JP2000241431A - 免疫グロブリンａ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定試薬および測定法 - Google Patents
免疫グロブリンａ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定試薬および測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】体液中のＩｇＡ−フィブロネクチン複合体を抗
フィブロネクチン抗体および抗ＩｇＡ抗体を用いて、精
度よく免疫学的に測定する試薬を提供するものである。 【解決手段】抗体結合量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２
である抗ヒト−フィブロネクチン抗体を結合する固相担
体および抗ヒト−免疫グロブリンＡ抗体を含む免疫グロ
ブリンＡ−フィブロネクチン複合体測定試薬および該測
定試薬を用いる免疫グロブリンＡ−フィブロネクチン複
合体測定方法。
フィブロネクチン抗体および抗ＩｇＡ抗体を用いて、精
度よく免疫学的に測定する試薬を提供するものである。 【解決手段】抗体結合量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２
である抗ヒト−フィブロネクチン抗体を結合する固相担
体および抗ヒト−免疫グロブリンＡ抗体を含む免疫グロ
ブリンＡ−フィブロネクチン複合体測定試薬および該測
定試薬を用いる免疫グロブリンＡ−フィブロネクチン複
合体測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫グロブリンＡ
−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定試薬、免疫学
的測定法及びこれらを利用するＩｇＡ腎症患者の免疫学
的診断方法に関する。さらに詳細には、本発明は、抗ヒ
ト−フィブロネクチン抗体を固相化させる手段を選択し
たことを特徴とする免疫グロブリンＡ−フィブロネクチ
ン複合体の免疫学的測定試薬、免疫学的測定法及びこれ
らを利用するＩｇＡ腎症患者の免疫学的診断方法に関す
る。以下、免疫グロブリンＡはＩｇＡと記載する。
−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定試薬、免疫学
的測定法及びこれらを利用するＩｇＡ腎症患者の免疫学
的診断方法に関する。さらに詳細には、本発明は、抗ヒ
ト−フィブロネクチン抗体を固相化させる手段を選択し
たことを特徴とする免疫グロブリンＡ−フィブロネクチ
ン複合体の免疫学的測定試薬、免疫学的測定法及びこれ
らを利用するＩｇＡ腎症患者の免疫学的診断方法に関す
る。以下、免疫グロブリンＡはＩｇＡと記載する。
【０００２】
【従来の技術】ＩｇＡ腎症は、慢性腎臓炎患者の約３０
％を占める腎疾患であり、ＩｇＡ腎症患者の約３０％は
透析に移行するといわれている。この腎臓疾患を診断す
るための基準が、１９９５年に「厚生省特定疾患進行性
腎障害調査研究班と日本腎臓学会の共同委員会」より示
されている。この基準では、尿検査（持続的顕微鏡的血
尿、持続的または間欠的蛋白尿、肉眼的血尿）、血液検
査（血清ＩｇＡ値が３５０ｍｇ／ｄＬ以上）によるとさ
れ、確定診断は『腎生検による糸球体の観察』が唯一の
方法となっている。
％を占める腎疾患であり、ＩｇＡ腎症患者の約３０％は
透析に移行するといわれている。この腎臓疾患を診断す
るための基準が、１９９５年に「厚生省特定疾患進行性
腎障害調査研究班と日本腎臓学会の共同委員会」より示
されている。この基準では、尿検査（持続的顕微鏡的血
尿、持続的または間欠的蛋白尿、肉眼的血尿）、血液検
査（血清ＩｇＡ値が３５０ｍｇ／ｄＬ以上）によるとさ
れ、確定診断は『腎生検による糸球体の観察』が唯一の
方法となっている。
【０００３】しかし、Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍらによって
「ＩｇＡ−フィブロネクチン複合体」がＩｇＡ腎症患者
の体液に特異的に存在することが報告され（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．８
５， ｐｐ．４８６５−４８６８， １９８８）、この
発見をもとにして，ＣｅｄｅｒｈｏｌｍらはＩｇＡ−フ
ィブロネクチン複合体の親和性を利用して免疫学的に該
複合体を測定し、その結果をもとにＩｇＡ腎臓病を診断
する診断用キットを提案している（特許第２５９２１２
１号公報）。
「ＩｇＡ−フィブロネクチン複合体」がＩｇＡ腎症患者
の体液に特異的に存在することが報告され（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｖｏｌ．８
５， ｐｐ．４８６５−４８６８， １９８８）、この
発見をもとにして，ＣｅｄｅｒｈｏｌｍらはＩｇＡ−フ
ィブロネクチン複合体の親和性を利用して免疫学的に該
複合体を測定し、その結果をもとにＩｇＡ腎臓病を診断
する診断用キットを提案している（特許第２５９２１２
１号公報）。
【０００４】その方法は、ＩｇＡ−フィブロネクチン複
合体のフィブロネクチン部分とコラーゲン、フィブリン
またはヘパリン、あるいは抗フィブロネクチン抗体との
親和性、または該複合体のＩｇＡ部分と抗ＩｇＡ抗体ま
たはＩｇＡ結合レクチンとの親和性を利用する方法であ
る。
合体のフィブロネクチン部分とコラーゲン、フィブリン
またはヘパリン、あるいは抗フィブロネクチン抗体との
親和性、または該複合体のＩｇＡ部分と抗ＩｇＡ抗体ま
たはＩｇＡ結合レクチンとの親和性を利用する方法であ
る。
【０００５】該公報には、その発明の実施例として、Ｉ
ｇＡ腎症患者の被験試料（抗血清）を用い、コラーゲン
Ｉに結合し、抗ヒト−ＩｇＡ抗体と反応する画分をジャ
カリン（レクチン）−セファロースにかけて、該複合体
を単離している（実施例２）。また、ヒト血清をヘパリ
ン−セファロースにかけ、次いで、変性コラーゲン被覆
マイクロタイター穴中でインキュベートし、結合したＩ
ｇＡ抗体を特異的抗体コンジュゲートにより検出してい
る（実施例８）。
ｇＡ腎症患者の被験試料（抗血清）を用い、コラーゲン
Ｉに結合し、抗ヒト−ＩｇＡ抗体と反応する画分をジャ
カリン（レクチン）−セファロースにかけて、該複合体
を単離している（実施例２）。また、ヒト血清をヘパリ
ン−セファロースにかけ、次いで、変性コラーゲン被覆
マイクロタイター穴中でインキュベートし、結合したＩ
ｇＡ抗体を特異的抗体コンジュゲートにより検出してい
る（実施例８）。
【０００６】これらの記載には、固相に抗フィブロネク
チン抗体を固定化し、該抗体に結合した上記複合体を抗
ＩｇＡ抗体と反応させて、該複合体の存在を知るサンド
イッチ測定法については、具体的な開示がない。
チン抗体を固定化し、該抗体に結合した上記複合体を抗
ＩｇＡ抗体と反応させて、該複合体の存在を知るサンド
イッチ測定法については、具体的な開示がない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、体液
中のＩｇＡ−フィブロネクチン複合体を抗フィブロネク
チン抗体および抗ＩｇＡ抗体を用いて、免疫学的に測定
する試薬であって、反応特異性が高く、かつ測定感度が
充分に高い免疫学的測定試薬を提供するものであり、該
試薬はＩｇＡ腎症の診断を補助することが可能である。
中のＩｇＡ−フィブロネクチン複合体を抗フィブロネク
チン抗体および抗ＩｇＡ抗体を用いて、免疫学的に測定
する試薬であって、反応特異性が高く、かつ測定感度が
充分に高い免疫学的測定試薬を提供するものであり、該
試薬はＩｇＡ腎症の診断を補助することが可能である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題を
解決するために、種々鋭意検討した結果、抗フィブロネ
クチン抗体の固相への固定化量が、特定の範囲内にある
ことにより、該複合体の測定が精度よく行い得ることを
見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は抗体結
合量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２である抗ヒト−フィ
ブロネクチン抗体を結合する固相担体および抗ヒト−免
疫グロブリンＡ抗体を含む免疫グロブリン−フィブロネ
クチン複合体測定試薬である。また、本発明は抗体結合
量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２である抗ヒト−フィブ
ロネクチン抗体を結合した固相担体に試料を作用させ、
次いで標識された免疫グロブリンＡ抗体を反応させ、固
相担体に結合した標識または固相担体に結合されなかっ
た標識を測定することを特徴とする免疫グロブリンＡ−
フィブロネクチン複合体測定方法である。
解決するために、種々鋭意検討した結果、抗フィブロネ
クチン抗体の固相への固定化量が、特定の範囲内にある
ことにより、該複合体の測定が精度よく行い得ることを
見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は抗体結
合量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２である抗ヒト−フィ
ブロネクチン抗体を結合する固相担体および抗ヒト−免
疫グロブリンＡ抗体を含む免疫グロブリン−フィブロネ
クチン複合体測定試薬である。また、本発明は抗体結合
量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２である抗ヒト−フィブ
ロネクチン抗体を結合した固相担体に試料を作用させ、
次いで標識された免疫グロブリンＡ抗体を反応させ、固
相担体に結合した標識または固相担体に結合されなかっ
た標識を測定することを特徴とする免疫グロブリンＡ−
フィブロネクチン複合体測定方法である。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。本発明において、抗ヒト−フィブロネクチン抗体と
は、ヒトのフィブロネクチンに特異的に反応するヒト以
外の動物由来の抗体を意味する。その製法は、例えば、
ヒト血漿由来のフィブロネクチンを免疫原として、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ等の動物に注射して産生された免疫グ
ロブリンを、自体公知の免疫グロブリンを精製する手段
を適用して調製される。より詳細には、フィブロネクチ
ンとの免疫的親和性を利用したアフィニテイークロマト
グラフィーを適用して抗ヒト−フィブロネクチン抗体が
回収できる。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。本発明において、抗ヒト−フィブロネクチン抗体と
は、ヒトのフィブロネクチンに特異的に反応するヒト以
外の動物由来の抗体を意味する。その製法は、例えば、
ヒト血漿由来のフィブロネクチンを免疫原として、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ等の動物に注射して産生された免疫グ
ロブリンを、自体公知の免疫グロブリンを精製する手段
を適用して調製される。より詳細には、フィブロネクチ
ンとの免疫的親和性を利用したアフィニテイークロマト
グラフィーを適用して抗ヒト−フィブロネクチン抗体が
回収できる。
【００１０】抗ヒト−フィブロネクチン抗体の免疫グロ
ブリンとしての精製度及びフィブロネクチン特異性につ
いての精製度は、測定に利用する固相担体の作製に問題
無いくらいに精製したものをいう。より簡便には、各種
市販の抗ヒト−フィブロネクチン抗体が使用できる。例
えば、ＤＡＫＯ社製の抗ヒト−フィブロネクチン抗体
（ウサギ）、ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ社製の抗ヒト−
フィブロネクチン抗体（ヒツジ）が例示される。
ブリンとしての精製度及びフィブロネクチン特異性につ
いての精製度は、測定に利用する固相担体の作製に問題
無いくらいに精製したものをいう。より簡便には、各種
市販の抗ヒト−フィブロネクチン抗体が使用できる。例
えば、ＤＡＫＯ社製の抗ヒト−フィブロネクチン抗体
（ウサギ）、ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩＴＥ社製の抗ヒト−
フィブロネクチン抗体（ヒツジ）が例示される。
【００１１】本発明において、固相化とは、抗ヒト−フ
ィブロネクチン抗体を不溶性の担体（固相担体）に固定
化することにより不溶化することを意味する。担体とし
ては、合成樹脂、例えばポリスチレン、ナイロン製のマ
イクロタイタープレート、ビーズ、試験管、ペーパーな
ど、およびガラス製のマイクロタイタープレート、ビー
ズなどが例示される。特にポリスチレン製のマイクロタ
イタープレートが好ましい。固相担体に当該抗体を結合
する手段は、固相担体の性質によって自体公知の手段が
適用できる。本発明においては、最適な手段としてタン
パク質と固相担体との物理的な様式（物理吸着）を利用
する方法を採用した。
ィブロネクチン抗体を不溶性の担体（固相担体）に固定
化することにより不溶化することを意味する。担体とし
ては、合成樹脂、例えばポリスチレン、ナイロン製のマ
イクロタイタープレート、ビーズ、試験管、ペーパーな
ど、およびガラス製のマイクロタイタープレート、ビー
ズなどが例示される。特にポリスチレン製のマイクロタ
イタープレートが好ましい。固相担体に当該抗体を結合
する手段は、固相担体の性質によって自体公知の手段が
適用できる。本発明においては、最適な手段としてタン
パク質と固相担体との物理的な様式（物理吸着）を利用
する方法を採用した。
【００１２】例えば、ポリスチレン製のマイクロタイタ
ープレートに０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．
７）中の抗体を一定の時間、一定の温度で、静置、ある
いは振盪する方法によって、抗体は固相担体に固相化さ
れる。
ープレートに０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．
７）中の抗体を一定の時間、一定の温度で、静置、ある
いは振盪する方法によって、抗体は固相担体に固相化さ
れる。
【００１３】本発明において、固相担体への抗体の結合
量は、ＩｇＡ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定
手段において、実質的に測定感度の高さを保持しかつ担
体の抗体未固相化部分の非特異反応を実質的に抑制する
量であり、その量の決定は健康人とＩｇＡ腎症患者血清
中のＩｇＡ−フィブロネクチン複合体量の比較考量結果
をもとにして、例えば標識体による吸光度の差によって
確立されるカットオフ値によって決定される。具体的に
は、実施例に記載した手段を適用して決定することが、
より簡便である。
量は、ＩｇＡ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定
手段において、実質的に測定感度の高さを保持しかつ担
体の抗体未固相化部分の非特異反応を実質的に抑制する
量であり、その量の決定は健康人とＩｇＡ腎症患者血清
中のＩｇＡ−フィブロネクチン複合体量の比較考量結果
をもとにして、例えば標識体による吸光度の差によって
確立されるカットオフ値によって決定される。具体的に
は、実施例に記載した手段を適用して決定することが、
より簡便である。
【００１４】さらに、固相担体への抗ヒト−フィブロネ
クチン抗体の固相化量は、抗体と固相担体との選択され
た固相化手段により達成される固相化されうる抗体量の
初期ピーク量を基準とし、加えて固相化抗体量の経済性
を考慮して決定することができる。
クチン抗体の固相化量は、抗体と固相担体との選択され
た固相化手段により達成される固相化されうる抗体量の
初期ピーク量を基準とし、加えて固相化抗体量の経済性
を考慮して決定することができる。
【００１５】本発明の実施例に開示の手段によって特定
化される抗ヒト−フィブロネクチン抗体の固相化量は、
約１５０〜約５００ｎｇ／ｃｍ２であり、より好ましく
は約２００〜約４６０ｎｇ／ｃｍ２である。結合量が約
１５０ｎｇ／ｃｍ２未満であると、測定感度が低いばか
りでなく、未結合部分のブロッキング状態によって非特
異反応が大きくなり、特異的な反応の検出が困難とな
る。逆に、抗体結合量が約５００ｎｇ／ｃｍ２を超える
と、ブロッキングに関係無く非特異的反応が目立ちはじ
め、目的疾患の患者以外の検体でも測定値が高値を示す
ようになる。従って、目的疾患患者の判別補助に悪影響
を与える可能性が高くなる。また、抗体の固相化のため
に使用する抗ヒト−フィブロネクチン抗体量が非常に多
くなると、製造コストに占める原材料費が高くなりすぎ
る。
化される抗ヒト−フィブロネクチン抗体の固相化量は、
約１５０〜約５００ｎｇ／ｃｍ２であり、より好ましく
は約２００〜約４６０ｎｇ／ｃｍ２である。結合量が約
１５０ｎｇ／ｃｍ２未満であると、測定感度が低いばか
りでなく、未結合部分のブロッキング状態によって非特
異反応が大きくなり、特異的な反応の検出が困難とな
る。逆に、抗体結合量が約５００ｎｇ／ｃｍ２を超える
と、ブロッキングに関係無く非特異的反応が目立ちはじ
め、目的疾患の患者以外の検体でも測定値が高値を示す
ようになる。従って、目的疾患患者の判別補助に悪影響
を与える可能性が高くなる。また、抗体の固相化のため
に使用する抗ヒト−フィブロネクチン抗体量が非常に多
くなると、製造コストに占める原材料費が高くなりすぎ
る。
【００１６】かくして、特定化された数値は、実施例で
例示された手段において、最良の結果をもたらすもので
あるが、また手段、条件を変えることにより、適宜実質
的に同等の効果をもたらす数値を選択可能である。
例示された手段において、最良の結果をもたらすもので
あるが、また手段、条件を変えることにより、適宜実質
的に同等の効果をもたらす数値を選択可能である。
【００１７】本発明において、抗ヒト−ＩｇＡ抗体と
は、ヒトのＩｇＡに反応するヒト以外の動物由来の抗体
を意味する。例えば、ヒト血清由来のＩｇＡを免疫原と
して、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の動物に投与して産生し
た免疫グロブリンを、自体公知の精製法によって高度精
製することにより得られる。本発明において、抗ヒト−
ＩｇＡ抗体は、二次抗体（標識抗体）として使われ、被
験試料と固相化抗ヒト−フィブロネクチン抗体の接触・
反応後にトラップ（捕捉）されたＩｇＡ−フィブロネク
チン複合体との２次反応に供される。
は、ヒトのＩｇＡに反応するヒト以外の動物由来の抗体
を意味する。例えば、ヒト血清由来のＩｇＡを免疫原と
して、ウサギ、ヤギ、ヒツジ等の動物に投与して産生し
た免疫グロブリンを、自体公知の精製法によって高度精
製することにより得られる。本発明において、抗ヒト−
ＩｇＡ抗体は、二次抗体（標識抗体）として使われ、被
験試料と固相化抗ヒト−フィブロネクチン抗体の接触・
反応後にトラップ（捕捉）されたＩｇＡ−フィブロネク
チン複合体との２次反応に供される。
【００１８】標識としては、酵素、蛍光物質、ラジオア
イソトープ、発光物質などが使用される。酵素としては
アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼなどが使用される。抗ヒト−ＩｇＡ抗
体の標識化は、公知の方法により行う。
イソトープ、発光物質などが使用される。酵素としては
アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼなどが使用される。抗ヒト−ＩｇＡ抗
体の標識化は、公知の方法により行う。
【００１９】本発明の免疫グロブリンＡ−フィブロネク
チン複合体測定試薬は、上記抗フィブロネクチン抗体が
固定化された担体および標識された抗ＩｇＡ抗体を含
み、さらに緩衝液、洗浄液などを必要により含む。
チン複合体測定試薬は、上記抗フィブロネクチン抗体が
固定化された担体および標識された抗ＩｇＡ抗体を含
み、さらに緩衝液、洗浄液などを必要により含む。
【００２０】本発明は、抗体結合量が１５０〜５００ｎ
ｇ／ｃｍ２である抗ヒト−フィブロネクチン抗体を結合
した固相担体に試料を作用させ、次いで標識された免疫
グロブリンＡ抗体を反応させ、固相担体に結合した標識
または固相担体に結合されなかった標識を測定する免疫
グロブリンＡ−フィブロネクチン複合体測定方法であ
る。該測定法では、それぞれの標識に応じて、その発
色、発光、蛍光、または放射線の強度を常法に従い測定
する。
ｇ／ｃｍ２である抗ヒト−フィブロネクチン抗体を結合
した固相担体に試料を作用させ、次いで標識された免疫
グロブリンＡ抗体を反応させ、固相担体に結合した標識
または固相担体に結合されなかった標識を測定する免疫
グロブリンＡ−フィブロネクチン複合体測定方法であ
る。該測定法では、それぞれの標識に応じて、その発
色、発光、蛍光、または放射線の強度を常法に従い測定
する。
【００２１】酵素免疫測定（ＥＩＡ）系での測定法は、
自体既知の手段によりおこなわれ、酵素の基質を種々選
択することにより、比色法、蛍光法、化学発光法、生物
発光法等の検出法が選択される。実施例では、二次抗体
に標識する酵素としてアルカリホスファターゼを選択
し、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）
を利用し、比色法によって検出した。つまり、基質を添
加し、固相に吸着した酵素を一定時間反応させ、発色し
た試験液の４０５ｎｍの吸光度を測定する方法を採用し
た。また、二次抗体に標識する酵素としてペルオキシダ
ーゼを選択する場合には、基質としてｏ−フェニレンジ
アミン（ＯＰＤ）やテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
を添加して発色させる比色法もある。なお、この検出法
の選択は、自体所望の検出限界により選定される。より
低い検出限界値を所望する場合には、例えばいわゆる化
学発光法等の手段が選択される。
自体既知の手段によりおこなわれ、酵素の基質を種々選
択することにより、比色法、蛍光法、化学発光法、生物
発光法等の検出法が選択される。実施例では、二次抗体
に標識する酵素としてアルカリホスファターゼを選択
し、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）
を利用し、比色法によって検出した。つまり、基質を添
加し、固相に吸着した酵素を一定時間反応させ、発色し
た試験液の４０５ｎｍの吸光度を測定する方法を採用し
た。また、二次抗体に標識する酵素としてペルオキシダ
ーゼを選択する場合には、基質としてｏ−フェニレンジ
アミン（ＯＰＤ）やテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）
を添加して発色させる比色法もある。なお、この検出法
の選択は、自体所望の検出限界により選定される。より
低い検出限界値を所望する場合には、例えばいわゆる化
学発光法等の手段が選択される。
【００２２】
【参考例１】固相抗体量の定量 ０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）で抗ヒト
−フィブロネクチン抗体（ＤＡＫＯ社製）を希釈して、
１．２７５ｍｇ／ｍＬ〜１．５９４μｇ／ｍＬの濃度の
抗体溶液を調製し、ポリスチレン製マイクロタイタープ
レート（Ｎｕｎｃ社製、９６−ｗｅｌｌｓ、高吸着タイ
プ）に２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で１８時
間以上静置後、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で３回洗浄した。プレートに吸着した抗体量
を、ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）
を用いて定量した。
−フィブロネクチン抗体（ＤＡＫＯ社製）を希釈して、
１．２７５ｍｇ／ｍＬ〜１．５９４μｇ／ｍＬの濃度の
抗体溶液を調製し、ポリスチレン製マイクロタイタープ
レート（Ｎｕｎｃ社製、９６−ｗｅｌｌｓ、高吸着タイ
プ）に２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で１８時
間以上静置後、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で３回洗浄した。プレートに吸着した抗体量
を、ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）
を用いて定量した。
【００２３】ＢＣＡ反応溶液を３００μＬ／ｗｅｌｌず
つ分注し、３７℃で１時間振盪後、室温まで冷却させ、
５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｔｙ
ｐｅ−ＭＴＰ−１２０；コロナ社製）を用いて測定し
た。抗体を含まない炭酸緩衝液のみでも同様な操作を行
い、抗体を固相化したウェルの吸光度値から炭酸緩衝液
のみの吸光度値を差し引いた。
つ分注し、３７℃で１時間振盪後、室温まで冷却させ、
５５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｔｙ
ｐｅ−ＭＴＰ−１２０；コロナ社製）を用いて測定し
た。抗体を含まない炭酸緩衝液のみでも同様な操作を行
い、抗体を固相化したウェルの吸光度値から炭酸緩衝液
のみの吸光度値を差し引いた。
【００２４】これと同時に検量線作成用として、ＢＣＡ
キットに添付されている牛血清アルブミン標準液（Ｐｉ
ｅｒｃｅ社製）をマイクロタイタープレートに１０μＬ
分注し、ＢＣＡ反応溶液を３００μＬ／ｗｅｌｌずつ分
注し、３７℃で１時間振盪後、室温まで冷却させ、５５
０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｔｙｐｅ
−ＭＴＰ−１２０；コロナ社製）を用いて測定し、検量
線とした。この検量線を用いてプレートに結合した抗体
量を求めた結果を図１に示す。
キットに添付されている牛血清アルブミン標準液（Ｐｉ
ｅｒｃｅ社製）をマイクロタイタープレートに１０μＬ
分注し、ＢＣＡ反応溶液を３００μＬ／ｗｅｌｌずつ分
注し、３７℃で１時間振盪後、室温まで冷却させ、５５
０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｔｙｐｅ
−ＭＴＰ−１２０；コロナ社製）を用いて測定し、検量
線とした。この検量線を用いてプレートに結合した抗体
量を求めた結果を図１に示す。
【００２５】図１の結果から、固相抗体量は、４３０ｎ
ｇ／ｃｍ２でいったんピークになりその後一定となる。
しかし、さらに抗体添加量を増やすと固相抗体量は徐々
に増加する傾向にあった。このことから、抗体の固相量
を安定化させるには、抗体添加量を１０μｇ／ｗｅｌｌ
以上とすることが好ましい。
ｇ／ｃｍ２でいったんピークになりその後一定となる。
しかし、さらに抗体添加量を増やすと固相抗体量は徐々
に増加する傾向にあった。このことから、抗体の固相量
を安定化させるには、抗体添加量を１０μｇ／ｗｅｌｌ
以上とすることが好ましい。
【００２６】
【実施例１】抗体固相量と患者特異性の関係 抗ヒト−フィブロネクチン抗体（ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩ
ＴＥ社製）を０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．
７）で希釈して、１ｍｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬの濃
度の抗体溶液を調製し、ポリスチレン製マイクロタイタ
ープレート（Ｎｕｎｃ社製、９６−ｗｅｌｌｓ、高吸着
タイプ）に２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で１
８時間以上静置後、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
ＴＥ社製）を０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．
７）で希釈して、１ｍｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬの濃
度の抗体溶液を調製し、ポリスチレン製マイクロタイタ
ープレート（Ｎｕｎｃ社製、９６−ｗｅｌｌｓ、高吸着
タイプ）に２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、４℃で１
８時間以上静置後、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【００２７】牛血清アルブミン（ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥ
ＫＮＩＫＡ Ｂ．Ｖ．社製）を１％含む０．０１ｍｏｌ
／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を３００μＬ／ｗｅ
ｌｌ分注し、２５℃で２時間静置後、０．０１ｍｏｌ／
Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。市販
安定化剤（Ｓｔａｂｉｌ Ｃｏａｔ、 ＢＳＩ ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を３００μＬ／ｗｅｌｌ分注
し、４℃で３０分静置後、溶液を除去し風乾させ、測定
用のマイクロタイタープレートを得た。このプレートは
シールし４℃で保存した。
ＫＮＩＫＡ Ｂ．Ｖ．社製）を１％含む０．０１ｍｏｌ
／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を３００μＬ／ｗｅ
ｌｌ分注し、２５℃で２時間静置後、０．０１ｍｏｌ／
Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。市販
安定化剤（Ｓｔａｂｉｌ Ｃｏａｔ、 ＢＳＩ ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を３００μＬ／ｗｅｌｌ分注
し、４℃で３０分静置後、溶液を除去し風乾させ、測定
用のマイクロタイタープレートを得た。このプレートは
シールし４℃で保存した。
【００２８】被験試料として、ＩｇＡ腎症患者血清と健
常人血清を０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で２５倍に希釈して２００μＬ／ｗｅｌｌ（２
重測定分）分注した。２５℃で６０分反応後、０．０５
％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、０．０１ｍ
ｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したアル
カリホスファターゼ標識・抗ヒト−ＩｇＡ抗体（Ｓｉｇ
ｍａ社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注した。
常人血清を０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で２５倍に希釈して２００μＬ／ｗｅｌｌ（２
重測定分）分注した。２５℃で６０分反応後、０．０５
％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、０．０１ｍ
ｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したアル
カリホスファターゼ標識・抗ヒト−ＩｇＡ抗体（Ｓｉｇ
ｍａ社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注した。
【００２９】２５℃で６０分反応後、０．０５％のＴｗ
ｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、１ｍｏｌ／Ｌのジエ
タノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．８）で調製した
１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム
（Ｓｉｇｍａ社製）を発色溶液として２００μＬ／ｗｅ
ｌｌ分注し、０分と６０分の吸光度差をマイクロプレー
トリーダー（Ｔｙｐｅ−ＭＴＰ−１２０；コロナ社製）
を用いて４０５ｎｍで測定した。その結果を図２に示
す。
ｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、１ｍｏｌ／Ｌのジエ
タノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．８）で調製した
１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム
（Ｓｉｇｍａ社製）を発色溶液として２００μＬ／ｗｅ
ｌｌ分注し、０分と６０分の吸光度差をマイクロプレー
トリーダー（Ｔｙｐｅ−ＭＴＰ−１２０；コロナ社製）
を用いて４０５ｎｍで測定した。その結果を図２に示
す。
【００３０】図２の結果から、抗体の添加量が少ないと
測定感度も低く、患者特異性は低くなるといえる。図２
における測定値（△ＯＤ）のカットオフを０．３とする
と、患者と健常人を分けるためには１５０ｎｇ／ｃｍ２
以上の固相化抗体量が必要であった。よって患者特異性
を高めるためには、抗体結合量が約１５０〜約５００ｎ
ｇ／ｃｍ２の範囲が適している。
測定感度も低く、患者特異性は低くなるといえる。図２
における測定値（△ＯＤ）のカットオフを０．３とする
と、患者と健常人を分けるためには１５０ｎｇ／ｃｍ２
以上の固相化抗体量が必要であった。よって患者特異性
を高めるためには、抗体結合量が約１５０〜約５００ｎ
ｇ／ｃｍ２の範囲が適している。
【００３１】
【実施例２】抗ヒト−フィブロネクチン抗体固相プレー
ト（ＦＮ） 抗ヒト−フィブロネクチン抗体（ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩ
ＴＥ社製）を０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液で希釈し
て、ポリスチレン製のマイクロタイタープレート（Ｎｕ
ｎｃ社製、９６−ｗｅｌｌｓ、高吸着タイプ）に約１５
０〜約５００ｎｇ／ｃｍ２の密度の範囲に４℃で１８時
間以上かけて結合させ、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
ト（ＦＮ） 抗ヒト−フィブロネクチン抗体（ＢＩＮＤＩＮＧ ＳＩ
ＴＥ社製）を０．１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液で希釈し
て、ポリスチレン製のマイクロタイタープレート（Ｎｕ
ｎｃ社製、９６−ｗｅｌｌｓ、高吸着タイプ）に約１５
０〜約５００ｎｇ／ｃｍ２の密度の範囲に４℃で１８時
間以上かけて結合させ、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。
【００３２】牛血清アルブミン（ＯＲＧＡＮＯＮ ＴＥ
ＫＮＩＫＡ Ｂ．Ｖ．社製）を１％含む０．０１ｍｏｌ
／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を３００μＬ／ｗｅ
ｌｌ分注し、２５℃で２時間静置後、０．０１ｍｏｌ／
Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。市販
安定化剤（Ｓｔａｂｉｌ Ｃｏａｔ、 ＢＳＩ ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を３００μＬ／ｗｅｌｌ分注
し、４℃で３０分静置後、溶液を除去し風乾させ、測定
用の抗ヒト−フィブロネクチン抗体固相マイクロタイタ
ープレート（ＦＮ）を得た。
ＫＮＩＫＡ Ｂ．Ｖ．社製）を１％含む０．０１ｍｏｌ
／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を３００μＬ／ｗｅ
ｌｌ分注し、２５℃で２時間静置後、０．０１ｍｏｌ／
Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。市販
安定化剤（Ｓｔａｂｉｌ Ｃｏａｔ、 ＢＳＩ ｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を３００μＬ／ｗｅｌｌ分注
し、４℃で３０分静置後、溶液を除去し風乾させ、測定
用の抗ヒト−フィブロネクチン抗体固相マイクロタイタ
ープレート（ＦＮ）を得た。
【００３３】被験試料は、ＩｇＡ腎症患者と健常人との
血清とし、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で２５倍に希釈したものをそれぞれのマイクロ
タイタープレートに２００μＬ／ｗｅｌｌ（２重測定
分）添加し、２５℃で６０分反応 後、０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、０．０１ｍｏｌ／
Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したアルカリホ
スファターゼ標識・抗ヒト−ＩｇＡ抗体（Ｓｉｇｍａ社
製）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注した。
血清とし、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）で２５倍に希釈したものをそれぞれのマイクロ
タイタープレートに２００μＬ／ｗｅｌｌ（２重測定
分）添加し、２５℃で６０分反応 後、０．０５％のＴ
ｗｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、０．０１ｍｏｌ／
Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したアルカリホ
スファターゼ標識・抗ヒト−ＩｇＡ抗体（Ｓｉｇｍａ社
製）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注した。
【００３４】２５℃で６０分反応後、０．０５％のＴｗ
ｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、１ｍｏｌ／Ｌのジエ
タノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．８）で調製した
１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム
（Ｓｉｇｍａ社製）を発色溶液として２００μＬ／ｗｅ
ｌｌ分注し、２５℃、６０分後の４０５ｎｍの吸光度を
マイクロプレートリーダー（Ｔｙｐｅ−ＭＴＰ−１２
０；コロナ社製）を用いて測定した結果を図３に示す。
ｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、１ｍｏｌ／Ｌのジエ
タノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．８）で調製した
１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム
（Ｓｉｇｍａ社製）を発色溶液として２００μＬ／ｗｅ
ｌｌ分注し、２５℃、６０分後の４０５ｎｍの吸光度を
マイクロプレートリーダー（Ｔｙｐｅ−ＭＴＰ−１２
０；コロナ社製）を用いて測定した結果を図３に示す。
【００３５】その結果、健常人検体のＩｇＡ−フィブロ
ネクチン複合体の測定値が低めに収束しており、カット
オフ吸光度を低く設定できる。
ネクチン複合体の測定値が低めに収束しており、カット
オフ吸光度を低く設定できる。
【００３６】
【比較例】変性コラーゲン固相プレート（ＣＢ） Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍらと同様に、マイクロタイタープレ
ートに臭化シアンで変性させたコラーゲンを結合させる
検討を比較として行った。ポリスチレン製のマイクロタ
イタープレート（Ｎｕｎｃ社製、９６−ｗｅｌｌｓ、高
吸着タイプ）に臭化シアンで処理したコラーゲン（ＣＢ
６＋７フラクション、ＷｉｅｓｌａｂＡＢ社製）を０．
１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）で希釈調製
し、４℃で１８時間以上静置後、０．０１ｍｏｌ／Ｌの
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。特許第２
５９２１２１号公報に記載されているように、ブロッキ
ング操作は実施しなかった。市販安定化剤（Ｓｔａｂｉ
ｌ Ｃｏａｔ、 ＢＳＩｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）
を３００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、４℃で３０分静置後、
溶液を除去し風乾させ、測定用の変性コラーゲン固相化
マイクロタイタープレート（ＣＢ）を得た。被験試料
は、実施例２に用いたものと同じＩｇＡ腎症患者と健常
人との血清とし、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で２５倍に希釈したものをそれぞれのマ
イクロタイタープレートに２００μＬ／ｗｅｌｌ（２重
測定分）添加し、２５℃で６０分反応後、０．０５％の
Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、０．０１ｍｏｌ
／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したアルカリ
ホスファターゼ標識・抗ヒト−ＩｇＡ抗体（Ｓｉｇｍａ
社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注した。２５℃で６０
分反応後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０
１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝波（ｐＨ７．４）で３回洗浄
を行い、１ｍｏｌ／Ｌのジエタノールアミン−塩酸緩衝
液（ｐＨ９．８）で調製した１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロ
フェニルリン酸２ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製）を発色
溶液として２００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、２５℃、６０
分後の４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー
（Ｔｙｐｅ−ＭＴＰ−１２０；コロナ社製）を用いて測
定した結果を図４に示す。
ートに臭化シアンで変性させたコラーゲンを結合させる
検討を比較として行った。ポリスチレン製のマイクロタ
イタープレート（Ｎｕｎｃ社製、９６−ｗｅｌｌｓ、高
吸着タイプ）に臭化シアンで処理したコラーゲン（ＣＢ
６＋７フラクション、ＷｉｅｓｌａｂＡＢ社製）を０．
１ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）で希釈調製
し、４℃で１８時間以上静置後、０．０１ｍｏｌ／Ｌの
リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。特許第２
５９２１２１号公報に記載されているように、ブロッキ
ング操作は実施しなかった。市販安定化剤（Ｓｔａｂｉ
ｌ Ｃｏａｔ、 ＢＳＩｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）
を３００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、４℃で３０分静置後、
溶液を除去し風乾させ、測定用の変性コラーゲン固相化
マイクロタイタープレート（ＣＢ）を得た。被験試料
は、実施例２に用いたものと同じＩｇＡ腎症患者と健常
人との血清とし、０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で２５倍に希釈したものをそれぞれのマ
イクロタイタープレートに２００μＬ／ｗｅｌｌ（２重
測定分）添加し、２５℃で６０分反応後、０．０５％の
Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．０１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄を行い、０．０１ｍｏｌ
／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈したアルカリ
ホスファターゼ標識・抗ヒト−ＩｇＡ抗体（Ｓｉｇｍａ
社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌ分注した。２５℃で６０
分反応後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む０．０
１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝波（ｐＨ７．４）で３回洗浄
を行い、１ｍｏｌ／Ｌのジエタノールアミン−塩酸緩衝
液（ｐＨ９．８）で調製した１ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロ
フェニルリン酸２ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製）を発色
溶液として２００μＬ／ｗｅｌｌ分注し、２５℃、６０
分後の４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー
（Ｔｙｐｅ−ＭＴＰ−１２０；コロナ社製）を用いて測
定した結果を図４に示す。
【００３７】この比較例の結果は、健常人被験試料のＩ
ｇＡ−フィブロネクチン複合体の測定値が広く分散して
おり、疾患に関係無い副反応や非特異反応が多いことが
示唆される。これは、コラーゲンの接着分子としての性
格上、仕方ない結果であり、決してブロッキングを行わ
なかったことによる非特異物質のプレートへの直接結合
ではないと確認している。この結果、変性コラーゲンを
固相化したプレートを使用する場合、カットオフ吸光度
を高めに設定する必要がある。
ｇＡ−フィブロネクチン複合体の測定値が広く分散して
おり、疾患に関係無い副反応や非特異反応が多いことが
示唆される。これは、コラーゲンの接着分子としての性
格上、仕方ない結果であり、決してブロッキングを行わ
なかったことによる非特異物質のプレートへの直接結合
ではないと確認している。この結果、変性コラーゲンを
固相化したプレートを使用する場合、カットオフ吸光度
を高めに設定する必要がある。
【００３８】図３、図４の結果より、非特異反応を低く
抑え、カットオフの設定も低くした状態で、ＩｇＡ腎症
患者を特異的に検出するためには、抗ヒト−フィブロネ
クチン抗体を結合させたマイクロタイタープレート（Ｆ
Ｎ）を用いたＥＬＩＳＡ法が変性コラーゲン（ＣＢ）を
結合させたものより優れていることが分かった。
抑え、カットオフの設定も低くした状態で、ＩｇＡ腎症
患者を特異的に検出するためには、抗ヒト−フィブロネ
クチン抗体を結合させたマイクロタイタープレート（Ｆ
Ｎ）を用いたＥＬＩＳＡ法が変性コラーゲン（ＣＢ）を
結合させたものより優れていることが分かった。
【００３９】
【発明の効果】本発明によって提供される免疫グロブリ
ンＡ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定法は、抗
体結合量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２である抗ヒト−
フィブロネクチン抗体を結合した固相担体に試料を作用
させることにより、反応特異性および測定感度を高く保
ち、ＩｇＡ腎症の診断補助を可能とするものである。
ンＡ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定法は、抗
体結合量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２である抗ヒト−
フィブロネクチン抗体を結合した固相担体に試料を作用
させることにより、反応特異性および測定感度を高く保
ち、ＩｇＡ腎症の診断補助を可能とするものである。
【図１】マイクロタイタープレートに抗体を結合する際
に添加する抗ヒト−フィブロネクチン抗体量（横軸）
と、プレート表面に結合した抗体量をＢＣＡ法により定
量し、単位面積当たりの結合量に換算した値（縦軸）を
示すグラフである。
に添加する抗ヒト−フィブロネクチン抗体量（横軸）
と、プレート表面に結合した抗体量をＢＣＡ法により定
量し、単位面積当たりの結合量に換算した値（縦軸）を
示すグラフである。
【図２】Ａはマイクロタイタープレートに結合した抗ヒ
ト−フィブロネクチン抗体量（横軸）と、ＩｇＡ腎症患
者血清２検体（ＩｇＡ−Ｎ１、ＩｇＡ−Ｎ２）、健常人
血清２検体およびＰＢＳ緩衝液中に含まれるＩｇＡ−フ
ィブロネクチン複合体をＥＬＩＳＡ法で測定した結果
（縦軸）を示すグラフであり、Ｂは図２Ａの一部分の拡
大図である。
ト−フィブロネクチン抗体量（横軸）と、ＩｇＡ腎症患
者血清２検体（ＩｇＡ−Ｎ１、ＩｇＡ−Ｎ２）、健常人
血清２検体およびＰＢＳ緩衝液中に含まれるＩｇＡ−フ
ィブロネクチン複合体をＥＬＩＳＡ法で測定した結果
（縦軸）を示すグラフであり、Ｂは図２Ａの一部分の拡
大図である。
【図３】抗ヒト−フィブロネクチン抗体固定化プレート
（ＦＮ）によるＩｇＡ−フィブロネクチン複合体測定値
の分布を示す図である。
（ＦＮ）によるＩｇＡ−フィブロネクチン複合体測定値
の分布を示す図である。
【図４】変性コラーゲン固相化プレート（ＣＢ）による
ＩｇＡ−フィブロネクチン複合体測定値の分布を示す図
である。
ＩｇＡ−フィブロネクチン複合体測定値の分布を示す図
である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年１１月４日（１９９９．１１．
４）
４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】その結果、健常人の平均測定値は０．２４
１、ＩｇＡ腎症患者の平均測定値は１．５９５となり、
両者の吸光度の比は１：６．６１８であった。すなわ
ち、健常人検体のＩｇＡ−フィブロネクチン複合体の測
定値が低めに収束しており、カットオフ吸光度を低く設
定できる。
１、ＩｇＡ腎症患者の平均測定値は１．５９５となり、
両者の吸光度の比は１：６．６１８であった。すなわ
ち、健常人検体のＩｇＡ−フィブロネクチン複合体の測
定値が低めに収束しており、カットオフ吸光度を低く設
定できる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】この比較例の結果、健常人の平均測定値は
０．６１２、ＩｇＡ腎症患者の平均測定値は１．７３６
となり、両者の吸光度の比は１：２．８３８であった。
すなわち、健常人被験試料のＩｇＡ−フィブロネクチン
複合体の測定値が広く分散しており、疾患に関係無い副
反応や非特異反応が多いことが示唆される。これは、コ
ラーゲンの接着分子としての性格上、仕方ない結果であ
り、決してブロッキングを行わなかったことによる非特
異物質のプレートへの直接結合ではないと確認してい
る。この結果、変性コラーゲンを固相化したプレートを
使用する場合、カットオフ吸光度を高めに設定する必要
がある。
０．６１２、ＩｇＡ腎症患者の平均測定値は１．７３６
となり、両者の吸光度の比は１：２．８３８であった。
すなわち、健常人被験試料のＩｇＡ−フィブロネクチン
複合体の測定値が広く分散しており、疾患に関係無い副
反応や非特異反応が多いことが示唆される。これは、コ
ラーゲンの接着分子としての性格上、仕方ない結果であ
り、決してブロッキングを行わなかったことによる非特
異物質のプレートへの直接結合ではないと確認してい
る。この結果、変性コラーゲンを固相化したプレートを
使用する場合、カットオフ吸光度を高めに設定する必要
がある。
Claims (5)
- 【請求項１】抗体結合量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２
である抗ヒト−フィブロネクチン抗体を結合する固相担
体および抗ヒト−免疫グロブリンＡ抗体を含む免疫グロ
ブリン−フィブロネクチン複合体測定試薬。 - 【請求項２】固相担体が合成樹脂製担体である請求項１
記載の免疫グロブリンＡ−フィブロネクチン複合体測定
試薬。 - 【請求項３】抗ヒト−フィブロネクチン抗体が固相担体
に物理的に吸着された請求項１記載の免疫グロブリンＡ
−フィブロネクチン複合体測定試薬。 - 【請求項４】抗ヒト−免疫グロブリンＡ抗体が標識され
た抗体である請求項１記載の免疫グロブリンＡ−フィブ
ロネクチン複合体測定試薬。 - 【請求項５】抗体結合量が１５０〜５００ｎｇ／ｃｍ２
である抗ヒト−フィブロネクチン抗体を結合した固相担
体に試料を作用させ、次いで標識された免疫グロブリン
Ａ抗体を反応させ、固相担体に結合した標識または固相
担体に結合されなかった標識を測定することを特徴とす
る免疫グロブリンＡ−フィブロネクチン複合体測定方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11038983A JP2000241431A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | 免疫グロブリンａ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定試薬および測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11038983A JP2000241431A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | 免疫グロブリンａ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定試薬および測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000241431A true JP2000241431A (ja) | 2000-09-08 |
Family
ID=12540395
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11038983A Pending JP2000241431A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | 免疫グロブリンａ−フィブロネクチン複合体の免疫学的測定試薬および測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000241431A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009147999A1 (ja) | 2008-06-02 | 2009-12-10 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | ＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キット |
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1999
- 1999-02-17 JP JP11038983A patent/JP2000241431A/ja active Pending
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