JP3538381B2 - 結腸癌を診断し、モニターし、そして病期決定する新規方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、部分的に、癌、特に結腸癌を検出し、診断
し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するため
の、新たに開発されたアッセイに関する。発明の背景 結腸癌は、米国において、二番目に多く頻繁に診断され
る悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）である。胃腸管の
癌、特に結腸癌は、非常に治療可能であり、そして腸
（ｂｏｗｅｌ）に局在する場合、しばしば治癒可能な疾
患である。しかし、現在、結腸癌は、癌での死亡の二番
目に多い原因である。手術が主な治療であり、そして患
者のおよそ５０％が治癒する。手術後の再発が主な問題
であり、そしてしばしば死の究極的な原因である。結腸
癌の予後は、明らかに、腸壁を通じた腫瘍の浸透の度合
いおよび結節関与の有無に関連する。これらの２つの特
性が、本疾患に関し開発されたすべての病期決定系の基
本を成す。腸閉塞および腸穿孔は、予後不良の指標であ
る。癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９−
９（ＣＡ １９−９）の血清レベルが治療前に上昇して
いる場合もまた、有意に予後が陰性である。

【０００２】疾患頻度が高く（新規の結腸癌症例は毎年
およそ１６０，０００）、高リスク群が同定され、原発
病巣の増殖が遅いことが立証され、初期病巣では生存率
が高く、そしてスクリーニング試験が比較的単純でそし
て正確であるため、結腸癌に関するスクリーニングは、
５０歳以上のすべての成人、特に結腸直腸癌患者の一親
等の親族である成人のための、日常的な医療の一部であ
るべきである。

【０００３】結腸癌を検出し、診断し、モニターし、病
期決定し、そして予後判定するために用いられる方法
は、患者の結果に非常に重要である。例えば、初期結腸
癌と診断された患者は、一般的に、遠隔転移結腸癌と診
断された患者の生存率に比べ、はるかに高い５年生存率
を有する。治療決定は、通常、病期決定のためのより古
いＤｕｋｅｓまたは修飾Ａｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒ
（ＭＡＣ）分類計画を参考にして行われる。しかし、明
らかに、初期結腸癌を検出するための、より感度が高く
そして特異的な新規診断法が必要である。

【０００４】さらに、結腸癌患者は、最初の療法後、そ
して補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）療法中、療法に対する
反応を測定し、そして転移の持続または再発疾患を検出
するため、綿密にモニターしなければならない。したが
って、結腸癌再発を検出するのに、より感度が高くそし
て特異的な結腸癌マーカーが、明らかに必要である。

【０００５】結腸癌を管理する、別の重要な段階は、患
者の疾患の病期を決定することである。病期決定は、予
後判定に有用である可能性があり、そして最適な療法を
設計するための規準を提供する。病理学的な病期決定
は、より正確な予後を提供するため、現在、結腸癌の病
理学的な病期決定が、臨床的な病期決定より好ましい。
しかし、臨床的な病期決定は、病理学的評価のための組
織を得る侵襲処置に依存しないため、臨床的な病期決定
法が少なくとも病理学的な病期決定と同程度に正確であ
れば、臨床的病理決定が好ましいであろう。結腸癌の病
期決定は、細胞、組織、または体液において、侵襲の異
なる病期の間を区別することが可能な新規マーカーを検
出することにより、改善されるであろう。

【０００６】本発明において、９つの結腸特異的遺伝子
（ＣＳＧ）を介し、結腸癌、特に結腸、胃、および小腸
癌を検出し、診断し、モニターし、病期決定し、そして
予後判定するための方法が提供される。これらの９つの
ＣＳＧは、とりわけ、配列番号１、２、３、４、５、
６、７、８または９のいかなるものでもよいポリヌクレ
オチド配列を含む遺伝子により発現される天然タンパク
質を指す。あるいは、本明細書において、９つのＣＳＧ
により、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８また
は９の配列のポリヌクレオチド配列のいかなるものでも
よいものを含む遺伝子によりコードされる天然ｍＲＮ
Ａ、あるいは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８
または９のポリヌクレオチド配列のいかなるものでもよ
いものを含む遺伝子のレベルを意味する。

【０００７】本発明の他の目的、特徴、利点および側面
は、以下の説明から当業者に明らかになるであろう。し
かし、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ま
しい態様を示す一方で、例示の手段としてのみ提示され
ることが理解されなければならない。開示される発明の
精神および範囲内の多様な変化および修飾は、以下の説
明を読むことにより、そして本開示の他の部分を読むこ
とにより、当業者に容易に明らかになるであろう。発明の概要 これらの、そして他の目的に向け、患者における結腸癌
の存在を診断するための方法であって、患者由来の細
胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルを測
定し、そしてＣＳＧの該測定レベルを、コントロール
の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液にお
けるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールに
おけるＣＳＧレベルに対する患者における測定ＣＳＧレ
ベルの増加は、結腸癌と関連する、ことを含む前記方法
を提供するのが、本発明の目的である。

【０００８】本発明の別の目的は、患者における転移性
結腸癌を診断する方法であって、患者由来の細胞、組織
または体液の試料におけるＣＳＧレベルを測定し、そし
て該測定ＣＳＧレベルを、コントロールの、好ましくは
同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＣＳＧのレ
ベルと比較する、ここでコントロールにおけるＣＳＧレ
ベルに対する患者における測定ＣＳＧレベルの増加は、
転移している癌と関連する、ことを含む前記方法を提供
することである。

【０００９】本発明の別の目的は、患者における結腸癌
を病期決定する方法であって、結腸癌を有する患者を同
定し、該患者から得た細胞、組織、または体液の試料に
おけるＣＳＧのレベルを測定し、そして該測定ＣＳＧレ
ベルを、コントロールの、好ましくは同じ種類の細胞、
組織または体液におけるＣＳＧのレベルと比較すること
を含む前記方法を提供することである。コントロールに
おけるＣＳＧレベルに対する患者における測定ＣＳＧレ
ベルの増加は、進行している癌と関連する可能性があ
り、一方、コントロールに対する患者における測定ＣＳ
Ｇの減少したまたは同等のレベルは、後退または緩解し
ている癌と関連する可能性がある。

【００１０】本発明の別の目的は、転移の開始に関し、
患者における結腸癌をモニターする方法を提供すること
である。該方法は、転移していることが知られていない
結腸癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組
織、または体液の試料におけるＣＳＧのレベルを定期的
に測定し、そして該測定ＣＳＧレベルを、コントロール
の、好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液にお
けるＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールＣ
ＳＧレベルに対する測定ＣＳＧレベルの増加は、転移し
ている癌と関連する、ことを含む前記方法を提供するこ
とである。

【００１１】本発明のさらに別の目的は、患者における
結腸癌の病期の変化をモニターする方法であって、結腸
癌を有する患者を同定し、該患者から得た細胞、組織、
または体液の試料におけるＣＳＧのレベルを定期的に測
定し、そして該測定ＣＳＧレベルを、コントロールの、
好ましくは同じ種類の細胞、組織、または体液における
ＣＳＧのレベルと比較する、ここでコントロールＣＳＧ
レベルに対する測定ＣＳＧレベルの増加は、進行してい
る癌と関連し、そしてコントロールＣＳＧレベルに対す
る測定ＣＳＧレベルの減少は、後退または緩解している
癌と関連する、ことを含む前記方法を提供することであ
る。

【００１２】本発明の他の目的、特徴、利点および側面
は、以下の説明から当業者に明らかになるであろう。し
かし、以下の説明および特定の実施例は、本発明の好ま
しい態様を示す一方で、例示の手段としてのみ提示され
ることが理解されなければならない。開示される発明の
精神および範囲内の多様な変化および修飾は、以下の説
明を読むことにより、そして本開示の他の部分を読むこ
とにより、当業者に容易に明らかになるであろう。発明の詳細な説明 本発明は、ＣＳＧレベルを健常ヒトコントロールにおけ
るＣＳＧレベルと比較することにより、癌を検出し、診
断し、モニターし、病期決定し、そして予後判定するた
めの、定量的かつ定性的な診断アッセイおよび方法に関
する。本明細書において、「ＣＳＧレベル」により、配
列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９のいか
なるものでもよいポリヌクレオチド配列を含む遺伝子に
より発現される天然タンパク質のレベルを意味する。あ
るいは、本明細書において、「ＣＳＧレベル」により、
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８または９のポ
リヌクレオチド配列のいかなるものでもよいものを含む
遺伝子のいかなるものでもよいものによりコードされる
天然ｍＲＮＡ、あるいは配列番号１、２、３、４、５、
６、７、８または９のポリヌクレオチド配列のいかなる
ものでもよいものを含む遺伝子のレベルを意味する。こ
うしたレベルは、好ましくは、少なくとも１つの細胞、
組織および／または体液で測定され、正常および異常レ
ベルの決定を含む。したがって例えば、正常なコントロ
ール体液、細胞、または組織試料に比較した、いかなる
１つでもよいＣＳＧタンパク質の過剰発現を診断するた
め、本発明に一致した診断アッセイを用い、結腸癌を含
む癌の存在を診断してもよい。本発明の方法において、
９つのＣＳＧのいずれを単独で測定してもよいし、ある
いは９つをすべて共にまたはいかなる組み合わせで測定
してもよい。

【００１３】「コントロール」により、癌でないヒト患
者および／または該患者由来の非癌性試料を意味し、ま
た、本明細書において、健常ヒトコントロールも指す；
転移に関し診断するまたはモニターするための方法にお
いて、コントロールはまた、信頼できる方法により、転
移していない結腸癌を有すると決定されたヒト患者由来
の試料も含んでもよい。

【００１４】本発明の方法はすべて、所望により、ＣＳ
Ｇと共に他の癌マーカーのレベルを測定することを含ん
でもよい。ＣＳＧに加え、本発明に有用な他の癌マーカ
ーは、試験される癌に依存するであろうし、そして当業
者に知られる。

【００１５】診断アッセイ 本発明は、ヒト健常コントロール由来の、好ましくは同
じ種類の細胞、組織または体液におけるＣＳＧのレベル
と比較した、細胞、組織または体液におけるＣＳＧのレ
ベルの変化に関し解析することにより、結腸癌の存在を
診断する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者に
おけるＣＳＧレベルの増加は、結腸癌の存在と関連す
る、ための方法を提供する。本発明を限定することな
く、典型的には、定量的な診断アッセイに関し、試験さ
れた患者が癌を有することを示す陽性の結果は、ＣＳＧ
などの癌マーカーの細胞、組織、または体液レベルが、
健常ヒトコントロールの、好ましくは同じ細胞、組織、
または体液におけるより、少なくとも２倍高く、そして
最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。

【００１６】本発明はまた、転移の開始に関し、まだ転
移していない結腸癌を有する患者において、転移性結腸
癌を診断する方法も提供する。本発明の方法において、
転移している可能性がある（が、転移していることが既
に知られていない）結腸癌を有すると疑われるヒト癌患
者が同定される。これは、当業者に知られる多様な手段
により達成される。例えば、結腸癌の場合、典型的に
は、患者は、伝統的な検出法の後、結腸癌と診断され
る。

【００１７】本発明において、細胞、組織、または体液
におけるＣＳＧレベルの存在の決定は、転移していない
結腸癌および転移している結腸癌の間を区別するのに、
特に有用である。既存の技術では、転移している結腸癌
および転移していない結腸癌の間を区別するのは困難で
あり、そして適切な治療選択は、しばしばこうした知識
に依存する。

【００１８】本発明において、こうした細胞、組織、ま
たは体液において測定される癌マーカーレベルは、ＣＳ
Ｇであり、そして健常ヒトコントロールの、好ましくは
同じ種類の細胞、組織、または体液におけるＣＳＧレベ
ルと比較される。すなわち、観察される癌マーカーが、
血清中のＣＳＧのみである場合、本レベルは、好ましく
は健常ヒト患者の血清におけるＣＳＧレベルと比較され
る。健常ヒトコントロールに対する患者におけるＣＳＧ
の増加は、転移している結腸癌に関連する。

【００１９】本発明を限定することなく、典型的には、
定量的な診断アッセイに関し、試験されるまたはモニタ
ーされる患者における癌が転移していることを示す陽性
の結果は、ＣＳＧなどの癌マーカーの細胞、組織または
体液レベルが、健常患者の、好ましくは同じ細胞、組
織、または体液におけるより、少なくとも２倍高く、そ
して最も好ましくは少なくとも５倍高いものである。

【００２０】本明細書において、健常ヒトコントロール
には、癌でないヒト患者および／または該患者由来の非
癌性試料が含まれ；転移に関し診断するまたはモニター
するための方法において、健常ヒトコントロールはま
た、信頼できる方法により、転移していない結腸癌を有
すると決定されたヒト患者由来の試料も含んでもよい。

【００２１】病期決定 本発明はまた、ヒト患者における結腸癌を病期決定する
方法も提供する。本方法は、こうした癌を有するヒト患
者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体
液の試料を、ＣＳＧに関し、解析することを含む。その
後、該方法は、こうした細胞、組織、または体液におけ
るＣＳＧレベルを、健常ヒトコントロール試料の、好ま
しくは同じ種類の細胞、組織、または体液と比較する、
ここで健常ヒトコントロール試料に対する患者における
ＣＳＧレベルの増加は、進行している癌と関連し、そし
てＣＳＧのレベルの減少は、後退または緩解している癌
と関連する。

【００２２】モニター さらに提供されるのは、転移の開始に関し、こうした癌
を有するヒトにおける結腸癌をモニターする方法であ
る。該方法は、転移していることが知られていない癌を
有するヒト患者を同定し；こうした患者由来の細胞、組
織、または体液の試料をＣＳＧに関し定期的に解析し；
こうした細胞、組織、または体液における該ＣＳＧレベ
ルを、健常ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種
類の細胞、組織、または体液におけるＣＳＧのレベルと
比較する、ここで健常ヒトコントロールに対する患者に
おけるＣＳＧレベルの増加は、転移している癌と関連す
る、ことを含む。

【００２３】本発明にさらに提供されるのは、こうした
癌を有するヒトにおける結腸癌の病期の変化をモニター
する方法である。該方法は、こうした癌を有するヒト患
者を同定し；こうした患者由来の細胞、組織、または体
液の試料をＣＳＧに関し定期的に解析し；こうした細
胞、組織、または体液における該ＣＳＧレベルを、健常
ヒトコントロール試料の、好ましくは同じ種類の細胞、
組織、または体液におけるＣＳＧのレベルと比較する、
ここで健常ヒトコントロールに対する患者におけるＣＳ
Ｇレベルの増加は、病期が進行している癌と関連し、そ
してＣＳＧのレベルの減少は、病期が後退または緩解し
ている癌と関連する、ことを含む。

【００２４】転移の開始に関する、こうした患者のモニ
ターは、定期的であり、そして好ましくは、原則として
年４回行われる。しかし、癌、特定の患者、および癌の
病期に応じ、この頻度はより多くてもまたは少なくても
よい。

【００２５】アッセイ技術 宿主由来の試料における、本発明のＣＳＧなどの、遺伝
子発現のレベルを決定するのに用いてもよいアッセイ技
術は、当業者に周知である。こうしたアッセイ法には、
ラジオイムノアッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕ
ハイブリダイゼーションアッセイ、競合結合アッセイ、
ウェスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが含
まれる。とりわけ、ＥＬＩＳＡは、生物学的流体におけ
る遺伝子の発現タンパク質を診断するのに、しばしば好
ましい。商業的供給源から容易に入手可能でない場合、
ＥＬＩＳＡアッセイは、まず、ＣＳＧに特異的な抗体、
好ましくはモノクローナル抗体を調製することを含む。
さらに、一般的に、ＣＳＧに特異的に結合するレポータ
ー抗体が調製される。レポーター抗体は、検出可能な試
薬、例えば放射能、蛍光または酵素的試薬、例えば西洋
ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファタ
ーゼに付着している。

【００２６】ＥＬＩＳＡを実行するため、ＣＳＧに特異
的な抗体を、ポリスチレンプレートなど、抗体に結合す
る固体支持体上でインキュベーションする。その後、非
特異的タンパク質、例えばウシ血清アルブミンとインキ
ュベーションすることにより、プレート上のいかなる未
結合のタンパク質結合部位も、被覆される。次に、解析
しようとする試料を、プレート中でインキュベーション
し、その間、ＣＳＧは、ポリスチレンプレートに付着し
ている特異的抗体に結合する。未結合試料を緩衝液で洗
い流す。ＣＳＧに特異的に向けられ、そして西洋ワサビ
ペルオキシダーゼに連結されているレポーター抗体をプ
レートに加え、その結果ＣＳＧに結合しているいかなる
モノクローナル抗体に対してもレポーター抗体が結合す
る。その後、未結合レポーター抗体を洗い流す。その
後、比色基質を含む、ぺルオキシダーゼ活性のための試
薬をプレートに添加する。ＣＳＧ抗体に結合している固
定化ペルオキシダーゼは、呈色反応産物を生じる。既定
の期間に現れた色の量は、試料に存在するＣＳＧタンパ
ク質の量に比例する。定量的結果は、典型的には、標準
曲線に照合することにより、得られる。

【００２７】競合アッセイを使用してもよく、該アッセ
イでは、ＣＳＧに特異的な抗体が、固体支持体に付着し
ており、そして標識ＣＳＧおよび宿主由来の試料を該固
体支持体上に流す。すると、固体支持体に付着してい
る、検出される標識の量は、試料におけるＣＳＧの量と
相関し得る。核酸法を用い、結腸癌のマーカーとしてＣ
ＳＧ ｍＲＮＡを検出してもよい。ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）および他の核酸法、例えばリガーゼ連鎖反
応（ＬＣＲ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＡＢ
Ａ）を用い、多様な悪性腫瘍の診断およびモニターのた
め、悪性細胞を検出してもよい。例えば、逆転写酵素Ｐ
ＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、何千もの他のｍＲＮＡ種の複
合混合物における、特定のｍＲＮＡ集団の存在を検出す
るのに用いることが可能な、強力な技術である。ＲＴ−
ＰＣＲでは、まず逆転写酵素を使用し、ｍＲＮＡ種を相
補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写し；その後ｃＤＮＡを
標準的ＰＣＲ反応におけるように、増幅する。したがっ
て、ＲＴ−ＰＣＲは、増幅により、単一種のｍＲＮＡの
存在を明らかにすることが可能である。したがって、ｍ
ＲＮＡが該ｍＲＮＡを産生する細胞に非常に特異的であ
る場合、ＲＴ−ＰＣＲを用い、特定の種類の細胞の存在
を同定することが可能である。

【００２８】固体支持体上にアレー化されているクロー
ンまたはオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼー
ション（すなわち、格子化（gridding））を用い、その
遺伝子の発現を検出し、そしてかつ該遺伝子の発現レベ
ルを定量化してもよい。本アプローチにおいて、ＣＳＧ
遺伝子をコードするｃＤＮＡは、支持体に固定されてい
る。支持体は、限定されるわけではないが、ガラス、ニ
トロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含む、
いかなる適切な種類でもよい。ＣＳＧ遺伝子をコードす
るＤＮＡの少なくとも一部は、支持体に付着し、そして
その後、目的の組織から単離されたＲＮＡでもまたはＲ
ＮＡの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コピーでもよい解析物
とインキュベーションする。支持体結合ＤＮＡおよび解
析物の間のハイブリダイゼーションを、限定されるわけ
ではないが、解析物の放射能標識または蛍光標識、ある
いはハイブリッドを検出するよう設計された二次分子を
含む、いくつかの手段により、検出しそして定量化して
もよい。遺伝子発現レベルの定量化は、解析物由来のシ
グナルの強度を、既知の標準から決定されるものと比較
することにより、行ってもよい。標準は、標的遺伝子を
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、収量を定量化し、そしてその
後その要素を用いて標準曲線を生成することにより、得
てもよい。

【００２９】上記の試験は、多様な患者細胞、体液およ
び／または組織抽出物（ホモジェネートまたは可溶化組
織）、例えば組織生検および検死素材由来の試料に対
し、行ってもよい。本発明に有用な体液には、血液、
尿、唾液、またはいかなる他の体の分泌物またはその派
生物も含まれる。血液には、全血、血漿、血清、または
いかなる血液派生物を含んでもよい。

【００３０】

【実施例】本発明は、以下の実施例により、さらに説明
される。これらの実施例は、特定の態様に言及すること
により、もっぱら本発明を例示するためにのみ提供され
る。これらの例示は、本発明の特定の側面を例示する
が、限定を表現せず、または開示される発明を制限しな
い。実施例１：ＣＳＧ Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、カリ
フォルニア州パロアルトから入手可能なＬＩＦＥＳＥＱ
（登録商標）データベースの一部として以下の検索ツー
ルを用い、検索を行い、そしてＣＳＧを同定した： １．ライブラリー比較（１つのライブラリーを他の１つ
のライブラリーと比較する）は、腫瘍で発現され、そし
て正常組織に存在しないまたは正常組織で、より低いレ
ベルで発現されるクローンの同定を可能にする。 ２．サブセット化（ｓｕｂｓｅｔｔｉｎｇ）は、ライブ
ラリー比較と類似であるが、ライブラリーのプールで発
現され、そして第二のライブラリーのプールに存在しな
いまたは第二のライブラリーのプールで、より低いレベ
ルで発現されるクローンの同定を可能にする。 ３．転写画像化は、存在量に基づき、単一のライブラリ
ーまたはライブラリーのプールにおけるすべてのクロー
ンをリストアップする。その後、電子ノーザン（Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｎｉｃ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）を用い、個々のク
ローンを調べ、その構成要素ＥＳＴの組織供給源を決定
してもよい。 ４．タンパク質機能：Ｉｎｃｙｔｅは、既知のタンパク
質に対する相同性に基づき、タンパク質機能を持つ可能
性があるＥＳＴのサブセットを同定してきている。本デ
ータベースのいくつかの例には、転写因子およびプロテ
アーゼが含まれる。我々は、その構成要素ＥＳＴが疾患
特異性を示すクローンに関し、本データベースを検索す
ることにより、いくつかのリード遺伝子（ｌｅａｄ）を
同定した。

【００３１】電子サブトラクション、転写画像化および
タンパク質機能検索を用い、その構成要素ＥＳＴが、特
定の腫瘍由来のライブラリーでのみ、または該ライブラ
リーで、より頻繁に見られるクローンを同定した。各Ｅ
ＳＴが生じた場所を確かめることにより、個々の候補ク
ローンを詳細に調べた。

【００３２】表１：ＣＳＧ

【００３３】

【表１】

【００３４】別に詳細に記載される場合を除き、当業者
に周知でそして日常的な標準的技術を用い、以下の実施
例を行った。以下の実施例の日常的な分子生物学的技術
は、標準的な実験室マニュアル、例えばＳａｍｂｒｏｏ
ｋら， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ Ｌ
ＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第二版； Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハ
ーバー（１９８９）に記載されるように行ってもよい。実施例２：ＣＳＧ遺伝子発現の相対定量化 蛍光Ｔａｑｍａｎプローブを用いたリアルタイム定量的
ＰＣＲは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌ
クレアーゼ活性を利用した、定量化検出系である。該方
法は、５’レポーター色素および下流の３’消光色素で
標識された内部蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（Ｔａ
ｑｍａｎ）を使用する。ＰＣＲ中、Ｔａｑ ＤＮＡポリ
メラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、レポーター
を放出し、その蛍光をその後、モデル７７００配列検出
系（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米
国カリフォルニア州フォスターシティー）のレーザー検
出装置により、検出してもよい。

【００３５】内因性コントロールの増幅を用い、反応に
添加された試料ＲＮＡの量を標準化し、そして逆転写酵
素（ＲＴ）効率を正規化する。シクロフィリン、グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ
Ｈ）または１８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のいず
れかをこの内因性コントロールとして用いる。調べたす
べての試料の間の相対定量化を計算するため、１つの試
料に関する標的ＲＮＡレベルを、比較結果の基本として
用いる（基準値（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ））。「基準
値」に対し相対的な定量化は、標準曲線法または比較法
を用い、得ることが可能である（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅ
ｔｉｎ ＃２： ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検
出系）。

【００３６】ＣＳＧの組織分布、並びに正常および腫瘍
組織におけるレベルを評価するため、正常組織、腫瘍組
織から、そして腫瘍および対応正常組織から、総ＲＮＡ
を抽出した。続いて、逆転写酵素で第一鎖ｃＤＮＡを調
製し、そしてＣＳＧに特異的なプライマーおよびＴａｑ
ｍａｎプローブを用い、ポリメラーゼ連鎖反応を行っ
た。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００配列検出装置を用
い、結果を解析した。無名数（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｎｕ
ｍｂｅｒ）は、基準値に比較したＣＳＧの相対発現レベ
ルである。

【００３７】比較例 比較のため、診断マーカーＰＳＡ（前立腺特異的抗原）
およびＰＬＡ２（ホスホリパーゼＡ２）をコードする遺
伝子に関する類似のｍＲＮＡ発現解析を行った。ＰＳＡ
は、臨床実験室で現在入手可能な、唯一の癌スクリーニ
ングマーカーである。一連の正常組織のプールを解析し
た際、ＰＳＡは非常に高いレベルで前立腺に発現し、乳
房および精巣では発現が非常に低かった。１４の異なる
組織由来の５５以上の対応する試料を解析したデータに
より、正常組織試料で見られる組織特異性が確認され
た。前立腺組織の１２の対応する試料に関し、癌および
正常隣接組織におけるＰＳＡ発現を比較した。ＰＳＡの
相対レベルは、１０の癌試料において、より高かった
（８３％）。最近得られた臨床データにより、前立腺癌
の病期が後期であることの病期決定マーカーとしてＰＬ
Ａ２を利用することが支持される。本明細書に記載され
るｍＲＮＡ発現データは、解析した１２の前立腺対応試
料のうち８つでｍＲＮＡの過剰発現を示した（６６
％）。ＰＬＡ２は、小腸、前立腺、肝臓、および膵臓
で、高レベルのｍＲＮＡ発現を示した。

【００３８】配列番号３；クローン番号１３４１７０
１；遺伝子番号２９６３４（Ｃｌｎ１０６）の測定 表２に示される無名数は、１２の正常な異なる組織にお
けるＣｌｎ１０６（配列番号３）の相対発現レベルであ
る。すべての値は、正常精巣（基準値）に比較したもの
である。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手可能なプ
ールであり、異なる個体由来の特定の組織の試料をプー
ルすることにより生じたものである。

【００３９】表２：プール試料におけるＣｌｎ１０６発
現の相対レベル

【００４０】

【表２】

【００４１】表２の相対発現レベルは、ＣＳＧ Ｃｌｎ
１０６（配列番号３）に関し、ｍＲＮＡ発現が、前立腺
（１６）に比較し、正常上行結腸のプール（１１０）で
６倍以上高いことを示す。相対発現レベル１の、基準値
である精巣は、Ｃｌｎ１０６（配列番号３）のｍＲＮＡ
を発現する唯一の他の組織である。これらの結果は、本
ＣＳＧのｍＲＮＡ発現は、結腸に非常に特異的であるこ
とを立証する。

【００４２】表２における無名数は、異なる個体由来の
特定の組織の試料のプールを解析して得た。これらを、
表３−５における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡ
から生じた無名数と比較することは不可能である。

【００４３】表３−５における無名数は、５７対の対応
する試料におけるＣｌｎ１０６（配列番号３）の相対発
現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に
比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試
料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正常隣接
試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。

【００４４】表３−５：個々の試料におけるＣｌｎ１０
６発現の相対レベル

【００４５】

【表３】

【００４６】

【表４】

【００４７】

【表５】

【００４８】０＝陰性 対応試料を解析した際、結腸で発現レベルがより高く、
本組織に関し高い度合いの組織特異性が示された。これ
らの結果により、一連の正常プール試料で得られた組織
特異性結果（表２）が確認される。さらに、同一個体由
来の癌試料および同種同系正常隣接組織におけるｍＲＮ
Ａ発現レベルを比較した。本比較は、癌病期に関する特
異性の目安を提供する（例えば正常隣接試料に比較した
癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現レベル）。表３
−５は、それぞれの正常隣接組織と比較した１５の結腸
癌組織（結腸試料＃１、２、３、４、５、６、８、９、
１０、１２、１３、１６、２０、２１、および２２）に
おけるＣｌｎ１０６（配列番号３）の過剰発現を示す。
試験した結腸対応試料の６５％に関し、癌組織における
過剰発現が見られる（総数２３の結腸対応試料）。対応
試料Ｐａｎ ７１ＸＬは、膵臓における続発癌であり、
該個体における原発癌は十二指腸癌であった。

【００４９】要するに、高レベルの組織特異性に加え、
試験した結腸対応試料の６５％でのｍＲＮＡ過剰発現
は、ＣＳＧ Ｃｌｎ１０６（配列番号３）が、結腸癌の
診断マーカーであることを立証する。

【００５０】配列番号４；クローン番号８１６２５７；
遺伝子番号４０６４５２（Ｃｌｎ１０７）の測定 表６に示される無名数は、１２の正常な異なる組織にお
けるＣＳＧ Ｃｌｎ１０７（配列番号４）の相対発現レ
ベルである。すべての値は、正常小腸（基準値）に比較
したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入手
可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の試
料をプールすることにより生じたものである。

【００５１】表６：プール試料におけるＣｌｎ１０７発
現の相対レベル

【００５２】

【表６】

【００５３】表６の相対発現レベルは、ＣＳＧ Ｃｌｎ
１０７（配列番号４）のｍＲＮＡ発現が、次に高い発現
組織（腎臓の０．２）に比較し、正常上行結腸のプール
（３．２）で１０倍以上高く、小腸（１）で５倍高く、
そして胃（０．３）で１．５倍高いことを示す。解析さ
れたプール組織試料のうち７つは陰性であり、そして前
立腺は、Ｃｌｎ１０７（配列番号４）に関し０．１の相
対発現を示した。これらの結果は、Ｃｌｎ１０７ ｍＲ
ＮＡ発現は、結腸、小腸に非常に特異的であり、そして
より低い度合いで胃に特異的であることを立証する。

【００５４】表６における無名数は、異なる個体由来の
特定の組織の試料のプールを解析して得た。これらを、
表７−９における単一の個人の組織試料から得たＲＮＡ
から生じた無名数と比較することは不可能である。

【００５５】表７−９における無名数は、５７対の対応
する試料におけるＣｌｎ１０７（配列番号４）の相対発
現レベルである。すべての値は、正常精巣（基準値）に
比較したものである。対応する対は、特定の組織の癌試
料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正常隣接
試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。

【００５６】表７−９：個々の試料におけるＣｌｎ１０
７発現の相対レベル

【００５７】

【表７】

【００５８】

【表８】

【００５９】

【表９】

【００６０】０＝陰性 対応試料を解析した際、結腸、胃、および小腸で発現レ
ベルがより高く、結腸組織に関し高い度合いの組織特異
性が示された。これらの結果により、一連の正常プール
試料で得られた組織特異性結果（表６）が確認される。
さらに、同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接
組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較
は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正
常隣接試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮ
Ａ発現レベル）。表７−９は、それぞれの正常隣接組織
と比較した１１の結腸癌組織（結腸試料＃５、７、１
０、１１、１２、１３、１５、１７、１８、２０、およ
び２１）におけるＣｌｎ１０７（配列番号４）の過剰発
現を示す。試験した結腸対応試料の４８％に関し、癌組
織における過剰発現が見られる（総数２３の結腸対応試
料）。対応試料Ｐａｎ７１ＸＬは、膵臓における続発癌
であり、該個体における原発癌は十二指腸癌であった。

【００６１】要するに、高レベルの組織特異性に加え、
試験した結腸、胃、および小腸対応試料のほぼ半数での
ｍＲＮＡ過剰発現は、ＣＳＧ Ｃｌｎ１０７（配列番号
４）が、結腸癌の診断マーカーであることを立証する。

【００６２】配列番号５；クローン番号７７５１３３；
遺伝子番号２４５０８（Ｃｌｎ１０８）の測定 表１０に示される無名数は、１２の正常な異なる組織に
おけるＣＳＧ Ｃｌｎ１０８（配列番号５）の相対発現
レベルである。すべての値は、正常小腸（基準値）に比
較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入
手可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の
試料をプールすることにより生じたものである。

【００６３】表１０：プール試料におけるＣｌｎ１０８
発現の相対レベル

【００６４】

【表１０】

【００６５】表１０の相対発現レベルは、ＣＳＧ Ｃｌ
ｎ１０８（配列番号５）のｍＲＮＡ発現が、解析したい
かなる他の組織における発現レベルと比較しても、正常
上行結腸のプール（２８４６．５）で１０倍以上高く、
そして胃（９９８１．２）でほぼ１０倍高いことを示
す。これらの結果は、本ＣＳＧのｍＲＮＡ発現もまた、
結腸および胃に非常に特異的であることを立証する。

【００６６】表１０における無名数は、異なる個体由来
の特定の組織の試料のプールを解析して得た。これら
を、表１１−１３における単一の個人の組織試料から得
たＲＮＡから生じた無名数と比較することは不可能であ
る。

【００６７】表１１−１３における無名数は、５７対の
対応する試料におけるＣｌｎ１０８（配列番号５）の相
対発現レベルである。すべての値は、正常小腸（基準
値）に比較したものである。対応する対は、特定の組織
の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正
常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。

【００６８】表１１−１３：個々の試料におけるＣｌｎ
１０８発現の相対レベル

【００６９】

【表１１】

【００７０】

【表１２】

【００７１】

【表１３】

【００７２】０＝陰性 対応試料を解析した際、結腸および胃で発現レベルがよ
り高く、これら２つの組織に関し高い度合いの組織特異
性が示された。これらの結果により、正常プール試料で
得られた組織特異性結果（表１０）が確認される。さら
に、同一個体由来の癌試料および同種同系正常隣接組織
におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本比較は、癌
病期に関する特異性の目安を提供する（例えば正常隣接
試料に比較した癌試料における、より高いｍＲＮＡ発現
レベル）。表１１−１３は、それぞれの正常隣接組織と
比較した１３の結腸癌組織（結腸試料＃１、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１８、２１、お
よび２２）におけるＣＳＧＣｌｎ１０８（配列番号５）
の過剰発現を示す。試験した結腸対応試料の５６％に関
し、癌組織における過剰発現が見られる（総数２３の結
腸対応試料）。対応試料Ｐａｎ ７１ＸＬは、膵臓にお
ける続発癌であり、該個体における原発癌は十二指腸癌
であった。

【００７３】要するに、高レベルの組織特異性に加え、
試験した結腸、胃、および小腸対応試料の半数以上での
ｍＲＮＡ過剰発現は、本ＣＳＧ、Ｃｌｎ１０８（配列番
号５）もまた、結腸癌の診断マーカーであることを立証
する。

【００７４】配列番号７；クローン番号２３４８１２
２；遺伝子番号２３３７１（Ｃｌｎ１０９）の測定 表１４に示される無名数は、１２の正常な異なる組織に
おけるＣＳＧ Ｃｌｎ１０９（配列番号７）の相対発現
レベルである。すべての値は、正常卵巣（基準値）に比
較したものである。これらのＲＮＡ試料は、商業的に入
手可能なプールであり、異なる個体由来の特定の組織の
試料をプールすることにより生じたものである。

【００７５】表１４：プール試料におけるＣｌｎ１０９
発現の相対レベル

【００７６】

【表１４】

【００７７】表１４の相対発現レベルは、ＣＳＧ Ｃｌ
ｎ１０９（配列番号７）のｍＲＮＡ発現が、解析したい
かなる他の組織における発現レベルと比較しても、正常
小腸のプール（６２６．４）で５倍以上高いことを示
す。これらの結果は、Ｃｏｎ１０９（配列番号７）ｍＲ
ＮＡ発現は、小腸に非常に特異的であることを立証す
る。

【００７８】表１４における無名数は、異なる個体由来
の特定の組織の試料のプールを解析して得た。これら
を、表１５−１６における単一の個人の組織試料から得
たＲＮＡから生じた無名数と比較することは不可能であ
る。

【００７９】表１５−１６における無名数は、５３対の
対応する試料におけるＣｌｎ１０９（配列番号７）の相
対発現レベルである。すべての値は、正常卵巣（基準
値）に比較したものである。対応する対は、特定の組織
の癌試料由来のｍＲＮＡおよび同一個体の同一組織の正
常隣接試料由来のｍＲＮＡにより、形成される。

【００８０】表１５−１６：プール試料におけるＣｌｎ
１０９発現の相対レベル

【００８１】

【表１５】

【００８２】

【表１６】

【００８３】０＝陰性 対応試料を解析した際、小腸、結腸および胃で発現レベ
ルがより高く、これら３つの結腸組織に関し高い度合い
の組織特異性が示された。これらの結果により、正常プ
ール試料で得られた組織特異性結果（表１４）が確認さ
れる。さらに、同一個体由来の癌試料および同種同系正
常隣接組織におけるｍＲＮＡ発現レベルを比較した。本
比較は、癌病期に関する特異性の目安を提供する（例え
ば正常隣接試料に比較した癌試料における、より高いｍ
ＲＮＡ発現レベル）。表１５−１６は、それぞれの正常
隣接組織と比較した１５の結腸癌組織（結腸試料＃１、
２、３、６、７、８、９、１２、１３、１５、１６、１
７、１９、２０、および２１）におけるＣＳＧ Ｃｌｎ
１０９（配列番号７）の過剰発現を示す。試験した結腸
対応試料の６８％に関し、癌組織における過剰発現が見
られる（総数２２の結腸対応試料）。対応試料Ｐａｎ
７１ＸＬは、膵臓における続発癌であり、該個体におけ
る原発癌は十二指腸癌であった。

【００８４】要するに、高レベルの組織特異性に加え、
試験した結腸、胃および小腸対応試料の半数以上でのｍ
ＲＮＡ過剰発現は、ＣＳＧ Ｃｌｎ１０９（配列番号
７）が、結腸癌の診断マーカーであることを立証する。
Ｃｌｎ１０９の読み枠によりコードされるアミノ酸配列
は、配列番号１０に示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヤン，フェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92128, サン・ディエゴ，カミニト・カンティレ ナ 18375，アパートメント 204 (72)発明者 スン，ヨンミン アメリカ合衆国カリフォルニア州92128, サン・ホセ，サウス・ウィンチェスタ ー・ブールヴァード 869，アパートメ ント 260 (56)参考文献 特表2001−522238（ＪＰ，Ａ) 特表2002−512513（ＪＰ，Ａ) 国際公開96／039419（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/574 C12Q 1/68 G01N 33/50

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 患者の試料において結腸癌の存在をアッ
   セイするための方法であって、 （ａ）患者から得た細胞、組織または体液の試料におけ
   るＣＳＧのレベルを測定し；そして （ｂ）ＣＳＧの測定レベルを、コントロールから得た細
   胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルと比
   較するが、その際コントロールにおけるＣＳＧレベルに
   対する患者におけるＣＳＧの測定レベルの増加が結腸癌
   の存在と関連することを含み、そしてＣＳＧが配列番号
   ３、５又は７の何れかを含む、前記方法。
2. 【請求項２】 患者の試料において転移性結腸癌をアッ
   セイするための方法であって、 （ａ）患者から得た細胞、組織または体液の試料におけ
   るＣＳＧのレベルを測定し；そして （ｂ）ＣＳＧの測定レベルを、コントロールから得た細
   胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルと比
   較するが、その際コントロールにおけるＣＳＧレベルに
   対する患者におけるＣＳＧの測定レベルの増加が転移し
   た癌と関連することを含み、そしてＣＳＧが配列番号
   ３、５又は７の何れかを含む、前記方法。
3. 【請求項３】 結腸癌を患う患者の試料において結腸癌
   を病期決定するための方法であって、 （ａ）患者から得た細胞、組織または体液の試料におけ
   るＣＳＧのレベルを測定し；そして （ｂ）ＣＳＧの測定レベルを、コントロールから得た細
   胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルと比
   較するが、その際コントロールにおけるＣＳＧレベルに
   対する患者におけるＣＳＧの測定レベルの増加が進行し
   ている癌と関連し、そしてコントロールにおけるＣＳＧ
   レベルに対するＣＳＧの測定レベルの減少が後退または
   緩解している癌と関連することを含み、そしてＣＳＧが
   配列番号３、５又は７の何れかを含む、前記方法。
4. 【請求項４】 転移の開始に関して患者の試料において
   結腸癌をモニターする方法であって、 （ａ）転移したことがわかっていない結腸癌患者から得
   た細胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベル
   を測定し；そして （ｂ）ＣＳＧの定期的な測定レベルを、コントロールか
   ら得た細胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレ
   ベルと比較するが、その際コントロールにおけるＣＳＧ
   レベルに対する患者におけるＣＳＧのいかなる１つでも
   よい定期的な測定レベルの増加が転移している癌と関連
   することを含み、そしてＣＳＧが配列番号３、５又は７
   の何れかを含む、前記方法。
5. 【請求項５】 結腸癌を有する患者の試料において結腸
   癌の病期の変化をモニターする方法であって、 （ａ）患者から得た細胞、組織または体液の試料におけ
   るＣＳＧのレベルを測定し；そして （ｂ）ＣＳＧの測定レベルを、コントロールの同じ細
   胞、組織または体液の試料におけるＣＳＧのレベルと比
   較するが、その際コントロールにおけるＣＳＧレベルに
   対するＣＳＧのいかなる１つでもよい定期的な測定レベ
   ルの増加が、病期が進行している癌と関連し、そしてコ
   ントロールにおけるＣＳＧレベルに対するＣＳＧのいか
   なる１つでもよい定期的な測定レベルの減少が病期の後
   退または緩解している癌と関連することを含み、そして
   ＣＳＧが配列番号３、５又は７の何れかを含む、前記方
   法。