックスする方法、またはDNAで覆ったタングステンまたは金球体を細胞またはプロトプラストに撃ち込む方法など、（2）ポリエチレングリコール処理または高圧電気パルスの印加（エレクトロポレーション）によって巨大分子に対して細胞膜を透過性にすることにより、DNAを導入する方法、または（3）リポソーム（cDNAを含むもの）を使って細胞膜に融合させる方法などが挙げられる。
【００８９】
CTLA4突然変異体分子の発現は当技術分野で知られた方法によって検出することができる。例えば突然変異体分子はSDS-PAGEゲルのクーマシー染色およびCTLA4を結合する抗体を使った免疫ブロッティングによって検出することができる。タンパク質の回収は、標準的なタンパク質精製手段、例えばアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて実質的に純粋な産物を得ることによって行うことができる（R.Scopes「Protein Purification,Principles and Practice」第3版,Springer-Verlag（1994））。
【００９０】
本発明はさらに、上で製造された可溶性CTLA4突然変異体分子も提供する。
【００９１】
CTLA4Igコドンベース突然変異誘発法
一態様として、部位特異的突然変異誘発法および新規スクリーニング法を使って、CD86に対する結合アビディティーを向上させるCTLA4の細胞外ドメイン中の突然変異をいくつか同定した。この態様では、CTLA4の細胞外ドメインのうち、セリン25からアルギニン33までの領域、C'鎖（アラニン49およびスレオニン51）、F鎖（リジン93、グルタミン酸95およびロイシン96）、メチオニン97からチロシン102までの領域、チロシン103からグリシン107までの領域、そしてグルタミン111、チロシン113およびイソロイシン115のG鎖中の残基に突然変異を導入した。これらの部位は、キメラCD28/CTLA4融合タンパク質の研究（Peachら,J.Exp.Med.,1994,180:2049-2058）、どのアミノ酸残基側鎖が溶媒露出しているかを予測するモデル、およびCD28とCTLA4の間で一定の位置にアミノ酸残基同一性または相同性が欠けていることに基づいて選択した。また、特定した残基に空間的に近接（5〜20オングストローム単位）している残基も本発明の一部とみなされる。
【００９２】
CD80および/またはCD86に対するアフィニティーが変化している可溶性CTLA4突然変異体分子を合成し選別するために、2段階法を採用した。これらの実験では、まず、CTLA4の細胞外ドメインの特定コドンにおける突然変異のライブラリーを作製し、次にBIAcore解析によってそれらをスクリーニングすることにより、CD80またはCD86に対する反応性が変化している突然変異体を同定した。BIAcoreアッセイシステム（Pharmacia（ニュージャージー州ピスカタウェイ））では、検出器に配置されたデキストラン被覆センサーチップへのCD80IgまたはCD86Igの共有結合が基本的に必要な表面プラズモン共鳴検出器システムを使用する。次に、センサーチップを含むチャンバーに試験分子を注入し、結合する相補的タンパク質の量を、センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に結合している分子量の変化に基づいて評価することができ、分子量の変化は検出器システムによって測定することができる。
【００９３】
本発明の利点
CD80およびCD86へのCTLA4結合は迅速な「オン」速度と迅速な解離（「オフ」）速度とを特徴とすること、またCTLA4Ig-CD86複合体はCTLA4Ig-CD80複合体よりおよそ5〜8倍迅速に解離することから、CD80および/またはCD86からのCTLA4Igの解離速度を遅くすることにより、より強力な免疫抑制特性を持つ分子が得られるだろうと考えた。したがってCD80陽性またはCD86陽性細胞に対して野生型CTLA4または非突然変異型CTLA4Igより高いアビディティーを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子は、CTLA4または非突然変異型CTAL4Igよりも高い効率で抗原特異的活性化細胞のプライミングを遮断すると予想される。
【００９４】
さらにまたCTLA4Igの製造コストは極めて高い。より強力な免疫抑制特性を持つ高アビディティー突然変異型CTLA4Ig分子は、臨床的に非突然変異型CTLA4Igよりかなり低い用量で使用しても、ほぼ同等の免疫抑制レベルを達成することができる。したがって可溶性CTLA4突然変異体分子、例えばL104EA29YIgは費用効果が極めて高いだろう。
【００９５】
本発明を例示して、当業者がそれを製造し使用する際の助けとなるように、以下に実施例を記載する。以下の実施例は決して本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００９６】
実施例
実施例1
この実施例では本発明の可溶性CTLA4突然変異体分子をコードするヌクレオチド配列を作製するために使用する方法を説明する。一部位突然変異体L104EIgを作製し、CD80および/またはCD86に関する結合動態を調べた。テンプレートとしてL104EIgヌクレオチド配列を使用して、二部位突然変異型CTLA4配列L104EA29YIgを作製し、CD80および/またはCD86に関する結合動態を調べた。
【００９７】
CTLA4Ig コドンベース突然変異誘発
CD80および/またはCD86分子からの解離速度（「オフ」速度）が遅くなっている突然変異型CTLA4Ig分子を同定するために、突然変異誘発およびスクリーニング方法を開発した。テンプレートとしてCTLA4Ig（米国特許第5,844,095号、第5,851,795号および第5,885,796号、ATCC受託番号68629）を使用して、一部位突然変異体ヌクレオチド配列を作製した。コドンの1位および2位は任意の塩基であってよいが3位はグアニンまたはチミンのみ（XXG/T；NNG/Tともいう）とすることにより、特定cDNAコドンのランダム突然変異誘発用の変異原オリゴヌクレオチドPCRプライマーを設計した。この方法でアミノ酸をコードする特定のコドンを、20アミノ酸のそれぞれをコードするように、ランダムに突然変異させた。このXXG/T突然変異誘発法では、20アミノ酸のそれぞれをコードする32種類のコドンが得られる。CTLA4IgのM97〜G107（図7または8参照）付近に突然変異をコードするPCR産物をSacI/XbaIで消化し、同様に切断したCTLA4IgπLN発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使って、一部位CTLA4突然変異体分子L104EIg（図8）を作製した。
【００９８】
CTLA4IgのS25〜R33付近の突然変異誘発については、PCRプライマー指定突然変異誘発法によって、まず、このループの5'側にサイレントなNheI制限部位を導入した。PCR産物をNheI/XbaIで消化し、同様に切断したCTLA4IgまたはL104EIg発現ベクターにサブクローニングした。この方法を使って、二部位CTLA4突然変異体分子L104EA29YIg（図7）を作製した。具体的には、テンプレートとして一部位CTLA4突然変異体分子L104EIgをコードする核酸分子を使用して、二部位CTLA4突然変異体分子L104EA29YIgを作製した。L104EA29YIgを含むpiLNベクターを図12に示す。
【００９９】
実施例2
以下に、実施例1に記載のコンストラクトから発現された一部位および二部位突然変異型CTLA4ポリペプチドであって、CD80およびCD86抗原に対して非突然変異型CTLA4Ig分子より高い結合アビディティーを示すものを同定するために使用したスクリーニング方法を説明する。
【０１００】
最新のインビトロおよびインビボ研究により、CTLA4Ig単独では抗原特異的活性化T細胞のプライミングを完全には遮断できないことが示されている。CTLA4Igと、CD80またはCD86に特異的なモノクローナル抗体とを用いてT細胞増殖の阻害を測定したインビトロ研究では、抗CD80モノクローナル抗体がCTLA4Ig阻害を増強しなかったことが示されている。しかし、抗CD86モノクローナル抗体は阻害を増強したことから、CTLA4IgはCD86相互作用の遮断にはあまり有効でないことがわかる。これらのデータは、CD80が媒介する細胞応答の阻害に必要なCTLA4Ig濃度はCD86が媒介する細胞応答の場合の約1/100であることを示したLinsleyら（Immunity（1994）1:793-801）による初期の発見を裏付けている。これらの知見に基づいて、CD86に対して野生型CTLA4より高いアビディティーを持つ可溶性CTLA4突然変異体分子は、抗原特異的活性化細胞のプライミングをCTLA4Igより良く遮断することができるはずであると推測した。
【０１０１】
そこで、新しいスクリーニング法を用いて上記実施例1に記載の可溶性CTLA4突然変異体分子をスクリーニングして、CD80およびCD86に対する結合アビディティーを向上させるCTLA4の細胞外ドメイン中の突然変異をいくつか同定した。「オフ」速度の決定は濃度に依存しないので、このスクリーニング方法は、「オフ」速度が遅くなっていると思われる突然変異体を、タンパク質精製または定量を行わずに直接同定するための効果的な方法になる（O'Shannessyら（1993）Anal.Biochem.,212：457-468）。
【０１０２】
COS細胞に個々のミニプレップ精製プラスミドDNAをトランスフェクトし、数日間増殖させた。3日調整培養培地を可溶性CD80IgまたはCD86Igで被覆したBIAcoreバイオセンサーチップ（Pharmacia Biotech AB（スウェーデン・ウプサラ）にかけた。突然変異体タンパク質の特異的結合および解離を、表面プラズモン共鳴によって測定した（O'Shannessy,D.J.ら（1993）Anal.Biochem. 212:457-468）。実験は全てBIAcore（商標）またはBIAcore（商標）2000バイオセンサーを使って25℃で行った。リガンドは一般的なN-エチル-N'-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドN-ヒドロキシスクシンイミドカップリング法を使って研究用NCM5センサーチップ（Pharmacia）に固定化した（Johnsson,B.ら（1991）Anal.Biochem. 198:268-277、Khilko,S.N.ら（1993）J.Biol.Chem 268:5425-15434）。
【０１０３】
スクリーニング法
24穴組織培養プレートで生育したCOS細胞に、突然変異型CTLA4IgをコードするDNAを一過性にトランスフェクトした。分泌された可溶性突然変異型CTLA4Igを含む培養培地を3日後に収集した。
【０１０４】
Greeneら,1996,J.Biol.Chem. 271:26762-26771に記載されているようにCD86IgまたはCD80Igで誘導体化したBIAcoreバイオセンサーチップに、COS細胞調整培養培地を流し、野生型CTLA4Igに見られる「オフ」速度より遅い「オフ」速度を持つ突然変異体分子を同定した。選択した培地試料に対応するcDNAを配列決定した。また、COS細胞一過性トランスフェクションを大量に行って、そこから培養培地のプロテインA精製によって突然変異型CTLA4Igタンパク質を調製するために、DNAを調製した。
【０１０５】
BIAcore解析条件および平衡結合データ解析はJ.Greeneら,1996,J.Biol.Chem. 271:26762-26771および本明細書に記載されているように行った。
【０１０６】
BIAcore データ解析
分析に先立ってセンサーグラムのベースラインをゼロ応答単位（RU）に標準化した。試料をモック誘導化フローセルに流して、溶液間のバルク屈折率差によるバックグラウンド応答単位（RU）値を決定した。平衡解離定数（Kd）はReq対Cのプロットから計算した。ここに、Reqは（定常状態応答）−（モック誘導化チップでの応答）であり、Cは分析物のモル濃度である。結合曲線は市販の非線形カーブフィッティングソフトウェア（Prism、GraphPAD Software）を使って解析した。
【０１０７】
実験データは、まず単一レセプターへの単一リガンド結合のモデル（1部位モデル、すなわち単純なラングミュアー系、A＋B←→AB）にあてはめ、平衡結合定数（Kd＝[A][B]/[AB]）を式：R＝Rmax・C/(Kd＋C)から計算した。次に、データを、リガンド結合の最も簡単な二部位モデル（すなわち、式：R＝Rmax1・C/(Kd1＋C)＋Rmax2・C/(Kd2＋C)で表される2つの相互作用しない独立した結合部位を持つレセプター）にあてはめた。
【０１０８】
これら2つのモデルの適合度を、実験データとの比較によって視覚的に、また平方和のF検定によって統計的に解析した。二部位モデルの方が適合度が有意に高くない限り（p＜0.1）、より単純な一部位モデルをベストフィットとして選択した。
【０１０９】
結合および解離解析はBIAevaluation2.1ソフトウェア（Pharmacia）を使って行った。結合速度定数konは均一な一部位相互作用および並行2部位相互作用の両方を仮定して2つの方法で計算した。一部位相互作用の場合は、Rt＝Req(1-exp-ks(t-t0)）［式中、Rtは時刻tにおける応答、Reqは定常状態応答、t0は注入を開始した時刻、ks＝dR/dt＝kon・Ckoffであって、Cはモノマー結合部位に関して計算した分析物の濃度である］に従ってkon値を計算した。二部位相互作用の場合は、式：Rt＝Req1(1-exp-ks1(t-t0)）＋Req2(1-expks2(t-t0)）に従ってkon値を計算した。各モデルについて、ks対Cのプロットの傾き（最大結合の約70％まで）の計算値からkonの値を決定した。
【０１１０】
解離データは一部位モデル（AB＝A＋B）または二部位モデル（AiBj＝Ai＋Bj）に従って解析し、速度定数（koff）をベストフィット曲線から計算した。誤差が機械のバックグランド（機械によって2〜10RU）より大きい場合（その場合は二結合部位モデルを使用）を除いて、上記結合部位モデルを使用した。レセプター占有の半減期はt1/2＝0.693/koffの関係を使って計算した。
【０１１１】
フローサイトメトリー
マウスモノクローナル抗体L307.4（抗CD80）はBecton Dickinson（カリフォルニア州サンホゼ）から購入し、IT2.2（抗B7-0［CD86とも呼ばれる］）はPharmingen（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。免疫染色のために、10mM EDTAを含むリン酸緩衝食塩水（PBS）中でインキュベートすることによって、CD80陽性および/またはCD86陽性CHO細胞を培養器から取り出した。CHO細胞（1〜10×105個）をまずモノクローナル抗体または免疫グロブリン融合タンパク質と共に10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むDMEM中でインキュベートした後、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリン第2段階試薬と共にインキュベートした（Tago（カリフォルニア州バーリンゲーム））。細胞に最終洗浄を施し、FACScan（Becton Dickinson）で解析した。
【０１１２】
SDS-PAGE およびサイズ排除クロマトグラフィー
SDS-PAGEはトリス/グリシン4-20％アクリルアミドゲル（Novex（カリフォルニア州サンディエゴ））で行った。分析用ゲルはクーマシーブルーで染色し、デジタルスキャニングによって湿ゲルの画像を得た。0.02％NaN3を含むリン酸緩衝食塩水で平衡化したTSK-GEL G300 SWXLカラム（7.8×300mm、Tosohaas（ペンシルバニア州モントゴメリービル））を使用し、1.0ml/分の流量で、CTLA4Ig（25μg）およびL104EA29YIg（25μg）をサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【０１１３】
CTLA4X C120S および L104EA29YX C120S
一本鎖CTLA4XC120Sを先に記述されているように製造した（Linsleyら（1995）J.Biol.Chem.,270:15417-15424）。簡単に述べると、オンコスタチンM CTLA4（OMCTLA4）発現プラスミドをテンプレートとして使用し、ベクター中の配列に適合するようにフォワードプライマー：
GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG
を選択した。またリバースプライマー：
GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC
は、CTLA4の細胞外ドメインの最後の7アミノ酸（すなわちアミノ酸118〜124）に相当し、制限酵素部位および停止コドン（TGA）を含んだ。C120S（120位におけるシステインからセリンへの）突然変異はリバースプライマーによって指定された。具体的に述べると、上記リバースプライマーのヌクレオチド配列GCA（ヌクレオチド34〜36）を以下のヌクレオチドの一つで置き換える：AGA、GGA、TGA、CGA、ACTまたはGCT。当業者には理解されるであろうが、ヌクレオチド配列GCAはシステインのコドンTGCの逆相補配列である。同様に、ヌクレオチド配列AGA、GGA、TGA、CGA、ACTまたはGCTはセリンのコドンの逆相補配列である。ポリメラーゼ連鎖反応産物をHindIII/XbaIで消化し、発現ベクターπLN（Bristrol-Myers Squibb Company（ニュージャージー州プリンストン））に特定の向きでサブクローニングした。各コンストラクトをDNA配列決定によって確認した。
【０１１４】
高アビディティー突然変異体の同定および生化学的特徴づけ
24のアミノ酸を突然変異誘発用に選択し、得られた約2300の突然変異型タンパク質を、表面プラズモン共鳴法（SPR；上記の方法）により、CD86Ig結合に関してアッセイした。各部位での突然変異誘発の主な効果を表３に要約する。S25〜R33中のアミノ酸の一部にはランダム突然変異を施してもリガンド結合は変化しないようだった。E31およびR33ならびに残基M97〜Y102の突然変異誘発はリガンド結合の低下をもたらすようだった。残基S25、A29、およびT30、K93、L96、Y103、L104、およびG105の突然変異誘発は「オン」速度の低下および/または「オフ」速度の低下をもたらした。これらの結果は、S25〜R33領域中の残基およびM97〜Y102中またはその近傍にある残基がリガンド結合に影響するという先の発見を裏付けている（Peachら（1994）J.Exp.Med.,180：2049-2058）。
【０１１５】
部位S25、T30、K93、L96、Y103およびG105の突然変異誘発によって、「オフ」速度がCD86Igより遅い突然変異体がいくつか同定された。しかしこれらの例では、遅い「オフ」速度が遅い「オン」速度と相殺して、CD86Igに対して野生型CTLA4Igで見られるアビディティーと見かけ上同じ程度の総アビディティーを持つ突然変異体が得られた。また、K93の突然変異誘発はかなりの凝集をもたらしたが、これも観察された動態変化の原因になっていたのだろう。
【０１１６】
L104にランダム突然変異誘発を行った後、COS細胞のトランスフェクションおよび固定化CD86Igに対する培養培地試料のSPRによるスクリーニングを行ったところ、「オフ」速度が野生型CTLA4Igのおよそ1/2しかない突然変異体タンパク質を含む培地試料が6つ得られた。これら突然変異体の対応するcDNAを配列決定したところ、いずれもロイシンからグルタミン酸への突然変異（L104E）をコードすることがわかった。ロイシン104からアスパラギンへの置換（L104D）はCD86Ig結合に影響を及ぼさないようだった。
【０１１７】
次に、今度はPCRテンプレートとして野生型CTLA4IgではなくL104Eを使用して、表３に列挙した各部位で、上述のように突然変異誘発を繰り返した。再び固定化CD86Igを使ってSPR解析を行ったところ、アラニン29の突然変異誘発により、「オフ」速度が野生型CTLA4Igのおよそ1/4しかないタンパク質を含む培養培地試料が6つ同定された。最も遅い2つはチロシン置換（L104EA29Y）、2つはロイシン（L104EA29L）、1つはトリプトファン（L104EA29W）、そして1つはスレオニン（L104EA29T）だった。野生型CTLA4Igのアラニン29を単独でランダムに突然変異させても遅い「オフ」速度を持つ突然変異体は同定されないようだった。
【０１１８】
精製したL104EおよびL104EA29YIgの相対分子量および凝集状態をSDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって評価した。L104EA29YIg（約1μg；レーン3）およびL104EIg（約1μg；レーン2）は、還元条件（約50kDa；＋βME；＋2-メルカプトエタノール）でも非還元条件（約100kDa；−βME）でも、CTLA4Ig（約1μg；レーン1）と見かけ上同じ電気泳動移動度を持っていた（図10A）。サイズ排除クロマトグラフィーにより、L104EA29YIg（図10C）はCTLA4Ig二量体（図10B）と見かけ上同じ移動度を持つことが証明された。主要ピークはタンパク質二量体に相当し、図10Bで速く溶出するマイナーピークは高分子量凝集体に相当する。CTLA4Igの約5.0％は高分子量凝集体として存在したが、L104EA29YIgまたはL104EIgの凝集を示す証拠は認められなかった。したがって、L104EIgおよびL104EA29YIgに見られたCD86Igへの強い結合は、突然変異誘発が誘発した凝集に起因するものではないと考えられる。
【０１１９】
平衡結合解析および速度論的結合解析
プロテインAで精製したCTLA4Ig、L104EIg、およびL104EA29YIgに対し、表面プラズモン共鳴法（SPR）を使って、平衡結合解析および速度論的結合解析を行った。結果を表２に示す。観察された平衡解離定数（Kd；表２）はある濃度範囲（5.0〜200nM）にわたって作成した結合曲線から計算した。L104EA29YIgはL104EIgまたはCTLA4Igより強くCD86Igに結合する。L104EA29YIgのKd（3.21nM）がL104EIg（6.06nM）またはCTLA4Ig（13.9nM）より低いことは、L104EA29YIgの方がCD86Igに対して高い結合アビディティーを持つことを示している。L104EA29YIgのKd（3.66nM）がL104EIg（4.47nM）またはCTLA4Ig（6.51nM）より低いことは、L104EA29YIgの方がCD80Igに対して高い結合アビディティーを持つことを示している。
【０１２０】
速度論的結合解析により、CD80に対するCTLA4Ig、L104EIgおよびL104EA29YIg結合の「オン」速度は同じぐらいであり、CD86Igに関する「オン」速度も同様であることがわかった（表２）。しかしこれらの分子の「オフ」速度は等しくなかった（表２）。CTLA4Igと比較すると、L104EA29YIgのCD80Igからの「オフ」速度は約1/2、CD86Igからの「オフ」速度は約1/4だった。L104Eの「オフ」速度はL104EA29YIgとCTLA4Igの中間だった。これらの突然変異の導入は「オン」速度には有意な影響を与えなかったので、L104EA29YIgで観察されたCD80IgおよびCD86Igに対するアビディティーの増加は、主として「オフ」速度の低下によると思われた。
【０１２１】
CD86IgおよびCD80Igに対するL104EA29YIgのアビディティーの増加が、各単量体の二量体としての会合の仕方に突然変異が影響を与えたためかどうか、あるいはアビディティーを増大させる構造変化が各単量体に導入されたかどうかを決定するために、CTLA4およびL104EA29Y細胞外ドメインの一本鎖コンストラクトを、上述のように、そしてLinsleyら（1995）J.Biol.Chem.,270:15417-15424に記載のように、システイン120のセリンへの突然変異誘発によって作製した。精製したタンパク質CTLA4XC120SおよびL104EA29YXC120Sが単量体であることをゲル透過クロマトグラフィーによって明らかにした後（Linsleyら（1995）前掲）、それらのリガンド結合特性をSPRによって解析した。その結果、CD86Igに対する両単量体タンパク質の結合アフィニティーはそれぞれの二量体で観察される結合アフィニティーのおよそ35〜80分の1であることがわかった（表２）。これは、高アビディティーリガンド結合にはCTLA4の二量化が必要であることを示す先に公表されたデータを裏付けている（Greeneら（1996）J.Biol.Chem.,271:26762-26771）。
【０１２２】
L104EA29YXC120SはCD80IgにもCD86IgにもCTLA4XC120Sより約2倍高いアフィニティーで結合した。このアフィニティーの増大は、どちらのリガンドからも解離速度が約1/3に低下したためだった。したがって、L104EA29Yによる強いリガンド結合は、分子の二量化に変化があったからではなく、おそらくアビディティーを増大させる構造変化が各モノマー鎖に導入されたためだろう。
【０１２３】
アビディティを増大させる突然変異の位置および構造解析
最近、CTLA4の細胞外IgV様ドメインの溶液構造がNMR分光法によって決定された（Metzlerら（1997）Nature Struct.Biol.,4:527-531）。これにより、三次元フォールドにおけるロイシン104およびアラニン29の正確な位置特定が可能になった（図11A〜B）。ロイシン104は高度に保存されたMYPPPYアミノ酸配列の近くに位置する。アラニン29は、MYPPPY領域に空間的に隣接するS25〜R33領域のC末端近くに位置する。これら2つの領域の基礎をなす残基間には有意な相互作用があるが、L104とA29の間には、どちらもタンパク質の隣接する疎水コアの一部を構成しているものの、直接的な相互作用はないようである。アビディティーを増大させる2つの突然変異が構造にもたらす結果をモデリングによって評価した。A29Y突然変異はS25〜R33領域とMYPPPY領域の間の溝に容易に収納され、MYPPPY領域のコンフォメーションを安定化する役割を果たしうる。野生型CTLA4では、L104はMYPPPY領域に近いL96およびV94と強い疎水相互作用を形成する。グルタミン酸突然変異がL104に似たコンフォメーションをとることは2つの理由からまずあり得ない。第1に、S25〜R33領域に有意な摂動を加えずに構造上長いグルタミン酸側鎖を収容するには空間が不十分である。第2に、グルタミン酸側鎖の負電荷を疎水領域に埋め込むとエネルギー損失が大きい。むしろモデリング研究によれば、グルタミン酸側鎖は表面に飛びだし、表面ではその電荷が溶媒和によって安定化されうることが予測される。このようなコンフォメーション変化は、当該領域中の他の残基に歪みをもたらすことなく、G105によって容易に調節されうる。
【０１２４】
CD80 または CD86 を発現する CHO 細胞への高アビディティー突然変異体の結合
安定にトランスフェクトされたCD80+およびCD86+CHO細胞へのCTLA4Igおよび突然変異体分子結合のFACS解析（図2）を本明細書に記載するように行った。CD80陽性およびCD86陽性CHO細胞を様々な濃度のCTLA4Ig、L104EA29YIgまたはL104EIgと共にインキュベートした後、洗浄した。結合した免疫グロブリン融合タンパク質をフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを使って検出した。
【０１２５】
図2に示すように、CD80陽性またはCD86陽性CHO細胞（1.5×105個）を、表示した濃度のCTLA4Ig（■）、L104EA29YIg（○）またはL104EIg（△）と共に23℃で2時間インキュベートし、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体と共にインキュベートした。合計5,000個の生細胞への結合をFACScanで解析し（単回測定）し、PC-LYSYSを使ってデータヒストグラムから平均蛍光強度（MFI）を決定した。データを、第2段階試薬のみと共にインキュベートした細胞で測定されたバックグラウンド蛍光（MFI＝7）に関して補正した。対照L6モノクローナル抗体（80μg/ml）は30未満のMFIを示した。これらの結果は4回の独立した実験の代表例である。
【０１２６】
ヒトCD80トランスフェクトCHO細胞へのL104EA29YIg、L104EIgおよびCTLA4Igの結合はほぼ同等である（図2A）。L104EA29YIgおよびL104EIgは、ヒトCD86を安定にトランスフェクトしたCHO細胞に、CTLA4Igより強く結合する（図2B）。
【０１２７】
機能アッセイ
ヒトCD4陽性T細胞を免疫磁気ネガティブ選択法によって単離した（Linsleyら（1992）J.Exp.Med. 176:1595-1604）。単離したCD4陽性T細胞を、滴定濃度の阻害剤の存在下にホルバール（phorbal）ミリステートアセテート（PMA）＋CD80陽性またはCD86陽性CHO細胞で刺激した。CD4陽性T細胞（8〜10×104個/細胞）を1nM PMAの存在下で、照射CHO細胞刺激因子と共にまたは同刺激因子なしで培養した。72時間培養の最後の7時間にわたって1μCi/ウェルの[3H]チミジンを添加することにより、増殖応答を測定した。PMA＋CD80陽性CHOまたはCD86陽性CHO刺激T細胞のL104EA29YIgおよびCTLA4Igによる阻害を行った。結果を図3に示す。L104EA29YIgはCD80陽性PMA処理CHO細胞の増殖をCTLA4Igより強く阻害した（図3A）。L104EA29YIgはCD86陽性PMA処理CHO細胞の増殖の阻害にもCTLA4Igより有効だった（図3B）。したがってL104EA29YIgは、T細胞のCD80媒介性共刺激およびCD86媒介性共刺激のどちらについても、より強力な阻害剤である。
【０１２８】
図4は、上で調製したアロ刺激ヒトT細胞を、CD80およびCD86を発現させるPMと呼ばれるヒトBリンパ芽球腫細胞株（LCL）でさらにアロ刺激した細胞のL104EA29YIgおよびCTLA4Igによる阻害を示している（3.0×104個/ウェルのT細胞および8.0×103個/ウェルのPM）。一次アロ刺激を6日間行った後、細胞に3H-チミジンを7時間パルスし、次いで放射ラベルの取込みを決定した。
【０１２９】
二次アロ刺激は以下のように行った。7日間一次アロ刺激したT細胞をリンパ球分離媒体（LSM）（ICN（オハイオ州オーロラ））上に収集し、24時間休止させた。次に、上と同じ比率のPMを加えることにより、滴定量のCTLA4IgまたはL104EA29YIgの存在下で、T細胞を再び（二次）刺激した。3日間刺激した後、細胞に放射標識をパルスし、上記のように収集した。一次アロ刺激T細胞に対するL104EA29YIgの効果を図4Aに示す。二次アロ刺激T細胞に対するL104EA29YIgの効果を図4Bに示す。L104EA29YIgは一次、二次共にT細胞増殖応答をCTLA4Igより強く阻害する。
【０１３０】
サイトカイン産生（図5）を測定するために、一対の二次アロ刺激プレートを用意した。3日後にELISAキット（Biosource（カリフォルニア州カマリロ））を使用し製造者の推奨する条件で培養培地をアッセイした。L104EA29YIgは、二次アロ刺激後のT細胞のIL-2、IL-4およびγ-IFNサイトカイン産生の遮断に関して、CTLA4Igより強力であることがわかった（図5A〜C）。
【０１３１】
サル混合リンパ球反応（MLR）に対するL104EA29YIgおよびCTLA4Igの効果を図6に示す。2匹のサルの末梢血単核細胞（PBMC；各サルから3.5×104細胞/ウェル）をリンパ球分離媒体（LSM）で精製し、2μg/mlのフィトヘマグルチニン（PHA）と混合した。細胞を3日間刺激した後、放射標識を16時間パルスしてから収集した。L104EA29YIgはサルT細胞増殖をCTLA4Igより強く阻害した。
【０１３２】
平衡定数および見かけの速度定数を以下の表に示す（値は3回の異なる実験から得た平均±標準偏差である）
【表２】
以下に挙げる部位でのCTLA4Igの突然変異誘発によるCD86Ig結合に対する効果を上述のようにSPRによって決定した。主な効果を「＋」記号で示す。
【表３】
本発明が関係する分野の当業者には明らかであろうが、本発明には、本発明の精神または欠くことのできない特徴から逸脱することなく、上に詳しく開示した態様以外の態様を持たせることができる。したがって上述した本発明の具体的態様は例示であって限定ではないとみなすべきである。本発明の範囲は上記の説明に含まれる実施例に限定されるのではなく特許請求の範囲に記載されているとおりである。
【０１３５】
（配列表）
<110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY
<120> SOLUBLE CTLA4 MUTANT MOLECULES AND USES THEREOF
<130> 186478
<140> 2002-500948
<141> 2001-05-23
<150> 60/287,576
<151> 2000-05-26
<150> 60/214,065
<151> 2000-06-26
<160> 9
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Oncostatin M
CTLA4 (OMCTLA4) Forward Primer
<400> 1
gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:Oncostatin M
CTLA4 (OMCTLA4) Reverse Primer
<400> 2
gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42
<210> 3
<211> 1152
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:L104EA29YIg
<400> 3
atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60
agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120
ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180
acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240
gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300
gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360
gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420
attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480
acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140
ccgggtaaat ga 1152
<210> 4
<211> 383
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:L104EA29YIg
<400> 4
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 5
<211> 1152
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:L104EIg
<400> 5
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<211> 383
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:L104EIg
<400> 6
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Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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<210> 7
<211> 1152
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:CTLA4Ig
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<210> 8
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:CTLA4Ig
<400> 8
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Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:MYPPPY amino
acid sequence
<400> 9
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
1 5
【図面の簡単な説明】
【図１】 CD86Igに対するL104EA29YIg、L104EIgおよび野生型CTLA4Igの平衡結合解析を表す図。
【図２】 上記実施例2に記載するヒトCD80またはヒトCD86トランスフェクトCHO細胞へのL104EA29YIg、L104EIgおよびCTLA4Igの結合を示すFACSアッセイのデータを表す図。
【図３】 上記実施例2に記載するCD80陽性およびCD86陽性CHO細胞の増殖の阻害を表す図。
【図４】 上記実施例2で説明するように、L104EA29YIgが一次および二次アロ刺激T細胞の増殖の阻害に関してCTLA4Igより有効であることを示す図。
【図５】 上記実施例2で説明するように、アロ刺激ヒトT細胞におけるIL-2（図5A）、IL-4（図5B）およびγ-インターフェロン（図5C）サイトカイン産生の阻害に関して、L104EA29YIgがCTLA4Igより有効であることを示す図。
【図６】 上記実施例2で説明するように、フィトヘマグルチニン（PHA）刺激サルT細胞の増殖の阻害に関して、L104EA29YIgがCTLA4Igより有効であることを示す図。
【図７】 上記実施例1で説明するようにシグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の突然変異型細胞外ドメイン、およびIg領域を含むCTLA4突然変異体分子（L104EA29YIg）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図８】 上記実施例1で説明するようにシグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の突然変異型細胞外ドメイン、およびIg領域を含むCTLA4突然変異体分子（L104EIg）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図９】 シグナルペプチド、＋1位のメチオニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるかまたは−1位のアラニンから始まって＋124位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の細胞外ドメインの野生型アミノ酸配列、およびIg領域を持つCTLA4Igのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を表す図。
【図１０】 CTLA4Ig（レーン1）、L104EIg（レーン2）およびL104EA29YIg（レーン3A）のSDSゲル（図10A）ならびにCTLA4Ig（図10B）およびL104EA29YIg（図10C）のサイズ排除クロマトグラフ。
【図１１】 NMR分光法によって決定された溶液構造から作成したCTLA4細胞外Ig V様フォールドのリボン図。図11BはS25〜R33領域およびMYPPPY領域の拡大図であって、アビディティーを増大させる突然変異L104およびA29の位置と側鎖の向きとを示している。
【図１２】 L104EA29YIgインサートを持つベクターpiLN-LEA29Yの概略図。
Claims (35)
- 配列番号：8で示されるCTLA4の細胞外ドメインの26位のアラニンまたは27位のメチオニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるCTLA4の細胞外ドメインであって、55位のアラニンがチロシンで置換され、130位のロイシンがグルタミン酸で置換されるCTLA4の細胞外ドメインを含む、CD80および/またはCD86を結合するCTLA4突然変異体分子。
- (a)配列番号：4の27位のメチオニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列；または(b)配列番号：4の26位のアラニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列を含む、CTLA4突然変異体分子。
- (a)CD80および/またはCD86を結合する、配列番号：4の27位のメチオニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列；または(b)CD80および/またはCD86を結合する、配列番号：4の26位のアラニンで始まり、150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列を含む、CTLA4突然変異体分子。
- CTLA4突然変異体分子の溶解性を変化させるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１、２または３に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 溶解性を変化させるアミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域を含む、請求項４に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 免疫グロブリン定常領域が、エフェクター機能を低下させるように突然変異している、請求項５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリン分子のヒンジ、CH2およびCH3領域を含む、請求項５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 免疫グロブリン定常領域が、ヒトまたはサル免疫グロブリン定常領域である、請求項５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- (a)配列番号：4の27位のメチオニンで始まり、383位のリジンで終わるアミノ酸配列；または(b)配列番号：4の26位のアラニンで始まり、383位のリジンで終わるアミノ酸配列を含む、CTLA4突然変異体分子。
- (a)配列番号：4の27位のメチオニンで始まり、383位のリジンで終わるアミノ酸配列；または(b)配列番号：4の26位のアラニンで始まり、383位のリジンで終わるアミノ酸配列からなるCTLA4突然変異体分子。
- CTLA4突然変異体分子の分泌を可能にするアミノ酸配列をさらに含む、請求項１、２、３または９に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 分泌を可能にするアミノ酸配列がオンコスタチンMシグナルペプチドを含む、請求項１１に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 配列番号：4の1位のメチオニンで始まり、383位のリジンで終わるアミノ酸配列を含む、CTLA4突然変異体分子。
- 配列番号：3の塩基配列を含むATCC番号PTA-2104の核酸分子によってコードされる、配列番号：4のアミノ酸配列を含むCTLA4突然変異体分子。
- 配列番号：3の塩基配列を含むATCC番号PTA-2104の核酸分子によってコードされる配列番号：4のアミノ酸配列を含むCTAL4突然変異体分子の全細胞外ドメインを含む、CTLA4突然変異体分子。
- 免疫グロブリンがヒンジを含み、ヒンジ内のいずれかまたはすべてのシステイン残基がセリンで置換される、請求項５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 配列番号：4に示されるように、+156位のシステインがセリンで置換され、+162位のシステインがセリンで置換され、+165位のシステインがセリンで置換される、請求項１６に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 配列番号：4に示されるように、免疫グロブリン定常領域が、セリンで置換された+156位のシステイン、セリンで置換された+162位のシステイン、セリンで置換された+165位のシステインおよびセリンで置換された+174位のプロリンを含むように突然変異している、請求項５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 配列番号：4に示されるように、免疫グロブリンが、+152位のグルタミン酸で始まり、+383位のリジンで終わるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 接合部アミノ酸残基が、+150位のアスパラギン酸で終わるアミノ酸配列および免疫グロブリンの間に位置する、接合部アミノ酸残基および免疫グロブリンをさらに含む、請求項１、２または３に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 接合部アミノ酸残基がグルタミンである、請求項２０に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 結合しているCD86からの解離速度が野生型CTLA4より遅い、請求項１、２、３、９または１０に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 可溶性である、請求項１、２、３、９、１０、１４または１５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- CTLA4突然変異体分子が二量体である、請求項１、２、３、９、１０、１４または１５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- CTLA4突然変異体分子が、約100キロダルトンの分子量を有する、請求項１、２、３、９、１０、１４または１５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 分子量が、非還元条件下でのSDS-PAGEによって評価される、請求項２５に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 免疫グロブリン定常領域が、免疫グロブリン分子のヒンジ、CH2およびCH3領域を含む、請求項６に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 可溶性である、請求項２７に記載のCTLA4突然変異体分子。
- CTLA4突然変異体分子が二量体である、請求項２７に記載のCTLA4突然変異体分子。
- CTLA4突然変異体分子が、約100キロダルトンの分子量を有する、請求項２７に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 分子量が、非還元条件下でのSDS-PAGEによって評価される、請求項３０に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 可溶性である、請求項７に記載のCTLA4突然変異体分子。
- CTLA4突然変異体分子が二量体である、請求項７に記載のCTLA4突然変異体分子。
- CTLA4突然変異体分子が、約100キロダルトンの分子量を有する、請求項７に記載のCTLA4突然変異体分子。
- 分子量が、非還元条件下でのSDS-PAGEによって評価される、請求項３４に記載のCTLA4突然変異体分子。
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