DE102004037860A1

DE102004037860A1 - Turmormarker zur Diagnose von Karzinomen und/oder davon abstammender Metastasen

Info

Publication number: DE102004037860A1
Application number: DE102004037860A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. Brückl; Axel Dr. Wein; Marc Dr. Munnes
Original assignee: Friedrich Alexander Universitaet Erlangen Nuernberg
Current assignee: Friedrich Alexander Universitaet Erlangen Nuernberg
Priority date: 2004-08-04
Filing date: 2004-08-04
Publication date: 2006-03-16
Also published as: EP1776475A2; US20080311567A1; WO2006015742A3; WO2006015742A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (i) zur Erkennung eines Karzinoms, insbesondere eines Adenokarzinoms, bevorzugterweise eines gastrointestinalen Karzinoms und besonders bevorzugt eines kolorektalen Karzinoms, (ii) zur Prädiktion von Metastasen, vorzugsweise von Lebermetastasen, in Abhängigkeit eines primären Kolonkarzinoms und/oder (iii) zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil-haltige Chemotherapie, umfassend die Bestimmung eines Genexpressionsprofils von 120 Markergenen oder einer Auswahl daraus.

Description

Die Erfindung umfasst ein Verfahren (i) zur Erkennung eines Karzinoms, insbesondere eines Adenokarzinoms, bevorzugterweise eines gastrointestinalen Karzinoms und besonders bevorzugt eines kolorektalen Karzinoms, (ii) zur Prädiktion von Metastasen, vorzugsweise von Lebermetastasen, in Abhängigkeit eines primären Kolonkarzinoms und/oder (iii) zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil-haltige Chemotherapie umfassend die Bestimmung eines Genexpressionsprofils von 120 Markergenen oder einer Auswahl daraus. Die 120 Gene sind durch ihre Sequenzen wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 181 definiert. Ebenfalls offenbart werden Kits zur Durchführung des erfinderischen Verfahrens und diagnostische Kits. Weitere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Verwendung der hierin offenbarten Markergene und/oder der hierin offenbarten Kombination von Markergenen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung nicht-menschlicher Säuger oder kultivierter Zellen daraus, deren Erbgut in Bezug auf eines oder mehrere der in dieser Erfindung ausgeführten Gene verändert wurde. Die nicht-menschlichen Säuger oder die kultivierten Zellen, deren Erbgut verändert wurde, können insbesondere für Tests alternativer Therapien oder Therapeutika in Bezug auf primäre kolorektale Karzinome und daraus abgeleiteter Metastasen eingesetzt werden.

Kolorektale Karzinome stellen die dritthäufigste Tumorentität in westlichen Ländern dar. In Deutschland erkranken ca. 50.000 Patienten pro Jahr an kolorektalen Karzinomen. Jährlich treten bei etwa 20.000 Patienten mit kolorektalem Karzinom synchron oder metachron Lungen- oder Lebermetastasen auf. In Deutschland ist bei ca. 4.000 der 20.000 Patienten mit Fernmetastasen eine kurative Metastasenresektion (R0), die mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von ca. 30% einhergeht, technisch möglich.

Bei den übrigen 16.000 Patienten ist aus verschiedensten Gründen (multinodulär, ungünstige Lokalisation an Gefäßen und Gallengängen, extrahepatisch) eine Resektion nicht möglich. In diesen Fällen sind palliative Therapieoptionen indiziert. Ziel der palliativen Behandlung ist neben der Aufrechterhaltung einer guten Lebensqualität die Verlängerung der Überlebenszeit. Derzeit steht eine Vielzahl von Therapieregimen auf der Grundlage von 5-FU/Folinsäure zur Verfügung. Ohne Hinzunahme weiterer Substanzen kann ein Ansprechen von etwa 40% erzielt werden. Die Kombination von 5-FU/Folinsäure mit Irinotecan oder Oxaliplatin führte in mehreren Studien zu einer Verbesserung der Ansprechrate auf bis zu 50% der behandelten Patienten. Darüber hinaus werden derzeit weitere Substanzen bei der palliativen Therapie des kolorektalen Karzinoms überprüft, wie etwa Antikörper gegen VEGR und EGF-R oder sog. "small molecules" gegen die Tyrosinkinase-Domäne von VEGF-R oder EGF-R. Eine endgültige Wertigkeit dieser neuen Substanzen bleibt zunächst weiteren Untersuchungen im Rahmen präklinischer Testung und klinischen Phase I-III Studien vorbehalten. Ein allgemein akzeptiertes Standardregime der Erstbehandlung kann aufgrund der Vielzahl von relevanten Studienergebnissen mit unterschiedlichen Regimen nicht gegeben werden.

Das Ansprechen auf die Therapie wird nach WHO Richtlinien (World Health Organization. Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment. WHO Offset Publication No. 48. Geneva: WHO 1979) bewertet. Als „Responder" werden Patienten bezeichnet, die in bildgebenden Verfahren eine komplette (CR, complete remission) oder eine partielle (PR, partial remission) Remission aufweisen, als „Non-Responder" diejenigen Patienten, die einen stabilen (SD, stable disease) oder progredienten (PD, progressive disease) Tumorverlauf in der Bildgebung zeigen. Das Ansprechen auf die Chemotherapie korreliert beim kolorektalen Karzinom mit dem Überleben der Patienten. Faktoren, die das Ansprechen auf die Chemotherapie vorhersagen können, werden als prädiktive Marker bezeichnet. Basierend auf prädiktiven Markern könnte eine individualisierte Therapie zur Verfügung gestellt werden. Trotz vielfältiger Untersuchungen auf diesem Gebiet sind die bisher in der Literatur beschriebenen molekularen prädiktiven Marker beim metastasierten kolorektalen Karzinom nicht ausreichend.

Watson (2003) Clin. Sci. 104, 537–545 zeigt in einer Genotypisierungs-Studie, dass Polymorphismen des Apolipoprotein E-Gens das Risiko an einem kolorektalen Karziniom zu erkranken beeinflussen. Laut Untersuchung, haben Personen mit einem ε2/ε2-Genotyp im Unterschied zu dem verbreitet auftretenden ε3/ε3-Genotyp ein erhöhtes Risiko an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken, wobei eine deutliche Geschlechtsspezifität in Bezug auf die Erkrankung bestimmt wird. Sladek (2002) Cancer Chemother. Pharmacol. 49, 309–321 und Sreerama (2001) Cancer Chemother. Pharmacol. 47, 255–362 weisen auf die Möglichkeit hin, durch die Bestimmung des zellulären Expressionsniveaus der Aldehyd-Dehydrogenasen ALDH1A1 und ALDH3A1 das Ansprechen von Brustkrebs auf eine cyclophosphamid (oder andere Oxazaphosphorine z.B.: Ifosfamid) -basierte Chemotherapie zu prädizieren. Kemmner (1994) Clin. Exp. Metastasis 12, 245–254 stellt dar, dass in humanen kolorektalen Tumoren die Expression von zwei Sialyltransferasen gegenüber normalem Gewebe erhöht sei, und dass daher eine quantitative Bestimmung der spezifischen Sialyltransferase-Aktivität zur Detektion und Überwachung von Kolonkarzinomen geeignet sein könne. Sotiropoulou (2002) Mol. Med. 8, 42–55 identifiziert ein neues Sialyltransferase-Gen (SIATL1), dessen Expression in humanen Brusttumorgewebe-Zelllinien im Vergleich zu normalen Brustgewebe-Zelllinien herunterreguliert ist. Die anormale Expression und enzymatische Aktivität von Sialyltransferasen in Tumorzellen führt zur Bildung von tumor-assozierten Kohlenhydrat-Antigenen, welche insbesondere in der Immuntherapie eingesetzt werden können. Dolnick (1996) Advan. Enzyme Regul. 36, 165–180 und Dolnick (1996) Cancer Res. 56, 3207–3210 weisen zwei Genprodukte des rThymidylate Synthase-Gens nach, die als rTSα und rTSβ bezeichnet werden. In den beiden Zelllinien H630-1 und H630-10, wird eine veränderte Aktivität der Thymidylate Synthase festgestellt. Maxwell (2003) Cancer Res. 63, 4602–4606 zeigt bei 619 Genen mittels DNA-Mikrochip-Technologie eine Veränderung der Genexpression in Zelllinien auf. Die Untersuchungen wurden an MCF-7-Brustkrebszellen, sowie an H630- und H630-R10-Kolonkarzinom-Zelllinien durchgeführt. Ein expressionsaktivierender Effekt von 5-FU und gesteigerte Expression des Spermin/Spermidin Acetyl-Transferase Gens, Annexin II-Gens, des Thymosin β-10-Gens, des Chaperonin-10 Gens und besonders des MAT-8 Gens werden dargestellt. Biran (1986) Clin. Pathol. 39, 794–797 misst in einer Studie an 160 Lungenkrebs-Patienten die Konzentration von Serum Amyloid A und weist darauf hin, dass eine aktive Krankheit mit einem hohen Titer im Vergleich zum nicht-aktiven Stadium der Krankheit verknüpft ist. Serienuntersuchungen ergaben eine gute Übereinstimmung zwischen der Veränderung der Serum Amyloid A-Konzentration und dem klinischen Verlauf. Bruno (2003) Clin. Cancer Res. 9, 1077–1082 untersucht 180 Lungenkrebs-Patienten (NSLCL) und stellt dar, dass α₁-saures Glycoprotein ein Protein zur Vorhersage von Behandlungseffekten in Lungenkrebs-Patienten sei. O'Hanlon (2002) Anticancer Res. 22, 1289–1293 weist in einer Studie zu Akute Phase Proteinen die Konzentrationen von C-reaktivem Protein und von Serum Amyloid A in 92 Patienten mit Brustkrebs und 31 Patienten mit gutartiger Brustgewebeveränderung nach. Die Serienuntersuchungen ergaben signifikant erhöhte Konzentrationen der beiden Proteine in Patienten im UICC Stadium IV und insbesondere in T4 ulzerierenden Tumoren. Simpson (1995) Clin. Exp. Immunol. 99, 143–147 behandelte 24 Patienten, die an metastasierenden kolorektal Karzinomen litten mit einer Kombinationstherapie bestehend aus rekombinantem Interleukin 2 (rIL-2), gefolgt von 5-Fluorouracil und Folinsäure. Der Therapieverlauf wurde durch Messungen der Konzentrationen von C reaktivem Protein, Retinol Bindungsprotein, Alpha 1-Antitrypsin, Transferrin und Albumin untersucht. Lediglich 7 der 24 Patienten sprachen auf die rIL-2-basierte Therapie an. Glojnaric (2001) Clin. Chem. Lab. Med. 39, 129–133 bestimmte zu 12 Zeitpunkten (vor der Operation, nach der Operation und vor jedem der 9 nicht näher spezifizierten Chemotherapie Zyklen) bei 67 Patienten mit kolorektalem Karzinom die Konzentrationen von Serum Amyloid A Protein, von C reaktiven Protein, von α₁-Antichymotrypsin und von α₁-saures Glycoprotein. Von den vier untersuchten Akute Phase Proteinen erwies sich das Serum Amyloid A Protein als das mit der höchsten Spezifität und Sensitivität. Der Autor schlägt daher lediglich das Serum Amyloid A Protein als verlässlichen, nicht-spezifischen Tumormarker für kolorektale Karzinome im klinischen Alltag vor. McMillan (2003) Br. J. Surg. 90, 215–219 untersuchte die Veränderung der Konzentration des C reaktiven Proteins in 174 Patienten mit kolorektalem Karzinom vor und nach der Resektion. Der Autor stellte fest, dass die Aussagekraft dieses Parameters gering ist. Koeffler (2003) Clin. Cancer Res. 9, 1–9 beschreibt, dass es unterschiedliche Ansichten über den Zusammenhang des Peroxisome proliferative activated receptor γ (PPARγ) in Verbindung mit Krebs gibt. Das Gen wird nur durch die Bindung eines Liganden aktiviert. Einige Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass PPARγ als Tumor-Suppressor fungiert, wohingegen andere Forschungsergebnisse aus Mausmodellen dafür sprechen, dass unter bestimmten Bedingungen PPARγ Liganden die Bildung von Krebs fördern. Gupta (2002) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283, G266–G269 ging der Frage nach, ob eine Aktivierung des Peroxisome proliferative activated receptor γ (PPARγ) das Wachstum von kolorektalen Karzinomen beschleuningt oder verlangsamt, da eine Aktivierung des Peroxisome proliferative activated receptor γ (PPARγ) durch Ligandenbindung die Proliferation von kultivierten kolorektalen Krebszellen oder von kolorektalen Karzinomen im Mausmodell negativ beeinflusst. Mouawad (2002) Melanoma Res. 12, 343–348 bestimmte in 81 Patienten mit metastasierendem, malignen Melanom und 50 normalen Freiwilligen das Expressionsniveau der Caspase-1, um eine Korrelation zwischen diesem, an apoptotischen Prozessen beteiligten Enzym und dem pathologischen Zustand des Patienten herzustellen. Den Patienten wurde Cisplatin, rekombinantes Interleukin-2 und α-Interferon verabreicht. Das durchschnittliche Caspase-1-Niveau der Melanom-Patienten lag deutlich über dem der Kontrollgruppe. De Vita (1993) Eur. J. Cancer 29, 887–893 beschreibt, dass einige Hox-Gene in primären Kolontumoren und davon abstammenden hepatischen Metastasen ein erhöhtes Expressionsniveau aufweisen, was einen Zusammenhang dieser Gene mit Kolontumorwachstum nahe legt. Kawazoe (2002) Develop. Growth Differ. 44, 77–84 wies durch in situ-Hybridisierungs-studien die Expression verschiedener Hox-Gene zum Zeitpunkt 12,5 Tage postembryonal im Darm der Maus nach. Für die Gene der HoxD-Gene in Bezug auf die Expression im Kolon wiesen sie eine Expression von HoxD-4, HoxD-8 und HoxD-9 nach. Nunes (2003) Pesqui. Odontol. Bras. 17, 94–98 stellte aus der aktuellen Literatur die Ergebnisse zu der These zusammen, dass es viele Zusammenhänge zwischen normaler Entwicklung und Tumorbildung gibt. Cillo (1994–95) Invasion Metastasis 14, 38–49 untersuchte das Expressionsmuster der Hox-Gene in gesunden humanen Organen, in Nieren- und Kolontumoren, Kleinzelligen Bronchialkarzinomen (SCLC) und metastasierenden Varianten davon. Er kommt zu dem Ergebnis, dass Hox-Gene als ein Netzwerk zur Transkriptionsregulation fungieren und an den Prozessen der Zell-Zell-Kommunikation während der normalen Morphogenese beteiligt sind. Wang (2002) Cancer Letters 179, 71–77 verglich das Expressionsniveau des CASK- und des Reelin-Gens in humanen Magen-, Kolon- und Ösophaguskarzinomen mittels RT-PCR, immunhistoche-mischen Methoden und per Western Blot. In 87,5 % der untersuchten Ösophaguskarzinome wurde eine erhöhte Expression des CASK- und des Reelin-Gens im Vergleich zu gesundem Ösophagusgewebe festgestellt. In 50 % der Magenkarzinome und 64,3 % der Kolonkarzinome wurde eine Steigerung des CASK-Expressionsniveaus gegenüber normalem Gewebe nachgewiesen, wohingegen der Reelin-Level keine Veränderung aufwies. Der Autor kommt zu dem Ergebnis, dass das CASK-Gen in die Tumorgenese des Ösophagus involviert ist, indem es die Transkription des Reelin-Gens beeinflusst. Dennoch ist die exakte Funktion des CASK- und des Reelin-Gens und deren Interaktion untereinander nach wie vor unklar. Kuno (1997) JBC 272, 556–562 berichtet von ADAMTS-1 aus der ADAM Genfamilie. Untersuchungen ergaben, dass die intravenöse Verabreichung von Lipopolysacchariden bei Mäusen die Transkription des ADAMTS-1-Gens selektiv in Niere und Herz aktivierte. Aus den Ergebnissen schlossen die Autoren, dass das ADAMTS-1-Gen an verschiedenen Entzündungsprozessen, sowie an der Ausbildung von Tumorkachexieen beteiligt sei. Iruela-Arispe (2003) Ann. NY Acad. Sci. 995, 183–190 isolierte eine sekretorische Metalloproteinase (METH1/ADAMTS1) und zeigten, dass sie in vitro das Wachstum von Endothelzellen unterbindet und in vivo die, durch Wachstumsfaktoren ausgelöste neovaskuläre Antwort blockiert. Die Autoren fanden Hinweise dafür, dass zwei Domänen des Proteins benötigt werden, um die antiangiogene/antitumor Aktivität von ADAMTS1 auszubilden. Rathnakumar (2000) Indian J. Cancer. 37, 23–26 weist darauf hin, dass eine Vielzahl an biochemischen Tests zur Diagnose von Lebermetastasen vor und nach einer Operation durchgeführt wurden. Durch die kürzlich eingeführten hoch auflösenden bildgebenden Verfahren, wie Computertomographie oder Ultrasonographie, hat der Wert dieser biochemischen Methoden jedoch abgenommen. Es wurden verschiedene biochemische Marker zur Identifizierung von Lebermetastasen vorgeschlagen und der Autor spricht sich in seiner Studie für die Bestimmung des 5'-Nukleotidase-Gehalts aus, da er dieses Gen als sensitivsten Marker für Lebermetastasen ansieht. Eroglu (2000) Med Oncol. 17, 319–324 ist der Auffassung, dass zur Charakterisierung von kolorektalen Tumoren viel Augenmerk auf enzymatische Studien gelegt wurde, jedoch wenig über den Zusammenhang zwischen dem Level von Schlüsselenzymen des Purin-Nukleotid-Signalwegs und einigen klinischen und biologischen Indikatoren der Invasivität und Aggression von Tumor bekannt ist. In seiner Studie hat der Autor den Gehalt der Adenosin Deaminase (ADA) und der 5'-Nukleotidase (5'-NT) in gesundem und Tumorgewebe von 38 Patienten mit kolorektalen Karzinomen bestimmt. Das Ergebnis der Studie war, dass der Enzym-Gehalt im Primärtumor deutlich über dem normaler Mucosa lag. Galmarini (2002) Brit. J. Haematol. 117, 860–868 untersuchte bei akuter myeloischer Leukämie (AML) den Resistenzmechanismus auf Cytarabin. Er stellte fest, dass die Expression von 5'-Nukleotidase, hENT1 und DNA Polymerase α zum Zeitpunkt der Diagnose die Cytarabin-Resistenz in Patienten mit akuter myeloider Leukämie verursacht. Wiksten (2003) Oncology 64, 245–250 untersuchte die Expression von Tenascin-C im Bindegewebe von 314 Magenkarzinom-Patienten in einer immunhistochemischen Studie. Tenascin-C ist ein hexameres, extrazelluläres Matrix-Glykoprotein, das während der embryonalen Entwicklung und bei proliferativen Prozessen, wie der Wundheilung oder Tumorgenese exprimiert wird. Der Autor fand heraus, dass dem Anschein nach die Tenascin-C-Expression mit der Überlebensrate von Patienten mit Magenkrebs korreliert, aber keine signifikante prognostische Information darstellt. Riedl (1995) Int. J Cancer 64, 65–69 bestimmte in einer Studie mit 118 Patienten mit kolorektalem Karzinom und einer Kontrollgruppe von 51 gesunden Personen den Serumgehalt an Tenascin. Es zeigte sich, dass Patienten mit kolorektalen Karzinomen einen signifikant höheren Serumspiegel an Tenascin aufwiesen, als die Kontrollgruppe. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass in Patienten mit Fernmetastasen der Serumspiegel an Tenascin deutlich über dem von Patienten ohne Fernmetastasen lag. Emoto (2001) Cancer 92, 1419–1426 untersuchte in einer Studie die Korrelation der Überexpression von Annexin II und Tenascin-C in kolorektalen Karzinomen. Mit immunhistochemischen Methoden maß er die Expression beider Gene in 105 primären kolorektalen Tumoren. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl Annexin II, als auch Tenascin-C in fortgeschrittenen kolorektalen Karzinomen überexprimiert werden. Gu (2004) Int. J. Oncol 24, 671–678 ging in einer Studie der Frage nach, ob die Expression von IMP-1, -2 und -3 in Eierstockepithel-Tumoren mit der Überlebensrate der Patienten verknüpft wäre. Dazu wurde mit einem semiquantitativen PCR-Verfahren das Expressionsniveau der IMP-Gene in 59 Eierstockepithel-Karzinomen und 7 normalen Eierstöcken bestimmt. Eine Expression der IMP-Gene wurde in allen untersuchten Tumorgeweben, einschließlich Brust-, Lunge-, Kolon-Prostata- und Eierstockkrebs, mit Ausnahmen von Pankreaskrebs festgestellt. Riede (1998) Langenbecks Arch. Chir. Suppl. Kongressbd. 115, 299–302 analysierte die Expression und die Regulation der Expression des MUC2-Gens in normalem Kolon-, Kolonkarzinom- und Metastasengewebe. Der Autor stellte fest, dass die MUC2-Expression in Metastasen signifikant niedriger, als in normaler Mucosa und primärem Tumor war und mit dem normalen Metastasierungsprozess scheinbar nicht in Verbindung steht. Manne (2000) Clin. Canc. Res. 6, 4017–4025 untersuchte den prognostischen Wert der Korrelation zwischen der Expression von MUC1- und MUC2-Gen in kolorektalen Adenokarzinomen und der Aggressivität der kolorektalen Adenokarzinome in Bezug auf Unterschiede innerhalb der Bevölkerung. Die Expression von MUC1 und MUC2 wurde immunhistochemisch in 166 Proben kolorektaler Adenokarzinome bestimmt, von denen 58 afroamerikanischen und 108 kaukasischen Ursprungs waren. Ein prognostischer Nutzen von MUC2 konnte in dieser Studie weder bei Kaukasieren, noch bei Afroamerikanern festgestellt werden: Akyurek (2002) Pathol. Res. Pract. 198, 665–675 betrachtete eine mögliche Verbindung zwischen MUC1- und MUC2-Expression mit der Überlebensdauer von 143 Magenkarzinom-Patienten. Der Autor fasste seine Studie mit dem Ergebnis zusammen, dass die MUC1-Expression einen brauchbaren prognostischen Faktor zur Vorhersage der Überlebenswahrscheinlichkeit von Magenkarzinom-Patienten darstellt, wohingegen die Rolle der MUC2-Expression unklar bleibt. Baba (2000) Cancer Res 60, 6886–6889 vertritt die Auffassung, dass die Aktivierung des Ki-Ras-Signalwegs einen Faktor darstellt, der zur Überexpression von Epiregulin in humanen Kolonkrebszellen führt. Außerdem ist er der Meinung, dass Epiregulin eine entscheidende Rolle bei der Tumorgenese in vivo beim Menschen spielt. Dionigi (2000) Am. J. Clin. Pathol. 114, 111–122 untersuchte mittels Immunofärbungen 23 Eierstockmetastasen kolorektaler Primärtumore und 23 primäre Eierstockkarzinome, um Kriterien zur diagnostischen Unterscheidung der beiden Krebsarten zu identifizieren. Bei den Immunofärbungen wurden Antikörper gegen Antigastritisches-M1-Antigen, CA125, Vimentin, Östrogen- und Progesteron-Rezeptoren, Zytokeratine 7 und 20, Alfa-Inhibin und Kathepsin E eingesetzt. Die Studie ergab, dass sich die Immunreaktion von Zytokeratin 20 und die nicht auftretende Immunreaktion auf das Antigastritische-M1-Antigen, CA125 und Zytokeratin 7 zur diagnostischen Unterscheidung zwischen Eierstockmetastasen kolorektaler Primärtumore und primärer Eierstockkarzinome eignet. DePrimo (2003) BMC Cancer 3, 3 nutzt in seiner Studie ein Verfahren, um ein Microarray basiertes Tumor-Genprofil aus einer Blutprobe zu erstellen. In seinen Untersuchungen setzt er Monozyten aus dem Blut von 23 Patienten mit fortgeschrittenem kolorektalem Karzinom ein, die sich in einer klinischen Behandlung der Phase III mit SU5416 befanden. Im Verlauf der Studie wurde nach Veränderungen im Expressionsprofil gesucht, die auf die Behandlung mit SU5416 zurückzuführen waren. Der Autor identifizierte 4 Transkripte, die sich zur Klassifizierung der Patienten entsprechend der Behandlungsmethode eignen (CD24, Lactoferrin, Lipocallin 2 und MMP-9), konnte jedoch nicht mit Sicherheit ausschließen, dass die veränderte Expression dieser 4 Gene auch durch die Verabreichungsart oder Begleitmedikamente verursacht wurde. Mariadason (2003) Cancer Res. 63, 8791–8812 erstellte in einer Microarray basierten Studie aus 30 Kolontumor-Zelllinien ein Expressionsprofil von 430 Genen, dass Aussagen bezüglich des Ansprechens des Tumors auf verschiedene Chemotherapeutika zulässt. In Bezug auf das Ansprechen von Kolonkrebs auf eine 5-FU-Therapie fokussiert er seine Auswahl auf 50 Gene.

Der Stand der Technik hat damit bereits Marker für diverse proliferative Erkrankungen bereitgestellt. Problematisch ist dennoch eine verlässliche Diagnostik bereit zu stellen, die zu individuellen Therapien und insbesondere zu höheren Ansprechraten auf Therapeutika führen kann.

Das technische Problem ist durch die Bereitstellung der hierin offenbarten Ausführungsformen und insbesondere durch die die Erfindung charakterisierten Ansprüche gelöst.

Die Erfindung umfasst daher ein Verfahren zur

(a) Erkennung eines kolorektalen Karzinoms;
(b) Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms; und/oder
(c) Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie;

umfassend die Bestimmung eines Genexpressionsprofils von 120 Markergenen (SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181) oder einer Auswahl daraus.

Die Erfindung bezieht sich auf die Expressionsprofile bestimmter Gene, die von Bedeutung bei Karzinomen, insbesondere Adenokarzinomen, bevorzugterweise bei gastro-intestinalen Karzinomen und besonders bevorzugt bei primären kolorektalen Karzinomen und daraus abgeleiteten Metastasen, vorzugsweise Lebermetastasen sind. Die Erfindung beinhaltet ebenfalls den Nutzen aus dem Wissen dieser Expression und die Erstellung von Expressionsprofilen zur möglichen Diagnose, Prognose, Prädiktion des Ansprechens auf therapeutische Maßnahmen, insbesondere z.B. einer Chemotherapie und bevorzugt einer 5-FU-haltigen Chemo- und/oder Kombinationstherapie. Weiterhin kann die vorgelegte Erfindung dazu dienen, den Therapieverlauf von Karzinomen, inbesondere von primären kolorektalen Karzinomen und daraus abgeleiteten Metastasen, vorzugsweise Lebermetastasen zu beobachten.

Die 120 Gene (Markergene) der Erfindung sind insbesondere in der Tabelle D definiert und werden durch ihre entsprechenden codierende(n) Sequenzen) dargestellt. Somit sind die entsprechenden Gene teilweise durch mehrere SEQ ID NO charakterisiert. Die einzelnen Sequenzen der definierten 120 Markergene stellen z.B. Varianten, insbesondere Splicevarianten oder Gene hoher Homologie dar.

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung bezeichnet der Begriff „kolorektales Karzinom" insbesondere polypoide, plateauförmige, ulzeröse und flächenhafte (szirrhöse) Formen, die histologisch in solide, schleimbildende oder drüsige Adenokarzinome, Siegelringzellenkarzinome, squamöse, adenosquamöse, kribriforme, plattenepithelartige oder undifferenzierte Karzinome entsprechend der WHO-Klassifikation typisiert werden. (Becker, Hohenberger, Junginger, Schlag. Chirurgische Onkologie. Thieme, Stuttgart 2002). Wie oben erwähnt, sind die erfinderischen Verfahren nicht auf kolorektale Karzinome beschränkt.

Im Zusammenhang mit dieser Erfindung betrifft der Begriff „Adenokarzinom" eine Krebsgeschwulst, die von einer epithelialen Zellschicht des drüsigen Anteils einer Schleimhaut ausgeht. Das Adenokarzinom stellt einen eigenen, morphologisch klar umgrenzten Teil der Karzinome dar.

Der Begriff „Erkennung" eines Karzinoms, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms umfasst insbesondere die in vitro Bestimmung eines möglichen (kolorektalen) Karzinoms. Vorzugsweise handelt es sich bei dieser Erkennung um eine Früherkennung. Der Begriff „Früherkennung" im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet, dass ein (kolorektales) Karzinom frühmöglichst in seiner Genese, Entstehung und/oder Manifestation erkannt werden kann. „Früherkennung" umfasst daher die Detektion von (kolorektalen) Karzinomen in einem frühen Stadium der Erkrankung, in der die Erkrankung noch auf den Tumor beschränkt ist und noch keine Absiedelungen in die Lymphgefäße/Lymphknoten (L0, N0), andere Organe (M0) oder Gefäßeinbrüche (V0) stattgefunden haben, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Diese „Früherkennung" bezieht sich, inter alia, auf die diagnostische Analyse bei Vorsorgeuntersuchungen, als auch in Routineuntersuchungen oder Nachsorgeuntersuchungen, z.B. nach erfolgter Resektion eines bereits verhandenen Primärtumors.

Der Begriff „Prädiktion" bezeichnet im Kontext dieser Erfindung die Bestimmung des biologischen, biomedizinischen Zustands von Gewebe oder einzelnen Zellen, insbesondere bei der Bestimmung ob ein gegebenes Gewebe/eine gegebene Zelle proliferativ verändert ist. Im Zuge dieser Erfindung wird vorzugsweise bestimmt, ob eine potentielle Metastase, vorzugsweise eine Lebermetastase, tatsächlich eine proliferative Veränderung aufweist und/oder tatsächlich ein sekundärer Krankheitsherd infolge einer primären proliferativen und/oder tumorogenen Erkrankung ist. Die primäre proliferative Erkrankung ist im Kontext dieser Erfindung vorzugsweise ein kolorektales Karzinom und der sekundäre Krankheitsherd ist eine Metastase, vorzugsweise eine Lebermetastase.

Der Begriff „Prädiktion" im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Ansprechens von Metastasen, wiederum bevorzugt Lebermetastasen, auf eine 5-FU-haltige Chemo- und/oder Kombinationstherapie beinhaltet die Bestimmung der möglichen „Responsivität" oder eines „Ansprechens" einer metastatischen Zelle oder eines metastatischen Gewebes auf die Therapie. Somit stellt die „Responsivität" das Auslösen einer die Heilung einer Krankheit oder eines Leidens (in diesem Zusammenhang, einer proliferativen Erkrankung) begünstigenden Reaktion einer einzelnen Zelle, einer Zellpopulation, eines Zellverbandes, eines Gewebes, eines Organs oder eines Organismus dar. Insbesondere umfasst der Begriff „Responsibilität" die Empfindlichkeit einzelner (proliferativ veränderter und/oder metastatischer) Zellen, einer Zellpopulation oder eines Zellverbandes/Gewebes auf 5-FU allein oder in Kombination mit weiteren Medikamenten zu reagieren. Der Begriff „Responder" und „Non-Responder" sind dem Fachmann bekannt und wurden bereits oben erläutert. Als „Responder" werden Patienten bewertet, die eine komplette (CR, complete remission) oder eine partielle (PR, partial remission) Remission aufweisen, als „Non- Responder" diejenigen Patienten, die einen stabilen (SD, stable disease) oder progredienten (PD, progressive disease) Tumorverlauf in der Bildgebung zeigen. Das Ansprechen auf die Chemotherapie korreliert beim kolorektalen Karzinom mit dem Überleben der Patienten. Faktoren, die das Ansprechen auf die Therapie vorhersagen könnten, würden im Falle eines „Responders" dazu führen, die Therapie zu empfehlen und im Falle eines „Non-Responders" dem Patienten bestehende Therapiealternativen anzubieten.

Eine Rolle spielt hierbei auch der „prognostische Faktor" und der „prädiktive Faktor". Dabei ist der „prognostische Faktor" eine Variable, die einen unabhängigen Einfluss auf den Krankheitsverlauf ausübt. Klinische, pathohistologische und molekulare Prognosefaktoren wurden 2000 vom American Joint Comittee on Cancer Prognostic Factors (AJCC) beim kolorektalen Karzinom bewertet (Compton C. et al., Cancer 88, 1739–57 (2000)). Eindeutige prognostische Relevanz wurde der pT-Kategorie, der pN-Kategorie, der Venen- und Lymphgefäßinvaion, der Resiudaltumor-R-Klassifikation, sowie dem präoperativen CEA Wert zugeschrieben. Die molekularen Marker gelten als bisher noch nicht ausreichend validiert.

Der „prädiktive Faktor" ist eine Variable, die einen unabhängigen Einfluß auf das Ansprechen einer nichtoperativen Therapie ausübt. Auch hier sind molekulare Faktoren für die Prädiktion einer palliativen Chemotherapie beim kolorektalen Karzinom noch nicht ausreichend validiert.

Vorzugsweise wird die proliferativ veränderte (metastatische) Zelle/der Zellverband aufgrund der 5-FU Therapie absterben und/oder in ihrer/seiner Proliferation gestoppt. Eine Kombinationstherapie mit 5-FU umfasst, inter alia, die zusätzliche Verabreichung weiterer Medikamente an den Patienten, vorzugsweise sind dies ebenfalls Krebsmedikamente. Die Medikamente können aber auch z.B. immunstimulierende Medikamente umfassen. Weitere einsetzbare Medikamente in der Krebs- oder Chemotherapie sind Platinum-Verbindungen (wie zum Beispiel Cisplatin oder Oxaliplatin). Auch die weitere Verabreichung von z.B. Folsäure ist eine Kombinationstherapie im Sinne dieser Erfindung. In den Beispielen wird belegt, dass die hier dargestellt Erfindung insbesondere auch in der palliativen Erstlinientherapie nutzbar ist, wobei im konkreten Beispiel 5-FU mit Oxaliplatin eingesetzt wurde. Die 5-Fluorouracil (5-FU) basierte Chemotherapie stellt die wichtigste Säule der Chemotherapie kolorektaler Karzinome dar. Zur Biomodulation wird in aller Regel Folinsäure hinzugefügt. Früher wurde das 5-FU als Bolus (sog. Mayo-Regime) appliziert, mittlerweile liegen aber Studien vor, die zeigen, dass die Therapie als 24-h Infusion (sog. AlO-Regime) wesentlich verträglicher ist (weniger Diarrhoe, Mucositis und Hand-Fuß-Syndrom auftritt und die Therapie auch mit einem besseren Ansprechen verbunden ist. Andere Therapieoptionen stellen die Therapie mit dem oral verfügbaren 5-FU Derivat Xeloda^® dar (das ohne Folinsäure appliziert wird) oder die Kombinationstherapie mit z.B. Folinsäure, Irinotecan, Cisplatin oder Oxaliplatin. Weitere Kombinationen, die derzeit in Phase I-III Studien überprüft werden sind 5-FU haltige Schemata in Kombination mit z.B. Cetuximab, Erlotinib, Bevacizumab oder Vatalanib.

Der Begriff „Metastasen" umfasst im Zusammenhang mit dem oben genannten Verfahren zur Prädiktion/Bestimmung des Ansprechens auf eine Therapie, bevorzugt auf eine 5-FU-haltige Chemo- und/oder Kombinationstherapie. Ferner umfasst der Begriff „Metastasen" erfindungsgemäß Leber-, Lungen-, Hirn-, Knochenund/ oder Peritoneal- Metastasen und insbesondere Lebermetastasen.

Im Zusammenhang mit der Erfindung umfasst der Begriff „Genexpressionsprofil" sowohl die Bestimmung von „Expressionsprofilen", als auch „Expressionslevels" oder „Expressionsniveaus" der entsprechenden Gene.

Der Begriff „Expressionsniveau", als auch der Begriff „Expressionsprofil" umfasst erfindungsgemäß sowohl die Quantität des Expressionsprodukts, als auch die Qualität des Expressionsprodukts, wie z.B. Produkte alternativer Splicevorgänge, Methylierungen, Glykosylierungen, Phosphorylierungen, etc. Somit wird bei der Bestimmung des „Expressionsprofils" im Zusammenhang mit der Erfindung im wesentlichen auf die Quantität der entsprechenden Genprodukte (RNA/Protein) geachtet. Beim Expressionsniveau wird ebenfalls die Quantität beachtet, jedoch gegebenenfalls in Vergleich zu anderen Geweben oder Geweben und Zellen von anderen (vorzugsweise gesunden) Individuen gestellt. Gegebenenfalls werden auch Modifikationen im Genprodukt (wie z.B. Mutationen) im Vergleich zu anderen Geweben bestimmt. Entsprechende Ausführungsbeispiele sind im experimentellen Teil belegt und auch insbesondere in den Tabellen, vorzugsweise in den Tabellen A, B, C dargestellt.

In einer besonderen Ausführungsform umfasst die Erfindung das oben genannte Verfahren, wobei das Expressionsprofil von mindestens zwei der 120 Markergene, wie in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 dargestellt, bestimmt wird. Wie oben erwähnt, sind die 120 Markergene auch durch Varianten definiert, die wiederum in der Tabelle D dargestellt sind. Vorzugsweise wird dieses Expressionsprofil mit dem Expressionsprofil einer „Referenz" verglichen. Eine Referenz kann zum Beispiel das Expressionsprofil von gesundem Gewebe (z.B. Darmgewebe oder Gewebe der Leber, Lunge etc.) sein. Als „gesundes Gewebe" kann hierbei Gewebe des betroffenen Individuums (Patient) verwendet werden, wobei von diesem Gewebe bekannt ist, dass es nicht proliferativ verändert oder gar metastatisch ist. Entsprechende Beispiele sind im experimentellen Teil der Erfindung dargestellt. Allerdings können als „Referenz" oder „Referenzwert" auch Daten von Geweben von fremden Individuen, vorzugsweise (Gesunden) herangezogen werden.

Die Bestimmung der Expressionsprofile wird insbesondere in Geweben und/oder einzelnen Zellen des Gewebes durchgeführt. Einzelzellanalysen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen auch DNA- oder RNA-Bestimmungen; siehe, inter alia, die Bestimmung einzelner Kopien einzelner Gene, wie dargestellt in Klein (1999) PNAS 96, 4494–4499 oder die Bestimmung von genomischen Unausgewogenheiten („genomic imbalances"), wie z.B. beschrieben in Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes, Cancer 20, 399–407. Auch sind zur Bestimmung des Expressionsprofils der hierin dargestellten Gene (Genabschnitte) Techniken wie in situ-Hybridisierungen, Bestimmung der Kopienanzahl einzelner Gene (DNA copy number) durch komparative genomische Hybridisierung möglich. Weitere Verfahren zur Bestimmung des Expressionsprofils umfassen daher (im Sinne dieser Erfindung) die Bestimmung mittels PCR-Methodik und die Verwendung von Biochips (siehe auch experimentellen Teil der Erfindung). Wie im experimentellen Teil belegt, umfasst die Bestimmung des „Expressionsprofils" bzw. des „Expressionsniveaus" insbesondere die quantitative, gegebenenfalls vergleichende Bestimmung der Genexpressionsprodukte, insbesondere von RNA (aber auch von Proteinen) Ebenfalls zur Bestimmung des Expressionsprofils der hierin offenbarten Gene (oder Genabschnitte) können folgende Verfahren herangezogen werden: Immunodetektion des proteinösen Genprodukts (z.B. Westernblot, ELISA-Techniken oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse); biochemische Bestimmungen des Expressionsprodukts (z.B. Immunopräzipitationen, Enzymtests). Im Zuge dieser Erfindung werden vorzugsweise nicht ausschließlich alle hier genannten Gene untersucht, jedoch werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn zumindest 80, vorzugsweise mindestens 70, mehr bevorzugt mindestens 60, mehr bevorzugt mindestens 50, mehr bevorzugt mindestens 40, mehr bevorzugt mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 20, mehr bevorzugt mindestens 15, mehr bevorzugt mindestens 10, mehr bevorzugt mindestens 10, mehr bevorzugt mindestens 5, mehr bevorzugt drei, am meisten bevorzugt mindestens zwei Gene beziehungsweise deren Expressionsprofil oder Expressionsniveau, bestimmt wird.

Wie unten dargelegt wird, sollen erfindungsgemäß im Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms mindestens drei, vorzugsweise jedoch mindestens zwei der hier dargestellten Markergene (ausgewählt aus der Gruppe der 120 Gene/Genabschnitte, wie in den SEQ ID NOs: 1 bis 181 gezeigt) bestimmt werden. Weitere Ausführungsformen sind dem experimentellen Teil zu entnehmen.

Das vorher in Unterpunkt (a) erwähnte Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms kann insbesondere die Auswahl und Bestimmung des Expressionsprofils von mindestens zwei Genen der 120 Markergene, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 umfassen, wobei das Expressionsprofil der Gene mit dem durchschnittlichen Expressionsprofil aus normaler Darmmucosa verglichen wird. Wie bereits oben erwähnt kann die normale Darmmucosa vom Patienten stammen oder aber auch von anderen Individuen.

In den folgenden Ausführungsformen werden bevorzugt Gene dargestellt, die im erfinderischen Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms herangezogen werden können.

Somit umfasst das Verfahren insbesondere die Bestimmung des Genexpressionsprofils von mindestens zwei Genen, wobei mindestens eines der beiden Gene (wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 120) aus den „Minimal sets", wie im folgenden definiert, verwendet wird. Diese „Minimal sets" umfassen die entsprechend benannten und ausgewählten 72, 55, 33, 18 oder 3 Gene. Weitere Details sind auch dem experimentellen Teil und den Tabellen zu entnehmen.

In dieser als auch den folgenden Ausführungsformen ist für den Fachmann verständlich, dass es sich hierbei um bevorzugte Ausführungsformen handelt. Der Fachmann wird ebenfalls nur einzelne Gene, vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens 3 Gene (beziehungsweise deren Genexpressionsprofile/Genexpressionsniveaus) erfindungsgemäß bestimmen. Er wird dabei auch auf eine Auswahl der verschiedenen, hier dargestellten „Minimal sets" zurück greifen/zurück greifen können.

In einer bevorzugten Ausführungsform des die Erfindung umfassenden Verfahrens zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms wird eine Auswahl der Markergene des Expressionsprofils von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens von zwei Genen, der 72 Markergene, die in den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 72 oder SEQ ID NO: 121 bis SEQ ID NO: 156 dargestellt sind, getroffen und ausgewertet. Wiederum kann z.B. (und bevorzugt) das Expressionsprofil dieser 72 Gene im zu testenden Gewebe bestimmt und mit gesundem Gewebe verglichen werden. Entsprechende Ausführungsformen und Gewebe-Details können dem experimentellen Teil entnommen werden.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens von zwei Genen von 55 Markergenen bestimmt wird. Diese 55 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 und SEQ ID NO: 73 bis SEQ ID NO: 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154, 155, 157 bis 181 dargestellt.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens von zwei Genen der 33 Markergene bestimmt wird. Diese 33 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68, 70, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115 und 118 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 122, 124, 136 bis 140, 157, 159 bis 162, 170, 171, 172, 174 und 177 bis 180 dargestellt.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens von zwei Genen der 18 Markergene bestimmt wird. Diese 18 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68 und 70 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 122, 124 und 136 bis 140 dargestellt. Eine andere, aber auch erfindungsgemäße Auswahl der mindestens 18 Gene umfasst in dieser Ausführungsform die Bestimmung mindestens eines Gens, vorzugsweise mindestens von zwei der 18 Markergene, welche die Gene, wie in den SEQ ID NOs: 25, 41, 68, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115 oder 118 dargestellt, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136 bis 138, 157, 159 bis 162, 170 bis 172, 174 und 177 bis 180 dargestellt.

In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform im Sinne der Erfindung, umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem, vorzugsweise mindestens zwei der 3 Markergene bestimmt wird. Diese 3 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 25, 41 und 68 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136 bis 138 dargestellt.

Das bereits in Unterpunkt (b) erwähnte Verfahren zur Prädiktion von Metastasen, vorzugsweise von Lebermetastasen, in Abhängigkeit eines primären (kolorektalen) Karzinoms, kann insbesondere die Auswahl und Bestimmung des Expressionsprofils von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens zwei Genen von den hier offenbarten 120 Markergenen umfassen, wobei diese Gene über SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 definiert sind und wobei das Expressionsprofil der Gene, gewonnen aus potentiellen metastatischen Zellen oder Gewebe, vorzugsweise in Leberzellen oder Lebergewebe, mit dem Expressionsprofil gewonnen aus primären kolorektalen Tumorzellen oder -gewebe verglichen wird. Die Proben zur Gewinnung der beiden Expressionsprofile können vom gleichen Patienten stammen, aber auch von unterschiedlichen Patienten.

In den folgenden Ausführungsformen werden bevorzugt Gene dargestellt, die im erfinderischen Verfahren zur Prädiktion von Metastasen, vorzugsweise von Lebermetastasen, in Abhängigkeit eines primären (kolorektalen) Karzinoms, herangezogen werden können. Somit umfasst das Verfahren insbesondere die Bestimmung des Genexpressionsprofils von mindestens einem, vorzugsweise mindestens von zwei Genen, wobei mindestens eines der beiden Gene von den 120 Markergenen (wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 181) aus den „Minimal sets", wie im folgenden definiert, verwendet wird. Diese „Minimal sets" umfassen die benannten 72, 55, 22, 20 oder 2 Gene. Weitere Details sind auch dem experimentellen Teil, als auch den Tabellen zu entnehmen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des die Erfindung umfassenden Verfahrens zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären (kolorektalen) Karzinoms, vorzugsweise von Lebermetastasen, wird eine Auswahl der Markergene des Expressionsprofils von mindestens einem Gen der in Tabelle 2 definierten 72 Markergene, die auch in den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 72 oder SEQ ID NO: 121 bis SEQ ID NO: 156 dargestellt sind, getroffen und ausgewertet. Wiederum kann z.B. (und bevorzugt) das Expressionsprofil dieser 72 Gene aus potentiell metastatischen Zellen oder Gewebe, vorzugsweise Leberzellen oder Lebergewebe gewonnen werden und mit dem Expressionsprofil aus primären kolorektalen Tumorzellen oder -gewebe verglichen werden.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären Karzinoms, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms, vorzugsweise der Prädiktion von Lebermetastasen, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen der in Tabelle 3 definierten 55 Markergene bestimmt wird. Diese 55 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 und SEQ ID NO: 73 bis SEQ ID NO: 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154, 155, 157 bis 181 dargestellt. In dieser, als auch den folgenden Ausführungsformen ist für den Fachmann verständlich, dass es sich hierbei um bevorzugte Ausführungsformen handelt. Der Fachmann wird ebenfalls nur einzelne Gene, vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens 3 Gene (beziehungsweise deren Genexpressionsprofile/Genexpressionsniveaus) erfindungsgemäß bestimmen. Er wird dabei auch auf eine Auswahl der verschiedenen, hier dargestellten „Minimal sets" zurück greifen/zurück greifen können. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären Karzinoms, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms, vorzugsweise der Prädiktion von Lebermetastasen, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen der auch in Tabelle C definierten 22 Markergene bestimmt wird. Diese 22 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69, 71, 72, 74 und 109 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 125, 133, 134, 135, 151, 152, 156 und 177 dargestellt.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären Karzinoms, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms, vorzugsweise der Prädiktion von Lebermetastasen, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen der 20 Markergene bestimmt wird. Diese 20 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69, 71 und 72 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 125, 133, 134, 135, 151, 152 und 156 dargestellt.

In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform im Sinne der Erfindung, umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären (kolorektalen) Karzinoms, vorzugsweise von Lebermetastasen, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem der zwei Markergene, wie in den SEQ ID NOs: 74 und 109 dargestellt, bestimmt wird.

Das zuvor in Unterpunkt (c) genannte Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie kann insbesondere die Auswahl und Bestimmung des Expressionsprofils von mindestens zwei Genen aus der Gruppe der hier offenbarten 120 Markergene umfassen, wobei diese Gene über die SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 definiert sind und wobei das Expressionsprofil der Gene, gewonnen aus Metastasenproben von Patienten die auf eine Therapie ansprechen mit dem Expressionsprofil aus Metastasenproben von Patienten die nicht auf eine Therapie ansprechen verglichen wird.

In den folgenden Ausführungsformen werden bevorzugt Gene dargestellt, die im erfinderischen Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie herangezogen werden können. Somit umfasst das Verfahren insbesondere die Bestimmung des Genexpressionsprofils von mindestens einem, bevorzugt mindestens zwei Gene, wobei mindestens eines der beiden Gene von den 120 Markergenen (wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 181) aus den „Minimal sets", wie im folgenden definiert, verwendet wird. Diese „Minimal sets" umfassen die benannten 72, 55, 34, 28 oder 7 Gene. Weitere Details sind auch dem experimentellen Teil und den Tabellen zu entnehmen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des die Erfindung umfassenden Verfahrens zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie wird eine Auswahl der in Tabelle 1 definierten 72 Markergene des Expressionsprofils, die in den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 72 oder SEQ ID NO: 121 bis SEQ ID NO: 156 dargestellt sind, getroffen und ausgewertet. Wiederum kann z.B. (und bevorzugt) das Expressionsprofil der Gene, gewonnen aus Metastasenproben von Patienten die auf eine Therapie ansprechen mit dem Expressionsprofil aus Metastasenproben von Patienten die nicht auf eine Therapie ansprechen verglichen werden.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen der in Tabelle 4 definierten 55 Markergene bestimmt wird. Diese 55 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 und SEQ ID NO: 73 bis SEQ ID NO: 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154, 155, 157 bis 181 dargestellt. In dieser als auch den folgenden Ausführungsformen ist für den Fachmann verständlich, dass es sich hierbei um bevorzugte Ausführungsformen handelt. Der Fachmann wird ebenfalls nur einzelne Gene, vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens 3 Gene (beziehungsweise deren Genexpressionsprofile/ Genexpressionsniveaus) erfindungsgemäß bestimmen. Diese Gene können aus verschiedenen hier definierten „Minimal sets" stammen.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen der in Tabelle A definierten 34 Markergene bestimmt wird. Diese 34 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 10, 13, 14, 24, 25, 41, 45, 46, 48, 52, 54, 60, 61, 63, 65, 66, 68, 73, 78, 79, 80, 89, 97, 98, 101, 104, 107, 108, 116, 117 und 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 122, 136 bis 147, 151 bis 155, 157, 167, 168, 169, 171, 172, 176 und 181 dargestellt.

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen der in Tabelle A definierten 28 Markergene bestimmt wird. Diese 28 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 13, 24, 45, 46, 48, 52, 54, 60, 61, 65, 66, 73, 78, 79, 80, 89, 97, 98, 101, 104, 107, 108, 116, 117 und 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 122, 139 bis 147, 151, 152, 157, 167, 168, 169, 171, 172, 176 und 181 dargestellt.

In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform im Sinne der Erfindung, umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens zwei der folgenden 7 Markergene bestimmt wird. Diese 7 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63 und 68 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154 und 155 dargestellt.

Der Begriff „Markergen" im Zusammenhang mit dieser Erfindung umfasst erfindungsgemäß ein Gen oder einen Genabschnitt, der mindestens zu 60 % homolog, vorzugsweise mindestens 65 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 70 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 75 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 80 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 85 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 90 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 95 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 96 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 97 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 98 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 99 % homolog, am meisten bevorzugt mindestens 100 % homolog zu dem in den SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NOs 181 dargestellten Sequenzen in Form von Desoxyribonnukleotiden oder entsprechenden Ribonunkleotiden bzw. den daraus abgeleiteten Proteinen ist. Unter einem aus den 120 Markergenen (definiert in den SEQ ID NOs: 1 bis 181, zum Beispiel in Tabelle D) abgeleiteten Protein wird in dieser Erfindung erfindungsgemäß ein Protein, ein Proteinfragment oder ein Polypeptid verstanden, das im nativen Leserahmen (in frame) translatiert wurde.

Die „Gewinnung eines Expressionsprofils" der Markergene umfasst erfindungsgemäß die Gewinnung des zuvor beschriebenen Expressionsprofils aus einer oder mehrer Proben eines oder mehrerer Individuen.

Bei diesen „Individuen" handelt es sich erfindungsgemäß primär um Menschen, jedoch kann die Erfindung auch bei anderen Säugetieren und besonders bei Affen, Mäuse, Ratten, Schweine, Pferde, Hunde, Katzen, Hasen, Kaninchen, Hamster und Meerschweinchen angewandt werden. Ferner umfasst der Begriff „Individuum" sowohl kranke, als auch gesunde Vertreter der zuvor genannten Arten.

Unter einer „Probe" wird erfindungsgemäß eine oder mehrere Zellen, Gewebe, ein vollständiges Organ oder ein Teil davon verstanden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Probe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Operationspräparat, Gewebsbiopsie, Peritoneal-Flüssigkeit, Blut, Urin, Serum und Stuhl.

Wie auch im experimentellen Teil der Erfindung dargestellt, wird das Expressionsprofil der hier offenbarten 120 Markergene (oder einer Auswahl daraus), vorzugsweise, durch die Messung der Quantität an Markergen-mRNA bestimmt. Diese Quantität von Markergen-mRNA kann z.B. mittels Genchiptechnologie, (RT-) PCR, Northern Hybridisierung, Dot-Blotting oder in situ Hybridisierung bestimmt werden. Allerdings kann das erfinderische Verfahren auch durchgeführt werden, indem der Fachmann die Genprodukte (falls vorhanden auf Protein- oder Peptidebene) misst und bestimmt. Somit umfasst die Erfindung die hier beschriebenen Verfahren, bei denen die Genexpressionsprodukte in Form ihrer synthetisierten Proteine (oder Peptide) bestimmt werden. Hierbei kann sowohl die Quantität, als auch die Qualität (z.B. Modifikationen, wie Phosphorylierungen oder Glycosylierungen) bestimmt werden. Vorzugsweise wird in diesem Zusammenhang jedoch das Expressionsprofil der Markergene durch die Messung der Polypeptidquantität der Markergene bestimmt und, falls gewünscht, mit einem Referenzwert verglichen. Der Referenzwert wurde oben bereits beschrieben und kann von gesundem oder kranken Gewebe stammen. Das Polypeptidlevel, bzw. die Polypeptidquantität der Markergene kann durch ELISA, RIA, (Immuno-) Blotting, FACS oder immunhistochemische Methoden bestimmt werden.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Erstellen des Expressionsprofils, wie oben definiert, in einer Patientenprobe; und
(b) Bestimmen mit Hilfe des in (a) erstellten Genexpressionsprofils, ob der Patient an i. einem kolorektalen Karzinom leidet; ii. als Folge eines kolorektalen Karzinoms Lebermetastasen aufweist; und/oder iii. auf eine 5-FU-haltige Chemotherapie der Metastasen anspricht.

Die oben genannten Ausführungsformen gelten ebenfalls für das hier dargestellte Verfahren. Ebenfalls wird die Erfindung das oben genannten Verfahren bereitstellen, um zu bestimmen, ob der Patient an einem Karzinom, vorzugsweise an einem Adenokarzinom leidet. Auch ist das Verfahren nicht auf die Bestimmung von Lebermetastasen beschränkt. Das gleiche gilt, mutatis mutandis, für die weiteren erfindungsgemäßen Verfahren.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Kit zur Durchführung der Verfahren die hier beschrieben sind, wobei das Kit spezifische (Nukleotid-) Sonden, Primer (-paare), Antikörper, Aptamere zur Bestimmung von mindestens zwei der 120 Markergene, die in SEQ ID NO:1 bis 181 dargestellt sind, oder zur Bestimmung von mindestens zwei Genprodukten der 120 Markergene die von den Markergenen, die in SEQ ID NO: 1 bis 181 codiert werden, umfasst. Der Kit ist vorzugsweise ein diagnostischer Kit. Als „Kit" im Sinne der Erfindung wird auch ein „Microarray" oder ein „Genchip" bezeichnet.

Somit umfasst die Erfindung ebenfalls die Verwendung eines der 120 Markergene oder eine Gruppe der 120 Markergene, die in SEQ ID NO: 1 bis 181 dargestellt wurden, zur Bestimmung, ob der Patient

(a) an einem kolorektalen Karzinom leidet;
(b) als Folge eines kolorektalen Karzinoms Lebermetastasen aufweist; und/oder
(c) auf eine 5-FU-haltige Chemotherapie der Metastasen anspricht.

Eine weitere mögliche Anwendung der Erfindung kann in der Herstellung eines transgenen, nicht menschlichen Tieres, vorzugsweise einer transgenen Maus bestehen, die eines oder mehrere der Marker über- oder unterexprimiert. So eine transgene Maus kann dazu dienen, ein Modellsystem für z.B. die Lebermetastasierung beim Menschen darzustellen. Damit könnte der bisher nur teilweise verstandene Prozess der Metastasierung deutlich gemacht werden und neue Erkentnisse über den Metastasierungsweg des kolorektalen Karzinoms oder auch anderer Karzinome gewonnen werden. Darüber hinaus könnte mit Hilfe so einer transgenen Maus therapeutische oder toxische Substanzen getestet werden. Ein ähnliches Prinzip liegt auch den Knock-out Analysen zugrunde, die mit Hilfe der Gene dieser Erfindung durchgeführt werden könnten. Somit kann das erfindungsgemäße Tier auch zu Durchmusterungsverfahren (Screeningverfahren) herangezogen werden.

Daher betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, das eines oder mehrere der hier definierten Markergene über- oder unterexprimiert in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel. Dieses Durchmusterungsverfahren ist insbesondere für die Durchmusterung von Mitteln in der Krebstherapie, insbesondere in der Behandlung von kolorektalen Karzinomen und/oder Metastasen, vorzugsweise Lebermetastasen geeignet.

Ebenfalls Teil der Erfindung ist die Verwendung einer transgenen Zelle, die eines oder mehrere der hier definierten Markergene über- oder unterexprimiert in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel. Auch hier werden vorzugsweise Medikamente zur Krebstherapie durchmustert. Somit stellt auch dies vorzugsweise eine Verwendung in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel zur Behandlung von kolorektalen Karzinomen; und/oder Metastasen, bevorzugt Lebermetastasen, dar.

Wie bereits oben diskutiert, können die Gensequenzen, Oligonukleotide oder andere Fragmente der Markergene dieser Erfindung benutzt werden, um die differentielle Genexpression zu detektieren und zu quantifizieren. Qualitative und quantitative Methoden für solche Messungen sind in der Molekulargenetik gut bekannt. Des weiteren können Antikörper gegen ein Epitop oder ein Protein oder mehrere Epitope oder mehrere Proteine, die für die in dieser Erfindung beschriebenen Gene produziert werden. Diese Antikörper können dazu benutzt werden, um den Proteingehalt in einer menschlichen Zelle zu quantifizieren. Protokolle zur Detektion und zur Quantifizierung der Proteinexpression durch monoklonale oder polyklonale Antikörper sind in der Molekulargenetik gut bekannt. Beispiele sind ELISA, RIA und FACS-Analyse.

Die Gensequenzen oder Gen-Fragmente oder komplementäre Nukleinsäuren der Markergene dieser Erfindung können auch in der Gen-Therapie genutzt werden. Beispielsweise kann die cDNA einer oder mehrerer Gene der Erfindung ex vivo in Zielzellen eingeschleusst werden. Nachdem die stabile Integration und Transkription oder Translation sicher gestellt ist, können die Zellen in den Tumor des Patienten zurückgegeben werden und können möglicherweise Mutationen korrigieren, die mit der Unter- oder Überexpression dieses Proteins verbunden sind. Alternativ können die cDNA einer oder mehrerer Gene der Erfindung in vivo eingeschleusst werden, indem Vektoren, wie etwa Retroviren, Adenoviren, HS-Viren oder bakterielle Plasmide benutzt werden. Nicht virale Methoden stellen zudem die Einschleussung kationischer Liposomen, Polylysin-Konjugate oder die direkte Injektion der DNA dar.

Eine weitere mögliche Anwendung der Erfindung ist in der Möglichkeit, die durch die Markergene der Erfindung kodierten Proteine, ihre Liganden oder komplementäre Nukleinsäure-Sequenzen therapeutisch einzusetzen. Insbesondere kann die Kombination verschiedener solcher Medikamente synergistisch auf die Tumorreduktion wirken oder dazu führen, dass keine Metastasierung auftritt. Darüber hinaus könnten diese Medikamente auch synergistisch mit bereits etablierten Substanzen in der Therapie des kolorektalen Karzinoms eingesetzt werden.

Die Tabellen zeigen:

Tabelle 1 enthält die Gene, die in der vorliegenden Erfindung differentiell zwischen Primärtumor und Lebermetastase exprimiert werden. (Nähere Ausführungen zu Tabelle 1 finden sich in der Beschreibung der Erfindung).

Tabelle 2 enthält die Gene, die in der vorliegenden Erfindung differentiell zwischen Lebermetastasen von Respondern und Non-Respondern auf eine 5-FU haltige Chemotherapie exprimiert werden. (Nähere Ausführungen zu Tabelle 2 finden sich in der Beschreibung der Erfindung).

Tabelle 3 enthält die Annotationen, Gen-Namen und Affymetrix ID Nr. der in Tabellen 1–3 beschriebenen Gene.

Tabelle 4 Expressionsdaten nach statistischer Auswertung entsprechend Beispiel 4b von Responder (Resp) versus Non-Responder (Non-Resp) auf eine 5-FU haltige palliative Chemotherapie

Tabelle 5 Expressionsdaten von Respondern (Resp), Non-Respondern (Nonresp) und Pat. T. von Beispiel 16

Tabelle A Prädiktion des Ansprechens von Lebermetastasen auf eine 5-FU haltige Chemotherapie durch den Vergleich von Respondern (Resp; n = 10) und Non-Respondern

Tabelle B Früherkennung eines kolorektalen Karzinoms durch den Vergleich von gesunder Mucosa (Muc; n = 3) und kolorektalem Karzinom

Tabelle C Prädiktion von Lebermetastasen durch den Vergleich von Lebermetastasen (Lm; n = 20) und kolorektalem Karzinom

Tabelle D Kongruenzliste der vergebenen SEQ ID NOs

Die Abbildungen zeigen:

1 zeigt schematisch das methodische Vorgehen, das zur Erstellung eines Genexpressionsprofils mit prädiktiver Bedeutung und damit für die Erfindung notwendig sind. (Nähere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).

2 zeigt den Ablauf der statistischen Auswertung durch ein Trainings-Test Set Verfahren. Dabei ist unter A. das Vorgehen gezeigt, wie es unter Beispiel 4a aufgeführt ist, unter B. wird gezeigt, wie unter Beispiel 4b vorgegangen wurde. (Nährere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).

3 zeigt „heat-maps" der Expressionsprofile, die über mathematische Algorithmen die Ähnlichkeit der Signaturen erstellt und eine Aufteilung in Gruppen vornimmt. 3A. zeigt die überwachte (supervised) Clusteranalyse des Trainingssets, 3b die daraufhin durchgeführte Clusteranalyse mit einem vom Trainingsset unabhängigen Test-Set. (Nähere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).

4 zeigt die Auswertung der Principal Componant Analyse. Jede Kugel symbolisiert dabei das Genexpressionsprofil aus einem Gewebe (Tumor oder Metastase). Die räumliche Nähe der Kugeln von sowohl Respondern (grün) als Non-Respondern (rotbraun) auf die 5-FU haltige Chemotherapie und die räumliche Trennung zwischen grünen und rotbraunen Kugeln zeigt die gute Möglichkeit zur Diskriminierung beider Formen des Ansprechens. (Nähre Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).

5 zeigt Computertomografie (CT) Aufnahmen des Pat. 7. vor und nach First-line Behandlung mit einer 5-FU haltigen Therapie. Deutlich ist die Größenregredienz der Lebermetastasen (rot umrandet) nach Einleitung der Behandlung zu erkennen. Es handelt sich hier nach WHO Kriterien um eine partielle Remission (PR), also ein Ansprechen auf die Chemotherapie. Dieser Pat. zeigt das Ansprech-Profil auch im Genexpressionsprofil aus der dargestellten Lebermetastase. (Nähere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).

6 zeigt eine Kaplan-Meier (Absterbe) Kurve. Dargestellt ist auf der X-Achse die Überlebenszeit in Wochen, auf der Y-Achse das kummulative Überleben bzw. Absterben in %. Stratifiziert wurde nach dem Genexpressionsprofil zwischen Respondern (durchgezogene Linie) und Non-Respondern (gestrichelt). Deutlich ist der Überlebensvorteil der Patienten mit der Response-Signatur zu Erkennen. In der log-rank Analyse ergab sich eine statistische Signifkanz von p=0.030 (Nähere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).

Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung und schränken sie in keinster Weise ein.
Beispiel 1: Gewinnung des Gewebes und dessen Aufreinigung
Die Gewebeproben der normalen Kolonmucosa, der kolorektalen Karzinome und der korrespondierenden Lebermetastasen wurden intraoperativ gewonnen, sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und anschließend bei –80 °C archiviert.
Mittels Kryotom wurden 5 μm dicke Schnitte der Tumorproben hergestellt, die auf Glas-Objektträger aufgezogen und mittels Hämatoxilin-Eosin (HE) gefärbt wurden.
Nur solche Tumorproben, die einen mikroskopisch bestimmten Tumorzellanteil von mindestens 80 % aufwiesen wurden für die weitere Bearbeitung ausgewählt. Anschließend wurden mit dem Kryotom 30 μm dicke Schnitte der ausgewählten Tumorproben angefertigt, die auf spezielle Folienobjektträger (Membrane Slides for Laser microdissection; Molecular Machines & Industries AG; CH-8152 Glattbrugg) aufgezogen und umgehend in 70 % Ethanol überführt wurden.
Zur Vorbereitung der Laser-Mikrodissektion schlossen sich folgende Inkubationsschritte an:

1. 30 Sekunden in Mayers Hämalaunlösung
2. spülen in RNase freiem Wasser
3. ca. 30 Sekunden bläuen lassen in RNase freiem Wasser
4. 60 Sekunden in 70% Ethanol waschen
5. 60 Sekunden in 95% Ethanol waschen
6. 30 Sekunden in Eosin Y-Lösung
7. 60 Sekunden in 95 % Ethanol waschen
8. 60 Sekunden in 95 % Ethanol waschen
9. 60 Sekunden in 100 % Ethanol waschen
10. 5 Minuten in 100 % Xylol waschen
11. Schnitte an der Luft trocknen und eventuell mit einem fusselfreien Tuch Xylol-Reste entfernen

Die Tumorzellareale wurden nun mit einem Laser-Mikrodissektionsgerät (LMD) der Firma Leica ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde die Gesamt-RNA aus den Tumorzellarealen mit einem RNeasy Mini-Kit (Best.-Nr. 74104) der Firma Qiagen nach dem Protokoll des Herstellers isoliert. Entsprechende Protolle sind beim Hersteller erhältlich bzw. im Internet veröffentlicht.
Die Qualität der isolierten Gesamt-RNA wurde mit Hilfe eines Lab-on-a-Chip Gerätes (Firma Agilent) überprüft und nur quantitativ ausreichende Gesamt-RNA (>100 ng) sowie qualitativ hochwertige RNA für die folgenden Arbeitsschritte verwendet.
Beispiel 2: Herstellung und Amplifikation von aRNA aus isolierter Gesamt-RNA
Die Herstellung amino-allyl markierter cRNA (aRNA) aus Gesamt-RNA und deren Amplifikation erfolgte nach der Eberwine-Methode (van Geldern RN et al. (1990); PNAS USA 87: 1663 – 7) und wurde mit dem MessageAmp^®-Kit der Firma Ambion nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Entsprechende Protolle sind beim Hersteller erhältlich bzw. im Internet veröffentlicht.
Die markierte cRNA wurde mit dem „RNeasy mini" Kit der Firma Qiagen aufgereinigt und konzentriert. Die dazu notwendigen Arbeitsschritte wurden entsprechend dem Protokoll des Herstellers durchgeführt, das auch im Internet veröffentlich ist.
Beispiel 3: Benutzung des Affymetrig Genarrayers
Die Sonde die zur Hybridisierung eingesetzt werden sollte, wurde durch Fragmentierung markierter cRNA hergestellt. Anschließend wurden HG U133-A Microarrys der Firma Affymetrix mit dieser Sonde hybridisiert, ungebundene Sonde entfernt und die Rohdaten mit dem GeneArray Scanner der Firma Agilent ausgelesen. Die Arbeitsschritte zur Durchführung der genannten Prozeduren wurden entsprechend der Angaben im Handbuch zur Genexpressionsanalyse (Firma Affymetrix) ausgeführt. Die Signalintensitäten und die Detektionssignale („detection calls") wurden mit Hilfe der GeneChip 5.0 Software der Firma Affymetrix erstellt.
Beispiel 4: Statistische Auswertung der gewonnenen Daten
Die durch den GeneArray Scanner gesammelten Daten in Bezug auf die Hybridisierung der markierten cRNA-Fragmente mit Microarray-Sequenzen wurden anschließend statistisch ausgewertet. Diese Auswertung erfolgte auf zwei Wegen:

a) Das Verfahren umfasste die Erstellung eines Traininings-Kollektives und die Überprüfung der gewonnen Daten an einem Test-Kollektiv. 1. Die Datensätze werden mittels Affymetrix Software „gepublished", d.h. vergleichbar gemacht. 2. Vorauswertung mittels Affymetrix Data mining tool (average Resp, average Non-Responder, fold-change, T-test Resp. vs. Non-responder p < 0.05. Das Trainings-Kollektiv (n=10) wird dabei zufällig zusammengestellt. 726 Gene sind signifikant differentiell exprimiert. 3. Die Daten werden in Excel übertragen. Anschließend werden die im T-test signifikant unterschiedlich exprimierten Gene weiter reduziert durch Einengung auf Gene, die ≥ 3-fach unterschiedlich exprimiert werden. Reduktion auf 168 Gene. 4. Die weitere Filterung geschieht durch Einengung auf Gene die einen average Signalwert in mindestens einer Gruppe von ≥ 300 aufweisen. Reduktion auf 82 Gene. 5. Entfernen von doppelt und mehrfach gelisteten Genen auf dem Chip. Reduktion auf 72 Gene. 6. Das Expressionsprofil dieser 72 Gene (auch dargestellt in Tabelle 2) wird auf das Testkollektiv (n=7) angewandt und hierarchisch nach Korrelation geclustert (Spotfire^® Software). Es ergeben sich zwei Cluster, die zu 100 % den Respondern und Non-Respondern entsprechen. Es werden die Überlebensdaten der Patienten (Zeitpunkt Tod bzw. Last date Leben minus Zeitpunkt der Operation) berechnet und eine Kaplan-Meier Kurve mit der Variable „bad"-„good" response erstellt. Es ergibt sich eine Signifikanz für das Gesamtüberleben von p=0.04 im Log-rank Test.
b) Eine alternative Methode zur statistischen Auswertung der Rohdaten ging von den vorhandenen 30 Datensätzen aus und bildete fünf Gruppen daraus: Gruppe_1 LM responder; Gruppe_2 LM non responder; Gruppe_3 PR responder; Gruppe_4 PR non responder und Gruppe_5 undefiniertes klinisches Ansprechen. Die Findungsphase wurde in zwei parallel verlaufende Abschnitte A und B unterteilt. In dem Findungsabschnitt A wurden mittels T-Test, Welch, Wilcoxon und Kolgomorov-Smirnov Analyse die statistisch signifikant differentiell regulierten Gene zwischen den Gruppen_1 und_2 mit jeweils n=8 bzw. n=9 Datensätzen identifiziert. Hierbei wurde der cutoff-level für die Signifikanz bei p=0.05 gesetzt. Aus dieser Analyse ging eine Gruppe von 806 Genen aus dem gesamten Genpool von 22.283 Genen als signifikant hervor. In einer zweiten Stufe wurden diese Gene dann einer Qualitätsanalyse unterworfen bei der sich 230 Gene als mit dem Affymetrix Genechip System nicht valide messbar erwiesen und weitere 3 Gene unterhalb des gesetzten Detektions-schwellenwerts von 30 RLU lagen. In einem weiteren Analyseschritt wurden von den verbleibenden 573 Genen all jene Gene getrennt die in ihrer biologischen Funktion in Zusammenhang mit entzündlichen Reaktionen oder dem Immunsystem zu sehen sind. Dieses geschah basierend auf zuvor erstellten Genlisten und auf Literatur- wie Datenbank (NCBI, OMIM, UNIGENE) -angaben. Um nur jene Gene als prädiktiv zu identifizieren, die in ihrer relativen Expressionsänderung deutlich messbar sind wurden nochmals jene Gene Entfernt bei denen das delta in der Expression zwischen Gruppe_1 und Gruppe_2 größer als ein Faktor 2 war. Dieses Kriterium erfüllten 191 Gene. In einem Crossvalidierungsschritt wurde mittels der KNN (k nearest neighbour ) Analyse und unter Hinzunahme der Gruppe_5 sowie der Anwendung eines sog. Generankings die Anzahl der Gene auf 55 reduziert. Durch Einsatz dieser Gene wurden in der KNN-Analyse nur drei Datensätze fehlklassifiziert bei einem k=3 und 25% test-set Fraktion sowie 10.000 Iterationen.

In dem zweiten unabhängigen Findungsansatz wurde ausgehend von den gleichen Gruppen_1 und_2 mittels einer vorgeschalteten Qualitätsanalyse von 22.283 Genen nur rund 15.000 als valide (hinreichend gut differentiell expremiert) in diesem Analyseaufbau betrachtet. Mit diesen rund 15.000 Genen wurde dann eine Genreduktion basierend auf SVM (Support Vector Machines) -Algorithmen die sich als besonders gut geeignet zur Lösung von n-dimensionalen Problemen mit zwei oder mehr Klassen erwiesen haben (Weston and Watkins, Proceedings of the Seventh European Symposium On Artificial Neural Networks, April 1999; Vapnik, The Nature of Statistical Learning Theory, 1995, Springer, New York; Vapnik, Statistical Learning Theory, 1998, Wiley, New York; Burges, Data Mining and Knowledge Discovery, 2(2):955–974, 1998). Mit Hilfe dieser Algorithmen wird im n-dimensionalen Raum eine hyperplane (Trennungsebene) definiert, die aus den „Vektoren" der einzelnen Gene und deren Expressionsstärke besteht. Die Reduktion ergab 181 für eine prädiktive Trennung notwendige Gene. Nach Überprüfung der Daten auf „doppelte"-Nennungen, die durch die mehrfache Repräsentanz von Genen auf den GeneChip Microarrays entstehen, und der Reduktion von Immunsystem-Genen standen für eine erste, wie bereits zuvor beschriebene Kreuzvalidierung 57 Gene zur Verfügung. Die Schnittmenge der beiden Gengruppen aus den Analyseabschnitten A und B belief sich auf 55 (55 Gene, wie aufgeführt in Tabelle 3). In einem nun folgenden Analyseabschnitt C wurden die bislang nicht eingesetzten Datensätze der Gruppen 3 und 4 in einer Validierung mit KNN-Algorithmen und in einer PCA (principle component analysis) eingesetzt. Bis auf einen Datensatz aus der Gruppe 4 wurden alle primären Tumorproben korrekt den jeweiligen Gruppen „responder" oder „non responder" zugeordnet.
Somit stellt die Erfindung 72 und 55 Gene bereit, deren Expressionsprofil und/oder Expressionsniveau sowohl zur (Früh-)erkennung eines kolorektalen Karzinoms, zur Prädiktion von Metastasen (bevorzugt Lebermetastasen) in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms und/oder zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-FU haltige Therapie (Chemotherapie) herangezogen werden können. Da die hier dargebotenen Gene von 72 und 55 Genen Überlappungen aufweisen, werden hier insgesamt 120 Gene bereitgestellt (dargestellt in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 und gezeigt in Tabelle 2 und 3, als auch in Tabelle D), mit welchen der Fachmann die Verfahren der Erfindung, als auch die Verwendung der Erfindung durchführen kann. SEQ ID NO: 1 bis 120 beziehen sich dabei auf einzelne Gene, die den 120 Markergenen entsprechen. Die zusätzlichen Sequenzen wie in SEQ ID NO: 121 bis 181 dargestellt, sind Varianten von einzelnen Markergenen. Die entsprechende Korrelation der einzelnen Markergene (120) zu den Sequenzen (181) ist den Tabellen, insbesondere Tabelle D zu entnehmen. Auch die „Kits" der Erfindung sind durch diese 120 Gene definiert und nachzuarbeiten.
Die hier beigefügten Tabellen (insbesondere Tabelle 1 bis 5 und A, B, C, D) erlauben es dem Fachmann die ausgewählten Expressionsprofile zu bestimmen und zu analysieren.
Beispiel 5: 72 Gene und eine Auswahl davon aus Tabelle 2, die als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms geeignet sind
Die Werte der Spalte 7 in Tabelle 2 zeigen eine signifikant differenzielle Expression der 72 beschriebenen Gene für Kolonmucosa und kolorektale Karzinome. Daraus erschließt sich der Einsatz dieser Gene als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms. Aufgrund einer besonders hohen Signifikanz von p < 0,05 im T-Test (Spalte 7, Tabelle 2), eignet sich folgende Genauswahl (18 Gene) besonders gut im Einsatz als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms: Major histocompatibility complex, dass II, DP beta 1 [Affymetrix Nummer 201137_s_at], SEQ ID Nummer 2; CD163 antigen [Affymetrix Nummer 203645_s_at], SEQ ID Nummer 7; phospholipase C, beta 4 [Affymetrix Nummer 203895_at], SEQ ID Nummer 8 oder 122; Solute carrier family 31 (copper transporters), member 2 [Affymetrix Number 204204_at], SEQ ID Nummer 12; Group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix Nummer 204965_at], SEQ ID Nummer 19; Profilin 2 [Affymetrix Nummer 204992_s_at], SEQ ID Nummer 21 oder 124; LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix Nummer 205969_at], SEQ ID Nummer 33; Down syndrome critical region gene 6 [Affymetrix Nummer 207267_s_at], SEQ ID Nummer 38; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix Nummer 209901_x_at], SEQ ID Nummer 45, 139 oder 140; Major histocompatibility complex, dass II, DP alpha 1 [Affymetrix Nummer 211991_s_at], SEQ ID Nummer 49; Aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1 [Affymetrix Nummer 212224_at], SEQ ID Nummer 50; Plexin D 1 [Affymetrix Nummer 212235_at], SEQ ID Nummer 51; Hypothetical protein PP1665 [Affymetrix Nummer 213343_s_at], SEQ ID Nummer 54; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68; A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 [Affymetrix Nummer 222162_s_at], SEQ ID Nummer 70.
Im diagnostischen Einsatz werden die Werte eines oder mehrerer (vorzugsweise mindestens zweier) der beschriebenen Gene oder ihrer translatierten Proteine beispielsweise im Blut bestimmt. Die Bestimmung von RNA im Blut erfolgt über die Isolierung von RNA aus dem Citratplasma, Umschreibung in cDNA und anschließender PCR. Die Bestimmung von Proteinen im Blut kann mittels Western-Blot, ELISA oder Luminex^® Technologie erfolgen. Die so erhaltenen Werte werden mit den Normalwerten eines Individuums (oder mit gesundem Gewebe des Patienten) verglichen, um ein kolorektales Karzinom frühzeitig diagnostizieren zu können.
Der Fachmann wird zur Bestimmung eines kolorektalen Karzinoms oder zu dessen Früherkennung vorzugsweise mindestens eines, mehr bevorzugt mindestens zwei und am meisten bevorzugt mindestens drei der hier dargestellten Markergene in Form ihres Expressionsprofils untersuchen. Am meisten bevorzugt wird das Expressionsprofil definiert durch die folgenden Gene: LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Glucosaminyl (N- acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68.
Beispiel 6: 55 Gene und eine Auswahl davon aus Tabelle 3, die als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms geeignet sind
Die Werte der Spalte 7 in Tabelle 3 (T-Test) zeigen eine signifikant differenzielle Expression der 55 beschriebenen Gene für Kolonmucosa und kolorektale Karzinome. Daraus erschließt sich der Einsatz dieser Gene, als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms. Aufgrund einer besonders hohen Signifikanz von p < 0,05 im T-Test (Spalte 7, Tabelle 3), eignet sich folgende Genauswahl (18 Gene) besonders gut im Einsatz als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms: LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68; Phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila) [Affymetrix Nummer 203708_at], SEQ ID Nummer 78 oder 157; Solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 2 [Affymetrix Nummer 205097_at], SEQ ID Nummer 83; Pleiomorphic adenoma gene 1 [Affymetrix Nummer 205372_at], SEQ ID Nummer 85; KIAA0672 gene product [Affymetrix Nummer 205414_s_at], SEQ ID Nummer 86; PTK7 protein tyrosine kinase 7 [Affymetrix Nummer 207011_s_at], SEQ ID Nummer 92, 159, 160, 161 oder 162; Homeo box A9 [Affymetrix Nummer 209905_at], SEQ ID Nummer 99 oder 170; Interleukin 1 receptor, type II [Affymetrix Nummer 211372_s_at], SEQ ID Nummer 101, 171 oder 172; Protein Ofucosyltransferase 1 [Affymetrix Nummer 212349_at], SEQ ID Nummer 103 oder 174; Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix Nummer 212531_at], SEQ ID Nummer 104; Paraneoplastic antigen [Affymetrix Nummer 213230_at], SEQ ID Nummer 105; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix Nummer 214677_x_at], SEQ ID Nummer 109 oder 177; Chromosome 14 open reading frame 18 [Affymetrix Nummer 217988_at], SEQ ID Nummer 112, 178, 179 oder 180; Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 [Affymetrix Nummer 219697_at], SEQ ID Nummer 114; LBP protein; likely ortholog of mouse CRTR-1 [Affymetrix Nummer 219735_s_at], SEQ ID Nummer 115; Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 [Affymetrix Nummer 220658_s_at], SEQ ID Nummer 118.
Im diagnostischen Einsatz werden die Werte eines oder mehrerer (vorzugsweise mindestens zweier) der beschriebenen Gene oder ihrer translatierten Proteine beispielsweise im Blut bestimmt und mit den Normalwerten eines Individuums verglichen, um eine Tumorerkrankung frühzeitig diagnostizieren zu können. Die „Normalwerte eines Individuums" können die Werte eines nicht erkrankten Individuums sein oder aber auch, wie oben erwähnt, von gesundem Gewebe des erkrankten Patienten stammen.
Beispiel 7: Auswahl an Genen der Tabellen 2 und 3, die besonders gut als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms geeignet sind
Die Genauswahl aus den 72 Genen der Tabelle 2 (Beispiel 5) kombiniert mit der Genauswahl aus den 55 Genen der Tabelle 3 (Beispiel 6) stellen ein erstes „minimal set" von 33 Markergenen dar, das sich in Bezug auf eine besonders signifikant differentielle Expression, gemessen an p < 0,05 im T-Test (Tabelle 2 und Tabelle 3, Spalte 7) aus der Menge der gesamten 120 Markergene abhebt und daher von besonderer diagnostischer Relevanz ist. Bei den Genen handelt es sich um: Major histocompatibility complex, class II, DP beta 1 [Affymetrix Nummer 201137_s_at], SEQ ID Nummer 2; CD163 antigen [Affymetrix Nummer 203645_s_at], SEQ ID Nummer 7; phospholipase C, beta 4 [Affymetrix Nummer 203895_at], SEQ ID Nummer 8 oder 122; Solute carrier family 31 (copper transporters), member 2 [Affymetrix Number 204204_at], SEQ ID Nummer 12; Group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix Nummer 204965_at], SEQ ID Nummer 19; Profilin 2 [Affymetrix Nummer 204992_s_at], SEQ ID Nummer 21 oder 124; LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix Nummer 205969_at], SEQ ID Nummer 33; Down syndrome critical region gene 6 [Affymetrix Nummer 207267_s_at], SEQ ID Nummer 38; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix Nummer 209901_x_at], SEQ ID Nummer 45, 139 oder 140; Major histocompatibility complex, dass II, DP alpha 1 [Affymetrix Nummer 211991_s_at], SEQ ID Nummer 49; Aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1 [Affymetrix Nummer 212224_at], SEQ ID Nummer 50; Plexin D1 [Affymetrix Nummer 212235_at], SEQ ID Nummer 51; Hypothetical protein PP1665 [Affymetrix Nummer 213343_s_at], SEQ ID Nummer 54; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68; A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 [Affymetrix Nummer 222162_s_at], SEQ ID Nummer 70; Phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila) [Affymetrix Nummer 203708_at], SEQ ID Nummer 78 oder 157; Solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 2 [Affymetrix Nummer 205097_at], SEQ ID Nummer 83; Pleiomorphic adenoma gene 1 [Affymetrix Nummer 205372_at], SEQ ID Nummer 85; KIAA0672 gene product [Affymetrix Nummer 205414_s_at], SEQ ID Nummer 86; PTK7 protein tyrosine kinase 7 [Affymetrix Nummer 207011_s_at], SEQ ID Nummer 92, 159, 160, 161 oder 162; Homeo box A9 [Affymetrix Nummer 209905_at], SEQ ID Nummer 99 oder 170; Interleukin 1 receptor, type II [Affymetrix Nummer 211372_s_at], SEQ ID Nummer 101, 171 oder 172; Protein O-fucosyltransferase 1 [Affymetrix Nummer 212349_at], SEQ ID Nummer 103 oder 174; Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix Nummer 212531_at], SEQ ID Nummer 104; Paraneoplastic antigen [Affymetrix Nummer 213230_at], SEQ ID Nummer 105; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix Nummer 214677_x_at], SEQ ID Nummer 109 oder 177; Chromosome 14 open reading frame 18 [Affymetrix Nummer 217988_at], SEQ ID Nummer 112; Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 [Affymetrix Nummer 219697_at], SEQ ID Nummer 114; LBP protein; likely ortholog of mouse CRTR-1 [Affymetrix Nummer 219735_s_at], SEQ ID Nummer 115; Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 [Affymetrix Nummer 220658_s_at], SEQ ID Nummer 118. Vorzugsweise werden aus der hier dargestellten Gensammlung von 33 Genen wiederum mindestens 18 bestimmt, wobei diese 18 zur Früherkennung eines kolorektalen Karzinoms dienen können. Bevorzugte Auswahl bei diesen 18 Markergenen sind z.B. die Gene mit den SEQ ID NOs: 2, 7, 8 (oder 122), 12, 19, 21 (oder 124), 25, 33, 38, 41 (oder 136, 137, 138), 45 (oder 139, 140), 49, 50, 51, 54, 66, 68 und 70 (siehe auch Beispiel 5) oder die Gene mit den SEQ ID NOs: 25, 41 (oder 136, 137, 138), 68, 78 (oder 157), 83, 85, 86, 92 (oder 159, 160, 161, 162), 99 (oder 170), 101 (oder 171, 172), 103 (oder 174), 104, 105, 109 (oder 177), 112, 114, 115 und 118 (siehe auch Beispiel 6). Der Fachmann kann durchaus die hier dargestellten Ergebnisse zur Zusammenstellung weiterer diagnostischer Auswahlen verwenden. So ist es ihm, inter alia, möglich aus den beigefügten Tabellen die relevanten diagnostischen Markergene zu bestimmen und die entsprechende Auswahl zu treffen.
Die hierin als bevorzugt benannten Markergenauswahlen umfassen bevorzugte Ausführungsformen. So kann der Fachmann durchaus die 18 Gene, wie in Beispiel 6 dargestellt, kombinieren.
Durch den Vergleich der Gene, die entsprechend Tabelle 2 und Tabelle 3 eine differentielle Expression zwischen kolorektalen Karzinomen und Mucosa aufwiesen, ließen sich drei Gene identifizieren, die in beiden Auswahlen (Beispiel 5 und Beispiel 6) berücksichtigt wurden und die eine besonders signifikant differentielle Expression aufwiesen. Diese drei Gene sind in Form einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung zur Früherkennung eines kolorektalen Karzinoms anzusehen. Bevorzugt wird mindestens eines dieser drei Gene, mehr bevorzugt mindestens zwei und am meisten bevorzugt alle drei Gene bestimmt. Der Fachmann wird daraus auch das Expressionsprofil weiterer Gene (z.B. ausgewählt aus den „Minimal sets" der hier genannten 72, 55, 33, 18 Gene) zur Diagnostik heranzuziehen. Die besondere Auswahl dieser drei Gene stellt ein weiteres „minimal set" dar, dass von großer diagnostischer Relevanz ist. Bei den Genen handelt es sich um: LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68.
Die Gene dieser hier dargestellten „minimal sets" sind im Rahmen einer Krebs-Vorsorgeuntersuchung von besonderem Interesse, da diese 33, 18, 18 bzw. drei Gene als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms besonders gut geeignet sind. Entsprechende Daten sind ebenfalls der Tabelle B zu entnehmen.
Tabelle B zeigt den Unterschied im Expressionsprofil/Expressionsniveau der definierten Gene im Vergleich von gesunder Mucosa (Muc) und dem Tumorgewebe (Tu). Ein „↓" bedeutet hierbei, dass das entsprechende Gen in Mucosa gegenüber Tumoren ein niedrigeres Expressionsniveau hat, während ein „↑" bedeutet, dass das entsprechende Gen in gesundem Gewebe gegenüber dem Tumorgewebe ein höheres Expressionsnivau hat. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass „↓" in der Tabelle B bedeutet, dass das entsprechende Gen im Tumorgewebe ein höheres Expressionsniveau zeigt, als in der gesunden Mucosa und dass „↑" bedeutet, dass das entsprechende Gen im Tumorgewebe ein niedrigeres Expressionsniveau zeigt, als in der gesunden Mucosa.
In Beispiel 8 und den folgenden Beispielen wird dargelegt, dass sich die erfindungsgemäßen 120 Gene (SEQ ID NOs: 1 bis 181) ebenfalls zur Bestimmung einer Lebermetastase von einem kolorektalen Karzinom eignen. Somit kann eine Lebermetastase, abhängig von einem kolorektalen Karzinom, vorzugsweise eines bereits diagnostizierten kolorektalen Karzinoms bestimmt werden.
Beispiel 8: Die 72 Gene aus Tabelle 2 lassen sich ebenfalls zur Prädiktion von Lebermetastasen von kolorektalen Karzinomen einsetzen
Die Werte aus Spalte 10 der Tabelle 2 zeigen eine differenzielle Expression der 72 beschriebenen Gene zwischen kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Lebermetastasen. In Spalte 10 wird der T-Test zwischen Lebermetastasen gegenüber dem Tumor dargestellt. Aus diesem Grund eignen sich diese Gene als Markergene zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms.
Beispiel 9: Minimal-Auswahl („minimal set") an Genen aus Tabelle 2, die zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines kolorektalen Karzinoms besonders gut geeignet sind
Unter Berücksichtigung der Signifikanz ab einem Wert kleiner als 0,05 im T-Test in Spalte 10 der Tabelle 2, ließen sich 20 Gene identifizieren, bei denen eine besonders deutliche differentielle Expression zwischen kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Lebermetastasen zu verzeichnen war (siehe auch Tabelle C, erste Spalte). Bei den Genen handelt es sich um: Aldolase B, fructose-bisphosphate [Affymetrix Nummer 204705_x_at], SEQ ID Nummer 17; Group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix Nummer 204965_at], SEQ ID Nummer 19; Fibrinogen, B beta polypeptide [Affymetrix Nummer 204988_at], SEQ ID Nummer 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ID Nummer 22; Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor [Affymetrix Nummer 205477_s_at], SEQ ID Nummer 26; Fibrinogen A alpha polypeptide [Affymetrix Nummer 205650_s_at], SEQ ID Nummer 29 oder 125; Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix Nummer 205754_at], SEQ ID Nummer 30; Pre-alpha (globulin) inhibitor, H3 polypeptide [Affymetrix Nummer 205755_at], SEQ ID Nummer 31; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix Nummer 205969_at], SEQ ID Nummer 33; Asialoglycoprotein receptor 2 [Affymetrix Nummer 206130_s_at], SEQ ID Nummer 35, 133, 134 oder 135; Amyloid P component, serum [Affymetrix Nummer 206350_at], SEQ ID Nummer 37; Haptoglobin [Affymetrix Nummer 208470_s_at], SEQ ID Nummer 40; Alpha-1 Antitrypsin [Affymetrix Nummer 211429_s_at], SEQ ID Nummer 48, 151 oder 152; Transferrin [Affymetrix Nummer 214063_s_at], SEQ ID Nummer 58; Complement component 4A [Affymetrix Nummer 214428_x_at], SEQ ID Nummer 59; Similar to Human Ig rearranged gamma chain mRNA, V-J-C region [Affymetrix Nummer 214669_x_at], SEQ ID Nummer 64; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Fibrinogen, gamma polypeptide [Affymetrix Nummer 219612_s_at], SEQ ID Nummer 69 oder 156; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix Nummer 37020_at], SEQ ID Nummer 71; Hemopexin [Affymetrix Nummer 39763_at] SEQ ID Nummer 72.
Die zuvor genannten 20 Gene stellen eine besonders geeignete Auswahl dar, die es im Rahmen einer Standarduntersuchung dieser Markergene ermöglicht, das Vorhandensein bzw. das Wachstum von Lebermetastasen aufgrund eines primären kolorektalen Karzinoms zu untersuchen. Beim entsprechenden Expressionsprofil/Expressionsniveau eines einzelnen zu bestimmenden Gens in der Tabelle C bedeutet „↑", dass das entsprechende Gen in der Metastase gegenüber dem Primär-Tumor hochreguliert ist, während „↓" bedeutet, dass das Gen entsprechend herunter reguliert ist.
Beispiel 10: Die 55 Gene aus Tabelle 3, lassen sich zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms einsetzen
Die Werte aus Spalte 10 der Tabelle 3 zeigen eine differenzielle Expression der 55 beschriebenen Gene zwischen kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Lebermetastasen. Aus diesem Grund eignen sich diese Gene als Markergene zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines bereits diagnostizierten kolorektalen Karzinoms; siehe Tabelle 3.
Beispiel 11: Minimal-Auswahl an Genen aus Tabelle 3, die zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms besonders gut geeignet sind
Unter Berücksichtigung der Signifikanz ab einem Wert kleiner als 0,05 im T-Test in Spalte 10 der Tabelle 3, ließen sich zwei Gene identifizieren, bei denen eine besonders deutliche differentielle Expression zwischen kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Lebermetastasen zu verzeichnen war. Bei den Genen handelt es sich um: Tenascin C (hexabrachion) [Affymetrix Nummer 201645_at], SEQ ID Nummer 74; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix Nummer 214677_x_at], SEQ ID Nummer 109 oder 177; siehe auch Tabelle C. Beim entsprechenden Expressionsprofil/Expressionsniveau eines einzelnen zu bestimmenden Gens in der Tabelle C bedeutet „↑", dass das entsprechende Gen in der Metastase gegenüber dem Primär-Tumor hochreguliert ist, während „↓" bedeutet, dass das Gen entsprechend herunter reguliert ist.
Die zuvor genannten zwei Gene stellen eine besonders geeignete Auswahl dar, die es im Rahmen einer Standarduntersuchung dieser Markergene ermöglicht, das Wachstum von Lebermetastasen aufgrund eines primären kolorektalen Karzinoms zu untersuchen.
Vorzugsweise werden diese beiden Gene gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Genen zur entsprechenden Diagnostik herangezogen. In einer bevorzugten Diagnostik werden diese beiden Gene mit mindestens einem weiteren Gen aus Tabelle C, Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 kombiniert, jedoch können auch andere Gene der SEQ ID NOs 1 bis 73, 75 bis 108, 110 bis 176 und 178 bis 181 zur Diagnostik herangezogen werden. Die entsprechende Information befindet sich ebenfalls in der Spalte 10 der Tabellen 2 und 3.
Beispiel 12: Auswahl an Genen der Tabellen 2 und 3, die sich besonders gut zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms eignen
Die Summe der 20 ausgewählten Gene aus Tabelle 2 und die zwei ausgewählten Gene aus Tabelle 3 stellen das bevorzugte „minimal set" an Markergenen dar und sind daher von sehr großer diagnostischer Bedeutung; siehe auch Tabelle C mit den entsprechenden Erklärungen in den vorhergehenden Beispielen. Bei den Genen handelt es sich um: Aldolase B, fructose-bisphosphate [Affymetrix Nummer 204705_x_at], SEQ ID Nummer 17; Group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix Nummer 204965_at], SEQ ID Nummer 19; Fibrinogen, B beta polypeptide [Affymetrix Nummer 204988_at], SEQ ID Nummer 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ID Nummer 22; Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor [Affymetrix Nummer 205477_s_at], SEQ ID Nummer 26; Fibrinogen A alpha polypeptide [Affymetrix Nummer 205650_s_at], SEQ ID Nummer 29 oder 125; Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix Nummer 205754_at], SEQ ID Nummer 30; Pre-alpha (globulin) inhibitor, H3 polypeptide [Affymetrix Nummer 205755_at], SEQ ID Nummer 31; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix Nummer 205969_at], SEQ ID Nummer 33; Asialoglycoprotein receptor 2 [Affymetrix Nummer 206130_s_at], SEQ ID Nummer 35, 133, 134 oder 135; Amyloid P component, serum [Affymetrix Nummer 206350_at], SEQ ID Nummer 37; Haptoglobin [Affymetrix Nummer 208470_s_at], SEQ ID Nummer 40; Alpha-1 Antitrypsin [Affymetrix Nummer 211429_s_at], SEQ ID Nummer 48, 151 oder 152; Transferrin [Affymetrix Nummer 214063_s_at], SEQ ID Nummer 58; Complement component 4A [Affymetrix Nummer 214428_x_at], SEQ ID Nummer 59; Similar to Human Ig rearranged gamma chain mRNA, V-J-C region [Affymetrix Nummer 214669_x_at], SEQ ID Nummer 64; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Fibrinogen, gamma polypeptide [Affymetrix Nummer 219612_s_at], SEQ ID Nummer 69 oder 156; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix Nummer 37020_at], SEQ ID Nummer 71; Hemopexin [Affymetrix Nummer 39763_at] SEQ ID Nummer 72; Tenascin C (hexabrachion) [Affymetrix Nummer 201645_at], SEQ ID Nummer 74; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix Nummer 214677_x_at], SEQ ID Nummer 109 oder 177.
Die Untersuchung der Expressionsniveaus dieser ausgewählten Gene ist im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms von besonders großem Interesse, da sich die 22 Gene besonders gut als Markergene für den Nachweis bereits ausgeprägter, korrespondierender Lebermetastasen einsetzen lassen.
Die folgenden Beispiele belegen, dass die hier identifizierten 120 Gene auch zur Bestimmung/Prädiktion des Therapieverlaufs einer 5-FU-hatigen Chemotherapie bei der Behandlung von Metastasen, insbesondere von Lebermetastasen, verwendet werden können.
Hierbei werden in den folgenden Beispielen bevorzugt Lebermetastasen untersucht.
Beispiel 13: 72 Gene aus Tabelle 1, die sich zur Prädiktion des Therapieverlaufs von Patienten mit Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms im Falle einer 5-FU haltigen Chemo- oder Kombinationstherapie eignen
Durch den Vergleich der Genexpression in Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms zwischen Patienten, die auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen („responder") und Patienten, die nicht auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen („non-responder"), konnte eine signifikant differentielle Expression bei 72 Genen identifiziert werden, siehe auch Tabelle 1 und Tabelle A erste Spalte.
Eines oder mehrere der beschriebenen Gene, Genfragmente, komplementäre Nukleinsäuren oder translatierte Proteine eignen sich aus diesem Grund gut zur Prädiktion der Effektivität einer 5-FU basierten Chemo- oder Kombinationstherapie (5-FU z.B. in Kombination mit Folinsäure, Irinotecan, Oxaliplatin und anderen).
In Tabelle A wird für dieses Beispiel (und die folgenden Beispiele) dargelegt, dass sich das Expressionsniveau der einzelnen Gene bestimmen und insbesondere zwischen „Respondern" und „Non-Respondern" unterscheiden lässt. Daten für die 120 erfindungsgemäßen Gene sind in den Tabellen 1 und 4 aufgeführt.
In Tabelle A werden die bevorzugt zu analysierenden Gene dargestellt. Hierbei bedeutet „↑", dass das entsprechende Gen bei Patienten, die auf eine 5-FU-haltige Chemo- und/oder Kombinationstherapie ansprechen („Responder") gegenüber den Patienten, die nicht ansprechen („Non-Responder") stärker exprimiert („hochreguliert") ist. Dagegen bedeutet das „↓" eine schwächere Expression des entsprechenden Gens in „Respondern" versus „Non-Respondern".
Generell im Kontext mit dieser Erfindung bedeutet das Wort „Expressionsniveau" somit einen messbar zu bestimmenden Wert der Expression des zu untersuchenden Gens, wobei dieser Wert sich, wie in den Tabellen dargelegt und in Beispiel 2 dargestellt, auf das Expressionsprofil der RNA in der Probe bezieht. Der Fachmann kann jedoch in den hier dargestellten Verfahren (zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms, zur Prädiktion von Metastasen, als auch zur Prädiktion des Ansprechens auf eine 5-FU Therapie) das Expressionsniveau durch andere Analysen bestimmen (z.B. Bestimmung der Proteinmenge, der durch die Gene SEQ ID NOs: 1 bis 181 kodierten Proteine, Peptide oder Peptidabschnitte). Diese Analysen umfassen, z.B. und nicht limitierend, Immundetektionsverfahren wie Westernblot, ELISA, RIA, Immunopräzipitation, als auch FACS-Analysen.
Beispiel 14: 55 Gene aus Tabelle 4, die sich zur Prädikoon des Therapieverlaufs von Patienten mit Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms im Falle einer 5-FU haltigen Chemo- oder Kombinationstherapie eignen
Durch den Vergleich der Genexpression in Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms zwischen Patienten, die auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen und Patienten, die nicht auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen, konnte eine signifikant differentielle Expression bei 55 Genen identifiziert werden; siehe Tabelle 4 und Tabelle A (zweite Spalte).
Eines oder mehrere der beschriebenen Gene, Genfragmente, komplementäre Nukleinsäuren oder translatierte Proteine eignen sich aus diesem Grund gut zur Prädiktion der Effektivität einer 5-FU basierten Chemo- oder Kombinationstherapie (5-FU z.B. in Kombination mit Folinsäure, Irinotecan, Oxaliplatin und anderen).
Beispiel 15: Auswahl an Genen aus Tabellen 1 und 4, die sich als Markergene zur Prädiktion des Therapieverlaufs von Patienten mit Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms im Falle einer 5-FU haltigen Chemo- oder Kombinationstherapie einsetzen lassen
Durch den Vergleich der Genexpression in Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms zwischen Patienten, die auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen und Patienten, die nicht auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen, unter Berücksichtigung der Signifikanzen in der vergleichenden statistischen Analyse (t-, Welsh- und Wilcoxon-Test); siehe Tabelle A Spalte 7, 8, 9 und 10 konnten in den Tabellen 1 und 4 insgesamt 34 besonders signifikant differentiell exprimierte Gene identifiziert werden. Neben der statistischen Auswahl zur Reduktion der Genliste wurden auch die Daten der „Principal Component Analyse" (PCA) herangezogen. Bei der „Principal Component Analyse" (PCA) handelt es sich um ein Verfahren, mit dem man Variablen gemäß ihrer korrelativen Beziehungen in voneinander relativ unabhängige Gruppen klassifizieren kann und eine Reduktion der vorhandenen Dimensionen auf wenige Grundkomponenten durchführen kann. Das Ergebnis der Faktorenanalyse sind wechselseitig voneinander relativ unabhängige Faktoren, welche die Zusammenhänge zwischen den in ihnen gebündelten Variablen erklären. Sie ist somit ein datenreduzierendes und hypothesengenerierendes Verfahren, welches geeignet ist, die Dimensionalität komplexer Merkamle zu überprüfen. Anhand der „Ladungen" (ähnliche Gene) der einzelnen Konstrukte auf den Hauptkomponenten können die Dimensionen inhaltlich definiert werden. Ladungen informieren im Rahmen faktorenanalytischer Verfahren allgemein darüber, wie gut eine Variable zu einer Variablengruppe passt. Hierbei wurden jene Gene, die in der ersten Auswahl, siehe Tabelle A, Spalten 1 und 2, eine deutliche Trennung zwischen Lebermetastasen und Primärtumor, unabhängig von ihrem prädiktiven Potential bzgl. Ansprechen, zeigten nicht für die Auswahl der 28 Gene in Tabelle A, Spalte 4 berücksichtigt. Die hier repräsentierten Gene stellen somit das Optimum bzgl. Responseprädiktion und statistischer Signifikanz dar.
Bei diesen Genen handelt es sich um: Apolipoprotein E [Affymetrix Nummer 203382_s_at], SEQ ID Nummer 6; CD163 antigen [Affymetrix Nummer 203645_s_at], SEQ ID Nummer 7; Phospholipase C, beta 4 [Affymetrix Nummer 203895_at], SEQ ID Nummer 8 oder 122; Chromosome 11 open reading frame 9 [Affymetrix Nummer 204073_s_at], SEQ ID Nummer 10; Apolipoprotein C-I [Affymetrix Nummer 204416_x_at], SEQ ID Nummer 13; Sialyltransferase [Affymetrix Nummer 204542_at], SEQ ID Nummer 14; Coagulation factor C homolog, cochlin (Limulus polyphemus) [Affymetrix Nummer 205229_s_at], SEQ ID Nummer 24; LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix Nummer 209901_x_at], SEQ ID Nummer 45, 139 oder 140; Hyaluronoglucosaminidase 1 [Affymetrix Nummer 210619_s_at], SEQ ID Nummer 46, 141, 142, 143, 144, 145, 146 oder 147; Alpha-1 Antitrypsin [Affymetrix Nummer 211429_s_at], SEQ ID Nummer 48, 151 oder 152; Low density lipoprotein receptorrelated protein 4 [Affymetrix Nummer 212850_s_at], SEQ ID Nummer 52; Hypothetical protein PP1665 [Affymetrix Nummer 213343_s_at], SEQ ID Nummer 54; Serum amyloid A2 [Affymetrix Nummer 214456_x_at], SEQ ID Nummer 60; Orosomucoid 2 [Affymetrix Nummer 214465_at], SEQ ID Nummer 61; Eyes absent homolog 1 (Drosophila) [Affymetrix Nummer 214608_s_at], SEQ ID Nummer 63, 153, 154 oder 155; H factor (complement)-like 1 [Affymetrix Nummer 215388_s_at], SEQ ID Nummer 65; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68; Fascin homolog 1, actin-bundling protein (Strongylocentrotus purpuratus) [Affymetrix Nummer 201564_s_at], SEQ ID Nummer 73; Phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila) [Affymetrix Nummer 203708_at], SEQ ID Nummer 78 oder 157; Biliverdin reductase A [Affymetrix Nummer 203771_s_at], SEQ ID Nummer 79; IGF-II mRNA-binding protein 3 [Affymetrix Nummer 203819_s_at], SEQ ID Nummer 80; Cathepsin E [Affymetrix Nummer 205927_s_at], SEQ ID Nummer 89 oder 181; Keratin 6A [Affymetrix Nummer 209125_at], SEQ ID Nummer 97, 167 oder 168; spondin 1, (f-spondin) extracellular matrix protein [Affymetrix Nummer 209436_at], SEQ ID Nummer 98 oder 169; Interleukin 1 receptor, type II [Affymetrix Nummer 211372_s_at], SEQ ID Nummer 101, 171 oder 172; Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix Nummer 212531_at], SEQ ID Nummer 104; G protein-coupled receptor 49 [Affymetrix Nummer 213880_at], SEQ ID Nummer 107; Spondin 1, (f-spondin) extracellular matrix protein [Affymetrix Nummer 213994_s_at], SEQ ID Nummer 108 oder 176; Frizzled homolog 10 (Drosophila) [Affymetrix Nummer 219764_at], SEQ ID Nummer 116; Deafness locus associated putative guanine nucleotide exchange factor [Affymetrix Nummer 220482_s_at], SEQ ID Nummer 117; CDW52 antigen (CAMPATH-1 antigen) [Affymetrix Nummer 34210_at], SEQ ID Nummer 120.
Dementsprechend stellt die Erfindung vorzugsweise eine Auswahl aus den 120 gargestellten Genen dar, nämlich 34, vorzugsweise 28, welche insbesondere zur Bestimmung der Responsivität auf 5-FU-haltige Therapien herangezogen werden können.
Eines oder mehrere (vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens drei) der beschriebenen Gene, Genfragmente, komplementäre Nukleinsäuren oder translatierte Proteine eignen sich aus diesem Grund besonders gut zur Prädiktion der Effektivität einer 5-FU basierten Chemo- oder Kombinationstherapie (5-FU z.B. in Kombination mit Folinsäure, Irinotecan, Oxaliplatin und anderen). Bevorzugte mindestens 3 Gene sind, inter alia, die Gene 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, dargestellt in den SEQ ID NOs: Chromosome 11 open reading frame 9 [Affymetrix Nummer 204073_s_at], SEQ ID Nummer 10; Sialyltransferase [Affymetrix Nummer 204542_at], SEQ ID Nummer 14; LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s-at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Low density lipoprotein receptor-related protein 4 [Affymetrix Nummer 212850_s_at], SEQ ID Nummer 52; Eyes absent homolog 1 (Drosophila) [Affymetrix Nummer 214608_s_at], SEQ ID Nummer 63, 153, 154 oder 155; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68.
Beispiel 16: Individuelle Therapie von Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms abgeleitet aus den Expressionsdaten der jeweiligen Patienten
Herr T. ist ein 42 jähriger Patient, bei dem im Juli 2003 ein subtotal stenosierendes Sigmakarzinom mit Lebermetastasierung diagnostiziert wurde. Der Primärtumor wurde am 18.07.2003 komplett (R0) reseziert und parallel dazu wurde aus einer der Lebermetastasen eine Biopsie gewonnen. Diese Lebermetastase wurde (gemäß der Beispiele 1 – 4) laser-mikrodisseziert, die RNA isoliert und amplifiziert. Anschließend wurde die amplifizierte RNA auf einem Affymetrix-Chip HG U133-A hybridisiert und das Expressionsmuster ausgelesen. Das Ergebnis der Analysen stand am 05.09.2003 fest (siehe Tabelle 5, Spalte 4) und ergab eine Gen-Signatur, die ein gutes Ansprechen prädizierte (Beispiele 13 bis 15).
Der Patient wurde nach der Operation mit einer palliativen Chemotherapie, bestehend aus Folinsäure und 5-Fluorourcil als 24-h Infusion (AIO-Regime) sowie mit Oxaliplatin alle 2 Wochen behandelt. Am 06.08.2004 wurde mit dem ersten Zyklus der Behandlung begonnen und es zeigte sich bereits bei der ersten Kontrolle des Tumor-Ansprechens mittels Computertomografie (CT) am 24.09.2003 ein Ansprechen auf die Chemotherapie. Nach Beendigung des zweiten Zyklus konnte eine partielle Remission (Verkleinerung der Lebermetastasen um > 50%) erreicht werden. Es wurde daher ein 3. und ein 4. Zyklus dieser Chemotherapie (CTx) gegeben. Die vorläufig letzte Kontrolle des Tumor-Ansprechens fand am 23.03.2004 statt. Die Referenzmetastase hat sich von ursprünglich (CT Befund vom 04.08.2003; vor Chemotherpapie) 12,9 × 9,0 cm auf nunmehr 4,2 × 7,6 cm (CT Befund vom 25.03.2004; nach 4 Zyklen Chemotherapie) verkleinert (Reduktion um 72,6 %; entspricht einer partiellen Remission nach WHO-Kriterien) Die CT-Befunde dieses Patienten vor Chemotherapie und nach dem 4. Chemotherapie-Zyklus finden sich in der 5. Auch die anderen Lebermetastasen waren größenregredient und es traten keine neuen Metastasen auf. Der Patient lebt zum jetzigen Zeitpunkt (Mai 2004), es wird sogar eine sekundär kurative Metastasenchirurgie diskutiert.
Die Genexpressionsprofile, so wie sie in den Beispielen 13 bis 15 beschrieben sind, wurden an diesem Patienten prospektiv getestet, da das Ergebnis der Untersuchungen bereits am 05.09.2004, also 15 Tage vor der ersten Tumorkontrolle unter Chemotherapie feststand und das Genexpressions-Profil das Ansprechen auf die Therapie richtig prädizierte.; siehe Tabelle 5.
Tabelle A
Tabelle B
Tabelle C
Tabelle D Kongruenzliste der vergebenen SEQ ID NOs
Der Begriff „Variante" umfasst in dieser Erfindung bezüglich der hier offenbarten 120 Markergene sowohl Splicevarianten, als auch homologe oder hochhomologe Gene.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur (a) Erkennung eines kolorektalen Karzinoms; (b) Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms; und/oder (c) Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil-haltige Chemotherapie; umfassend die Bestimmung eines Genexpressionsprofils von 120 Markergenen (wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 181) oder einer Auswahl daraus.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Expressionsprofil mindestens zweier der 120 Markergene (SEQ ID NOs: 1 bis 181) bestimmt und mit einem Referenzwert verglichen wird.
Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem das Expressionsniveau mindestens zweier der 120 Gene ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID NOs: 1 bis 181 bestimmt und mit dem durchschnittlichen Expressionsniveau der Gene aus normaler Darmmucosa verglichen wird.
Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 72 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 1 bis 72 oder 121 bis 156 bestimmt wird.
Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüchen 1 bis 3, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 55 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, 73 bis 120, 136, 137, 138, 153, 154, 155 und 157 bis 181, bestimmt wird.
Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 33 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68, 70, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115, 118, 122, 124, 136 bis 140, 157, 159 bis 162, 170, 171, 172, 174 und 177 bis 180, bestimmt wird.
Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 18 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NO NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68, 70, 122, 124 und 136 bis 140, bestimmt wird.
Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 und 6, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 18 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 25, 41, 68, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115, 118, 136 bis 138, 157, 159 bis 162, 170 bis 172, 174 und 177 bis 180, bestimmt wird.
Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Anspüche 1 bis 8, bei dem das Expressionsprofil von 3 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 25, 41, 68 und 136 bis 138, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem das Expressionsniveau oder Expressionsprofil in einer Probe eines primären kolorektalen Karzinoms von mindestens zwei der 120 Gene ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID NOs: 1 bis 181 bestimmt und mit dem Expressionsniveau in Lebermetastasen und/oder in Lebergewebe verglichen wird.
Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2 und 10, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 72 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 1 bis 72 oder 121 bis 156, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2 und 10, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 55 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, 73 bis 120, 136, 137, 138, 153, 154, 155 und 157 bis 181, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2 und 10, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 22 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69, 71, 72, 74, 109, 125, 133, 134, 135, 151, 152, 156 und 177, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2, 10, 11 und 13, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 20 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69, 71, 72, 125, 133, 134, 135, 151, 152 und 156, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2, 10, 12 und 13 bei dem das Expressionsprofil von mindestens einem der beiden Markergene, wie definiert in den SEQ ID NOs: 74, 109 und 177, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracilhaltige Chemotherapie nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem das Expressionsniveau/Expressionsprofil in einer Probe einer Metastase mindestens zweier der 120 Gene ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID NO: 1 bis 181 bestimmt und mit dem Expressionsniveau von Respondern und/oder Non-Respondern verglichen wird.
Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracilhaltige Chemotherapie nach einem der Ansprüche 1, 2 und 16 bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 72 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 1 bis 72 oder 121 bis 156, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracilhaltige Chemotherapie nach einem der Ansprüchen 1, 2 und 16, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 55 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, 73 bis 120, 136, 137, 138, 153, 154, 155, und 157 bis 181, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracilhaltige Chemotherapie nach einem der Ansprüche 1, 2 und 16, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 34 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 10, 13, 14, 24, 25, 41, 45, 46, 48, 52, 54, 60, 61, 63, 65, 66, 68, 73, 78, 79, 80, 89, 97, 98, 101, 104, 107, 108, 116, 117, 120, 122, 136 bis 147, 151 bis 155, 157, 167, 168, 169, 171, 172, 176 und 181, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracilhaltige Chemotherapie nach nach einem der Ansprüche 1, 2, 16 und 19, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 28 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 13, 24, 45, 46, 48, 52, 54, 60, 61, 65, 66, 73, 78, 79, 80, 89, 97, 98, 101, 104, 107, 108, 116, 117, 120, 122, 139 bis 147, 151, 152, 157, 167, 168, 169, 171, 172, 176 und 181, bestimmt wird.
Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracilhaltige Chemotherapie nach einem der Ansprüche 1, 2, 16 bis 19, bei dem das Expressionsprofil von mindestens einem Gen von 7 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, 136, 137, 138, 153, 154, 155, bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, bei dem die Bestimmung des (Gen-) Expressionsprofils die Bestimmung mindestens eines Markergens umfasst, das mindestens 60 % homolog zu einem der in SEQ ID NO: 1 bis 120 dargestellten Markergene ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Expressionsprofil der Markergene aus einer Probe des Patienten gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Probe ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gewebsbiopsie, peritoneal Flüssigkeit, Blut, Urin, Serum und Stuhl.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Expressionsprofil der Markergene durch die Messung der Quantität an Markergen-mRNA bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Quantität von Markergen-mRNA mittels Genchiptechnologie, (RT-) PCR, Northern Hybridisierung, Dot-Blotting oder in situ Hybridisierung bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Expressionprofil der Markergene durch die Messung der Polypeptidquantität der Markergene bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Polypeptidquantität der Markergene durch ELISA, RIA, (Immuno-) Blotting, FACS oder immunhistochemische Methoden bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Erstellen des Genexpressionsprofils, wie in einem der Ansprüche 1 bis 28 definiert, in einer Patientenprobe; und (b) Bestimmen mit Hilfe des in (a) erstellten Genexpressionsprofils, ob der Patient i. an einem kolorektalen Karzinom leidet; ii. als Folge eines kolorektalen Karzinoms Metastasen aufweist; und/oder iii. auf eine 5-FU-haltige Chemotherapie der Metastasen anspricht.
Kit zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei das Kit spezifische (Nukleotid-) Sonden, Primer (-paare), Antikörper, Aptamere zur Bestimmung von mindestens zwei von 120 Markergenen, die in SEQ ID NO:1 bis 181 dargestellt sind, oder zur Bestimmung von mindestens zwei Genprodukten die von den 120 Markergenen, die in SEQ ID NO: 1 bis 181 codiert werden, umfasst.
Kit nach Anspruch 30, der ein diagnostisches Kit ist.
Verwendung mindestens eines der 120 Markergene oder einer Gruppe dieser 120 Markergene, dargestellt in SEQ ID NO: 1 bis 181 zur Bestimmung, ob der Patient (a) an einem kolorektalen Karzinom leidet; (b) als Folge eines kolorektalen Karzinoms Metastasen aufweist; und/oder (c) auf eine 5-FU-haltige Chemotherapie der Metastasen anspricht.
Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, das eines oder mehrere der in Anspruch 1 definierten Markergene über- oder unterexprimiert in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel.
Verwendung einer transgenen Zelle, die eines oder mehrere der in Anspruch 1 definierten Markergene über- oder unterexprimiert in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel.
Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Tieres gemäß Anspruch 33 oder einer transgenen Zelle gemäß Anspruch 34, in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel zur Behandlung von kolorektalen Karzinomen; und/oder Metastasen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 10 bis 21 und 29 und Verwendung nach Anspruch 32 und 35, wobei die Metastasen Lebermetastasen sind.