JP4250365B2 - イメージ化法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多分析物アッセイを行うためのデバイスおよび装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、分析物の検出および特性化において、分子の組立て配列を使用することに広く興味が持たれている。例えば、ポリヌクレオチドの組立て配列が、ＤＮＡ配列決定法において、ならびに、患者の遺伝的変異を検出するためのハイブリダイゼーション研究において、現在では広く使用されている。
【０００３】
組立て配列は、固体支持体表面に固定化した高密度の同一または異なる分子を含むように設計することができる。これにより、使用者が、１つの実験操作において多くの結果を得ることが可能になる。また、この配列は、分析方法を自動化することができ、これにより試料の高処理量の達成を可能にするという利点をも有する。
【０００４】
通常、この配列は、固体支持体上の空間的に異なる領域に配置された、複数の個々の反応部位を有するように設計される。空間的に異なる領域に配列を作成するための最も普通の方法は、写真平板法によるものである。固体支持体を、光不安定性リンカーで、即ち、適当な波長の光を照射した後にのみ結合性リガンドに対して反応性になるリンカーで被覆する。空間的な分割は、固体支持体表面に物理的マスクを置くことによって達成する。このマスク中の穴のパターンが、固体支持体上の結合領域のパターンを決定する。
【０００５】
国際特許出願公開ＷＯ-Ａ-９５／１６２０４は、アビジンおよび光不安定性分子フォトビオチンを用いる写真平板法を記載している。空間的な分割は、受動吸着によって達成されている。例えば、米国特許ＵＳ-Ａ-５４３２０９９は、イオン相互作用、疎水性相互作用およびファンデアワールス力による、固体支持体表面への分子の結合を開示している。
【０００６】
組立て配列の１つの特定の例は、核酸が固定化された固体支持体材料に関する。通常、これらの配列は、空間的に異なる領域に固定化されたポリヌクレオチドの高密度マトリックスからなる。Fodorら[Trends in Biotechnology (1994) 12: 19-26]は、マスクにより保護されているが、規定した領域では適切に修飾したヌクレオチドホスホルアミダイトの結合が可能であるように曝露された、化学的に感作したガラス表面を用いて、核酸を組立てる方法を記載している。Stimpsonら[PNAS (1995) 92: 6379-6383]は、固体支持体上の予め決めた位置に既知のポリヌクレオチドを「スポッティング」する方法による組立て配列の製造を記載している。
【０００７】
配列法を用いて試料処理量および潜在能力を最大にするためには、配列の反応部位からのシグナル処理を完全自動化することが必須である。従って、手による操作を介在させることなく、配列のイメージ化、さらに該イメージの数学的処理を行うことが必要である。完全自動化の系で経験される困難は、それぞれの反応部位を正確に位置決定するのが時には困難になることである。これは、配列がそれぞれのデバイスにおいて同じ位置に正確に存在していることができないという、配列製造方法の性質によるものであろう。また、この問題は、アッセイ操作において必要な洗浄工程中に引き起こされることがある、装置中のデバイスのわずかな移動によるものであろう。それぞれ異なる反応部位は、わずか１０〜５０μｍの距離でしか離れていないことがあるので、自動化の系が各反応部位を正確に配置するのを確実にするのは困難である。例えば、配列の移動は、各反応部位間の距離と同程度であることがある。このことは、分析すべき各反応部位のためのイメージ中の予め決めた窓を容易に使用することができないことを意味する。これは、移動により、反応部位の境界を規定する検査窓の内側に、間違った反応部位が入ってくるであろうためである。また、反応部位が窓から外れることもあり、恐らくは２つの部位が同じ窓に入ることもある。処理をより容易にするためには、１つの反応部位だけが、それぞれの分析物検査窓内全体に入るのを確実にすることが必要である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、それぞれ離れた反応部位を配列上に正確に配置する改良法が必要とされている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列への個々の反応部位の正確な配置を、各配列への参照分子の導入によって行いうるという認識に基づくものである。
【００１０】
本発明の第１の態様によれば、固体支持体の表面における、別個の反応部位の配列中に含まれる分子をイメージするための方法であって、以下の工程を含んでなる方法が提供される：
(ｉ)配列をイメージし、配列に対して既知の位置において固体支持体上に配置された第１分子を検出し；
(ii)該第１分子を参照して、該別個の反応部位に合致させて検査窓を整列させ；そして
(iii)それぞれの窓における検出可能シグナルの量を測定する。
【００１１】
この方法は、検査窓の正確な配置を可能にし、これにより、通常の自動化した系に改善を与える。
【００１２】
第１分子は、配列に対して固体支持体上の既知の位置にあるので、検査窓を、配列した反応部位に合致するように整列させることができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、配列させた分子を正確にイメージ化するために通常の装置を使用する。通常のイメージ化装置を用いて、固体支持体または「バイオチップ」を、例えば、光学顕微鏡または電荷と組合せたデバイスによりイメージ化する。このイメージを、カメラ電子工学によって１ピクセル(画素)あたり１６ビットで、例えば５１２×５１２ピクセルにデジタル化し、処理のために分析機を含むコンピューターに移す。バイオチップ上にそれぞれの反応部位を正確に配置するために、参照分子(または第１分子)を最初に配置し、分析物検査窓の配列を、参照分子に対して確立する(図１)。次いで、配置された検査窓を用いて、バイオチップ上の反応部位または「分析物スポット」を見つける。
【００１４】
「検査窓」なる用語は、本明細書においては、検出可能なシグナルをイメージ化するために使用するピクセルの２次元配列を包含する規定された境界を意味するように使用する。
【００１５】
また、参照分子を、チップ上の品質管理チェックとして使用することもでき、これにより、検出可能シグナルの強度が、例えばバイオチップの製造が原因で、予め規定した範囲を外れたときに、このバイオチップの結果を拒絶することができる。
【００１６】
参照分子は、それぞれのバイオチップ上の予め規定した位置に配置すべきである。例えば、参照分子を、バイオチップの１またはそれ以上のコーナーに配置することができる。従って、１またはそれ以上の検査窓を、予想される参照分子の位置に対応して、固定位置に規定することができる。製造時の許容性は、参照分子が、反応部位または分析物検査窓よりも若干大きい検索検査窓の中に入ればよいというものであり、配列からの１またはそれ以上の反応部位が、参照分子検査窓の内側に入っていてもよい。他の反応部位を無視して検査窓中のそれぞれの参照分子だけを見つけるために使用する検索法は、参照分子を最初に発見することを確実にするように選択しなければならない。例えば、参照分子が各バイオチップの最上部左端のコーナーに配置されているときには、検査窓の最上部左端のコーナーから出発する対角線検索は、参照分子に最初に遭遇し、従って、それを正確に同定することが可能であろう(図２)。他の参照の配置のためには、検索法をそれに応じて調節することができる。通常のソフトウエアーを用いて検索を行って、固体支持体を横切って検索検査窓を移動させ、参照分子の位置決定を行い、それに合致させることができる。
【００１７】
参照分子の位置が同定されたなら、分析物検査窓を、それに対して配置することができる(図３において５で示す)。この配置は、既知の位置に配置した第２の参照分子を使用することによって、あるいは、第１の参照分子が反応部位の配列に対して固定位置で配置されているという知識によって助けられる。参照分子の位置決定は、配列の各反応部位の位置が決定されることを可能にする。
【００１８】
好ましい態様においては、バイオチップは２つの参照分子を含んでなる。２つの参照分子が含まれているときには、さらなる利点が得られる。即ち、それぞれの座標が決定されたときには、検査窓の整列のために調整を行うことができる。これは、図４および図５に最も明瞭に示されている。第２の参照分子が、第１の参照分子およびその予想される位置に対して変化している程度を算出し、それを用いてバイオチップの回転または誤整列の程度を決定することができる。これにより、分析物検査窓のさらに正確な配置が可能になる。図４において、６は、参照分子検査窓内で行われる検索の方向を示す。
【００１９】
バイオチップ上の参照分子の座標を用いて、分析すべき分子を含む別個の反応部位のための検査窓を配置する。シグナルの処理により、検出可能シグナルの量が決定され、これにより、該部位の反応のレベルが決定される。処理は、通常の方法[共焦点の顕微鏡または電荷と組合せたデバイス(ＣＣＤ)]を用いて行うことができる。好ましい態様においては、バイオチップデバイスを、電荷と組合せたデバイスを含む系において使用して、配列を目に見えるようにする。
【００２０】
イメージは、次のように処理する。イメージ化デバイスを用いてイメージを生成させ、これをプロセッサーにコピーする。次いで、これにいくつかの通常の形態を滑らかにする操作を行って、滑らかに変化する背景イメージを生成させることができる。次いで、これを最初のイメージから差し引いて、背景補正されたイメージを得る。このイメージデータに通常の限界値化操作を行って、二元イメージを生成させることができる。これは、イメージを、限界値を超える領域については白に、そして、限界値を下回る領域については黒に区分することによって行う(この際に、限界値を適切なレベルで選択して、参照分子を見い出す)。
【００２１】
区分した参照分子は、別個の隣接した「小塊(blob)」を形成すべきである。「小塊」分析(これは、上記のような別個の区分された領域の処理を記述するのに通常使用される用語である)を用いて、予め規定した検査窓内の参照分子の部分を構成するピクセルを見つける。通常、「小塊」分析は、輪郭追跡オペレーターを用いて、区分した領域の輪郭を追跡するので、閉じられた境界が形成される。デジタルイメージ処理または輪郭追跡に共通するのは、連鎖コードまたはFreemanコードである(１９６１年から使用されている)。このコードおよびその修正版を用いて、区分された対象の周囲長さおよびサイズを算出することができ、このようなパラメーターを用いて、区分した小塊のサイズおよび形状が参照分子の予想限界の範囲内にあることを確認することができる。この「小塊」が小さすぎるか、大きすぎるか、または不適切な形状(例えば、長さと高さの比、または円形性)であるときには、これを拒絶することができる。これにより、宇宙線人工物、バイオチップ壁からの迷反射、窓中に侵入する他の分析物スポットの部分などを無視することが可能になる。
【００２２】
「小塊」分析を用いる市販のプログラムには、National InstrumentsからのIMAQ Vision SoftwareおよびStemmer ImagingからのCVCが含まれる。他のプログラム(例えば、Data Translation Ltd.からのNeurocheck 4.2)は異なる用語を使用するが(小塊よりもむしろ目的の領域に言及する)、種々の検索法によって見い出された領域の測定のために、ピクセルデータに本質的に同じ操作を行う。
【００２３】
バイオチップ分析物配列のコーナーまたはその近くに配置された参照分子のために、二元化された参照検査窓の対角線検索(参照分子が最初に見い出されるのを確実にするのに適切な方向で行う)を用いて、対角線に沿って限界値を超える最初のピクセルの位置決定を行い、他の限界値を超えるピクセルに対する関連性を、このピクセルの周辺において決定することができる。それが、十分な数の他の限界値を超えるピクセルに直接的に関連しているときには、それは、参照分子の境界部分を構成するものとみなすことができる。検索を続けて、境界部分を構成する全ての限界値を超えるピクセルの位置決定を行い、連鎖コードを用いて境界を閉じる。この際に、最初の境界ピクセルから始めてそこで終わり、こうして、参照分子を構成するピクセルだけを同定する。
【００２４】
次いで、閉じられた境界上にまたはその中に入ることがわかったピクセルは、それぞれの参照窓について算出された中心位置を持つことができ、次いで、これらの中心位置を用いて、分析物検査窓の位置を規定することができる。分析物検査窓の位置が決定されたときには、これらの中のイメージデータを同じように分析して、配列された分子の別個の領域(反応部位)を決定する別個の試験反応部位(ＤＴＲ)のそれぞれを構成するピクセルを決定することができる。次いで、これらの反応部位区分された「小塊」のそれぞれに対する背景補正したイメージ強度をさらに処理して、これらの位置のそれぞれにおけるシグナル、従って、それぞれの反応部位で起こった生化学反応の程度を算出することができる。
【００２５】
通常、各反応部位に対して同定したピクセルのシグナルを算出するために、各部位の最大強度を見つけ、次いで、経験的に決めた範囲(例えば、各最大値の２０％以下)内の強度を有する全てのピクセルを用いて、シグナルを測定する。このようなシグナル測定は、それぞれの反応部位に対する、先の限界値の範囲内にある全ピクセル強度の単純合計、または恐らくはその平均になるであろう。好ましいイメージ化法の例は、欧州特許出願公開ＥＰ-Ａ-０９０２３９４に開示されている(この文献の内容は、本明細書の一部を構成する)。
【００２６】
別個の反応部位の配列は、常に規則的なパターンで整列している訳ではないであろう。ありうる誤整列を補正するために、参照分子が位置決定されたときに、全ての可能な反応部位が１つの窓の中に配置されるように(図６の７を参照)、分析物検査窓を整列させるのが好ましいであろう。「小塊」分析を用いるイメージ化は、反応部位の閉じられた輪郭を明らかにし、個々の検査窓を各反応部位に対して整列させることを可能にし、これにより、次に中心位置を算出することができる。
【００２７】
別の態様においては、異なるバイオチップ中の参照分子の相対座標を用いて、回転または誤整列の程度を算出することができる。このことは、図７において最も簡単に示されている。この図においては、複数のバイオチップが単一のラックに配置されている。それぞれの参照分子の互いに対する位置および参照分子の１つから予想される整列の算出により、回転の程度を算出することが可能になる。次いで、検査窓を、それぞれの反応部位と正確に合致するように整列させることができる。
【００２８】
本発明のデバイスにおいて使用する固体支持体材料は、例えば、シリコン、プラスチック、膜形成材料、石英、ガラスまたはセラミック材料(酸化アルミニウム)であってよい。蛍光および化学発光の両検出方法を成功裏に使用することができるので、セラミック材料がシリコンの優れた代替物を与える。
【００２９】
本発明において使用する固体支持体材料は、１ｃｍ^２未満であってよい。固定化分子の別個の領域は、２００μｍ未満、好ましくは１００μｍ未満、最も好ましくは１０〜１５μｍで離れていてよい。
【００３０】
本発明において使用することができる好ましいデバイスは、英国特許出願公開ＧＢ-Ａ-２３２４８６６に記載されている(この文献の内容は、本明細書の一部を構成する)。
【００３１】
本発明において使用する分子は、常法により材料表面に固定化することができる。共有結合による固定化が好ましい。受動吸着を使用することもできるが、この形態の固定化は、ｐＨ、温度およびイオン強度の変化に感受性であり、ある種の場合には、インキュベーションおよび洗浄工程中に弱く結合した分子が遊離する結果になることがあり、従って再現性に劣る。勿論、これら分子は、固定化操作の後に最大活性を保持しているのが望ましい。
【００３２】
分子の共有結合による固定化は、常法を用いて、通常は、規定の条件下で活性化することができる化学的反応性のリンカー分子を用いて行うことができる。適当なリンカー分子の例は、ＧＢ-Ａ-２３２４８６６に記載されている。
【００３３】
固体支持体材料に固定化する分子は、分析物アッセイにおいて使用するのに適するあらゆる分子であってよい。例えば、配列させる分子は、ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその官能性類似体であってよい。また、タンパク質およびペプチド、例えば、酵素、抗体、受容体またはホルモンを使用することもできる。さらに、これら分子は、ウイルスまたは有機化合物であってもよい。
【００３４】
参照分子を、種々の方法によって、例えば、測色法、化学発光法、蛍光法または生発光法によって可視化することができる。従って、分子は、検出可能シグナルの生成が可能であるかまたはそれを容易にすることができるあらゆる分子であってよい。１つの態様においては、この分子は蛍光ラベルであり、これをデバイスに結合させる。
【００３５】
適当な蛍光ラベルは、当業者には既知であろう。その例には、ローダミン、ＣＹ-５、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートおよびオレゴングリーンが含まれる。
【００３６】
蛍光ラベルは、化学的手段を用いて固体支持体に直接的に結合させることができる。また、蛍光ラベルを、固定化されたリンカー分子(例えば、タンパク質または抗体分子)により、あるいは、相補性ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、間接的に結合させることができる。さらに、ラベルされたポリヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションを必要とすることなく使用することもできる。
【００３７】
別法によれば、分子は、リガンドと相互作用して検出可能シグナルを生成することができる生物学的分子であってもよい。適当な生物学的分子の例は、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼまたはβ-ガラクトシダーゼ)である。これら酵素のそれぞれは、検出可能シグナルを生成する生物学的反応に関与することができる。別の態様においては、抗体を参照分子として使用することができ、使用時にこの抗体は、自体検出可能なリガンドに結合する。例えば、抗体は、化学発光過程を経て検出可能シグナルを生成することができる酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼに対して親和性を有することができる。好ましくは、参照分子は、固体支持体上の配列分子と接触することになる分析物とは反応しない。さらに、参照分子は、固体支持体上で行われる他の分析物反応とは無関係に、常に検出可能であるべきである。従って、参照分子は、分析物アッセイにおいて反応する分子とは独立して選択するのが好ましい。
【００３８】
本発明の方法は、適切にプログラムされたコンピューターによって制御された自動化手段によって行うのが好ましい。
【００３９】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明する。
この実験において、一連の９ｍｍ^２の多分析物バイオチップ(ラック中の３×３グリッドに保持される)を、有標の堆積装置を用いて、５×５グリッドのバイオチップあたり１９の独立した位置に１９の抗体スポットを堆積させることによって調製した。このバイオチップを、堆積後に３７℃でインキュベートして、バイオチップ表面への抗体の共有結合を確実にした。次いで、このバイオチップを、ブロック溶液中に浸漬した。このブロック溶液は、バイオチップのスポットのない領域に結合し、従って、抗体スポットの外側の領域への非特異的な結合を妨げる(ＤＴＲ)。
【００４０】
各バイオチップにおいて使用した分析物スポットのグリッドは、以下に示すようであった(表示した短縮形は、後記で説明する)：
【表１】

【００４１】
最上部左端のコーナーに配置した参照分子は、ＦＩＴＣであった。これは、周知の発光物質であり、発光量が予め規定した範囲内にあるように、既知の濃度まで希釈した。カメラ発光量を、相対的な光単位(ＲＬＵ)で測定した。参照分子のＲＬＵ値が、指定範囲の外にある場合には、処理に誤りがあると考えられたので、このバイオチップを拒絶した。また、ＦＩＴＣのさらに４つのスポット(ＦＩＴＣ １〜４)を含有させて、さらなる参照分子として働くようにした(以下においては、これらを「補正スポット」と称する)。
【００４２】
使用した短縮形は、次の通りである。
【表２】

【００４３】
９つの異なる患者試料を、１つのバイオチップウエルあたり１つで添加し、処理して、分析用のイメージを得た。参照分子が、それぞれのバイオチップ上の予め規定した参照分子検索窓内に見い出され、ＲＬＵ値、面積(ピクセルの数)およびＸ/Ｙアスペクト比の予め規定した基準に対してスクリーニングした。全ての参照分子が、予め規定したＲＬＵ限界値の範囲内にあった。
【００４４】
小さな角度のイメージの回転が明らかであった。適切な予め規定した窓内に見い出された各バイオチップ上の参照分子を用いて、分析物の窓をＤＴＲで自動的に整列させ、イメージ化を行った。
【００４５】
初めに形態的な処理(一連のイメージの開放および閉鎖操作による)を行うことによって、イメージを自動的に処理して、粗イメージから背景イメージを算出した。次いで、この算出した背景イメージを、粗イメージから差し引いて、背景-差し引きイメージを得た。これにより、背景の変動によるシグナルレベルのあらゆる変動が除去される。最後に、一連の限界値を、背景-差し引きイメージに対して使用して、どのピクセルがそれぞれの限界値を超えているかを明らかにし、興味ある存在物の位置決定を可能にした。最も高い限界値を最初に試験し、種々の「小塊」分析法によって隣接(別個)の対象を見つけた。測定可能なＤＴＲの全て(即ち、ＣＣＤカメラのノイズレベル変動に従って設定した、最も低い限界値を超えるもの)が同定されるまで、限界値を徐々に低下させた。それぞれの存在物の図心を算出して、該存在物の位置マーカーとして使用した。
【００４６】
全ての検出された存在物のＲＬＵ値を、常法に従って算出した。各存在物の境界内のピーク光レベルを見つけ、次いで、限界値を、各存在物についてピークピクセルＲＬＵ値の２０％下に設定した。この限界値(存在物ピークＲＬＵの２０％下)を超える存在物のピクセルだけを、該存在物の平均ＲＬＵ値を後に算出する際に使用した。このバイオチップのイメージを図８に示す。
【００４７】
それぞれの整列させた分析物窓をチェックして、存在物の図心が、その境界内にあることを確実にした。そのようであるとき、該存在物を、該窓に割り当てられた分析物種に指名した。即ち、各存在物は、１つの分析物種であると同定された。次いで、９つのバイオチップ上の補正スポットを、参照スポットと同じ基準に対してスクリーニングし、全ての補正スポットが、予め決めた限界値内のＲＬＵ値を有することを見い出し、これにより、各チップが、処理に対して許容しうる品質のものであると称することが可能になった。次いで、それぞれの整列させた分析物窓の中の同定された存在物の平均ＲＬＵ値を、それぞれの処理されたバイオチップのために表示させた。
【００４８】
ラックの最上部左端の第１バイオチップの結果を、以下の表３に示す。
【表３】

【００４９】
これらのＲＬＵ値を、分析物濃度の関数として、測定した発光量曲線に対して比較して、各分析物の濃度を決定することができる。次いで、各分析物の限界濃度に関する工業規格を、決定した濃度に適用して、適当なときに陽性または陰性の結果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 参照分子検索窓(１)中にイメージされた各バイオチップ(２)を有する、バイオチップ配列の模式図である。
【図２】 参照分子(３)および分析物反応部位の配列(４)を有する個々のバイオチップ(２)の模式図である。
【図３】 分析物反応部位(４)と合致させた分析物検査窓(５)の整列を示す図である。
【図４】 反応部位と正確に合致するように検査窓(５)を配置するために使用することができる２つの参照分子(３)を有するバイオチップの模式図である。
【図５】 反応部位と正確に合致するように検査窓(５)を配置するために使用することができる２つの参照分子(３)を有するバイオチップの模式図である。
【図６】 参照分子検索窓中の参照分子の対角線検索を示す図である。
【図７】 各バイオチップ上の単一の参照分子を用いて算出したラックの回転度を有する、１つのラックにおいて整列させたいくつかのバイオチップを示す図である。
【図８】 参照分子を用いて検査窓を整列させた後、種々の分析物のアッセイにおいて得られたイメージを示す図である。

Claims (16)

1. 固体支持体の表面における、別個の反応部位の配列のデジタル化イメージ中に含まれる分子の位置を決定するための方法であって、以下の工程を含んでなる方法：
   (ｉ)配列をイメージし、イメージをデジタル化し；
   (ii)配列に対して既知の位置において固体支持体上に配置された第１分子を検出し；
   (iii)該第１分子を参照して、該別個の反応部位に合致させて、それぞれが２次元のピクセル配列を包含する検査窓を確立および整列させ；そして
   (iv)それぞれの検査窓における検出可能シグナルの量を決定する。
2. 第１分子の検出を、該第１分子を含む支持体の領域内に第１検査窓を整列させ、該窓内で該第１分子のイメージを検索することによって行う請求項１に記載の方法。
3. 第１検査窓が２次元のピクセル配列を規定し、検索が、該ピクセル配列の対角線走査およびピクセルの値の測定によって行われる請求項２に記載の方法。
4. 第１分子の検出後に、第１検査窓を再配置するかまたは大きくして、１またはそれ以上の別個の反応部位も該窓内に位置するようにし、該１またはそれ以上の部位を検出し、該第１分子および該１またはそれ以上の部位を参照して、配列の各反応部位に合致するように更なる検査窓を整列させる請求項２または３に記載の方法。
5. 反応部位の配列が、第１分子が配置されているコーナーを規定する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 第１分子に加えて、配列に対して既知の位置において固体支持体上に配置された第２分子を検出する工程、および、第１および第２の両分子を参照して検査窓を整列させる工程、を含んでなる請求項１に記載の方法。
7. イメージ化を、放射の検出によって行う請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 放射が、化学発光、生発光または蛍光である請求項７に記載の方法。
9. 配列の分子が、分析物と反応しうるものである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 配列の分子が、ポリヌクレオチド、抗体、タンパク質または有機化合物である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 固体支持体が、１ｃｍ^２未満である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 固体支持体が、セラミック、シリコンまたはガラス材料である請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 配列の分子が、固体支持体の表面に共有結合している請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 工程(ｉ)において得られるイメージが、工程(ii)および(iii)を進めるために、予め規定した値を超えるものでなければならない請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 請求項１〜１４のいずれかに記載の方法を行うためにプログラムされたコンピューター。
16. 請求項１５に記載のコンピューターによって制御されるイメージ化デバイス。

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