JP3376453B2

JP3376453B2 - 糸状菌及び細菌に対する溶菌活性を有するイネキチナーゼ相補ｄｎａを含む形質転換体

Info

Publication number: JP3376453B2
Application number: JP12390598A
Authority: JP
Inventors: 義文伊藤; ムーンパークスン; ナムハイチォン
Original assignee: 独立行政法人食品総合研究所; 生物系特定産業技術研究推進機構
Priority date: 1998-04-20
Filing date: 1998-04-20
Publication date: 2003-02-10
Anticipated expiration: 2018-04-20
Also published as: JPH11299488A; US6124126A

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【発明の属する技術分野】本発明は、糸状菌及び細菌に
対する溶菌活性を有するイネキチナーゼの相補ＤＮＡを
含む形質転換体であるピキア・パストリスに関する。【０００２】キチナーゼは、昆虫及び甲殻類の外皮や糸
状菌の細胞壁の構成成分であるキチンを加水分解する酵
素であり、微生物や植物に広く存在する。植物には、ク
ラスＩ〜Ｖの５種類のキチナーゼが存在するが、このう
ち、クラスＩ、II、IV及びＶのキチナーゼには、糸状菌
の細胞壁を分解する能力はあるが、細菌の細胞壁を分解
する能力はない。一方、クラスIII のキチナーゼは、細
菌の細胞壁を分解する能力はあるが、糸状菌の細胞壁を
分解する能力はない。本発明は、糸状菌、細菌のいずれ
に対しても溶菌活性をもつ新規なイネキチナーゼの相補
ＤＮＡの利用に関する。【０００３】【従来の技術】植物病原性微生物の感染による収穫量の
減少は、農業に甚大な損失を与える。このような微生物
による感染予防や感染の拡大阻止手段として、殺菌剤の
散布が行われている。しかしながら、近年、これらの殺
菌剤の環境や人体への影響に対する懸念から、化学物質
に頼らない病原菌感染防除技術の開発が求められてい
る。【０００４】植物には、病原性微生物の侵入を阻止する
ための特有の感染防除機構が存在する。具体的には、植
物が、病原性微生物が感染したことを感知すると、ファ
イトアレキシンと呼ばれる化合物や病原性関連蛋白質
（ＰＲ蛋白質）などの抗菌性蛋白質を生産し、感染から
植物体を防御している。ＰＲ蛋白質の中でも、微生物に
対する作用機構が最も明確なものとして、昆虫及び甲殻
類の外皮や糸状菌の細胞壁の構成成分であるキチンを加
水分解するキチナーゼが挙げられる。【０００５】前述の如く、植物のキチナーゼには、クラ
スＩ〜Ｖの５種類が存在するが、このうち、クラスＩ、
II、IV及びＶのキチナーゼには、糸状菌の増殖を阻害す
る抗カビ活性がある。これらのキチナーゼは、特に細胞
壁の合成が活発な菌糸の成長点に作用する。その結果、
増殖中の細胞が崩壊し、菌糸の伸長が阻害される。中で
も、キチン結合領域をもつクラスＩとIVの酵素の抗カビ
活性は特に高く、病原性糸状菌に対する抵抗性作物を開
発するための導入遺伝子として注目されている。【０００６】このような背景から、植物にキチナーゼの
相補ＤＮＡを導入して、病原性糸状菌に耐性な作物を開
発する研究が行われている。しかしながら、該導入遺伝
子にコードされるキチナーゼは、糸状菌の細胞壁を分解
することはできても、細菌の細胞壁を分解するリゾチー
ム活性はない。このため、該遺伝子でコードされるキチ
ナーゼを作物に導入しても、病原性細菌に対する耐性ま
では付与することができず、抵抗性作物としての特性と
しては不十分であった。【０００７】一方、古くから、植物にリゾチーム活性を
有する酵素が存在することが知られている。また、ゴム
の木の乳液に存在するヘバミンや幾つかのクラスIII キ
チナーゼは、細菌の細胞壁を溶解するリゾチーム活性を
有していることも知られている。しかしながら、ヘバミ
ンについては、その相補ＤＮＡや遺伝子に関する報告は
なく、また、リゾチーム活性を有するキチナーゼの相補
ＤＮＡについても知られていなかった。【０００８】抗カビ活性及びリゾチーム活性の両方を併
せ持つキチナーゼの相補ＤＮＡは、これまでに発見され
ていなかった。勿論、相補ＤＮＡから蛋白質を発現さ
せ、抗カビ活性とリゾチーム活性とを持つキチナーゼを
コードしていることも、実証されていなかった。【０００９】【発明が解決しようとする課題】本発明は、糸状菌と細
菌の両方の細胞壁を溶解する新規なキチナーゼをコード
する相補ＤＮＡを特定し、該配列を植物に導入すること
によって、広範な病原性微生物に対して抵抗性を獲得し
た組換え作物が開発できる可能性を実現することを目的
とするものである。【００１０】【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明者らは鋭意検討を続けた結果、糸状菌と細菌
の両方に対する溶菌活性を持つキチナーゼをコードする
相補ＤＮＡを、イネから以下のようにして単離すること
に成功した。【００１１】すなわち、本発明者らは、イネゲノムプロ
ジェクトが単離したＳ４９６０クローンに含まれる相補
ＤＮＡの全塩基配列を決定し、該クローンが、３０５ア
ミノ酸残基からなる分子量３２，２６０ダルトンの蛋白
質をコードする１，１０９ｂｐの相補ＤＮＡを含むこと
を明らかにした。該蛋白質のアミノ酸配列は、ゴムの木
の乳液に含まれるクラスIII のキチナーゼであるヘバミ
ンの配列と６８％の相同性があることから、キチナーゼ
である可能性が高いと判断した。【００１２】続いて、該蛋白質の発現系を構築するため
に、数種類の微生物を宿主に用いて、該蛋白質の発現系
を構築するための研究を行った。その結果、酵母の一種
であるピキア・パストリス（Pichia pastoris) を宿主
とした場合に、該蛋白質を効率的に分泌生産できること
を見出した。さらに、ピキア・パストリスで生産した該
蛋白質を精製し、精製蛋白質がグリコールキチンやキト
オリゴ糖を分解するキチナーゼであることを実証した。
さらに、精製キチナーゼが、糸状菌であるトリコデルマ
・リーゼイ（Trichoderma reesei）に対し抗カビ活性を
示すと同時に、細菌であるミクロコッカス・リソデイク
ティカス（Micrococcus lysodeikticus)の菌体を溶解す
るリゾチーム活性をも示すことを実証した。このように
して、本発明を完成するに至った。【００１３】請求項１記載の本発明は、配列表の配列番
号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするイ
ネキチナーゼ相補ＤＮＡを含むプラスミドベクターを有
する形質転換体であるピキア・パストリスである。【００１４】【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の形質転換体に含まれるイネキチナーゼ相補ＤＮ
Ａは、イネ由来のＤＮＡ配列の一部である。本発明者ら
は、抗カビ活性とリゾチーム活性を持つ植物クラスIII
キチナーゼをコードする全長の相補ＤＮＡを取得する目
的で、イネゲノムプロジェクト（ＲＧＰ；Rice Genome
Project, Japan）がイネ相補ＤＮＡのライブラリーを構
築して多数の相補ＤＮＡの部分配列を登録しているＤＮ
Ａデータベースに対し、タバコのクラスIII キチナーゼ
の相補ＤＮＡの配列（Lawton, K., Ward, E., Payne,
G., Moyer, M. and Ryals, J., Plant Mol. Biol., 19:
735-743, 1992)を用いてBlast ホモロジー検索(Altsch
ul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J.,
Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.J., Nucleic
Acids Res., 25:3389-3402, 1997)を行った。その結
果、Ｓ４９６０クローンの部分配列（４０５ｂｐ）が、
タバコのクラスIII キチナーゼの相補ＤＮＡと５９％の
相同性を持つことを見出した。【００１５】次いで、このＳ４９６０クローンに含まれ
る相補ＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列の決定
は、通常用いられる手段により達成することができる。
例えば、該相補ＤＮＡをファルマシア社製のＦｌｅｘ−
ｐｒｅｐプラスミド精製キットで調製して得られるプラ
スミドＤＮＡを鋳型とし、パーキンエルマー社製のダイ
プライマーサイクルシーケンシングキットを使用してシ
ーケンス反応を行う。さらに、ＤＮＡシーケンサー（モ
デルＡＢＩ３７７；パーキンエルマー社製）を用いて塩
基配列を決定することができる。【００１６】ここで、鋳型として用いるプラスミドＤＮ
Ａの調製は、アルカリ−ＳＤＳ法（Sambrook. J., Frit
sch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning. A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory P
ress, New York, 1989）によっても可能である。【００１７】また、塩基配列の決定は、Sangerの方法
(Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977)や Maxa
m-Gilvertの方法 (Maxam, A. M. and Gilvert, W., Met
hods Enzymol., 65: 499-560,1980)等に従って行うこと
もできる。【００１８】その結果、Ｓ４９６０クローンは、１，１
０９ｂｐの相補ＤＮＡを含むことが明らかとなり、３０
５アミノ酸残基からなる分子量３２，２６０ダルトンの
蛋白質をコードしていると推定された（配列表の配列番
号１参照）。この１，１０９ｂｐの相補ＤＮＡが、本発
明の形質転換体に含まれるイネキチナーゼ相補ＤＮＡで
ある。【００１９】このイネキチナーゼ相補ＤＮＡがキチナー
ゼをコードするものであることは、該ＤＮＡ配列から予
想される蛋白質のアミノ酸配列についてのホモロジー検
索の結果、ゴムの木のキチナーゼであるヘバミン（Jeke
l, P. A., Hartmann, B. H.,and Beintema, J. J., Eu
r. J. Biochem., 200: 123-130, 1991）と６８％の相同
性を有することから明らかである。【００２０】このようにして、全塩基配列が明らかとな
った１，１０９ｂｐの相補ＤＮＡを含むプラスミドを、
大腸菌ＤＨ５α（Bethesda Research Laborotories製）
に形質転換した。形質転換は、例えばInoue らの方法
（Inoue, H., Nojima, H. and Okayama,H., Gene, 96:
23-28, 1990）、塩化カルシウム法（Cohen, S. N., Cha
ng, A. C.Y. and Hsu, L., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 69: 2110-2114, 1972) 、エレクトポレーション法
(三浦謹一郎ら編、新基礎生化学実験法、遺伝子工
学、１９８８、丸善株式会社）等の通常用いられる方法
で行うことができる。形質転換した大腸菌は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託
番号はＦＥＲＭＢＰ−６２８６である。【００２１】なお、上述の方法は一例にすぎず、その他
の方法、例えばＳ４９６０の相補ＤＮＡをプローブとし
て、イネの相補ＤＮＡライブラリーからコロニーまたは
プラークハイブリダイゼーション法（Sambrook. J., Fr
itsch, E. F. and Maniatis,T., Molecular Cloning. A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, 1989）によっても、同一の配列をも
つ相補ＤＮＡを得ることもできる。【００２２】この相補ＤＮＡを用いて、以下の操作によ
りコードされるキチナーゼを生産し、抗カビ活性と細胞
壁溶解活性を実証した。まず、該酵素のアミノ酸配列
（配列表の配列番号１参照）の３０〜３０５番目の成熟
酵素領域を、オリゴＥ−１（配列表の配列番号２参照）
とオリゴＥ−２（配列表の配列番号３参照）の２つの合
成オリゴヌクレオチド（北海道システムサービス社製）
をプライマーとして、該クローンプラスミドから、ＫＯ
ＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を使用したＰＣＲ
法（Methods in Molecular Biology, 15巻、1993）で増
幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐ
ＥＴ−２２ｂ（＋）(Novagen社製) に連結してプラスミ
ドｐＯＩＳ５を得た。【００２３】さらに、オリゴＰ−１（配列表の配列番号
４参照：北海道システムサービス社製）とオリゴＰ−２
（配列表の配列番号５参照：北海道システムサービス社
製）とをプライマーに、プラスミドｐＯＩＳ５ＤＮＡ
を鋳型として、ＰＣＲ反応（ＫＯＤＤＮＡポリメラー
ゼを使用）を行い、増幅されたＤＮＡ断片を、プラスミ
ドベクターｐＰＩＣ９（Invitrogen社製）にクローン化
することによって、組換えプラスミドｐＯＩＳ９を作成
した。エレクトロポレーション法を用いて、ｐＯＩＳ９
をヒスチジン要求性のピキア・パストリス（Pichia pa
storis) Ｇ１１５株（Invitrogen社製）に形質転換し、
該相補ＤＮＡを染色体に持つ形質転換体ピキア・パスト
リス IIIa を得た。【００２４】この形質転換体であるピキア・パストリス
を培養し、該酵母の生産する酵素のアミノ酸配列を特定
すること、あるいはキチナーゼ活性を測定することによ
り、イネキチナーゼ相補ＤＮＡの発現を確認することが
できる。【００２５】本発明の形質転換体に含まれるイネキチナ
ーゼ相補ＤＮＡは、糸状菌のみならず細菌に対しても溶
菌効果を示す新規な（植物クラスIII)キチナーゼをコー
ドするものである。これまでに、細菌の細胞壁を溶解す
るリゾチーム活性を持つキチナーゼをコードする相補Ｄ
ＮＡについて報告はない。また、抗カビ活性とリゾチー
ム活性を併せ持つキチナーゼも本発明によって初めて見
出されたものである。さらに、該活性のある植物キチナ
ーゼを効率的に生産する微生物の発現系は、従来確立さ
れていなかったものであり、本発明のイネキチナーゼ相
補ＤＮＡを含む形質転換体であるピキア・パストリス
は、広範な病原性微生物に対して抵抗性を獲得した組換
え作物が開発できる可能性を示すものである。【００２６】【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらによって制限されるものではない。実施例１（１）Ｓ４９６０の入手イネゲノムプロジェクトのイネ相補ＤＮＡライブラリー
にクラスIII キチナーゼをコードするクローンが含まれ
いる可能性について検討した。タバコのクラスIII キチ
ナーゼの相補ＤＮＡの配列（Lawton, K., Ward, E.,Pay
ne, G.,Moyer, M. and Ryals, J., Plant Mol. Biol.,
19:735-743, 1992 ）を用いて、ＤＮＡデータベースに
登録されているＤＮＡ配列に対してBlast ホモロジー検
索（Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A.
A., Zhang, J.,Zhang, Z., Miller, W., and Lipman,
D. J., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997）
し、有意な相同性が認められた配列の中に、イネゲノム
プロジェクトが単離した二つのクローンが含まれている
いることを見出した。【００２７】そこで、イネゲノムプロジェクトから、こ
れらのクローンのうちの一つであるＳ４９６０を入手し
た。Ｓ４９６０の相補ＤＮＡの部分配列（４０５ｂｐ）
は、タバコのクラスIII キチナーゼと５９％の相同性を
有していた。【００２８】（２）Ｓ４９６０に含まれる相補ＤＮＡの
塩基配列の解明ファルマシア社製のＦｌｅｘ−ｐｒｅｐプラスミド精製
キットを用いて該クローンＤＮＡを精製して得られたプ
ラスミドＤＮＡを鋳型とし、パーキンエルマー社製のダ
イプライマーサイクルシーケンシングキットを使用して
シーケンス反応を行なった。塩基配列は、ＤＮＡシーケ
ンサー（モデルＡＢＩ３７７；パーキンエルマー社製）
で決定した。【００２９】その結果、当該クローンは１，１０９ｂｐ
の相補ＤＮＡを含むことが明らかとなり、３０５アミノ
酸残基からなる分子量３２，２６０ダルトンの蛋白質を
コードしていると推定された（配列表の配列番号１参
照）。予想された蛋白質のアミノ酸配列で、Blast ホモ
ロジー検索（Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaff
er, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., andLi
pman, D. J., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 199
7）を行ったところ、ゴムの木のキチナーゼであるヘバ
ミン（Jekel, P. A., Hartmann, B. H., and Beintema,
J. J., Eur. J. Biochem., 200:123-130, 1991 ）と６
８％の相同性があることが判明した。【００３０】（３）ピキア・パストリスにおける相補Ｄ
ＮＡがコードする蛋白質の生産の検討先に、Ｓ４９６０が含む相補ＤＮＡがコードする蛋白質
の発現を、大腸菌の幾つかの宿主−ベクター系を用いて
種々の培養条件下で試みたが、発現した蛋白質は活性の
ない不溶性蛋白質として封入体を形成した。そこで、真
核微生物である酵母の１種、ピキア・パストリス（Invi
trogen社製）での発現について検討を行った。【００３１】（ａ）ヒスチジンタグの付加Ｓ４９６０が含む相補ＤＮＡがコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列（配列表の配列番号１参照）のうち、３０〜３
０５番目の残基からなる成熟蛋白質のＣ末端にヒスチジ
ンタグを付けるために、オリゴＥ−１（配列表の配列番
号２）とオリゴＥ−２（配列表の配列番号３）の二つの
合成オリゴヌクレオチド（北海道システムサービス社
製）をプライマーとして、Ｓ４９６０クローンプラスミ
ドから、ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を使
用したＰＣＲ法（Methods in Molecular Biology, 15
巻、1993）で増幅した。反応は、東洋紡の推奨する条件
で行った。【００３２】（ｂ）組換えプラスミドｐＯＩＳ５の作製増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄII
I で切断した後、同じ制限酵素で切断したベクタープラ
スミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Novagen 社製）に宝製の
ライゲーションキット（Ver. 1）を用いて連結した。連
結したプラスミドＤＮＡを、Inoue らの方法（Inoue,
H., Nojima, H. andOkayama, H., Gene, 96:23-28, 199
0）で、大腸菌ＤＨ５α（Bethesda Research Laborotor
ies製）に形質転換した。【００３３】形質転換体から、プラスミドＤＮＡをアル
カリ溶菌法 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Mania
tis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2
nd ed. ColdSpring Harvbor Laboratory, New York, 19
89）で調製した後、制限酵素による解析を行い、目的と
する組換えプラスミドｐＯＩＳ５を得た。このｐＯＩＳ
５について上記ＤＮＡシーケンスを行なったところ、正
しい塩基配列を持つことが確認された。【００３４】（ｃ）組換えプラスミドｐＯＩＳ９の作製さらに、ヒスチジンタグが付いた成熟蛋白質をピキア・
パストリスで生産するために、制限酵素ＳｎａＢ１とＮ
ｏｔＩ部位を持つオリゴＰ−１（配列表の配列番号４；
北海道システムサービス社製）とオリゴＰ−２（配列表
の配列番号５；北海道システムサービス社製）をプライ
マーに、プラスミドｐＯＩＳ５ＤＮＡを鋳型としてＰＣ
Ｒ反応（ＫＯＤＤＮＡポリメラーゼを使用）を行なっ
た。【００３５】増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡ
シーケンスで確認した後、ＳｎａＢ１及びＮｏｔＩで切
断した。これをプラスミドベクターｐＰＩＣ９（Invitr
ogen社製）のα−因子のシグナル配列のＣ末端に位置す
る同制限酵素部位の間に読み取り枠が連続するようにin
frameにクローン化した。こうして、組換えプラスミド
ｐＯＩＳ９を作成した。【００３６】（ｄ）形質転換体ピキア・パストリス III
a の作製ｐＯＩＳ９を制限酵素ＢｇｌIIで切断し、ヒスチジン要
求性のピキア・パストリス G115 株（His-;Invitrogen
社製）にエレクトロポレーション法で形質転換した。エ
レクトロポレーションは、Invitrogenの実験手引き書に
記載された条件で行なった。その後、ＭＤ最小寒天培地
（１．３４％イーストナイトロゲンベース、４×１０^-5
％ビオチン、１％グルコース、１．５％寒天）でヒス
チジン非要求性のコロニーを選抜することにより、目的
の形質転換体ピキア・パストリスIIIa を得た。【００３７】（ｅ）形質転換体ピキア・パストリス III
a からの精製キチナーゼの誘導キチナーゼの誘導は、Invitrogenの実験手引き書に準じ
て行った。すなわち、まずピキア・パストリス IIIa を
５０ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％バクト酵母エキス、２％
ペプトン（シグマ社製）、ｐＨ６．０の１００ｍＭリン
酸カリウム、１．３４％バクトイーストナイトロゲンブ
ロス、４×１０^-5％ビオチン、１％グリセロール）で３
０℃で２０時間震とう培養した。培養後、遠心（３００
０×ｇ、5 分）で細胞を集め、５０ｍｌのＢＭＭＹ培地
（グリセロールの代わりにメタノールを含む以外はＢＭ
ＧＹ培地と同じ組成）に再懸濁し、再び３０℃で２４時
間振とう培養した。【００３８】（ｆ）キチナーゼの精製（アフィニテイー
カラムクロマトグラフィー）予備的な実験により、発現した該蛋白質は培地中に分泌
生産されることが既に明らかであった。そこで、培養上
清を直接ニッケルカラムに通し、該蛋白質のＣ末端の６
つのヒスチジン残基（ヒスタグ）を介してニッケルカラ
ムに吸着することを利用したアフィニテイーカラムクロ
マトグラフィーにより該蛋白質を精製した。【００３９】具体的には、３０００×ｇで５分間遠心し
て得た培養上清を、ファルマシア社製のヒストラップカ
ラム（カラム容積；１ｍｌ）に通した。カラムを５ｍｌ
の０．５ＭＮａＣｌと１０ｍＭイミダゾールを含む２
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、該蛋
白質を５ｍｌの０．５ＭＮａＣｌと５００ｍＭイミダ
ゾールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶
出した。【００４０】（ｇ）精製キチナーゼの電気泳動及びＮ末
端のアミノ酸配列解析上記操作で該蛋白質が純粋に精製されたか否かの確認の
ため、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動及び等電点電
気泳動の二種類の電気泳動並びにＮ末端のアミノ酸配列
の解析を行なった。【００４１】まず、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
は、バイオラッド社製のレディーゲルＪ（１２．５％ポ
リアクリルアミド）ゲルを用いて、Laemmli の方法（Na
ture, 227: 680-685, 1970）で行なった。すなわち、精
製該蛋白質３μｇをサンプルバッファー（Laemmli, U.
K., Nature, 227: 680-685, 1970) １０μｌで処理して
電気泳動を行ない、コマーブリリアントブルーで蛋白質
を染色した。得られた泳動写真を図１に示す。図１にお
いて、左のレーンは分子量マーカーを、右のレーンは精
製イネキチナーゼを示す。図１より明らかな通り、染色
したゲルには、精製画分は該蛋白質の推定分子量３０，
９３１に一致する分子量３０，０００ダルトンの蛋白質
のバンドのみが検出された。このことから、該蛋白質の
分子量は、３０，０００ダルトンと算出された。【００４２】また、精製された該蛋白質１μｇをファル
マア製のPhastGel IEF3-9 ゲルに供し、ファーストシス
テム電気泳動装置（ファルマシア製）で等電点電気泳動
を行なった。ゲル上の蛋白質を、ファルマシアの推奨す
る方法に従い染色した。結果を図２に示す。図２におい
て、左のレーンは等電点マーカー蛋白質、右のレーンは
精製イネキチナーゼの泳動結果である。図２の結果及び
等電点マーカー蛋白質の移動度から作成した検量線か
ら、精製イネキチナーゼの等電点は８．２と算出され
た。【００４３】さらに、該精製蛋白質のＮ末端アミノ酸配
列を自動プロテインシーケンサー（ヒューレットパッカ
ード社製；モデルＧ１０００Ａ）で分析した。その結
果、該精製蛋白質のＮ末端アミノ酸配列は、α−因子の
シグナル配列切断部位のＣ末端配列Glu-Ala-Glu-Ala-Ty
r で始まり、α−因子の塩基配列の後ろに該蛋白質をコ
ードするＤＮＡ断片を連結するためにＳｎａＢＩ部位を
導入した際に本来の２９番目のAla が変化したVal 、さ
らにその後は該蛋白質のアミノ酸配列であるGly-Asp-Il
e-Ala であった。このアミノ酸配列を分析した結果、該
蛋白質の配列に相当するアミノ酸以外のアミノ酸は全く
検出されなかった。以上の結果から、該蛋白質が純粋に
精製されたと判断した。【００４４】（ｈ）キチナーゼ活性の測定次に、該精製蛋白質を用いて、該蛋白質がキチナーゼ活
性を有することを立証する実験を行なった。キチナーゼ
の活性測定に汎用されているグリコールキチン（Imoto,
T. and Yagishita, K., Agric. Biol. Chem., 35:1154
-1156, 1971)を０．２％含む０．１Ｍのトリ塩酸緩衝液
（ｐＨ＝８．４）に該蛋白質を添加し、３７℃で保温し
た。溶液中の還元糖をMonreaとReese の方法（Can. J.
Microbiol., 15:689-696,1969）により測定したとこ
ろ、反応時間や加えた蛋白質量に依存した還元糖の増加
が観察された。【００４５】該蛋白質のキチナーゼ活性に関して酵素学
的に解析した結果は、次の通りである。分子量：３０，０００ダルトン（実験値）；３０，９３
１ダルトン（計算値）等電点：８．２（実験値）Ｎ末端アミノ酸配列：Glu-Ala-Glu-Ala-Tyr-Val-Gly-As
p-Ile-Ala 至適反応ｐＨ：８．４（グリコールキチン）；３．０−
５．０（リゾチーム活性）【００４６】反応至適ｐＨは８．４で、グリコールキチ
ンに対するＫｍ及びＶmax は、それぞれ０．４ｍｇ／ｍ
ｌと５．２単位／ｍｇ蛋白質であった。また、該精製蛋
白質は、N-Acetyl-hexa-D-glucosamine を N-Acetyl-di
-D-glucosamineに分解した。【００４７】（ｉ）蛋白質の抗カビ活性測定該精製蛋白質の抗カビ活性を、トリコデルマ・リーゼイ
(Trichoderma reesei)IFO31329 株を指示菌として、Ro
berts とSelitrennikoff（J. Gen. Microbiol., 134:16
9-176, 1988)によって記載された方法で調べた。培地
は、Difco 社のポテトデキストロース（ＰＤ）寒天培地
を用いた。ＰＤ寒天平板培の中央に、滅菌したパルプデ
スク（ＴＯＹＯ社製、直径１cm）を置き、約３，０００
個のトリコデルマ・リーゼイ IFO31329 の胞子を接種し
た。胞子を接種したパルプデスクから３ｃｍ離れた位置
に、５〜６枚の滅菌パルプデスクを同心円状に等間隔に
置いた。このパルプデスクに精製蛋白質５〜１０ｍｇを
吸収させ、２５℃で３〜４日間培養し、該蛋白質を吸収
させたパルプデスクの周囲での菌糸の生育阻害を顕微鏡
観察した。【００４８】結果を図３（顕微鏡写真、倍率：１００
倍）に示す。この図から明らかなように、トリコデルマ
・リーゼイ IFO31329 の菌糸は、該蛋白質により生育阻
害を受けた。すなわち、図中のＡは対照で、牛血清アル
ブミンを吸収させたパルプデスクの周囲でのトリコデル
マ・リーゼイ IFO31329 の生育状況を観察したものであ
り、菌糸の正常な伸長が認められた。一方、図中のＢは
精製蛋白質（イネキチナーゼ）を吸収させたパルプデス
クの周囲でのトリコデルマ・リーゼイ IFO31329の生育
状況を観察したものであり、菌糸の伸長が著しく阻害さ
れていることがわかる。このことから、精製蛋白質の抗
カビ活性が証明された。【００４９】（ｊ）蛋白質の抗菌活性一方、細菌細胞壁を溶解するリゾチーム活性は、ミクロ
コッカス・リソデイクティカス（Micrococcus lysodeik
ticus)（Sigma 社製）に対する溶菌活性をRichard らの
方法（Richard, T. M., McCollum, T. G., Niedz, R.
P., Hearn, C. J., McDonald, R. E., Berdis、 E. and
Doosdar, H., Planta, 200: 289-295, 1996）によって
調べた。【００５０】すなわち、０．０３％のミクロコッカス・
リソデイクティカスの凍結乾燥菌体を含む１．５％寒天
平板（ｐＨ４．８）に精製蛋白質（５μｇ／５μｌ）と
卵白リゾチーム（５μｇ／５μｌ）を滴下し、３７℃で
１６時間保温した後に溶菌斑の生成の有無を観察した。
その結果、この条件下では、精製蛋白質は卵白リゾチー
ム以上の溶菌活性を示した。以上のことから、本発明の
形質転換体に含まれる相補ＤＮＡが新規な特性を有する
キチナーゼをコードしていることが実証された。【００５１】【発明の効果】本発明によれば、イネキチナーゼをコー
ドする相補ＤＮＡを含むプラスミドベクターを有する形
質転換体であるピキア・パストリスが提供される。この
相補ＤＮＡのコードするイネキチナーゼは、糸状菌のみ
ならず細菌に対して溶菌作用を有する酵素である。これ
までに、抗カビ活性のほかに、細菌の細胞壁を溶解する
リゾチーム活性を持つキチナーゼをコードする相補ＤＮ
Ａについて報告はない。また、抗カビ活性とリゾチーム
活性を併せ持つキチナーゼも見出されていない。【００５２】さらに、本発明のイネキチナーゼ相補ＤＮ
Ａを組み込んだ形質転換体であるピキア・パストリスを
利用することにより、広範な病原性微生物に対して抵抗
性を獲得した組換え作物の開発が期待される。【００５３】【配列表】配列番号：１配列の長さ：１１０９トポロジー：一本鎖配列の種類：相補ＤＮＡ起源生物名：イネ（Oryza sative L. ）株名：日本晴直接の起源プラスミド名：Ｓ４９６０配列の特徴：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ特徴を決定した方法：Ｅ配列 CGGACGCTGA ATTCGATCGA GAATCACC ATG ATG ACA AGT AGA ATG TTT TCG 52 Met Met Thr Ser Arg Met Phe Ser 5 GCA ATG CAG ATG CTG ATC ATG GTG GTG GTG GCA TTG GCC GGG CTA GCT 100 Ala Met Gln Met Leu Ile Met Val Val Val Ala Leu Ala Gly Leu Ala 10 15 20 GCC GGA ACG CGC GCC GGC GAC ATC GCG ATC TAC TGG GGC CAG AAC GGC 148 Ala Gly Thr Arg Ala Gly Asp Ile Ala Ile Tyr Trp Gly Gln Asn Gly 25 30 35 40 AAC GAG GGC ACG CTG GCG CAG ACG TGC GCG ACC GGT AAT TAC AGG TTC 196 Asn Glu Gly Thr Leu Ala Gln Thr Cys Ala Thr Gly Asn Tyr Arg Phe 45 50 55 GTC ATC GTG GCC TTC CTG CCT GTG TTC GGC AAG GGC CAG ACG CCG GTG 244 Val Ile Val Ala Phe Leu Pro Val Phe Gly Lys Gly Gln Thr Pro Val 60 65 70 CTG AAC CTG GCC GGC CAC TGC GAC CCG GCG TCG AAC GGC TGC ACC GGC 292 Leu Asn Leu Ala Gly His Cys Asp Pro Ala Ser Asn Gly Cys Thr Gly 75 80 85 GTG GGC GCC GAC ATC AAG TCG TGC CAG AGC CTC GGC ATC AAG GTC ATG 340 Val Gly Ala Asp Ile Lys Ser Cys Gln Ser Leu Gly Ile Lys Val Met 90 95 100 TTC TCG ATC GGC GGC GGC GTC GGC AAC TAC GGC CTG TCC TCC CGC GAC 388 Phe Ser Ile Gly Gly Gly Val Gly Asn Tyr Gly Leu Ser Ser Arg Asp 105 110 115 120 GAC GCC AAG CAG GTC GCG GCG TAC CTG TGG AAC AAC TAC CTC GGC GGC 436 Asp Ala Lys Gln Val Ala Ala Tyr Leu Trp Asn Asn Tyr Leu Gly Gly 125 130 135 ACG TCG CCG TCA AGG CCG CTC GGC GAC GCC GTC ATG GAC GGC ATC GAC 484 Thr Ser Pro Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Met Asp Gly Ile Asp 140 145 150 TTC GAC ATC GAG AGC GGC GGG GGC ATG TAC TGG GAC GAC TTG GCC AGG 532 Phe Asp Ile Glu Ser Gly Gly Gly Met Tyr Trp Asp Asp Leu Ala Arg 155 160 165 TAC CTC AAG GCG TAC TCG CGG CAG GGG AGC AGC AAG AAG CCG GTG TAC 580 Tyr Leu Lys Ala Tyr Ser Arg Gln Gly Ser Ser Lys Lys Pro Val Tyr 170 175 180 CTG ACG GCG GCG CCA CAG TGC CCC TTC CCG GAC GCG TCG CTC GGC GTC 628 Leu Thr Ala Ala Pro Gln Cys Pro Phe Pro Asp Ala Ser Leu Gly Val 185 190 195 200 GCG CTC AGC ACC GGC CTG TTC GAC TAC GTG TGG GTG CAG TTC TAC AAC 676 Ala Leu Ser Thr Gly Leu Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn 205 210 215 AAC CCG CCG TGC CAG TAC AGC TCG TCC AAC GGC GTG GGC AAC CTG GCG 724 Asn Pro Pro Cys Gln Tyr Ser Ser Ser Asn Gly Val Gly Asn Leu Ala 220 225 230 AGC GCG TGG AAG CAG TGG ACG TCG ATC CCG GCG GGA CGG GTG TTC CTC 772 Ser Ala Trp Lys Gln Trp Thr Ser Ile Pro Ala Gly Arg Val Phe Leu 235 240 245 GGC CTG CCG GCG GCG GCG GAG GCC GCC GGC ACC GGG TTC GTG GAG ACG 820 Gly Leu Pro Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Thr Gly Phe Val Glu Thr 250 255 260 AGC GAC CTG GTG TCG AAG GTG CTC CCC GTG GTG AAG AAG TCT CCC AAG 868 Ser Asp Leu Val Ser Lys Val Leu Pro Val Val Lys Lys Ser Pro Lys 265 270 275 280 TAC GGA GGG ATC ATG CTG TGG TCG CGG TAC TAT GAC GGG CTC ACG GGG 916 Tyr Gly Gly Ile Met Leu Trp Ser Arg Tyr Tyr Asp Gly Leu Thr Gly 285 290 295 TAC AGC GAC AAG GTG AAG TCC AGC GTT TGA GCTAGCCAGG GTAAGCTCGT GTC 969 Tyr Ser Asp Lys Val Lys Ser Ser Val Stop 300 305 AGGTCGGCGT TCGCGTAGAA TCACACGTGC CGCGCGTTCC CTGCAAGATG GAGTAGTTTC 1029 TACACATTTC AGAACAAAGC AAACATGTAC AATAAGATGG CCGGCTTGTA TACTCATTTA 1089 GAAGCAGAAA AAATTGTGAG 1109 【００５４】配列番号：２配列の長さ：２９トポロジー：一本鎖配列の種類：合成オリゴヌクレオチド起源生物名：イネ（Oryza sative L. ）株名：日本晴直接の起源プラスミド名：ｐＳ６９４０配列の特徴：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ特徴を決定した方法：Ｅ配列 CCACCATGGG CGACATCGCG ATCTACTGG 29 【００５５】配列番号：３配列の長さ：２７トポロジー：一本鎖配列の種類：合成オリゴヌクレオチド起源生物名：イネ（Oryza sative L. ）株名：日本晴直接の起源プラスミド名：ｐＳ６９４０配列の特徴：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ特徴を決定した方法：Ｅ配列 AAGAAGCTTC ACCTTGTCGC TGTACCC 27 【００５６】配列番号：４配列の長さ：３３トポロジー：一本鎖配列の種類：合成オリゴヌクレオチド起源生物名：イネ（Oryza sative L. ）株名：日本晴直接の起源プラスミド名：ｐＯＩＳ５配列の特徴：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ特徴を決定した方法：Ｅ配列 TACTACGTAG GCGACATCGC GATCTACTGG GGC 33 【００５７】配列番号：５配列の長さ：３４トポロジー：一本鎖配列の種類：合成オリゴヌクレオチド起源生物名：イネ（Oryza sative L. ）株名：日本晴直接の起源プラスミド名：ｐＯＩＳ５配列の特徴：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ特徴を決定した方法：Ｅ配列 TGCGGCCGCT CAGCGGTGGC AGCAGCCAAC TCAG

【図面の簡単な説明】【図１】精製イネキチナーゼのＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動による解析結果を示す泳動写真であ
る。【図２】精製イネキチナーゼの等電点電気泳動による
解析結果を示す泳動写真である。【図３】カビの形態を示す顕微鏡写真（×１００）
で、精製イネキチナーゼによる抗カビ活性を示す。【符号の説明】Ａは牛血清アルブミンを吸収させたパルプデスクの周
囲でのトリコデルマ・リーゼイ IFO31329 の生育状況を
示す写真であり、Ｂは、精製イネキチナーゼを吸収させ
たパルプデスクの周囲でのトリコデルマ・リーゼイ IFO
31329 の生育状況を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者チォンナムハイ茨城県つくば市観音台２丁目１−２海外宿泊棟410号室 (56)参考文献ＤＮＡＲｅｓ．（1997）Ｖｏｌ. ４，Ｎｏ．６，ｐ．379−385 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/42 C12N 1/19 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】【請求項１】配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
からなる蛋白質をコードするイネキチナーゼ相補ＤＮＡ
を含むプラスミドベクターを有する形質転換体であるピ
キア・パストリス。