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JP3218039B2 - 硫酸化多糖類，それらの調製法，医薬組成物および使用 - Google Patents

硫酸化多糖類，それらの調製法，医薬組成物および使用

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JP3218039B2
JP3218039B2 JP51382593A JP51382593A JP3218039B2 JP 3218039 B2 JP3218039 B2 JP 3218039B2 JP 51382593 A JP51382593 A JP 51382593A JP 51382593 A JP51382593 A JP 51382593A JP 3218039 B2 JP3218039 B2 JP 3218039B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、低分子量多糖類の分野に関する。より具体
的には、本発明は、優れた薬理学的および抗血栓症的性
質を有するオリゴ糖組成物に関する。
抗血栓症治療は、一般に２つの大きな部門の薬物、す
なわち抗凝固剤および抗血小板剤を使用する。
抗凝固剤には、抗ビタミンＫ化合物が、非常に重要な
ファミリーを構成する。これらの化合物は、経口により
作用するので、それらは、多数の適応症において使用さ
れる。しかしながら、それらの使用は、ある種の短所に
よって、そして特にそれらが引き起こす出血の危険なら
びにその投薬を長期治療に適応させることの困難におい
て、今なお制約を受ける。
ヘパリンは、抗凝固剤の第２の部門を構成する。それ
らは、種々の鎖長および硫酸化度をもつオリゴ糖からな
るグリコサミノグリカンのファミリーから抽出される生
物的物質である。より正確には、無分画ヘパリンを構成
している鎖の分子量は、一般に2,000〜40,000ダルトン
の範囲にわたっている。ヘパリンは、種々のタイプの血
栓症、特に静脈血栓症の治療および予防に、できれば他
の治療法と組み合わせて使用される。
ヘパリンの短所は、出血を生じることもあるそれらの
高い抗凝結活性、ならびに比較的高投与量の使用を必要
とする血小板因子４のようなある種の血液阻害因子への
それらの感受性に存在する。
さらに、ヘパリンは、非常に不均一な産物である。従
って、それらの作用機構を評価すること、ヘパリンの総
活性における各成分の寄与を算定することは困難であ
り、そのため副作用の増大なしに抗血栓症活性を増大さ
せることが困難である。この分野の科学的知見の発展
は、これらのオリゴ糖の生物学的性質、言い換えれば血
液凝固への効果、ならびに薬理学的性質、言い換えれば
生体内での抗血栓症活性が、それらの分子量によって変
化するということを明らかにして来た。
前述の短所の最初の解決は、低分子量のヘパリンによ
ってもたらされた。これらのヘパリンは、分子量が、一
般に2,000〜10,000ダルトンの間に分布される硫酸化オ
リゴ糖の混合物である。これらのヘパリンは、ヘパリン
のオリゴ糖鎖の分画によって（例えば、“Barrowcliffe
et al.,Thrombosis research 12（1977）27−36"によ
るゲル浸透によって）、または化学的もしくは酵素的薬
剤を用いるヘパリンのオリゴ糖鎖の断片化（低分子化）
によって得られる。特に、その低分子化は、強塩基の存
在下でのヘパリンエステルの処理によって作出された
（欧州特許第40144号）。また、それは、亜硝酸の存在
で、またはヘパリナーゼの作用によってヘパリンを処理
することによって実施することもできる（欧州特許第64
452号）。これらの種々の方法は、ヘパリンを構成する
多糖類の一般的構造をもつが、低い平均分子量をもつオ
リゴ糖混合物を生成する。これらの改変は、一般に、良
好な生物学的利用能および無分画ヘパリンに比較して出
血への最小の影響において反映される。
より具体的には、研究努力は、基本的に、非常に短い
オリゴ糖鎖をもつヘパリンから得られる混合物に向けら
れてきた。かくして、欧州特許第27089号は、８糖単位
以上を含まないヘパリンから得られるオリゴ糖の混合物
が、ヘパリンより優れた特異的な抗血栓症活性を有する
ことを示している。同様の方法で、ヘキサ糖が調製さ
れ、それらの抗血栓症が研究された（欧州特許第64452
号）。また、ヘパリンから得られるヘキサー，ペンター
およびテトラ糖のような多糖類に関するより最近の特
許、欧州特許第84 999号および欧州特許第301 618号を
挙げることもできる。
しかしながら、これまで記載された生産物は、ヘパリ
ンに関わる問題を全般的に満足できるように解決するこ
とはできなかった。特に、低分子量ヘパリンの多くは、
ヘパリンよりも６倍以上も低いトロンビンに対する阻害
作用（抗II a活性）をもっている。ウサギにおけるウエ
スラー（Wessler）の標準血栓症モデルのようなモデル
における実験では、抗血栓症投与量は、ヘパリンのそれ
よりも非常に大きいものである。
今や、本発明者は、天然もしくは低分子化されたヘパ
リンから、優れた生物学的および薬理学的性質、そして
結果的に良好な治療能力をもつオリゴ多糖の混合物が得
られることを明らかにした。
事実、本発明者は、意外なことに、分子量分布につい
て、5,400〜7,800ダルトンの間の分子量の硫酸化オリゴ
糖が70％に等しいかより多く、そして6,900ダルトン以
上の分子量の硫酸化オリゴ糖が少なくとも５％である比
率と、そして約60IU/mg以上、好ましくは約70IU/mgに等
しいかそれ以上の抗II a活性を有することを特徴とする
オリゴ糖の混合物が調製される場合に、この調製品が、
良好な生物学的利用能および低分子量ヘパリンの出血に
ほとんど無影響という長所を保持するが、トロンビンに
対して阻害力を増大するという付加的な長所、そして少
なくとも同等の作用持続性のあるより優れた抗血栓症活
性を有すること、を見出だした。
かくして、本発明の一つの主題は、ヘパリンを構成し
ているオリゴ糖の一般構造を有する硫酸化オリゴ糖の混
合物であって、分子量5,400〜7,800ダルトンを有するオ
リゴ糖が少なくとも70％を占め、そして分子量6,900ダ
ルトン以上を有するオリゴ糖が少なくとも５％を占め、
そして約60IU/mg以上、好ましくは約70IU/mgに等しいか
それ以上の抗II a活性を有することを特徴とする混合物
にある。
そのような混合物は、初めて、無分画ヘパリンの長所
と低分子量ヘパリンの長所を合わせ持つ。
天然のヘパリンと比較して、本発明の混合物は、その
上に、血小板因子４のような血液阻害因子に対して顕著
に低い活性をもち、その治療能力を増大させる。
本発明の混合物のその他の長所は、特に、血小板減少
作用のようなある種の望ましくない副作用の低減にあ
る。ヘパリンから得られた既知の混合物の欠点の一つ
は、それらが血小板数の低下を起こすことから生じる。
この望ましくない影響は、本発明の混合物が使用される
場合には、強力に減少される。
上記の性質は、特別に効果的な薬理学的使用、特に静
脈および動脈血栓症の予防および治療における使用を可
能にする。加えて、それらは、出血の危険を増大するこ
となしに、生体内でのより大きい投与量の使用を可能に
するであろう。
本発明の混合物は、より好ましくは、6,900ダルトン
以上の分子量をもつオリゴ糖少なくとも10％を含有す
る。
さらに、好適な本発明の混合物は、5,700〜7,500ダル
トンの分子量をもつオリゴ糖少なくとも60％を含有す
る。
なお一層好ましくは、本発明の混合物は、5,700〜6,9
00ダルトンの分子量をもつオリゴ糖少なくとも60％を含
有する。
さらに、本発明の混合物の抗II a活性は、好ましく
は、それらの抗X a活性より低いことである。
好適な態様において、本発明の混合物は、低分子化ヘ
パリンのより特別な画分である。先に示したように、低
分子化ヘパリンは、ヘパリンのオリゴ糖鎖の分断を可能
とする当業者に公知のいかなる化学的、酵素的もしくは
その他の技術によっても得ることができる。特に、特
許、欧州特許第40144号、欧州特許第64452号、欧州特許
第37319号もしくは欧州特許第337327号に記載された方
法が、本発明のために適切である。
なお一層好ましくは、本発明の混合物は、それらの一
つの末端において２−Ｏ−スルホ−４−エノピラノスル
ホン酸をもつオリゴ糖からなる。
特別に有用な混合物は、ヘパリンエステルに対する塩
基の作用によって低分子化されたヘパリン画分からな
る。
本発明のその他の主題は、先に定義されたような混合
物の調製方法に関するものであって、ヘパリンもしくは
低分子化ヘパリンがゲル濾過によって分画されることを
特徴とするものである。
本発明の方法は、数種のパラメーターを必要とするも
のであって、その制御が、最終混合物の分子量および分
子量分布の算定を可能とする。特に、これらのパラメー
ターは、溶出液のイオン強度および使用される支持体の
性質である。
さらに、好ましくは、その分画は、（ｉ）出発材料の
ヘパリンもしくは低分子化ヘパリンをその溶出液に溶解
すること、（ii）かくして得られた溶出液を、同じ溶出
液で予め平衡にされた、少なくともゲル濾過用の固体支
持体を含有するカラムを通過させること、そして（ii
i）望ましい分子量の画分を回収することからなる段階
が、連続的に実施されることを特徴とする。
本発明の特別な実施態様においては、低分子化ヘパリ
ンが出発ヘパリンとして使用される。そのようなヘパリ
ンは、特許、欧州特許第40144号、欧州特許第64452号、
欧州特許第37319号もしくは欧州特許第337327号に記載
された方法に従って得ることができる。
なお一層好ましくは、例えば欧州特許第40144号に記
載された技術によるような、ヘパリンエステルに対する
塩基の作用によって低分子化されたヘパリンが使用され
る。具体的には、その低分子化は、水性媒体もしくは不
活性有機溶媒中で、例えば水酸化ナトリウムもしくは水
酸化カリウム、アルカリ金属炭酸塩もしくは第３級アミ
ン（トリエチルアミン、トリエチレンジアンミン等）の
ような有機もしくは無機塩基の作用下で実施することが
できる。そのエステルに対する塩基の作用は、その一般
構造を変化させることなしに、ヘパリンの部分的および
制御された低分子化を遂行することを可能とする。
本発明の方法において使用される溶出液としては、種
々のタイプの生理食塩液、例えば塩化ナトリウム溶液を
挙げることができる。しかしながら、本発明者は、最良
の性質をもつ画分を得るために、特に、リン酸カリウ
ム、リン酸ナトリウムもしくはNH4H2PO4のようなリン酸
バッファーから選ばれる溶出液を用いて分画を行うこと
が、特に有利であることを明らかにした。また、優れた
特性の混合液が得られるNaClO4もしくはNH4NO3の溶液を
使用することもできる。その溶出液の濃度、およびその
イオン強度は、望ましい最終混合液に適応される。特
に、溶出液の濃度は、1M以下そしてより一層好ましく
は、0.1〜0.5Mが好都合である。
リン酸バッファーが使用される場合には、0.2Mに近い
濃度で行うことが、特に好都合である。
本発明の方法の第２段階においては、使用される支持
体は、一般に、出発産物（天然、低分子化等のヘパリ
ン）の平均分子量、目的の最終産物、および使用される
溶出液中の出発混合物の挙動によって選択される。ポリ
アクリルアミド−アガロースタイプのゲルは、支持体と
して有利に使用される。例を挙げれば、ゲルAcA54、AcA
202、セファデックスG25もしくはG50、さもなくばBioge
lP30を挙げることができ、それらは良好な結果を与え
る。
本発明の方法の第１の特に有用な実施態様において
は、分画の第２段階の間、その固体支持体は、連続に配
列された数本のカラムに分配される。本発明のこの変法
は、先行技術の欠点、すなわち本質的に目詰まり現象を
廃して、ゲル濾過のために大量の最終支持体量の使用を
可能とする。この方法では、単一分画操作において、高
分子量範囲を含む分離は、より一層明確になり、その支
持体は、より容易に再生させることができる。
使用されるカラム数は、当業者によって、分離効率と
ゲルの目詰まりによる悪影響との間で最良のバランスを
得るために、使用されるゲルの容量および性質に従って
適応される。
実用的な実施理由により、一般には、その方法の第２
段階では、20本以下のカラム数を使用することが適切で
ある。
１例として、AcA202ゲルの40リットルが、４リットル
のカラム10本に、または130リットルが13リットルのカ
ラム10本に分配される。
本発明の方法のその他の特に有用な実施態様において
は、異なる分離特性を有する少なくとも２種類の支持体
が、その分画の第２段階で連続的に使用される。本発明
のこの変法は、得られる最終画分の品質を良好にする。
例を挙げれば、その分画は、次のゲル配列:AcA202−A
cA54−AcA202において行うことができる。
本発明の良好な実施のためには、明確な分離を達成
し、高い均質性を得る目的で、大量のゲルを使用するこ
とが重要である。しかしながら、この種のゲル濾過に使
用されるかなり遅い流速を考慮すると、ゲル容量は、分
離と縦の拡散効果との最良のバランスを得るために、分
別されるべき生産物量に適合されるべきである。
本発明の方法において、出発ヘパリン（ｇ）／ゲル容
量（ｌ）比は、２以下、なお一層好ましくは0.5〜1.5の
間が好都合である。
本発明のその他の目的は、活性成分として上記の混合
物を含む医薬組成物に関する。そのような組成物は、血
栓症の発作の予防または治療もしくは抑制において、特
に有利に使用することができる。より正確には、それ
は、： −危険状況における静脈血栓症の防止、 −特に心筋梗塞の場合の、動脈血栓症発作の防止、 −術後療法における、外科患者の静脈血栓症の防止、さ
もなくば、 −外科装置における血栓の防止、 において使用することができる。
本発明は、以下の実施例によってより完全に説明され
るであろうが、それは、１例示として、限定なしに考慮
されるべきである。これらの実施例においては、該混合
物の物理化学的、生物学的、薬理学的特性は、次の技法
に従って決定された： 分子量および分子量分布 生産物の分子量および分子量分布は、直列に２本のカ
ラムを用いる高圧液体クロマトグラフィー、例えば、屈
折計検出器と連動された市販のTSK G3000 XLおよびTS
K G200 XL、によって測定された。
使用された溶出液は、0.5M硝酸リチウムであり、流速
は、0.6ml/分である。そのシステムは、“Barrowcliffe
et al.,Thromb.Res.,12,27−36（1977−78）”または
“D.A.Lane et al.,Thromb.Res.,12,257−271（1977−7
8）”に記載の技法に従って、アガロース−ポリアクリ
ルアミド（IBF）でのエキスクルージョン（exclusion）
・クロマトグラフィーによるエノキサパリン（enoxapar
ine）（Pharmuka）の分画によって得られる単分散標準
を用いて測定される。その結果は、GPC6プログラム（Pe
rkin Elmer）を用いて計算される。
抗X a活性 使用された技法は、標準として低分子量ヘパリン（WH
O LMWH1）のための第１国際標準を用いて、“Teien A.
N.＆ Lie M.,Thrombosis reseach 10（1977）399−410"
記載のものである。
抗II a活性 使用された技法は、標準として低分子量ヘパリン（WH
O LMWH1）のための第１国際標準を用いて、“Anderson
L.O.et al.,Thrombosis reseach 15（1979）531−541"
記載のものである。
APTT 使用された技法は、“Bell W.N.＆ Alton H.G.,Natur
e 174（1954）880−881"記載の“Actimat"技術（Bio Me
rieux）である。
ウサギにおける静脈血栓症 使用された技法は、“Wessler S.,Journal of Clinic
al investigation 34（1955）647−651"記載のものであ
る。
ラットにおける出血時間 使用された技法は、“Palm M.et al.,Thrombosis and
haemostasis 64（１）（1990）127−132"記載のもので
ある。
図の説明 図1:他のヘパリンと比較された本発明の混合物のヒト
血漿に対する試験管内APTT活性。
図２（ａおよびｂ）：ウサギにおける本発明の混合物
の抗X a活性の反応速度論：他の低分子量ヘパリンと比
較。
図３（ａおよびｂ）：ウサギにおける本発明の混合物
の抗II a活性の反応速度論：他の低分子量ヘパリンと比
較。
（実施例1:低分子化ヘパリンの調製） 水100ml中のヘパリンナトリウム塩10g溶液に、水125m
中の塩化ベンゼトニウム25g溶液を添加する。室温で得
られた生成物を濾過し、水で洗浄して、乾燥する。この
ようにして得られたヘパリンベンゼトニウム塩15gを、
塩化メチレン75ml中に溶解し、それに塩化ベンジル15ml
を添加する。その溶液を、25〜35℃の温度で25時間加熱
する。次に、メタノール中10％酢酸ナトリウム溶液90ml
を、添加し、続いて濾過し、メタノールで洗浄、乾燥す
る。上記条件下で、ナトリウム塩の形で得られたヘパリ
ンベンジルエステル10gを、水250ml中に溶解する。約60
℃に加熱されたこの溶液に、水酸化ナトリウム0.9gを添
加する。その温度を約60℃で1.5時間維持し、その反応
混合物を、続いて約20℃に冷却し、希塩酸の添加により
中和する。次いで、その溶液の濃度を、塩化ナトリウム
10％含量に調整し、その生成物を、メタノール750ml中
で沈殿させ、濾別、乾燥する。
（実施例2:混合物M1の調製） AcA202ゲル（ポリアクリルアミド−アガロースのビー
ズ形で、直径60〜140μｍのゲル）４リットルを各々含
む直径100mm、高さ50cmのガラスカラム10本が、分画の
ために連続して使用される： 実施例１記載の条件下で低分子化されたヘパリン30g
を含有する溶液を、第１のカラムの上部に添加し、0.2M
KH2PO4溶液からなる移動相を用いて、流速300ml/時で溶
出する。その画分は、第10カラムの末端において集めら
れる。
この処理により、オリゴ糖鎖が、その分子量に従って
効率的に分別され、続いて、その望まれる特性をもつ混
合物を得るために組み合わせられる。その結果、混合物
M1を得て、それについての試験管内での生物学的および
物理化学的特性が表１に示される。
（実施例3:混合物M2の調製） 混合物M2を、低分子化ヘパリン50gを用いて、実施例
２記載と同様の分画操作に従って得た。
その混合物M2の試験管内での生物学的および物理化学
的特性が表１に示される。
（実施例4:混合物M5および混合物M6の調製） 混合物M5を、低分子化ヘパリン30gから、実施例２記
載と同様の分画操作に従ったが、直径9cmおよび高さ50c
mの10カラムを用いて得た。
混合物M6を、低分子化ヘパリン150gから、直径18cmお
よび高さ50cmの10カラム、移動相の流速1.1 l/時で、
実施例２の操作により行われた最初の分画によって得
た。その目的の画分をプールし、オリゴ多糖をメタノー
ル添加によって沈殿させた。回収された固形物を、続い
て溶解し、次に、同様のクロマトグラフィー系で再分画
した。その画分を、第10カラムの末端で回収した。
その混合物M5およびM6の試験管内での生物学的および
物理化学的特性が、表１に示される。
（実施例5:比較実施例：混合物M3および混合物M4の調
製） 混合物M3を、実施例２記載と同様の分画操作に従って
得た。混合物M4については、実施例２の操作による分画
の後、それは、5,530ダルトンにおいて溶離する画分（6
3％）と7,770ダルトンで溶離する画分（37％）との混合
によって得た。
その混合物M3およびM4の試験管内での生物学的および
物理化学的特性が、表１に示される。
（実施例6:本発明の混合物のヒト血漿におけるAPTT活性
の試験管内検討） 得られた結果は、図１に示される。それは、本発明の
混合物（M1）が、ヒト血漿におけるAPTTを、無分画ヘパ
リンによるよりも一層顕著に試験管内で変化させること
を明確に示している。
（実施例7:ウサギにおける抗X aおよび抗II a活性の反
応速度論的研究） この研究は、次の方法に従って実施された： −ウサギ：ニュージーランド種（3.5kg）、−注射
量：皮下経路:0.5ml/kg（腹部領域）、−血液サンプ
ル：血液3mlが、耳の中央動脈から3.1％クエン酸ナトリ
ウム溶液（1/10）に、時間０分、45分、90分、３時間、
４時間、６時間、８時間において採血された。
本発明による混合物M1、M5およびM6を用いるか、また
は実施例１による低分子化ヘパリンを用いて、等しい抗
X a投与量で、ウサギに皮下注射した後、得られた抗X a
および抗II a活性は、血漿中において次のようである：
−抗X aに関しては類似し、匹敵する（図２）、−抗II
a活性に関しては本発明の混合物は、はるかに優れてい
る（図３）。
実施例５記載の混合物M4に関して行われた同様の比較
は、血漿の抗X a活性は類似のままであるが、抗II a活
性については非常に大きい差があることを示している
（図２および３）。
それ故、これらの結果は、驚くべきことに、本発明の
混合物が、持続性で高い生体内抗X aおよび抗II a活性
を維持することを示している。したがって、これらの混
合物は、生体内抗X aおよび抗II a活性が、非常に短命
である無分画ヘパリンとの比較だけでなく、生体内抗II
a活性が、非常に短命である先行技術に記載された低分
子量ヘパリンと比較しても、特に優れている。
（実施例8:静脈内注射後のウサギにおける静脈血栓症に
対する本発明の混合物の生体内活性の研究） 得られた結果は、表２において対照して調べられる。
この表は、分子分布が、特許請求された低分子化ヘパリ
ン（実施例１）とは異なる混合物M3（実施例４）が、本
発明の混合物M1よりも低い活性であることを示してい
る。特に、後者は、明瞭に優れている抗II a活性を与え
る。
（実施例9:皮下注射後のウサギにおける静脈血栓症に対
する本発明の混合物の生体内活性の研究） 得られた結果は、表３および４において対照して調べ
られる。これらの表は、混合物M1、M5およびM6が、先行
技術の低分子化ヘパリン（実施例１）よりさらに活性で
あり、そしてそれらが、少なくとも同等の作用期間を有
することを示している。
（実施例10:ラットにおける出血時間に対する生体内活
性の研究） 次の表５に示された結果は、本発明の混合物（混合物
M1、M5およびM6で表される）が、他の低分子量ヘパリン
よりも出血を低下させることを、明らかに示している。
その得られた結果は、対照値に関する分単位での出血時
間の増加と一致する。2mg/kgにおける比較では、ヘパリ
ンは、13の出血時間における増加を引き起こす［小窩
（lacuna）］。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C08B 37/10 A61K 31/727 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヘパリンの構成分オリゴ糖の一般構造を有
    する硫酸化オリゴ糖の混合物であって、分子量5,400〜
    7,800ダルトンを有するオリゴ糖が少なくとも70％を占
    め、分子量6,900ダルトン以上を有するオリゴ糖が少な
    くとも５％を占め、そして約60〜80IU/mgの抗II a活性
    を有することを特徴とする混合物。
  2. 【請求項２】混合物が、分子量5,700〜7,500ダルトンを
    有するオリゴ糖少なくとも70％を含有することを特徴と
    する請求の範囲１記載の混合物。
  3. 【請求項３】混合物が、分子量5,700〜6,900ダルトンを
    有するオリゴ糖少なくとも60％を含有することを特徴と
    する請求の範囲２記載の混合物。
  4. 【請求項４】混合物が、分子量6,900ダルトン以上を有
    するオリゴ糖少なくとも10％を含有することを特徴とす
    る請求の範囲１〜３の一つに記載の混合物。
  5. 【請求項５】混合物が、約70〜80IU/mgの抗II a活性を
    有することを特徴とする請求の範囲１〜４の一つに記載
    の混合物。
  6. 【請求項６】混合物が、ヘパリンの画分であることを特
    徴とする請求の範囲１〜５の一つに記載の混合物。
  7. 【請求項７】混合物が、低分子化ヘパリンの画分である
    ことを特徴とする請求の範囲１〜５の一つに記載の混合
    物。
  8. 【請求項８】混合物が、その一つの末端において２−Ｏ
    −スルホ−４−エノピラノスルホン酸をもつオリゴ糖か
    らなることを特徴とする請求の範囲７記載の混合物。
  9. 【請求項９】混合物が、ヘパリンエステルにおける塩基
    の作用によって低分子化されたヘパリン画分であること
    を特徴とする請求の範囲８記載の混合物。
  10. 【請求項１０】ヘパリンもしくは低分子化ヘパリンがゲ
    ル濾過によって分画されることを特徴とする請求の範囲
    １〜９の一つに記載の混合物の調製方法。
  11. 【請求項１１】分画が、（ｉ）出発材料のヘパリンもし
    くは低分子化ヘパリンをその溶出液に溶解すること、
    （ii）かくして得られた溶出液を、同じ溶出液で予め平
    衡にされた、少なくともゲル濾過用の固体支持体を含有
    するカラムを通過させること、および（iii）望ましい
    分子量の画分を回収することからなる段階を、連続的に
    含有することを特徴とする請求の範囲10記載の方法。
  12. 【請求項１２】低分子化ヘパリンが使用されることを特
    徴とする請求の範囲11記載の方法。
  13. 【請求項１３】ヘパリンエステルに対する塩基の作用に
    よって低分子化されたヘパリンが使用されることを特徴
    とする請求の範囲12記載の方法。
  14. 【請求項１４】分画の第２段階の間、支持体が、連続に
    配列された数本のカラムに分配されることを特徴とする
    請求の範囲11記載の方法。
  15. 【請求項１５】第２段階が、異なる分離特性を有する少
    なくとも２種類の支持体を用いて連続的に実施されるこ
    とを特徴とする請求の範囲11記載の方法。
  16. 【請求項１６】活性成分として、請求の範囲１〜９のい
    ずれか一つに記載のオリゴ糖の混合物を有効成分とする
    静脈または動脈血栓症の治療または予防剤。
  17. 【請求項１７】静脈および動脈血栓症が心筋梗塞の場合
    の動脈血栓症の発作である請求の範囲16記載の治療また
    は予防剤。
  18. 【請求項１８】静脈および動脈血栓症が術後療法におけ
    る外科患者の静脈血栓症である請求の範囲16記載の治療
    または予防剤。
  19. 【請求項１９】外科装置における血栓を防止する上での
    請求の範囲１〜９のいずれか一つに記載のオリゴ糖の混
    合物の使用方法。
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