HUP0302201A2 - Oldható CTLA4 mutáns molekulák és alkalmazásuk - Google Patents

Abstract

A találmány olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákra vonatkozik, amelyekfelismerik és erősebb aviditással kötik a CD80-at és CD86-ot, mint avad típusú CTLA4. A találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulaegy fúziós protein, amely egy szignálpeptidet, a CTLA4 extracellulárisdoménjét és a humán immunglobulin egy konstans régióját tartalmazza. Amutagenezist helyre irányuló mutagenezissel, PCR alkalmazásávalvégzik. A mutagenizált fúziós proteint pedig géntechnológiaieljárásokkal állítják elő. A találmány szerinti oldható CTLA4Ig mutánsmolekula olyan immunrendszeri betegségek kezelésére alkalmazható, aholimmunszuppresszióra van szükség. Ilyenek pédául az autoimmunbetegségek, immunproliferatív betegségek, szövetátültetés utánikilökődés (graft versus host) stb. Ó

Description

., _r , -./15:665/BE „ , _n , , _n . .. ' ' ' . KOZZETETEEF · *“ _P03 UZZUl , _; - PÉLDÁNY

Oldható CTLA4 mutáns molekulák és alkalmazásuk

A bejelentésben számos közleményre hivatkozunk. A közlemények tartalmát teljes egészükben referenciaként tartalmazza ez a bejelentés abból a célból, hogy azon szakterület technikai állását, amelyhez ez a találmány tartozik, részletesebben ismertessük.

A találmány olyan oldható CTLA4 molekulák területére vonatkozik, amelyeket vad tipusú CTLA4-ből mutagenizáltunk, CD80-hoz és vagy CD86-hoz való kötődési képességének megtartása végett.

A T limfociták és az antigén bemutató sejtek (APC-k) közötti nem antigén-specifikus intercelluláris kölcsönhatások T sejt kostimulációs szignálokat hoznak létre, amelyek antigén ellenes T sejt válaszokat eredményeznek [Jenkins and Johnson, Curr. Opin. Immunoi., 5, 361-367 (1993)]. A kostimulációs szignálok határozzák meg az antigénre adott T sejt válasz erősségét és azt, hogy ez a válasz aktiválja-e vagy inaktiválja-e az antigére adott következő válaszokat [Mueller et al., Annu.Rév.Immunoi., 7, (445-480)].

Kostimuláció hiányában a T sejt aktiválás tökéletlen vagy anergiás T sejt választ eredményez [R.H.Schwartz, Cell, 71, 1065-1068 (1992)]. Kulcsszerepet játszó kostimulációs szignál keletkezik a CD28 T sejt felületi receptor és az antigén bemutató sejteken lévő B7-tel (B7-1 és B7-2 néven, illetve CD80 és CD86 néven is ismert) rokon molekulák közötti kölcsönhatás révén [P.Linsley and J.Ledbetter, Annu. Rev. Immunol., 11, 191-212 (1993)].

A jelenleg CD80-nak nevezett molekulát eredetileg mint humán B sejt-asszociált aktiválási antigént Írták le [T.Yokochi et al., J.Immunoi., 128, 823-827 (1981); G.J. Freeman et al., J.

Immunoi., 143, 2714-2722 (1989)], később pedig a CD28 és CTLA4 rokon T sejt molekulák ellenreceptoraként azonosították [P.Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 5031-5035 (1990); P.S.Linsley et al., J. Exp. Med., 173, 721-730 (1991a);

P.S.Linsley et al., J.Exp.Med., 174, 561-570 )1991b)].

Legújabban a CTLA4 egy másik ellenreceptorát azonosították antigén bemutató sejteken [N.Azuma et al., Nature, 366, 76-79 (1993); Freeman, Science, 262, 909-911 (1993a); G.J.Freeman et al., J. Exp. Med., 178, 2185-2192 (1993b); K.L.S. Hathcock, J. Exp. Med., 180, 631-640 (1994); D.J. Lenschow et al. , Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11054-11058 (1993); Z.Ravi-Wolf et al. , Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11182-11186 (1993); Y.Wu et al. , J.Exp.Med., 178, 1789-1793 (1993)]. Ez a molekula, amelyet ma CD86 néven ismernek [C.Caux et al., J.Exp.Med., 180, 1841-1848 (1994)] — de használják a B7-0 [Azuma et al., (1993) lásd fentebb] vagy B7-2 [Freeman et al., (1993a) lásd fentebb] nevet is a CD80-nal, ennek extracelluláris régiójában, körülbelül 25%os szekvencia azonosságot mutat [Azuma et al., (1993), lásd fentebb; Freeman et al., (1993a), (1993b), lásd fentebb]. A CD86tal transzfektált sejtek CD28-közvetitett T-sejt válaszokat [Azuma et al., (1993), lásd fentebb; Freeman et al., (1993a) (1993b), lásd fentebb] váltanak ki.

A CD80 és CD86 kifejeződésének az összehasonlítása számos tanulmány tárgya volt [Azuma et al., (1993), lásd fentebb; 75.665/BE

Hatchcock et al., (1994), lásd fentebb; C.P.Larsen et al., J. Immunol., 152, 5208-5219 (1994); R.M.Stack et al., J. Immunol., 152, 5723-5733 (1994)]. A jelenlegi adatok azt mutatják, hogy a CD80 és CD86 expressziójának a szabályozása különbözik, és arra engednek következtetni, hogy egy immunválasz folyamán a CD86 expressziója hajlamos arra, hogy megelőzze a CD80 expresszióját.

A CD28 és CTLA4 oldható formáit úgy állították elő, hogy a CD28 és CTLA4 variábilis (v)-szerű extracelluláris doménjét immunglobulin (lg) konstans doménekkel fuzionálták, és így CD28Ig-t és CTLA4Ig-t kaptak. A CTLA4Ig mind a CD80 pozitív, mind a CD86 pozitív sejteket erősebben köti, mint a CD28lg [P.Linsley et al., Immunity, 1, 793-780 (1994)]. A CTLA4Ig számos T sejt-függő immunválaszt blokkol in vitro és in vivo [Linsley et al., (1991b), lásd fentebb; P.S.Linsley et al., Science, 257, 792-795 (1992a); P.S.Linsley et al., J.Exp.Med., 176, 1595-1604 (1992b); D.J.Lenschow et al., Science, 257, 789-792 (1992); P.Tan et al., J. Exp. Med., 177, 165-173 (1992); L.A.Turka, Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 11100-11105 (1992)].

Peach és munkatársai [J. Exp. Med., 180, 2049-2058 (1994)] olyan régiókat azonosítottak a CTLA4 extracelluláris doménjében, amely fontos a CD80-hoz való erős kötődés szempontjából. Pontosabban, a komplementaritást meghatározó 3—as régióban _ (CDR3)szerű régió ^- egy hexapeptid motívumot (MYPPPY) azonosítottak, amely a CD28 és CTLA4 család minden tagjánál teljesen állandó. A CTLA4-ben és a CD28lg—bői kiválasztott csoportoknál az MYPPPY motívum mentén végzett pásztázó alanin mutagenezis csökkentette vagy megszüntette a CD80-hoz való kötődést.

75.665/BE

Kiméra molekulákat is szerkesztettek a CTLA4 és a CD28 homológ régióinak egymás közötti cseréjével. A HS4, HS4-A és HS4-B molekulákat úgy állították elő, hogy a CTLA4 CDR3-szerű régióit amelyek egy karboxi-terminálisan meghosszabbított részt is tartalmaztak, hogy néhány nem állandó aminosav csoportot is magukba foglaljanak ^— beültették a CD28Ig-be. Ezek a homológ mutánsok jobb kötési aviditást mutattak a CD80-hoz, mint a CD28lg.

A kiméra homológ mutánsok egy másik csoportjában a CTLA4 CDRl-szerű régióját, amely a CD28-ban nem állandó és feltehető, hogy térbelileg a CDR3-szerű régió szomszédságában van, beültették a HS4-be és HS4-A-ba. Ezek a kiméra homológ mutáns molekulák (jelük: HS7 és HS8) ugyancsak nagyobb kötési aviditást mutattak CD80-hoz, mint a CD28lg.

Kiméra homológ mutánsokat úgy is szerkesztettek, hogy a HS7be és HS8-ba a CTLA4 CDR2-szerű régióját ültették be, de ez a kombináció tovább már nem javította a CD80-nal szembeni kötési aviditást. Megállapították, hogy a CTLA4 és a CD28 MYPPPY motívuma lényeges a CD80-hoz való kötődés szempontjából, de a CDRlszerű es CDR3-szerű régiók néhány nem állandó aminosavcsoportja szintén felelős a CTLA4 CD80-nal szembeni megnövekedett kötési aviditásáért.

Kimutatták, hogy a CTLA4Ig hatásosan blokkolja a CD80-aszszociált T sejt kostimulációt, de nem volt ennyire hatásos a CD86—asszociált válaszok blokkolásánál. Főképpen olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat állítottak elő, amelyeknek erősebb az aviditása a CD86-hoz, mint a vad típusú CTLA4-é és ezekről feltételezték, hogy jobban fogják blokkolni az antigén specifikusan

75.665/BE aktivált sejtek stimulációját, mint a CTLA4Ig.

Igény maradt olyan javított CTLA4 molekulákra, amelyek immunszuppresszióhoz és a rák kezeléséhez jobb gyógyszerkészítményeket biztosítanak, mint a CTLA4 korábban ismert formái.

A találmány ennek megfelelően olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákra vonatkozik, amelyek kötik a CD80-at és/vagy a CD86-ot. A találmány olyan mutáns molekulákra is vonatkozik, amelyek képesek felismerni és megkötni akár a CD80-at vagy CD86-ot vagy mind a kettőt. Egyes kiviteli alakokban a mutáns molekulák nagyobb aviditással kötik a CD80-at és/vagy a CD86-ot, mint a CTLA4.

Egy itt leírt CTLA4 mutáns molekula például az L104EA29YIg (7. ábra). Egy további itt leírt CTLA4 mutáns molekula például az L104Eig (8. ábra). Az L104EA29YIg és az L104EIg nagyobb aviditással köti a CD80-at és CD86-ot, mint a CTLA4Ig.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábra az L104EA29YIg, L104EIg és a vad típusú CTLA4Ig CD86-hoz való egyensúlyi kötődési analízisét mutatja.

A 2A. és a 2B. ábra FACS assay-k adatait szemlélteti, amelyek az L104EA29YIg, az L104EIg és a CTLA4Ig humán CD80-nal vagy CD86-tal transzfektált CHO sejtekhez való kötődését mutatják, ahogy a 2. példában leírtuk (lásd alább).

A 3A. és a 3B. ábra CD80-pozitív és CD86-pozitív CHO sejtek proliferációjának gátlását mutatja. Lásd alább a 2. példát.

A 4A. és 4B. ábrán látható, hogy az L104EA29YIg az elsődlegesen és másodlagosan allostimulált T sejtek proliferációjának gátlásában hatásosabb, mint a CTLA4Ig. Lásd alább a 2. példát.

75.665/BE

Az 5 A-C. ábrák azt szemléltetik, hogy az L104EA29YIg az allostimulált T sejtek IL-2 (5A. ábra), IL-4 (5B. ábra) és a-interferon (5C ábra) citokin termelésének gátlásában hatásosabb, mint a CTLA4Ig. Lásd alább a 2. példát.

A 6. ábra bemutatja, hogy az L104EA29YIg a fitohemagglutininnel (PHA) stimulált majom T sejtek proliferációjának gátlásában hatásosabb, mint a CTLA4Ig. Lásd alabb a 2. példát.

A 7. ábra bemutatja egy szignál pepiidet tartalmazó CTLA4 mutáns molekula (L104EA29YIg) nukleotid és aminosav szekvenciáját; bemutatja a CTLA4 mutagenizált extracelluláris doménjét, amely a +1 pozícióban lévő metioninnál kezdődik, és a +124 pozíciónál aszparaginsavval fejeződik be, vagy a -1 pozíciónál lévő alaninnal kezdődik, és a +124 pozíciónál aszparaginsavval fejeződik be; bemutat továbbá egy lg régiót. Lásd alább az 1. példát .

A 8. ábra bemutatja egy szignál pepiidet tartalmazó CTLA4 mutáns molekula (L104EIg) nukleotid- és aminosav-szekveciáját; bemutatja a CTLA4 mutagenizált extracelluláris doménjét, amely a +1 pozícióban lévő metioninnál kezdődik, és a +124 pozíciónál aszparaginsavval fejeződik be, vagy a -1 pozíciónál lévő alaninnal kezdődik, és a +124 pozíciónál aszparaginsavval fejeződik be; bemutat továbbá egy lg régiót. Lásd alább az 1. példát.

A 9. ábra bemutat egy szignál pepiidet tartalmazó CTLA4lg-t; bemutatja a CTLA4 extracelluláris doménjének vad típusú aminosav-szekvenciáját, amely a +1 pozíciónál lévő metioninnál kezdődik, és a +124 pozíciónál lévő aszparaginsavhoz tart, vagy a -1 pozíciónál lévő alaninnál kezdődik, és a +124 pozíciónál lévő

75.665/BE aszparaginsavhoz tart; bemutat továbbá egy lg régiót.

A 10 A-C ábrák egy SDS gélt mutatnak (10A ábra): 1-es nyomsáv: CTLA4Ig, 2-es nyomsáv: L104EIg és 3-as nyomsáv: L104EA29YIg; bemutatják továbbá a CTLA4Ig (10B ábra) és az L104EA29YIg (10C ábra) méretkizárásos kromatogrammját.

A 11A és 11B ábrán a CTLA4 extracelluláris lg V-szerü gombolyagának ~ amelyet az oldat szerkezet hozott létre ^- szalag diagrammja látható. A meghatározást NMR spektroszkópiával végeztük. A 11B. ábra az S25-R33 régió és az MYPPPY régió kiterjesztett képét mutatja, amely az L104 és A29 aviditás fokozó mutációk helyzetére és oldallánc orientációjára utal.

A 12. ábra az L104EA29YIg-t tartalmazó piLN-LEA29Y vektor vázlatos képét mutatja.

A bejelentésben hasznait következő kifejezések jelentését az alábbiakban ismertetjük.

A „vad típusú CTLA4 — ahogy itt használjuk — a természetben előforduló, teljes hosszúságú CTLA4 (5,434,131, 5,844,095, 5,851,795 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások) vagy extracelluláris doménje aminosav-szekvenciájával rendelkezik. Kötődik a CD80-hoz és/vagy CD86-hoz, és/vagy gátolja a CD80-at és/vagy CD86-ot ligandumaikhoz való kötődésükben. Speciális kiviteli alakokban a vad típusú CTLA4 metioninnal kezdődik a +1 pozícióban és aszparaginsavval végződik a +124 pozícióban, vagy pedig a vad típusu CTLA4 extracelluláris doménje alaninnal kezdődik a -1 pozícióban, és aszparaginsavval fejeződik be a +124 pozícióban. A vad típusú CTLA4 egy sejtfelületi protein, amelynek egy N-terminális extracelluláris doménje, egy transz75.665/BE membrán dóménje és egy C-terminális citoplazmatikus doménje van. Az extracelluláris dómén kötődik a cél-antigénekhez , ilyen a CD80 és CD86. Egy sejtben a természetben előforduló vad típusú CTLA4 protein éretlen polipeptidként transzlatálódik, amely szignál peptidet tartalmaz N-terminális végén. Az éretlen polipeptid poszt-transzlációs feldolgozáson megy keresztül, amikoris a szignál peptid lehasad és eltávolítódik. így egy olyan CTLA4 hasítási termék keletkezik, amely egy újból létrejött N-terminális véggel rendelkezik, amely az éretlen forma N-terminális végétől különbözik. Azok, akik a szakterületen járatosak, tisztában vannak azzal, hogy további poszt-transzlációs feldolgozás történhet, amely egy vagy több aminosavat eltávolíthat a CTLA4 hasítási termék újonnan létrejött N-terminális végéről. A CTLA4 molekula érett formája a CTLA4 extracelluláris doménjét, vagy ennek bármilyen olyan részét tartalmazza, amely kötődik a CD80-hoz és/vagy a CD86-hoz.

„A CTLA4Ig egy oldható fúziós protein, amely a vad típusú CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazza vagy ennek egy olyan részét, amely köti a CD80-at és/vagy a CD86-ot. A proteinhez egy lg farok illeszkedik. Egy speciális alak a vad típusú CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazza, amely metioninnal kezdődik a +1 pozíciónál, és aszparaginsavval végződik a +124 pozíciónál; vagy alaninnal kezdődik a -1 pozíciónál, és aszparaginsavval végződik a +124 pozíciónál; tartalmaz egy junkciós aminosav csoportot, a glutamint a +125 pozícióban; és egy immunglobulin részt, amely a +126 pozícióban lévő glutaminsavtól a +137 pozícióban lévő lizinig tart (9, ábra).

75.665/BE

A „fúziós protein — ahogy itt használjuk — úgy definiálható, hogy akkor jön létre, ha egy vagy több aminosavszekvenciát kapcsolunk össze a szakterületen jól ismert eljárások alkalmazásával. Ezek leírását az 5,434,131 vagy 5,637,481 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások tartalmazzák. Az összekapcsolt aminosav-szekvenciák így képeznek egy fúziós proteint.

Egy „CTLA4 mutáns molekula — ahogy itt használjuk — egy olyan molekula, amely teljes hosszúságú CTLA4 lehet vagy ennek részei (származékai vagy fragmentumai), és amelyben a CTLA4 egy vagy több mutációt tartalmaz (előnyösen a CTLA4 extracelluláris doménjében) olyanképpen, hogy hasonlít a vad típusú CTLA4 molekulához, de már nem azonos vele. A CTLA4 mutáns molekulák kötik a CD80-at vagy a CD86-ot, vagy mind a kettőt. A mutáns CTLA4 molekulák egy biológiailag vagy kémiailag aktív nem-CTLA4 molekulát tartalmazhatnak, amely bennük, vagy hozzájuk kapcsolódva helyezkedhet el. A mutáns molekulák lehetnek oldható molekulák (például a keringésben) vagy felülethez kötöttek. A CTLA4 mutáns molekulák tartalmazhatják a CTLA4 teljes extracelluláris doménjét vagy ennek részeit, például fragmentumait vagy származékait. A CTLA4 mutáns molekulák szintetikus vagy rekombináns technikával állíthatók elő.

A „mutáció kifejezés — ahogy itt használjuk — azt jelenti, hogy változás következett be a vad típusu CTLA4 extracelluláris doménjében. A változás lehet egy aminosav változtatás, amely szubsztitúciókat, deléciókat, addíciókat vagy csonkításokat foglalhat magába. Egy mutáns molekula egy vagy több mutációt tartalmazhat. Egy nukleotid-szekvenciában a jelenlévő mutációk vagy eredményeznek vagy nem eredményeznek mutációt az aminosav75.665/BE

-szekvenciában. Ez jól ismert ezen a szakterületen, tekintve, hogy néhány nukleotid kodon ugyanazt az aminosavat kódolja. Például a CGU, CGG, CGC és CGA nukleotid kodonok az arginin ( R ) aminosavat kódolják, vagy a GAU és GAC kodonok az aszparaginsav (D) aminosavat kódolják. így tehát egy proteint egy vagy több olyan nukleinsav molekula kódolhat, amelyek specifikus nukleotid-szekvenciájukban különbözhetnek, de még mindig olyan protein molekulákat kódolnak, amelyeknek azonosak a szekvenciáik. Az aminosavakat kódoló szekvenciák a következők:

Aminosav	Szimbólum	Egybetűs szimbólum	Kodonok
Alanin	Alá	A	GCU, GCC GCA, GCG
Cisztein	Cys	C	UGU, UGC
Aszparaginsav	Asp	D	GAU, GAC
Glutaminsav	Glu	E	GAA, GAG
Fenilalanin	Phe	F	UUU, UUC
Glicin	Gly	G	GGU, GGC, GGA, GGG
Hisztidin	His	H	CAU, CAC
Izoleucin	Ile	I	AUU, AUC , AUA
Lizin	Lys	K	AAA, AAG
Leucin	Leu	L	UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
Metionin	Met	M	AUG
Aszparagin	Asn	N	AAU, AAC
Prolin	Pro	P	CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamin	Gin	Q	CAA, CAG
Arginin	Arg	R	CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Szerin	Ser	S	UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
Treonin	Thr	T	ACU, ACC, ACA, ACG
Valin	Val	V	GUU, GUC, GUA, GUG
Triptofán	Trp	w	UGG
Tirozin	Tyr	Y	UAU, UAC

75.665/BE

A „CTLA4 extracelluláris doménje — ahogy itt használjuk — a CTLA4 egy olyan része, amely felismeri és köti a CD80-at és/vagy a CD86-ot. Példul: a CTLA4 egy extracelluláris doménje a +1 pozíciónál lévő metionintól a +124 pozíciónál lévő aszparaginsavig tart (9. ábra). Vagy a CTLA4 egy extracelluláris doménje alanint tartalmaz a +1 pozícióban, és a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed (9. ábra). Az extracelluláris dómén magába foglalja a CTLA4 azon fragmentumait vagy származékait, amelyek kötik a CD80-at és/vagy a CD86-ot.

Egy „nem-CTLA4 protein szekvencia vagy „nem-CTLA4 molekula ahogy itt használjuk — minden olyan molekulára vontkozik, amelyek nem kötik a CD80-at és/vagy CD86-ot és nem akadályozzák a CTLA4 kötődését célmolekulájához. Ilyen például, de nem kizárólag, egy immunglobulin (lg) konstans régió vagy ennek része. Előnyös, ha az lg konstans régió egy humán vagy majom konstans régió, például humán C(gamma)1, beleértve a csukló, CH2 és CH3 régiót. Az lg konstans régiót mutagenizálhatjuk effektor funkcióinak csökkentése végett (5,637,481 és 6,132,992 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások).

Egy „CTLA4 mutáns molekula fragmentuma — ahogy itt használjuk egy CTLA4 mutáns molekula része, előnyösen a CTLA4 extracelluláris dómén vagy ennek része, amely felismeri és köti célmolekuláját, például a CD80-at és/vagy a CD86-ot.

Egy „CTLA4 mutáns molekula származéka — ahogy itt használjuk egy olyan molekula, amelynek a szekvenciája legalább 70%ban hasonló a CTLA4 extracelluláris doménjének szekvenciájához és funkciói is hasonlóak, azaz felismeri és köti a CD80-at

75.665/BE ·«* ·♦ · · · λ 4 a · · · és/vagy CD86-ot.

Egy „CTLA4 molekula része — ahogy itt használjuk — magába foglalja egy olyan CTLA4 molekula származékait, amelyek kötik a CD80-at és/vagy CD86-ot.

Annak érdekében, hogy az itt leírt találmányt jobban meg lehessen érteni, az alábbi leírást adjuk közre.

A találmány olyan oldható mutáns molekulákra vonatkozik, amelyek felismerik és kötik a CD80-at és/vagy CD86-ot. Bizonyos kiviteli alakokban az oldható CTLA4 mutánsoknak erősebb az aviditásuk CD80-hoz és/vagy CD86-hoz, mint a CTLA4Ig-nek.

CTLA4 mutáns molekulák közé tartozik például az L104EA29YIg (7. ábra). Az L104EA29YIg aminosavszekvenciája kezdődhet alaninnal a -1-es aminosav pozícióban, és végződhet lizinnel a +357-es aminosav pozíciónál. Az L104EA29YIg aminosavszekvenciája kezdődhet metioninnal is a ti—es aminosav pozícióban, és végződhet lizinnel a t357-es aminosav pozíciónál. Az L104EA29YIg CTLA4 része a ti aminosav pozíciónál lévő metionintól a tl24 aminosav pozíciónál lévő aszparaginsavig terjed. Az L104EA29YIg junkciós aminosavként glutamint tartalmaz a tl25 pozícióban és egy immunglobulin részt, amely a tl26 pozícióban lévő glutaminsavtól a t357 pozícióban lévő lizinig terjed (7. ábra). Az L104EA29YIg körülbelül kétszer erősebb aviditással kötődik a CD80-hoz, mint a vad típusu CTLA4Ig (a továbbiakban CTLA4Ig—nek nevezzük) és körülbelül négyszer erősebb aviditással kötődik a CD86-hoz, mint a CTLA4Ig. Ennek az erős kötődésnek az az eredménye, hogy az L104EA29YIg hatásosabb, mint a CTLA4 az immunválaszok blokkolásában .

75.665/BE

A CTLA4 mutáns molekulák legalább a CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazzák, vagy ennek részeit, amelyek kötik a CD80at és/vagy a CD86-ot. A CTLA4 mutáns molekula extracelluláris része olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely metioninnal kezdődik a +1 pozícióban .és a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed (7. vagy 8. ábra). Vagy másképpen, a CTLA4 extracelluláris része tartalmazhat egy olyan aminosavszekvenciát, amely alaninnal kezdődik a -1 pozícióban, és a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed (7. vagy 8. ábra).

Egy kiviteli alakban az oldható CTLA4 mutáns molekula egy olyan fúziós protein, amelyben a CTLA4 extracelluláris doménje egy vagy több mutációt tartalmaz egy olyan aminosavszekvencia régióban, amely szerinnel kezdődik +25-nél, és argininnel fejeződik be +33-nál (S25-R33). Például: a vad típusú CTLA4 +29-es pozíciójában lévő alanint tirozinnal (kodonok: UAU, UAC) helyettesíthetjük. Vagy másképpen, az alanint leucinnal (kodonok: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG) , fenilalaninnal (kodonok: UUU, UUC) , triptofánnal (kodon: UGG) vagy treoninnal (kodonok: ACU, ACC, ACA, ACG) helyettesíthetjük. A szakterületen jártas személyek tudják, hogy az RNS szekvencia uracil (U) nukleotidja megfelel a DNS szekvencia timin (T) nukleotidjának

Egy másik kiviteli alakban az oldható mutáns molekula egy olyan fúziós protein, amelyben a CTLA4 extracelluláris doménje egy vagy több mutációt tartalmaz egy olyan aminosavszekvencia régióban vagy ennek közelében, amely metioninnal kezdődik + 97nél, és glicinnel végződik +107-nél (M97-G107). Például: a vad típusú CTLA4 +104 pozíciójában lévő leucin glutaminsavval (kodo75.665/BE ¹⁴ <:<?;·'/*?

« · « · 5 - · «4 ,, nők: GAA, GAG) helyettesíthető. Az ezen suibsztitúciót tartalmazó CTLA4 mutáns molekulát itt L104EIg-nek nevezzük (8. ábra).

Egy még további kiviteli alakban az oldható CTLA4 mutáns molekula egy olyan fúziós protein, amelyben a CTLA4 extracelluláris doménje egy vagy több mutációt tartalmaz az S25-R33 és M97-G107 régióban. Egy kiviteli alakban például egy CTLA4 mutáns molekula tirozint tartalmaz a +29 pozícióban alanin helyett, és glutaminsavat a +104 pozícióban leucin helyett. Azt a mutáns molekulát, amely ezeket a szubsztitúciókat tartalmazza, itt L104EA29YIg-nek nevezzük (7. ábra). Azt a nukleinsav molekulát, amely az L104EA29YIg-t kódolja, a pD16 L104EA29YIg tartalmazza, amelyet 2000 junius 19-én letétbe helyeztünk az American Type Culture Collection (ATCC) intézményben (10811 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209; ATCC letéti száma: PTA-2104). A pD16 L104EA29YIg vektor a pcDNA3 vektor (INVITROGEN) egy származéka.

A találmány a továbbiakban egy olyan oldható CTLA4 mutáns molekulát ismertet, amely a 7. vagy 8. ábrán bemutatott CTLA4 mutáns extracelluláris doménjét — vagy ennek egy részét vagy részeit tartalmazza, valamint egy olyan elemet, amely megváltoztatja a CTLA4 mutáns molekula oldhatóságát, affinitását és/vagy valenciáját.

A találmány alkalmazásának megfelelően az elem egy immunglobulin konstans régiója lehet, vagy ennek egy része. In vivo alkalmazás esetén előnyös, ha az immunglobulin konstans régió nem vált ki ártalmas immunválaszt a betegben. Például klinikai eljárásmódok (protokollok) esetén előnyös lehet, ha a mutáns molekulák humán vagy majom immunglobulin konstans régiókat tartalmaz75.665/BE nak. Alkalmas immunglobulin régió például a humán C(gamma)1, amely a csukló, CH2 és CH3 régiókat tartalmazza. Más izotipusok alkalmazása szintén lehetséges. Ezenkívül más immunglobulin konstans régiók alkalmazására is van lehetőség (előnyösen más gyenge vagy nem immunogén immunglobulin konstans régiók alkalmazására) .

Egyéb elemek például a polipeptid toldalékok. Alkalmas toldalékok például — de nem kizárólag - a következők: p97 molekula, env gpl20 molekula, E7 molekula és óva molekula [B.Dash et al., J. Gen. Virol., 7 5, 1389-1397 (1994); T.Ikeda et al., Gene, 138, 193-196 (1994); K.Falk et al., Cell. Immunoi., 150, 447-452; K.Fujisaka et al., Virology, 204, 789-793 (1994)]. Más molekulák toldalékként való használata szintén lehetséges [C.Gerard et al., Neuroscience, 62, 721-739 (1994); R.Byrn et al. , J. Virol., 63, 4370-4375 (1989); D.Smith et al., Science, 238, 1704-1707 (1987); L.Lasky, Science, 233, 209-212 (1996)].

A találmány a továbbiakban olyan mutáns CTLA4 fúziós proteineket bocsát rendelkezésre, amelyek előnyösen reaktívabbak a CD80-nal és/vagy a CD86-tal szemben, mint a vad típusú CTLA4. Ilyen például a 7. ábrán bemutatott L104EA29YIg.

Egy másik megvalósításban az oldható CTLA4 mutáns molekula olyan junkciós aminosavcsoportot tartalmaz, amely a CTLA4 rész és az immunglobulin rész között helyezkedik el. A jukciós aminosav bármilyen aminosav lehet, beleértve a glutamint. A junkciós aminosavat a szakterületen ismert molekuláris vagy kémiai szintetikus módszerekkel lehet bevezetni.

Egy további megvalósításban az oldható CTLA4 mutáns molekula 75.665/BE az immunglobulin részt (például a csukló, CH2 és CH3 doméneket) ott tartalmazza, ahol az immunglobulin rész csukló doménjén belül bármelyik vagy mindegyik cisztein csoport szerinnel van helyettesítve. Például a következő pozíciójú ciszteinek: +130, + 136 vagy +139 (7. vagy 8. ábra). A mutáns molekulában a +148 pozícióban lévő prolin is helyettesíthető szerinnel, ahogy ezt a 7. vagy 8. ábra mutatja.

Az oldható CTLA4 mutáns molekula a mutáns molekula CTLA4 részének extracelluláris dóménje N-terminális végéhez kapcsolva szignál peptidet tartalmazhat. A szignál peptid bármilyen olyan szekvencia lehet, amely lehetővé teszi a mutáns molekula szekrécióját, beleértve az onkosztatin M-ből származó szignál peptidet [Malik et al., Molec. Cell. Bioi., 9, 2847-2853 (1989)], vagy a CD5-öt [N.H.Jones et al., Nature, 323, 346-349 (1986)], vagy bármely extracelluláris proteinből származó szignál peptidet.

A mutáns molekula az onkosztatin M szignál peptidet a CTLA4 extracelluláris dóménjének N-terminális végéhez kapcsolva és a humán immunglobulin molekulát (azaz a csukló, CH2 és CH3 domént) a CTLA4 extracelluláris dóménjének C-terminális végéhez kapcsolva tartalmazhatja. Ebben a molekulában az onkosztatin M szignál peptid olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely metioninnal kezdődik a -26 pozícióban és a -1 pozícióban lévő alaninig terjed, a CTLA4 rész olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely a +1 pozícióban metioninnal indul és a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed, a +125 pozícióban van a junkciós amino— sav csoport, a glutamin, az immunglobulin rész aminosav-szekvenciája pedig glutaminsavval kezdődik a +126 pozícióban, és a 75.665/BE +357 pozícióban lévő lizinig terjed.

A találmány szerinti CTLA4 mutáns molekulák molekuláris vagy kémiai szintetikus eljárásokkal állíthatók elő. A molekuláris eljárások a következő lépéseket tartalmazhatják: egy olyan nukleinsav molekulát tartalmazó alkalmas gazdasejtet vezetünk be, amely az oldható CTLA4 mutáns molekulát fejezi ki és kódolja; az így bevezetett gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik, hogy a gazdasejt kifejezze a mutáns molekulákat; és a kifejezett mutáns molekulákat izoláljuk. A mutáns molekula szignál peptid része lehetővé teszi, hogy a protein molekulák a sejt felületén fejeződjenek ki és a molekulákat a gazdasejt szekretálja. A transzlatált mutáns molekulák poszttranszlációs módosuláson mehetnek keresztül, amikoris a szignál peptid lehasad, miáltal egy olyan érett protein keletkezik, amely a CTLA4-et és az immunglobulin részt tartalmazza. A hasadás a -1 pozícióban lévő alanin után jöhet létre, amely olyan érett mutáns molekulát eredményez, amely a +1 pozícióban metio— nmt tartalmaz első aminosavkent (7. vagy 8. abra) Másképpen a hasadás a metionin után, a -2 pozícióban fordulhat elő, amely olyan érett mutáns molekulát eredményez, amely -1 pozíciójában alanint tartalmaz első aminosavként.

Egy előnyös megvalósítási forma egy olyan oldható CTLA4 mutáns molekula, amelyben a human CTLA4 extracelluláris dómén sgy teljes human immunglobulin molekulához vagy ennek egy részéhez (például csukló, CH2 és CH3) van kapcsolva. Ez az előnyös molekula az oldható molekula CTLA4 részét tartalmazza, amelyben egy aminosavszekvencia metionint tartalmaz a +1 pozícióban, és

75.665/BE aszparaginsavat a +124 pozícióban, tartalmaz továbbá egy junkciós aminosav csoportot, a glutaminsavat a +125 pozícióban és az immunglobulin részt, amely glutaminsavval kezdődik a +126 pozícióban, és +357 pozícióban lévő lizinig terjed. Azt a részt, amely a CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazza, úgy mutagenizáltuk, hogy a +29 pozícióban lévő alanint tirozinnal helyettesítettük és a +104 pozícióban lévő leucint glutaminsavval helyettesítettük. A mutáns molekula immunglobulin részét úgy mutagenizálhatjuk, hogy a +130, +136 és +139 pozíciókban lévő ciszteint szerinnel helyettesítjük és a +148 pozícióban lévő prolint szerinnel helyettesítjük. Ezt a mutáns molekulát itt L104EA29YIgnek neveztük el (7. ábra).

Az L104EA29YIg egy másik alakja egy olyan mutáns molekula, amelynek az aminosavszekvenciája alanint tartalmaz a -1 pozícióban és a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed, junkciós aminosav csoportként glutamint tartalmaz a +125 pozícióban és immunglobulin része glutaminsavat tartalmaz +126 pozícióban (például +126-tól a +357 pozícióban lévő lizinig tart). A CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazó részt úgy mutagenizáltuk, hogy a +29 pozícióban lévő alanint tirozinnal cseréltük fel, és a +104 pozícióban lévő leucint glutaminsavra cseréltük. A mutáns molekula immunglobulin részét úgy mutagenizáltuk, hogy a +130, +136 és +139 pozíciókban a ciszteineket szerinnel helyettesítettük és a +148 pozícióban a prolint szerinre cseréltük fel. Ezt a mutáns molekulát itt L104EA29YIg-nek neveztük el (7. ábra). Miután a szignál szekvencia lehasadt, az L104EA29YIg vagy metioninnel kezdődik a +1 pozícióban, vagy alaninnal kezdődik a

75.665/BE

-1 pozícióban.

Egy másik találmány szerinti mutáns molekula egy olyan oldható CTLA4 mutáns molekula, amelyben egy humán CTLA4 extracelluláris dómén humán immunglobulin molekulához (például csukló, CH2 és CH3) kapcsolódik. Ez a molekula a CTLA4-et meghatározó aminosav-szekvencia részt — amely metioninnal kezdődik a +1 pozícióban és a +124 pozíciónál lévő aszparaginsavig terjed — tartalmazza, továbbá a +125 pozícióban egy junkciós aminosav csoportot, a glutamint és az immunglobulin részt, amelynek az aminosav-szekvenciája glutaminsavat tartalmaz a +126 pozícióban, és a +357 pozíciónál lévő lizinig terjed. A CTLA4 extracelluláris domént tartalmazó részt úgy mutagenizáltuk, hogy a leucint a +104 pozíciónál glutaminsavval helyettesítettük. A mutáns molekula csukló részét úgy mutagenizáltuk, hogy a +130, +136 és +139 pozíciókban lévő ciszteineket szerinnel helyettesítettük, és a +148 pozíciónál lévő prolint szerinnel helyettesítettük. Ezt a mutáns molekulát itt L104EIg-nek neveztük el (8. ábra).

Vagy pedig az L104EIg forma egy olyan oldható CTLA4 mutáns molekula, amelyben egy humán CTLA4 extracelluláris dómén egy humán immunglobulin molekulához (például csukló, CH2 és CH3) kapcsolódik. Ez az előnyös molekula a CTLA4 részt — amelynek az aminosav—szekvenciája alaninnal kezdődik a —1 pozícióban, és a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed — tartalmazza, továbbá egy junkciós aminosav csoportot, a glutamint tartalmazza a +125 pozícióban és az immunglobulin részt, amely glutaminsavat tartalmaz a +126 pozícióban, és a +357 pozícióban lévő lizinig terjed. A CTLA4 extracelluláris domént tartalmazó részt úgy 75.665/BE mutagenizáltuk, hogy a +104 pozícióban lévő leucint glutaminsavval helyettesítettük. A mutáns molekula csukló részét úgy mutagenizáltuk, hogy a +130, +136 és +139 pozíciókban a ciszteineket szerinnel helyettesítettük és a +148 pozícióban lévő prolint szintén szerinnel. Ezt a mutáns molekulát itt L104EIg-nek neveztük el (8. ábra).

A találmány további tárgyát egy olyan oldható CTLA4 mutáns molekula képezi, amely a következőket tartalmazza: (a) az első aminosav-szekvencia egy membrán glükoprotein, például CD28, CD86, CD80, CD40 és gp39, amely blokkolja a T sejt proliferációt, egy második aminosav-szekvenciához fuzionálva; (b) a második aminosav-szekvencia a mutáns CTLA4 extracelluláris doménjének egy olyan fragmentuma, amely blokkolja a T sejt proliierációt, ilyen például egy aminosav molekula, amely metionint tartalmaz a +1 pozíciónál és a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed (7. vagy 8. ábra); és (c) egy harmadik aminosav-szekvencia, amely azonosítási toldalék gyanánt működik, vagy pedig fokozza a molekula oldhatóságát. Például: a harmadik aminosav-szekvencia egy nem immunogén immunglobulin molekula csukló, CH2 és CH3 régióinak aminosav csoportjaiból állhat. Alkalmas immunglobulin molekulák — de nem kizárólag — például a humán vagy majom immunglobulin, például C(gamma)1. Más izotípusok alkalmazása szintén lehetséges.

A találmány tárgyát a továbbiakban olyan nukleinsav molekulák képezik, amelyek a találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekuláknak megfelelő aminosav-szekvenciákat kódolják. Egy kiviteli alakban a nukleinsav molekula egy DNS (például cDNS) vagy

75.665/BE ennek egy hibridje. Vagy másként, a nukleinsav molekulák RNS molekulák vagy ezek hibridjei.

A találmány ezenkívül egy olyan vektorra vonatkozik, amely a találmány szerinti nukleotid-szekvenciákat tartalmazza. Ismertetünk egy gazda vektor rendszert is. A gazda vektor rendszer magába foglalja a találmány szerinti vektort egy alkalmas gazdasejtben. Megfelelő gazdasejtek — de nem kizárólag — például a prokarióta és eukarióta sejtek,

A találmány az immunrendszer betegségeinek kezelésére szolgáló olyan gyógyszerkészítményekre is vonatkozik, amelyek az oldható CTLA4 mutáns molekulák gyógyszrészetileg hatásos mennyiségeit tartalmazzák. Bizonyos alakokban az immunrendszer betegségeit a CD28- és/vagy CTLA4-pozitív sejteknek a CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtekkel való kölcsönhatása váltja ki. Az oldható CTLA4 mutáns molekulák előnyösen olyan CTLA4 molekulák, amelyek egy vagy több mutációt tartalmaznak a CTLA4 extracelluláris doménjében. A gyógyszerkészítmény tartalmazhat oldható CTLA4 mutáns protein molekulákat és/vagy a molekulákat kódolo nukleinsav molekulákat és/vagy vektorokat. Előnyös kiviteli alakokban az oldható CTLA4 mutáns molekulák a 7. vagy a 8. ábrán bemutatott CTLA4 extracelluláris dómén aminosav-szekvenciáját tartalmazzák (L104EA29Y, illetve L104E). Még előnyösebb, ha az oldható mutáns molekula a találmány szerinti L104EA29YIg. A készítmények ezenkívül tartalmazhatnak más terápiás hatóanyagokat, beleértve, de nem kizárólag, drug toxinokat, enzimeket, antitesteket vagy konj ugátumokat.

Előnyös, ha a gyógyszerkészítmények alkalmas vivőanyagokat

75.665/BE és adjuvánsokat is tartalmaznak. Ezek minden olyan anyagot felölelnek, amelyet a találmány szerinti molekulához (például egy oldható CTLA4 mutáns molekulához, mint az L104EA29Y vagy L104E) hozzáadva, megőrzi a molekula aktivitását és nem reagál a beteg immunrendszerével. Megfelelő vivőanyagok és adjuvánsok — de nem kizárólag — például a következők: humán szérum albumin; ioncserélők; aluminium vegyületek; lecitin; puffer anyagok, mint a foszfátok; glicin; szorbonsav; kálium-szorbát; sók vagy elektrolitok, például protamin-szulfát. További példák: a standard gyógyszerészeti vivőanyagok bármelyike, mint például egy foszfáttal pufferolt konyhasó-oldat; viz; emulziók, például olaj/viz emulziók; és a nedvesítő szerek bármelyike. További vivőanyagok közé tartoznak a steril oldatok; tabletták, beleértve a bevont tablettákat és kapszulákat. Az ilyen vivőanyagok általában töltőanyagokat tartalmaznak. Ilyen a keményítő, tej, cukor, bizonyos agyag típusok, zselatin, sztearinsav vagy ennek sói, magnézium vagy kalcium sztearát, talkum, növényi zsírok vagy olajok, mézgák, glikolok vagy más ismert töltőanyagok. A vivőanyagok tartalmazhatnak ízesítő és színező adalékokat vagy más alkotórészeket. Az ilyen vivőanyagokat tartalmazó készítményeket jól ismert hagyományos eljárásokkal formulázzuk. A készítményeket különböző lipid készítményekbe formulálhatjuk, ilyenek például a liposzómák, vagy különböző polimer készítményekbe, mint a polimer mikrogömbök.

A találmány szerinti készítményeket hagyományos módszerek alkalmazásával adhatjuk be, beleértve — de nem kizárólag — az intravénás (i.v.) alkalmazást, intraperitoneális (i.p.) alkalma

75.665/BE zást, intramuszkuláris (i.m.) alkalmazást, szubkután alkalmazást, orális alkalmazást, a kúp formában vagy topikális kontaktust biztosító formában való alkalmazást. Vagy úgy járunk el, hogy egy lassú kibocsátást biztosító eszközt, például egy miniozmótikus pumpát építünk be a betegbe.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények különböző gyógyszerformákban formulázhatók, ilyenek például — de nem kizárólag — a folyékony oldatok vagy szuszpenziók, tabletták, pirulák, porok, kúpok, polimer mikrokapszulák vagy mikrovezikulák, liposzómák és injektálható vagy infundálható oldatok. Az előnyös forma a beadás módjától és a terápiás alkalmazástól függ.

A találmány szerinti készítmények számára az alkalmazás lehatásosabb módja és adagolási rendje a betegség súlyosságától és lefolyásától, a paciens egészségi állapotától és a kezelésre adott válaszától függ, valamint a kezelő orvos megítélésétől. Ennek értelmében a készítmények adagolását az individuális pacienshez kell beállítani.

Az oldható mutáns molekulákat egy betegnél olyan mennyiségben és annyi ideig (például mennyire hosszú ideig és/vagy hányszor) alkalmazhatjuk, amennyi elégséges ahhoz, hogy az endogén B7 (például CD80 és/vagy CD86) molekulák megfelelő ligandumaikhoz való kötődését blokkolják a betegben. Az endogén B7/ligandum kötés blokádja tehát gátolja a B7-pozitív sejtek (például CD80- és/vagy CD86-pozitív sejtek) és a CD28- és/vagy CTLA4-pozítiv sejtek közötti kölcsönhatásokat. A terápiás hatóanyag adagolása számos faktortól függ, beleértve — de nem kizárólag _ az érintett szövet típusát, a kezelendő autoimmun betegség típusát,

75.665/BE a betegség súlyosságát, a beteg egészségi állapotát és a beteg válaszát a hatóanyagokkal végzett kezelésre. Ennek alapján a hatóanyagok adagolása a betegtől és az alkalmazás módjától függően változhat. Az oldható CTLA4 mutáns molekulákat 0,1 - 20,0 mg/kg (a beteg tömege)/nap, előnyösen 0,5 - 10,0 mg/kg/nap mennyiségben alkalmazhatjuk. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények bevitelét különböző időn keresztül oldhatjuk meg. Egy megvalósításban a találmány szerinti gyógyszerkészítményeket egy vagy több órán keresztül adhatjuk be. Ezenkívül ismételhetjük az alkalmazást a betegség súlyosságától függően, valamint a szakterületen ismert más faktoroktól függően.

A találmány a továbbiakban protein termelésére szolgáló eljárásokat ismertet. A találmány szerinti gazda vektor rendszerben tenyésztéssel állítjuk elő a gazdaban a proteint, és az így kapott proteint izoláljuk.

Ezenkívül a találmány eljárásokat bocsát rendelkezésre a CTLA4- és CD28-pozitív T sejtek és a CD80- és/vagy CD86-pozitív sejtek között működő kölcsönhatások szabályozására. Az eljárások a következőket tartalmazzák: a CD80- és/vagy CD86-pozitív sejteket egy találmány szerinti CTLA4 mutáns molekulával hozzuk érintkezésbe úgy, hogy mutáns CTLA4/CD80 és/vagy mutáns CTLA4/CD86 komplexek képződjenek, a komplexek akadályozzák az endogén CTLA4-antigén reakcióját CD80-nal és/vagy CD86-tal, és/vagy a komplexek akadályozzák az endogén CD28 antigén reakcióját CD80-nal és/vagy CD86-tal. A találmány egy kiviteli alakjában az oldható CTLA4 mutáns molekula egy olyan fúziós protein amely a mutáns CTLA4 extracelluláris doménjének legalább egy ré75.665/BE szét tartalmazza. Egy további kiviteli alakban az oldható CTLA4 mutáns molekula a következőket tartalmazza: az első aminosav-szekvencia egy CTLA4 extracelluláris domént tartalmazó olyan aminosav-szekvenciából áll, amelyben a +1 pozícióban metionin van és amely a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed, és legalább egy mutációt tartalmaz; a második aminosavszekvencia tartalmazza a humán immunglobulin gamma 1 molekula csukló, CH2 és CH3 régióit (7. vagy 8. ábra).

A találmány gyakorlatának megfelelően a CD80- vagy CD8 6-pozitív sejteket a találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulák fragmentumaival vagy származékaival hozzuk össze. Vagy más esetben, az oldható CTLA4 mutáns molekula egy CD28Ig/CTLA4Ig fúziós protein, amelyben az első aminosavszekvencia a CD28 receptor extracelluláris dómén egy részének felel meg, amely egy második aminosavszekvenciához van fuzionálva, amely a CTLA4 mutáns receptor extracelluláris dómén egy részének felel meg, a harmadik aminosav-szekvencia pedig a humán immunglobulin C-gamma-1 csukló, CH2 és CH3 régióinak felel meg.

Várható, hogy az oldható CTLA4 mutáns molekulák gátló tulajdonságokkal rendelkeznek in vivo. Bizonyos körülmények között, ahol a T sejt/APC kölcsönhatások, például T sejt/B sejt kölcsönhatások fordulnak elő T sejtek és APC sejtek érintkezése következményeként, a CD80- és/vagy CD86-pozitív sejtekkel, például a B sejtekkel való reakció végett bevitt CTLA4 mutáns molekulák kötődése akadályozhatja, azaz gátolhatja a T sejt/APC sejt kölcsönhatásokat, ami az immunválaszok szabályozását eredményezi.

A találmány eljárásokat ismertet immunválaszok gyengítésére.

75.665/BE

Egy immunválasz gyengítését oldható CTLA4 mutáns molekulák segítségével vagy egy már folyamatban lévő immunválasz gátlásával vagy blokkolásával érhetjük el, vagy úgy, hogy megelőzzük egy immunválasz indukcióját. A találmány szerinti oldható CTLA4 molekulák az aktivált T sejtek funkcióit — ilyen a T limfocita proliferáció és a citokin szekréció — a T sejt válaszok szuppressziójával gátolhatják, vagy azzal, hogy specifikus toleranciát indukálnak a T sejtekben, vagy pedig mind a két módszerrel.

A találmány további eljárásokat ismertet az immunrendszer betegségeinek kezelésére és tolerancia indukciójára. Speciális kiviteli alakokban az immunrendszer betegségeit a CD28- és/vagy a CTLA4-pozitív sejtek CD80/CD86 sejtekkel való kölcsönhatásai váltják ki. Egy további alakban a T sejt kölcsönhatások gátoltak. Immunrendszer betegségek például — de nem kizárólag — a következők: autoimmun betegségek, immunproliferativ betegségek es graft tál (átültetett szövet) kapcsolatos rendellenességek. Ezekben az eljárásokban egy betegnek találmány szerinti oldható mutáns molekulákat adunk be, hogy a T sejt CD80- és/vagy CD86pozitrv sejtekkel való kölcsönhatasat szabályozzuk. Másként úgy járhatunk el, hogy CTLA4 mutáns hibridet alkalmazunk, amely egy CTLA4 mutáns molekulához kapcsolt membrán glikoproteint tartalmaz. Graft-tal összefüggő betegségek például a következők: graft versus host betegség (GVHD) (például ilyen betegséget okozhat a csontvelő átültetés, vagy ez eredményezheti a tolerancia indukciót), immun-rendellenességek, amelyek átültetett graft kilökődéssel, krónikus kilökődéssel és szövet vagy sejt allo- vagy xenograftokkal kapcsolatosak, beleértve a szolid szerveket, 75.665/BE bőrt, szigeteket, izmokat, májsejteket, idegsejteket. Iramunproliferativ betegségek közé tartoznak — de nem kizárólag — a következők: pszoriázis, T sejt lymphoma, T sejt akut limfoblasztos leukémia, tesztikuláris angiocentrikus T sejt lymphoma, benignus limfocitás angiitis és autoimmun betegségek, mint a lupus (azaz lupus erythematosus, lupus nephritis), Hashimoto thyroiditis, primer mixödéma, Graves betegség, vészes vérszegénység, autoimmun atrófiás gastritis, Addison kór, diabétesz (például: inzulin-függő diabetes mellitus, I típusú diabetes mellitus), Goodpasture-szindróma, myasthenia gravis, pemphigus, Crohn betegség, szimpátiás szemgyulladás (ophthalmia sympathica), autoimmun uveitis, szklerózis multiplex, autoimmun hemolitikus anémia, idiopátiás trombocitopénia, primer biliáris cirrózis, krónikus action hepatitis, colitis ulcerosa, Sjögren szindróma, reumás betegségek (például: rheumatoid arthritis), polymyositis, szkleroderma és kevert kötőszöveti betegség.

A találmány eljárást ismertet szolid szerv és/vagy szövet transzplantátum betegből való kilökődésének gátlására, amikoris a beteg a transzplantált szövet recipiense. Szövet transzplantátumok esetén általában a graft kilökődését az indítja meg, hogy a T sejtek idegenként ismerik fel, és a felismerést olyan immunválasz követi, amely károsítja a graftot. A találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulák a T limfocita proliferáció és/vagy a citokin szekréció gátlásával csökkenthetik a szövet károsodást és egy antigén-specifikus T sejt válaszadási képtelenséget indukálhatnak, amely hosszantartó graft elfogadást eredményezhet anélkül, hogy generalizált immunszuppresszióra 75.665/BE lenne szükség. Ezenkívül a találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulákat be lehet adni más gyógyszerkészítményekkel, beleértve — de nem kizárólag — a következőket: kortikoszteroidok, ciklosporin, rapamicin, mikofenolát mofetil, azatioprin, takrolizmusz, baziliximab és/vagy más biológiai anyagok.

A találmány olyan eljárásokra is vonatkozik, amelyek egy betegben gátolják a graft versus host betegséget. Az eljárás a következőket tartalmazza: a betegnek egy találmány szerinti oldható CTLA4 molekulát adunk be, egyedül, vagy további olyan ligandumokkal együtt, amelyek IL-2-vel, IL-4-gyel vagy «-interferonnal reagálnak. Például: egy találmány szerinti oldható CTLA4 mutánst molekulát beadhatunk egy csontvelő transzplantált recipiensnek, hogy gátolja a donor T sejtek alloreaktivitását. Vagy úgy járunk el, hogy egy csontvelő grafton belül tesszük toleránssá a donor T sejteket a recipiens alloantigénjeivel szemben ex vivo a transzplantáció előtt.

A T sejt válaszok gátlása oldható CTLA4 mutáns molekulákkal hasznos lehet autoimmun rendellenességek kezelésében is. Számos autoimmun rendellenességet a T sejtek nem megfelelő aktiválása eredményezi, így reaktívakká válnak az autoantigénekkel szemben. Az aktiválás elősegíti citokinek és autoantitestek termelését, amelyek szerepet játszanak a betegség kortanában. Oldható CTLA4 mutáns molekula alkalmazása egy olyan betegnél, aki autoimmun betegségben szenved vagy erre fogékony, megakadályozhatja az autoreaktív T sejtek aktiválódását, és csökkentheti vagy megszüntetheti a betegség tüneteit. Ez a módszer azt is tartalmazhatja, hogy a találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulát vagy ma75.665/BE gában alkalmazzuk a betegnél, vagy további ligandumokkal együtt, amelyek IL-2-vel, IL-4-gyel vagy α-interferonnal reagálnak.

A találmány ezenkívül magába foglalja az oldható CTLA4 mutáns molekuláknak más immunszuppresszív szerekkel való együttes alkalmazását. Ilyen szerek például a következők: ciklosporin [lásd: Mathiesen, Cancer Lett., 44, 151-156 (1989)], prednizon, azatioprin és metotrexát [R.Handschumacher, 53. fejezet: „Drugs Used for Immunsuppression, 1264-1276 oldal]. Más immunszuppreszszív szerek alkalmazása is lehetséges. Például a rheumatoid arthritis kezelesere az oldható CTLA4 mutáns molekulát a következő gyógyszerekkel — de nem kizárólag — alkalmazhatjuk: kortikoszteroidok, nem szteroid gyulladás elleni szerek/Cox 2 inhibitorok, metotrexát, hidroxiklorokin, szulfaszalazopirin, arany sok, etanercept, infliximab, anakinra, azatioprin és/vagy más biológiai anyagok, mint az anti-TNF. Szisztémás lupus erythematosus kezelesere az oldható CTLA4 mutáns molekulákat a következő gyógyszerekkel — de nem kizárólag — alkalmazhatjuk: kortikoszteroidok, citoxan, azatioprin, hidroxi—klorokin, mikofenolát mofetil és/vagy más biológiai anyagok. Továbbá a szklerózis multiplex kezelésére az oldható CTLA4 mutáns molekulákat a következő gyógyszerekkel — de nem kizárólag — alkalmazhatjuk: kortikoszteroidok, interferon béta-la, interferon béta-lb, glatiramer acetat, mitoxantron hidroklorid es/vagy más biológiai hatóanyagok.

Az oldható CTLA4 mutáns molekulákat (előnyösen az L104EA29YIg-t) egy vagy több következő hatóanyaggal kombinálva is alkalmazhatjuk az immunválasz szabályozására: oldható gp39 75.665/BE

[CD40 ligandum (CD40L) , CD154, T-BAM, TRAP néven is ismert], oldható CD29, oldható CD40, oldható CD80, oldható CD86, oldható CD28, oldható CD56, oldható Thy-1, oldható CD3, oldható TCR, oldható VLA-4, oldható VCAM-1, oldható LECAM-1, oldható ELAM-1, oldható CD44, gp39-cel reagáló antitestek, CD40-nel reagáló antitestek, B7-tel reagáló antitestek, CD28-cal reagáló antitestek, LFA-l-gyel reagáló antitestek, LFA-2-vel reagáló antitestek, IL-2-vel reagáló antitestek, IL-12-vel reagáló antitestek, IFN-gammával reagáló antitestek, CD2-vel reagáló antitestek, CD48-cal reagáló antitestek, mindegyik ICAM-mel (például ICAM-2vel) reagáló antitestek, CTLA4-gyel reagáló antitestek, Thy-1gyel reagáló antitestek, CD56-tal reagáló antitestek, CD3-mal reagáló antitestek, CD29-cel reagáló antitestek, TCR-rel reagáló antitestek, VLA-4-gyel reagáló antitestek, VCAM-l-gyel reagáló antitestek, LECAM-l-gyel reagáló antitestek, ELAM-l-gyel reagáló antitestek, CD44-gyel reagáló antitestek. Néhány kiviteli alakban előnyben részesítjük a monoklonális antitesteket. Más kiviteli alakokban előnyben részesítjük az antitest fragmentumokat. A szakterületen gyakorlattal rendelkező személyek számára magától értetődik, hogy a kombináció a találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulákat és egy más immunszuppresszív szert tartalmazhat, hogy az oldható CTLA4 mutáns molekulákon kívül két másik immunszuppresszív szert tartalmazhat, hogy az oldható CTLA4 mutáns molekulákon kívül három másik immunszuppresszív szert tartalmazhat, és így tovább.Az optimális kombináció és az adagolás a szakmában jól ismert módszerekkel meghatározható és optimalizálható.

75.665/BE ³¹ 'λ: χ ; :

Néhány speciális kombinációt a következőkben ismertetünk: L104EA29YIg és CD80 mAt-ek; L104EA29YIg és CD86 mAt-ek; L104EA29YIg, CD80 mAt-ek és CD86 mAt-ek; L104EA29YIg és gp39 mAt-ek; L104EA29YIg és CD40 mAt-ek; L104EA29YIg és CD28 mAt-ek; L104EA29YIg, CD80 és CD86 mAt-ek és gp39 mAt-ek; L104EA29YIg, CD80 és CD86 mAt-ek és CD40 mAt-ek; és L104EA29YIg, anti-LFA-1 mAt és anti-gp39 mAt. Egy gp39 mAt-re specifikus példa az MR1. A szakterületen járatos személyek tisztában vannak azzal, és számukra magától értetődik, hogy más kombinációk is alkalmazhatók.

A találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulák, például az L104EA29Y, mint aktív hatóanyagok egyedül alkalmazhatók vagy más hatóanyagokkal együtt alkalmazhatók immunmodulációs adagolási sémákban. Más gyulladásgátló szerekkel együtt adhatók például allo- vagy xenograft akut vagy krónikus kilökődések esetén, vagy gyulladásos vagy autoimmun rendellenességek kezelésére vagy megelőzésére vagy tolerancia indukciója végett. Alkalmazható például kalcineurin inhibitorral, például ciklosporin A-val vagy FK506-tal kombinálva; egy immunszuppresszív makroliddal, például rapamicinnel vagy ennek egy származékával, például 40-0-(2-hidroxi-etil)-rapamicinnel, egy limfocita homing ágenssel, például FTY720-szal vagy egy analógjával; kortikoszteroidokkal; ciklofoszfamiddal; azatioprinnel; metotrexáttal; leflunomiddal vagy egy analógjával; mizoribinnel; mikofenolsavval; mikofenolát mofetillel; 15-dezoxi-spergualinnal vagy egy analógjával; immunszuppresszív monoklonális antitestekkel, például leukocita receptorok — például MHC, CD2, CD3, CD4, CDlla/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), 0X40,

75.665/BE

4-1BB — elleni vagy ligandumai elleni monoklonális antitestekkel; vagy más immunmoduláló vegyületekkel, például CTLA4/CD28Ig-vel vagy más adhéziós molekula inhibitorokkal, például mAtekkel vagy alacsony molekulatömegű inhibitorokkal, beleértve az LFA-1 antagonistákat, szelektin antagonistákat és VLA-4 antagonistákat. A vegyület különösen jól használható egy olyan vegyülettel kombinálva, amely gátolja a CD40-et és ligandumát, ilyenek például a CD40 elleni antitestek és a CD40-L elleni antitestek például a fent leirt indikációknál, például tolerancia indukciój ánál.

Ahol a találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulákat más immunszuppressziv/immunmodulációs vagy anti-inflammatorikus terápiával együtt alkalmazzuk, például ahogyan fentebb részleteztük, az említett oldható CTLA4 mutáns molekulákkal együtt beadott immunszuppresszív, immunmoduláló vagy anti-inflammatorikus vegyület (co-drug) adagolása természetesen az alkalmazott codrug típusától — például, hogy szteroid-e vagy egy ciklosporin — az alkalmazott speciális hatóanyagtól, a kezelendő állapottól és így tovább, függően fog változni.

Az előbbieknek megfelelően a találmány a már fentiekben meghatározott eljárásokon kívül még további szempontnak megfelelő eljárásokat ismertet. Az eljárások a találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulák terápiásán hatásos mennyiségének egyidejű vagy egymást követő alkalmazását tartalmazzák, például az H04EA29YIg alkalmazasat szabad formaban vagy gyogyszerészetileg elfogadható só formájában, egy második hatóanyaggal együtt, amikoris a második hatóanyag egy immunszuppresszív, immunmo

75.665/BE dulációs vagy anti-inflammatorikus szer, mint fentebb rámutattunk. A további terápiás kombinációk közül például egy készletet (kit-et) ismertetünk, például bármely fent meghatározott módszerben való alkalmazásra. A kit L104EA29YIg-t tartalmaz szabad formában vagy gyógyszerészetileg elfogadható só formájában, amelyet legalább egy olyan gyógyszerkészítménnyel egyidejűleg vagy egymást követően alkalmazunk, amely egy immunszuppressziv, immunmoduláló vagy anti-inflammatorikus hatóanyagot tartalmaz. A kit előírásokat tartalmazhat felhasználásához.

Eljárások a találmány szerinti molekulák előállítására

A CTLA4 mutáns molekulák kifejezhetők prokarióta sejtekben. A prokariótákat leggyakrabban különböző baktérium törzsek képviselik. A baktériumok lehetnek Gram pozitívok vagy Gram negatívok. Általában a Gram negatív baktériumokat, ilyen az E.coli, részesítjük előnyben. Más mikroba törzsek szintén használhatók.

A CTLA4 mutáns molekulákat kódoló szekvenciákat olyan vektorba építhetjük be, amelyet idegen szekvenciák prokarióta sejtekben — ilyen az E.coli — való kifejezésére szerkesztettünk. Ezek a vektorok általánosan használt prokarióta szabályozó szekvenciákat tartalmazhatnak, azaz ahogy itt meghatározzuk, promotereket tartalmaznak a transzkripció megindításához, adott esetben egy operátorral, végig riboszóma kötőhely szekvenciákkal. Általánosan használt promoterek például a béta-laktamáz (penicillináz) és laktóz (lac) promoter rendszerek [Chang et al., Nature, 198, 1056 (1977)], a triptofán (trp) promoter rendszer [Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 3, 4057 (1980)] és a lambda eredetű P_L promoter, valamint az N-gén riboszóma kötő hely

75.665/BE

[Shimatake et al., 292, 128 (1981)].

Ezek az expresszios vektorok tartalmaznak még replikációs origókat és szelekciós markereket, ilyen például a béta-laktamáz vagy neomicin foszfotranszferáz gén, amely antibiotikum rezisztenciát biztosít. A vektorok tehát replikálódhatnak a baktériumokban és a plazmidokat hordozó sejteket szelektálhatjuk, amikor antibiotikumok, például ampicillin vagy kanamicin jelenlétében növekednek.

Az expressziós plazmidokat standard eljárások nagy választékának segítségével vezethetjük be a prokarióta sejtekbe. Ilyen eljárás például — de nem kizárólag — a kalcium-klorid sokk [Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 2110 (1972) és Sambrook et al., (szerk.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press (1989)] és az elektroporáció.

A találmány gyakorlatának megfelelően az eukarióta sejtek alkalmas gazdasejtek is. Eukarióta sejt például minden állati sejt, akár primer, akár halhatatlanná tett, az élesztő (például: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe és Pichia pastoris) és a növényi sejtek. Például a myeloma, COS és CHO állati sejtek gazdasejtekként használhatók. Speciális CHO sejtek például — de nem kizárólag — a következők:DG44 [Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet., 12, 555-556 (1986); Kolkekar, Biochemistry, 36, 10901-10909 (1997)], CHO-K1 (ATCC letéti száma CCL-61), CHO-K1 Tet-On sejtvonal (Clontech), ECACC 85050302 jelű CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) , CHO klón 13 (GEIMG, Genova, IT) és RR-CHOK1, jele ECACC 92052128 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) . Példaként említjük a növényi sejtek közül a do75.665/BE hány (teljes növények, sejt tenyészet vagy callus), kukorica, szójabab és rizs sejteket. Elfogadhatók a kukorica, szójabab és rizs magok is.

A CTLA4 mutáns molekulákat kódoló nukleinsav szekvenciákat is beépíthetjük olyan vektorba, amelyet idegen sejtek eukarióta gazdában történő kifejeződése végett szerkesztettünk. A vektor szabályozó elemei a speciális eukarióta gazdának megfelelően változhatnak.

Az expressziós vektorokban általánosan alkalmazott szabályozó szekvenciák a következők: promoterek és emlős sejtekkel kompatíbilis szabályozó szekvenciák, ilyenek például a CMV promoter (CDM8 vektor) és avian sarcoma vírus (ASV) (dLN vektor). Egyéb általánosan használt promoterek közé tartozik például a Simian vírus 40-ből (SV40) származó korai és késői promoter [Fiers et al., Nature, 273, 113 (1973)], vagy más virális promoterek, amelyek polyoma, adenovirus 2 és bovin papilloma vírus eredetűek. Indukálható promoter, mint a hMTII [Karin et al., Nature, 299, 797-802 (1982)], szintén használható.

A CTLA4 mutáns molekulákat eukariótákban kifejező vektorok enhancer régióknak nevezett szekvenciákat is hordozhatnak. Ezek a gén-expresszió optimalizálásában fontosak és a promoter régiótól vagy 5' irányban vagy 3' irányban találhatók.

Eukarióta gazdasejtek számára megfelelő expressziós vektorok például de nem kizárólag az emlős sejtekhez való vektorok [például: BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); pVPakc vektorok, pCMV vektorok, pSG5 vektorok (Stratagene)], retro

75.665/BE virális vektorok [például: pFB vektorok (Stratagene)], pCDNA-3 (Invitrogen) vagy ennek módosított formái, adenovirális vektorok, Adeno-asszociált vírus vektorok, bakulovírus vektorok, élesztő vektorok [például: pESC vektorok (Stratagene)].

A CTLA4 mutáns molekulákat kódoló nukleinsav szekvenciák be tudnak integrálódni az eukariota gazdasejt genomjaba, és úgy rθρίikalodnak, ahogy a gazda genomja replikalodik. Mas esetben a CTLA4 mutáns molekulákat hordozo vektor replikaciós kezdőpontokat tartalmazhat, amelyek lehetővé teszik az extrakromoszómális replikációt.

A nukleinsav-szekvenciák Saccharomyces cerevisiae-ben való kifejeződéséhez az endogén élesztő plazmidból, a 2μ cikuláris plazmidbol szármázó replikaciós origo használható [Broach, Meth. Enz., 101, 307 (1983)]. Vagy pedig az élesztő genomból olyan szekveciakat hasznaihatunk, amelyek az autonóm replikációt képesek előmozdítani [lásd például: Stinchcomb et al., Nature, 282, 39 (1983); Tschemper et al. , Gene, 10, 157 (1980); Clarke et al., Meth.Enz., 101, 300 (1983)].

Az élesztő vektorokhoz alkalmas transzkripciós szabályozó szekvenciák magukba foglalják a glikolízis enzimeinek szintéziséhez szolgáló promotereket [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 (1968); Holland et al., Biochemistry, 17, 4900 (1978)]. A szakterületen ismert további promoterek például a következők: a CDM8 vektorban rendelkezésre álló CMV promoter [Toyama and Okoyama, FEBS, 268, 217-221 (1990)]; a 3-foszfoglicerát kináz promoter [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 2073 (1980)] és a további glikolítikus enzimek.

75.665/BE

Vannak indukálható promoterek, ezek környezeti stimulusokkal vagy a sejtek táptalajával szabályozhatók. Az indukálható promoterek magukba foglalják a hősokk proteineket, az alkohol dehidrogenáz 2-t, az izocitokróm C-t, a savanyú foszfatázt, a nitrogén katabolizmussal kapcsolatos enzimeket és a maltóz és galaktóz hasznosításáért felelős enzimeket meghatározó génekből származó promotereket.

A szabályozó szekvenciákat a kódoló szekvenciák 3' végére is telepíthetjük. Ezek a szekvenciák stabilizálhatják a messenger RNS-t. Ilyen terminátorok találhatók számos élesztőből származó és emlős génben a kódoló szekvenciák utáni 3' nem transzlatált régióban.

Növényekhez és növényi sejtekhez alkalmas vektorok például de nem kizárólag az agrobakterium Ti plazmidok, a karfiol mozaik vírus (CaMV = cauliflower mosaic virus) és a paradicsom arany mozaik vírus (TGMV = tomato golden mosaic virus).

Az emlős gazdasejt rendszer transzformációinak általános aspektusait Axel írta le (1983 augusztus 16—án 4,399,216 számon közzétett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat). Emlős sejteket a következő módszerekkel — de nem kizárólag — transzformálhatunk: transzfekció kalcium-foszfát jelenlétében, mikroinjekció, elektroporáció vagy virális vektorok útján végzett transzdukció.

Idegen DNS szekvenciák növényi és élesztő genomba való bevezetéséhez szolgáló eljárások közé soroljuk (1) a mechanikai módszereket, ilyen a DNS mikroinjekciója egyedi sejtekbe vagy protoplasztokba, a sejtek Vortex keverőben üvegszemcsékkal való keverése DNS jelenlétében vagy DNS-sel bevont wolfram vagy arany

75.665/BE gömbök belövése sejtekbe vagy protoplasztokba; (2) a DNS olyan módon való bevezetését, amikoris makromolekulák számára átjárhatóvá tesszük a sejt membránokat polietilénglikol kezeléssel vagy magas feszültségű elektromos pulzusokkal (elektroporáció) ; vagy (3) a liposzómák (cDNS tartalmú) használatát, amelyek a sejtmembránokhoz fuzionálnak.

A CTLA4 mutáns molekulák expresszióját a szakma áltál ismert módszerekkel detektálhatjuk. Például: a mutáns molekulákat SDSPAGE gélek Coomassie festésével tudjuk kimutatni és immunblotting segítségével, olyan antitesteket használva, amelyek kötik a CTLA4-et. Protein izolálást standard protein tisztításhoz szolgáló eszközökkel végezhetünk, például ilyen az affinitás kromatográfia vagy az ioncserés kromatográfia. Ezek az eljárások lényegében tiszta terméket eredményeznek [R.Scopes közleménye a „Protein Purification, Principles and Practice című kiadványban, 3. kiadás, Springer-Verlag (1994)].

A találmány a fentiek szerint előállított oldható CTLA4 mutáns molekulákra is vonatkozik.

CTLA4Ig kodon-alapú mutagenezise

Egy kiviteli alakban helyre irányuló mutagenezist és egy új szűrési eljárást alkalmaztunk, hogy több olyan mutációt azonosítsunk a CTLA4 extracelluláris doménjében, amelyek javítják a CD86-hoz való kötő-aviditást. Ebben a kiviteli alakban a CTLA4 extracelluláris dómén régióiban a következő csoportoknál végeztünk mutációkat: szerin 25-től arginin 33-ig, a C' szálban (alanin 49 és treonin 51), az F szálban (lizin 93, glutaminsav 95 és leucin 96), a metionin 97-től tirozin 102-ig és a tirozin 103-tól glicin 107-ig terjedő régióban és a G szálban a glutamin

75.665/BE

Hl, tirozin 113 es izoleucin 115 pozíciókban. Ezeknek a helyeknek a kiválasztását a kiméra CD28/CTLA4 fúziós proteinek [Peach et al., J. Exp. Med., 180, 2049-2058 (1994)] tanulmányozása alapjan végeztük es sgy olyan modell alapjan, amellyel előre ki lehetett számítani, hogy mely aminosav csoportokból álló oldalláncok lesznek kitéve oldószernek és a CD28 és CTLA4 között bizonyos pozíciókban aminosavcsoport azonosság vagy homológia hiány alapján. Tehát minden olyan csoportot, amely térbelileg szoros közelségben van (5 - 20 Á°, azaz 0,5-2 nm) az azonosított csoportokhoz, úgy tekintünk, hogy a találmány részét képezi.

Kétlépéses stratégiát vezettünk be olyan oldható CTLA4 mutáns molekulák szintetizálására és szűrésére, amelyek megváltozott affinitással rendelkeznek CD80-hoz és/vagy CD86-hoz.A kísérletekben úgy jártunk el, hogy először a CTLA4 extracelluláris részének egy speciális kodonjánál mutáció-tárat hoztunk létre, amelyet azután BIAcore analízissel szűrtünk, hogy azokat a mutánsokat azonosítsuk, amelyeknek a CD80-nal vagy a CD86-tal szemben megváltozott a reaktivitása. A BIAcore assay rendszer (Pharmacia, Piscataway, N.J.) egy felületi plasmon rezonancia detektor rendszert foglal magába, amelyben lényegében akár a CD80lg, akár a CD86lg egy dextránnal fedett szenzor chiphez _ amely a detektorban helyezkedik el — kovalens módon van kötve. A teszt molekulát ekkor a szenzor chipet tartalmazó kamrába injektálhatjuk és a kötődő komplementer protein mennyiségét a molekulatömeg — amely fizikailag a szenzor chip dextránnal fedett oldalával társul változása alapján állapíthatjuk meg; a molekulatömeg változását a detektor rendszerrel mérhetjük.

A találmány előnyei

75.665/BE

Minthogy a CTLA4 CD80-hoz és CD86-hoz való kötődését gyors asszociációs („on) sebességek és gyors disszociációs („off) sebességek jellemzik, és mivel a CTLA4Ig-CD86 komplexek megközelítőleg 5-8-szor gyorsabban disszociálnak, mint a CTLA4-CD80 komplexek, azt gondoltuk, hogy a CTLA4Ig CD80-tól és/vagy CD86tól való disszociációs sebességét lassítva, hatásosabb immunszuppresszív tulajdonságokkal rendelkező molekulákat kapunk. így arra számítottunk, hogy azok az oldható CTLA4 mutáns molekulák, amelyeknek a CD80- vagy CD86-pozitív sejtekhez erősebb az avíditasuk, mint a vad txpusu CTLA4—e vagy mint a CTLA4Ig nem mutagenizált formáié, nagyobb hatékonysággal blokkolják az antigén-specifikus aktivált sejtek stimulációját, mint a vad típusú CTLA4 vagy a CTLA4Ig nem mutagenizált formái

A CTLA4Ig termelési költségei ezenkívül nagyon magasak. Az erős aviditású mutáns CTLA4lg molekulák, amelyek hatékonyabb immunszuppresszív tulajdonságokkal rendelkeznek, jelentékenyen alacsonyabb dózisokban alkalmazhatók a klínikumban, mint a nem mutagenizált CTLA4Ig, hasonló immunszuppressziós szintek eléréséhez. Tehat az oldható CTLA4 mutáns molekulák, például az L104EA29YIg, nagymértékben költségkímélők lehetnek.

Az alábbi példákat a találmány szemléltetése végett mutatjuk be és hogy azoknak, akik általános jártassággal rendelkeznek, segítséget adjunk a találmány kivitelezéséhez és alkalmazásához. A példákkal egyébként semmiképpen nem szándékozzuk korlátozni a találmány oltalmi körét.

75.665/BE

PÉLDÁK 1. példa

Ez a példa a találmány szerinti CTLA4 mutáns molekulákat kódoló nukleotid szekvenciák előállítására szolgáló eljárások leírását tartalmazza. Egy egy-helyes mutáns L104EIg -t állítottunk elő és CD80-nal és/vagy CD86-tal szembeni kötődési kinetikáját teszteltük. Az L104EIg nukleotid szekvenciáját templátként használtuk a két-helyes mutáns CTLA4 mutáns szekvencia, az L104EA29YIg előállításához, amelynek CD80-nal és/vagy CD86-tal szembeni kötődési kinetikáját teszteltük.

A CTLAATg kodon alapú mutagenezise

Mutagenizalo es szúró stratégiát fejlesztettünk ki, hogy olyan mutáns CTLA4Ig molekulákat azonosítsunk, amelyek CD80 és/vagy CD86 molekuláktól kisebb sebességgel disszociálnak („off „ sebességek). Egy-helyes mutáns nukleotid szekvenciákat állítottunk elő úgy, hogy CTLA4Ig-t (5,844,095, 5,851,795 és

5,885,796 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; ATCC letéti szám: 68629) használtunk templátként. Mutagén oligonukleotid PCR primereket szerkesztettünk egy specifikus cDNS kodon random mutageneziséhez, megengedve a kodon 1 és 2 pozíciójánál bármely bázist, de a 3 pozícióban csak a guanint vagy timint (XXG/T; NNG/T néven is ismert). Ilyen módon egy aminosavat kódoló specifikus kodon találomra (random) úgy mutagenizálható, hogy a 20 aminosav mindegyikét kódolja. Ebben a vonatkozásban az XXG/T mutagenezis 32 potenciális kodont hoz létre, amelyek mind a 20 aminosavat kódolják. A CTLA4lg M97-G107 közvetlen közelében lévő mutációkat kódoló PCR termékeket (lásd a

75.665/BE

7. vagy 8. ábrát) SacI/Xbal-gyel emésztettük, és a hasonlóan hasított CTLA4Ig dLN expressziós vektorba szubklónoztuk. Ezt az eljárást alkalmaztuk az L104EIg egy-helyes mutáns molekula elállítására (8. ábra).

A CTLA4Ig S25-R33 közelében végzett mutagenezishez először egy csendes Nhel restrikciós helyet vezettünk be 5'-nél ebbe a hurokba, PCR primer-irányított mutagenezissel. A PCR termékeket Nhel/Xbal-gyel emésztettük és a hasonlóképpen hasított CTLA4Ig vagy L104Ig expressziós vektorba szubklónoztuk. Ezt az eljárást alkalmaztuk a két-helyes CTLA4 mutáns molekula, az L104EA29YIg (7. ábra) előállítására. Pontosabban, az egy-helyes CTLA4 mutáns molekulát, az L104EIg-t kódoló nukleinsav molekulát használtuk templátként a két-helyes mutáns molekula, az L104EA29YIg előállításához. Az L104EA29YIg-t tartalmazó dLN vektort a 12.ábrán mutatjuk be.

2. példa

A következőkben azokat a szűrő módszereket írjuk le, amelyeket az 1. példában leírt szerkezetekből kifejezett egy- és kéthelyes olyan mutáns polipeptidek azonosítására használtunk, amelyek erősebb kötő aviditást mutattak CD80 és CD86 antigénhez, mint a nem mutagenizált CTLA4Ig molekulák.

A jelenlegi in vitro és in vivo vizsgálatok arra utalnak, hogy maga a CTLA4 nem képes teljesen blokkolni az antigén specifikusan aktivált T sejtek stimulációját. A CTLA4Ig-vel és mind CD80, mind CD86 specifikus monoklonális antitesttel végzett in vitro vizsgálatok, amelyekkel a T sejt propliferáció gátlást mértük, azt mutatták, hogy az anti-CD80 monoklonális antitest

75.665/BE nem növeli a CTLA4Ig gátlást. Az anti-CD86 monoklonális antitest azonban növelte a gátlást, ami azt jelenti, hogy a CTLA4lg nem volt olyan hatásos a CD86 kölcsönhatások blokkolása terén. Ezek az adatok alátámasztják Linsley és munkakatársai [Immunity, 1, 793-801 (1994)] korábbi megállapításait, melyek szerint a CD80közvetített celluláris válaszok gátlásához körülbelül százszor alacsonyabb CTLA4Ig koncentrációkra volt szükség, mint a CD86közvetített válaszok gátlásához. Ezeknek a megállapításoknak az alapján feltételeztük, hogy az oldható CTLA4 mutáns molekulák, amelyeknek erősebb az aviditása CD86-hoz, mint a vad típusú CTLA4-nek, jobban kell blokkolják az antigén specifikusan aktivált sejtek stimulációját, mint a CTLA4Ig.

Ezért az 1. példában leírt oldható CTLA4 mutáns molekulákat egy új szűrési eljárással szűrtük annak érdekében, hogy a CTLA4 extracelluláris doménjében számos olyan mutációt azonosítsunk, amelyek a CD80-nal és CD86-tal szembeni kötő aviditást javítják. Ez a szűrési stratégia hatásos módszert nyújtott nyilvánvalóan alacsonyabb „off sebességű mutánsok azonosításához anélkül, hogy szükség lett volna protein tisztításra vagy mérésre, minthogy az „off sebesség meghatározás koncentráció független [O'Shannessy et al., Anal.Biochem., 212, 457-468 (1993)].

COS sejteket transzfektáltunk individuális miniprep módszerrel tisztított plazmid DNS-sel és a sejteket több napig tenyésztettük. Három napos kondicionált táptalajokat vittünk rá oldható CD80lg-vel vagy CD86lg-vel fedett BIAcore csipekre (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Svédország). A mutáns proteinek specifikus kötődését és disszociációját felületi plasmon rezonanciával

75.665/BE

[D.J.0' Shannessy et al., Anal. Biochem., 212, 457-468 (1993)] mértük. Minden kísérletet BIAcore™ vagy BIAcore™ 2000 bioszenzoron, 25° C-on futtattunk. A ligandumokat kutatási minőségű NCM5 szenzor chipeken (Pharmacia) immobilizáltuk, standard N-etil-N'-[(dimetil-amino)-propil]-karbodiimid-N-hidroxi-szukcinimid konjugálást [B.Johnsson et al., Anal.Biochem., 198, 268-277 (1991); S.N.Khilko et al., J.Biol. Chern., 268, 15425-15434 (1993)] alkalmazva .

Szűrési eljárás

Huszonnégy tartályos szövettenyésztő lemezeken tenyésztett COS sejteket tranziens módon transzfektáltunk mutáns CTLA4Ig-t kódoló DNS-sel. Három nap múlva a szekretált oldható mutáns CTLA4Ig—t tartalmazó táptalajokat összegyűjtöttük.

A kondicionált COS sejt táptalajokat CD86Ig-vel vagy CD80Igvel módosított BIAcore bioszenzor chipeken folyattuk át [Greene et al., J. Biol. Chem., 271, 26762-26771 (1996), a közleményben található leírás szerint] és a mutáns molekulákat a vad típusú CTLA4Ig-nél megfigyeltnél alacsonyabb „off sebességek alapján azonosítottuk. A kiválasztott táptalaj mintáknak megfelelő cDNSeket szekvenáltuk és DNS-t izoláltunk, hogy nagyobb mennyiségű COS sejt tranziens transzfekcióját végezhessük el. A táptalaj protein A-val való tisztítása után állítottuk elő a mutáns CTLA4Ig proteint.

A BIAcore analízishez olyan feltételeket teremtettünk és az egyensúlyi kötési adatok analízisét úgy végeztük, ahogyan J.Greene és munkatársai leírták [J. Bioi. Chem., 271, 26762-26771 (1996)]és ahogyan a következőkben leírjuk.

75.665/BE

BIAcore adat analízis

Analízis előtt a szenzogramm alapvonalakat zéró válasz egységekre (RU = response unit) korrigáltuk. A mintákat vakkal módosított cellákon folyattuk át, hogy meghatározzuk a háttér RU értéket, amelyet az oldatok közötti bulk refraktív index különbségek eredményeznek. Az egyensúlyi disszociációs állandókat (K_d ) C-vel szemben felvett R_eq értékekből kapott grafikonból számítottuk ki, ahol R_eq a steady-state válasz mínusz a vakkal módosított chipen kapott választ jelenti, C pedig az analizált minta moláris koncentrációját. A kötési görbéket a kereskedelemben kapható nonlinear Curve-fitting software-rel (Prism, GraphPAD Software) analizáltuk.

A kísérleti adatokat először egy olyan modellbe illesztettük be, amelyben egyetlen ligandum kötődik egyetlen receptorhoz (egy-helyes modell, azaz egyszerű Langmuir rendszer, A + B - AB) és az egyensúlyi asszociációs állandót (K_d = [A] ’ [B] / [AB] ) a következő egyenletből számítottuk ki: R = R_max . C/(K_d+C) . Az adatokat ezután a ligandum kötés legegyszerűbb két-helyes modelljébe illesztettük be [azaz a ligandum olyan receptorhoz kötődik, amely két, egymásra nem ható, független kötőhellyel rendelkezik, ahogyan a következő egyenlet leírja:

R = R_max.C/K_dl +C) + (K_d2+C) ] .

E két modellben az illesztés helyességét (goodness-of-fits) vizuálisan analizáltuk, a statisztikai kiértékelést pedig a kísérleti adatokkal való összehasonlítás révén a négyzetösszegek F tesztjével (F test of sums—of squares) végeztük el. Az egyszerűbb egy-helyes modellt választottuk, mint legjobb illesztést,

75.665/BE hacsak a két-helyes modellbe illesztés nem bizonyult szignifikánsan jobbnak (p <0,l).

Az asszociációs és disszociációs analíziseket BIA evaluation 2.1 Software-rel (Pharmacia) végeztük. Az asszociációs sebességi állandókat — k_on — kétféleképpen számítottuk ki, feltételezve mind homogén egy-helyes kölcsönhatásokat, mind parallel kéthelyes kölcsönhatásokat. Egy-helyes kölcsönhatások esetén a k_on értékeket a következő egyenlettel számítottuk ki:

Rt = R_eq d - exp’V^V ) , ahol R_t egy válasz egy adott t időpontban; R_eq a steady-state válasz; t_o az injekció megkezdésének időpontja; és k_s dR/dt k_on C_off es ahol C az analizált anyag koncentrációja, monomer kötőhelyekre számítva. Két-helyes kölcsönhatás esetére a k_on értékeket a következő egyenlettel számítottuk ki:

R_t = Régid - ΘΧρΛί'^ο¹) + R_eq2 d ~ ΘΧρ’\₂ ) Mindkét modellnél a k_On értékeket a C—vei szemben felvett k_s görbék számított hajlásából (körülbelül 70% maximális asszociációig) határoztuk meg.

A disszociációs adatokat egy-helyes (AB = A + B) vagy kéthelyes (AiBj = Ai + Bj) modell szerint analizáltuk és a sebességi állandókat (k_off) a legjobb illesztési görbékből számítottuk ki. A kötési hely modellt használtuk, kivéve, ha a különbözetek nagyobbak voltak, mint a készülék háttér (2 - 10 RU, a készüléknek megfelelően), mely esetben a két-helyes modelelt alkalmaztuk. A receptor birtoklás fél-idejét a következő összefüggés segítségével számítottuk ki:

ti/2 = 0, 693/k_off.

75.665/BE

Áramlási citometria

Az L307.4 (anti-CD80) egér monoklonális antitestet (mAt) a Becton Dickinson cégtől (San Jose, California) és az IT2.2 [anti-B7-0 (CD86 néven is ismert)] mAt-et a Pharmingen cégtől (San Diego, California) szereztük be. Immuno-festéshez a CD80 és/vagy CD86 pozitív CHO sejteket úgy távolítottuk el a tenyésztő edényekből, hogy a sejteket 10 mM EDTA tartalmú foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban inkubáltuk. A CHO sejteket (1 - 10 x 10⁵) először mAt-ekkel vagy immunglobulin fúziós proteinekkel inkubáltuk 10% fetális marha szérumot (FBS) tartalmazó DMEM táptalajban, ezután mosás következett, majd inkubálás fluoreszceinizotio-cianáttal konjugált kecske anti-egér vagy anti-humán immunglobulin második reagensekkel (Tago, Burlingame, California). A sejtek egy végső mosást kaptak, majd FACScan készülékben (Becton Dickinson) végeztük az analízist.

SDS-PAGE és méretkizárásos kromatográfia

Az SDS-PAGE kivitelezéséhez trisz/glicin 4-20% akrilamid géleket (Novex, San Diego, CA) használtunk. Az analitikai géleket Coomassie Blue-val festettük meg és a nedves gélek képeit digitális letapogatással kaptuk. A CTLA4Ig-t (25 ég) és az L104EA29YIg-t (25 gg) méret kizárásos kromatográfiával analizáltuk, TSK-GEL G300 SW_XL oszlopot (7,8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) alkalmazva, amelyet 0,02% nátrium-azid tartalmú foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal hoztunk egyensúlyba 1,0 ml/perc átfolyási sebesség mellett.

75.665/BE

CTIA4Xci2os és LlO4EA29YXci₂os

Egyszálú CTLA4X_ci2os-t állítottunk elő Linsley és mukatársai korábbi leírása szerint [J. Bioi. Chem., 270, 15417-15424 (1995)]. Röviden kifejtve: egy onkosztatin M CTLA4 (OMCTLA4) expresszió GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG forward prímért úgy választottuk meg, hogy illeszkedjen a vektor szekvenciáihoz; a GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC reverz primer pedig, amely a CTLA4 extracelluláris doménben az utolsó hét aminosavnak (azaz a 118-124. aminosavaknak) felelt meg, tartalmazott egy restrikciós enzim helyet és egy stop kodont (TGA). A reverz primer egy C120S (cisztein helyett szerin a 120 pozíciónál) mutációt határozott meg. Nevezetesen, a fent bemutatott reverz primerben a GCA nukleotid szekvenciát (34-36. nukleotidok) a következő nukleotid szekvenciák egyikével helyettesítettük: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT vagy GOT. A szakmában jártas személyek tudni fogják, hogy a GCA nukleotid szekvencia a cisztein TGC kodonjának egy fordított komplementer szekvenciája. Ugyanígy, az AGA, GGA, TGA, CGA, ACT vagy GCT a szerin kodonjainak fordított komplementer szekvenciáit képviselik. A polimeráz láncreakció termékeit HindlII/Xbal-gyel emésztettük, és közvetlenül a dLN expressziós vektorba (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ) szubklónoztuk. Az L104EA29YX_cl20s-et azonos módon állítottuk elő. Mindkét szerkezetet DNS szekvenálással azonosítottuk.

75.665/BE

Erős aviditású. mutánsok azonosítása és biokémiai vizsgálata

Mutagenizáláshoz huszonnégy aminosavat válalsztottunk ki és a kapott -2300 mutáns proteint CD86Ig kötésre vizsgáltuk felületi plazmon rezonancia (surface plasmon resonance = SPR; mint fentebb leírtuk) alkalmazásával. Az egyes helyeken létrejött mutagenezisek által kifejtett hatásokat a 2. táblázatban foglaljuk össze. Néhány aminosav véletlenszerű mutagenezise S25-R33ban nyilvánvalóan nem változtatta meg a ligandum kötést. Az E31 és R33, valamint az M97-Y102 csoportok mutagenezise láthatóan csökkent ligandum kötést eredményezett. Az S25, A29 és T30, K93, L96, Y103, L104 és G105 csoportok mutagenezise alacsony „on és/vagy alacsony „off sebességű proteineket eredményezett. Ezek az eredmények megerősítik azokat az előző megállapításokat, miszerint az S25-R33 régióban lévő csoportok és az M97-Y102 régióban lévő csoportok, vagy az ehhez közeli csoportok befolyásolják a ligandum kötést [Peach et al., J. Exp. Med., 180, 2049-2058 (1994)] .

Az S25, T30, K93, L96, Y103 és G105 helyek mutagenezise néhány olyan mutáns protein azonosítását eredményezte, amelyeknek CD86lg-től alacsonyabb volt az „off sebességük. Ezekben az esetekben azonban az alacsony „off sebességet egy alacsony „on sebesség kiegyenlítette, amely a mutáns proteinekben CD86Ig-vel szemben egy általános aviditást eredményezett, és ez kétségtelenül hasonló volt ahhoz, amelyet a vad típusú CTLA4Ig-nél láttunk. Ezenkívül a K93 mutagenezise jelentős aggregációt okozott, amely a megfigyelt kinetikai változásokért felelős lehetett.

Az L104 random mutagenezise, amely után COS sejt transz75.665/BE fekciót végeztünk, és a táptalaj mintákat immobilizált CD86Ig-n SPR-rel szűrtük, hat olyan mutáns proteint tartalmazó táptalaj mintát eredményezett, amelyeknek körülbelül kétszer kisebb volt az „off sebességük, mint a vad tipusu CTLA4Ig—é. Timikor ezen mutánsok megfelelő cDNS-eit szekvenáltuk, úgy találtuk, hogy mindsgyik sgy leucinrol glutaminsavra való változást előidéző mutációt (L104E) kódol. A leucin 104 helyettesítése aszparaginsavval (L104D) valószínűleg nem zavarja a CD86lg kötést.

A 2. táblázatban felsorolt minden egyes hely mutagenizálását a fent leírtak szerint megismételtük, ezúttal L104E PCR templátot alkalmazva vad típusú CTLA4Ig helyett. Az SPR analízis, amelyben újból immobilizált CD86lg-t használtunk, az alanin 29 mutageneziséből hat olyan táptalajt azonosított, amelyben a proteinek körülbelül négyszer alacsonyabb „off sebességgel rendelkeztek, mint a vad típusú CTLA4lg. A két leglassabb protein tirozin szubsztitúciót (L104EA29Y) tartalmazott, kettő leucin (L104EA29L), egy triptofán (L104EA29W) és egy treonin (L104EA29T) szubsztitúciót. Nyilvánvalóan nem azonosítottunk alacsony „off sebességű mutánsokat, amikor csak alanin 29-nél végeztünk random mutációt a vad típusú CTLA4Ig-ben.

A tisztított L104EIg és L104EA29YIg relatív molekulatömegét és aggregációs állapotát SDS-PAGE és méret kizárásos karomatográfia alkalmazásával határoztuk meg. Az L104EA29YIg-nek (~1 gg; 3-as nyomsáv) és L104EIg-nek (~1 gg; 2-es nyomsáv) láthatóan ugyanolyan az elektroforetikus mobilitása, mint a CTLA4Ignek (~1 gg; 1-es-nyomsáv) redukáló (~50 kD; + βΜΕ; + 2-merkapto-etanol) és nem-redukáló (~100 kD; -βΜΕ) körülmények között (10A.

75.665/BE ábra) . A méret kizárásos kromatográfia azt mutatta, hogy az L104EA29YIg-nek (10C. ábra) valószínűleg azonos a mobilitása, mint a dimer CTLA4Ig-nek (10B. ábra). A nagyobb csúcsok protein dimereket képviselnek, míg a gyorsabban eluáló kisebb csúcs a 10B ábrán magasabb molekulatömegű aggregátumokra mutat. A CTLA4Ig-nek mintegy 5,0%-a magasabb molekulatömegű aggregátumok formájában volt jelen, de az L104EA29YIg vagy az L104EIg aggregációjára nem volt bizonyíték. Ennélfogva a CD86Ig-hez való erősebb kötődés, amely az L104EIg-nél és L104EA29YIg-nél volt látható, nem tulajdonítható mutagenezis által indukált aggregációnak.

Egyensúlyi és kinetikus kötődési analízis

Elvégeztük a protein A-val tisztított CTLA4Ig, L104EIg és L104EA29YIg egyensúlyi és kinetikus kötődési analízisét felületi plazmon rezonancia (SPR) alkalmazásával. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza. Az egyensúlyi disszociációs állandókat (Ka; 1. táblázat) egy koncentráció sorozat (5,0 - 200 nM) használatával kapott kötési görbékből számítottuk ki. Az L104EA29YIg erősebben kötődik CD86Ig-hez, mint az L104EIg vagy a CTLA4Ig. Az L104EA29YIg-re alacsonyabb K_d értéket (3,21 nM) kaptunk, mint az L104EIg-re (6,06 nM) vagy CTLA4Ig-re (13,9 nM), és ez az L104EA29YIg CD86Ig-vel szembeni erősebb kötési aviditását mutatja. Az L104EA29YIg alacsonyabb K_d értéke (3,66 nM) az L104EIg-vel (4,47 nM) vagy a CTLA4Ig-vel (6,51 nM) összehasonlítva, azt mutatja, hogy az L104EA29YIg CD80lg-vel szemben erősebb a kötési aviditása.

A kinetikus kötődési analízis felfedte, hogy a CTLA4Ig,

75.665/BE

L104EIg és L104EA29YIg CD80lg-hez való kötődés „on sebessége, valamint CD86Ig-hez való kötődés „on sebessége hasonlóak voltak (1. táblázat). Ezeknek a molekuláknak az „off sebességei azonban nem voltak azonosak (1. táblázat). A CTLA4Ig-hez hasonlítva, az L104EA29YIg-nek körülbelül kétszer lassabb volt az „off sebessége CD80lg-től és körülbelül négyszer lassabb volt az „off sebessége CD86Ig-től. Az L104EIg „off sebességei közbülső értékeket mutattak az L104EA29YIg és a CTLA4Ig között. Minthogy ezeknek a mutációknak a bevezetése jelentősen nem befolyásolta az „on sebességeket, a CD80lg-vel és a CD86Ig-vel szemben megnyilvánuló aviditás növekedés, amelyet az L104EA29YIg-nél figyeltünk meg, valószínűleg elsődlegesen az „off sebességek csökkenésének tudható be.

Annak meghatározására, hogy vajon az L104EA29YIg aviditás növekedése CD86Ig-hez és CD80lg-hez a mutációknak köszönhető-e, amelyek az egyes monomerek dimerré való asszociációjának módját befolyásolják, vagy vájjon aviditás fokozó strukturális változások mentek-e végbe az egyes monomerekben, előállítottuk a CTLA4 és L104EA29Y extracelluláris domének egyszálu szerkezeteit, amelyekben a cisztein 120-at szerinné mutagenizáltuk, ahogyan fentebb leírtuk és ahogyan Linsley és munkatársai közölték [J. Biol. Chem. , 270, 15417-15424 (1995)]. A CTLA4X_ci₂os és LlO4EA29YXci2os tisztított proteinek monomernek mutatkoztak gél áteresztéses kromatografálásnál [Linsley et al., lásd fentebb (1995)], mielőtt ligandum kötő tulajdonságaikat SPR-rel analizáltuk. Az eredmények azt mutatták, hogy mindkét monomer protein kötési affinitása CD86Ig-vel szemben megközelítőleg 35-80-szor

75.665/BE kisebb volt, mint megfelelő dimereiké (1. táblázat). Ez alátámasztja azokat az előzőleg közölt adatokat, amelyek megállapították, hogy az erős aviditással végbemenő ligandum kötéshez szükség volt a CTLA4 dimerizációjára [Greene et al., J. Bioi. Chem., 271, 26762-26771 (1996)].

Az LlO4EA29YXci2os körülbelül kétszer nagyobb affinitással kötődött mind CD80Ig-hez, mind CD86lg-hez, mint a CTLA4X_cl20s. A megnövekedett affinitás annak volt köszönhető, hogy a disszociáció sebessége mindkét ligandumtól körülbelül háromszor lassabb volt. Tehát az L104EA29Y által kifejtett erősebb ligandum kötés nagy valószínűséggel inkább azoknak az aviditást fokozó strukturális változásoknak volt köszönhető, amelyeket az egyes monomer láncokba bevezettünk, és nem az olyan módosulásoknak, amelyek által a molekula demerizálódott.

Aviditás fokozó mutációk helye és szerkezeti

A CTLA4 extracelluláris IgV-szerű dómén oldat-szerkezetét nemrég MMR spektroszkópiával határozták meg [Metzler et al., Nature Struct. Biol., _4, 527-531 (1997),]. Ez lehetővé tette a leucin 104 és alanin 29 pontos elhelyezését a háromdimenziós gombolyagban (11A-B. ábra). A leucin 104 a nagymértékben állandó MYPPPY aminosavszekvencia közelében helyezkedik el. Az alanin 29 az MYPPPY régióval térbelileg szomszédos S25-R33 régió C-terminális végéhez közel helyezkedik el. Míg e két régió bázisán a csoportok között jelentős a kölcsönhatás, kétségtelenül nincs közvetlen kölcsönhatás az L104 és A29 között, bár mindkettő egy összefüggő hidrofób mag részét képezi a proteinben. A két aviditás erősítő mutáns szerkezeti konzekvenciáit modellezéssel értékel—

75.665/BE tűk ki. Az A29Y mutációt könnyen el lehet helyezni az S25-R33 régió és az MYPPPY régió közötti résben és az MYPPPY régió konformációjának stabilizációját szolgálhatja. A vad típusú CTLA4ben az L104 az L96-tal és V94-gyel erőteljes kölcsönhatásokat alakít ki az MYPPPY régió közelében. Nagyon valószínűtlen, hogy a glutaminsav mutáció az L104 mutációhoz hasonló konformációt vesz fel két okból. Először: nincs elég hely a szerkezetben a hosszabb glutaminsav oldallánc elhelyezésére az S25-R33 régió jelentős megzavarása nélkül. Másodszor: a negatív töltésű glutaminsav oldallánc bevitele a hidrofób régióba nagy energia ráfordítással járna. A modellezési vizsgálatok előre jelezték, hogy a glutaminsav oldallánc ehelyett kipattan a felületre, ahol a töltése szolvatálással stabilizálható. Egy ilyen konformációs változtatás G105-tel könnyen megoldható a régiókban lévő többi csoport minimális torzításával.

Erős aviditású mutánsok kötődése CD80-at vagy CD86-ot kifejező CHO sejtekhez

Elvégeztük a CTLA4Ig és a mutáns molekulák stabilan transzfektált CD80+ és CD86+ CHO sejtekhez való kötődésének FACS analízisét (2. abra) . A módszert ebben a leírásban ismertettük. A CD80-pozitív és CD86—pozitív CHO sejteket növekvő koncentrációjú CTLA4Ig-vel, L104EA29YIg-vel vagy L104EIg-vel inkubáltuk, majd mostuk. A megkötött immunglobulin fúziós proteint fluoreszcein-izotio-cianáttal konjugált kecske anti-humán immunglobulin használatával mutattuk ki.

Mint a 2. ábra mutatja, a CD80-pozitív vagy CD86-pozitív CHO sejteket (1,5 x 10⁵) CTLA4Ig (négyszögek), L104EA29YIg (körök)

75.665/BE vagy L104EIg (háromszögek) megadott koncentrációival 2 órán át 23°C-on inkubáltuk, mostuk, majd fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált kecske anti-humán immunglobulin antitesttel inkubáltuk. Összesen 5000 élő sejt kötődését analizáltuk (egyetlen meghatározás) egy FACScan készülékben és a közepes fluoreszcencia intenzitást (mean fluorescence intensity = MFI) hisztogramm adatokból határoztuk meg PC-LYSYS alkalmazásával. Az adatokat a háttér fluoreszcenciára tekintettel korrigáltuk. Ezt csak a második lépésben használt reagenssel inkubált sejteken mértük (MFI = 7). A kontroll L6 mAt (80 pg/ml) MFI <30 értéket adott. Ezek az adatok négy független kísérlet eredményeit képviselik.

Az L104EA29YIg, L104EIg és CTLA4Ig kötődése humán CD80-nal transzfektált sejtekhez megközelítőleg azonos (2A. ábra). Az L104EA29YIg és az L104EIg erősebben kötődik humán CD86-tal stabilan transzfektált CHO sejtekhez, mint a CTLA4Ig (2B ábra).

Funkciós vizsgálatok

Humán CD4-pozitív T sejteket izoláltunk immunmágneses negatív szelekcióval [Linsley et al., J. Exp. Med., 176, 1595-1604 (1992)]. Az izolált CD4-pozitív T sejteket forbol-mirisztát-acetáttal (phorbol myristate acetate = PMA) plusz CD80-pozitív vagy CD86-pozitív CHO sejtekkel stimuláltuk inhibitor titrált koncentrációinak jelenlétében. CD4-pozitív T sejteket (8-10 x 10 /tartály) tenyésztettünk 1 nM PMA jelenlétében besugárzott CHO sejt stimulátorokkal vagy ezek nélkül. A proliferatív válaszokat Ιμθί/tartály [3H]timidin hozzáadása révén mértük egy 72 órás tenyésztés utolsó 7 órája folyamán. A PMA plusz CD80-pozitív CHO vagy CD86-pozitív CHO stimulált T sejtek gátlását L104EA29YIg75.665/BE vei és CTLA4Ig-vel végeztük. Az eredményeket a 3. ábra mutatja. Az L104EA29YIg a CD80-pozitív PMA-val kezelt CHO sejtek proliferációját jobban gátolta, mint a CTLA4lg (3A. ábra). Az L104EA29YIg a CD86-pozitiv PMA kezelt CHO sejtek proliferációjának gátlásánál is hatásosabb volt, mint a CTLA4Ig (3B. ábra) . Tehát az L104EA29YIg erősebb inhibitora a T sejtek mind CD80 által, mind CD86 által kiváltott kostimulációjának.

A 4. ábrán a fent előállított allostimulált humán T sejtek, amelyeket a továbbiakban egy CD80-at és CD86-ot kifejező PM elnevezésű humán B limfoblasztoid sejtvonallal (lymphoblastoid cell line = LCL) allostimuláltunk, L104EA29YIg-vel és CTLA4lgvel való gátlását mutatjuk be (T sejtek: 3,0 x 10⁴/tartály; PM: 8,0 x 10³/tartály). Az elsődleges allostimuláció 6 napig tartott, ezután a sejteket ³H-timidinnel pulzáltuk 7 óra hosszat, mielőtt a radiojelzés beépülését meghatároztuk.

A másodlagos allostimulálást a következőképpen végeztük. Hét napos elsődlegesen allostimulált T sejteket limfocita szeparáló közeg (lymphocyte separation medium = LSM) (ICN, Aurora, OH) alkalmazásával gyűjtöttünk és 24 órát állni hagytuk. A T sejteket ezután CTLA4lg vagy L104EA29YIg titrált mennyiségeinek jelenlétében PM hozzáadásával — ugyanolyan arányban, mint fent — restimuláltuk (másodlagosan) . A stimulálás 3 napig tartott, ezután a sejteket radiojelzővel pulzáltuk és mint fent, összegyűjtöttük. Az L104EA29YIg hatását az elsődlegesen allostimulált T sejtekre a 4A. ábra mutatja. Az L104EA29YIg hatását a másodlagosan allostimulalt T sejtekre a 4B. ábra mutatja. Az L104EA29YIg mind az elsődleges, mind a másodlagos T sejt proliferatív válaszokat 75.665/BE jobban gátolja, mint a CTLA4Ig.

A citokin termelés méréséhez (5. ábra) másodlagos allostimulacios lemezeket készítettünk két példányban. Három nap múlva a táptalajokat ELISA kitekkel (Biosource, Camarillo, CA) vizsgáltuk a gyártó cég által ajánlott körülmények alkalmazásával. Megállapítottuk, hogy egy másodlagos allogén stimulus után az L104EA29YIg hatékonyabb volt, mint a CTLA4lg a T sejt IL-2, IL-4 és γΙΕΝ citokin termelés blokkolásánál (5A-C. ábrák).

A 6. ábrán az L104EA29YIg és a CTLA4lg hatását mutatjuk be majom kevert limfocita válaszra (mixed lymphocyte response = MLR) . Két majomból perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC; 3,5 x 10⁴ sejt/tartály egy-egy majomból) tisztítottunk limfocita szeparáló közeg (LSM) alkalmazásával és a sejteket 2 ég/ml fitohemagglutininnal (PHA) kevertük össze. A sejteket 3 napig stimuláltuk, ezután radiojelzővel pulzáltuk 16 órán át az aratás előtt. Az L104EA29YIg jobban gátolta a majom T sejt proliferációt, mint a CTLA4Ig.

75.665/BE

1. táblázat

Az alábbi táblázat az egyensúlyi állandókat és a valószínű kinetikai állandókat tartalmazza (az értékek három különböző kísérletből kapott adatok középértékét jelentik ± standard eltéréssel )

Immobilizált protein	Vizsgálandó anyag	kon (X 105) I/1 S'1	kOff(x10-3) S'1	Kd nM
CD80Ig	CTLA4Ig	3,44 ± 0,29	2,21 ± 0,18	6,51 ± 1,08
CD80Ig	L104EIg	3,02 ± 0,05	1,35 ± 0,08	4,47 ± 0,36
CD80lg	L104EA29YIg	2,96 ± 0,20	1,08 ± 0,05	3,66 ± 0,41
CD80Ig	CTLA4XCi2os	12,0 ±1,0	230 ± 10	195 ± 25
CD80lg	LlO4EA29YXci2os	8,3 ± 0,26	71 ± 5	85,0 ± 2,5
CD86lg	CTLA4Ig	5,95 ± 0,57	8,16 ±0,52	13,9 ± 2,27
CD86lg	L104EIg	7,03 ± 0,22	4,26 ±0,11	6,06 ± 0,05
CD86lg	L104EA29YIg	6,42 ± 0,40	2,06 ± 0,03	3,21 ± 0,23
CD86lg	CTLA4Xci2os	16,5 ±0,5	840 ± 55	511 ± 17
CD86Ig	L1O4EA29YXCi2os	11,4 ± 1,6	300 ± 10	267 ± 29

75.665/BE

2. táblázat

A CTLA4Ig-ben a megadott helyeken végzett mutagenizálás hatása a CD86lg kötésre. A meghatározást SPR-rel végeztük, leírását lásd fentebb. A megnyilvánuló hatást „+ jellel jelöltük.

Mutagenezis helye Mutagenezis hatásai

	Nincs hatás	nyilvánvaló	Lassú „on” sebesség/lassú „off sebesség	Csökkent ligandum kötés
S25			+
P26		+
G27		+
K28		+
A29			+
T30			+
E31				+
R33				+
K93			+
L96			+
M97				+
Y98				+
P99				+
P100				+
P101				+
Y102				+
Y103			+
L104			+
G105			+
1106		+
G107		+
Qlll		+
Y113		+
1115		+

75.665/BE

Azok számára, akik ezen a szakterületen — ahová ez a találmány tartozik — jártasak nyilvánvaló, hogy ezt a találmányt a fentiekben közreadott formákon kívül másképpen is kivitelezhetik anélkül, hogy a találmány szellemétől és lényegi jellemzőitől eltérnének. A találmány fent leírt speciális kiviteli alakjai tehát úgy tekintendők, hogy a szemléltetést szolgálják, és nem korlátozó jellegűek. A találmány oltalmi köre inkább a csatolt igénypontokban jut kifejezésre és nem korlátozzák az előzőekben leírt példák.

75.665/BE

Claims (65)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. CTLA4 mutáns molekula, amely köti a CD80-at és/vagy a CD86-ot és, amely a CTLA4 extracelluláris dóménjét tartalmazza úgy, hogy az extracelluláris doménben (a) a +29 pozícióban lévő alanin egy, a tirozinból, leucinból, triptofánból és treoninból álló csoportból kiválasztott aminosavval van helyettesíve, és (b) a +104 pozícióban lévő leucin glutaminsavval van helyettesítve.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amely ezenkívül egy olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amely az oldható CTLA4 mutáns molekula oldhatóságát, affinitását és valenciáját megváltoztatja.
3. 3. A 2. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amelyben az aminosav-szekvencia egy humán immunglobulin konstans régiót tartalmaz.
4. 4. A 2. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amely egy olyan aminosav-szekvenciát is tartalmaz, amely lehetővé teszi az oldható CTLA4 mutáns molekula szekrécióját.
5. 5. A 4. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amelyben az aminosav-szekvencia egy onkosztatin M szignálpeptidet tartalmaz .
6. 6. Az 1. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amely a +1 pozícióban metionint és a +124 pozícióban aszparaginsavat tartalmaz, mint a 7. ábra mutatja.
7. 7. Az 1. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amely a -1 pozícióban alanint és a +124 pozícióban aszparaginsavat tartalmaz, mint a 7. ábra mutatja.

   75.665/BE
8. 8. A3, igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amelyben a humán immunglobulin konstans régiót úgy mutagenizáltuk, hogy a +130 pozícióban a cisztein szerinnel van helyettesítve, a +136 pozícióban a cisztein szerinnel van helyettesítve, a + 139 pozícióban a cisztein szerinnel van helyettesítve, és a + 148 pozícióban lévő prolin szerinnel van helyettesítve, mint a 7. ábra mutatj a.
9. 9. Oldható CTLA4 mutáns molekula, amely nagyobb aviditás— sál köti a CD80-at és/vagy a CD86-ot, mint a CTLA4, és a CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazza, ahol az extracelluláris domenben a +29 pozícióban az alanin tirozinnal es a 104 pozícióban a leucin glutaminsavval van helyettesítve, mint a 7. ábra mutatja.
10. 10. A 9. igénypont szerinti mutáns molekula, amely még ogy olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amely az oldható CTLA4 mutáns molekula oldhatóságát, affinitását vagy valenciáját megváltoztatja.
11. 11. A 10. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amelyben az aminosav-szekvencia egy humán immunglobulin konstans régiót tartalmaz.
12. 12. A 10. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amely még egy olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amely lehetővé teszi az oldható CTLA4 mutáns molekula szekrécióját.
13. 13. A 12. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amelyben az aminosav-szekvencia egy onkosztatin M szignálpeptidet tartalmaz.
14. 14. A 9. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amely

    75.665/BE metionint tartalmaz a +1 pozícióban és aszparaginsavat a +124 pozícióban, mint a 7. ábra mutatja.
15. 15. A 9. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amely alanint tartalmaz a -1 pozícióban és aszparaginsavat a +124 pozícióban, mint a 7. ábra mutatja.
16. 16. A 11. igénypont szerinti CTLA4 mutáns molekula, amelyben a humán immunglobulin konstans régiót úgy mutagenizáltuk, hogy a cisztein a +130 pozícióban szerinnel van helyettesítve, a cisztein a +136 pozícióban szerinnel van helyettesítve, a cisztein a +139 pozícióban szerinnel van helyettesítve, és a +148 pozícióban lévő prolin szerinnel van helyettesítve, mint a 7. ábra mutatja.
17. 17. Oldható CTLA4 mutáns molekula, amely nagyobb aviditással kötődik CD80-hoz és/vagy CD86-hoz, mint a CTLA4 és, amely egy CTLA4 extracelluláris domént tartalmaz, ahol az extracelluláris doménben a +104 pozícióban a leucin glutaminsavval van helyettesítve, mint a 8. ábra mutatja.
18. 18. Nukleinsav molekula, amely az 1. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulának megfelelő aminosav-szekvenciát kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmaz.
19. 19. Nukleinsav molekula, amely a 9. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulának megfelelő aminosav-szekvenciát kódoló nukleotid-szekvenciát tartalmaz.
20. 20. A 18. igénypont szerinti nukleinsav molekula, amelynek a nukleotid-szekvenciája adeninnel kezdődik a +1 nukleotid pozíciónál és adeninnel fejeződik be a +1071 pozíciónál, mint a 7. vagy a 8. ábra mutatja.

    75.665/BE
21. 21. A 19. igénypont szerinti nukleinsav molekula, amelynek a nukleotid-szekvenciája adeninnel kezdődik a +1 nukleotid pozíciónál és adeninnel fejeződik be a +1071 pozíciónál, mint a 7. vagy 8. ábra mutatja.
22. 22. A 18. igénypont szerinti nukleinsav molekula, amelynek a nukleotid-szekvenciája guanidinnel kezdődik -3-nál és adeninnel fejeződik be +1071-nél, mint a 7. vagy 8. ábra mutatja.
23. 23. A 19. igénypont szerinti nukleinsav molekula, amelynek nukleotid-szekvenciája guanidinnel kezdődik -3-nál és adeninnel fejeződik be +1071-nél, mint a 7. vagy 8. ábra mutatja.
24. 24. Vektor, amely a 18-23. igénypontok bármelyike szerinti nukleotid szekvenciát tartalmaz.
25. 25. Vektor, amely az L104EA29YIg-t kódolja, és pD16L104EA29YIg jelzéssel van letétbe helyezve az ATCC-nél ATCC PTA-2104 szám alatt.
26. 26. Gazda vektor rendszer, amely egy 24. vagy 25. igénypont szerinti vektort tartalmaz egy alkalmas gazdasejtben.
27. 27. A 26. igénypont szerinti gazda vektor rendszer, amelyben az alkalmas gazdasejt egy baktérium sejt vagy egy eukarióta sejt.
28. 28. Gazdasejt, amely a 24. vagy a 25. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
29. 29. A 28. igénypont szerinti gazdasejt, amely egy eukarióta sejt.
30. 30. A 29. igénypont szerinti gazdasejt, amely egy COS sejt.
31. 31. A 29. igénypont szerinti gazdasejt, amelyben az eukarióta sejt egy kínai hörcsög petefészek (Chinese Hamster Ovary = CHO) sejt.
32. 32. A 31. igénypont szerinti gazdasejt, amelyben a CHO sejt

    75.665/BE a DG44, CH0-K1 Tet-On sejtvonal, ECACC 85050302 jelű CHO, CHO klón 13, CHO klón B, CHO-K1/SF és RR-CHOK1 közül kiválasztott.
33. 33. Eljárás oldható CTLA4 mutáns protein előállítására, azzal jellemezve, hogy a 26. igénypont szerinti gazda vektor rendszert a CTLA4 mutáns proteinnek a gazdasejtben való termelődéséhez alkalmas körülmények között tenyésztjük, és az így termelt proteint elkülönítjük.
34. 34. Eljárás L104EA29YIg előállítására, azzal jellemezve, hogy a 28. igénypont szerinti gazda vektor rendszert az L104EA29YIg-nek a gazdasejtben való termelődéséhez alkalmas körülmények között tenyésztjük, és az így termelt proteint elkülönítjük.
35. 35. A 33. igénypont szerinti eljárással előállított oldható CTLA4 mutáns protein.
36. 36. A 34. igénypont szerinti eljárással előállított L104EA29YIg.
37. 37. Eljárás egy T sejtnek egy CD80 és/vagy CD86 pozitív sejttel való kölcsönhatásának szabályozására, azzal jellemezve, hogy egy CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtet az 1. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulával hozzuk össze úgy, hogy egy CTLA4 mutáns molekula/CD80 vagy egy CTLA4 mutáns molekula/CD86 komplex képződjék, amikoris a komplex zavarja a T sejt és a CD80 és/vagy CD86 pozitív sejt közötti kölcsönhatást.
38. 38. Eljárás egy T sejtnek egy CD80 és/vagy CD86 pozitív sejttel való kölcsönhatásának szabályozására, azzal jellemezve, hogy egy CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtet a 9. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulával hozzuk össze úgy, hogy egy

    75.665/BE

    CTLA4 mutáns molekula/CD80 vagy egy CTLA4 mutáns molekula/CD86 komplex képződjék, amikoris a komplex zavarja a T sejt és a CD80 és/vagy CD86 pozitív sejt közötti kölcsönhatást.
39. 39. A 37. igénypont szerinti eljárás, amelyben az oldható CTLA4 mutáns molekula egy olyan CTLA4 extracelluláris domént tartalmaz, ahol az extracelluláris doménben a +104 pozíciónál lévő leucin glutaminsavval van helyettesítve, mint a 8. ábra mutatja.
40. 40. A 37. igénypont szerinti eljárás, amelyben a CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtet az oldható CTLA4 mutáns molekula egy fragmentumával vagy egy származékával hozzuk össze.
41. 41. A 38. igénypont szerinti eljárás, amelyben a CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtet az oldható CTLA4 mutáns molekula egy fragmentumával vagy egy származékával hozzuk össze.
42. 42. A 37. igénypont szerinti eljárás, amelyben a CD80 és/vagy CD86 pozitív sejt egy antigén bemutató sejt.
43. 43. A 38. igénypont szerinti eljárás, amelyben a CD80 és/vagy CD86 pozitív sejt egy antigén bemutató sejt.
44. 44. A 37. igénypont szerinti eljárás, amelyben a CTLA4-pozitív T sejtek CD80 és CD86 pozitív sejtekkel való kölcsönhatása gátolt.
45. 45. A 38. igénypont szerinti eljárás, amelyben a CTLA4-pozitív T sejtek CD80 és CD86 pozitív sejtekkel való kölcsönhatása gátolt.
46. 46. Az 1. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekula alkalmazása CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtekkel reagáló T sejt által kiváltott olyan immunrendszeri betegségek kezelésére szol

    75.665/BE gáló gyógyszerkészítmény előállítására, amely szabályozza a T sejt kölcsönhatását CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtekkel .
47. 47. A 9. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekula alkalmazása CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtekkel reagáló T sejt által kiváltott olyan immunrendszeri betegségek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, amely szabályozza a T sejt kölcsönhatását CD80 és/vagy CD86 pozitív sejtekkel.
48. 48. A 46. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekula egy CTLA4 extracelluláris domént tartalmaz, és az extracelluláris doménben a +104 pozícióban lévő leucin glutaminsav van helyettesítve, mint a 8. ábra mutatja.
49. 49. A 46. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett T sejt kölcsönhatások gátoltak.
50. 50. A 47. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett T sejt kölcsönhatások gátoltak.
51. 51. Az 1. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekula és egy IL-4-gyel reagáló ligandum alkalmazása szövetátültetés utáni kilökődés (graft versus hopst disease) gátlására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
52. 52. A 9. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekula és egy IL-4-gyel reagáló ligandum alkalmazása szövetátültetés utáni kilökődés gátlására szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására .
53. 53. Az 51. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekula egy CTLA4 extracelluláris domént tartalmaz, és az extracelluláris doménben a +104 pozícióban lévő leucin glutaminsav van helyettesítve, mint a 8. ábra mutatja.

    75.665/BE ⁶⁸ 'h
54. 54. Oldható CTLA4 mutáns molekula, amelyet az ATCC PTA-2104 letéti számú nukleinsavmolekula kódol.
55. 55. DNS szekvencia, amely az L104EA29YIg-t kódolja, és letéti száma ATCC PTA-2104.

    56 Oldható CTLA4 mutáns molekula, amely a, 7. ábra szerinti aminosav-szekvenciát tartalmazza.
56. 57. Nukleinsavmolekula, amely az 56. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulát kódolja.
57. 58. Oldható CTLA4 mutáns molekula, amely nagyobb aviditással köti a CD86-ot, mint a vad típusú CTLA4,
58. 59. Oldható CTLA4 mutáns molekula, amely CD80-nal és/vagy CD86-tal létrejött kötéséből kisebb sebességgel disszociál, mint a vad típusú CTLA4.
59. 60. Oldható CTLA4 mutáns molekula, amely CD80-nal és/vagy CD86-tal létrejött kötődéséből kisebb sebességgel disszociál, és CD80-hoz és/vagy CD86-hoz kisebb sebességgel asszociál, mint a vad típusú CTLA4.
60. 61. Az ATCC PTA-2104 letéti számú nukleinsav molekula által kódolt oldható CTLA4 mutáns molekula egy része, amely rész a mutáns CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazza.
61. 62. A 61. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekula része, amely egy lg farkat is tartalmaz.
62. 63. Oldható CTLA4 mutáns molekulát kódoló és ATCC PTA-2104 letéti számú nukleinsav molekula része, amely rész a mutáns CTLA4 molekula extracelluláris dóménjének részét kódolja.
63. 64. A 63. igénypont szerinti nukleinsav molekula része, amely még egy lg farkat kódoló nukleinsav molekulát is tartal

    75.665/BE máz .
64. 65. Immunrendszeri betegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, amely az 1. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulát és egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyagot tartalmaz .
65. 66. Immunrendszeri betegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, amely a 9. igénypont szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulát és egy gyógyszerészetileg elfogadott vivőanyagot tartalmaz .

    A meghatalmazott:

    75.665/BE

    75.6§5/ΒΕ