JP3357359B2 - 新規の細胞外基質レセプター／リガンド相互作用を利用した血管内皮に対するリンパ球接着の抑止方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 1.［発明の利用分野］ 本発明は細胞どうしの接着を抑止する方法に係わり、
α４β１細胞外基質レセプターが特定のペプチド鎖と結
合することによって血管内皮細胞へのリンパ球の接着を
促進するとの所見に基づくものである。本発明の実施例
においては、血管内皮細胞とリンパ球の結合を抑止し
て、リンパ球が組織に入り込み、免疫応答を妨げるのを
防止するためにモノクローン抗体またはペプチドを利用
する。

2.［発明の背景］ 2.1. 細胞外基質レセプター コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどのよう
な細胞外基質（ECM）成分に特異の細胞表面レセプター
については既に報告がなされている（Hynes,1987,Cell,
48:549−554;Helmer,1988,Immunol.Today,９:109）。細
胞外基質レセプター（ECMRs I,II及びVI）の作用は、ア
フィニティー・クロマトグラフィーによって（Wayner及
びCarter,1987,J.Cell.Biol.,105:1873−1884;Staatz
等、1989,J.Cell Biol.,198:1971−1924）、さらには細
胞と精製リガンドの相互作用を抑止するモノクローン抗
体を製造することによって（Wayner及びCarter,1987,J.
Cell Biol.,105:1873−1884）または細胞とECMの相互作
用を抑止しするモノクローン抗体を製造することによっ
て（Wayne等,1988,J.Cell.Biol.,107:1881−1891）解明
された。

上記の技術を利用して種々のECMRsが固定された。モ
ノクローン抗体を使用して、Wayner及びCarter（1987,
J.Cell Biol.,105:1873−1884）はヒトの線維肉腫細胞
に固有のコラーゲンに対する２種類の細胞表面レセプタ
ーを発見した。分類Ｉのレセプターはコラーゲン、フィ
ブロネクチン及びラミニンとの細胞接着に関与し、分類
IIのレセプターは固有のコラーゲンとの細胞接着にだけ
関与した。Wayner等（1988,J.Cell Biol.,107:1881−18
91）はコラーゲン（P1H5）、フィブロネクチン（P1F8ま
たはP1D6）、及びコラーゲンとフィブロネクチン（P1B
5）の双方に対するヒト細胞の接着を抑止するモノクロ
ーン抗体を発見した。なお、P1F8及びP1D6はECMR VIと
して知られる140kD表面レセプターと反応することが判
明した。Kunicki等（1988,J.Cell Biol.Chem.,263:4516
−4519）は上記P1H5がコラーゲンＩ及びIIIに対する不
活化されたヒト血小板の接着をも抑止するが、フィブロ
ネクチンとの接着は抑止しないことを報告した。フィブ
ロネクチンとの細胞接着を抑止するモノクローン抗体を
使用してニワトリの胚線維芽細胞から少なくとも３種類
の糖蛋白を含む錯体が分離され（Knudsen等、1985,Exp.
Cell,Rse.,157:218−226;Chen等,1985,J.Cell.Biol.,10
0:1103−1114）、ヴィトロネクチン・アフィニティー・
クロマトグラフィーを利用して哺乳類細胞から２種類の
糖蛋白の錯体が分離された（Pytela等,1985,Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.,82;5766−5770;Pytela等,1986,Scienc
l,231:1559−1562）。主要な血小板表面蛋白質II b及び
III aは血小板膜中に非共有結合1:1錯体として存在し
（Jennings及びPhillips,1982,J.Biol.Chem.,257:10458
−10463）、フィブリノーゲン（Bennett等,1983,Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.,80:2417−2421;Marguerie等,198
4,Eur.J.Biochem.,139:5−11）、フィブロネクチン（Ga
rdner及びHynes,1985,Cell.42:439−448;Plow等,1985,B
lood,66:724−727）、フォン・ウィルブラント因子（Ru
ggeri等,1982,Proc.Nat.Acad,Sci U.S.A.,79:6038−604
1）及びヴィトロネクチン（Pytela等,1986,Science,23
1:1559−1562）に対するECMRとして作用することが判明
している。

細胞外基質レセプターの多くは構造的に相同である。
ECMRsは細胞接着分子という１群のインテグリンに属
し、インテグリンβ１サブユニットと錯化合した特有の
αサブユニットを有する（Hynes,1987,Cell,48:549−55
4;Wayner及びCarter,1987,J.Cell Biol.,105:1881−189
1）。同じくインテグリン・レセプターに属するものと
しては、白血球接着蛋白及びVLA抗原がある。白血球接
着蛋白にはLFA−1,Mac−1,P150/95などがあり、種々の
α鎖と共通の95kDaβ鎖から成る二量体糖蛋白である
（岸本等、1987.Cell.48:681−690。VLA抗原は培養Ｔリ
ンパ球に極めて遅く現われると（very late appearanc
l）ことから命名された（Hemler等,1983,J.Immunol.,13
1:334−340;Hemler等,1984,J.Immunol.,132:3011−301
8;Hemler等,1985,Eur.J.Immunol.,15:502−508）。VLA
−βサブユニットに対する抗血清がフィブロネクチンま
たはラミニンへの細胞接着を阻止することが確認されて
いる（高田等,1987,Nature,326:607−610）。

これらのECMRs間の相互関係が既に解明されている。E
CMR VIは基本型フィブロネクチン・レセプター（Pytel
a等,1985,Call,40:191−198）、α５β１、血小板糖蛋
白（gp）I c/II a及びVLA5と同じであり、ECMR IIはα
２β１、血小板糖蛋白I a/II a及びVLA2と同じであり
（Hemler等,1987,J.Biol.Chem.,262:11478−114851）、
ECMR Iはα３β１、及びVLA3（Kunicki等,1988,J.Biol.
Chem.,263:4516−4519;高田等,1988,J.Cellular Bioche
m.,37:385−393;Wayner等,1988,J.Cell.Biol.,107:1881
−1891）。α２β1,α３β１及びα５β１に対するモノ
クローン抗体（P1H5,P1D6及びP1B5）はコラーゲン，フ
ィブロネクチン及びラミニン被覆表面への線維芽細胞ま
たは血小板の接着を抑止する（Kunicki等,1988 J.Cell.
Biol.,107:1881−1891;Wayner等,1988,同上）。表Ｉに
は上記インテグリンのいくつかを、表IIには種々のECMR
sを認識するモノクローン抗体をそれぞれ表記した。

β１インテグリンは培養された細胞と組織とで異なる
形で発現され、活性化発現に明らかな差異がある。例え
ば、造血細胞中でのα５β１の発現は胸腺細胞及び末梢
血液リンパ球、単球、急性リンパ性または骨髄性白血病
細胞、活性化Ｔ細胞、遊走造血前駆体細胞、及び培養T,
Bまたは赤白血病細胞系のポピュレーション細区分に限
られる（Bernardi等,1987,J.Cell.Biol.,105:489−498;
Cardarelli等,1988,J.Cell.Biol.,106:2183−2190;Garc
ia−Pardo等,1989,Exp.Cell Res.,181:420−431;Gianot
ti等,1988,J.Cell.Biol.,103:429−437;Liao等,1987,Ex
p.Cell Res.,171:306−320;Wayner等,1988,J.Cell.Bio
l.,107:1881−1891）。

2.2. フィブロネクチン フィブロネクチンは細胞外基質、血漿及びいくつかの
タイプの細胞の表面に見出される蛋白である（秋山及び
山田,1987,Adv.Enzymol.59:1−57）。血漿中ではフィブ
ロネクチンはそれぞれが約220kDaの分子量を有する２つ
の類似したサブユニット（Ａ及びＢ鎖）から成る糖蛋白
ヘテロダイマーとして存在する（秋山及び山田,1987,Ad
v.Enzymol.59:1−57;Erickson等,1981,J.Cell.Biol.,9
1:673−678）。フィブロネクチン分子の複数の特定分子
内領域（Ruoslahti等,1981,J.Biol.Chem.,256:7277−72
81）を完全な分子と同様にコラーゲン、線維素、ヘパリ
ン及び細胞表面と相互作用できるフラグメントに分割す
ることができる（Hynes及び山田,1982,J.Cell Biol.,9
5:369−377）。

細胞及び血漿フィブロネクチン・ヘテロダイマーは類
似した、ただし全く同じではないポリペプチドを含む。
フィブロネクチン・サブユニットの構造が多様であるの
はプレフィブロネクチンmRNAの少なくとも２つの部位
（ED及びIII CS部位）におけるスプライニングに起因す
るフィブロネクチンmRNA1次鎖の多様性による。

フィブロネクチンは種々のタイプの細胞、例えば、線
維芽細胞（Grinell等,1977,Exp.Cell Bes.,110:175−21
0）、マクロファージ（Bevilacque等,1981,J.Exp.Med.,
153:42−60）、多形核白血球（Marino等,1985,J.Lab.Cl
in.Med.,105:725−730）、血小板（Koteliansky等,198
1,Fed.Euro.Biochem.Soc.,123:59−62）及びケラチン細
胞（Clark等,1985,J.Invest Dermatol.,84:378−383）
の接着を促進する。このほかにも接着を促進される細胞
がある（Liao等,1989、Exp.Cell Res.,181:348−36
1）。

フィブロネクチンと分子量が約140kDaの細胞表面蛋白
との相互作用が線維芽細胞（Brown及びJuliano,1985,Sc
ience,228:1448−1451:秋山等,1986,J.Cell Biol.,102:
442−448;Brown及びJuliano,1986,J.Cell Biol.,103:15
95−1603;Wylis等,1979,J.Cell Biol.,80:385−402）、
内皮細胞（Plow等,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,8
3:6002−6006）、リンパ細胞（Brown及びJuliano,1986,
J.Cell Biol.,103:1595−1603）、血小板（Pytela等,19
86,Science,228:1559−1562;Gardner及びHynes,1985,Ce
ll,42:439−448）。筋肉細胞（Horowitz等,1985,J.Cell
Biol.,101:2134−2144;Dambaky等,1985,J.Cell Biol.,
100:1528−1539;Chapman,1984,J.Cell Biochem.,259:10
9−121）、及び骨肉腫細胞（Pytela等,1985,Cell,40:19
1−198）において観察されている。

細胞表面とのフィブロネクチンの結合はフィブロネク
チンのフラグメントによって競合的に抑止することがで
きる（秋山等,1985,J.Biol.Chem.,260:13256−1326
0）。合成ペプチドを使用し最小細胞認識部位と考えら
れる鎖がテトラペプチドArg−Gly−Asp−Ser（RGDS）で
あると同定された（Pierschbacher及びRuoslahti,1984,
Nature,309:30−33;Pierschbacher等,1982,Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.,80:1224−1227;Pierschbacher等,1984,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:5985−5988;秋山等,198
5,J.Cell.Biol.,102:442−448）。フィブロネクチンの
“細胞結合”領域に存在するRGDS鎖はPytela等が報告し
た基本型フィブロネクチン・レセプターのリガンドであ
る（1985,Cell.,40:191−198）。

RGDS以外の部位がフィブロネクチン結合に関与するこ
とが種々の観察なら推測された（Humphries等,1986,J.C
ell Biol.,103:2637−2647）。例えば、合成ペプチドの
結合親和力はこれよりも大きいフラグメントまたは完全
なフィブロネクチンの結合親和力よりもはるかに低いこ
とが明らかになっている（秋山等,1985,J.Biol.Chem.,2
60:10402−10404;秋山等,1985,J.Biol.Chem.,260:13256
−13260）。McCarthy等は血漿フィブロネクチンの33kDa
とB16−F10黒色腫細胞との間の結合新和力を報告してい
る（1986,J.Cell.Biol.,102:179−188）。Bernardi等は
リンパ前駆体細胞がフィブロネクチンの２つの異なる部
位に接着し、BaF3細胞系がRGD結合領域と相互作用し、P
D31細胞系がカルボキシ末端セグメントにあってヘパリ
ンに対する高親和力結合部位と関連する別の領域と相互
作用するらしいと報告している（1987,J.Cell Biol.,10
5:489−498）。

Humphries等は他の細胞との接着相互作用を形成する
フィブロネクチン・フラグメントの能力を黒色腫細胞と
線維芽細胞を対象に比較した（1986,J.Cell Biol.,103:
2637−2647）。線維芽BHK細胞はRGDSを含有する細胞結
合領域を表わす75kDaフラグメントに急速に付着したの
に対して、B10−F10黒色腫細胞は75kDaフラグメントに
は付着せず、タイプIII結合セグメント（CS）弁別部位
または（mRNAのオルターナティブ・スプライシングが起
こる）Ｖ−部位を含むフィブロネクチン部分から得られ
た113kDaフラグメントに付着した。フィブロネクチン・
カルボキシル末端付近に位置する上記III CS部位におい
て鎖Agr−Glu−Asp−Val（REDV）が重要な機能を果すと
推測された。Humphries等はIII CS部位にまたがる一連
のオーバラップ合成ペプチドを観察した（1987,J.Biol.
Chem.,262:6886−6892）。その結果、互いに隣接しない
２つのペプチドCS1及びCS5は黒色腫細胞へのフィブロネ
クチンの接着を競合的に抑止するが、線維芽細胞への接
着は抑止しないことを発見した。なお、CS1はCS5よりも
顕著な抑止作用を示した。Liao等はIgA−分泌リンパ細
胞であるMOPC315がRGD相互作用を介して細胞結合領域に
結合するだけでなく、RGDとは無関係のメカニズムによ
ってカルボキシ末端ヘパリン結合領域とも優先的に結合
することを報告している（1989,Exp.Cell.Res.,181:348
−362）。ただし、フィブロネクチンのカルボキシ末端
部位に存在する接着鎖及びこの接着鎖への細胞接着に関
与する細胞表面レセプターは同定されていない。

2.3. 細胞接着分子の生物学的機能 細胞間の接着相互作用は組織の分化、成長、発育など
種々の生物学的事象の過程で起こり、種々の疾病の原因
として重要な役割を果すらしいとの結論が出されている
（Humphries等,1986,J.Cell.Biol.,103:2637−2647;Gri
nnell,1984,J.Cell.Biochem.,26:107−116;Hynes,1986,
Sci.Am.,245:42−51）。

例えは、免疫系において接着相互作用が極めて重要で
あることが知られており、免疫仲介細胞の位置は少なく
とも部分的要因として細胞間の接着相互作用によって決
定されると考えられる。リンパ細胞の再循環はランダム
ではなく（Male等，“Advanced Immunology",J.B.Lippi
ncatt Co.,Philadelphia,P.14.4−14.5）、リンパ球は
進入する２次リンパ器官のタイプに対する優先選択性を
示す。２次リンパ器官を通過する際にリンパ球は先ず該
当の後毛細管小静脈の血管内皮細胞と結合し、次いで内
皮細胞間の強固な接合部を開らき、最終的にその下にあ
る組織内へ移動しなければならない。ホーミングと呼ば
れる血液から特定リンパ組織への再循環リンパ球の移動
はリンパ球球表面及び高内皮小静脈の補完的接着分子と
関連した。

同様に、多形核白血球の血管内皮への接着は急性炎症
性応答発生における重要な事象であり、走行性応答やあ
る腫の好中球仲介血管損傷の必須条件であると考えられ
る。（Zimmerman及びMcIntyre,1988,J.Clin.Invest.,8
1:531−537;Harlan等,1987,“Leukocyte Emigration an
d its Sequelae",Movat,ed.S.Karger AG,Basel.pp.94−
104;Zimmerman等、同論文.,pp.105−118）。特定の作用
物質によって刺戟されると、多形核白血球（Tonnensen
等、1984,J.Clin.Invest.,74:1581−1592）、内皮細胞
（Zimmerman等、1985,J.Clin.Invest.,76:2235−2246;B
evilacque等、J.Clin.Invest.,76:2003−2011）、また
は双方（Gamble等、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,8
2:8667−8671）が接着性になり、その結果、内皮細胞表
面に多形核白血球が蓄積する。

また、免疫欠乏患者における特定の抗糖蛋白抗体の研
究の結果、有効な好中球の化学走性及びその他の接着関
連機能にはCD18錯体の１つまたは２つの以上の成分が必
要であることが明らかになった（Zimmerman及びMcIntyr
e,1988,J.Clin,Invest.,81:531−537）。CD18錯体は上
記β２インテグリン亜科と同じである。

成熟と分化の過程で、解剖学的に異なる部位において
リンパ球のポピュレーレョン細区分が現われる。例え
ば、胸腺に未成熟Ｔ細胞が存在し、同様に、腸粘膜にIg
A−生成Ｂ細胞の存在が観察される（Parrott,1976,Cli
n.Gastroenterol.,５:211−228）。これとは対照的に、
IgG−生成Ｂ細胞は主としてリンパ節に存在し、リンパ
節から全身的循環系へIgGが必須される（Parrot及びdeS
ousa,1966,Nature,212:1316−1317）。Ｔ細胞は粘膜内
層よりも皮膚外フに豊富に存在するようである（Cahill
等,1997,J.Exp.Med.,145:420−428）。

（上記）白血球接着蛋白の生理的重要性はヒトの遺伝
的疾病である白血球接着欠乏（LAD）の存在によって強
調されている（Anderson等,1985,J.Infect.Dis.,152:66
8;Arnaout等,1985,Fed.Proc.,44:2664）。種々の研究結
果から、LADに関連する分子欠乏が結果的には共通β鎖
の合成または合成速度の不足を招き、急速な劣化に至る
ことが判明した（Liowska−Grospierre等,1986,Eur.J.I
mmunol.,16:205;Diamanche等,1987,Eur.J.Immunol.,17:
417）。重度のLADでは白血球膜にLFA−1,Mac−1,P150/9
5が発現せず、中程度の疾病を持つ患者では低レベルの
白血球膜発現が観察されている。その結果、炎症性反応
の過程において血管系から組織への多形核白血球及び単
球の可動性が不足し、感染症の再発につながる（Anders
on等,Infect.Dis.,152:668;Arnaout等,1985,Fed.Proc.,
44:2664）。

ECMRsが免疫系外の機能とも関連することが観察され
ている。II b/III a血小板表面糖蛋白錯体が失われると
遺伝的疾病グランツマン血小板無力症における血小板機
能の低下を招くと考えられる（Hynes,1987,Cell,48:549
−554）。Humphries等は末梢神経系のニューロンがフィ
ブロネクチンの中央細胞結合領域及びIII CS部位を有す
る基質に達する神経突起を形成させることができること
を発見した（1988,J.Cell.Biol.,106:1289−1297）。ま
た、発明者らはラミニンまたはフィブロネクチンにおけ
る神経突起形成をECMRsに対する抗体によって抑止でき
ることを最近発表した。

3.［発明の概要］ 本発明は細胞外基質レセプターとそのリガンドとの間
の相互作用に干渉することによって細胞どうしの接着を
抑止する方法に係わる。

本発明はα４β１細胞外基質レセプターが特定のペプ
チド鎖に付着することによって内皮細胞へのリンパ球の
接着を促進するという所見に基づいている。本発明がな
されるまでは、α４β１レセプターのリガンドは同定さ
れておらず、リンパ球付着におけるα４β１レセプター
の機能も知られていなかった。抗体または特定のペプチ
ド鎖を使用してα４β１レセプターとそのリガンドとの
相互作用を阻止することにより本発明はリンパ球が血管
内皮を通過して組織内へ移動するのに初めて介入を可能
にするものであり、従って、本発明は免疫応答の抑止に
臨床的有用性を有する。本発明の種々の実施例におい
て、内皮へのリンパ球接着を全身的に抑止するか、ある
いは特定の組織または部位に局限することができる。従
って、本発明の自己免疫やその他の慢性または再発生免
疫系活性化、例えばアレルギー、ぜん息及び慢性皮膚炎
症などの疾病治療を可能にする。

3.1. 略語 本明細書に現われるペプチド鎖はアミノ酸残基に対す
る１文字記号により下記のように表わされる： Ａ（アラニン）,R（アルギニン）,N（アスパラギ
ン）,D（アスパラギン酸）,C（システイン）,Q（グルタ
ミン）,E（グルタミン酸）,G（グリシン）,H（ヒスチジ
ン）,I（イソロイシン）,L（ロイシン）,K（リジン）,M
（メチオニン）,F（フェニルアラニン）,P（プロリ
ン）,S（セリン）,T（スレオニン）,W（トリプトファ
ン）,Y（チロシン）,V（バリン）。

4.［図面の説明］ 図１は、血漿フィブロネクチンへのＴリンパ球（Molt
4）、K562−1,RDまたはHT1080細胞の接着、P1D6モノク
ローン抗体による抑止及びα５β１の細胞表面発現を示
す。

⁵¹Cr−標識細胞（10⁵細胞/ml）をPID6モノクローン抗
体（50μg/ml）と共に60分間に亘って４℃に保温し、P1
D6（塗りつぶしレバー）またはマウスIgG（白抜きバ
ー）の存在において30分間（HT1080またはRD）または４
時間（Molt4またはK562）に亘り37℃においてフィブロ
ネクチン被覆（20μg/ml）プラスチック表面に接着させ
た。血漿フィブロネクチン（pFN）への接着はプラスチ
ック表面に結合する⁵¹Crのcpmで表わされる。α５β１
の細胞表面発現はP1D6モノクローン抗体によって細胞を
懸濁液中で着色することによりフローサイトメトリーに
よって測定した。log P1D6蛍光はバックグラウント以
上の平均チャンネル・ナンバー（０−255）として表わ
される。

図２は、HT10890,Molt4または慢性的に活性化してい
るCD8＋Ｔ（LAK）細胞の洗浄剤抽出物からのリンパ球フ
ィブロネクチン・レセプターの免疫沈降を示す。

プロテアーゼ抑止剤としてのフェニルメチル・スルフ
ォニル・フルオライド（1mM）、Ｎ−エチルマレイミド
（1mM）、ロイペプチン（１μg/ml）及びジイソプロピ
ル・フルオロフォスフェート（1mM）の存在において¹²⁵
I−標識Molt4,LAKまたはHT1080細胞を１％トリトンＸ−
100で抽出した。これらの抽出物の部分サンプルをα３
β1,α２β１及びα４β１に対するそれぞれのモノクロ
ーン抗体P1B5,P1H5及びP3E3と共に免疫沈降させた。２
−ME不在の条件下で免疫沈降抗原を7.5％SDS−PAGEゲル
に塗布し、オートラジオグラフィーで可視測定した。P3
E3と共にＴリンパ球から免疫沈降した３本の帯が示され
た（矢印）。

図３は、リンパ球の特定フィブロネクチン・レセプタ
ーとインテグリンα４β１との同定を示す。

1mMのCaCl₂,1mMジイソプロピル・フルオロフオスフェ
ート、1mMのフェニルメチル・スルフォニル・フルオラ
イド,1mMのＮ−エチルマレイミド,1μg/mlのロイペプチ
ン及び２μg/mlの大豆トリプシン抑制剤の存在におい
て、¹²⁵I−表面標識Jurkat細胞を0.3％CHAPsで抽出し
た。抽出物の部分サンプルを骨髄腫（SP2）培養上澄み
またはモノクローン抗体P3E3,P4C2,P4G9またはP1D6（抗
−α５β１）と共に免疫沈降させた。還元剤不在の条件
下で免疫沈降物を８％SDS−PAGEゲル上に塗布し、オー
トラジオグラフィーで可視測定した。左側に分子量マー
カーを示す。P3E3P,4C2及びP4G9と共に得られた免疫沈
降物中に帯としてα５及びβ１サブユニットが示されて
いる（矢印）。

図4A,4B,4C及び4Dは、フィブロネクチン被覆表面にお
ける局部的接着部位へのα４β１及びα５β１の集中度
を示す。

RD細胞をトリプシン処理し、血清不在の条件下で１時
間に亘り37℃で、シラン処理されたフィブロネクチン被
覆（20μg/ml）ガラス・カバー・スリップに接着させ
た。この１時間が経過した時点で、（実験手順）の項で
後述するようにレセプターを局部的接着部位に集中させ
た。パネルＡ及びＣはPD細胞がフィブロネクチンに接着
する過程で干渉反射顕微鏡で鏡検される局部的接着（矢
印）を示す。パネルＢは抗体AB33で着色されたRGD基本
型フィブロネクチン・レセプターα５β１の局部接着部
位（矢印）への組織変化を示す。パネルＤはRD細胞がフ
ィブロネクチンに接着する時にP4G9（FITC）で着色され
たα４β１の局部的接着部位への組織変化（矢印）を示
す。パネルＡ及びＢは同じフィールドであり、パネルＣ
及びＤは同じフィールドである。

図5Aは、この研究に使用されるフラグメントの起点を
示すヒト血漿フィブロネクチン（pFN）の領域構造を示
す。

図5Bは、フラグメントの純度を求めるSDS−PAGEゲル
分析（10％アクリルアミド）図を示す。

80kDaフラグメントはＮ−末端アミノ酸鎖SD（）VPSPR
（）LQFを有し、従って、フィブロネクチン分子の位置8
74で始まる。（Kornblihtt等,1985,EMBOJ.,４:1755−17
59）。このフラグメントはフィブロネクチン（＊）の細
胞結合領域（Cell）及びRGDS鎖を含む。58kDa及び38kDa
フラグメントはＮ−末端アミノ酸鎖TAGPTQTEMTIEGLQを
有する。両フラグメントはＣ−末端ヘパリン結合領域
（Hep II）を含み、トリプシンによる２つのフィブロネ
クチン鎖の分割がそれぞれ異なる。38kDaフラグメント
はフィブロネクチンのオルターナティブ・スプライシン
グされた連結セグメント（III CS）の最初の67個のアミ
ノ酸残基から成り（Garcia−Pardo,1987,Biochem.J.,24
1:923−928）、従ってＡ鎖から誘導される。38kDaフラ
グメントはB16−F10黒色腫細胞によって認識されるREDV
接着部位を含まない（Humphries等,1986,同上;Humphrie
s等,1987,同上）。58kDaフラグメントもフィブロネクチ
ンのＢ鎖から誘導され、III CS領域を含まない（Garcia
−Pardo等,1989,EMBO J）。58kDaフラグメントはフィブ
ロネクチンのＣ−末端フィブリン結合領域（Fib II）を
含み、血漿フィブロネクチンのこの領域からの既に報告
されているフラグメントと同様である（Click,E.M.及び
Balian,G.,1985,Biochem.,24:6685−6696）。帯は銀汚
染によって可視化する。

図6A,6B,及び6Cは、血漿フィブロネクチン及びその精
製された38kDa及び80kDaトリプシン・フラグメントへの
造血細胞の接着性を示す。

指示濃度の完全血漿フィブロネクチン（pFN）または
精製80kDa及び38kDaトリプシン・フラグメントで被覆し
たプラスチック表面に⁵¹Cr−標識K562（赤白血病）、Ju
rkat（CD3＋Ｔリンパ球）及びYT（CD3−Ｔリンパ球）細
胞（10⁵/ウエル）を２時間に亘り37℃で接着させた。こ
の２時間が経過した時点で非接着細胞を洗い落とし、接
着細胞をSDS/NaOHに溶解して測定した。測定結果は結合
している⁵¹Crのcpmで表わされる。

図7A,7B及び7Cは、完全血漿フィブロネクチン（pFN）
または精製80kDa及び38kDaトリプシン・フラグメントへ
のＴリンパ球接着に対する抗インテグリン・レセプター
α５β１及びα４β１モノクローン抗体P1D6,P4C2の作
用を示す。

精製P1D6またはP4C2モノクローン抗体（50μg/ml）ま
たは精製マウスIgG（（50μg/ml）と共に⁵¹Cr−標識Mol
t4細胞を１時間に亘り４℃に保温した。次いで指示濃度
の完全血漿フィブロネクチンまたは80kDa及び38kDaトリ
プシン・フラグメントで被覆したプラスチック表面に１
時間に亘って接着させた。この１時間が経過した時点
で、非接着細胞を洗い落とし、接着細胞を可溶化し、結
合している⁵¹Crのcpmをガンマカウンターで測定した。
測定結果は結合cpmで表わされた。

図８は、IL−１β活性化HUVE細胞へのＴリンパ球に対
するCS−１β12ペプチドの作用を示す。

図9A及び9Bはそれぞれ III CS及びCS−１領域のダイヤグラム。及びCS−1,A1
3及びB12のアミノ酸鎖を示す。

5.［発明の詳細な説明］ リンパ球中でのα５β１の作用を検討する実験におい
て、静止状態の末梢血液性及び培養Ｔリンパ球（Molt4
またはJurkat）が基本型フィブロネクチン・レセプター
α５β１に関係なくフィブロネクチンに対する親和性を
示すことが判明した。これらの細胞はフィブロネクチン
被覆表面に付着することがモノクローン抗体P1D6によっ
て認識されるα５β１のレベルは低いか、または検出不
能であった（Wayner等,1988,J.Cell.Biol.,107:1881−1
891）。また、フィブロネクチンへのＴリンパ球接着は
ペプチドを含有するP1D6またはRGDによって部分的にし
か抑止できなかった。このことは接着プロセスに他のフ
ィブロネクチン・レセプターが関与することを示唆する
ものである。ただし、フィブロネクチンへの他の細胞、
例えば悪性または変性線維芽細胞や活性Ｔリンパ球（LA
K細胞）の接着はP1D6によって完全に抑止された。この
ことは静止末梢血液性Ｔリンパ球及び培養Ｔリンパ球が
多様な独立的かつ機能的フィブロネクチン・レセプター
を発現することを示唆するものである。

本発明では、フィブロネクチンに対するＴリンパ球だ
けの接着を特定的に抑止するモノクローン抗体を製造す
ることによって代わりとなるフィブロネクチン・レセプ
ターを同定した。このレセプターはインテグリン・レセ
プターのα４β１と同じであり、血漿フィブロネクチン
への末梢血液性リンパ球、培養Ｔ細胞系及びRD細胞の接
着を仲介した。また、Ｔリンパ球はCS−1,CS−２及びCS
−３部位にまたがるタイプIII連結セグメント（III C
S）のヘパリンII領域及び69アミノ酸残基（Humphries
等,1986,J.Cell.Biol.,103:2637−2647）を含有する血
漿フィブロネクチンの38kDaトリプシン・フラグメント
に対する明確な優先選択を示した（Garcia−Rardo等,19
87,Biochem,J.,241:923−928）。本発明では、Ｔリンパ
球がCS−１にだけ付着し、α４β１に対するモノクロー
ン抗体（P3E3,P4C2,P4G9）が38kDaフラグメント及びCS
−１へのＴリンパ球接着を完全に抑止することが判明し
た。Ｔリンパ球が（極めて低い親和力で）ヘパリンII領
域中の部位に付着し、α４β１に対するモノクローン抗
体がこの相互作用を抑止することも明らかになった。α
４β１に対するモノクローン抗体はRGD鎖を含有する血
漿フィブロネクチンの80kDaトリプシン・フラグメント
へのＴリンパ球接着を抑止せず、α５β１（基本型フィ
ブロネクチン・レセプター）に対する抗体がこの相互作
用を完全に抑止した。

本発明はα４β１レセプターがリンパ球と内皮細胞と
の相互作用を仲介するという発見にも係わる。本発明で
は、抗体またはペプチドを使用することによって内皮細
胞へのリンパ球接着を阻止することができる。

説明の便宜上、本発明を下記パラグラフに分けて記述
する。

ｉ） 細胞外基質レセプター（ECMRs）に対する抗体の
製造； ii）ECMR/リガンド相互作用の特徴づけ； iii）細胞接着への介入方法； iv）本発明の実用性；及び ｖ） 本発明のペプチド及び抗体。

5.1. 細胞外基質レセプターに対する抗体の製造 細胞外基質レセプターに対する抗体の製造は公知の抗
体製造方法を利用して行えばよい。完全な細胞または精
製細胞外基質レセプター（ECMR）を免疫源として使用す
ることができる。宿主の免疫処置は異種移植片から得ら
れた免疫源を使用して行うのが好ましい。抗体はポリク
ローンでもモノクローンでもよい。

所与のECMRのエピトープに対するポリクローン抗体の製
造には種々の公知方法を利用すればよい。抗体の製造に
際しては、ECMR蛋白、合成蛋白またはそのフラグメント
を注射することで種々の宿主動物を免疫処置することが
でき、完全な細胞を使用してもよい。種々の補助剤を利
用することにより、宿主の種類に応じて免疫応答を増大
させることができ、補助剤としては例えば（完全または
不完全な）水酸化アルミニウムのようなフロインドのミ
ネラル・ゲル，リソレシチン，プルロニック・ポリオー
ル，ポリオニオン，ペプチド，オイル・イマルジョン，
キーホール・リムペット・ホモシアニンズ，ジニトロフ
ェノールのような界面活性物質、及びBCG（カルメット
・ゲラン杆菌）やコリネバクテリウム・パルブムのよう
なヒト補助剤がある。

ECMRのエピトープに対するモノクローン抗体は連続細
胞系培養によって抗体分子を生成させる方法で製造でき
る。このような技術としてはKohler及びMilstein（197
5,Nature,256:495−497）やTaggart及びSamloff（1983,
Science,219:1228−1230）が発表したハイブリドーマ技
術、さらに新しいヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozb
or等,1983,Immunology Today,４:72）及びEBV−ハイブ
リドーマ技術（Cole等,1985,Monoclonal Antibodies an
d Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77−96）など
がある。

治療用モノクローン抗体としてはヒト・モノクローン
抗体またはキメライン・ヒト・マウス（またはその他）
モノクローン抗体がある。ヒト・モノクローン抗体は公
知の技術（例えば、Teng等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,80:7308−7312;Kozbor等,1983,Immunology Toda
y,４:72−49;Olsson等,1982,Meth.Enzymol.,92:3−16）
のいずれかによって製造すればよい。キメライン抗体分
子はマウス抗原結合領域を含有するように作成すればよ
い（Morrison等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:6
851;竹田等,1985,Nature,314:425）。

ECMRエピトープに対する抗体の分子クローンは公知の
技術で製造できる。組換えDNA法（例えば、Maniatis等,
1982,Molecular Cloning,A Laboratory Manual.Cold Sp
ring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New Yor
k）を利用することにより、モノクローン抗体分子また
はその抗原結合部位を符号化する核酸鎖を構成すること
ができる。

抗体分子は公知技術、例えば、免疫吸収または免疫ア
フィニティー・クロマトグラフィー、HPLC（高速液体ク
ロマトグラフィー）のようなクロマトグラフ法、または
これらの組合わせなどで精製すればよい。

分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは
公知技術で形成することができる。例えば、このような
フラグメントとして、抗体分子のペプシン消化によって
得られるＦ（ab′）_２フラグメント、Ｆ（ab′）_２フラ
グメントの二硫化物ブリッジを還元することによって得
られるFab′フラグメント、抗体分子をパパイン及び還
元剤によって処理して得られる2FabまたはFabフラグメ
ントがある。

同様に、上記方法によって得られたECMRsと反応する
抗体は公知技術によって同定し、選択することができ
る。例えば、抗体がポリアクリルアミドの場合のように
他の蛋白から精製または分離された既知ECMRと結合及び
／またはこれを免疫沈降させることを確認することによ
って同定してもよいし、既知ECMR抗体と競合してECMRs
と結合する能力によって同定してもよい。ECMRsと結合
する抗体はECMR/リガンド相互作用を阻止する能力によ
っても同定できる。例えば、フィブロネクチンと結合す
るECMR（それ自体は同定されていなくても特徴が判明し
ていなくてもよく、機能が解明されているだけでよい）
を含む細胞はフィブロネクチンに被覆された基質に接着
することを実証すればよい。もし抗血清またはハイブリ
ドーマ上澄みが基質への細胞接着を抑止することが実証
されるなら、抗血清または上澄みに含まれる抗体がECMR
レセプターを認識することができる。

本発明では、α４β１レセプターを認識する抗体を、
上記方法で製造すればよく、本発明の好ましい実施例で
は、α４β１をターゲットとするモノクローン抗体を次
のように製造する。即ち、RBF/DNマウスから得られたマ
ウスを約100μｌのパックＴリンパ球で免疫処置したの
ち、その脾臓を摘出し、黒色腫細胞、例えばNS−1/FOX
−NY黒色腫細胞と混合する（大井及びHerzenberg,198
0,″Selected Merhods In Cullular Immunology″,Mish
ell and Shiigi,eds,Freeman and Co.,San Francisco,p
p.351−373;Tagart及びSamloff,1983,Science,219:1228
−1230）。次いでアデニン／アミノプテリン／チミジン
を添加されたRPM1 1640メディア中で生存可能なヘテロ
核を選択する。リンパ球ECMRsをターゲットとする抗体
を生成するハイブリドーマはフィブロネクチン被覆表面
への接着によってスクリーニングし、限界希釈によって
クローン化すればよい。具体的には、例えばCS−１ペプ
チドまたはその誘導体で被覆された基質または内皮細胞
へのリンパ球接着を抑止する能力によってα４β１に対
する抗体を同定することができる。ただし、α４β１を
認識する抗体はα５β１レセプターを有する細胞とRGD
ペプチド被覆基質との結合は抑止しない。α４β１をタ
ーゲットとする抗体を同定する別の方法として、ｉ）
（例えばP4C2またはP4C10のような）既知の抗体α４β
１の抗体の結合を競合的に抑止する能力、またはii）
（例えば蛋白ゲル、ウエスタン・ブロット、または連続
的免疫沈降実験において）既知の抗体α４β１抗体と同
じ蛋白と結合する能力によって同定することもできる。

5.2 ECMR/リガンド相互作用の特徴づけ 細胞外基質レセプターとリガンドとの相互作用は例え
ば下記の方法で特徴づけることができる。

ｉ）レセプターの分布及び機能の測定； ii）レセプター／リガンド結合への干渉； iii）レセプター及び／またはリガンドの分離及び化学
的特徴づけ。

これらの方法を以下のパラグラフでさらに詳しく説明す
る。

5.2.1 レセプターの分布及び機能の測定 本発明の方法では、公知の方法を利用してレセプター
分布を測定する。例えば、関連のECMRをターゲットとす
るモノクローン抗体を使用してこのECMRを有する細胞ポ
ピュレーションを明らかにする。ECMRと抗体の結合は免
疫蛍光検査や免疫ペロキシダーゼ着色のような免疫組織
化学技術を利用して検出することができる。あるいは、
関連ECMRを有する細胞ポピュレーションを蛍光活性化細
胞選別法を利用して採集することも可能である。

細胞が適当なリガンドを中心に成長する時、細胞表面
の接着レセプターの組織が特異な変化を起こして集中的
接着を形成すると考えられるから（Burridge等,1988,An
n.Rev.Cell.Biol.,４:487−525）、所与のレセプターと
潜在的リガンドとの相互作用を特徴づける１つの方法と
して、関連のECMRが細胞とリガンド基質との間に形成さ
れた集中接着中に分布しているかどうかの判定を行う。
例えば、下記の方法により、レセプター／リガンド関係
においてα４β１がフィブロネクチンと相互作用するこ
とをは明らかにすればよい。リンパ球をフィブロネクチ
ン基質に接着させ、干渉反射顕微鏡による鏡検によって
細胞と基質との間の集中的接着を可視化すればよい（Iz
zard等,1976,J.Cell.Sci.,21:129−158）。P4G9またはP
4C10のようなα４β１認識抗体を使用すれば、例えばフ
ルオロイソチオシアネートなどによる標準的な免疫組織
化学的方法によって、血清不在の状態でα４β１が集中
接着中に再分布するのを確認することができる。

ECMRとリガンドの相互作用はECMRが多様な基質に接着
する能力をテストすることによってもその特徴を知るこ
とができる。例えば、関連タイプの細胞または関連のEC
MRがフィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンなどのよ
うな細胞外膜の精製成分から成る基質と結合できる能力
をテストすればよい。本発明の一実施例では、α４β１
を有する細胞がフィブロネクチンには接着するが、α４
β1/フィブロネクチン相互作用の結果としてコラーゲン
やラミニンとは接着しないことを解明する。

関連のECMRが特定の蛋白リガンドと結合する本発明の
他の実施例では、蛋白リガンドのサブフラグメントを含
む基質が細胞表面のECMRと結合できる能力をテストする
ことにより、ECMRとリガンドとの結合部位で位置検出す
る。レセプターがフィブロネクチンと結合するα４β１
である本発明の一実施例では、フィブロネクチンのサブ
フラグメントを含む基質が後述のようにα４β１を有す
る細胞と結合できる能力をテストする。Ｔリンパ球はα
４β１レセプターを有するフィブロネクチンの80kDa細
胞結合領域に付着しているが（図5A）、Ｔリンパ球は血
漿フィブロネクチンのＡ（または重）鎖から誘導された
38kDaトリプシン・フラグメントに位置する非RD含有部
位を優先選択した。Ｔリンパ球はまた58kDaフラグメン
トを含む他のHep IIを認識し、これと結合した。ただ
し、高親和力リンパ球結合部位は38kDaフラグメントに
位置することが判明した。モル・ベースで38kDaフラグ
メントは仲介Ｔリンパ球接着において58kDaフラグメン
トよりも３倍以上有力であった。図5Aに示すように、38
kDaフラグメント及び58kDaフラグメントは血漿フィブロ
ネクチンのＡ及びＢ鎖からそれぞれ誘導された。従っ
て、両フラグメントはIII CSの存否に関係なく互いに異
なる（Kornblihtt等,1985,同上:Garcia−Pardo,1987,同
上）。従って、ここに使用される38kDaフラグメント及
び58kDaフラグメントはHep II領域に位置する共通の低
親和力Ｔリンパ球結合部位を分け合うことができ、III
CS領域に38kDaフラグメントに固有の高親和力Ｔリンパ
球接着部位が別に存在することになる。即ち、Ｔリンパ
球はB16黒色腫細胞及びトリ神経堤細胞に対する高親和
力接着部位として確認されているCS−１を特定的に認識
し、これと結合すると考えられる（Humphries等,1987,
同上;Humphries等,1988,J.Cell.Biol.,106:1289−1297;
Dufour等,1988,EMBO J.,７:2661−2671）。CS−１は血
漿フィブロネクチンＡ鎖のタイプIII CS領域に存在する
（オルターナティブ・スプライシングによって形成され
た）分子異質性部位である。

5.2.2 レセプター／リガンド結合への干渉 レセプター／リガンド結合を妨害する因子を同定し、
評価することによってECMR/リガンド関係をさらに特徴
づけることができる。

例えば、関連のECMRをターゲットとする抗体を使用す
ることによりリガンド／レセプター結合を抑止すること
がてきる。特定の細胞タイプが所与のリガンドまたは細
胞基質に接着するという観察事実から、相互作用に関与
するECMRを同定すればよく、そのためには、それぞれが
別々のECMRをターゲットとする一連のモノクローン抗体
を、基質への細胞接着を阻止する能力についてテストす
ればよい。特定の抗体によって結合が抑止されたとすれ
ば、この抗体によって認識されたECMRが接着相互作用に
関与することを示唆するものである。本発明の一実施例
では、培養内皮細胞へのリンパ球接着を抗α４β１抗体
によって抑止することができるが、その他のECMRsをタ
ーゲットとする抗体では抑止できず、このことは内皮細
胞へのリンパ球接着にα４β１が必要であることを示唆
するものである。また、モノクローン抗体を使用するこ
とにより、ECMRとリガンド基質との関係を解明すること
ができる。

後述するように、38及び58kDaフラグメントへのＴリ
ンパ球接着は機能が解明されている抗α４β１モノクロ
ーン抗体によって完全に抑止できた。さらに、（IgG接
合）CS−１被覆表面へのＴリンパ球接着はP4C2,P3E3ま
たはP4G9によって完全に抑止することができた。これら
のデータから、α４β１がCS−１に対するＴリンパ球レ
セプターであることは明らかである。しかし、これらの
抗体は基本型接着鎖arg−gly−asp（RGD）を含有する80
kDaフラグメントへのＴ細胞接着を抑止できなかった。8
0kDaフラグメントへのＴ細胞接着は抗α５β１モノクロ
ーン抗体（P1D6）またはRGDSによって完全に抑止するこ
とができた。P1D6及びRGDSは38及び58kDaフラグメント
またはCS−１へのＴリンパ球接着を抑止できなかった。
これらのデータを総合すれば、α４β１がIII CS（CS−
１）及びおそらくはHep IIにおけるオルターナティブ接
着鎖に対する血漿フィブロネクチンレセプターのカルボ
キシル末端接着領域に対してレセプターとして作用する
ことは明らかである。

本発明の他の実施例では、リガンドの構造を解明する
ことによってECMR/リガンド関係を特徴づけることがで
きる。具体的には、ECMR/リガンド相互作用において作
用剤がリガンドと競合する能力を評価すればよい。例え
ば、リガンドが蛋白である場合には種々の蛋白フラグメ
ントを、レセプター／リガンド結合を競合的に抑止でき
る能力についてテストすればよい。リンパ球が内皮細胞
及びフィブロネクチンと結合することが観察される本発
明の一実施例では、フィブロネクチンのペプチドフラグ
メントを、内皮細胞基質へのリンパ球結合を競合的に抑
止する能力についてテストすればよい。後述するよう
に、CS−１及び特にペプチドEILDVPSTはフィブロネクチ
ン及び内皮細胞へのリンパ球結合を競合的に抑止するこ
とができ、これによってEILDVPSTと全く同じか相同の部
位に対するリガンドの結合部位を位置検出することがで
きた。

5.3. 細胞接着への干渉方法 本発明では、ECMR/リガンド相互作用に干渉すること
によって細胞どうしの接着を抑止することができる。本
発明の一実施例においては、内皮細胞へのリンパ球結合
を、α４β１とそのリガンドとの結合に干渉することで
抑止することができる。この干渉はECMRをターゲットと
する、またはそのリガンドをターゲットとする抗体を使
用することによって達成される（リガンドに対する抗体
はECMRに対する抗体と同様に作成される）。本発明の他
の実施例では、α４β１とそのリガンドとの結合を抑止
するペプチドを使用することにより、内皮細胞へのリン
パ球接着を抑止することができる。

本発明の一実施例では、抗α４β１抗体またはそのフ
ラグメントまたは誘導体を使用することにより、α４β
１レセプターを有するリンパ球が血管内皮細胞に結合す
るのを抑止することができる。好ましい実施例において
は、抗体はモノクローン抗体、特に抗体P4C2（α４β
１）またはP4C10（β１）、またはそのフラグメントま
たは誘導体、例えば同じ結合特異性を有するキメラ抗体
である。

本発明の他の実施例では、ペプチドを使用することに
より、α４β１レセプターを有するリンパ球が血管内皮
細胞と結合するのを抑止することができる。好ましい実
施例ではペプチドがフィブロネクチンのIII CS可変領域
の鎖の少なくとも一部から成る。さらに好ましい実施例
ではペプチドがその内容を参考のため本願明細書に引用
したHumphries等のリポート（1987,J.Biol.Chem.,262:6
886−6892）に記載されているようなCS−１ペプチドの
少なくとも一部またはほぼ相同のペプチドから成る。最
も好ましい実施例ではペプチドが鎖EILDVPSTの少なくと
も一部、またはこれとほぼ相同の鎖から成る。

5.4. 発明の実用性 本発明ではECMRとそのリガンドとの間の結合に干渉す
ることにより細胞どうしの接着を抑止することができ
る。本発明の実施例ではリンパ球側のα４β１と内皮細
胞表面のリガンドとの結合に干渉することで内皮細胞へ
のリンパ球接着を抑止する。本発明は別のECMRを内皮細
胞リガンドと相互作用させてECMR/内皮細胞相互作用を
妨げることにより内皮細胞へのこれら細胞の接着を抑止
する。例えば、内皮細胞へのマクロファージ接着もマク
ロファージECMR/内皮細胞相互作用に干渉することで抑
止することができる。同様に、CS−１ペプチドを認識す
る黒色腫細胞が転移して組織に進入するのを本発明のペ
プチドまたは抗体を使用することで抑止できる。

従って、本発明の方法はリンパ球が血管内皮を通って
組織に進入するのを防止するのに有用である。即ち、本
発明はヒト患者における免疫応答を抑制する方法を提供
する。実施例として、本発明は免疫系の慢性または再発
性の活性化に伴なう疾病、例えば、膠原血管疾患及びそ
の他の自己免疫疾患（全身の紅斑性狼瘡やリウマチ性関
節炎など）のほか、多発性硬化症、ぜん息、アレルギー
などの治療法を提供する。本発明はまた、例えば対宿主
性移植片病、同種移植片拒絶反応、輸血反応などのよう
な比較的急性の免疫系活性化に対する治療法を提供す
る。

患者の異常の性質によっては、全身的または局部的に
組織へのリンパ球移動を抑止することが望ましい場合が
ある。例えば、全身の紅斑性狼瘡のように複数の器官系
にまたがる疾病においては、病勢悪化の過程でリンパ球
接着を全身的に抑止することが望ましい。ただし、局部
的な接触皮膚炎では関連組織へのリンパ球移動だけを抑
止することが好ましい。

本発明の方法を全身的に利用するか局部的に利用する
かの制御は投与する抗体またはペプチドの組成に変化を
加えるか、または作用薬の構造またはその薬学的組成に
変化を加えることによって達成することができる。例え
ば、本発明の抗体またはペプチドは皮下，筋肉内，脈管
内，静脈内，動脈内，鼻腔内，経口，腸腔内，直腸内，
気管内，鞘内など多様なルートで投与することができ
る。ただし、内皮細胞へのリンパ球接着を局所的に抑止
するには本発明の抗体またはペプチドを適当な基剤に適
量混入したものを皮下または筋肉内投与するのが好まし
い。リンパ球接着を全身的に抑止するには抗体またはペ
プチドを静脈内投与するのが好ましい。

本発明の種々の実施例において、本発明の抗体、ペプ
チドなどの投与を容易にする基剤を用いれば好都合であ
る。例えば、慢性皮膚炎治療のため抗体、ペプチドなど
を皮膚に到達させたければ、角質、外皮及び真皮に対す
る浸透を助ける基剤が好適である。

本発明のペプチドまたは抗体の拡散はペプチドまたは
抗体の半減期または有効半減期を変えることによって制
御できる。例えば、本発明のペプチドはその半減期が比
較的短く、もしこれを持続放出性の埋没片の形で投与す
ると、埋没片に近い組織部分（例えばリウマチ性関節炎
患者の関節）にペプチドが作用するが、もっと遠い組織
に到達する前にペプチドは分解してしまう。これとは逆
に、アミノ酸置換，グリコシル置換，鏡像性変更体（即
ち組成アミノ酸の鏡像異性体）の置換，添加などのよう
な化学的変性手段によって誘導体を生成させて半減期を
長くすれば、ペプチドを持続的なレベルで広範囲に分布
させることができる。さらに他の例として、ペプチドの
Ｎ末端またはＣ末端を変えることによって安定性を高め
ることができる。

さらに別の実施例では、本発明の抗体またはペプチド
を、これを特定の組織に向ける他の抗体またはリガンド
に接合する。例えば、本発明のペプチドを内皮細胞をタ
ーゲットとする抗体に接合する。さらにまた、ECMRを模
倣して内皮細胞リガンドに付着することにより、リンパ
球接着を阻止する抗体を製造することもできる。

5.5. 本発明のペプチド及び抗体 本発明のペプチドは関連のECMRと相互作用可能なすべ
てのペプチドを含む。本発明の一実施例においては、α
４β１レセプターと相互作用可能なペプチドを使用する
ことにより、内皮細胞へのリンパ球結合を抑止する。生
体に使用する前に、試験管内で内皮細胞へのリンパ球接
着を抑止する能力についてペプチドをテストするのが好
ましい。本発明の好ましい実施例では、ペプチドがフィ
ブロネクチンIII CS領域の少なくとも一部から成る。さ
らに好ましい実施例では、ペプチドがCS−１ペプチド鎖
の少なくとも一部、または図９（ａ）及び（ｂ）に示す
ようにCS−１鎖とほぼ相同の鎖から成る。最も好ましい
実施例では、ペプチドが鎖EILDVPSTの少なくとも一部、
またはこれとほぼ相同のペプチド鎖からなる。“ほぼ相
同”とは本発明のペプチドがペプチド鎖中の１個または
２個以上のアミノ酸を機能的にこれと等価のアミノ酸で
置換し、従って事実上変化のない変形鎖でもよいという
ことである。例えば、ペプチド鎖内の１個または２個以
上のアミノ酸残基を機能的に等価の作用を有する極性が
同じく他のアミノ酸で置換することができる。ペプチド
鎖内のアミノ酸に対する置換分はこのアミノ酸と同種の
他のアミノ酸から選択すればよい。例えば、無極性（疎
水）アミノ酸としてはアラニン，ロイシン，イソロイシ
ン，バリン，プロリン，フェニルアラニン，トリプトフ
ァン，メチオニンなどがある。極中性アミノ酸としては
グリシン，セリン，スレオニン，システイン，チロシ
ン，アスパラギン，グルタミンなどがある。正電荷（塩
基性）アミノ酸としてはアルジニン，リジン，ヒスチジ
ンなどがある。負電荷（酸性）アミノ酸としてはアスパ
ラギン酸，グルタミン酸などがある。さらに、既に述べ
たように、本発明は上記ペプチドの誘導体にも係わる。

本発明の抗体にはモノクローン及びポリクローン抗体
のほか、そのフラグメントや誘導体も含まれ、Ｆ（a
b′）2,Fab′及びFabフラグメントも含まれる。

6.［実施例］ 血漿フィブロネクチン中のオルターナティブ細胞結合領
域に対するリンパ球接着レセプターの同定及び特徴づけ 下記実験は有核造血細胞によって優先的に発現される
インテグリン・レセプターα４β１（Hemler等,1987,同
上）と全く同じと考えられる新しいフィブロネクチンを
示唆した。α４β１を特異フィブロネクチン・レセプタ
ーとして同定した根拠は（ｉ）モノクローン抗体（P4C
2,P3E3及びP4G9）によるフィブロネクチンへの細胞接着
の抑止と、（ii）α４β１の再組織及びフィブロネクチ
ンによる局部接着への集中であった。これらの所見に照
らして、基本型フィブロネクチン・レセプターα４β１
及びα５β１がフィブロネクチンへの細胞接着を仲介す
る最も重要な要因として作用すると考えられる。

6.1. 材料及び方法 6.1.1 試薬 フェニルメチル・スルフォニル・フルオライド,n−エ
チルマレイミド，ロイペプチン，ジイソプロピル・フル
オロフォスフェート,2−メルカプトエタノール，ウシ血
清アルブミン（BSA），トリトンＸ−100,プロテインＡ
−アガロース，大豆トリプシン抑制剤、及びV8プロテア
ーゼ（Staphylococcus aureus,株V8,プロテアーゼ・タ
イプXVII）をSigma Chemical Co.（ミズーリ州セントル
イス）から購入した。ラクトロペロキシダーゼ及びグル
コース・オキシダーゼはCalbiochem（カリフォルニア州
サンディエゴ）から、TPCK−トリプシンはCooper Biome
dical（ペンシルバニア州モーバーン）からそれぞれ入
手した。フルオレスセイン接合（ヤギ）抗−マウスIgG
及びIgM（Ｈ及びＬ鎖）またはローダミン接合（ヤギ）
抗−ラビットIgG及びIgM（Ｈ及びＬ鎖）をTago,Inc.
（カリフォルニア州バーリンゲーム）から入手した。Ｒ
−紅藻素接合ストレパビジンをBiomeda（カリフォルニ
ア州フォスターシティー）から、ラビット抗−マウスIg
G（Ｈ＋Ｌ）抗血清をCappel（Cooper Biomedica,ペンシ
ンバニア州モーバーン）からそれぞれ入手した。クロム
酸⁵¹Cr−ナトリウムはNew England Nuclearから、¹²⁵I
はAmershem（イリノイ州アーリントンハイツ）からそれ
ぞれ入手した。ヒト組換え型インターロイキン−２（HL
−２）はDr.D.Urdal（Immunex Corp.,ワシントン州シア
トル）から供与された。ラミニンはCollabortive Resea
rch,Inc.（マサチューセッツ州ベッドフォード）から購
入し、精製血漿フィブロネクチン及びコラーゲン・タイ
プＩ及びIIIは上述したように製造した（Wayner,E.A.及
びCarter,W.G.,1987同上及びWayner等,1988,同上）。

6.1.2 細胞及び細胞培養 RD（ヒト横紋筋肉腫）細胞及びHT1080（ヒト線維肉
腫）細胞をAmerican Type Culture Collection（メリー
ランド州ロックビル）から入手した。健常な提供者から
の末梢血液単核細胞（PBMC）、血小板及び顆粒球ポピュ
レーションを公知の方法（Kunicki等,1988,同上;Wayner
等,1988,同上）で処理した。急性リンパ球の、大顆粒リ
ンパ球（LGL）または骨髄性白血球患者の末梢血液細胞
をDr.I.Bernstein及びDr.T.Loughran（Fred Hutchinson
Cancer Research Center）から入手した。ヒトのリン
フォカイン（500U/ml IL−２）活性キラー（LAK）細胞
及びモノクローンHLA B7特異ヒト細胞素性Ｔリンパ球
（CTL）細胞系C1C4を標準プロトコル（Grimm等,1982,J.
Exp.Med.,155:1923−1941;Glasebrook,A.L.及びFitch,
F.W.,1980,J.Exp.Med.,151:876−895;Brooks,1983,Natu
re,305:155−158;Wayner.E.A.及びBrooks,C.G.,1984,J.
Immunol.,132:2135−2142;Wayner,E.A.及びCarter,W.
G.,1987,J.Cell.Biol.,105:1873−1884）に従って製造
した。C1C4 CTL系の製造に使用される提供者の脾臓か
らEBV転換Ｂリンパ球細胞系（BLCL）ST−１を得た。そ
の他の細胞系及び細胞培養条件はすべて公知の通りであ
った（Wayner,E.A.及びCarter,W.G.,1987,同上;Wayner,
等,1988,同上）。

6.1.3 抗体 フィブロネクチン・レセプターα５β１の細胞質領域
に対して製造されたラビットのポリクローン抗体AB33を
使用して局部接着におけるα５β１を検出した。VLAレ
セプター（Hemler等,1987,同上）の共通インテグリン
（Hynes,R.O.,1987,同上）β１サブユニットに対するモ
ノクローン抗体A1A5及びVLA4αサブユニット（Hemler
等,1987,同上）に対するモノクローン抗体B5−G10をDan
a−Farber Cancer Inst（マサチューセッツ州ボスト
ン）のDr.Marton Hemlerから入手した。インデグリン・
レセプターα３β１（P1B5），α２β１（P1H5）及びα
５β１（P1D6）に対するモノクローン抗体はこの研究所
で開発された。P1H5及びP1D6はコラーゲン及びフィブロ
ネクチン被覆基質への線維芽細胞及び血小板の接着をそ
れぞれ抑止する（Wayner,E.A.及びCarter,W.G.,1987,同
上;Kunicki等,1988,同上;Wayner等,1988,同上）。

リンパ球接着レセプターに対するモノクローン抗体を
Oi及びHerzenberg（Selected Methods in Cellular Imm
unology.Ed.by B.B.Mishell and S.M.Shiigi,W.H.Freem
an and Co.,San Francisco,pp.351−373に発表されたO
i,V.T.及びHerzenberg,L.A.,1980,“Immunoglobulin pr
oducing hybrid cell lines"）及びTaggart及びSamloff
（Taggart,R.T.及びSamloff,I.M.,1983,Science,219:12
28−1230）の方法により、上述のように製造した（Wayn
er及びCarter,1987;Wayner等,1988）。パックＴリンパ
球100μｌで免疫処置されたRBF/DNマウスから脾臓を摘
出し、NS−1/FOX−NY骨髄腫細胞と混合した。アデニン
／アミノプテリン／チミジンを添加されたRPMI中で生存
可能なヘテロ核を選択した。リンパ球接着レセプターを
ターゲットとする抗体を生成するハイブリドーマをフィ
ブロネクチン被覆表面へのリンパ球接着抑止特性でスク
リーニングし、限界希釈度によってクローン化した。

A1A5（Hemler等,1987.J.Biol.Chem.,262:3300−330
9）はリンテグリン・レセプターのβ１サブユニットと
特定的に反応し、細胞接着を抑止すると報告されている
が（竹田等,1988,J.Cell.Biochem.,37:358−393）、観
察の結果、この試薬はいかなる表面へのリンパ球接着も
抑止しない。そこで上述した技術を利用し、複数のリガ
ンドへの細胞接着抑止をスクリーニングすることによっ
て、機能が解明されている抗−β１モノクローン抗体P4
C10を製造した。P4C10はフィブロネクチン,CS−1,コラ
ーゲン及びラミニン被覆表面への細胞接着を抑止し、標
準的な生化学基準によればβ１と反応する。

6.1.4. 完全フィブロネクチン及びそのフラグメントへ
の細胞接着抑止 精製血漿フィブロネクチン，トリプシン・フラグメン
ト及びCSペプチドへの細胞接着に影響する抗体を公知の
方法で（Wayner及びCarter,1987）同定した。即ち、48
ウエルの未使用スチレン・プレートをヒト血漿フィブロ
ネクチン（５μl/ml）で被覆し、10mg/ml熱変質BSA（HB
SA）を添加したPBSでブロックし、Ｔリンパ球またはHT1
080細胞をNa₂ ⁵¹CrO₄（50μlci/ml,2−４時間）で標識
し、洗浄し、５×10⁴HT1080または培養Ｔ細胞または５
×10¹⁰PBL/ウエルを1mg/ml熱変質BSAを添加したPBSで1:
2希釈した）ハイブリドーマ培養上澄みまたは対照骨髄
腫細胞培養上澄みと共に室温で15分間保温した。ハイブ
リドーマの存在において15−30分間（HT1080）または２
−４時間（リンパ球）に亘り37℃で蛋白被覆表面に細胞
を接着させた。非接着細胞をPBS洗浄によって除去し、
接着細胞をSDS/NaOHに溶解させ、結合している⁵¹Cr−cp
mをガンマー・カウンターで測定した。

6.1.5 免疫沈降試験、逐次免疫沈降試験V8プロテアー
ゼ・ペプチド・マッピング及びポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動 生存可能な細胞を公知の方法（Wayner及びCarter,198
7）に従って125−沃素で表面標識し、次いで50mMフォス
フェート緩衝塩pH7.2に１％V/VトリトンＸ−100洗浄剤
または0.3％CHAPS洗浄剤を溶かした溶液で抽出した。場
合によってはこのリーシス緩衝塩に1mMのCaCl₂を添加し
た。1mMのフェニルメチル・スルホン・フルオライド,1m
MのＮ−エチルマレイミド,1μl/mlのロイペプチン及び
１μg/mlの大豆トリプシンをプロテアーゼ抑制剤として
使用した。免疫沈降試験及び逐次免疫沈降試験は公知の
方法（Wayner及びCarter,1987,同上）に従って実施し
た。ペプチド分析はCleveland等の基本的な方法（1977,
J.Biol.Chem.,252:1102−1106）にこれも公知の改良を
加えた方法（Wayner及びCarter,1987）に従って実施し
た。Laemmliの基本的なスタッキング・ゲル方式（1970,
Nature,227:680−685）に従って硫酸ナトリウム・ドデ
シルを含有するポリアクリルアミド・スラブ・ゲル（SD
S−PAGEゲル）を製造した。

6.1.6. ヒト血漿フィブロネクチンからのトリプシン・
フラグメントの製造及びCSペプチドの合成 ヒト血漿フィブロネクチンはDrs.Horowitz及びSchulm
an（New york Blood Center,NY）から供与された。フィ
ブロネクチンをTPCK−トリプシンと共に37℃で90分間温
浸処理し、これを公知の方法（Garcia−Pardo等,1987,B
iochem.J.,241:923−928;Garcia−Pardo等1989,Exp.Cel
l.Res.,181:426−431）に従い、アフィニティー及びイ
オン交換クロマトグラフィーによって分留した。ヒト・
フィブロネクチンIII CS部位の初期48残基にまたがる２
つのオーバラップ・ペプチド（CS−１及びCS−２）を公
知の方法（Humphries等,1986,及びHumphries等,1987,J.
Biol.Chem.,262:6886−6892）で合成し、ラビットIgGと
結合した。

6.1.7 レセプター発現の蛍光分析 懸濁液中における細胞上のECMRs発現をEPICS750デュ
アル・レーザー・セルソーダー（Coulter,フロリダ州ハ
イアリー）による１色または２色フローサイトメトリー
によって分析した。ポジティブ蛍光を30logスケールで
測定し、蛍光の強さ（logFI）を平均チャンネル・ナン
バー（０−255）によって表わした。非免疫IgG負対照に
対するバックグラウンド蛍光を各細胞ポピュレーション
ごとに測定し、これを差引いた。接着細胞をトリプシン
処理し、フローサイトメトリーに使用する前に、血清の
存在において37℃で15分間回復するにまかせた。１色ま
たは２色蛍光測定を行うため、懸濁液中の10⁶個の細胞
を蛋白Ｇ−セファローゼ精製ヤギIgG（20μg/ml）と共
に30分間、次いで第１段抗体と共に60分間、４℃に保温
し、10mg/mlのHBSA及び0.02％アジ化ナトリウムを含有
するハンクス平衡塩溶液（Hanks/BSA/SA）中で洗浄し、
Hanks/BSA/SA中でFITC配合ラビット抗マウスIgGと共に6
0分間４℃に保温した。次いでこれを（調製したばかり
の）２％パラホルムアルデヒドの冷PBS溶液中で洗浄
し、固定した。２色蛍光の場合には、精製したビオチニ
ル置換モノクローン抗体を、Hanks/BSA/SA中の最終濃度
が１μg/mlとなるまで、FITC着色された固定細胞に添加
し、60分間、４℃に保温した。あらかじめ２％パラホル
ムアルデヒドで固定したことはリンパ球インテグリン・
レセプターの発現にほとんど影響しなかった。固定細胞
を洗浄し、1/50希釈比でフィコエリスリン配合ストレパ
ビジン（Bionetics）を含有する0.5ml Hanks/BSA/SA中
で30分間、４℃に保温した。最後に着色細胞を洗浄し、
再びパラホルムアルデヒド２％PBS溶液中に固定し、EPI
CSフローサイトメーターによる分析のため暗処で４℃に
維持した。

6.1.8. 局部接着へのレセプターの集中 接着細胞をトリプシン処理し、１μg/ml BSA及び100
μg/ml大豆トリプシン抑制剤を添加したRPMI中で洗浄
し、酸洗浄及びシラン処理を施したフィブロネクチン，
ラミニンまたはコラーゲン（20μg/ml）被覆ガラス・カ
バー・スリップに、１−４時間に亘り、血清不在の条件
下で接着するにまかせた。保温後、非接着細胞を除去
し、接着細胞を100mMのカコジル酸ナトリウム、100mMの
スクロース、4.5mMのCaCl₂、２％ホルムアルデヒド中で
20分間に亘って固定した。５分間に亘り0.5％トリトン
Ｘ−100で可浸透化したのち、ヤギ血清の25％PBS溶液で
洗浄し、ブロックした。可浸透化細胞を特定レセプター
に対する抗体で着色し（室温で60分間）、洗浄し、FITC
配合ヤギ抗マウスまたはローダミン）配合ヤギ抗ラビッ
トIgGと共に（45分間に亘って室温に）保温し、再び洗
浄した。公知の方法で（Izzard,S.C.及びLochner,L.R.,
1976,J.Cell.Sci.,21:129−159）カバー・スリップをガ
ラス・スライド上に伏せ、蛍光試験及び干渉反射顕微鏡
検（IRM）した。

6.1.9 組織着色 低温切片を蛍光鏡検することにより組織中αインテグ
リン・レセプター分布を検討した。低温切片（６μｍ）
はイソペンタン／液体窒素中で急冷したのちOCT媒中に
埋没させたヒトの皮膚，扁桃、または腫瘍サンプルから
作成した。公知の方法で（Carter及びWayner,1988,J.Bi
ol.Chem.,263:4193−4201）すべての切片をパラホルム
アルデヒド４％PBS溶液中に固定してから１次抗体及び
２次蛍光抗体と共に保温した。対照実験では、フルオレ
セイン・フィルターを使用したところ、ローダミンの蛍
光は全く検出されなかった。

6.2. 結果 6.2.1 オルターナティブ・フィブロネクチン・レセプ
ターの同定 培養Ｔリンパ球（Molt4）、K562、RD（横紋肉腫）及
びHT1080（線維肉腫）細胞及び新鮮な（図示しない）PB
Lがフィブロネクチン被覆表面に接着した（図1:白抜き
バー）。ただしMolt4及びRD細胞は低レベルまたは検出
不能レベルの、モノクローン抗体P1D6によって認識され
る基本型フィブロネクチン・レセプター（インテグリン
α５β１）を発現させた（図1:縞付きバー）。これと符
号して、フィブロネクチンへのMolt4及びRD細胞の接着
をP1D6によって完全には抑止できなかった（図1:塗りつ
ぶしレバー）。しかし、豊富なα５β１を発現させた細
胞（HT1080及びK562）のフィブロネクチンへの接着はP1
D6によって効果的に抑止された。また、合成ペプチドRG
DSは血漿フィブロネクチンへのＴリンパ球の接着を完全
には抑止しなかった（Molt4またはJurkat細胞では50−7
0％、線維芽細胞では80−90％、K562−１細胞では100
％）。これらのデータに照らして、Ｔリンパ球のような
いくつかの細胞はα５β１以外のフィブロネクチン接着
レセプターを発現させると考えられる。

そこで発明者等は培養Ｔリンパ球に対するモノクロー
ン抗体を作成し、フィブロネクチン被覆表面へのリンパ
球の接着を特定的に抑止するが線維芽細胞の接着は抑止
しない性質に関してこれらの抗体をスクリーニングする
ことにより、推定される他のフィブロネクチン・レセプ
ターの同定を試みた。このようなプロトコルを使用し
て、フィブロネクチンへの培養Ｔリンパ球の接着を抑止
するがHT1080細胞の接着は抑止しないいくつかのモノク
ローン抗体（P4C2,P3E3,P4G9）を同定した（表III）。

¹²⁵I表面標識PBL（図示しない）、Molt4またはHT1080
（図２）細胞をトリトンＸ−100洗浄剤に加えた溶液か
らの免疫沈降は抑止性モノクローン抗体（P3E3に関する
データを図示）が還元剤の存在において（図示しない）
または不在の条件下で（図２）M150,000（p150）で移動
するリンパ球抽出物中の単一蛋白と反応することを示唆
した。このような免疫沈降条件下でp150には明白なα−
βサブユニット構造が欠けており、インテグリン・レセ
プターα２β１またはα３β１のαまたはβサブユニッ
トと共に移動しなかった（図２）。慢性的に活性化した
CD8＋キラーＴリンパ球（LAK）またはCTL（図示しな
い）をトリトンＸ−100洗浄剤に添加して得た抽出物か
ら免疫沈降した抗原はp150のほかに、還元剤の存在にお
いて（図示しない）または不在の条件下でM80,000及び7
0,000で移動する比較的多量の２種類の小蛋白を含有し
ていた。V8プロテアーゼ・ペプチド・マッピンクの結
果、p80及びp70がp150の蛋白分解性フラグメントである
ことが判明した。これらの低分子量フラグメントは洗浄
剤抽出物が複数のプロテアーゼ抑制因子（図２、リガン
ド）の存在において調製された場合でも慢性活性化Ｔ細
胞から免疫沈降させることができた。静止PBL、培養Ｔ
（Molt4、Jurkat）またはＢ細胞性白血病細胞及びRD細
胞で調製した抽出物からはp80及びp70はほとんど検出さ
れなかった。

p150の生化学的特性はVLA4との関連性（Hemler等,198
7）を示唆した。このことはVLA4特異モノクローン抗体B
5−G10を使用した逐次免疫沈降（図示しない）によって
確認された。1mMのCa⁺⁺の存在において¹²⁵I表面標識Ｔ
リンパ球をCHAPS洗浄剤（0.3％）で可溶化したα５免疫
沈降試験を実施した結果、β１との関連性により、p150
はインテグリン・スーパー・ファミリーのαサブユニッ
トであることが明らかになった。このような条件下でα
４はβ１と共にヘテロダイマーとして沈降した。β１で
あることはV8プロテアー・ペプチド・マッピング（図示
しない）によって確認された。抑止性モノクローン抗体
（P3E3,P4C2及びP4G9）と共にＴリンパ球から免疫沈降
したα４β１ヘテロダイマーはP1D6と共に免疫沈降した
基本型フィブロネクチン・レセプターα５β１とは次の
３点で異なることが判明した。１）Ｔリンパ球の洗浄剤
抽出物中に存在するα４β１及びα５β１の相対量はα
５β１に比較してα４β１の存在が高レベルである点が
目立ち（図３）、このことはフローサイトメトリーを利
用して得たデータとも一致した（図１）。２）逐次免疫
沈降試験において、α４β１に対するモノクローン抗体
はα５β１をプレクリアしなかった。３）モノクローン
抗体P3E3及びP1D6と共に沈降したα４及びα５サブユニ
ットから得られたV8プロテアーゼ・ペプチド・マップは
互いにはっきりと区別できるものであった（図示しな
い）。さらにまた、Jurkat細胞からのα４β１の配合体
（図３）を可溶化するため設定された条件（0.3％CHAPS
及び1mM CaCl₂）下で、分子量が比較的高い他の蛋白
（p180）もモノクローン抗体と反応するか、またはα４
β１と共に沈降した。P1D6モノクローン抗体（図３）で
調製された抽出物、非リンパ細胞またはCa⁺⁺不在の条件
下で調製されたトリトンＸ−100洗浄剤抽出物からはp18
0が検出されなかった。p180と他のインテグリンとの関
係は未知である。Ca⁺⁺が不在の条件下でＴ細胞をトリト
ンＸ−100で可溶化したのちα４をβ１抜きで免疫沈降
させることができるから、抑止性モノクローン抗体がα
４サブユニットに存在するエピトープを認識することは
明らかである（図２）。

6.2.2. 培養細胞及び組織中のα４β１及びα５β１の
分布 既に報告されているように（Hemler,同上）、α４β
１は有核造血細胞に広く分布していた（表IV）。

２色フローサイトメリーは脾臓、扁桃及び末梢血液から
得られたリンパ球サブポピュレーションがいずれも豊富
なα４β１を発現させることを明らかにした。さらに、
急性リンパ球（ＴまたはＢ）白血病細胞からの末梢血液
単球、大顆粒リンパ球（LGL）及び骨髄性白血病及び培
養Ｔ及びＢリンパ球細胞系はいずれも豊富なα４β１を
発現させる（表IV）。健常なヒトの血小板及び顆粒球は
α４β１に関してはネガティブであった（表IV）。これ
とは対照的に、α５β１を発現させた造血細胞ポピュレ
ーションは活性化Ｔ細胞，血小板，単球，顆粒球，急性
リンパ性（ＴまたはＢ）及び骨髄性白血病細胞及び培養
K562、HL−60及びU937細胞であった。ある種の培養Ｔ
（Molt4またはJurkat）及びＢ（ST−１）細胞系はP1D6
モノクローン抗体による検出される低レベルのα５β１
を発現させる。数人の健常者ではフローサイトメトリー
によって検出されるP1D6蛍光に関してPBLサブポピュレ
ーションがポジティブであった。発明者等はα５β１を
発現させるこのPBLサブポピュレーションの性質を究明
中である。TY細胞、CD3T細胞リンパ腫はフローサイトメ
トリーによればP1D6に関して完全にネガティブであっ
た。これらの結果は静止Ｔリンパ球によって発現させら
れる主要フィブロネクチン・レセプターがα４β１であ
り、発明者等が既に報告したように（Wayner等,198
8）、Ｔリンパ球中のα５β１の発現は白血病または活
性化培養細胞に限られることを示唆している。興味深い
ことに、線維芽細胞の多くは低レベルのα４β１を発現
させたが、フローサイトメトリーによれば、大脈管内皮
細胞（HUVEs）及び培養上皮細胞はα４β１に関してネ
ガティブであった。

組織においては、成人の脾臓、リンパ節、及び扁桃に
α４β１が存在し、その他の組織にはほとんど存在しな
かった。さらに、特定の組織領域において細胞が発現さ
せるフィブロネクチン接着レセプターの相対量には大き
いばらつきが見られた。例えば、扁桃、皮質及び胚芽中
心部におけるPBL及びリンパ球は多量のα４β１を発現
させたが、α５β１はほとんど発現させなかった。α４
β１は成人のリンパ組織中にも見られたが、このことが
この部位のリンパ球湿潤の結果なのか、あるいはリンパ
上皮細胞によるα４β１発現なのかは不明であった。

6.2.3. α４β１はフィブロネクチンによる局部接着に
集中する 細胞が血清不在の条件下で適当なリガンドを中心に成
長すると細胞表面接着レセプターに特異な組織変化が生
じて局部接着が形成される（Burridge等,1988,Ann.Rev.
Cell Biol.,４;487−525）。線維芽細胞にはα４β１を
発現させるものがあるから、発明者等はフィブロネクチ
ンが接着基質として使用された場合、このレセプターが
局部接着に分布するかどうかを検討した。図４（Ａ及び
Ｃ）から明らかなように、主要な局部的接触部位または
接着部位を、RDがフィブロネクチン中で成長する時に干
渉反射顕微鏡検によって視認することができた（Izzar
d,S.C.及びLochner,L.R.,1976,J.Cell.Sci.,21:129−15
9）。発明者等及び他の研究者が既に報告したように（R
oman,J.,LaChance,R.,Broekelman,T.J.,Roberts,C.J.,W
ayner,E.A.,Carter,W.G.及びMacdonald,J.,1988,J.Cell
Biol.,108:2529−2543）、血漿不在の条件下でRD細胞
がフィブロネクチンで（図4B、矢印）ただしラミニン被
覆表面においてでなく成長すると、α５β１が局部的接
着部位に集中した。同様に、モノクローン抗体P4G9（図
4D、矢印）で着色した結果、細胞がフィブロネクチン
で、ただしラミニン被覆表面でなく成長するとα４β１
も局部的接着部位に集中した（図示しない）。これらの
結果に局部接着部位、即ち、培養細胞の主要接着構造に
存在するフィブロネクチンとα４β１の特異な相互作用
を示すものである。

局部的接触部位に両レセプターが存在することでα４
β１及びα５β１がフィブロネクチンの別々の接着鎖と
結合する可能性が示唆された。事実、この可能性はP4C2
及びP1D6を同時に使用して完全な血漿フィブロネクチン
への細胞接着を抑止した時に実証された。一緒に使用す
ると、P1D6及びP4C2は完全な血漿フィブロネクチンへの
Ｔリンパ球の接着を完全に抑止し、RD細胞の接着を部分
的に抑止した（表Ｖ）。

興味深いことに、Ｔリンパ球と異なり、P1D6だけでもP4
C2だけでも完全な血漿フィブロネクチンへのRD細胞接着
に対するすぐれた抑止因子とはならなかった。フィブロ
ネクチンへのRD細胞接着はP1D6及びP4C2を併用すること
で効率よく抑止できた。

6.2.4. α４β１はフィブロネクチン中のRGDとは独立
のオルターナティブ付着部位に対応するレセプターとし
て作用する 上記結果（表III,表Ｖ、図1,図４）から明らかなよう
に、血漿フィブロネクチンへの細胞接着は２つの互いに
独立の細胞表面レセプターα４β１及びα５β１によっ
て仲介される。フィブロネクチン中のα５β１に対応す
るリガンドが80kDa細胞結合領域であり、該領域がRGD鎖
を含有することは既に発表されている（Pytela,R.,Pier
schbacher,M.D.,及びRouslanti,E.,1985,Cell,40:191−
198）。α４β１と相互作用するフィブロネクチンの部
位を突き止めるため、（図5A及びＢ参照）発明者等は血
漿フィブロネクチンの種々の蛋白分解性フラグメントへ
の培養Ｔリンパ球の接着と、これらのフラグメントへの
リンパ球接着に対するモノクローン抗体P1D6及びP4C2の
作用を検討した。図６に示すように、Jurkat,YT及びMol
t4細胞は含RGDフラグメント（80kDa）に対してよりもヘ
パリン（Hep）II領域を含有する38kDaフラグメントに対
して効率よく接着する。Jurkat及びMolt4細胞は、58kDa
フラグメントを含有する他のHep II領域にも依存態様で
接着している。ただし、58kDaへの細胞接着は最大でも3
8kDaフィブロネクチン・フラグメントによって達成され
る接着の30％に過ぎない。このことは38kDaフラグメン
トがＴリンパ球との高親和力接着部位を含むことを示唆
する。Ｔリンパ球は血漿フィブロネクチンのHep I領域
を含有するＮ−末端29kDaフラグメントには接着しなか
った。一般に、新鮮なPBLはJurkatまたはMolt4細胞と同
様の接着パターンを示し、新鮮なPBLが80kDaフラグメン
トと結合する能力はα５β１の発現と相関した。他の造
血細胞系、例えばK562細胞（図６）は血漿フィブロネク
チンの80kDaフラグメントを優先的に選択し、RD細胞は
Ｎ−末端29kDaフラグメント以外のすべての血漿フィブ
ロネクチン・フラグメントと無差別に接着した。RDGS
（1mg/ml）は完全フィブロネクチンへのJurkat細胞の接
着を部分的に（50％）抑止し、80kDaフラグメントへの
接着を完全に（100％）抑止した。38kDaフラグメントへ
のJurkat細胞接着は（1mg/mlまでの）RFDSには影響され
なかった。

表３及び図１に示すように、α４β１及びα５β１に
対するモノクローン抗体は完全な血漿フィブロネクチン
へのＴリンパ球接着を部分的に抑止した（図７、上）。
予期した通り、P1D6はRGD接着鎖を含有する80kDaフラグ
メントへのＴ細胞接着を完全に抑止した（図７、中）。
P1D6は38kDa（図７、下）または58kDaフラグメントへの
Ｔリンパ球接着を抑止しなかった。これとは対照的に、
P4C2は38kDaフラグメントへのＴリンパ球接着を完全に
抑止し、80kDaフラグメントへの接着には全く作用しな
かった（図７）。また、Hep IIを含有する58kDaフラグ
メントへのＴリンパ球接着はP4C2によって抑止できなか
った。いずれの場合にも、（例えばJurkat細胞のよう
に）α４β１及びα５β１の双方を発現させる他のＴリ
ンパ球細胞系はMolt4細胞と全く同様の挙動を示した
（図７）。表４から明らかなように、K562細胞はα５β
１だけを発現させた。38（図６）及び58kDaフラグメン
トへのK562細胞の接着は80kDaフラグメント（図６）へ
の接着に比較してはるかに少なかった。完全な血漿フィ
ブロネクチン（図１）または80kDaフラグメントへのこ
れらの細胞の接着はP1D6によって完全に抑止することが
できた。他方、α５β１を発現させないYT細胞（表IV）
は完全血漿フィブロネクチン及び80kDaフラグメント
（図６）に対して接着し難い。これらの細胞が血漿フィ
ブロネクチン被覆表面に接着するにはJurkatまたはMolt
4細胞よりも２〜３倍長い時間がかかる。ただし、YT細
胞は38kDaフラグメント（図６）に効率よく、かつ投与
量に応じて接着し、38kDaフラグメントへのこの細胞の
接着はP4C2によって完全に抑止することができた。以上
のデータはα４β１の発現とHep II及びIII CS領域を含
む血漿フィブロネクチン・フラグメントへの接着能力と
の間に直接的な相関関係が存在することを示唆するもの
である。これらのデータはまた、α４β１がこのオルタ
ーナティブ細胞接着領域に対応するレセプターとして作
用することを明白に示す。

6.2.5. α４β１はCS−１に対応するリンパ球レセプタ
ーである 血漿フィブロネクチンＡ鎖に存在するIII CS領域（図
５）はフィブロネクチンへの細胞接着を仲介する少なく
とも２つの部位を含む（Humphries等,1986,J.Cell Bio
l.,103:2637−2647;Humphries等,1987,J.Biol.Chem.,26
2:6886−6892;Humphries等,1988,J.Cell Biol.,106:128
9−1297）。III CS領域全体にまたがる一連のオーバラ
ップ合成ペプチド（CSペプチド）を使用して、Humphrie
sとその協力者達はCS−１（Ｎ−末端）ペプチドがマウ
ス黒色腫細胞によって認識される接着鎖を含むことを立
証した（Humphries等,1986,1987）。発明者達は38kDaフ
ラグメントがヒトＴリンパ球によって認識される高親和
力接着部位を含み、α４β１が38kDaへのＴリンパ球接
着を仲介するレセプターであることを立証した。このフ
ラグメントはCS−５部位を含まず、黒色腫細胞に対する
高親和力接着部位として確認されている（Humphries等,
1987,J.Biol.Chem.,262:6886−6892）全CS−１領域を含
む（Garcia−Pardo等,1987,Biochem,J.,241:923−92
8）。従って、Ｔリンパ球がCS−１を認識し、これに接
着するかどうか、α４β１がこの相互作用に関与するレ
セプターであるかどうかを確認することが重要であっ
た。

Ｔリンパ球（JurkatまたはMolt4細胞）はCS−１（ラ
ビットIgG配合）被覆プラスチック表面を認識し、これ
に接着する（表VI）。Ｔリンパ球（Jurkat）はCS−２
（ラビットIgG配合）被覆表面またはラビットIgGだけで
被覆したプラスチック表面には接着しない。また、α４
β１に対するモノクローン抗体（P4C2）はCS−１へのＴ
リンパ球接着を完全に抑止したが、α５β１に対する抗
体（P1D6）は全く作用しなかった（表VI）。既に示した
通り、α４β１に対する抗体は38kDaフラグメントへの
Ｔリンパ球の接着を完全にかつ特定的に抑止し（表V
I）、α５β１に対する抗体は80kDaフラグメントを含む
RGDへの接着を特定的に抑止した。

6.3. 検討 モノクローン抗体技術（Wayner,E.A.,Carter,W.G.,Pi
otrowicz,R.及びKunicki,T.J.,1988,J.Cell Biol.,10:1
881−1891）を利用して、発明者等は新しいフィブロネ
クチン・レセプターα４β１を同定した。モノクローン
抗体P3E3,P4C2及びP4G9はα４サブユニットのエピトー
プを認識し、カルボキシ末端ヘパリンII領域及びタイプ
III連結セグメント（II CS）の一部を含有する血漿フィ
ブロネクチンの38kDaトリプシン・フラグメントへの末
梢血液及び培養Ｔリンパ球の接着を完全に抑止した。α
４β１に対応するIII CS中のリガンドは黒色腫細胞接着
部位として既に確認されているCS−１領域であった。α
４に対する既に機能の明らかなモノクローン抗体は完全
血漿フィブロネクチンへのＴリンパ球接着を部分的に抑
止し、RGD接着鎖を含む80kDaトリプシン・フラグメント
への接着には全く作用しなかった。上述したフィブロネ
クチン・レセプターα５β１に対するモノクローン抗体
（P1D6及びP1F8）は80kDaフラグメントへのＴリンパ球
接着を完全に抑止したが38kDaフラグメントまたはCS−
１への接着には全く作用しなかった。α４β１も、α５
β１これらのレセプターを発現させる線維芽細胞がフィ
ブロネクチン被覆表面で成長する時、局部的接着部位に
集中した。以上の知見から局部的接触部位における両レ
セプターとフィブロネクチンとの特異な相互作用が裏付
けられた。

最近になって、いくつかのＢリンパ球細胞系がカルボ
キシ末端Hep II領域内の血漿フィブロネクチン部位と結
合することが報告された（Bernardi等,1987,同上;Liao
等,1987,Exp.Cell Res.,171;306−320;Liao等,1989,Ex
p,Cell Res.,181:348−361）。Liao等はＢ細胞にインテ
グリン状のレセプターを同定した（1987,同上）。しか
し、彼等が報告した蛋白がα４β1,α２β1,α５β１の
いずれであるかは明確でない。Bernardi等（1987、同
上）もＢリンパ球によって発現されるフィブロネクチン
・レセプターを同定した。この研究では、Hep IIを含む
フラグメントに接着するＢ細胞がα４β１に似たレセプ
ターを発現させたのに対し、細胞接着領域を含むRGDに
接着する細胞はα５β１に似たレセプターを発現させ
た。ただし、これらのデータから接着に関与するレセプ
ターを明らかにすることは不可能であった。これらのリ
ポートと本発明の知見を総合すれば、ｉ）血漿フィブロ
ネクチンのカルボキシ末端にオルターナティブ接着部位
が存在することと、ii）α４β１がこのオルターナティ
ブ接着部位に対応するレセプターの役割を有することを
立証することができる。α４β１とフィブロネクチンの
相互作用に関与する正確なアミノ酸鎖を解明できれば有
意義である。38kDaフラグメントも58kDaフラグメントも
CS−１もRGD鎖を含まないから（Kornblitt等,1985,同
上;Garcia−Pardo等,1987,同上;Humphries等,1986,同
上；及びHumphries等,1987,同上）、α４β１に対応の
リガンドを特徴づけることでフィブロネクチンへの細胞
接着に不可欠な新しいアミノ酸鎖を同定できることは明
らかである。38kDaフラグメントはCS−５を含まないか
ら（Garcia−Pardo,1987,同上）、38kDaへのＴリンパ球
接着に関与する最小限のアミノ酸鎖、従ってこれらの細
胞中のα４β１に対応のリガンドはarg−glu−asp−val
でもREDVでみない（Humphries等,1986,同上）。

α２β１と同様に、α４サブユニットもβ１サブユニ
ットとの関連性が弱い。図２に示すデータと発明者等が
これまでに得た知見（Wayner,E.A.及びCarter,W.G.,198
7,同上；及びWayner等,1988,同上）を総合すると、α２
β１及びα４β１に対する既に機能が解明されているモ
ノクローン抗体がサブユニット分離後、β１抜きでα２
またはα４の免疫沈降に基づき、αサブユニットに存在
するエピトープと選択的に相互作用することは明らかで
ある。この結果は各α−β錯体のリガンド結合特異性を
決定するのがユニークなαサブユニットであることを示
唆する。このことはいずれもβ１と錯体を形成するα５
及び４がフィブロネクチンの特定部位との接着を仲介す
るという所見によっても裏付けられる。これはβサブユ
ニットが接着に重要でないというのではなく、レセプタ
ー／リガンド相互作用の特異性がαまたはユニークなα
−β錯体によって決定されることを示唆する。

LAK細胞は豊富な細胞表面α４β１を発現させたが機
能的レセプターとは考えられず、フィブロネクチンへの
LAK細胞接着をP1D6が完全に抑止したことは興味深い。
おそらくはLAK細胞が劣化した形のα４（図２参照）を
発現させるからであろう。また、LAK細胞は活性化状態
にあるから、静止末梢血液または白血病Ｔ細胞に比較し
てα５β１を過剰に発現させる（表VIII）。α４β１に
比較して多量のα５β１を発現させる他の細胞（K562−
１及びHT1080）では、α５β１を介した80KDaの含RGD領
域への接着が支配的である（図6,K562−１細胞を参
照）。このことはレセプター発現の制御によって細胞が
フィブロネクチンの種々の部位を認識し、これに接着す
る能力が決定されることを意味する。さらに、フィブロ
ネクチンに対応する２つのレセプターを同時発現させる
ことにより、細胞の結合親和力を増大させることがで
き、例えば、Jurkat及びRD細胞はα４β１だけを発現さ
せるYT細胞よりも無差別にフィブロネクチンに接着す
る。

フィブロネクチンへの細胞接着制御はα５β１及びα
４β１が互いに独立に機能し、フィブロネクチンの２つ
の結合部位との相互作用中にオーバラップしないという
最も単純な状態においても複雑になり易い。この単純な
状態からのバリエーションによって細胞接着の極めて敏
感な制御を行う可能性がある。最も単純なレベルでこの
制御はｉ）リガンドの結合部位の合成及び／または露出
の制御とii）レセプターの機能的発現の制御に大別され
る。種々のレベルで制御例は既に公知であり、例えば、
リンフォカイン及び特定抗原がＴリンパ球におけるα５
β１発現を誘発するとフィブロネクチンへの細胞接着が
増大するという所見がある（Wayner等,1988,同上）。傷
の癒合または炎症の過程でフィブロネクチンIII CS領域
におけるmRNAスプライシングを制御することによって、
静止または活性Ｔ細胞におけるレセプター／リガンド結
合の特異性を決定することができる（Kornblihtt等,198
5,同上）。単純な状態からのバリエーションは興味深い
が多様なメカニズムを究明するだけでもさらに実験を重
ねる必要がある。

結論として、培養Ｔリンパ球がフィブロネクチンへの
接着時に２つの独立レセプターを使用することと、ｉ）
α５β１が含RGD細胞接着領域に対応するレセプターで
あり、ii）α４β１がヘパリンII及びIII CS領域を含む
カルボキシ末端細胞接着領域に対応するレセプターであ
ることは上記知見から明白である。さらにまた、これら
のデータはＴリンパ球がフィブロネクチンプレmRNAのオ
ルターナティブ・スプラインによって形成されるIII 3C
S（CS−１）における分子異質性領域を優先選択するこ
とと、α４β１がこの接着部位に対応するレセプターで
あることを示唆する。

7.［実施例］ 活性化血管内皮細胞へのリンパ球接着はフィブロネクチ
ンのオルターナティブ・スプライシングされたIII CS領
域におけるインテグリン・レセプターα４β１とCS−１
の結合によって仲介される 以下にの述べる実験により、炎症応答に関連する種々
の細胞分裂、例えばIL−１、腫瘍壊死因子α（TNF
α）、腫瘍壊死因子β（TNFβ）で活性化された培養大
脈管皮内細胞へのＴ細胞接着を仲介するα４β１レセプ
ター及びそのリガンドCS−１の役割を明らかにした。さ
らに、α４β１を介してリンパ球が皮内細胞に接着する
のを阻止するモノクローン抗体及びペプチドの能力をも
明らかにした。

7.1. 材料及び方法 7.1.1. 試薬 使用した試薬は6.1.1節に記載した通りであった。

7.1.2 細胞及び細胞培養 Jurkat（ヒトＴ細胞白血病）はDr.Paul Conlon（Immu
nex.Corp.,ワシントン州シアトル）から、Ramos（ヒト
Ｂ細胞白血病）はAmerican Type Culture Collection
（メリーランド州ロックビル）からそれぞれ入手した。
LAD（白血病接着欠乏）及びST−1B細胞はヒトＢリンパ
球のEBウイルス変換によって調製した。LAD細胞系はβ
２インテグリン系接着レセプター欠乏患者のＢ細胞から
発生させたものであり、Dr.John Harlan（Harborview M
edical Center,ワシントン州シアトル）から入手した。
ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEs）はCell System,ワシント
ン州シアトルから購入した。HUVEsは同じくCell System
から購入した規定の（無血清）メディア（CS−100メデ
ィア）中に維持した。

7.1.3. 炎症性細胞分裂によるHUVESの活性化 IL−１β（1ng/ml）またはいくつかの実験ではTNFα
（10ng/ml）と共にHUVEsを６−24時間に亘り保温した。
この保温が終った時点でHUVE単層を洗浄し、接着試験に
使用した。

7.1.4. CSペプチドの合成 血漿フィブロネクチンCS−１領域から誘導されるペプ
チドはOncogen Corp.,ワシントン州シアトルにおいてD
r.James Blakeが標準プロトコルに従って合成し、HPLC
精製した。CS−ペプチドは同じくDr.James Blakeが標準
プロトコルに従ってラビット血清アルブミンまたはKLH
に配合された。RGDS対照ペプチドはPeninsula Laborato
ries（カリフォルニア州ベルモント）から入手した。

7.1.5. モノクローン抗体 下記の抗体は発明者等のラボラトリーにおいて開発さ
れた：α２β１レセプターを認識するP1H5（Wayner等,1
987,J.Cell Biol.,105:1873−11884;Wayner等,1988,J.C
ell Biol.,107:1881−1891）；α３β１レセプターを認
識するP1B5（同上）;Pytela等が報告したα５β１基本
型フィブロネクチン・レセプターを認識するP1D6（Cel
l,40:191−198）；β１サブユニットを認識するP4C10;
及びβ２（CD18）を認識するP4H9。これらは参考のため
本願明細書中に引用し、表IIにも掲げたWayner等の方法
を使用して開発した（Wayner等,1987,J.Cell Biol.,10
5:1873−1884;Wayner等,1988,J.Cell.Biol.,107:1881−
1891）。

7.1.6. 血管内皮細胞接着試験 上記方法により、48ウエル・プレートでヒト臍静脈内
皮細胞（HUVEs）を培養した。HUVE単層カルチュアへの
リンパ球接着を測定するため、リンパ球にNa₂ ⁵¹CrO₄（5
0μCi/ml）を２−４時間に亘って標識付けしたのち、洗
浄し、次いで抑止性抗体またはCS−１誘導ペプチドの存
在において、または不在の条件下で10⁵リンパ球をHUVE
単層と共に保温した。37℃で30分間に亘りリンパ球を接
着させた。非接着細胞をPBS洗浄によって除去し、接着
細胞をSDS/NaOHに溶解させた。結合⁵¹Crcpmをガンマカ
ウンターで測定した。いくつかの実験では、接着試験に
先立ち、規定のCS−100メディア（Cell System,ワシン
トン州シアトル）中でIL−１β（1ng/ml）またはTNF−
β（10ng/ml）と共に６−24時間に亘り保温することに
よって内皮細胞を活性化した。

7.2. 結果 7.2.1. 健常者及びLAD患者リンパ球の表面表現型 遊出の過程でリンパ球がいかなるメカニズムを用いる
かを知るため、発明者等は先ずインテグリン・レセプタ
ーに対する健常及びLADリンパ球の表面表現型を観察し
た。このデータは表VIIに示した通りであり、LAD細胞が
含β１インテグリンに対して正常な細胞表面表現型を有
することを示唆している。予期した通り、LAD患者から
のＢ細胞はβ２についてネガティブであったから、LAD
リンパ球が内皮細胞に接着し、かつこれを通過する過程
で含β１インテグリンを使用することは明白である。

7.2.2. リンパ球が静止及び活性化内皮細胞に接着する
能力 各種細胞系からのCr−標識リンパ球を静止または活性
化内皮細胞に接着する能力に関してテストした（表VI
I）。テストした細胞系はいずれもある程度静止内皮細
胞に接着するが、IL−１またはTNFによって活性化した
内皮細胞へのＴ及びＢリンパ球接着は10倍も顕著である
ことが判明した。内皮細胞へのLAD患者リンパ球の接着
は健常なＢ細胞からのST−１細胞系と大差がなかった。
IL−１活性化内皮細胞とTNF活性化内皮細胞への接着に
ついては細胞系間に差は見られなかった。

7.2.3. 内皮細胞へのリンパ球接着に対する抗レセプタ
ー抗体の作用 ハイブリドーマ上澄みの存在において内皮細胞へのCr
−標識リンパ球接着をテストしたところ、α４β１また
はβ１ターゲットとするモノクローン抗体だけが接着を
抑止し、基本型フィブロネクチン・レセプターやα３β
１レセプターなどのような他のレセプターをターゲット
とするモノクローン抗体はほとんど抑止効作を示さなか
った（表VIII）。（α４β１をターゲットとする）モノ
クローン抗体P4C2及び（β１をターゲットとする）モノ
クローン抗体P4C10の存在において内皮細胞へのCr−標
識リンパ球接着は完全に抑止された。興味深いことに、
LAD細胞の接着も抗−α４β１抗体（P4C2）によって抑
止され、CD18レセプターが接着性に関与していないこと
を示唆した。また、α２β1,α５β１（表VIII）及び
（表には示されていない）β２がリンパ球によって発現
させられたが、これらのレセプターに対する抗体は静止
型または活性化HUVEsへのリンパ球接着を抑止しなかっ
た（表IX参照）。これらのデータはインテグリン・レセ
プターの表面発現及びこのレセプターと抑止性抗体の結
合が必ずしも内皮細胞へのリンパ球接着の抑止とはなら
ないことを示唆するものである。これは遊出の初期段階
として内皮細胞へのリンパ球接着を仲介するα４β１の
特異な役割を暗示する。また、α４β１に対する抗体が
内皮細胞へのリンパ球接着を抑止したことはα４β１に
対応のリガンドであるアミノ酸鎖EILDVPST（表XII）も
内皮細胞表面に発現するリガンド中に存在するこのアミ
ノ酸鎖へのα４β１結合を介してリンパ球遊出に関与す
る可能性を示唆した。

7.2.4. 内皮細胞へのリンパ球接着における抗α４β１
リガンドとしてのCS−１の役割 活性化内皮細胞へのCr−標識リンパ球の接着を抑止す
る合成CS−１及び誘導ペプチドの能力を各種ペプチドを
使用して測定した。静止または活性化内皮細胞単層への
ＴまたはＢリンパ球接着に対して合成CS−１ペプチドは
強力な抑止作用を示した（表Ｘ及びXI）。興味深いこと
に、EILDVPST鎖は静止または活性化HUVEsへのリンパ球
接着に必要な最小ペプチドであった（表Ｘ及びXI）。Ra
mos細胞系などの場合にはHUVEsへの接着をEILDVPSTペプ
チドによって完全に抑止することができた。対照実験
（表XI）において、基本型フィブロネクチン・レセプタ
ーα５β１に対抗するリガンドであるRGDS鎖は静止また
は活性化HUVEsへのリンパ球接着を抑止しなかった。

7.3. 検討 （上記第６節にのべた）実験所見は血漿フィブロネク
チン中の対Ｔリンパ球高親和力結合部位がIII CS領域の
CS−１部位にあることを強く示唆した。CS−１部分は25
個のアミノ酸から成る（図IX）。従って、リンパ球α４
β１レセプターとフィブロネクチンの結合に関与する最
小ペプチド鎖を突き止めねばならなかった。最初のステ
ップとして、発明者等はCS−１ペプチドを２つの小さい
ペプチドA13及びB12に分割し（図IX）、そのいずれかが
α４β１レセプターとの結合に関してフィブロネクチン
と競合してフィブロネクチンへのリンパ球接着を抑止す
るかどうかを検査した。検査データによれば、抑止作用
がCS−１のカルボキシ末端部分から誘導されるB12ペプ
チドにあることが明らかになった。次のステップとし
て、発明者等はフィブロネクチン及びCS−１（RSA配
合）被覆表面へのリンパ球接着に対するB12のカルボキ
シ末端部位からの誘導ペプチドの抑止能力を鎖が短い方
から順次測定した。測定データによれば、血漿フィブロ
ネクチン及びCS−１へのリンパ球接着に関して、α４β
１の結合に必要な最小アミノ酸鎖はEILDVPSTである。

白血球接着欠乏（LAD）患者からの多形核白血球（好
中球）はβ２インテグリン・サブユニットの発現が不足
であり、従って、血管内皮細胞への接着に際して含β２
レセプター（LFA−1,Mac−１またはp150/95）を使用で
きない。従って、これらの患者からの好中球は周辺組織
への血流を妨げる。ただし、LADリンパ球は遊出によっ
て内皮細胞を通過し、この疾病を有する患者から得られ
る組織中に見出される。従って、このことはリンパ球が
血流から周辺組織へ移る際に含β２インテグリンとは別
のメカニズムを利用することを暗示する。以下に述べる
一連の実験は遊出の過程で末梢血液リンパ球が利用する
メカニズムを解明するために発明者等が試みたものであ
る。

この実験で、血管内皮細胞へのリンパ球接着における
α４β１レセプターの重要な役割が明らかになった。

テストされたリンパ球細胞系はいずれも蛍光分析の結
果によればα４β１及び／またはα５β１を発現させ、
培養されたヒト臍静脈内皮細胞に接着するのが観察され
た。この接着はα４β１をターゲットとするモノクロー
ン抗体によってのみ抑止され、その他のレセプターをタ
ーゲットとする抗体はほとんど抑止作用を持たず、リン
パ球と内皮細胞の接着相互作用におけるα４β１レセプ
ターの重要性が明らかになった。

さらにまた、合成CS−１及び誘導ペプチド（表IX,X及
びXI）は内皮細胞へのリンパ球接着を抑止した。アミノ
酸鎖EILDVPSTは相互作用にとって特に重要であることが
判明した。なお、リンパ球α４β１が内皮細胞表面のフ
ィブロネクチンと実際に相互作用するかどうかを判断で
きなかったことを強調しなければならない。α４β１が
他の非フィブロネクチン蛋白との関連においてペプチド
EILDVPSTまたは同様の鎖を認識するということも考えら
れる。

8.細胞系の寄託 下記の細胞系をATCC、メリーランド州ロックビルに寄
託し、下記受入れ番号を与えられた： 細胞系 受入れ番号 P4C2 HB−10215 P4G9 HB−10213 P3E3 HB−10212 P4C10 HB−10214 本発明は以上に例示した遺伝子及び蛋白または寄託さ
れた微生物によってその範囲を制限されるものではな
く、これらは説明の便宜上記述したに過ぎない。以上の
説明及び添付図面から多様な変更実施態様を創出できる
ことは当業者にとって明白であろう。このような変更は
後記する請求の範囲に包含されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (56)参考文献 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．138（５）, 1987年，ｐ．1510−1514 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．140（５）, 1988年，ｐ．1401−1407 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．134（６）, 1985年，ｐ．3762−3769 ＥＭＢＯ Ｊ．134（６），1989年５ 月，ｐ．1361−1368 Ｃｅｌｌ 56（１），1989年１月, ｐ．37−46 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 16/28 C12P 21/08 A61K 39/395 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (18)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】α４β１と結合し且つ血管内皮細胞へのリ
   ンパ球接着を抑止することができる抗体、又はこの抗体
   のα４β１と結合し且つ血管内皮細胞へのリンパ球接着
   を抑止することができる断片を含んで成る、血管内皮細
   胞への核化造血細胞の接着を介しての免疫系の慢性又は
   再発性活性化に伴う疾患の治療用医薬組成物。
2. 【請求項２】前記抗体がモノクローン抗体であることを
   特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
3. 【請求項３】前記モノクローナル抗体がATCC（American
   Type Culture Collection）に寄託された、受入れ番号
   がHB−10215のP4C2であることを特徴とする請求項２記
   載の医薬組成物。
4. 【請求項４】前記モノクローナル抗体がATCCに寄託され
   た、受入れ番号がHB−10214のP4C10であることを特徴と
   する請求項２記載の医薬組成物。
5. 【請求項５】前記断片がFab、Fab′、Ｆ（ab′）_２又は
   Fvである、請求項１に記載の医薬組成物。
6. 【請求項６】血管内皮細胞への核化造血細胞の接着を抑
   止するための医薬組成物であって、α４β１レセプター
   と結合し、且つ血管内皮細胞への核化造血細胞上の細胞
   外マトリックスレセプターの接着を抑止する抗体を含ん
   で成る医薬組成物。
7. 【請求項７】前記抗体がモノクローン抗体である請求項
   ６に記載の医薬組成物。
8. 【請求項８】前記モノクローナル抗体がα４β１のα４
   サブユニットに結合する、請求項６に記載の医薬組成
   物。
9. 【請求項９】前記抗体がATCCに寄託された、受入れ番号
   がHB−10215の、ハイブリドーマによって得られたP4C2
   である、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
10. 【請求項１０】前記抗体がα４β１のβ１サブユニット
    に結合する、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
11. 【請求項１１】前記抗体がATCCに寄託された、受入れ番
    号がHB−10214の、ハイブリドーマによって得られたP4C
    10である、請求項10に記載の医薬組成物。
12. 【請求項１２】請求項６〜11に記載の抗体の断片であっ
    て、血管内皮細胞への核化造血細胞上の細胞外マトリッ
    クスレセプターの接着を抑止する断片を含んで成る、血
    管内皮細胞への核化造血細胞の接着を抑止するための医
    薬組成物。
13. 【請求項１３】血管内皮細胞への核化造血細胞の接着を
    抑止するための医薬組成物であって、血管内皮細胞への
    核化造血細胞の接着を抑止するフィブロネクチンのIIIC
    S領域の部分を含んで成るペプチドの有効濃度を、医薬
    として適当なキャリヤー中に含んで成る医薬組成物。
14. 【請求項１４】前記ペプチドが、血管内皮細胞への核化
    造血細胞の接着を抑止するフィブロネクチンのCS−１領
    域の少なくとも部分を含んで成る、請求項13に記載の医
    薬組成物。
15. 【請求項１５】前記ペプチドがα４β１に結合する、請
    求項13又は14に記載の医薬組成物。
16. 【請求項１６】前記ペプチドが、ペプチドGlu Ile Leu
    Asp Val Pro Ser Thrを含有するフィブロネクチンのIII
    CS領域の少なくとも部分を含んで成る、請求項13〜15の
    いずれか１項に記載の医薬組成物。
17. 【請求項１７】前記ペプチドが、アミノ酸残基配列Glu
    Ile Leu Asp Val Pro Ser Thrである、請求項13〜16の
    いずれか１項に記載の医薬組成物。
18. 【請求項１８】皮下投与、筋内投与、血管内投与、静脈
    内投与、動脈内投与、鼻内投与、経口投与、腹腔内投
    与、気管内投与又は莢膜内投与のために製剤されてい
    る、請求項１〜17のいずれか１項に記載の医薬組成物。