DD297562A5

DD297562A5 - Hemmung von lymphozytadhaesion an der gefaessinnenhaut unter verwendung einer neuen extrazellularen matrixrezeptorligandwechselwirkung

Info

Publication number: DD297562A5
Application number: DD90343788A
Authority: DD
Inventors: Elisabeth Wayner
Original assignee: Kk
Priority date: 1989-09-01
Filing date: 1990-09-03
Publication date: 1992-01-16
Also published as: AU6354290A; EP0489837A4; DE122006000044I1; ATE253642T1; KR920703086A; JPH05503070A; DK0489837T4; LU91273I2; FI20050941L; DE69034116D1; KR100188459B1; NL300240I2; ES2210225T5; IL113261A; IE20040028A1; EP0489837A1; FI116793B; GR1001161B; DK0489837T3; NZ235131A

Abstract

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibierung der Adhaesion einer Zelle an eine andere durch Eingreifen in die Wechselwirkung zwischen dem extrazellulaeren Matrixrezeptor und seinem Liganden. Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, dasz der extrazellulaere a4b1-Matrixrezeptor die Adhaesion der Lymphozyten an die Endothelzellen durch Anheftung an eine bestimmte Peptidsequenz foerdert. Beim Stand der Technik vor dieser Erfindung war weder der Ligand des a4b1-Rezeptors identifiziert noch die Funktion des a4b1-Rezeptors bei der Lymphozytenanheftung bekannt. Durch Verhinderung der Wechselwirkung zwischen dem a4b1-Rezeptor und seinen Liganden unter Verwendung von Antikoerpern oder definierten Peptidsequenzen ermoeglicht diese Erfindung erstmals ein spezifisches Eingreifen in die Lymphozytenmigration durch das vaskulaere Endothel und in Gewebe. Diese Erfindung hat deshalb einen besonderen klinischen Nutzen bei der Unterdrueckung der Immunreaktion; in verschiedenen spezifischen Ausfuehrungsformen der Erfindung kann die Haftung der Lymphozyten an das Endothel systematisch inhibiert oder alternativ auf bestimmte Gewebe oder fest umschriebene Bereiche beschraenkt werden. Somit ermoeglicht diese Erfindung eine Behandlung von Krankheiten, die mit einer Autoimmunreaktion einhergehen, sowie anderer chronischer oder wiederkehrender Aktivierungen des Immunsystems, einschlieszlich Allergien, Asthma sowie chronischer Hautentzuendungen.

Description

Hierzu 10 Seiten Zeichnungen

1. Einleitung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibierung der Adhäsion eir.er Zelle an einer anderen. Sie basiert auf der Entdeckung, daß der extrazelluläre a4ß 1-Matrixrezeptor die Adhäsion von Lymphozyten an Endothelzellen durch Anheften an eine bestimmte Peptidsequenz fördert. In besonderen Ausführungsformen dieser Erfindung können monoklonale Antikörper oder Peptide zur Inhibierung der Bindung von Lymphozyten an Endothelzellen benutzt werden, wodurch das Eindringen von Lymphozyten in Gewebe verhindert und die Immunreaktion unterdrückt wird.

2. Hintergrund der Erfindung

2.1. Extrazelluläre Matrixrezeptoren

Spezifische Zelloberflächenrezeptoren (R) für extrazelluläre Matrixkomponenten (ECM) wie Collagen, Fibronectin sowie Laminin sind bereits beschrieben worden (dargestellt von Hynes, 1987, Cell, 48:549-554; Hemler, 1988, Immunol.Today, 9:109). Die Funktion der extrazellulären Matrixrezeptoren (ECMR I, Il und Vl) wurden durch die Affinitätschromatographie (Wayner und Carter, 1987, J.Cell Biol., 105:1873-1884; Staatzii.a., 1989, J.Cell Biol., 198:1917-1924) sowie durch die Bildung monoklonaler Antikörper bestimmt, die spezifisch die Wechselwirkung von Zellen mit gereinigten Liganden inhibierten (Wayner und Carter, 1987, J.Cell Biol., 105:1873-1884) oder ECM (Wayner u.a., 1988, J.Cell Biol.107:1881-1891).

Eine Reihe von ECMR wurden mittels dieser Verfahren identifiziert. Unter Verwendung monoklonaler Antikörper identifizierten Wayner und Carter (1987, J.Cell Biol., 105:1873-1884) zwei Klassen von Zeiloberflächenrezeptoren für natürliches Collagen in menschlichen Fibrosarkomzellen; Klasse I trat bei der Zelladhäsion an Collagen, Fibronectin sowie Laminin auf, während Klasse Il nur boi der Zelladhäsion an natürliches Collagen in Erscheinung trat. Wayner u.a. (1988, J.Cell Biol., 107:1881-1891) identifizierttinmonoklonale Antikörper, die die Adhäsion von Humanzellen an Collagen (P 1H 5), an Fibronectin (P 1F8 oder P1D6) sowie an Collagen und Fibronectin (P 1B5) inhibieren; P1F8 sowie P1D6 reagierten mit einem 140kD-Oberflächenrezeptor, der unter der Bezeichnung ECMR Vl bekannt ist. Nach Angaben von Kunicki u.a. (1988, J. Biol.Chem. 263:4516-4519) inhibierte P1H5 (supra) ebenfalls spezifisch die Adhäsion nichtaktivierter Humanblutplättchen an Collagen der Typen I und III, nicht jedoch an Fibronectin. Aus Hühnerembryo-Fibroblasten wurde unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die die Zelladhäsion an Fibronectin blockieren (Knudsen u.a., 1985, Exp.Cell Res. 157:218-226; Chen u.a., 1985, J.Cell Biol. 100:1103-1114), ein Komplex isoliert, der mindestens drei Glycoproteine umfaßt, während aus Säugetierzellen unter Anwendung der Vitronectin-Affinitätschromatographie (Pytela u.a., 1985, Proc.Natl.Acad.Sei.U.S.A.P2:5766-5770; Pytelau.a., 1986, Science 231:1559-1562) ein Komplex aus zwei Giycoproteinen isoliert wurde. Es wurde festgestellt, daß die Hauptglycoproteine Il b und III a an der Blutplättchenoberfläche als nichtkovalenter 1:1-Komplex in der Plättchenmembran auftreten (Jennings und Phillips, 1982, J.Biol.Chem.257:10458-10463) und als ECMR für Fibrinogen (Bennett u.a., 1983, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2417-2421; Marguerie u. a., 1984, Eur. J. Biochem. 139:5-11), Fibronectin (Gardner und Hynes, 1975, Cell 42:439-448; Plow u. a„ 1985, Blood 66:724-727) Willebrand-Faktor (Ruggeri u.a., 1982, Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A. 79:6038-6041) sowie für Vitronectin (Pytela u. a., 1986, Science 231:1559-1562) dienen.

Die meisten extrazellulären Matrixrezeptoren weisen eine strukturelle Homologie auf. Die ECMR sind Teil der Integrinfamilie der Zeiladhäsionsmoleküle und verfügen über einmalige α-Untereinheiten, die zu einer β 1-lntegrinuntereinheit zusammengefaßt werden (Hynes, 1987, Cell 48:549-554; Wayner und Carter, 1987, J.Cell Biol. 105:1873-1884; Wayner u.a., 1988, J.Cell Biol. 107:1881-1891). Weitere Teile der Integrinrezeptorfamilie umfassen Leukozystenadhäsionsproteine sowie VLA-Antigene. Die Leukozytenadhäsionsproteine umfassen LFA-1, Mac-1 sowie P150/95 und stellen dimere Glycoproteine dar, die aus verschiedenen α-Ketten sowie einer gemeinsamen 95kDa-ß-Kette bestehen (Kishiomoto u.a., 1987, Cell 48:681-690). VLA-Antigene wurden nach ihrem sehr späten Auftreten auf T-Lymphozytenkulturen benannt (Hemler u. a., 1983, J.Immunol. 131:334-340;Hemler u.a., 1984, J.Immunol. 132:3011-3018; Hemler u.a., 1985, Eur.J.lmmunol. 15:502-508). Antiseren zur VLA-ß-Untereinheit blockieren die Zelladhäsion an Fibronectin oder Laminin (Takada u.a., 1987, Nature 326:607-610). Die Wechselbeziehungen zwischen diesen ECMR wurden ermittelt. ECMR Vl ist identisch mit dem Prototyp des Fibronectinrezeptors (Pytela u.a., 1985, Cell, 40:191-198), a5ß 1, Plättchen-Glycoprotein (gp) Ic/lla und VLA5, ECMRIl ist identisch mita2ß1,Plättchen-Glycoprotein la/lla sowie VLA2 (Hemler u.a., 1987, J. Biol. Chem., 262:11478-11485) und ECMRI ist identisch mit a3ß 1 und VLA3 (Kunicki u.a., 1988, J. Biol. Chem., 263:4516-4519; Takada u.a„ 1988, J. Cellular Biochem., 37: 385-393; Wayner u.a., 1988, J. Cell Biol. 107:1881-1891). Monoklonal Antikörper zu α2β1₍α3β1 und a5ß1 (P1H5,P1D6 und P1B 5) inhibieren die Adhäsion von Fibroblasten oder Blutplättchen an Collagen, Fibronectin und lamininbeschichteten Oberflächen (Kunicki u.a., 1988, CeIi Biol. 107:1881-1891; Wayner u. a„ 1988, supra). Tabelle I enthält einige Teile einer Integrinfamilie, die supra beschrieben wurden, und Tabelle Il führt eine Reihe monoklonaler Antikörper an, die verschiedene ECMR erkennen.

Tabelle I	Vorgelegte	Bekannte	Bekannte Funktionen
Die Integrinrezeptor-Familie	Zusammensetzung	Liganden
Rezeptor	O₀ ß,	FN, LM, VN	Zelladhäsion,
	O₃ ßi		Zellmigration,
Hühnerintegrinkomplex			Zellgerüstverbindung
	a₆ß,	FN	Adhäsion an Fibronectin
	a₆ß,	VN	Adhäsion an Vitronectin
Fibronectin-Rezeptor	a_Mß₃	FN, FB, VN, VWF	Blutplättchen-Adhäsion und
Vitronectin-Rezeptor			-Anhäufung
Glycoproteinllb/Illa	a,ß₂	ICAM-1,	Leukozytenadhäsion an Endothel
		ICAM-2
LFA-1	a_mß₂	C3bi	C3b-Rezeptor
			Monozyten-und
MAC-1			Leukozytenadhäsion
	^Qi-eßi	C3bi	Neutrophilenadhäsion
	a,-_eßi	FN, COL, LAM	Zelladhäsion, Migration und
ρ 150/95			Zellgerüstverbindung
VLAs 1-6	a_eß4	UM	Epitheladhäsion
	a_vß₆	VN₁FN	Epithel-Zelladhäsion an VN, FN
Epithel	a₂ß,	C0L,UM	Adhäsion an COL, LM
Epithel	a₃ßi	COL, LM, FN	Adhäsion an COL, LM, FN
ECMRI, II, Vl, V			bisher unbekannt
	a_sß,	FN	Adhäsion an FN

Tabelle II	-Antikörper	Ligand	Bezugnahme
Antl-ECMR	Rezeptor	Collagen	(Wayner u. a., 1987, J. Cell Biol. 105:
Antikörper	ajßi	Laminin	1873-1884; Wayner u. a., 1988,
P1H5			J. Cell Biol. 107:1881-1891)
		Collagen	(Wayneru.a.,1987,J. Cell Biol.
	a₃ßi	Fibronectin	105:1873-1884)
P1B5		Fibronectin
	aißi	(CS-1)
P4C2		Fibronectin	(Wayneru.a.,1988,J. Biol. 105:
	a₆ß,	(Arg-Gly-Asp-Ser)	1873-1884)
P1D6		FN, COL, LAM
Zelle	ßl
P4C10	P₂(Cd 18)
P4119

Die β 1-lntegrine werden in Zellkulturen und in Gewebe unterschiedlich ausgeprägt und zeigen deutliche Unterschiede in der aktivierungsabh ingigen Expression. So ist z. B. die Expression von α 5ß 1 in hämopoetischen Zellen auf Unterpopulationen von Thymocyton sowie peripheren Blutlymphozyten, Monozyten, akute Lymphozyten- oder myelogene Leukämie, aktivierte T-Zellen, wandernde hämopoetische Vorläuferzellen sowie einige Kulturen von T-, B- oder Erythroleukämie-Zellinien beschränkt (Bernardi u.a., 1987, J. Cell Biol., 105:489-498; Cardarelli u.a., 1988, J. Cell Biol., 106:2183-2190; Garcia-^Dardo u.a., 1989, Exp. Cell Res., 181:420-431; Giancotti u.a., 1986, J. Cell Biol., 103:429-437; Liao u. a., 1987, Exp. Cell Res., 171:306-320; Wayner u.a„ 1988, J. Cell Biol., 107:1881-1891).

2.2. Fibronectin

Fibronectin ist ein Protein, das in der extrazellulären Matrix sowie in Plasma und auf der Oberfläche bestimmter Zelltypen zu finden ist (Akiyama und Yamada, 1987, Adv. Enzymol., 59:1-57). Im Plasma tritt Fibronectin als ein Glycoprotein-Heterodimer auf, das aus zwei gleichen Untereinheiten (A- und B-Kette genannt) besteht, deren relative Molekularmasse jeweils etwa 220 kDa beträgt (Akiyama und Yamada, 1987, Adv. Enzymol. 59:1-57; Erickson u.a., 1981, J. Cell Biol., 91: 673-678). Eine Vielzahl spezialisierter intramolekularer Domänen (Ruoslahti u. a., 1981, J. Biol. Chem. 256:7277-7281) des Fibronectinmoleküls können in Fragmente gespalten werden, die ihrerseits in der Lage sind, mit Collagen, Fibrin, Heparin sowie Zelloberflächen in einer dem intakten Molekül analogen Weise in Wechselwirkung zu treten (Hynes und Yamada, 1982, J. Cell Biol., 95:369-377). Zelluläre und Plasma-Fibronectin-Heterodimere umfassen ähnliche, aber nicht identische Polypeptide. Die Variabilität in der Struktur der Fibrcnectin-Untereinheiten ergibt sich aus Variationen in der Primärsequenz der Fibronectin-mRNA aufgrund alternativen Spleißens in mindestens 2 Regionon der Prä-Fibronectin-mRNA (den ED und IIICS-Regionen). Fibronectin ist fähig, die Adhäsion einer Reihe von Zelltypen zu fördern, wie z. B. von Fibroblasten (Qrinell u. a., 1977, Exp. Cell Res. 110:175-210), Makrophagen (Bevilacque u.a., 1981, J. Exp. Med. 153:42-60), polymorphkernigen Leukozyten (Marino u. a., 1985, J. Lab. Clin. Med. 105: 725-730), Blutplättchen (Koteliansky u.a., 1981, Fed. Euro. Biochem. Soc. 123: 59-62) sowie Keratinozyten (Clark u. a., 1985, J. Invest. Dermatol. 84: 378-383), um nur einige zu nennen (Liao u.a., 1989, Exp. Cell Res. 181: 348-361). Eine Wechselwirkung zwischen Fibronectin und einem Zeiloberflächenprotein mit einer relativen Molekularmasse von etwa 14OkDa wurde bei den Fibroblasten (Brown und Juliano, 1985, Science 228:1448-1451; Akiyama u.a., 1986, J. Cell Biol. 102:442-448; Brown und Juliano, 1986, J. Cell Biol. 103:1595-1603; Wylie u. a. 1979, J. Cell Biol. 80:385-402), bei Endothelzellen (Plow u.a., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83: 6002-6006), bei Lymphoidzellen (Brown und Juliano, 1986, J. Cell Biol. 103: 1595-1603; bei Blutplättchen (Pytela u. a„ 1986, Science 228:1559-1562; Gardner und Hynes, 1985, Cell 42:439-448), Muskelzellen (Horowitz u.a., 1985, J. Cell Biol. 101: 2134-2144; Dambsky u.a., 1985, J. Cell. Biol. 100:1528-1539; Chapman,

1984, J. Cell Biochem.259:109-121),sowie Osteosarkomzellen (Pytela u.a., 1985, Cell 40:191-198) beobachtet.

Die Bindung von Fibronectin an Zelloberflächen kann kompetitiv durch Fibronectinfragmente inhibiert werden (Akiyama u.a.,

1985, J. Biol. Chem. 260:13256-13260). Bei Verwendung synthetischer Peptide wurde eine Sequenz, die für die einzige Stelle einer Mindestzellerkennung gehalten wurde, als Tetrapeptid-Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) identifiziert (Pierschbacher und Ruoslahti, 1984, Nature 309: 30-33; Pierschbacher u.a., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:1224-1227; Pierschbacher u.a., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81: 5985-5988; Akiyama u. a„ 1985, J. Cell Biol. 102:442-448). Die in der „Zellbindungs"-Domäne von Fibronectin vorhandene RGDS-Sequenz ist ein Ligand für den Prototyp des Fibronectin-Rezeptors, wie er von Pytela u.a. beschrieben wird (1985, Cell 40:191-198).

Verschiedene Beobachtungen lassen vermuten, daß andere als die RGDS-Regionen in der Fibronectinbindung eine Rolle spielen können (Humphries u. a., 1986, J. Cell Biof. 103: 2637-2647). So war z. B. die Bindungsaffinität synthetischer Peptide bedeutend geringer als die Bindungsaffinität, die bei größeren Fragmenten oder intaktem Fibronectin auftritt (Akiyama u.a., 1985, J. Biol. Chem. 260:10402-10405; Akiyama u.a., 1985, J. Biol. Chem. 260:13256-13260). McCarthy u.a. (1986, J. Cell Biol. 102:179-188) berichteten über eine Bindungsaffinität zwischen einem 33 kDa-Fragment von Plasmafibronectin und B16-F10-Melanomtumorzellen. Bernardi u. a. (1987, J. Cell Biol. 105:489-498) berichtete davon, dsß Lymphoid-Vorläuferzellen an zwei verschiedenen Stellen am Fibronectin anhafteten; die BaF3-Zellinie trat in Wechselwirkung mit der RGD-Bindungsdomäne, während die PD31-Zellinie mit einer anderen Domäne in Wechselwirkung zu treten schien, die sich im Carboxy-Endsegment befand und mit einer Bindungsstelle hoher Affinität für Heparin in Zusammenhang stand.

Humphries u.a. (1986, J. Cell Biol. 103: 2637-2647) verglich die Fähigkeit der Fibronectinfragmente zur Bildung eines adhäsiven Zusammenwirkens mit der von Melanom gegenüber Fibroblastzellen. Fibroblast-BHK-Zellen verbreiteten sich schnell auf einem 75kDa-Fragment, das die RGDS enthaltende Zellbindungsdomäne darstellte, während B 16-F10-Melanomzellen sich nicht auf dem 75 kDa-Fragment auszubreiten schienen, sondern sich auf einem 113 kDa-Fragment ausbreiteten, das aus dem Teil des Fibronectin stammte, der die Typ HI-Verbindungssegment(CS)-Differenzregion oder V-Region enthielt (in der ein alternatives Spleißen der mRNA auftreten kann). In dieser IIICS-Region, die in der Nahe des Fibronectincarboxylendpunktes angeordnet ist,

schien die Arg-Glu-Asp-Val-Sequenz (REDV) funktionell Bedeutung zu haben. Humphries u. a. (1987, J. Biol. Chem. 262: 6886-6892) untersuchte eine Reihe sich überlappender synthetischer Peptide, die die IIICS-Region überspannten. Es wurde festgestellt, daß zwei nichtbenachbarte Peptide, CS1 und CS5, kompotitiv inhibierend auf die Adhäsion von Fibronectin an Melanom, nicht aberden Fibroblastzellen wirkten, wobei CS1 eine stärkere inhibierende Aktivität aufwies als CS5. Liao u.a. (1989, Exp. Cell Res. 181: 348-361) gab an, daß MOPC 315, IgA-sekretierende Lymphoidzellen, zusätzlich zur Bindung an die Zeilbindungsdomäne über die RGD-Wechselwirkung, vorzugsweise über einen RGD-unabhängigen Mechanismus an die Carboxy-terminale Heparinbindungsdomäne binden. Die in den Carboxyendrogionen von Fibronectin vorhandene(n) Adhäsionssequenz(en) sowie der/(die) für die Adhäsion der Zellen an diese Adhäsionssequenzen verantwortliche(n) Zelloberflächenrezeptor(en) wurde(n) jedoch nicht identifiziert.

2.3. Biologische Funktionen der ZelladhSsionsmolekule

Es wurde festgestellt, daß adhäsive Wechselwirkungen im Verlauf vieler wichtiger biologischer Vorgänge stattfinden, einschließlich der Gewebedifferenzierung, des Wachstums und der Entwicklung, und daß sie eine kritische Rolle in der Pathogenese verschiedener Krankheiten zu spielen scheinen (Humphries u.a., 1986, J. Cell Biol. 103: 2637-2647; Grinnell, 1984, J. Cell Biochem. 26:107-116; Hynes, 1986, Sei. Am. 254: 42-51).

So ist bekannt, daß adhäsive Wechselwirkungen z. B. im Immunsystem von großer Bedeutung sind, in welchem die Ortsbestimmung von Immunvermittlerzellen zumindest teilweise wahrscheinlich auf die adhäsive Wechselwirkung zwischen den Zellen zurückzuführen ist. Die Rezirkulation von Lymphoidzellen läuft nicht r, ach dem Zufallsprinzip ab (Male u.a., in „Advanced Immunology", J.B. Lippincatt Co., Philadelphia, S. 14.4-14.5); Lymphozyten zeigen eine Bevorzugung des Typs der Sekundärlymphorgane, in die sie eintreten werden. Beim Durchwandern eines Sekundärlymphorgans müssen die Lymphozyten sich zuerst an die Gefäßinnenhaut in den entsprechenden postkapillären Venolen binden, dann die festen Verbindungen zwischen den Endothelzellen öffnen und endlich in das darunterliegende Gewebe wandern. Die Wanderung rezirkulierender Lymphozyten aus dem Blut in spezifische Lymphgewebe, als „Heimkehr" (homing) bezeichnet, wurde mit komplementären Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche der Lymphozyten und auf den Endothelzellen der hohen Endothelvenolen in Verbindung gebracht.

Gleichermaßen wird die Haftung polymorphkerniger Leukozyten an der Gefäßinnenhaut als Schlüsselereignis bei der Entwicklung akuter Entzündungsreaktionen angesehen und scheint für eine effektive chemotaktische Reaktion sowie für bestimmte Typen von neutrophilübertragenen Gefäßverletzungen erforderlich zu sein (Zimmerman und Mclntyre, 1988, J. Clin. Invest. 81: 531-537; Harlan u.a., 1987, in „Leukocyte Emigration and its Sequelae", Movat, ed. S. Karger AG, Basel, S.94-104; Zimmerman u.a., ibid., S. 105-118). Bei Stimulierung durch spezifische Agonistsubstaruen werden die polymorphkernigen Leukozyten (Tonnensen u.a., 1984, J. Clin. Invest. 74:1581-1592), die Endothelzellen (Zimmerman u.a., 1985, J. Clin. Invest. 76: 2235-2246; Bevilacque u. a., J. Clin. Invest. 76: 2203-2011), oder beide (Gamble u. a., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82: 8667-8671) adhäsiv. Im Ergebnis dessen sammeln sich polymorphkernige Leukozyten auf der Endothelzelloberfläche. Zusätzlich haben Studien mit spezifischen Antiglycoprotein-Antikörpern bei Patienten mit Immundefiziten gezeigt, daß für eine effektive neutrophile Chemotaxis und andere adhäsionsbezogene Funktionen ein oder mehrere Komponenten des CD 18-Komplexes erforderlich sind (Zimmerman und Maclntyre, 1988, J. Clin. Invest. 81:531-537). Der CD 18-Komplex ist identisch mit der p₂-lntegrinunterfamilie (supra).

Während der Reifung und Differenzierung befinden sich die Lymphozyten-Unterpopulationen an verschiedenen anatomischen Stellen; so sind z. B. unreife T-Zellen im Thymus zu finden. In ähnlicher Weise wurde beobachtet, daß IgA-erzeugende B-Zellen sich in der Darmschleimhaut sammeln (Parrott, 1976, Clin. Gastroenterol. 5: 211-228). Im Gegensatz dazu sammeln sich die IgG-erzeugenden B-Zellen in erster Linie in den Lymphknoten, aus denen IgG in den Körperkreislauf abgeschieden wird (Parrott und deSousa, 1966, Nature212:1316-1317). T-Zellen scheinen in der Hautepidermis in größerer Menge vorhanden zu sein als in der Schleimhautauskleidung (Cahill u.a., 1977, J. Exp. Med. 145:420-428).

Die physiologische Bedeutung der Leukozytenadhäsionsproteine (supra) wird durch das Vorhandensein einer humangenetischen Erkrankung unterstrichen, dem Leukozytenadhäsionsmangel (LAD; Anderson u.a., 1985, J. Infect. Dis. 152: 668; Arnaout u.a., 1985, Fed. Proc. 44: 2664). Verschiedene Untersuchungen lassen vermuten, daß der mit LAD einhergehende Molekulardefekt entweder zum Fehlen der Synthese der gewöhnlichen ß-Kette oder zu einer normalen Synthesegeschwindigkeit führt, der eine rapide Zersetzung folgt (Liowska-Grospierre u.a., 1986, Eur. J. Immunol. 16: 205; Diamanche u. a., 1987, Eur. J. Immunol. 17:417).

Bei der schweren Form des LAD werden weder LFA-1, Mac-1 noch ρ 150/95 auf der Leukozytenmembran ausgeprägt; ein niedriges Niveau der Leukozytenmembranexpression wurde bei Patienten beobachtet, die an einer milderen Form dieser Krankheit leiden. Dies führt zu einer fehlerhaften Mobilisierung der polymorphkernigen Leukozyten und Monozyten aus dem Gefäßsystem zu den Abflußöffnungen während der Entzündungsreaktion, mit daraus resultierenden rezidivierenden bakteriellen Infektionen (Anderson u.a., J. Infect. Dis. 152: 668; Arnaout u.a., 1985, Fed. Proc. 44: 2664). Weiterhin wurde beobachtet, daß die ECMR mit Funktionen außerhalb des Immunsystems einhergehen. Ein Verlust des Il b/lll a-Glycoproteinkomplexes an der Plättchenoberfläche scheint zu einer fehlerhaften Plättchenfunktion während der als Glanzmann· Thrombozytenschwäche bekannten genetischen Erkrankung zu führen (Hynes, 1987,Cell 48:549-554). Humphries u.a. (1988, J. Cell Biol., 106:1289-1297) stellte fest, daß die Neuronen des peripheren Nervensystems in der Lage sind, Neurite auf Substrate auszudehnen, die sowohl die zentrale Zellbindungsdomäne als auch die IIICS-Region des Fibronectin aufweisen. Des weiteren haben wir kürzlich nachgewiesen, daß die Neuritenbildung auf Laminin oder Fibronectin durch Antikörper zu den ECMR inhibiert werden kann.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibierung der Adhäsion einer Zelle an einer anderen durch Eingriff in die Wechselwirkung zwischen dem extrazellulären Matrixrezeptor und seinem Liganden.

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß der extrazelluläre o.4ß 1 -Matrixrezeptor die Adhäsion von Lymphozyten an Endothelzellen durch Anheften an eine bestimmte Peptidsequenz fördert. Vor der vorliegenden Erfindung war weder der Ligand

des α4β1-Rezeptors identifiziert noch die Funktion des a4ß1-Rezeptors beim Anheften der Lymphozyten bekannt. Durch das Verhindern einer Wechselwirkung zwischen dem a4ß 1-Rezeptor und seinen Liganden durch Anwendung von Antikörpern oder bestimmten Peptidsequenzen ermöglicht die Erfindung erstmals eine gezielte Intervention bei der Wanderung der Lymphozyten durch die Gefäßinnenhaut ur; J in das Gewebe. Die Erfindung hat deshalb besonderen Wert für die klinische Praxis bei der Unterdrückung der Immunreaktion; in mehreren spezifischen Ausführungsformen der Erfindung kann die Haftung von Lymphozyten am Endothel systematisch inhibiert werden, oder sie können als Alternative bestimmten Geweben oder umschriebenen Bereichen zugeordnet werden. Demnach ermöglicht die Erfindung die Behandlung von Krankheiten, die mit einer Autoimmunreaktion einhergehen, sowie anderer chronischer oder wiederkehrender Aktivierungen des Immunsystems, einschließlich von Allergien, Asthma sowie chronischer Hautentzündungen.

3.1. Abkürzungen

Die hier definierten Peptid-Sequenzen werden wie folgt von Ein-Buchstabensymbolen für Aminosäurereste dargestellt: A (Alanin), R (Arginin), N (Asparagin), D (Asparaginsäure), C (Cystein), Q (Glutamin), E (Glutaminsäure), G (Glycin), H (Histidin),! (Isoleucin),L (Loucin), K (Lysin), M (Methionin),F (Phenylalanin), P (Prolin),S (Serin).T (Threonin),W (Tryptophan), Y (Tyrosin), V (Valin).

4. Beschreibung der Figuren

Flg.1. Adhäsion von T-Lymphozyten (MoIt 4), K562-1, RD oder HT1080-Zellen an Plasmafibronectin, Inhibierung mit P1 D6-monoklonalem Antikörper sowie Zeiloberflächenexpression von o.5ß1.

^MCr-markierte Zellen (10⁶ Zellen/ml) wurden für 60 Minuten bei 4°C mit P1 D6-monoklonalen Antikörpern (50Mg/ml) inkubiert und konnten sich dann an fibronectinbeschichteten Plastoberflächen (2(^g/ml) unter Vorhandensein von P1D6 (gefüllte Balken) oder Maus-lgG (offene Balken) 30 Minuten lang (HT1080oder RD) oder 4h (Molt4 oder K 562) bei 37°C anheften. Die Adhäsion an Plasmafibronectin (pFN) wird als ⁵¹Cr cpm, das an die Plastoberflächen gebunden ist, ausgedrückt. Die Zeiloberflächenexpression von αδβ 1 wurde mittels Durchflußzytometrie durch Einfärben der Zellen in Suspension mit P1D6-monoklonalen Antikörpern ermittelt. Die log-P 1D6-Fluoreszenz (gestrichelte Balken) wird als durchschnittliche Kanalzahl (0-255) über dem Hintergrund ausgedrückt.

Flg. 2. Die Immunpräzipitation von Lymphozyten-Fibronectin-Rezeptoren aus HT10890, MoIt 4 oder chronisch aktivierten CD8+ T-(LAK)-Zelldetergensoxtrakten.

'"!-markierte Molt A-, LAK- oder HT 1080-Zellen wurden mit 1%igem Titron X-100 in Gegenwart von Phenylmethylsulfonylfluorid (1 mM), N-Ethylmaleimid (1 mM), Leupeptin (1 pg/ml) sowie Diisopropylfluorphosphat (1 mM) als Proteaseinhibitoren extrahiert. Aliquote dieser Extrakte wurden mittels monoklonaler Antikörper, die auf o.3ß 1 (P 1B 5), o.2ß 1 (P 1H 5) und o.4ß 1 (P3E 3) gerichtet waren, immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten Antigene wurden bei Fehlen von 2-ME auf 7,5%igem SDS-PAGE-GeI separiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die drei durch P3E3 aus den T-Lymphozyten immunpräzipitierten Banden sind gekennzeichnet (Pfeile).

Fig. 3. Identifikation des lymphozytenspezifischen Fibronectinrezeptors als Integrin a4ß 1. ^t26l-oberflächenmarkierte Jurkatzellen wurden mit 0,3%igem CHAPS bei Vorhandensein von 1 mM CaCI₂,1 mM Diisopropylfluorphosphat, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM N-Ethylmaleimid, 1 Mg/ml Leupetin sowie 2μς/ηηΙ Sojabohnen-Trypsininhibitor extrahiert. Aliquoten dieser Extrakte wurden dann mittels Myelom(SP2)-Kulturüberstand oder mittels monoklonaler Antikörper P3E3, P4C2, P4G9 oder mittels P1D6(anti-a5ß1) immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden auf 8%igem SDS-PAGE-GeI bei Fehlen von Reduktionsmittel separiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite dargestellt. Die α5-und β 1-Untereinheiten sind genauso angegeben wie die in den Immunpräzipitaten enthaltenen Banden, die mit P3E3, P4C2 und P4G 9 (Pfeile) hergestellt wurden.

Fig. 4. Lokalisierung von a4ß1 unda5ß1 in Adhäsionsherden auf fibronectinbeschichteten Oberflächen. RD-Zellen wurden mit Trypsin versetzt und konnten sich dann an silan- und fibronectinbeschichteten (20μ9/ΓηΙ) Glasabdeckplättchen bei Fehlen des Serums etwa 1 Stunde lang bei 37°C absetzen. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die Zellen für die Lokalisierung der Rezeptoren in Adhäsionsherden wie beschrieben vorbereitet (Versuchsablauf). Die Tafeln A und C zeigen Adhäsionsherde (Pfeile), die durch Interferenzreflexionsmikroskopie sichtbar gemacht wurden, als die RD Zellen am Fibronectin anhafteten. Tafel B zeigt die Reorganisation des RGD-Prototyp-Fibronectinrezeptors αδβ 1, der mit Antikörper AB33 für die Adhäsionsherde gefärbt wurde (Pfeile). Tafel D zeigt die Reorganisation von mit P4G 9 (FITC) gefärbtem ci4ß 1 ebenfalls für die Adhäsionsherde, nachdem die RD-Zellen an das Fibronectin anhafteten (Pfeile). Die Tafeln A und B sowie die Tafeln C und D stellen dasselbe Feld dar.

Flg. 5 A. Domänenstruktur von Humanplasma-Fibronectin(pFN), die den Urspi ui der in dieser Studie verwendeten Fragmente aufzeigt.

B. SDS-PAGE-Gelanalyse (10%iges Acrylamid), die die Reinheit der Fragmente nachweist.

Das 80kDa-Fragment weist eine N-terminale Aminosäuresequenz SD()VPSPR()LQF auf und beginnt somit an Position 874 des Fibronectinmoleküls (Kornblihtt u. a., 1985, EMBO J. 4:1755-1759). Dieses Fragment enthält die Zeilbindungsdomäne (Zelle) ur;d die RGDS-Sequenz von Fibronectin C). Die 58kDa- und 38kDa-Fragmente weisen die N-terminale Aminosäuresequenz TAGPDQTEMTIEGLQ auf. Beide Fragmente enthalten die C-terminale Heparinbindungsdomäne (Hep II) und entstehen aus einer anderen Spaltung der zwei Fibronectinketten durch Trypsin. Das 38kDa-Fragment enthält die ersten 67 Aminosäurereste des alternativ gespleißten Verbindungssegments von Fibronectin (HICS) (Garcia-Pardo, 1987, Biochem. J., 241:923-928) und stammt somit von der Α-Kette. Das 38kDa-Fragment enthält keir-d REDV-Adhäsionsstelle, die von B 16-FIO-Melanomzellen erkannt wird (Humphries u. a., 1986, supra; Humphries u. a., 198/, supra). Das 58kDa-Fragmont ist ebenfalls von der B-Kette des

Fibronectin abgeleitet und weist keine IIICS-Rcgion auf (Garcia-Pardo u.a., 1989, EMBOJ., vorgelegt). Das 58kDa-Fragment enthält auch die C-terminale Fibrinbindungsdomäne von Fibronectin (Fib II) und gleicht den vorher beschriebenen Fragmenten aus dieser Region des Plasmafibronectin (Click, E. M., und Balian, G., 1985, Diochem. 24: 6685-6696). Die Banden wurden durch einen Silberstreifen sichtbar gemacht.

Flg. 6. Die Adhäsion von hämatopoetischen Zellen an Plasmafibronectin und gereinigte tryptische 38kDa- sowie 8OkDa-Fragmente von Plasmafibronectin.

⁶¹Cr-markierte K562-(Erythroleukämie), Jurkat- (CD3+ T-Lymphocyten) und YT (CD3· T-Lymphozyten)-Zellen MOVVertiefung) konnten an Plastoberflächen, die mit intaktem Plasmafibronectin (pFN) oder gereinigien tryptischen 8OkDa- und 38kDa-Fragmehten der angegebenen Konzentrationen beschichtet waren, zwei Stunden lang bei 37⁰C anhaften. Nach Ablauf dieser Zeit wurden nichthaftende Zellen abgewaschen und die gebundenen Zellen wurden in SDS/NaOH löslich gemacht und quantifiziert. Die Ergebnisse sind als gebundenes ⁵¹Cr cpm ausgedrückt.

Flg.7. Wirkt, ig der monoklonalen Antikörper P1D6 und P4C2 zu den Integrinrezeptoren a5ß1 und o.4ß1 auf die Adhäsion von T-Lymphozyten an intaktes Plasmafibronectin (pFN) oder die gereinigten tryptischen 8OkDa- und 38kDa-Fragmente. "Cr-markierte MoIt 4-Zellen wurden 1 Stunde lang bei 4°C mit gereinigten monoklonalen Antikörpern P1D6 oder P4C2 (50Mg/ ml) oder gereinigtem Maus-IgG (50pg/ml) inkubiert. Danach konnten sie eine Stunde langen die Plastoberflächen anhaften, die mit intaktem Plasmafibronactin beschichtet waren, oder an tryptische 8OkDa- und 38kDa-Fragmente der angegebenen Konzentrationen. Nach Ablauf dieser Zeit wurden die nichthaftenden Zellen abgewaschen, und die haftenden Zellen wurden löslich gemacht, und das gebundene ⁶¹Cr cpm (Zählung pro Minute) wurde in einem Gammazähler quantifiziert. Die Ergebnisse sind als gebundenes cpm ausgedrückt.

Flg.8. Wirkung der CS-1-B12-Peptide auf dieT-Lymphozytenadhäsion an IL-1 β aktivierte HUVE-Zellen.

(a) Diagramm der IHCS- und CS-1-Regionen.

(b) Aminosäuresequenz von CS-1, A13 und B12.

5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In Versuchen, die zur Untersuchung der Funktionen von α 5ß 1 in Lymphozyten bestimmt waren, wurde beobachtet, daß ruhendes peripheres Blut sowie T-Lymphozytenkulturen (MoIt 4 oder Jurkat) unabhängig vom Prototyp des Fibronectinrezeptors, o.5ß 1 eine Affinität für Fibronectin aufwiesen. Obwohl diese Zellen an fibronectinbeschichteten Oberflächen hafteten, zeigten sie ein geringes oder nicht nachweisbares Niveau an a5ß 1, das vom funktionell definierten monoklonalen Antikörper P1D6 erkannt wurde (Wayner u.a., 1988, J. Cell Biol., 107:1881-1891). Außerdem konnte die Adhäsion von T-Lymphozyten an Fibronectin nur teilweise durch P1D6- oder RGD-enthaltende Peptide inhibiert werden, was eine Beteiligung anderer Rezeptoren für Fibronectin während des Adhäsionsvorgangs vermuten ließ. Andererseits konnte die Adhäsion anderer Zellen an Fibronectin, wie z.B. bösartiger oder transformierter Fibroblasten und aktivierter T-Lymphozyten (LAK-Zellen), durch P1D6 vollständig inhibiert werden. Dies ließ vermuten, daß T-Lymphozyten aus ruhendem peripherem Blut sowie kultivierte T-Zellenleukämie mehrfach unabhängige und funktioneile Fibronectinrezeptoren ausprägen. Erfindungsgemäß wurde durch Herstellung monoklonaler Antikörper, die speziell die Adhäsion von T-Lymphozyten, jedoch nicht die anderer Zellen an Fibronectin inhibierten, ein alternativer Fibronectinrezeptor identifiziert. Dieser Rezeptor war identisch mit dem Integrinrezeptor, a4ß 1, und vermittelte die Haftung peripherer Blutlymphozyten, T-Zellinien-Kulturen sowie von RD-Zellen an Plasmafibronectin. Außerdem prägten die T-Lymphozyten eine klare Präferenz für ein tryptisches 38kDa-Fragment des Plasmafibronectin aus (Garcia-Pardo u. a., 1987, Biochem. J., 241:923-928), das die Heparin-Il-Domäne sowie 67 Aminosäurereste des Typ-Ill-Verbindungssegments (WCS) enthielt, das die Regionen CS-1, CS-2 und CS-3 überspannte, wie sie von Humphries u.a., 1986, J. Cell. Biol., 103:2637-2647; Humphries u.a., 1987, J. Biol. Chem., 262: 6886-6892) beschrieben wurden. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß sich die T-Lymphozyten nur an CS-1 haften, und monoklonal Antikörper zu o.4ß 1 (P3E3, P4C2 P4G9) die Adhäsion der T-Lymphozyten an das 38kDa-Fragment und an CS-1 vollständig inhibieren. Weiterhin wurde festgestellt, daß T-Lymphozyten (mit sehr viel geringerer Affinität) an einer Stelle haften, die in der Heparin-Il-Domäne vorhanden ist, und daß monoklonal Antikörper zu o.4ß 1 diese Wechselwirkung ebenfalls inhibierten. Die funktionell definierten monoklonalen Antikörper zu o.4ß 1 inhibierten nicht die Adhäsion der T-Lymphozyten an ein tryptisches 8OkDa-Fragment von RGD-Sequenz enthaltendem Plasmafibronectin, wähjend die Antikörper zu o.5ß1 (dem Prototyp des Fibronectinrezeptors) diese Wechselwirkung vollständig inhibierten.

Zusätzlich betrifft diese Erfindung die Entdeckung, daß der α4β 1 Rezeptor die Wechselwirkung zwischen Lymphozyten und Endothelzellen vermittelt. Erfindungsgemäß können die Antikörper oder Peptide zur Blockierung der Adhäsion von Lymphozyten an Endothelzellen benutzt werden.

Zum Zwecke der Übersichtlichkeit der Offenbarung der Erfindung und nicht zu ihrer Einschränkung wird diese Erfindung in den folgenden Unterabschnitten beschrieben

I) Herstellung von Antikörpern zu extrazellulären Matrixrezeptoren (ECMR);

II) Charakterisierung der Wechselwirkung ECMR-Ligand;

III) Methoden des Eingreifens in die Zelladhäsion;

IV) Nutze« der Erfindung und

V) Peptide und Antikörper der Erfindung.

5.1. Hurstellung von Antikörpern zu extrazellulären Matrixrezeptoren

Die Herstellung von Antikörpern zu extrazellulären Matrixrezeptoren kann mittels jedes nach dem heutigen Stand der Technikzur Herstellung von Antikörpern bekannten Verfahrens erfolgen. Intakte Zellen oder der gereinigte extrazelluläre Matrixrezeptor (ECMR) können als Immunogene benutzt werden. Die Immunisierung eines Wirts wird vorzugsweise unter Verwendung eines Immunogens durchgeführt, das aus einer xenogenen Quelle gewonnen wurde. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein.

Verschiedene im Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Herstellung polyklonaler Antikörper zu Epitopen eines bestimmten ECMR angewandt werden. Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion eines ECMR-Proteins oder eines synthatischen Proteins oder eines Fragments davon immunisiert werden, oder anderenfalls können intakte Zellen benutzt werden. Verschiedene Adjuvanzien können je nach Wirtsspezies zur Verstärkung der immunologischen Reaktion verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Freundsches Adjuvans (komplett oder nicht komplett), Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenak'ive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole Limpet Hämocyanine, Dinitrophenol und potentiell nützliche Humanadjuvanzien wie BSG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.

Ein monoklonaler Antikörper zu einem Epitop eines ECMR kann unter Anwendung jedes beliebigen Verfahrens hergestellt werden, das die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kulturen ermöglicht. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die Hybridomtechnik, die erstmals durch Kohler und Milstein (1975, Nature 256:495-497) sowie Taggart und Samloff (1983, Science 219:1228-1230) beschrieben wurde, sowie die modernere Human-B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor u.a., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik (CoIe u.a., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc., S. 77-96).

Die monoklonalen Antikörper für therapeutische Zwecke können entweder menschliche monoklonale Antikörper sein oder chimäre Mensch-Maus (oder die anderer Spezies) monoklonale Antikörper. Die menschlichen monoklonalen Antikörper können durch ein beliebiges der vielfältigen bekannten Verfahren hergestellt werden (z. B. Teng u. a., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor u.a., 1983, Immunology Today 4: 72-79; Olsson u.a., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Chimäre Antikörpermoleküle können so gewonnen werden, daß sie eine Maus-Antigenbindungsdomäne mit konstanten menschlichen Regionen enthalten (Morrison u.a., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81: 6851, Takeda u.a., 1985, Nature 314:452). Ein Molekularklon eines Antikörpers zu einem ECMR-Epitop kann mittels der bekannten Verfahren hergestellt werden. Für den Bau von Nucleinsäuresequenzen, die für ein monoklonales Antikörpermolekül oder die entsprechende Antigenbindungsregion kodieren, kann die Technik der In-vitro-DNA-Rekombination angewandt werden (vgl. z. B. Maniatis u.a., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Die Antikörpermoleküle können mittels der bekannten Verfahren gereinigt werden, z.B. durch Immunabsorption oder Immunaffinitätschromatographie, durch chromatographische Methoden wie HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie), oder durch eine Kombination dieser Verfahren.

Antikörperfragmente, die das Erbgut des Moleküls enthalten, können durch die bekannten Verfahren gewonnen werden. Solcho Fragmente schließen z.B. ein, sind aber nicht beschränkt auf: das F(ab')2-Fragment, das durch Pepsinverdauung des Antikörpermoleküls erzeugt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch Reduzierung der Disulfid-Bindungen des F(ab')₂-Fragments entstehen können, und die 2 Fab- oder Fab-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel gewonnen werden können.

In gleicherweise können Antikörper, die mit nach den vorstehend beschriebenen Verfahren gewonnenem ECMR reaktionsfähig sind, mittels jedes bekannten Verfahrens identifiziert und selektioniert werden. So können z. B. Antikörper an einen bekannten ECMR binden und/oder immunpräzipitieren, der gereinigt oder anderweitig von anderen Proteinen getrennt wurde, wie das in einem Polyacrylamidgel der Fall ist. Andererseits können Antikörper zu ECMR durch ihre Fähigkeit, mit vorher bereits bekannten ECMR-Antikörpern für die Bindung an ECMR in Wettbewerb zu treten, identifiziert werden. Antikörper, die an ECMR binden, können auch durch ihre Fähigkeit, die ECMR-Ligand-Wechselwirkung zu blockieren, identifiziert werden. So kann z. B. (ohne Beschränkung darauf) nachgewiesen werden, daß Zellen, welche einen ECMR-Rezeptor tragen, der an Fibronectin bindet (das selbst nicht identifiziert oder näher beschrieben sein muß, sondern nur funktionell definiert ist), an einem Substrat haften, das mit Fibronectin beschichtet ist. Wenn für einen Antiserum- oder Hybridomüberstand die Inhibierung der Zellhaftung an das Substrat nachgewiesen werden kann, können die in dem Ant'serum oder Überstand enthaltenen Antikörper den ECMR-Rezoptor erkennen.

Erfindungsgemäß können die den a4ß1 -Rezeptor erkennenden Antikörper nach den unter supra dargelegten Verfahren gewonnen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können auf a4ß 1 gerichtete monoklonale Antikörper wie folgt gewonnen werden: aus RBF/DN-Mäusen gezüchtete Mäuse können mit etwa 100μΙ T-Lymphozytenkonzentrat immunisiert werden; danach können ihre Milzen entfernt und mit Myelomzellen fusioniert werden, wie z. B. NS-1/FOX-NY-Myelomzellen, wie von Oi und Herzenberg (1980, in „Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell und Shiigi, eds, Freeman und Co., San Francisco, S. 351-373) sowie von Taggart und Samloff (1983, Science 219:1228-1230) beschrieben wurde. Lebensfähige Heterokaryone können in mit Adenin/Aminopterin/Thymidin supplementierten RPM1 1640 Medien selektioniert werden. Hybridome, die Antikörper gegen Lymphozyten-ECMR erzeugen, können durch Adhäsion an fibronectinbeschichtete Oberflächen gescreent und durch limitierende Verdünnung geklont werden. Insbesondere können auf a4ß1 gerichtete Antikörper z. B. durch ihre Fähigkeit, die Haftung von Lymphozyten an mit CS-1 -Peptid oder seinen Derivaten beschichtetes Substrat oder an Endothelzellen zu blockieren, identifiziert werden. Antikörper, die a4ß 1 erkennen, inhibieren jedoch nicht die Bindung von a5ß 1 -Rezeptor-Zellen an mit RGD-Peptid beschichtetem Substrat. Andererseits können auf a4ß 1 gerichtete Antikörper durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, I) die Bindung von bekannten Anti-a4ß1-Antikörpern kompetitivzu inhibieren (wie z. B. P4C 2 oder P4C10), oder II) eine Bindung an dasselbe Protein wie bekannte Anti-a4ß 1-Antikörper einzugehen (z. B. in einem Proteingel, einem Western-Blot oder in sequentiellen Immunpräzipitationsexperimenten).

5.2. Beschreibung der Wechselwirkung ECMR/Llgand

Die Wechselwirkung zwischen den extrazellulären Membranrezeptoren kann z. B. durch, jedoch nicht beschränkt auf, folgende Methoden beschrieben werden:

I) Bestimmung der Rezeptorverteilung und -funktion; II) Eingriff in die Rezeptor-Ligand-Bindung; III) Isolierung und chemische Charakterisierung des Rezeptors und/oder Liganden.

Diese Methoden werden in den folgenden drei Abschnitten näher erläutert.

5.2.1. Bestimmung der Rezeptorenverteilung und -funktion

Erfindungsgemäß kann die Rezeptorenverteilung mittels jedes bekannten Verfahrens bestimmt werden. So kennen ECMR-tragende Zellpopulationen z.B. durch, jedoch nicht beschränkt auf, monoklonal, auf den betreffen· an ECMR gerichtete Antikörper identifiziert werden. Die Bindung des Antikörpers an den ECMR kann unter Anwendung immunohistochemischer Verfahren, wie z. B. Immunfluoreszenz und Immunperoxidasefärbung, ermittelt werden. Andererseits können die den betreffenden ECMR tragenden Zellpopulationen unter Anwendung fluoreszenzaktivierter Zellsortierverfahren gesammelt werden.

Da eine spezifische Reorganisation der Zelloberfläch6iiadhäsionsrezeptoren an Adhäsionsherde vonstatten zu gehen scheint, wenn die Zellen auf den entsprechenden Liganden gewachsen sind (Burridge u.a., 1988, Ann. Rev. Cell Biol. 4:487-525), beinhaltet eine Methode zur Charakterisierung der funktioneilen Wechselwirkung zwischen einem bestimmten Rezeptor und einem potentiellen Liganden die Bestimmung dessen, ob der in Frage kommende ECMR sich in dem zwischen der Zelle und dem Ligandsubstrat gebildeten Adhäsionsherd ausbreitet. So kann z. B., jedoch nicht nur darauf beschränkt, durch folgende Methode nachgewiesen werden, daß a4ß 1 über eine Ligand/Rezeptor-Beziehung mit Fibronectin in Wechselwirkung tritt (siehe auch Abschnitt 6.2.3., infra). Man läßt Lymphozyten an ein Fibronectinsubstrat anhaften, und die Adhäsionsherde zwischen Zellen und Substrat können durch Interferenzreflexionsmikroskopie sichtbar gemacht werden (Izzard u.a., 1976, J. Cell Sei. 21:129-159). Die o.4ß 1 erkennenden Antikörper, wie z. B. P4G 9 oder P4C10, können unter Anwendung standardisierter immunohistochemischer Verfahren, wie z. B. von Fluor-Isothiocyanat, für den Nachweis dessen benutzt werden, daß sich bei NichtVorhandensein von Serum a4ß 1 erneut in die Adhäsionsherdo ausbreitet.

Die Wechselwirkung zwischen ECMR und Ligand kann auch durch Testen der Fähigkeit des ECMR zur Haftung an eine Reihe von Substraten beschrieben werden. So kann zum Beispiel ein interessierender Zelltyp oder ein interessierender ECMR auf die Fähigkeit hin untersucht werden, an Substrate binden zu können, die aus gereinigten Bestandteilen der extrazellulären Matrix, wie Fibronectin, Collagen, Vitronectin oder Laminin bestehen. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann nachgewiesen werden, daß a4ß 1 tragende Zellen sich an Fibronectin heften, nicht jedoch an Collagen- oder Lamininsubstrate, und zwar aufgrund der Wechselwirkung a4ß 1 /Fibronectin.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, in der nachgewiesen wird, daß sich der in Frage kommende ECMR an einen bestimmten Proteinliganden bindet, können Unterfragmente des Protein tragenden Substrats auf die Fähigkeit hin getestet werden, eine Bindung an einen ECMR auf der Zelloberfläche einzugehen, was eine Lokalisierung des Bindungsortes zwischen ECMR und Ligand ermöglicht.

In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung, in der der Rezeptor a4ß1 ist, von dem festgestellt wurde, daß er an Fibronectin bindet (supra), können Substrate, die Unterfragmente von Fibronectin tragen, auf ihre Fähigkeit hin untersucht werden, die a4ß 1 tragenden Zellen zu binden, wie in Abschnitt 6, Infra, dargestellt. Obwohl sich T-Lymphozyten an die 8OkDa-Zellbindungsdomäne des den a4ß 1 -Rezeptor (Fig.5A) tragenden Fibronectin hefteten, zeigten sitt eine deutliche Präferenz für die nicht RGD-enthaltende Region, die sich auf einem tryptischen 38kDa-Fragment befand, das von der Α-Kette (oder schweren Kette) des Plasmafibronectin abgeleitet war. Die T-Lymphozyten erkannten auch ein anderes Hep ll-enthaltendes 58kDa-Fragment und banden sich daran. Die Hochaffinitäts-Lymphozytenbindungsstelle befand sich jedoch auf dem 38kDa-Fragment. Auf molarer Grundlage erwies sich das 38kDa-Fragment bei der Vermittlung der T-Lymphozytenadhäsion dreimal effektiver als das58kDa-Fragment.

Wie in Fig. 5A dargestellt, wurden die 38kDa- und 58kDa-Fragmente jeweils von den A- und B-Ketten des Plasmafibronectin abgeleitet. Sie unterscheiden sich deshalb je nach Vorhandensein oder NichtVorhandensein von HICS (Kornblihtt u.a., 1985, supra; Garcia-Partio, 1987, supra). Damit ist es möglich, daß die hier verwendeten 38kDa- und 58kDa-Fragmonte eine gemeinsame T-Lymphozytenbindungsstelle mit geringer Affinität aufweisen, die sich in der Hep Il-Domäne befindet, und daß zusätzlich T-Lymphozytenadhäsionsste!!en von hoher Affinität in der nur bei 38kDa-Fragment vorhandenen IIICS-Region auftreten. T-Lymphozyten scheinen spezifisch CS-1 zu erkennen und daran zu binden, das als Hochaffinitäts-Adhäsionsstelle für B16-Melanomzellen sowie Vogel-Neuralleistenzellen bestimmt wurde (Humphries u.a., 1987, supra; Humphries u.a., 1988, J. Cell Biol., 106:1289-1297; Dufour u. a., 1988, EMBO J., 7:2661-2671). CS-1 stellt eine Region der molekularen Heterogenität dar (entstanden durch alternatives Spleißen), die in der Typ-lll-CS-Domäne auf der Α-Kette von Plasmafibronectin vorhanden ist.

5.2.2. Eingriff in die Rezeptor-Ligand-Bindung

Die ECMR-Ligand-Beziehung kann weiterhin durch die Bestimmung und Bewertung der Agenzien beschrieben werden, die in die Rezeptor-Ligand-Bindung eingreifen.

So können z. B. auf einen in Frage kommenden ECMR gerichtete Antikörper zur Inhibierung der Ligand-Rezeptor-Bindung benutzt werden. Nach Feststellung dessen, daß sich ein bestimmter Zelltyp an ein bestimmtes^Ligand- oder Zellsubstrat heftet, kann es von Interesse sein, den an der Wechselwirkung beteiligten ECMR zu identifizieren. Eine Reihe monoklonaler Antikörper, von denen jeder auf einen anderen ECMR gerichtet ist, kann auf die Fähigkeit hin untersucht werden, die Adhäsion der Zellen an das Substrat zu blockieren. Die Inhibierung der Bindung durch einen bestimmten Antikörper würde vermuten lassen, daß der von diesem Antikörper erkannte ECMR an der adhäsiven Wechselwirkung beteiligt ist. In einer speziellen Ausführungsform der

Erfindung kann die Lymphozytenhaft jng an Endothelzellen in Kultur durch auf a4ß 1 gerichtete Antikörper inhibiert werden, jedoch nicht durch auf eine Reihe andorer ECMR gerichtete Antikörper (siehe Abschnitt 7, unten), was darauf hindeutet, daß a4ß 1 für die Lymphozytenadhäsion an Endothelzellen notwendig ist. Außerdem können monoklonal Antikörper für die Bestimmung des Verhältnisses zwischen ECMR und dem Ligandsubstrat benutzt werden.

Wie in Abschnitt 6 dargestellt, Infra, konnte die T-Lymphozytenadhäsion an 38kDa- und 58kDa-Fragmente vollständig durch funktionell definierte monoklonale Antikörper zu o.4ß 1 inhibiert werden. Darüber hinaus konnte die T-Lymphozytenadhäsion an CS-1 -(IgG-Konjugatl-beschichtete Oberflächen ebenfalls vollständig durch P4C 2, P3E 3 oder P4G 9 inhibiert werden. Diese Daten machen deutlich, daß a4ß 1 den T-Lymphozytenrezoptor für CS-1 darstellt. Im Gegensatz dazu konnten diese Antikörper nicht die Adhäsion der T-Zellen an das 80kDa-Fragment inhibieren, welches die Prototyp-Adhäsionssequenz Arg-Gly-Asp (RGD) enthält. Die Adhäsion von T-Zellen an das 80kDa-Frogmont konnte vollständig durch einen monoklonalen Antikörper zu o.5ß 1 (P 1D6) oder durch RGDS inhibiert //erden. P1D6 und RGDS waren nicht in der Lage, die T-Lymphozytenadhäsion an 38- und 58kDa-Fragmente oder an CS-1 zu inhibieren. Zusammengefaßt ergeben diese Daten, daß o.4ß 1 als Rezeptor für die carboxyterminale Adhäsionsdomäne des Plasmafibronectinrezeptors für alternative Adhäsionssequenzen in HICS (CS-1) und möglicherweise Hep Il auftritt.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann die ECMR-Ligand-Beziehung durch Bestimmung der Struktur des Liganden beschrieben werden. Insbesondere kann die Fähigkeit von Agenzien bewertet werden, mit dem Liganden in der Wechselwirkung zwischen ECMR und Ligand in Konkurrenz zu treten. Wo z. B. der Ligand ein Protein ist, kennen verschiedene Fragmente des Proteins auf ihre Fähigkeit hin getestet werden, die Rezeptor-Ligand-Bindung kompetitiv zu inhibieren. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, bei dor die Lymphozyten sowohl an Endothelzellen als auch an Fibronectin binden, können Peptidfragmente des Fibronectin auf die Fähigkeit hin untersucht werden, die Bindung der Lymphozyten an das Endothelzellsubstrat kompetitiv inhibieren zu können. Wie in Abschnitt 7, infra, dargestellt, war das CS-1-Peptid und insbesondere das Peptid EILDVPST in der Lage, die Bindung von Lymphozyten an Fibronectin und an Endothelzellen kompetitiv zu inhibieren, wodurch die Bindungsstelle des Liganden an eine dem EILDVPST identische oder homologe Region lokalisiert werden konnte.

5.3. Methoden des Eingreifens in die ZelladhSslon

Erfindungsgemäß kann die Haftung einer Zelle an einer anderen durch Eingreifen in die Wechselbeziehung zwischen ECMR und Ligand inhibiert werden. In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann die Bindung von Lymphozyten an Endothelzellen durch Eingreifen in die Bindung von o.4ß 1 an seinen Liganden inhibiert werden. Die kann durch Anwendung von auf ECMR oder, anderenfalls auf seinen Liganden gerichteten Antikörpern erfolgen (Antikörper, die auf den Liganden gerichtet sind, können gemäß dem in Abschnitt 5.1. beschriebenen Verfahren gewonnen werden). In alternativen Austührungsformen der Erfindung können Peptide, die die Bindung von a4ß 1 an seinen Liganden inhibieren, ihrerseits für die Inhibierung der Haftung von Lymphozyten an Endothelzelien benutzt werden.

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung können Anti-αΊβ 1 -Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon für die Inhibierung der Bindung von Lymphozyten, die a4ß 1 -Rezeptoren tragen, an vaskuläre Endothelzellen benutzt werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, insbesondere der Antikörpb- P4C2 (a4ß 1) oder P4C10 (ß 1) oder Fragmente oder Derivate davon, einschließlich chimärer Antikörper mit denselben Bindungsspezifitäten.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können Peptide zur Inhibierung der Bindung von Lymphozyten, die a4ß 1-Rezeptoren tragen, an vaskuläre Endothelzellen benutzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Peptid mindestens einen Teil der Sequenz der IlICS-variablen Region von Fibronectin. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform beinhaltet das Peptid mindestens einen Teil des CS-1-Peptids gemäß der Definition von Humphries u.a., (1987, J. Bio). Chem. 262:6886-6892), das in seiner Gesamtheit bezugnehmend hier enthalten ist, oder ein Peptid, das grundsätzlich homolog zu ihm ist. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Peptid mindestens einen Teil der EILDVPST-Sequenz oder eine im wesentlichen dazu homologe Sequenz.

5.4. Nutzen der Erfindung

Erfindungsgemäß kann die Haftung einer Zelle an einer anderen durch Eingreifen in die Bindung zwischen dem ECMR und seinem Liganden inhibiert werden. In speziellen Ausführungsformen der Erfindung kann die Haftung von Lymphozyten an Endothelzellen durch Eingreifen in die Bindung von o.4ß 1 auf Lymphozyten an seinen Liganden auf der Endothelzelloberfläche inhibiert werden. Erfindungsgemäß ist ein Zusammenwirken von zusätzlichem ECMR mit Liganden von Endothelzellen vorgesehen, sowie die Inhibierung der Adhäsion diesnr Zellen am Endothel durch Eingreifen in die Wechselwirkung zwischen ECMR und Endothelzelle. So kann z. B. auch die Adhäsion von Makrophagen am Endothel durch Eingreifen in die Wechselwirkung zwischen Makrophagen-ECMR und Endothelzelle inhibiert werden. Gleichermaßen kann die Metastasenbildung von Melanomzellen, die ebenfalls das CS-1-Peptid erkennen, und ihr Eindringen in Gewebe durch die Anwendung von Peptiden oder erfindungsgemäßen Antikörpern inhibiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist deshalb nützlich zur Verhinderung des Austritts von Lymphozyten durch das vaskuläre Endothel und ihres Eindringens in Gewebe. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Unterdrückung der Immunreaktion beim behandlungsbedürftigen Menschen zur Verfügung. In besonderen Ausführungsformen bietet die Erfindung Methoden zur Krankheitsbehandlung im Zusammenhang mit chronischen oder wiederkehrenden Aktivierungen des Immunsystems, einschließlich Collagengefäßerkrankungen und anderer autoimmuner Krankheiten (wie z. B. systemische Lupus erythematodes und Rheumatoidarthritis), multipler Sklerose, Asthma und Allergien, um nur einige zu nennen. Die Erfindung stellt weiterhin Behandlungsverfahren für relativ akute Aktivierungen des Immunsystems bei behandlungsbedürftigen Patienten zur Verfügung, einschließlich z. B. der, nicht jedoch beschränkt auf, die Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion, Allograftabstoß oder Transfusionsreaktion.

In Abhängigkeit von der Art der Schädigung des Patienten kann es wünschenswert sein, die Lymphozytenmlgration in das Gewebe systematisch oder anderenfalls lokal zu inhibieren. So kann es z. B. bei Krankheiten, die mehrere Organe betreffen, wie systemische Lupus erythematodes, wünschenswert sein, die Lymphozytenadhäsion während einer klinischen Exacerbation systemisch zu inhibieren. Bei einer örtlich begrenzten Kontaktdermatitis kann es andererseits vorzuziehen sein, die Migration der Lymphozyten nur in den betroffenen Gewebebereichen einzuschränken.

Eine Steuerung der systemischen bzw. örtlichen Anwendung der erfindungsgemäßen Methoden kann durch Modifizierung der Zusammensetzung der verabreichten Antikörper oder Peptide oder durch Veränderung der Struktur dieser Agenzien oder ihrer pharmakologischen Zusammensetzung erfolgen. So können z. B. die erfindungsgemäßen Antikörper oder Peptide auf jedem beliebigen Weg verabreicht werden, einschließlich des subkutanen, intramuskulären, intravaskulären, intravenösen, intraarteriellen, intranasalen, oralen, intraperitonealen, rektalen, intrairachealen oder intrathekalen Weges. Für eine örtliche Inhibierung der Lymphozytenadhäsion am Endothel kann es jedoch wünschenswert sein, die erfindungsgemäßen Antikörper oder Peptide in therapeutischen Mengen und mittels eines geeigneten pharmakologischen Trägers subkutan oder intramuskulär zu verabreichen. Andererseits kann es für eine systemische Inhibierung der Lymphozytenadhäsion wünschenswert sein, die Antikörper oder Peptide intravenös zu verabreichen.

In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist es vorteilhaft, einen pharmakologischen Träger zu benutzen, der die Abgabe der erfindungsgemäßen Antikörper, Peptide, etc. erleichtert. Wenn z. B. die Antikörper, Peptide, etc. an die Haut abgegeben werden sollen (z. 8. für die Behandlung chronischer entzündlicher Hauterkrankungen), kann ein pharmakologischer Träger vorteilhaft sein, der ein Durchdringen der Kutikula, Epidermis sowie Dermis fördert.

Die Dissemination der erfindungsgemäßen Peptide ode^r Antikörper kann auch durch Veränderung der Halbwertszeit der Peptide oder Antikörper oder durch ihre effektive Halbwertszeit gesteuert werden. So können ζ B. die erfindungsgemäßen Peptide eine relativ kurze Halbwertszeit haben; wenn diese Peptide in einem langsam wirkenden Implantat verabreicht würden, würde der in der Nähe des Implantats befindliche Gewebebereich unter der Wirkung des Pep tids stehen (z. B. ein Gelenk bei einem an rheumatischer Arthritis leidenden Patienten), während die Peptide unter Umständen schon zerfallen wären, bevor sie entfernter liegende Gewebe erreichen würden.

Wenn andererseits das Peptid zur Erreichung einer längeren Halbwertszeit durch chemische Modifikationen, die zur Bildung von Derivaten führen, verändert wäre einschließlich, aber nicht beschränkt auf Aminosäuresubstitutionen, Glycosylationen, Substitution enantiomerer Varianten (d.h. D-Enantiomere von Aminosäurebestariü. ilen), Additionen, etc., können die Peptide wahrscheinlich auf gleichbleibendem Niveau weiter verteilt werden. Als weitere Beispiele können der N- oder C-Terminus der Peptide zum Erreichen einer größeren Stabilität modifiziert werden.

In zusätzlichen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Antikörper oder Peptide an Antikörper oder andere Liganden konjugiert werden, die die Antikörper oder Peptide zu spezifischen Geweben führen können. So können z. B., jedoch nicht beschränkt darauf, erfindungsgemäße Peptide an Antikörpern konjugiert werden, die auf Endothelzellen gerichtet sind. Außerdem können Antikörper hergestellt werden, die ECMR nachahmen, und sich somit an Endothelzelliganden heften, wodurch die Lymphozytenadhäsion blockiert wird.

5.5. Erfindungsgemäße Peptide und Antikörper

Die erfindungsgemäßen Peptide umfassen jedes Peptid, das in der Lage ist, mit dem in Frage kommenden ECMR in Wechselwirkung ζμ treten. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann jedes beliebige Peptid, welches in der Lage ist, mit dem a4ß 1 -Rezeptor in Wechselwirkung zu treten, zur Inhibierung der Bindung von Lymphozyten an das Endothel verwendet werden.

Vorzugsweise sollte vor dem In-vivo-Gebrauch in vitro nachgewiesen werden, daß diese Poptide die Adhäsion von Lvmphozyten an Endothel inhibieren. In einer bevorzugten Au sführungsform der Erfindung umfassen die Peptide mindestens einen Teil der IIICS-Region von Fibronectin. In einer bevorzugteren Ausführungsform umfassen dio Peptide mindestens einen Teil der CS-1 Peptidsequenz oder einer Sequenz, die im wesentlichen homolog zur CS-1-Sequenz gemäß Fig.9(a) und (b) ist. In der am meinten bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Peptide mindestens einen Teil der EILDVPST-Sequenz oder einer im wesentlichen mit ihr homologen Peptidsequenz. „Im wesentlichen homolog" ist so aufzufassen, daß die erfindungsgemäßen Peptide Abwandlungen der spezifischen Sequenz sind, bei denen z. B. eine funktionell äquivalente Aminosäure für eine oder mehrere Aminosäuren in der Peptidsequenz ausgetauscht ist, so daß ein stiller Austausch erfolpt. So können z. B. ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure gleicher Polarität ersetzt werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt. Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure grhört. So umfassen z. B. nichtpolare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Polare neutrale Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Positiv geladene (basische) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Negativ geladene (saure) Aminosäuren umfassen die Asparaginsäure sowie Glutaminsäure. Zusätzlich bezieht sich die Erfindung, wie in Abschnitt 5.3. dargestellt, auch auf die Derivate der o. g. Peptide. Die erfindungsgemäßen Antikörper, die hergestellt und definiert werden wie supra beschrieben, umfassen monoklonal sowie polygonale Antikörper und Fragmente und Derivate davon, einschließlich F(ab')₂, Fab' sowie FAB-Fragmente.

6. Beispiel: Identifizierung und Charakterisierung des Lymphozytenadhäsionsrezeptors für eine alternative Zeilhaftungsdomäne In Plasmalibronectln

Die folgenden Experimente beschreiben einen neuen Fibronectinrezeptor, der identisch mit dem Integrinrezeptora4ß1 zu sein scheint (Hemler u. a., 1987, supra), vorzugsweise ausgeprägt durch als Kern wirkende hämatopoetische Zellen. Die Identifizierung von ct4ß 1 als spezifischer Fibronec'inrezeptor basierte auf (I) der Inhibierung der Zelladhäsion an Fibronectin durch monoklonale Antikörper (P4C2, P3E 3 und P4G 9), sowie (II) der spezifischen Reorganisation und Konzentration von a4ß 1 in den fibronectinabhängigen Adhäsionsherden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß o.4ß 1 und a5ß1, die Prototypen eines Fibronectinrezeptors, zusammen bis Primärvermittler der Zelladhäsion an Fibronectin wirken.

-12- 297 562 S.1. Materlallen und Methoden

6.1.1. Reagenzien

Phenylmethylsulfonylfluorid, n-Ethylmaleimid, Leupeptin, Diisopropylfluorphosphat, 2-Mercaptoethanol, Rinderserumalbumin (BSA), Triton X-100, Protein-A-Agarose, Sojabohnentrypsininhibitor sowie V8-Protease (von Staphylococcus aureus. Stamm V8, Proteasetyp XVII) wurden bei Sigma Chemical Co. gekauft (St. Louis, MO). Lactoperoxidase und Glukoseoxidase kamen von Calbiochem (San Diego, CA). TPCK-Trypsin stammte von Cooper Biomedical, Malvern, PA. Fluoroscein-konjugierte (Ziege)-Anti-Maus-lgG und -IgM (H- und L-Ketten) oder Rhodamin-konjugierte (Ziege)-Anti-Kaninchen-lgG und -IgM (H- und L-Ketten) wurden bei Tago, Inc. (Burlingame, CA) erworben. R-Phycoerythrin-konjugiertes Strepavidin stammte von Biomeda (Foster City, CA). Kaninchen-Anti-Maus-lgG (H + L) Antiserum wurde von Cappel (Cooper Biomedical, Malvern, PA) erworben. ⁵¹Cr-Natriumchromat kam von New Englund Nuclear, '²⁵I von Amersham (Arlington Hts., IL). Rokombinantes Human-lnterleukin-2 (IL-2) war eine großzügige Spende von Dr. D. Urdal (Immunex Corp., Seattle, WA). Laminin wurde bei Collaborative Research, Inc., Bedford, MAj erworben und gereinigtes Plasmafibronectin und Collagen der Typen I und III wurden wie oben beschrieben angefertigt (Wayner, E.A. und Carter, W.G., 1987, supra sowie Wayner u.a., 1988, supra).

6.1.2. Zellen und Zellkulturen

RD (Human-Rhabdomyosarkom) und HT1080 (Human-Fibrosarkom)-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Einkernige Zellen aus perioherem Blut (PBMC), Blutplättchen sowie Granulozytpopulationen von normalen menschlichen Spendern wurden wie beschrieben gewonnen (Kunicki u.a., 1988, supra; Wayner u.a., 1988, supra). Zellen von peripherem Blut von Patienten mit akuter Lymphozyten-, großkörniger Lymphozyten-(LGL) oder Myelogenleukämie erhielten wir von Dr. I. Bernstein und Dr.T.Loughran (Fred Hutchinson Cancer Research Cente'l. Human-Iymphokine (500U/ml IL-2) aktivierte Killer-(LAK)-Zellen sowie monoklonal HLA B7 spezifische zytotoxische Human-T-Lymphozyten (CTL)-Zellinien, C1C4, wurden gemäß Standardprotokollen gewonnen (Grimm u.a., 1982, J. Exp. Med., 155:1923-1941; Glasebrook, A.L. und Fitch, F.W., 1980, J. Exp. Med. 151: 876-895; Brooks, 1983, Nature, 305:155-158; Wayner, E.A. und Brooks, CG., 1984, J. Immunol., 132: 2135-2142; Wayner, E.A. und Caiter, W.G., 1987, J. Cell Biol., 105:1873-1883). Die EBV-tiansformierte B-Lymphozytenzellinie (BLCL), ST-1, wurde aus einer Spendermilz gewonnen, die bei der Gewinnung der C1 C4-CTL-Reihe benutzt wurde. Alle anderen Zellinien und Zellkulturbedingungen entsprachen den oben beschriebenen (Wayner, E.A. und Carter, W.G., 1987, supra; Wayner u.a., 1988, supra).

6.1.3. Antikörper

Ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, AB33, der gegen die zytoplasmatische Domäne des Fibronectinrezeptors a5ß 1 hergestellt wurde, wurde zur Auffindung von a5ß 1 in Adhäsionsherden benutzt. Monoklonal Antikörper A1A5 gegen das gewöhnliche Integrin (Hynes, R. O., 1987, supra) β !-Untereinheit der VLA-Rezeptorenfamilie (Hemler, M.E., 1988, supra) sowie B 5-G10 zur VLA-4-a-Untereinheit (Hemler u.a., 1987, supra) wurden von Dr. Martin Hemler vom Dana-Farber Cancer Inst., Boston, MA erhalten. Monoklonal Antikörper zu den Integrinre/eptoren a3ß 1 (P 1B 5), a2ß 1 (P 1H 5) und α 5ß 1 (P 1D6) wurden in diesem Laboratorium beschrieben und entwickelt. P1H 5 und P1D6 inhibieren jeweils die Fibroblast- und Plättchenadhäsion an Collagen und fibronectinbeschichtete Substrate (Wayner, E.A. und Carter, W.G., 1987, supra; Kunicki u.a., 1988, supra; Wayner u.a., 1988, supra).

Monoklonal Antikörper zu Lymphozytenadhäsionsrezeptoren wurden nach den von Oi und Herzenberg (Oi, V. T. und Herzenberg, L.A., 1980, Immunoglobulin producing hybrid cell lines. In: Selected Methods in Cellular Immunology. Ed. by B. B. Mishell and S. M.Shiigl, W. H. Freeman and Co., San Francisco, S. 351-373) sowie von Taggart und Samloff (Taggart, R.T. und Samloff, I. M., 1983, Science, 219:1228-1230) beschriebenen Methoden hergestellt (Wayner und Carter, 1987; Wayner u.a., 1988). Mit 100μΙ T-Lymphozytenkonzentrat immunisierten RBF/DN-Mäusen wurde die Milz entnommen, die mit NS-1/Fox-NY-Myelomzellen verschmolzen wurde. Lebensfähige Heterokaryone wurden in mit Adenin/Aminopterin/Thymidin supplementiertem RPM11640 selektioniert (Taggart und Samloff, 1983). Hybridome, die auf Lymphozytenadhäsionsrezeptoren gerichtete Antikörper herstellen, wurden durch spezifische Inhibierung der Lymphozytenadhäsion an fibronectinbeschichtete Oberflächen geprüft und durch limitierende Verdünnung geklont.

Obwohl A1A5 (Hemler u.a„ 1987, J. Biol. Chem. 262: 3300-3309) spezifisch mit der β 1 -Untereinheit des Integrinrezeptors reagiert und die Zelladhäsion inhibieren soll, Takeda u.a. (1988, J. Cell Biochem. 37: 385-393), ist bei diesem Reagens niemals beobachtet worden, daß es die Adhäsion von Lymphozyten an eine beliebige Oberfläche inhibiert. Deshalb wurde ein funktionell definierter Anti-ß 1-monokonaler-Antikörper P4C10 unter Anwendung der vorher beschriebenen Techniken (supra) sowie durch Screenen der Zelladhäsionsinhibierung an multiplen Liganden produziert. Es wurde nachgewiesen, daß P4C10 die Zelladhäsion an Fibronectin, an CS-1, collagen- und lamininbeschichtete Oberflächen inhibiert und nach biochemischen Standardkriterien mit ß1 reagiert.

6.1.4. Inhibierung der Zelladhäsion an Intaktes Fibronectin sowie Fibronectlnfragmente

Antikörper, die die Zelladhäsion an gereinigtes Plasmafibronectin, tryptische Fragmente und CS-Peptide verändern würden, wurden wie oben beschrieben identifiziert (Wayner und Carter, 1987). Kurz gesagt wurden frische Styrenplatten mit 48 Vertiefungen mit Human-Plasmafibronectin beschichtet (5μΙΛηΙ). Die Platten wurden durch PBS blockiert, das mit 10mg/ml durch Hitze denaturiertem BSA (HBSA) supplementiert war. Die T-Lymphozyten oder HT 1080-Zellen wurden mit Na₂ ⁶¹CrO₄ (50ulCi/ml für 2-4h) markiert, gewaschen, undo χ 10⁴HT1080 oder kultivierte T-Zellenoder5 χ 10¹⁰PBL/Vertiefung wurden mit Überständen von Hybridomkulturen (1:2-Verdünnung in PBS, supplementiert mit 1 mg/ml durch Hitze denaturiert BSA) oder einem Überstand einer Kontrollkultur von Myelomzollen 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Zellen konnten in Gegenwart der Hybridomüberstände 15 bis 30 Minuten lang (HT1080) oder 2 bis 4 Stunden lang (Lymphozyten) bei 37⁰C an die proteinbeschichteten Oberflächen anhaften. Nichthaftende Zellen wurden durch Waschen mit PRS entfernt und die haftenden Zellen wurden in SDS/NaOH gelöst und die Menge der gebundenen ^slCr-cpm wurde mittels eines Gammazählers bestimmt.

6.1.5. Immunprözipltatlon, sequentielle Immunpräzlpltatlon, V8-Protease-Peptlükartierung sowie Polyacrylamldgel-Eloktrophorese

LebensfähigeZellen wurden, wie beschrieben (Wayner und Carter, 1987) mit Iod 125 oberflächenmarkiert und dann mit 1 % (V/V) Triton X-IOO Detergens oder 0,3%igem CHAPS-Detergens in 5OmM phosphatgepufferter Salzlösung, pH7,2 extrahiert. In einigen Fällen wurde dem Lysepuffer CaCI₂ zugesetzt. Als Proteaseinhibitoren wurden 1 mM henylmethylsulfonalfluorid, 1 mM N-Ethylmaleimid, 1 μΙ/ml Leupeptin und 1 Mg/ml Trypsir-Sojabohnoninhibitor benutzt. Die Immunpräzipitation sowie die sequentielle Immunpräzipitation wurden genau wie oben beschrieben durchgeführt (Wayner und Carter, 1987, supra). Dem Grundverfahren von Cleveland u.a. (1977, J. Biol. Chem. 252:1102-1106) mit den beschriebenen Modifikationen (Wayner und Carter, 1987) folgte die Peptidanalyse. Nach dem grundsätzlichen Sammeigelsystem von Laemmli (1970, Nature 227:680-685) wurden die Polyacrylamid-Plattengele, welche Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE-GeIe) enthalten, hergestellt.

6.1.6. Gewinnung von trvptlschen Fragmenten aus Humanplasnv (bronectln und Synthese von CS-Peptiden

Das Humanplasmafibronectin stellte eine großzügige Spendo von Dr. Horowitz und Dr. R. Schulman (New York Blood Center, NY) dar. Fibronectin wurde 90 Minuten lang bei 37°C mittels TPCK-Trypsin verdaut, und das Verdauungsprodukt wurde durch Affinitäts- und lonenaustausch-Chromatographie wie vorher beschrieben fraktioniert (Garcia-Pardo u. a., 1987, Biochem. J. 241: 923-928; Garcia-Pardo u.a., 1989, Exp. Cell Res. 181: 426-431). Zwei überlappende Peptide, die die ursprünglichen 48 Reste der IIICS-Region von Human-Fibronectin (CS-1 und CS-2) überspannen, wurden synthetisiert und wie beschrieben an Kaninchen-lgG gekoppelt (Humphries u.a., 1986, und Humphries u.a., 1987, J. Biol. Chem. 262: 6886-6892).

6.1.7. Fluoreszenzanalyse der Rezeptorexpression

Die Expression von ECMR auf Zellen in Suspension wurde mittels Ein- oder Zweifarben-Durchflußzytometrie auf einem dualen Laserzellensortierer (Coulter, Hialeah, FL) analysiert. Die positive Fluoreszenz wurde auf einet 3-Dekaden log-Skala ermittelt und die Fluoreszenzintensität (log Fl) wurde als durchschnittliche Kanalzahl ausgedrückt (0--225). Für jede Zellpopulation wurde die Hintergrundfluoreszenz für eine negative Kontrolle eines nicht-immunen Maus-lgG bestimmt. Adhärente Zellen wurden „trypsiniert" und konnten sich 15 Minuten lang bei 37⁰C in Gegenwart von Serum erholen, bevor die Durchflußzytometrie angewandt wurde. Für Ein-oder Zweifarben-Fluoreszenzmessungen wurden 10* Zellen in Suspension 30 Minuten lang mit Ziegen-lgG (2C^g/ml) inkubiert, das mittels Protein-G-Sepharosegel gereinigt wurde, und dann mit Antikörpern der ersten Stufe 60 Minuten lang bei 4°C inkubitirt, sodann in Hanks Salzlösung gewaschen, die 10rng/mi HBSA sowie 0,02% Natriumazid (Hi.:.'<s/BSA/SA) enthielt, und 60 Minuten lang bei 4°C mit FITC-konjugiertem Kaninchen-Antimaus-lgG in Hanks/BSA/SA inkubiert. Sie wurden gewaschen und in kaltem 2%igern Paraformaldehyd (frisch hergestellt) in PBS fixiert. Für die Zweifarbenfluoreszenz wurde dann den FITC-ge'ärbten und fixierten Zellen bis zu einer Endkonzentration von 1 Mg/ml in Hanks/ BSA/SA gereinigter und biotinylierter monoklonalor Antikörper zugesetzt und 60 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die vorherige Fixierung mit 2%igem Paraformaldehyd hatte wenig Auswirkungen auf die Expression der Lymphozytenintegrinrezeptoren. Die fixierten Zellen wurden gewaschen und 30 Minuten lang bei 4°C in 0,5ml Hanks/BSA/SA, das Phykoerythrin-konjugiertes Streptavidin (Bionetics) als Vw-Verdünnung enthielt, inkubiert. Abschließend wurden die gefärbten Zellen gewaschen und wieder in 2%igem Paraformaldehyd in PBS fixiert sowie für die Analyse auf dem EPICS-Durchflußzytometer bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.

6.1.8. Lokalisierung der Rezeptoren In Adhäsionsherden

Adhärente Zellen wurden „trypsiniert", in mit 1 Mg/ml BSA supplementiertem RPMI plus 10Opg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor gewaschen, und danach konnten sie an säuregewaschene und silanisierte Glasdeckplättchen, die mit Fibronectin, Laminin oder Collagen (20Mg/ml) beschichtet waren, bei NichtVorhandensein von Serum 1 bis 4 Stunden lang wie beschrieben anhaften (Carter und Wayner, in Vorbereitung). Nach Abschluß der Inkubation wurden nicht haftende Zellen entfernt und haftende Zellen in 10OmM Natriumkakodylat, 10OmM Saccharose, 4,5mM CaCI₂,2%igem Formaldehyd 20 Minuten lang fixiert. Sie wurden mittels 0,5%igem Triton X-100 5 Minuten lang permeabel gemacht, danach gewaschen und mit 25%igem Ziegenserum in PBS blockiert. Die permabel gemachten Zellen wurden mit Antikörpern zu spezifischen Rezeptoren gefärbt (60 Minuten lang bei Zimmertemperatur), gewaschen und entweder mit FITC-konjugiertem Anti-Maus- oder Rhodamin-konjugiertem-Anti-Kaninchen-lgG inkubiert (45 Minuten lang bei Zimmertemperatur) und nochmals gewaschen. Die Deckplättchen wurden für die Fluoreszenz- und Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) wie beschrieben auf Glasträger übertragen (Izzard, S. C. und Lochner, L.R., 1976, J. Cell Sei., 21,129- .59).

6.1.9. Gewebeeinf&rbung

Die Verteilung der Integrinrezoptoren im Gewebe wurde mittels der Fluoreszenzmikroskopie von Kryostatschnitten ermittelt. Kryostatschnitte (6pm) wurden aus der menschlichen Haut, aus Tonsillen oder Tumorproben entnommen, die nach Schockfrieren in Isopentan-Flüssigstickstoff in OCT-Mosdium eingebettet wurden. Alle Schnitte wurden vor der Inkubation mit Primärantikörpern und Sekundärfluoreszenz-Antikörpern wie besen ieben in 4%igem Para'ormaldehyd in PBS fixiert (Carter und Ws.'ner, 1988, J. Biol. Chem. 263:4193-4201). In Kontrollexperimeinen wurde keino Fluoreszenz des Rhodamin bei Verwendung von Fluoreszenzfiltern oder umgekehrt festgestellt.

6.2. Ergebnisse

6.2.1. Identifizierung eines alternativen Flbronectinrezeptors

T-Lymphozytenkulturen (MoIt 4), K 562, RD (Rhabdomyosarkom) und HT1080 (Fibre sarkom)-Zellen sowie frisch gewonnene PBL (nicht dargestellt) hafteten an fibronectinbeschichteten Oberflächen (Fig. 1: offene Balken). Die MoIt 4- sowie RD-Zellen zeigten jedoch nur ein geringes oder ein nicht feststellbares Niveau an Prototypen des Flbronectinrezeptors (Integrin α 5ß 1), der durch den monoklonalen Antikörper P1D6 erkannt wird (Fig. 1: gestrichelte Balken). In Übereinstimmung damit konnte die Adhäsion von Mol; 4- und RD-Zollen an Fibrom tin nicht vollständigt durch P1D6 inhibiert werden (Fig. 1: feste Balken). Andererseits konnte die Adhäsion von Zellen an Fibronectin, das in starkem Maße α 5ß 1 auspräg'e (HT 1080 und K 562), effektiv von P1D6

inhibiert werden. Außerdem inhibierte das synthetische Peptid RGDS die T-Lymphozytenadhäsion an Plasmafibronectin nicht vollständig (50-70% bei MoIt 4- oder Jurkat-Zellen gegenüber 80-90% bei Fibroblasten und 100% bei K 562-1-Zellen). Zusammengenommen ließen diese Daten vermuten, daß einige Zellen, wie z. B. T-Lymphozyten, andere als αδβ 1 Fibronectinadhäsionsrpzeptoren ausprägen.

Wir versuchten, anderu mutmaßliche Fibronectinrezeptoren durch Herstellung monoklonaler Antikörper zu T-Lymphozytenkulturen zu identifizieren und sie hinsichtlich der Fähigkeit zu prüfen, spezifisch die Lymphozyten-, nicht jedoch die Fibroblastadhäsion an fibronectinbeschichtete Oberflächen zu inhibieren. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden mehrere monoklonale Antikörper identifiziert (P4C 2, P3E 3, P4G9), die die Adhäsion von L-Lymphozytenkulturen an Fibronectin, nicht aber die HT1080 Zelladhäsion an Fibronectin inhibieren (Tabelle 3).

Tabelle III Spezifische Inhibierung der Lymphozytenadhäsion an Plasmafibronectin durch monoklonale Antikörper P3E 3, P4C2 und PPG49

	SP2	P1D6	Fibronectinadhäsion	P4G9
		(Ci₆Pi	(% der Kontrolle)
Zellen	100%	43%	P3E3 P4C2	52%
	100%	22%		48%
PBL	100%	18%	38% 10%	39%
Jurkat	100%	5%	33% 12%	104%
Molt4		12% 8%
HT1080		98% 93%

Die Immunpräzipitation aus Triton-X-100-Detergenslysaten, die mit '"l-oberflächenmarkiertem PBL (nicht dargestellt), mit MoIt 4- oder HT1080-Zellen (Fig. 2) gewonnen wurden, zeigt, daß die inhibierenden monoklonalen Antikörper (die Angaben beziehen sich auf P3E 3) mit einem Einzelprotein reagierten, das in den Lymphozytenextrakten vorhanden war, die bei M150000 (p150) in Gegenwart (nicht dargestellt) oder in Abwesenheit (Fig. 2) eines Reduktionsmittels migrierten. Unter diesen Bedingungen der Immunpräzipitation fehlte dem ρ 150 eine erkennbare α-β-Untereinheit-Struktur, und es migrierte weder mit der α- noch mit der ß-Untereinheit der Integrinrezeptoren a2ß 1 oder a3ß 1 (Fig. 2). Das aus denTriton-X-100-Detergensextrakten, welche mit chronisch aktivierten CD8 + Killer-T-Lymphozyten (LAK) oder CTL (nicht dargestellt) hergestellt wurden, immunpräzipitierte Antigen enthielt zusätzlich zu ρ 150 relativ große Mengen zweier kleinerer Proteine, die bei M 80000 und 70000 bei Vorhandensein (nicht dargestellt) oder Abwesenheit eines Reduktionsmittels migrierten. Die Kartierung von V 8-Proteasepeptiden ergab, daß p80 und p70 proteolytische Fragmente von ρ 150 (nicht dargestellt) waren. Die Formen mit niedrigerer relativer Molekülmasse konnten aus chronisch aktivierten T-Zellen auch dann immunpräzipitiert werden, wenn die Detergensextrakte in Gegenwart multipler Proteaseinhibitoren hergestellt wurden (Fig. 2/Legende). ρ80 und p70 waren praktisch in Extrakten, die mit ruhender PBL, kultivierter T- (Molt4, Jurkat) oder B-Zellen-Leukämie sowie RD-Zellen hergestellt wurden, nicht vorhanden.

Die biochemischen Merkmale von ρ 150 ließen vermuten, daß es mit dem von Hemler beschriebenen VLA-4-Antigon verwandt sein könnte (Hemler u.a., 1987). Dias wurde durch sequentielle Immunpräzipitation (nicht dargestellt) mit einem spezifischen VLA-4-monoklonalen Antikörper, B 5-G10, bestätigt. P150 wurae als α-Untereinheit der übergeordneten Integrin-Familie durch seine Assoziation mit β 1 bestimmt, wenn Immunpräzipitationen nach der Solubilisierung von '"-l-oberflächenmarkierten T-Lymphozyten durch CHAPS-Detergens (0,3%ig) bei Vorhandensein von 1 mM Ca⁺* erfolgten (Fig.3). Unter diesen Bedingungen wurde α4 als Heterodimer mit β 1 ausgefällt. Die Identität von β 1 wurde durch V8-Proteasepeptidkartierung bestätigt (nicht dargestellt). Das a4ß 1-Heterodimer, das mit den inhibierenden monoklonalen Antikörpern (P3E3, P4C2 und P4G9) aus den T-Lymphozyten ausgefällt wurde, unterschied sich vom Prototyp des Fibronectinrezeptors αδβ 1, der mit P1D6 immunpräzipitiert wurde, durch drei Kriterien. 1) Die relativen Mengen des in Detergensextrakten von T-Lymphozyten enthaltenen a4ß1 und α 5ß1 wiesen einen deutlich höheren Gehalt an a4ß1 auf (Fig.3). Dies stimmte mit den vor uns mittels der Durchflußzytometrie gewonnenen Daten überein (Fig. 1). 2) In Experimenten zur sequentiellen Immunpräzipitation erfolgte keine Vorklärung des αδβ 1 durch die monoklonalen Antikörper (nicht dargestellt). 3) Die V8-Protoasepeptidkarten, die aus den mit monoklonalen Antikörpern P3E3 und P1D6 ausgefällten a4- und a5-Untereinheiten abeleitet wurden, waren deutlich erkennbar (nicht dargestellt). Weiterhin reagierte unter den Bedingungen (0,3% CHAPS und 1 mM CaCI₂), die zur Solubilisierung des Konjuga's von a4ß 1 aus Jurkat-Zellen (Fig. 3) angewandt wurden, ein anderes Protein mit höherer relativer Molekülmasse (p 180) ebenfalls mit den monoklonalen Antikörpern oder co-präzipitierte mit a4ß 1. ρ 180 war in Extrakten, die mit P1D6 monoklonalen Antikörpern (Fig.3), mit nicht-lymphoiden Zellen oderTriton-X-100-Detergensextrakten in Abwesenheitvon Ca⁺⁺ hergestellt wurden, nicht enthalten. Die Beziehung von ρ 180 zu anderen Integrinen ist nicht bekannt. Da a4 ohne β 1 nach Solubilisierung der T-Zellen mittels Triton-X-100 in Abwesenheit von Ca^T+ immunpräzipitiert werden konnte, wies diese Tatsache darauf hin, daß die inhibierenden monoklonalen Antikörper die auf der a4-Untereinheit vorhandenen Epitope erkannten (Fig.2).

6.2.2. Verteilung vona4ß1 unda5ß1 In Zellkulturen und Gewebekulturen

Wie bereits dargestellt (Hemler, supra), war α4β 1 auf kernhaltigen hämatopoetischen Zellen weit verbreitet (Tabelle IV). Tabelle IV

Verteilung der Fibronectinrezeptorena4ß1 unda5ß1 auf Humanzellen

Zellen o.4ß1 Relative Fluoreszenzintensität a5ß1

Hfimatopeotische Zellen

PBL +++ +/-oder-

LGL(CD3-,CD16+) +++ +/-oder-

Monzyten(CD16+) ++ + +

Granulozyten - +

Blutplättchen - +

Tonsille

ALL (T oder B)

LGL Leukämie (CD3+, CD4+)

Molt4(CD3+,CD4+)

Jurka(CD3+,CD4+)

YT(CD3-)

PHA-Stammzellen (CD4+)

CTL(CD3+,CD8+)

LAK(CD3+,CD8+)

HL-60 ++ +

U937 ++ +

K 562-1 - ++

Fibroblasten

HFF(P5) + +

HT1080 + + +

RD ++ +

VA13 + + +

Epithelzellen

OVCAR-4⁷

T47D - +

QG56 - +

Die Zweifarben-Durchflußzytometrie ergab, daß alle aus Milz, Tonsillen und peripherem Blut gewonnenen Subpopulationen von Lymphozyten sehr viel o.4ß 1 ausprägten. Außerdem wiesen auch die von uns untersuchten Monozyten aus peripherem Blut, frisch gewonnene akute Lymphozytenleukämie (T oder B) alle großkörnigen Lymphozyten- (LGL) und myelogenen Leukämien sowie T- und B-Lymphozyten-Zellinien sehr viel o.4ß 1 auf (Tabelle IV). Normale menschliche Blutplättchen und Granulozyten waren hinsichtlich des a4ß 1 negativ (Tabelle IV). Andererseits waren die einzigen harn., topoetischen Zellpopulationen, die aöß 1 ausprägten, aktivierte T-Zellen, Blutplättchen, Monozyten und Granulozyten, akute lymphozytische (T oder B¹ und myelogene Leukämien sowie K562-, HL-60- und U 937-Zellkulturen. Einige kultivierte T- (Molt4 oder Jurkat) sowie B- (ST-I) Zellinien prägten ein niedriges a5ß 1-Niveau aus, wie von P1D6 monoklonalen Antikörpern nachgewiesen wurde. Bai einigen normalen Individuen war eine Subpopulation von PBL für die von der Durchflußzytometrie entdeckte P1 D6-Fluc7öszenz positiv. Wir sind dabei, die Natur dieser Subpopulation von PBLzu untersuchen, die α 5ß1 ausprägt. TY-Zellen, ein CD3T-Zellenlymphom, waren für P1D6 mittels Durchflußzytometrie vollständig negativ. Diese Ergebnisse zeigen, daß der konstitutiv durch ruhende T-Lymphozyten ausgeprägte wichtigste Fibronectinrezeptor das o.4ß 1 ist und daß, wie bereits früher angegeben (Wayner u. a., 1988) die Expression von o.5ß 1 in T-Lymphozyten auf leukämische oder aktivierte Zellkulturen beschränkt ist. Interessanterweise prägten die meisten Fibroblast-Zellinien eir. niedriges a4ß 1 -Niveau aus, während die Endothelzellen großer Gefäße (HUVE) sowie Endothelzellkulturen in bezug auf a.431 bei der Durchflußzytometrie negative Ergebnisse erbrachten. In Geweben war a4ß 1 in ausgewachsener dilz, Lymphknoten und Tonsillen vorhanden und im wesentlichen in allen anderen von uns untersuchten Geweben nicht enthalten. Außerdem variierten die relativen Mengen der Fibronectinadhäsionsrezeptoren, die durch Zellen in spezifischen Gewebsdomänen ausgeprägt wurden, sehr stark. So prägten z. B. PBL und Lymphozyten in Tonsillen und Kortex sowie zentralen Keimbereichen große Mengen von a4ß 1 aus, jedoch praktisch kein α 5ß 1. a4ß 1 wurde auch in Epithelbereichen von ausgewachsenem Lymphgewebe gefunden, ob dies jedoch ein Ergebnis der Lymphozyteninfiltration in diese Bereiche war oder der Expression von a4ß 1 durch lymphatische Epithelzellen, blieb unklar.

6.2.3. a4ß 1 sammelt sich In fibronectln-abhänglgen Adhäsionsherden

Wenn Zellen auf den entsprechenden Liganden ohne Serum gezüchtet werden, findet eine spezifische Reorganisation der Zelloberflächen-Adhäsionsrezeptoren in bezug auf die Adhäsionsherde statt (dargestellt von Burridge u. a., 1988, Ann. Rev. Cell Biol., 4,487-525). Da einige Fibroblaste a4ß 1 ausprägen, haben wir untersucht, ob sich dieser Rezeptor in die Adhäsionsherde ausbreitet, wenn Fibronectin als Adhäsionssubstrat benutzt wurde. Wie Fig.4 (A und C) zu entnehmen ist, konnten die Primärkontaktherde oder Adhäsionsherde mittels der Interferenzreflexionsmikroskopie sichtbar gemacht werden Jzzard, S.C. und Lochner, L. R., 1976, J. Cell. Sei., 21,129-159), wenn die RD-Zellen in Fibronectin gezüchtet wurden. Wie wir und andere bereits

berichtet haben (Roman, J., LaChance, R., Broekelmann,T. J., Roberts, C. J., Wayner, E. A., Carter, W. G., und MacDonald, J., 1988, J. Cell Biol. 108: 2529-2543), konzentrierte sich a5ß1 bei Abwesenheit von Serum auf die Adhäsionsherde, wenn die RD-Zellen auf Fibronectin, nicht jedoch auf lamininbeschichteten Oberflächen gezüchtet wurden (Fig.4 B, Pfeile). Gleichermaßen zeigte die Färbung mit monoklonalem Antikörper P4G 9 (Fig.4 D, Pfeile), daß a4ß 1 auch dann in Adhäsionsherden konzentriert war, wenn die Zellen auf Fibronectin, nicht jedoch auf lamininbeschichteten Oberflächen gezüchtet wurden (nicht dargestellt). Diese Ergebnisse belegen ein spezifisches Zusammenwirken von a4ß 1 mit Fibronectin in den Adhäsionsherden, der Primäradhäsionsstruktur von Zellkulturen.

Das Vorhandensein beider Rezeptoren in den Kontaktherden ließ vermuten, daß a4ß 1 und a5ß 1 eine Bindung an bostimmte Adhäsionssequerizen in Fibronectin eingehen. Diese Annahme wurde bestätigt, als P4C2 und P1D6 gleichzeitig zur Inhibieiung der Zelladhäsion an intaktes Plasmafibronectm benutzt wurden. Bei gleichzeitiger Anwendung inhibierten P1D6und P4C2 die Adhäsion der T-Lymphozyten vollständig und die Adhäsion der RD-Zellen an das intakte Plasmafibronectin teilweise (Tabelle V).

Tabelle V

Kombinierte Wirkung der monoklonalen Antikörper P1D6 und P4C2 auf die Adhäsion von T-Lymphozyten und RD-Zellen an Fibronectin

Zellen	Antikörper	Spezifität	Adhäsion
			(%der Kontrolle ± SD)
RD	IGG	—	100%
	P1D6	d5ß1	81 ±11
	P4C2	O.4ß1	99 ±7
	P1D6+P4C2		36 ±8
Jurkat	IGG	-	100%
	P1D6	O.5ß1	26 + 9
	P4C6	a4ß1	38 + 14
	P1D6+P4C2		0

Interessanterweise waren im Gegensatz zu den T-Lymphozyten weder P1D6 noch P4C 2 einzeln gute Inhibitoren der RD-Zelladhäsion an intaktes Plasmafibronectin. Die RD-Zelladhäsion an Fibronectin konnte von P1D6 und P4C2 nur bei gemeinsamer Anwendung effektiv inhibiert werden.

6.2.4. a4ß 1 wirkt als Rezeptor für eine RGD-unabhängige alternative Anheftungsstelle In Fibronectin Die vorangegangenen Ergebnisse (Tabelle III, Tabelle V, Fig. 1, Fig.4) gaben einen deutlichen Hinweis darauf, daß das Anheften einiger Zellen an Plasmafibronectin durch zwei unabhängige Zeiloberflächenrezeptoren, nämlich o.4ß 1 und o.5ß 1, vermittelt wurde. Es wurde umfassend nachgewiesen, daß der Ligand für a5ß 1 in Fibronectin die 80kDa-Zellbindungsdomäne ist, die eine RGD-Sequenz enthält (Pytela, R., Pierschbacher, M.D., und Ruoslahti, E., Cell, 40:191-198). Zur Bestimmung des Fibronectinbereiches, der mit dem a4ß 1 zusammenwirkt, untersuchten wir die Adhäsion von T-Lymphozytenkulturen an verschiedene proteolytische Fragmente von Plasmafibronectin (siehe Fig. 5A und B) sowie die Auswirkungen der monoklonalen Antikörper P1D6 und P4C 2 auf die Lymphozytenadhäsion an diese Fragmente. Wie der Fig. 6 zu entnehmen ist, heften sich Jurkat-, YT- und MoIt 4-Zellen viel effektiver an ein die Heparin (Hep)ll-Domäne enthaltendes 38kDa-Fragment als an ein RGD-enthaltendes Fragment iSOkDa). Jurkat- und MoIt 4-Zellen schließen sich auch dosierungsabhängig an ein anderes die Hep II-Domäne enthaltendes Fragment von 58kDa an. Die maximale Zellanheftung an das 58kDa-Fragment erreichte jedoch nur 30% des bei dem 38kDa-Fragment erreichten Wertes. Dies läßt vermuten, daß das 38kDa-Fragment eine Anheftungsstelle von höherer Affinität für T-Lymphozyten enthält. Die T-Lymphozyten hafteten nicht am N-termir,nle;i 29 kDa-Fragment, das die Hepl-Domäne des Plasmafibronectin enthielt. Generell zeigten frisch gewonnene PBL ein ähnliches Anheftungsverhalten wie Jurkat- oder Molt4-Zellen, und die Fähigkeit von frisch gewonnenen PBL, an das 80kDa-Fragment zu binden, stimmte mit der Expression von a5ß1 überein. Andere hämatopoetische Zellinien, wie K562-Zellen (Fig.6) zeigten eine klare Bevorzugung des 80kDa-Fragments von Fibronectin, während RD-Zellen eine breit gefächerte Adhäsion an alle Fragmente des untersuchten Plasmafibronectin mit Ausnahme des N-terminalen 29 kDa-Fragments aufwiesen. RGDS (1 mg/ml) inhibierte die Jurkatzelladhäsion an intaktes Fibronectin teilweise (50%) und ihre Adhäsion an das 80kDa-Fragment vollständig (100%). Die Jurkat-Zelladhäsion an das 38 kDa-Fragment wurde von RGDS nicht beeinflußt (bis zu 1 mg/ml).

Wie bereits früher dargestellt wurde (Tabelle 3 und Fig. 1), inhibieren monoklonal Antikörper zu o.4ß1 und ct5ß 1 teilweise die T-Lymphozytenadhäsion an intaktes Plasmafibronectin (Fig. 7, oben). Wie erwartet inhibierte P1D 6 die Adhäsion von T-Zellen an das 80kDa-Fragment, das die RGD-Adhäsionssequenz enthält (Fig.7, Mitte), vollständig. P1D6 inhibierte nicht die T-Lymphozytenadhäsion an die 38kDa- (Fig.7, unten) oder 58kDa-Fragmente. Im Gegensatz dazu inhibierte P4C2 die T-Lymphozytenadhäsion an das 38kDa-Fragment vollständig und hatte keine Wirkung auf die Adhäsion an das 80 kDa-Fragment (Fig.7). Weiterhin konnte die Adhäsion von T-Lymphozyten an das 58kDa-Fragment, das auch Hep Il enthält, durch P4C2 inhibiert werden. In jedem Fall verhalten sich andere T-Lymphozyten-Zellinien, die sowohl a4ß 1 als auch a5ß 1 ausprägen (wie z.B. Jurkat-Zellen) genauso wie MoIt 4-Zellen (Fig.7). Gemäß Tabelle 4 prägen K562-Zellen nur a5ß 1 aus. Die Adhäsion von K562-Zellen an die 38Da-(Fig. 6) und 58kDa-Fragmente wurden im Vergleich zu ihrer Adhäsion an das 80 kDa-Fragment stark verringert (Fig. 6). Die Adhäsion dieser Zellen an intaktes Plasmafibronectin (Fig. 1) oder das 80kDa-Fragment konnte durch P1D6 voll: -ändig inhibiert werden. Andererseits haften YT-Zellen, die kein o.5ß 1 ausprägen (Tabelle IV), schlecht an intaktem Plasmafibronectin und dem 80kDa-Fragment (Fig. 6). Diese Zellen brauchen zwei bis dreimal länger als Jurkat- oder Molt4-Zellen, um an plasmafibronectin-beschichtete Oberflächen anzuhaften. YT-Zellen haften jedoch effektiv und in dosierungsabhängiger Form am 38kDa-Fragment (Fig. 6) und die Adhäsion dieser Zellen am 38 kDa-Fragment konnte durch P4C 2 vollständig inhibiert werden. Diese Daten lassen eine direkte Beziehung zwischen der Expression von a4ß 1 und der Fähigkeit vermuten, an Fragmente von Plasmafibronectin anzuhaften, die Hep Il und IIICS-Bereiche enthalten. Außerdem zeigen diese Daten unzweideutig, daß a4ß 1 als Rezeptor für diese alternative Zeiladhäsionsdomäne auftritt.

6.2.5. α4β1 Ist der Lymphozytenrezeptor für CS-1

Die auf der Α-Kette des Plasmafibronectin vertretene IIICS-Region (Fig. 5) enthäl: mindestens zwei Stellen, die für die Vermittlung der Zelladhäsion an Fibronectin verantwortlich sind (Humphries u. a., 1986, J. Cell Biol. 103:2637-2647; Humphries u. a., 1987, J. Biol. Chem. 262: 6886-6892; Humphries u.a., 1988, J. Cell Biol. 106:1289-1297). Durch Nutzung einer Reihe sich überlappender synthetischer Peptide, die die gesamte IIICS-Region (CS-Peptide) überspannten, gelang es Humphries und seinen Mitarbeitern nachzuweisen, daß die CS-1- (N-terminalen) Peptide Adhäsionssequenzen enthielten, die von Mausmelanomzellen erkannt wurden (Humphries u.a., 1986,1987). Wir haben hier nachgewiesen, daß das 38kDa-Fragment eine Adhäsionsstelle von hoher Affinität enthält, der durch Human-T-Lymphozyten erkannt wird, und daß a4ß 1 der Rezeptor ist, der die T-Lymphozytenadhäsion an das 38 kDa-Fragment vermittelt. Dieses Fragment enthält nicht die CS-5-Stelle, jedoch die gesamte CS-1 -Region (Garcia-Pardo u. a., 1987, Biochem. J., 241: 923-928), die als Hochaffinitats-Adhä sionsstelle für Melanomzellen definiert wurde (Humphries u. a,, 1987, J. Biol. Chem. 262:6886-6892). Es war deshalb von Interesse, festzustellen, ob die I-Lymphozyten CS-1 erkennen und daran binden wurden und ob o.4ß 1 der an dieser Wechselwirkung beteiligte Rezeptor war.

T-Lymphozyten (Jurkat- oder MoIt 4-Zellen) erkennen CS-1 (Kaninchen-lgG-Konjugat)-beschirh'ulo Plastoberflächen (Tabelle IV) und heften sich an sie na. T-Lymphozyten-(Jurkat) heften sich nicht an CS-2 (Kaninchen-lgG-KonjugatJ-beschichtete Oberflächen oder an nur mit Kaninchen-lgG beschichtete Plastoberflächen. Weiterhin haben monoklonal Antikörper zu a4ß 1 (P4C2) die T-Lymphozytenadhäsion an CS-1 vollständig inhibiert, während Antikörper zu α 5ß1 (P1D6) absolut keine Wirkung hatten (Tabelle Vl). Wie bereits vorher gezeigt, inhibierten Antikörper zu a4ß 1 vollständig und spezifisch T-Lymphozytenadhäsion an das 38 kDa-Fragment (Tabelle Vl), während die Antikörper zu α 5ß 1 spezifisch die Adhäsion an das RGD-enthaltende 80 kDa-Fragment inhibierten.

Tabelle Vl

Inhibierung der T-Lymphozytenadhäsion an CS-1-Peptlde durch monoklonale Antikörper zu a4ß 1

Ligand	IgG	Antikörper'	P1D6
		P4C2
8OkDa	8 580 + 214	7154 ±398	202 ±105
38kDa	22680±1014	114 ±78	24917 ±352
CS-1	44339 ±513	841 ±555	42 897 ±728
CS-2	2 576 ±214	535 ± 258	435 ±168

6.3. Diskussion

Unter Anwendung der Technologie monoklonaler Antikörper (Wayner, E. A., Carter, W. G„ Piotrowicz, R., und T. J. Kunicki, 1988, J. Cell Biol., 10:1881-1891) haben wir einen neuen Fibronectinrezeptora4ß1 identifiziert. Die monoklonalen Antikörper P3E3, P4C2 und P4G 9 erkennten Epitope auf der a4-Untereinheit und inhibierten vollständig die Adhäsion von T-Lymphocyten aus peripherem Blut und aus Kulturen an ein tryptisches 38kDa-Fragment des Plasmafibronectin, das die carboxyterminale Heparinll-Domäne und einen Teil des Typ-Ill-Verbindungssegments (UCS) enthielt. Als Ligand im HICS für o.4ß1 trat die CS-1-Region auf, die vorher als eine Adhäsionsstelle für Melanomzellen bestimmt wurde. Die funktionell definierten monoklonalen Antikörper zu a4 inhibierten teilweise die T-Lymphozytenadhäsion an intaktes Plasmafibronectin und hatten keine Wirkung auf ihre Anheftung an ein tryptisches 80kDa-Fragment. das eine RGD-Adhäsionssequenz enthielt. Monoklunale Antikörper (P1D6 und P1F8)zu dem vorher beschriebenen Fibronectinrezeptora5ß1 inhibierten die T-Lymphozytenadhäsion an das 80 kDa-Fragment vollständig, hatten jedoch keine Wirkung auf ihre Anheftqng an das 38 kDa-Fragment oder an CS-1. Sowohl a4ß 1 als auch a5ß 1 sammelten sich an Adhäsionsherden, wenn die Fibroblasten, die diese Rezeptoren ausprägen, auf fibronectinbeschichteten Oberflächen gezüchtet wurden. Diese Feststellungen demonstrieren eine spezifische Wechselwirkung beider Rezeptoren mit Fibronectin an Kontaktherden.

Vor kurzem berichteten Bernardi u.a., 1987, supra; Liao u. a., 1987, Exp. Cell, Res., 171: 306-320; Liao u. a., 1989, Exp. Cell Res. 181: 348-361, daß einige B-Lymphozytenzellinien an eine Region des Plasmafibronectin binden, die sich innerhalb der carboxyterminalen Hepll-Domäne befindet. Liao u.a., 1987, supra, identifizierte einen integrinartigen Rezeptor auf B-Zellen. Es ist jedoch nicht ganz klar geworden, ob es sich bei dem von ihnen beschriebenen Protein um a4ß 1, a2ß 1 oder a5ß 1 handelt. Auch Bernardi u.a., 1987, supra, identifizierte durch B-Lymphozyten ausgeprägte Fibronectinrezeptoren. An dieser Studie war interessant, daß die B-Zellen, die sich an Hep Il enthaltende Fragmente hefteten, einen dem a4ß 1 ähnlichen Rezeptor ausprägten, während Zellen, die sich an eine RGD-enthaltende Zeiladhäsionsdomäne hefteten, einen dem a5ß 1 ähnlichen Rezeptor ausprägten. Aufgrund dieser Daten war es aber ebenfalls nicht möglich, den bei der Bindung beteiligten Rezeptor klar zu identifizieren. Zusammengefaßt bieten die Ergebnisse der früheren Studien sowie die jetzigen Ergebnisse klare Beweise dafür, daß I) es eine alternative Adhäsionsdomäne in dercarboxyterminalen Region von Plasmafibronectin gibt, und II) es füra4ß 1 eine Rolle als Rezeptor für diese alternative Adhäsionsstelle gibt. Es wird von Interesse sein, die genauen Aminosäuresequenzen zu bestimmen, die für die Wechselwirkung zwischen a4ß 1 und Fibronectin verantwortlich sind. Da weder die 38kDa- noch die 58kDa-Fragmente oder CS-1 eine RGD-Sequenz enthalten (Kornblihtt u.a., 1985, supra; Carcia-Pardo, 1987, supra; Humphries u.a., 1986, supra; sowie Humphries u.a., 1987, supra), war klar, daß die Beschreibung des Liganden für α4β Ί eine für die Zelladhäsion an Fibronectin wichtige neue Aminosäuresequenz identifizieren würde. Da das 38kDa-Fragment kein CS-5 enthält (Garcia-Pardo, 1987, supra), kann die Mindest-Aminosäuresequenz, die für die T-Lymphozytenadhäsion an 38 kDa verantwortlich ist, und somit der Ligand für a4ß 1 in diesen Zellen nicht Arg-Glu-Asp-Val oder REDVsein (Humphries u.a., 1986, supra). Wiea2ß1 ist auch die a4-Untereinheit nur schwach mit der β 1 -Untereinheit verbunden. Die hier angeführten Daten (Fig. 2) sowie frühere Feststellungen unsererseits (Wayner, E. A., und Carter, W. G., 1987, supra sowie Wayner u. a., 1988, supra) zeigen, daß die funktionell definierten monoklonalen Antikörper zu α 2ß1 unda4ß1 selektiv auf der Grundlage von Imnunpräzipitat von α 2 und a4 ohne β 1 nach Trennung der Untereinheiten mit den auf den α-Untereinheiten vorhandenen Epitopen in Wechselwirkung treten. Die Ergebnisse lassen vermuten, daß die einzigartige α-Untereinheit für die Bestimmung der Spezifität der Ligandbindung

jedes α-β-Komplexes verantwortlich ist. Diese Annahme hat nun durch die hier dargelegten Beobachtungen weitere Unterstützung bekommen, nach denen α 5 sowie σ.4, die beide mit β 1 verknüpft sind, die Adhäsion an bestimmte Stellen des Fibronectin vermitteln. Damit soll nicht gesagt werden, daß die ß-Untereinheit nicht wichtig für die Bindung ist, jedoch darauf hingewiesen werden, daß die Spezifität der Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Ligand durch α oder einen einzigartigen a-ß-Komplex bestimmt wird.

Es ist von Interesse, daß zwar die LAK-Zellen sehr viel ZelloberfIächen-a4ß 1 ausprägten, dieses jedoch nicht als funktioneller Rezeptor aufzutreten schien; P1D6 inhibierte die LAK-Zelladhäsion an Fibronectin vollständig. Ein Grund dafür konnte sein, daß die LAK-Zellen eine degradierte Form von a4 ausprägen (siehe Fig. 2). Außerdem prägen die LAK-Zellen, weil sie aktiviert sind, im Vergleich mit ruhendem peripherem Blut oder mit leukämischen T-Zellen übermäßig viel a5ß laus (Tabelle VIII). Bei andoren Zellen, die größere Mengen a5ß1 also.4ß1 ausprägen (K562-1 und HT1080), dominiert die Adhäsion an die RGD enthaltende 80kDa-Domäne über das ct5ß1 (siehe K562-1 -Zellen, Fig. 6). Dies setzt voraus, daß die Regulierung der Rezeptorexpression die Fähigkeit der Zelle bestimmt, verschiedene Stellen des Fibronectin zu erkennen und daran zu binden. Es ist außerdem auch möglich, daß die Ko-Expression zweier Rezeptoren für Fibronectin das Bestreben zur Zellbindung erhöht- so prägen z. B. Jurkat- und RD-Zellen eine relativ weitgefächerte Adhäsion an Fibronectin im Vergleich zu YT-Zellen aus, die nur a4ß 1 ausprägen. Die Regulierung der Zelladhäsion an Fibronectin ist selbst unter den einfachsten Bedingungen, bei denen davon ausgegangen wird, daß die a5ß 1 und a4ß 1 unabhängig voneinander wirken und sich während der Wechselwirkung mit den beiden Bindungsstellen auf Fibronectin nicht überlappen, potentiell komplex. Vibrationen dieses einfachsten Zustandes eröffnen Möglichkeiten für eine sehr feine Regulierung der Zelladhäsion. Auf dem am wenigsten komplexen Niveau kann diese Regulierung grob wie folgt eingeordnet werden: I) Prozesse, die die Synthese und/oder Exposition der Bindungsstellen auf dem Liganden steuern, sowie II) Regulierung der funktionellen Expression der Rezeptoren. Beispiele für die Regulierung auf beiden Ebenen stehen jetzt zur Verfugung und umfassen die Beobachtung, daß Lymphokine und spezifische Antigene die Expression von a5ß 1 auf T-Lymphozyten hervorrufen, gefolgt von einer erhöhten Zelladhäsion an Fibronectin (Wayner u.a., 1988, supra). Außerdem kann die Kontrolle des Spleißens von mRNA in der IIICS-Region von Fibronectin (Kcrnblihtt u.a., 1985, supra) während der Wundheilung oder Entzündung die Spezifität der Rezeptor-Ligand-Bindung in ruhenden oder aktivierten T-Zellen vorschreiben. Variationen vom einfachen Zustand sind zwar spannend, erfordern jedoch zusätzliche Forschungen, um auch nur ansatzweise die Vielzahl potentieller Mechanismen identifizieren zu können.

Abschließend gesagt zeigen diese Feststellungen deutlich, daß T-Lymphozytenkulturen während des Anheftens an Fibronectin zwei voneinanc ;r unabhängige Rezeptoren benutzen und daß I) o.5ß 1 der Rezeptor für die RGD enthaltende Zeiladhäsionsdomäne ist, und II) a4ß 1 der Rezeptor für die carboxyterminale Zelladhäsionsregion, die die Heparin II- sowie IIICS-Domänen enthält. Weiterhin zeigen diese Daten, daß die T-Lymphozyten einer Region molekularer Heterogenität in IHCS (CS-D klar den Vorzug geben, die durch alternatives Schleißen der Fibronectin-prä-mRNA gewonnen wurde, und daß a4ß 1 der Rezeptor für diese Adhäsionsstelle ist.

7. Beispiel: Lymphozytenadhäslon an aktiviertes Endothel wird durch die Bindung des Integrlnrezeptors a4ß1 anCS-1 Inder alternativ gespleißten IIICS-Reglon des Fibronectin vermittelt.

Die folgenden Experimente zeigten die Rolle des α4ß 1 -Rezeptors und seines Liganden, CS-1, bei der Vermittlung der T-Zelladhäsion an Endothelzellkulturen großer Gefäße sowie Endothelzellen, die durch eine Vielzahl von mit der Entzündungsreaktion in Zusammenhang stehenden Zytokinen aktiviert wurden, einschließlich IL-I, des Tumornekrosefaktors Alpha (TNFa) sowie des Tumornekrosefaktors Beta (TNFß). Außerdem wurde die Fähigkeit monoklonaler Antikörper und Peptidfragmente d< nonstriert, die Haftung von Lymphozyten an das Endothel über den a4ß 1 -Rezeptor zu blockieren.

7.1. Materialien

7.1.1. Reagenzien

Reagenzien wurden gemäß der Beschreibung in Abschnitt 6.1.1., supra, angewandt.

7.1.2. Zellen und Zellkulturen

Jurkat-Zellen (Human-T-Zellenleukämie) wurden von Dr. Paul Conlon erhalten (Immunex. Corp., Seattle, WA), Ramos (Human-B-Zellenleukämie) wurden von der American Type Culture Collection erhalten (Rockville, MD). Die LAD-(Leukozytenadhäsionsmangel) sowie ST-1-B-Zellinien wurden durch Epsten-Barr-Virustransformation von Human-B-Lymphozyten yewonnen. Die LAO-Zellinie wurde aus B-Zellen eines Patienten entwickelt, der einen Mangel bezüglich der β 2-lntegrinfamilie von Adhäsionsrezeptoren aufwies. Sie wurden von Dr. John Harlan (Harborview Medical Center, Seattle, WA) erhalten. Human-Nabelvenen-Endothelzellen (HUVE) wurden von Cell Systems, Seattle, WA käuflich erworben. HUVE wurden in definierten Medien (serumfrei) aufbewahrt, die ebenfalls von Cell Systems erworben wurden (CS-100 Medien).

7.1.3. Aktivierung von HUVE mit inflammatorischen Zytokinen

HUVE wurden mit IL-I β (1 ng/ml) oder in einigen Versuchen mit INFa (10ng/ml) für 6 bis 24 Stunden inkubiert. Nach Ende dieser Inkubation wurden die Monolayer gewaschen und in der Adhäsionsprüfung verwendet.

7.1.4. Synthese von CS-Peptlden

Die von der CS-1 -Region des Plasmafibronectin gewonnenen Peptide wurden synthetisiert und gemäß den Standardprotokollen von Dr. James Blake von der Oncogen Corp., Seattle, WA, HPLC-gereinigt. Ebenfalls gemäß den Standardprotokollen von Dr. James Blake wurden die CS-1-Peptide auf Kaninchenserumalbimun oder KLH konjugiert. Das RGDS-Kontrollpeptid erhielten wir von den Peninsula Laboratories (Belmont, CA).

7.1.5. Monoklonal Antikörper

Die folgenden Antikörper wurden in diesem Laboratorium entwickelt: P1H 5, das den α 2ß 1 -Rezeptor erkennt (Wayner u. a., 1987, J. Cell Biol., 105:1873-1884); Waynor u. a. 1988, J. Cell Biol., 107:1881-1891); P1B5, das den o.3ß 1 -Rezeptor erkennt (supra); P1D6, das den α5ß 1-Prototypen des Fibronectinrezeptors gemäß Beschreibung durch Pytela u.a. erkennt (Cell, 40:191-198); P4C10, das die β 1-Untereinheit erkennt; sowie P4H9, das β2 (CD 18) erkennt, unter Anwendung der von Wayner u.a. (1987, J. Cell Biol., 105:1873-1884) sowie Wayner u.a., 1988, J. Cell Biol., 107:1881-1891) vollständig beschriebenen Methoden, die hier in ihrer Gesamtheit bezugnehmend eingeschlossen und in Tabelle dargestellt sind.

7.1.6. Prüfung der Endothelzellenadliäslon

Human'Nabelvenen-Endothelzellen (HUVE) wurden, wie beschrieben, in Platten mit 48 Vertiefungen kultiviert. Für eine Messung der Haftung von Lymphozyten an HUVE-Monolayer-Kulturen wurden die Lymphozyten mit Na₂ ⁶¹CrO₄ (50 pCi/ml) 2 bis 4 Stunden lang markiert, gewaschen, und dann wurden 10⁵ Lymphozyten mit HUVE-Monolayers in Gegenwart oder Abwesenheit inhibierender Antikörper oder von CS-1 abgeleiteter Peptide inkubiert. Die Lymphozyten konnten 30 Minuten lang bei 37⁰C anhaften. Nichthaftende Zellen wurden abschließend durch Waschen mit PBS entfernt und die haftenden Zellen wurden in SDS/NaOH gelöst. Gebundenes ^eiCr-cpm wurde in einem Gammazählgerät quantifiziert. In einigen Versuchen wurden die Endothelzellen vor der Adhäsionsprüfung durch Inkubation mit IL-I β (1 ng/ml) oder TNF-ß (10ng/ml) 6 bis 14 Stunden lang in einem definierten CS-100-Medium (Cell Systems, Seattle, WA) inkubiert.

7.2. Ergebnisse

7.2.1. Oberflachen-Phanotyp von Lymphozyten von normalen und von LAD-Patlenten

Zur Ermittlung des von den Lymphozyten während des Blutaustritts benutzten Mechanismus bestimmten wir zuerst den Oberflächen-Phänotyp normaler Lymphozyten sowie von LAD-Lymphozyten hinsichtlich der Integrinrezeptoren. Diese Daten

sind in Tabelle VII angegeben und zeigen deutlich, daß die LAD-Zellen einen normalen Oberflächen-Phänotyp in bezug auf die β 1enthaltenden Integrine aufweisen. Da, wie erwartet, die vom LAD-Patienten gewonnenen B-Zellen bezüglich β 2 negativ waren,konnte stark vermutet werden, daß LAD-Lymphozyten die β 1 enthaltenden Integrine während ihrer Adhäsion an sowie der

Wanderung durch das Endothel benutzen. Tabelle VII Fluoreszenzanalyse der Integrinrezeptoroxpression bei normalen und LAD-Lymphozyten

Fluoreszenzintensität' Rezeptor Antikörper Jurkat(T) Ramos (B) ST-1 LAD

ß2	P4H9
ß1	P4C10
a2	P1H5
c3	P1B5
a.4	P4G9
a5	P1D6

a Die Fluoreszenzintensität wurde auf einer Dreidekaden-Iog-Skala ermittelt und Ist In Schiedselnheiten ausgedrückt, bei denen jedes Plus80 Einheiten von O-25S darstellt (Kanalzahlen). Ein Plus/Minus zeigt eine definierte und reproduzierbare Verschiebung über den Hintergrund an «50 Einheiten).

Tabelle VIII Adhäsion von T- und B-Lymphozyten Ruhende und aktivierte HUVE Monolayer

Zellinie	Adhäsion (cpm)*	IL-1ß
	Basal	94580
LAD(B)	29360	143860
ST-1 (B)	11572	11168
Ramos(B)	1088	352028
Jurkat(T)	74196	189384
YT(T)	43396

a cpm = Zählungen pro Minute. Die Angaben stammen aus einem einzigen repräsentativen Experiment.

7.2.2. Fähigkeit von Lymphozyten zur Haftung an ruhende und aktivierte Endothelzellen

Chrom-markierte Lymphozyten aus verschiedenen Zellinien wurden in bezug auf ihre Fähigkeit getestet, sich an ruhende oder aktivierte Endothelzellen anzuhaften (Tabelle VII).

Obwohl festgestellt wurde, daß alle getesteten Zellinien bis zu einem gewissen Grade an ruhendem Endothel hafteten, war die Adhäsion von T- und B-Lymphozyten an durch IL-I oder TNF aktiviertem Endothel viel stärker, sogar etwa zehnmal so stark. Die Lymphozytenadhäsion von LAD-Patienien an das Endothel unterschied sich nicht wesentlich von der aus normalen B-Zellen (ST-1) gewonnenen ST-1-Zellinien. Zwischen den Zellinien gab es in bezug auf die Adhäsion an IL-1 gegenüber TNF-aktiviertem Endothel keine Unterschiede.

7.2.3. Wirkung von Anti-Rezeptor-Antikörpern auf die Lymphozytenhaftung an das Endothel

Bei Prüfung der Fähigkeit von Chrom-markierten Lymphozyten zur Haftung am Endothel in Gegenwart von Hybridomüberständen wurde festgestellt, daß nur auf o.4ß1 oder β 1 gerichtete monoklonal Antikörper die Adhäsion inhibierten; auf andere Rezeptoren, wie den Prototyp des Fibronectinrezeptors und den a3ß 1 -Rezeptor gerichtete monoklonale

Antikörper hatten praktisch keine inhibierende Wirkung (Tabelle 8). In Gegenwart d r monoklonalen Antikörper P4C 2 (auf a4ß 1 gerichtet) sowie P4C10 (auf ß1 gerichtet) wurde die Adhäsion markierter Lymphozyten an das Endothel vollständig unterbunden. Interessanterweise wurde die Adhäsion von LAD-Zellen auch durch den Anti-a4ß 1-Antikörper (P4C2) inhibiert, was darauf hindeutet, daß der CD 18-Rezeptor nicht an den beobachteten Haftungseigenschaften beteiligt ist. Außerdem inhibierten die Antikörperzu diesen Rezeptoren die Lymphozytenadhäsion an entweder basaie oder aktivierte HUVE nicht (siehe Tabelle IX), obwohl α 2ß 1, α 5ß 1 (Tabelle VIII) sowie β 2 (nicht dargestellt) durch die Lymphozyten ausgeprägt werden. Diese Daten zeigen, daß die Oberflächenexpression eines Integrinrezeptors und die Bindung eines inhibierenden Antikörpers an diese nicht notwendigerweise zur Inhibierung der Lymphozytenbindung an das Endothel führt. Dies setzt eine spezifische RoIh des o.4ß 1 bei der Vermittlung der Lymphozyten adhäsion an das Endothel als ersten Schritt des Blutaustritts voraus. Weiterhin ist festzustellen, daß die Tatsache, daß die aui'o.4ß 1 gerichteten Antikörper die Lvmphozytenadhäsion an Endothelzellen inhibieren, vermuten läßt, daß der Ligand für a4ß 1, die Aminosäuresequenz EILDVPST (siehe Tabelle XII) ebenfalls an der Lymphozytendiapedese beteiligt ist, indem a4ß 1 an diese in einem Liganden vorhandene Sequenz, die an der Oberfläche des Endothels ausgeprägt ist, gebunden wird.

Tabelle IX

Wirkung inhibitorischer monoklonaler Antikörper auf die Lymphozytenadhäsion an HUVE-Monolayer (IL-1 ß-aktiviert)

Zellreihe	Antikörper	Spezifizität	Basal	Adhäsion (cpm)
			19542	+11-1 β
LAD(B)	SP2	—	15688	104672
	P1D6	O.5ß1	19064	113696
	P1B5	a2ß1	6458	90912
	P4C2	o.4ß1	6360	38132
	P4C10	ß1	972	52 552
Ramos (B)	SP2		808	12157
	P1D6	a5ß1	124	11196
	P1B5	a2ß1	456	10028
	P4C2	o.4ß1	604	3688
	P4C10	ß1	83924	3152
Jurkat(T)	SP2		83956	?·>2159
	P1D6	o.5ß1	66580	:7588
	P1B5	a2ß1	23108	4C9952
	P4C2	o.4ß1	36892	136632
	P4C10	ß1	230416

7.2.4. Die Rolle von CS-1 als Ligand zu a4ß 1 bei der Lymphozytenadhäsion an das Endothel Die Fähigkeit von synthetischem CS-1 und Peptidderivaten zur Inhibierung der Haftung von Chrom-markierten Lymphozyten an aktivierte Endothelzslten wurde unter Verwendung verschiedener Peptide bewertet. Das synthetische CS-1-Peptid erwies sich als starker Inhibitor der Adhäsion von T- oder B-Lymphozyten an basaie oder aktivierte Endothelzellen-Monolayer (Tabelle X und Xl). Interessanterweise stellte die EILDVPST-Sequenz gleichfalls das Mindestpeptid für die Inhibierung der Lymphozytenadhäsion an ruhende oder aktivierte HUVE dar (Tabelle X und Xl). In einigen Fällen, wie z. B. bei der Ramos-B-Zellinie, konnte die Adhäsion dieser Zellen an HUVE sogar vollständig durch EILDVPST-Peptide unterbunden werden. In Kontrollversuchen (Tabelle Xl) inhibierte die RGDS-Sequenz als Ligand für den Prototyp des Fibronectinrezeptors a5ß 1 die Lymphozytenadhäsion an ruhende oder aktivierte HUVE nicht.

Tabelle X

Wirkung von CS-1 und der von CS-1 abgeleiteten Peptide auf die Lymphozytenadhäsion an HUVE

Zellinie	Peptide*	Sequenz	Adhäsion (cpm)	Basal	+IL-1β
			20856	74096
LAD(B)	293 A	Ohne Beziehung	17500	26172
	344	CS-1	ND'	42728
	350	VpST	ND	29484
	352	EILDVPST	ND	27219
	354	GPEILDVPST	4856	11132
Ramos (B)	293 A	Ohne Beziehung	1660	2828
	344	CS-1	ND	4568
	350	VPST	ND	2584
	352	EILDVPST	ND	2265
	354	GPEILDVPST	58084	129864
Jurkat(T)	293 (A)	Ohne Beziehung	29568	75772
	344	CS-1	ND	127544
	350	VPST	ND	93056
	352	EILDVPST	ND	89721
	354	GPEILDVPST

'ND = nicht ermittelt

Tabelle XI

Wirkung von CS-1 und der von CS-1 abgeleiteten Peptide oder RGDS auf die LymphozytenadhSslon an HUVE

Zollinie Peptide # Sequenz Adhäsion (cpm) Basal +IL-I B

Jurkat(T) - -

RGDS

344 CS-1

350 VPST

351 LDVPST

352 EILDVPST LAD(B)

RGDS 344 CS-1

350 VPST

351 LDVPST

352 EILDVPST Ramos (B)

RGDS 344 CS-1

350 VPST

351 LDVPST

352 EILDVPST

Tabelle Xl

Inhibierung der Lymphozytenadhäsion an Fibronectin durch von CS-1-B12 abgeleitete Peptide

161092	314848
298688	357616
82404	248976
203716	322 208
166948	326200
84456	234796
44860	71408
70652	102076
22976	51560
38176	98860
39700	92 792
29964	58784
2724	12936
16920	28104
1844	5160
4168	15320
3532	15092
1696	4964

Peptid Sequenz Inhibierung

CS-1	DELPGLVTLPHPN
A13	LHGPEILDVPST
B13	VPST
350	LDVPST
351	EILDVPST
352	GPEILDVPST
354

7.3. Diskussion

Experimentolle Beobachtungen ließen stark vermuten (siehe Abschnitt 6, supra), daß sich die Hochaffinitäts-Bindungsstelle für T-Lymphozyten in Plasmafibronectin in der CS-1-Region der IIICS-Domäne befand. Die CS-1-Region umfaßt 25 Aminosäuren (Fig. 9). Es war deshalb wichtig, die Mindestpeptidsequenz zu ermitteln, die für die Bindung des Lymphozyten-a4ß 1-Rezeptors an Fibronectin verantwortlich ist. In einem ersten Schritt teilten wir das CS-1 -Peptid in zwei kleinere Peptide A13 und B12 (Fig. 9) auf und untersuchten, ob eines dieser Peptide sich mit Fibronectin bei der Bindung des a4ß 1-Rezeptors messen konnte und somit die Lymphozytenadhäsion an Fibronectin inhibieren konnte. Die Daten wiesen deutlich darauf hin, daß die inhibierende Wirkung in dem von dem carboxyterminalen Abschnitt des CS-1 gewonnenen B12-Peptid liegt. In einem nächsten Schritt untersuchten wir die Fähigkeit immer längerer Peptide, die vom carboxyterminalen Bereich von B12 abgeleitet waren, zur Inhibierung der Lymphozytenadhäsion an Fibronectin sowie an CS-1-(RSA-Konjugat)-beschichtete Oberflächen. Diese Daten zeigten, daß in bezug auf die Lymphozytenadhäsion an Plasmafibronectin und CS-1 die für die Bindung von α4 β 1 erforderliche Mindestaminosäuresequenz EiLDVPST ist.

Polymorphkernige Leukozyten (Neutrophile) von Patienten mit Leukozytenadhäsionsschädigung (LAD) weisen einen Defekt bei der Expression der β 2-lntegrinuntereinheit auf und können deshalb nicht die β 2 enthaltenden Rezeptoren (LFA-1, Mac-1 oder ρ 150/95) bei ihrer Adhäsion an das vaskuläre Endothel benutzen. Deshalb verlassen Neutrophüe von diesen Patienten nicht den Blutstrom, um in das periphere Gewebe einzudringen. LAD-Lymphozyten jedoch machen eine Diapedese durch, um das Endothel zu durchqueren, und können auch im Gewebe von Patienten mit dieser Schädigung gefunden werden. Dies läßt darauf schließen, daß die Lymphozyten während ihrer Wanderung aus dem Blutstrom in das periphere Gewebe einen von den β 2 enthaltenden Integ, inen abweichenden Mechanismus anwenden. Die folgende Reihe von Experimenten faßt unsere Versuche zusammen, den durch die Lymphozyten aus peripherem Blut während der Diapedese benutzten Mechanismus vollständig zu verstehen.

Die supra beschriebenen Experimente haben deutlich die wichtige Rolle aufgezeigt, die der α4 β 1 -Rezeptor bei der Adhäsion von Lymphozyten an vaskuläre Endothelzellen spielt.

Es konnte durch Fluoreszenzanalyse nachgewiesen werden, daß alle getesteten Lymphozyten-Zelliniena4ß1 und/oder a5ß1 ausprägten, und es wurde beobachtet, daß sie an Human-Nabelvenen-Endothelzellkulturen anhafteten. Es wurde festgestellt, daß diese Adhäsion nur durch monoklonal Antikörper blockiert wurde, welche auf a4ß 1 gerichtet waren; Antikörper, die auf andere Rezeptoren gerichtet waren, zeigten im Grunde genommen gar keine inhibierende Wirkung, wodurch die Bedeutung des α4 β 1-Rezeptors für die adhäsive Wechselwirkung zwischen Lymphozyten und Endothel unterstrichen wird. Außerdem wurde festgestellt, daß synthetisches CS-1 sowie Peptidderivate (Tabellen 9,10 und 11) die Adhäsion von Lymphozyten an das Endothel inhibieren. Die Aminosäuresequenz EILDVPST spielte für diese Wechselwirkung eine besonders

wichtige Rolle. Es muß betont werden, daß nicht festgestellt werden konnte, ob der Lymphozyten-a4ß 1 -Rezeptor wirklich mit dem Fibronectin auf der Endothelzelloberfläche in Wechselwirkung tritt. Es ist ebenfalls möglich, daß α4β 1 das Peptid EILDVPST oder eine ähnliche Sequenz im Zusammenhang mit einem anderen, nicht-Fibronectin-Protein erkennt.

8. Hinterlegung von Zelllnlen

Die folgenden Zellinien wurden bei ATCC, Rockville, MD hinterlegt und mit den folgenden Zugriffsnummern versehen:

Zellinie'	Zugriffsnummer
P4C2	HB-10215
P4G9	HB-10213
P3E3	HB-10212
P4C10	HB-10214

Diese Erfindung ist in ihrem Anwendungsbereich nicht beschränkt auf die durch Beispiele erläuterten Gene und Proteine oder die hinterlegten Mikroorganismen, die nur als Einzelillustrationen eines Aspekts der Erfindung dienen sollen. So werden dem Fachmann aus der vorangegangenen Beschreibung und den dazugehörigen Figuren verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen deutlich werden. Solche Modifikationen sollen durch die Patentansprüche mit erfaßt sein.

Claims

1. Verfahren zur Inhibierung der Lymphozytenhaftung an Endothelzellen, das die Behandlung der Lymphozyten mit einer wirksamen Menge eines Antikörpers oder eins Fragments oder eines Derivats von ihm umfaßt, welcher eine Bindung an a4ß 1 eingeht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper P4C2 ist, der bei ATCC hinterlegt wurde und die Zugiiffsnummer HB-10215 erhielt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eine Bindung an β 1 eingeht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper P4C10 ist, der bei ATCC hinterlegt wurde und die Zugriffsnummer HB-10214 erhielt.

6. Verfahren zur Inhibierung der Lymphozytenhaftung an Endothelzellen, bei dem die Lymphozyten mit einer wirksamen Menge von Peptiden behandelt werden, die an a4ß 1 eine Bindung eingehen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid an einen auf Endothelzellen gerichteten Antikörper konjugiert ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil der III CS-Region des Fibronectin oder eines Derivats davon umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil der CS-1 -Region des Fibronectin oder eines Derivats davon umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil der Sequenz EILDVPST, eines Derivats davon oder einer im wesentlichen homologen Sequenz umfaßt.

11. Antikörper, Antikörperfragment oder Derivat davon, der (das) zur Inhibierung der Lymphozytenhaftung an Endothelzellen benutzt werden kann.

12. Antikörper, Fragment oder Derivat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er (es) eine Bindung an den a4ß1-Rezeptor eingeht.

13. Antikörper nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.

14. Antikörper nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er P4C2 ist, von dem bei ATCC hinterlegten Hybridom gewonnen wurde und die Zugriffsnummer HB-10215 erhielt.

15. Antikörpernach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er P4C10 ist, der von dem bei ATCC hinterlegten Hybridom gewonnen wurde und die Zugriffsnummer HB-10214 erhielt.

16. Antikörper, Fragment oder Derivat davon, der (das) ein durch den monoklonalen Antikörper P4C2 definiertes Epitop erkennt.

17. Antikörper, Fragment oder Derviat davon nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß er (es) die Bindung des monoklonalen Antikörpers P4C2 kompetitiv inhibiert.

18. Antikörper, Fragment oder Derivat davon, der (das) ein durch den monoklonalen Antikörper P4C10 definiertes Epitop erkennt.

19. Antikörper, Fragment oder Derviat davon nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß er (es) die Bindung des monoklonalen Antikörpers P4C10 kompetitiv inhibiert.

20. Pharmazeutische Zusammensetzung, bestehend aus einer wirksamen Konzentration eines Antikörpers, eines Antikörperfragments oder eines Derivats davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem pharmakologisch geeigneten Trägermaterial die Haftung eines extrazellulären Matrixrezeptors auf Lymphozyten an Enothelzellen inhibiert.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, das Fragment oder das Derivat davon eine Bindung an den a4ß1-Rezeptor eingeht.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper P4C2 ist, von einem bei ATCC hinterlegten Hybridom gewonnen und nut der Zugriffsnummer HB-10215 versehen wurde.

24. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper P4C10 ist, der von einem bei ATCC hinterlegten Hybridom gewonnen und mit der Zugriffsnummer HB-10214 versehen wurde.

25. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Konzentration eines Peptide umfaßt, das in einem pharmakologisch geeigneten Trägermaterial die Lymphozytenhaftung an Endothelzellen inhibiert.

26. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine Bindung an α4β Ί eingeht.

27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil des III CS-Bereiches von Fibronectin oder eines Derivates davon umfaßt.

28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil der CS-1-Region von Fibronectin oder eines Derivats davon umfaßt.

29. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil der EILDVPST-Sequenz, eines Derviats davon oder einer im wesentlichen homologen Sequenz umfaßt.

30. Verfahren zur Verhinderung der Lymphozytenmigration in Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß eine wirksame Menge des Antikörpers oder eines Fragments oder eines Derivats davon verabreicht wird, der (das) die Lymphozytenadhäsion an die Endothelzellen über einen extrazellulären Matrixrezeptor bei einer behandlungsbedürftigen Person verhindert.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, das Fragment oder Derivat eine Bindung mit a4ß 1 eingeht.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper P4C2 ist, der bei ATCC hinterlegt und mit der Zugriffsnummer HB-10215 versehen wurde.

34. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper P4C10 ist, der bei ATCC hinterlegt und mit der Zugriffsnummer HB-10214 versehen wurde.

35. Verfahren zur Verhinderung der Lymphozytenmigration in Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß eine wirksame Menge eines Peptids in einem pharmakologisch geeigneten Trägermaterial verabreicht wird, die die Lymphozytenadhäsion an Endothelzellen bei einer behandlungsbedürftigen Person verhindert.

36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine Bindung mit a4ß 1 eingeht.

37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil der IIICS-Region des Fibronectin oder eines Derivats davon umfaßt.

38. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil der CS-1-Region des Fibronectin oder eines Derivats davon umfaßt.

39. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid mindestens einen Teil der EILDVPST-Sequenz, eines Derivats davon oder einer im wesentlichen homologen Sequenz umfaßt.