JP3768165B2

JP3768165B2 - 抗カルパスタチン抗体の測定法及び測定キット

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Publication number: JP3768165B2
Application number: JP2002055051A
Authority: JP
Inventors: 博明松野; 泰裕渡辺; 祥子江川; 匡輔宮崎
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2006-04-19
Anticipated expiration: 2022-02-28
Also published as: JP2003254966A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗カルパスタチン抗体の測定方法及び測定キットに関する。また本発明は、疾患の検出方法及び検出キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
カルパインはカルシウム依存性システインプロテアーゼの一種であり、慢性関節リウマチ（以下、単に「ＲＡ」という）の軟骨破壊に関与する酵素の一つと考えられている。一方、カルパスタチンはカルパインの特異的な内在性インヒビターである。
【０００３】
カルパインが組織破壊に関与するプロテアーゼの一種であることからすると、かかるプロテアーゼのインヒビターであるカルパスタチンに対する自己抗体（抗カルパスタチン抗体）が、リウマチ疾患、特にＲＡの発症や炎症の進展に関与している可能性がある。よって抗カルパスタチン抗体の測定は、ＲＡの検出や病態の把握等に有用であると考えられる。
【０００４】
British Journal of Rheumatology, 37, p1164-1171 (1998)及びRheumatology, 40, p1126-1134 (2001)には、血清中の抗カルパスタチン抗体を、カルパスタチンのＣ末端側２７アミノ酸(SSKAPKNGGKAKDSAKTTEETSKPKDD)に対応する合成ペプチド又は精製したカルパスタチンが固着された固相を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した旨が記載されている。しかし、関節液中の抗カルパスタチン抗体の測定については記載も示唆もない。
【０００５】
カルパインはＲＡの滑膜細胞や関節液中で増加すること等が知られていることから、関節液中の抗カルパスタチン抗体を測定することで、より正確なＲＡの検出や病態把握ができる可能性がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
関節液中の抗カルパスタチン抗体を、より高感度、特異的かつ正確に、定量性良く、かつ簡便に測定できる方法やキットが提供できれば、関節液中の抗カルパスタチン抗体の極めて実用性が高い測定方法が提供され、リウマチ疾患等の高感度な検出や病態把握が極めて容易となる可能性がある。
【０００７】
すなわち本発明は、関節液中の抗カルパスタチン抗体の極めて実用的な測定方法及び測定キット並びに疾患の検出方法及び検出キットを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、関節液中の抗カルパスタチン抗体をＥＬＩＳＡ法で測定する場合に、汎用されているカルパスタチンの部分ペプチドを固着させた固相を用いるのではなく、全長のポリペプチドを固着させた固相を用いることによって、より高感度、特異的かつ正確に、再現性・定量性良く、かつ簡便に測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、関節液中の抗カルパスタチン抗体の定量方法（以下、「本発明測定方法」という）を提供する。
工程(A)：カルパスタチンが固着された固相に関節液を接触させる工程。
工程(B)：固相に固着されたカルパスタチンに結合した抗カルパスタチン抗体量を検出する工程。
【００１０】
ここで、抗カルパスタチン抗体量の検出は、当該抗体に結合能を有する抗イムノグロブリン抗体を用いて行われることが好ましい。また、この抗イムノグロブリン抗体は、標識されているものが好ましい。
【００１１】
また本発明は、関節液中の抗カルパスタチン抗体を定量し、その定量結果と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の程度の検出方法（以下、「本発明検出方法」という）を提供する。関節液中の抗カルパスタチン抗体の定量は、本発明測定方法によって行われることが好ましい。また検出対象となる疾患はリウマチ疾患であることが好ましく、なかでもＲＡであることが好ましい。
【００１２】
また本発明は、下記構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、関節液中の抗カルパスタチン抗体の定量キット（以下、「本発明測定キット」という）を提供する。
(A)カルパスタチンが固着された固相。
(B)抗カルパスタチン抗体に結合能を有する抗イムノグロブリン抗体。
ここで、抗イムノグロブリン抗体は、標識されているものが好ましい。
【００１３】
さらに本発明は、本発明測定キットの構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、疾患の程度の検出キット（以下、「本発明検出キット」という）を提供する。検出対象となる疾患はリウマチ疾患であることが好ましく、なかでもＲＡであることが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
まず、本発明測定方法、本発明検出方法、本発明測定キット及び本発明検出キットを通じて共通する事項について説明する。
【００１５】
本発明で用いる「カルパスタチン」は、カルパスタチンの一部のアミノ酸配列からなるペプチド（いわゆる部分ペプチド）ではなく、天然に存在するカルパスタチンの全アミノ酸配列を有するポリペプチドである。本明細書において単に「カルパスタチン」と表記した場合には、「天然に存在するカルパスタチンの全アミノ酸配列を有するポリペプチド」を意味するものであり、その一部のアミノ酸配列からなるペプチドは包含しない趣旨である。
【００１６】
本発明で用いる「カルパスタチン」の製造方法は、最終的に「天然に存在するカルパスタチンの全アミノ酸配列を有するポリペプチド」が取得できる限りにおいて特に限定されない。例えば、カルパスタチンを含有する天然物から単離・精製することによって製造してもよく、カルパスタチンをコードするＤＮＡ等を用いた遺伝子工学的手法によって製造してもよく、化学合成的手法によって製造してもよい。本発明で用いるカルパスタチンは、これらいずれの製造方法で取得されたものであってもよい。このようなカルパスタチンは、市販されているものを用いることもできる。
【００１７】
なお、カルパスタチンは動物種によってそのアミノ酸配列が少しずつ異なっているが、本発明で用いるカルパスタチンは、測定対象たる抗カルパスタチン抗体（これを含有する関節液）が由来する動物種と同一の動物種のものを選択することが好ましい。例えば、ヒトの関節液中の抗カルパスタチン抗体の測定を意図する場合には、ヒトのカルパスタチンを用いることが好ましい。
【００１８】
本発明の最大の特徴は、「カルパスタチン」として、その一部のアミノ酸配列からなるペプチドを用いるのではなく「天然に存在するカルパスタチンの全アミノ酸配列を有するポリペプチド」を用いる点にあり、これにより関節液中の抗カルパスタチン抗体を高感度かつ定量性良く測定することができる。
【００１９】
＜１＞本発明測定方法
本発明測定方法は、下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、関節液中の抗カルパスタチン抗体の定量方法である。
工程(A)：カルパスタチンが固着された固相に関節液を接触させる工程。
工程(B)：固相に固着されたカルパスタチンに結合した抗カルパスタチン抗体量を検出する工程。
【００２０】
工程(A)で用いる「カルパスタチンが固着された固相」とは、カルパスタチンが、通常のＥＬＩＳＡ法におけるプロセス（ブロッキング、抗原抗体反応、洗浄、酵素反応、発色反応及び測定等）を通じて遊離しない程度に結合している固相を意味する。すなわち本明細書において「固着」とは、通常のＥＬＩＳＡ法におけるプロセスを通じて遊離しない程度に結合することをいう。
【００２１】
工程(A)で用いることができる「固相」は、カルパスタチンが固着可能な水不溶性の固相である限りにおいて、その形状や材質等も限定されない。
【００２２】
工程(A)で用いることができる固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウェル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、ラテックス等を例示することができる。同様に固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
【００２３】
これらの固相にカルパスタチンを固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
【００２４】
物理的吸着法として具体的には、例えば次の方法が挙げられ、かつ好ましい；カルパスタチン抗体を、ｐＨ７〜９程度の緩衝液(例えばホウ酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩液(ＰＢＳ)、炭酸緩衝液等)に溶解して固相と接触させ、４℃で一晩静置して固着させる方法。なお、この後に固相の表面を洗浄液で洗浄してもよい。洗浄液としては緩衝液(例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＢＳ等)等を用いることができる。
【００２５】
なお、この後にブロッキング物質を固相に接触させて、カルパスタチンが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、カゼイン、スキムミルク等が例示される。これらは単独の成分で用いてもよく、２種以上の成分として用いてもよい。なお、ブロッキング物質として市販されているものを使用してもよい。
【００２６】
この後に、固相の表面を洗浄液で洗浄してもよい。洗浄液としては緩衝液(例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＢＳ等)等を用いることができる。
以上により、「カルパスタチンが固着された固相」を製造することができる。
工程(A)は、このようにして製造された固相に、関節液を接触させる工程からなる。
【００２７】
「関節液」は、測定対象となる抗カルパスタチン抗体が含有されているか、又は含有されている可能性があるものであればよい。また、関節液は単離・精製等の処理が施されている必要もない。すなわち本発明測定方法によれば、関節液中に抗カルパスタチン抗体以外の各種蛋白質成分等が含有されていても、測定対象たる抗カルパスタチン抗体を特異的に測定することができる。
【００２８】
前記固相（カルパスタチンが固着された固相）に関節液を接触させると、関節液中の抗カルパスタチン抗体が、固相に固着されたカルパスタチンに結合する。
【００２９】
「カルパスタチンが固着された固相」と「関節液」とを接触させる方法は、当該固相に固着されたカルパスタチン分子と関節液中の抗カルパスタチン抗体分子とが接触する状態となる限りにおいて限定されない。両者を接触させる方法として具体的には、固相に関節液を添加する方法、関節液に固相を添加する方法、別体の容器に両者を同時に添加する方法等が例示されるが、これらに限定されるものではなく、固相の形状や材質等に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００３０】
これら両者を接触させた後、十分に抗原抗体反応させるためにインキュベートすることが好ましい。インキュベートの温度は、抗原抗体反応が起こる温度である限りにおいて特に限定されず、室温が例示される。インキュベートの時間は、前記両者が十分に反応する限りにおいて特に限定されないが、０．５時間〜２時間程度、より好ましくは１〜１．５時間程度を例示することができる。
【００３１】
また反応後、固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄は、固相に固着したカルパスタチン及びこれに結合した抗カルパスタチン抗体が遊離しない条件下で行われる。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween)系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液(例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＢＳ等)を用いることが好ましい。
【００３２】
以上の工程(A)を経た後、工程(B)に移行する。
【００３３】
工程(B)は、固相に固着されたカルパスタチンに結合した抗カルパスタチン抗体量を検出する工程である。
本発明測定方法は、固相に固着されているカルパスタチンと関節液中の抗カルパスタチン抗体との抗原抗体反応を利用しており、固相に固着されたカルパスタチンに結合した抗カルパスタチン抗体量を検出することによって、関節液中の抗カルパスタチン抗体を定量することができる。
【００３４】
すなわち、固相に固着されたカルパスタチンに結合した抗カルパスタチン抗体の検出量が多ければ、関節液中の抗カルパスタチン抗体量は多いと判定される。逆に、固相に固着されたカルパスタチンに結合した抗カルパスタチン抗体の検出量が少なければ、関節液中の抗カルパスタチン抗体量は少ないと判定される。
【００３５】
固相に固着された「カルパスタチン」に結合した抗カルパスタチン抗体の検出は、例えば、抗カルパスタチン抗体に結合能を有する抗イムノグロブリン抗体を用いることができる。この「抗イムノグロブリン抗体」が結合するイムノグロブリンのクラスは特に限定されないが、ＩｇＧが好ましい。すなわち「抗イムノグロブリン抗体」としては、「抗ＩｇＧ抗体」が好ましい。
【００３６】
なお、イムノグロブリンは動物種によってそのアミノ酸配列が少しずつ異なっており、これに対応して種々の抗イムノグロブリン抗体が存在するが、本発明で用いる抗イムノグロブリン抗体は、測定対象たる抗カルパスタチン抗体（これを含有する関節液）が由来する動物種と同一の動物種のイムノグロブリンに対する抗体を選択することが好ましい。例えば、ヒトの関節液中の抗カルパスタチン抗体の測定を意図する場合には、ヒトのイムノグロブリンに対する抗体を用いることが好ましく、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いることがより好ましい。
【００３７】
種々の動物に対する各種抗イムノグロブリン抗体は、当業者が適宜調製することもでき、市販されているものを用いることもできる。
この抗イムノグロブリン抗体は、検出を容易にするため、標識物質で標識されていることから好ましい。
【００３８】
抗イムノグロブリン抗体の標識に使用される標識物質としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等）、蛍光色素（ルミノール、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)など）、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位元素等が挙げられるが、蛋白質の標識に可能なものであれば特に限定されない。標識方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法等（「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人、1987年発行参照）から適宜選択することができる。また標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのヒドラジド誘導体を用いる方法(Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook, p57-63, PIERCE CHEMICAL COMPANY, 1994年発行参照)、またフルオレセインイソチオシアネートを使用する場合は特公昭63-17843号公報記載の方法等から適宜選択できる。
【００３９】
以上のような「抗カルパスタチン抗体に対して結合能を有する物質」を、抗カルパスタチン抗体がカルパスタチンを介して固着した固相に接触させることによって、当該物質と抗カルパスタチン抗体とを結合させ、当該物質を抗カルパスタチン抗体とカルパスタチンを介して固相に固着させることができる。この場合の接触の方法や、反応の条件、洗浄等に関しては、前記と同様である。
【００４０】
そして、「抗カルパスタチン抗体に対して結合能を有する物質」が標識されている場合には、その標識を検出することによって、カルパスタチンを介して固相に固着した抗カルパスタチン抗体（固相に固着されたカルパスタチンに結合した抗カルパスタチン抗体）を検出することができる。
標識の検出の方法は、標識に用いた標識物質に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００４１】
例えば、酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を標識物質として用いた場合には、これに酵素の基質や発色基質等を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で検出する方法などを採用できる。また、蛍光物質や化学発光物質を標識物質として用いた場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を検出する方法などを採用できる。放射性同位元素を標識物質として用いた場合は、この同位元素から発せられる放射線を検出すればよい。
【００４２】
標識物質としてビオチンを使用した場合には、これにストレプトアビジン等を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加してビオチンとストレプトアビジンとを結合させ、次いで酵素の基質や発色基質等を加えて、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で検出する方法などを採用できる。
【００４３】
このように標識を検出することにより、関節液中の抗カルパスタチン抗体の有無を調べることができる。また関節液中の抗カルパスタチン抗体の量（濃度）も、予め既知濃度の抗カルパスタチン抗体標準液を用いて抗カルパスタチン抗体濃度と標識の検出結果（例えば吸光度）との関係について検量線又は関係式を作成しておき、これを用いることによって測定することができる。すなわち本発明測定方法において「測定」とは、抗カルパスタチン抗体の有無という定性的な測定や、その量（濃度）の測定という定量的な測定の双方を含む概念である。
【００４４】
＜２＞本発明検出方法
本発明検出方法は、関節液中の抗カルパスタチン抗体を定量し、その定量結果と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の程度の検出方法である。
【００４５】
本発明検出方法による検出対象となる疾患は、関節液中の抗カルパスタチン抗体量に変化が生じるような疾患である限りにおいて特に限定されない。
また関節液中の抗カルパスタチン抗体を定量する方法も特に限定されないが、本発明測定方法によって行われることが好ましい。
【００４６】
また、関節液中の抗カルパスタチン抗体量と疾患との関連づけ、及びこれによる疾患の検出も、検出対象となる疾患に応じて適宜行うことができる。
例えば検出対象とする疾患が、関節液中の抗カルパスタチン抗体量が増加するような疾患の場合には、関節液中の抗カルパスタチン抗体量が健常な動物（当該疾患がない動物）の関節液中の抗カルパスタチン抗体量に比して増加するので、本発明測定方法等で測定された抗カルパスタチン抗体量が健常な個体の関節液中の量に比して多い場合には、「当該疾患である」、又は「当該疾患である可能性が高い」と関連づけられ、これにより当該疾患を検出することができる。
【００４７】
また例えば検出対象とする疾患が、関節液中の抗カルパスタチン抗体量が減少するような疾患の場合には、関節液中の抗カルパスタチン抗体量が健常なヒト（当該疾患がないヒト）の関節液中の抗カルパスタチン抗体量に比して減少するので、本発明測定方法等で測定された抗カルパスタチン抗体量が健常な個体の関節液中の量に比して少ない場合には、「当該疾患である」、又は「当該疾患である可能性が高い」と関連づけられ、これにより当該疾患を検出することができる。
【００４８】
また上記のような関節液中の抗カルパスタチン抗体量が増加又は減少するような疾患を検出対象とする場合において、本発明測定方法等で測定された抗カルパスタチン抗体量が健常な個体の関節液中の抗カルパスタチン抗体量と同等であれば、「当該疾患でない」、又は「当該疾患である可能性は低い」と関連づけることができる。
【００４９】
また本発明検出方法においては、上記疾患の有無のみでなく、上記疾患の程度の検出も含まれる。例えば個体の関節液中の抗カルパスタチン抗体量を本発明測定方法等により定期的に測定し、抗カルパスタチン抗体量が健常な個体のレベルから離れる傾向にある場合には「上記疾患が進行している」、又は「上記疾患が進行している可能性が高い」と関連づけることができる。また本発明測定方法等により測定された抗カルパスタチン抗体量が健常な個体のレベルに近づく傾向にある場合には、「上記疾患が改善方向にある」、又は「上記疾患が改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。また本発明測定方法等により測定された抗カルパスタチン抗体量が健常な個体のレベルの範囲内で変化しない場合には、「健常性に変化がない」、又は「健常性に変化がない可能性が高い」と関連づけることができ、抗カルパスタチン抗体量が健常な個体のレベルの範囲外で変化しない場合には、「上記疾患の程度に変化がない」、又は「上記疾患の程度に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。
【００５０】
なお、上記疾患の検出基準となる抗カルパスタチン抗体量は、抗カルパスタチン抗体標準品溶液の濃度と標識物質の検出結果との関係について作成した検量線又は関係式を用いて求めた抗カルパスタチン抗体濃度であっても良く、また当該検量線又は関係式を用いずに健常な個体（上記疾患がない個体）の体液中の抗カルパスタチン抗体量に対する比であっても良い。
【００５１】
例えば、リウマチ疾患、特にＲＡでは、関節液中の抗カルパスタチン抗体が増加する。したがって、リウマチ疾患、特にＲＡの検出を行う場合には、関節液中の抗カルパスタチン抗体を本発明測定方法等により測定し、この抗体量が健常な個体（リウマチ疾患(ＲＡ)がないヒト）の関節液中の抗カルパスタチン抗体量に比して増加している場合には、「リウマチ疾患(ＲＡ)である」、又は「リウマチ疾患(ＲＡ)である可能性が高い」と関連づけることができる。
【００５２】
なお本発明検出方法は、本発明測定方法によって関節液中の抗カルパスタチン抗体を測定し、関節液中の抗カルパスタチン抗体量とリウマチ疾患（特にＲＡ）とを関連づけることによりリウマチ疾患（特にＲＡ）を検出する方法であることが好ましい。
【００５３】
＜３＞本発明測定キット
本発明測定キットは、下記構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、関節液中の抗カルパスタチン抗体の定量キットである。
(A)カルパスタチンが固着された固相。
(B)抗カルパスタチン抗体に結合能を有する抗イムノグロブリン抗体。
【００５４】
(A)の固相及び(B)の抗イムノグロブリン抗体については、＜１＞本発明測定方法における説明と同様である。したがって、抗イムノグロブリン抗体は標識されているものが好ましい。
【００５５】
本発明測定キットは、上記(A)及び(B)を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線や関係式の作成のための標準となる既知濃度の抗カルパスタチン抗体標準品、標識物質の検出試薬、抗イムノグロブリン抗体を標識する試薬等を構成成分として加えることができる。また、これらの構成成分の他に、前記のブロッキング物質、前記の洗浄液、関節液を希釈するための液、酵素反応停止液等が含まれていてもよい。
【００５６】
これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容しておき、使用時に本発明測定方法に従って使えるキットとして保存しておくことができる。
【００５７】
本発明測定キットを用いた抗カルパスタチン抗体の測定は、前記＜１＞の本発明測定方法に従って行うことができる。
【００５８】
＜４＞本発明検出キット
本発明検出キットは、本発明測定キットの構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、疾患の程度の検出キットである。
【００５９】
本発明検出キットの構成成分(A)及び(B)並びにその他の点については、上記＜３＞の本発明測定キットにおける説明と同様である。
【００６０】
また本発明検出キットにより検出される疾患については、前記＜２＞における説明と同様である。したがって、疾患としてはリウマチ疾患であることが好ましく、ＲＡであることがより好ましい。
本発明検出キットを用いた疾患の検出は、上記＜２＞の本発明検出方法に従って行うことができる。
【００６１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００６２】
初めに、本実施例中で使用した材料をまとめて説明する。
【００６３】
９６ウエルマイクロプレート（岩城硝子製）(コード番号 3860-096)
カルパスタチン（ヒト赤血球由来）(カルビオケム製；カタログ番号 208901)
ＨＲＰＯ（西洋ワサビのペルオキシダーゼ）−アフィニ・ピュアウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・イムノ・リサーチ・ラボラトリー製；コード番号 309-035-003）
ＴＢＳ：20mM Tris-HCl(pH7.5)／0.5M NaCl
ＴＴＢＳ：0.05％トゥイーン(Tween)20／ＴＢＳ
ＯＰＤ：ｏ−フェニレンジアミン（25mlの0.1M クエン酸-0.2M リン酸緩衝液(pH5.0)中に10mgを含有）＋Ｈ_２Ｏ_２５μl
【００６４】
抗カルパスタチン抗体検出ＥＬＩＳＡ（Progen製；カタログ番号 PR59191）
なお、この「抗カルパスタチン抗体検出ＥＬＩＳＡ」は市販されており、血清又は血漿中に存在する「カルパスタチンのＣ末端側に特異的な自己抗体」の定量キットである。固相に固着されているものが、本発明では「天然に存在するカルパスタチンの全アミノ酸配列を有するポリペプチド」であるのに対し、当該市販キットでは「カルパスタチンのＣ末端側のペプチド」である点で異なっている。また対象となる検体も、本発明では「関節液」であるのに対し、当該市販キットでは「血清又は血漿」である点でも異なっている。
【００６５】
【実施例１】
＜カルパスタチンが固着された固相の作製＞
カルパスタチンを２μg/ml濃度となるように0.1M ホウ酸緩衝液(pH8.4)に溶解し、９６ウエルマイクロプレートに50μl／ウエルずつ添加して、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳで３回洗浄した後、２％ＢＳＡ／１％ゼラチンを含有するＴＢＳを100μl／ウエルずつ添加して、３７℃で１時間インキュベートした。次いでＴＢＳで３回洗浄することにより、カルパスタチンが固着された９６ウエルマイクロプレートを作製した。
【００６６】
＜カルパスタチンが固着された固相と標準品溶液との接触＞
上記で作製したカルパスタチン固着プレートに、種々の濃度のヒト抗カルパスタチン抗体(IgG)標準品溶液（2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、15ng/ml、30ng/ml、60ng/ml又は120ng/ml；1％ BSA/TBSで希釈）をそれぞれ100μl/ウエル添加した。室温で１．５時間インキュベートした後、ＴＴＢＳで３回洗浄した。
＜カルパスタチンを介して固相に固着された抗カルパスタチン抗体の検出＞
次いで、上記プレートに１％ BSA/TTBSで希釈したＨＲＰＯ−ウサギ抗ヒトＩｇＧを 50μl／ウエルずつ添加して、室温で１時間インキュベートした。ＴＴＢＳで３回洗浄した後、ＯＰＤ溶液を100μl／ウエルで添加して、暗条件下、室温で１５分間インキュベートした。Ｈ_２ＳＯ_４を50μl／ウエルで添加して発色反応を停止させ、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。抗カルパスタチン抗体濃度と吸光度との関係を図１に示す。
【００６７】
また、前記の市販キットを用いて、同様に種々の濃度の抗カルパスタチン抗体(IgG)標準品溶液についての吸光度を測定した。詳細な操作は、当該キットに添付されている説明書に従った。抗カルパスタチン抗体濃度と吸光度との関係を図２に示す。
【００６８】
図１と図２との比較から、カルパスタチン（天然に存在するカルパスタチンの全アミノ酸配列を有するポリペプチド）が固着されたプレートを用いた方が、市販のキット（カルパスタチンのＣ末端側のペプチド）を用いた場合に比して測定感度が高いことが判明した。また図１より、カルパスタチン（天然に存在するカルパスタチンの全アミノ酸配列を有するポリペプチド）が固着されたプレートを用いても、抗カルパスタチン抗体量が正確かつ定量性良く測定できることが示された。なお、図１の結果はそのまま検量線として利用することができる。
【００６９】
【実施例２】
＜ＲＡ患者関節液中の抗カルパスタチン抗体量の測定＞
ＲＡ患者（１６人）の関節液中の抗カルパスタチン抗体量について、上記と同様に測定を行った。なお、上記で作製したカルパスタチン固着プレートに接触させる場合には関節液を1％ BSA/TBSで２０００倍に希釈し、市販のキットに接触させる場合には関節液を同溶液で２００倍に希釈してそれぞれ用いた。同一の検体について上記プレートで測定した結果と、市販のキットで測定した結果との比較を図３に示す。
【００７０】
図３から明らかな通り、上記で作製したカルパスタチン固着プレートを用いて関節液中の抗カルパスタチン抗体量を測定すると、市販のキットよりも検体の希釈率が１０倍高いにもかかわらず、測定感度は顕著に高かった。このことは本発明によれば、市販のキットに比してより少ない量の関節液検体で、より感度が高い測定が可能であることを示している。
【００７１】
しかも、ＲＡか否かの判断の境目となるカットオフ値（30mU/ml）に対して、市販のキットでは１検体しか陽性にならなかったのに対し、上記で作製したキットでは１検体を除いて全て陽性となり、ＲＡを極めて感度良く検出できることが示された。
【００７２】
また上記で作製したカルパスタチン固着プレートを用いると、関節液中の抗カルパスタチン抗体を精製せずとも特異的に測定できることが示された。
【００７３】
【実施例３】
＜本発明測定キット及び本発明検出キットの作成＞
以下の構成からなる本発明測定キット及び本発明検出キットを作成した。
１．カルパスタチンがウェルに固着されたイムノプレート(９６ウェル) １枚
２．ＨＲＰＯ−ウサギ抗ヒトＩｇＧ１本
３．発色剤(ＯＰＤ) １本
４．反応停止液(６ＮＨ_２ＳＯ_４) １本
５．ヒト抗カルパスタチン抗体(IgG)標準品溶液１セット
標準液１( 2ng/ml) １本
標準液２( 4ng/ml) １本
標準液３( 8ng/ml) １本
標準液４(15ng/ml) １本
標準液５(30ng/ml) １本
標準液６(60ng/ml) １本
標準液７(120ng/ml) １本
【００７４】
【発明の効果】
本発明測定方法は、関節液中の抗カルパスタチン抗体をより高感度に測定できることから、患者から採取する関節液量も少なくて済み、極めて有用である。また本発明測定方法は、関節液中の抗カルパスタチン抗体を特異的かつ正確に、定量性良く、簡便に測定できる方法であり、極めて有用である。また本発明検出方法は本発明測定方法を応用したものであり、ＲＡをはじめとする種々の疾患を極めて簡便に検出できるので、非常に実用性が高い方法である。また本発明測定キット及び本発明検出キットは、本発明測定方法及び本発明検出方法を利用するキットであるので、これを用いて関節液中の抗カルパスタチン抗体を高感度、特異的かつ正確に、定量性良く、かつ簡便に測定でき、またＲＡをはじめとする種々の疾患を極めて簡便に検出できる。
【００７５】
また本発明測定キット及び本発明検出キットは、その構成が単純であり、構成試薬も少ないため、安価に提供することができる。
【００７６】
本発明は、本明細書中で説明したＲＡをはじめとする種々の疾患の検出のみならず、状態の把握、治療方針の決定、治療効果の確認、医薬品開発における候補物質の評価等へも応用することができ、極めて有用である。
【００７７】
【図面の簡単な説明】
【図１】カルパスタチン（ヒト赤血球由来）を固相化したプレートを用いた場合の、抗カルパスタチン抗体の測定結果（検量線）を示す。
【図２】市販のキット（カルパスタチンのＣ末端側のペプチドを固相化したプレート）を用いた場合の、抗カルパスタチン抗体の測定結果（検量線）を示す。
【図３】関節液中の抗カルパスタチン抗体量についての、本発明測定方法と市販のキットによる方法との比較を示す。図中の「ＲＦ−ＳＦ改良法」は本発明測定方法による結果を、「ＲＡ−ＳＦＫｉｔ」は市販のキットによる結果を示す。

Claims

下記工程(A)及び(B)を少なくとも含む、関節液中の抗カルパスタチン抗体の定量方法。
工程(A)：カルパスタチンが固着された固相に関節液を接触させる工程。
工程(B)：固相に固着されたカルパスタチンに結合した抗カルパスタチン抗体量を検出する工程。
抗カルパスタチン抗体量の検出が、当該抗体に結合能を有する抗イムノグロブリン抗体を用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載の定量方法。
抗イムノグロブリン抗体が標識されていることを特徴とする、請求項２に記載の定量方法。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の定量方法によって関節液中の抗カルパスタチン抗体を定量し、その定量結果と疾患とを関連づけることを特徴とする、疾患の程度の検出方法。
疾患が、リウマチ疾患である、請求項４に記載の検出方法。
リウマチ疾患が、慢性関節リウマチである、請求項５に記載の検出方法。
下記構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、関節液中の抗カルパスタチン抗体の定量キット。
(A)カルパスタチンが固着された固相。
(B)抗カルパスタチン抗体に結合能を有する抗イムノグロブリン抗体。
抗イムノグロブリン抗体が標識されていることを特徴とする請求項７に記載の定量キット。
請求項７又は８に記載の定量キットの構成成分(A)及び(B)を少なくとも含む、疾患の程度の検出キット。
疾患が、リウマチ疾患である、請求項９に記載の検出キット。
疾患が、慢性関節リウマチである、請求項１０に記載の検出キット。