JP3113901B2 - 血栓溶解剤 - Google Patents
血栓溶解剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はバチルス・スブチルス、バチルス・アミロリ
クエシェンス、バチルス・リヘルニホルミス等のバチル
ス属に属する微生物の生産するスブチリシン族蛋白分解
酵素を有効成分とする経口用血栓溶解剤に関する。
クエシェンス、バチルス・リヘルニホルミス等のバチル
ス属に属する微生物の生産するスブチリシン族蛋白分解
酵素を有効成分とする経口用血栓溶解剤に関する。
（従来の技術） 血栓は末梢動静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞症、冠
動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈血栓症をはじ
め、種々の疾患に関連し、病原因子として大きな問題と
なっている。現在、血栓症の治療には、主に欧米ではス
トレプトキナーゼ（以下、SKと略称する）を、そして本
邦ではウロキナーゼ（以下、UKと略称する）を用いる線
溶療法が良く用いられている。また、最近、ヒトの悪性
腫瘍の一つであるメラノーマ細胞から得られるプラスミ
ノーゲンアクチベーターがヒトの血管内皮細胞から血中
に産生されるティッシュプラスミノーゲンアクチベータ
ー（以下、TPAと略称する）と称する酵素と同一のアミ
ノ酸配列を持つことが知られてきた。このTPAはUKより
も血栓を引き起こす原因となるフィブリンへの親和性が
強いことから、よく効くと考えられメラノーマ細胞のみ
ならず、遺伝子組換え法により、微生物に造らせたTPA
の臨床応用が終了し、既に米国で市販されている。我が
国では、尚臨床試験段階であり、アミノ酸の一部を改変
した修飾TPAも検討されている。しかし、これらTPAは臨
床に必要な量が、当初予想された量よりも多くなり、生
産量との関係から高価格になるざるを得ない等の難点を
招来している。
動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈血栓症をはじ
め、種々の疾患に関連し、病原因子として大きな問題と
なっている。現在、血栓症の治療には、主に欧米ではス
トレプトキナーゼ（以下、SKと略称する）を、そして本
邦ではウロキナーゼ（以下、UKと略称する）を用いる線
溶療法が良く用いられている。また、最近、ヒトの悪性
腫瘍の一つであるメラノーマ細胞から得られるプラスミ
ノーゲンアクチベーターがヒトの血管内皮細胞から血中
に産生されるティッシュプラスミノーゲンアクチベータ
ー（以下、TPAと略称する）と称する酵素と同一のアミ
ノ酸配列を持つことが知られてきた。このTPAはUKより
も血栓を引き起こす原因となるフィブリンへの親和性が
強いことから、よく効くと考えられメラノーマ細胞のみ
ならず、遺伝子組換え法により、微生物に造らせたTPA
の臨床応用が終了し、既に米国で市販されている。我が
国では、尚臨床試験段階であり、アミノ酸の一部を改変
した修飾TPAも検討されている。しかし、これらTPAは臨
床に必要な量が、当初予想された量よりも多くなり、生
産量との関係から高価格になるざるを得ない等の難点を
招来している。
（発明が解決しようとする課題） SKはヒトの生体にとっては異物であり、反復して静注
投与すると種々のアレルギー反応、ショックなどを引き
起こす危険性がある。また、UK、TPAは静注投与すると
生体内での半減期が30分以内と極めて短く、また血中の
種々の阻害剤によって阻害されて、活性を失うため、大
量の持続点滴を要するなど、使い方に工夫を必要として
いる。しかも、これらの薬剤を大量投与すると、今度は
副作用として、出血傾向を招く危険性がある。かつて経
口用線溶酵素が開発されたことがある。即ち、経口用UK
である。このUKを含有する腸溶カプセルを経口投与する
と生体に内在しているプラスミノーゲンアクチベーター
の血中への放出がみられた（Robbins et al.,Academic
Press.Urokinase:Basic on Clinical Aspects,p265,198
2）。実際に、臨床試験も実施され、脳血栓に対する有
効性が確認されたこともある（Abe et al,Blood and Ve
ssel12:342,1981）。しかし、UKは既に静注製剤が市販
され、必要に即した使用がなされていること、経口UKの
場合にはある程度の投与量が必要で、量の確保の面で大
きな難点があった。
投与すると種々のアレルギー反応、ショックなどを引き
起こす危険性がある。また、UK、TPAは静注投与すると
生体内での半減期が30分以内と極めて短く、また血中の
種々の阻害剤によって阻害されて、活性を失うため、大
量の持続点滴を要するなど、使い方に工夫を必要として
いる。しかも、これらの薬剤を大量投与すると、今度は
副作用として、出血傾向を招く危険性がある。かつて経
口用線溶酵素が開発されたことがある。即ち、経口用UK
である。このUKを含有する腸溶カプセルを経口投与する
と生体に内在しているプラスミノーゲンアクチベーター
の血中への放出がみられた（Robbins et al.,Academic
Press.Urokinase:Basic on Clinical Aspects,p265,198
2）。実際に、臨床試験も実施され、脳血栓に対する有
効性が確認されたこともある（Abe et al,Blood and Ve
ssel12:342,1981）。しかし、UKは既に静注製剤が市販
され、必要に即した使用がなされていること、経口UKの
場合にはある程度の投与量が必要で、量の確保の面で大
きな難点があった。
本発明は上記の問題を克服し、比較的安価にして大量
に確保することが可能な、経口用血栓溶解剤の提供を意
図するものである。
に確保することが可能な、経口用血栓溶解剤の提供を意
図するものである。
（問題点を解決する為の手段） 従来、線溶療法に用いられているUKおよびTPAがフィ
ブリン平板を溶解する酵素であることが知られ、この事
実がこれらの酵素の医薬への利用の契機となった。本発
明者らも、従来からUK及び各種培養生産物の研究を鋭意
重ねてきた。その過程で、培養等で容易に入手が可能で
あるバチルス属の産生する蛋白質分解酵素、例えばバチ
ルス・スブチリス、バチルス・リヘルニホルミス、バチ
ルス・アミロリクエシェンスが産生するスブチリシンBP
N′、スブチリシン・カールスベルグ、スブチリシン・
アミロサッカリティカスが、フィブリン凝塊を溶かす作
用でみる試験（フィブリン平板法）で線溶活性を持つこ
とに気がついた。そこで、さらに研究を重ねていったと
ころ、UKが線溶活性を示すのにプラスミノーゲンを必要
とするのに対し、本発明者らの発見したバチルス属の蛋
白質分解酵素はプラスミノーゲンがなくとも線溶活性を
示すことを見出した。本発明者らが見出した上記のバチ
ルス属の産生する酵素は蛋白分解酵素として既知である
が、本発明者らにより、上記の新しい使用、用途が見出
され、本発明に至った。
ブリン平板を溶解する酵素であることが知られ、この事
実がこれらの酵素の医薬への利用の契機となった。本発
明者らも、従来からUK及び各種培養生産物の研究を鋭意
重ねてきた。その過程で、培養等で容易に入手が可能で
あるバチルス属の産生する蛋白質分解酵素、例えばバチ
ルス・スブチリス、バチルス・リヘルニホルミス、バチ
ルス・アミロリクエシェンスが産生するスブチリシンBP
N′、スブチリシン・カールスベルグ、スブチリシン・
アミロサッカリティカスが、フィブリン凝塊を溶かす作
用でみる試験（フィブリン平板法）で線溶活性を持つこ
とに気がついた。そこで、さらに研究を重ねていったと
ころ、UKが線溶活性を示すのにプラスミノーゲンを必要
とするのに対し、本発明者らの発見したバチルス属の蛋
白質分解酵素はプラスミノーゲンがなくとも線溶活性を
示すことを見出した。本発明者らが見出した上記のバチ
ルス属の産生する酵素は蛋白分解酵素として既知である
が、本発明者らにより、上記の新しい使用、用途が見出
され、本発明に至った。
本発明は、バチルス属微生物の生産するスブチリシン
族蛋白分解酵素を含有してなる経口用血栓溶解剤であ
る。
族蛋白分解酵素を含有してなる経口用血栓溶解剤であ
る。
スブチリシン（sbtilisin）族蛋白分解酵素として
は、スブチリシン・BPN′、同・カールスベルグ、同・
アミロサッカリティカスなどが挙げられる。
は、スブチリシン・BPN′、同・カールスベルグ、同・
アミロサッカリティカスなどが挙げられる。
スブチリシンBPN′はバチルス・スブチリスの生産す
る酵素ではナガーゼ或いはスブチロペプチダーゼＣとい
われるものであり、既に市販されている。発明者らは市
販品をさらにブチルセファロース、ゲル濾過クロマトで
精製し高純度にしたもの、又はバチルス・スブチリスの
培養物をB.Hagiharaらの方法（J.Biochemistry,45,185,
1958）で精製し、さらに市販品と同様の処理を施したも
ののいずれも用いることが出来る。スブチリシン・カー
ルスベルグも既に市販されており、この市販品をさらに
ゲル濾過クロマトで精製するか、或いはバチルス・リヘ
ルニホルミスの生産培養物から、A.V.Guntelbergらの方
法（Comp.−rend.Lab.Carlsberg,Ser.Chim.,29,36,195
4）で精製し、さらにゲル濾過カラムクロマト処理をし
精製したものの何れでもよい。スブチリシン・アミロリ
クエシェンスはバチルス・アミロサッカロティカスの産
生する酵素であり、バチルス・アミロサッカロティカス
の培養生成物をD.TSURUらの方法（Agr.BioChem.,30,126
1,1966）で精製し、さらにブチルセファロース及びゲル
濾過クロマトにより精製したものを用いてもよい。
る酵素ではナガーゼ或いはスブチロペプチダーゼＣとい
われるものであり、既に市販されている。発明者らは市
販品をさらにブチルセファロース、ゲル濾過クロマトで
精製し高純度にしたもの、又はバチルス・スブチリスの
培養物をB.Hagiharaらの方法（J.Biochemistry,45,185,
1958）で精製し、さらに市販品と同様の処理を施したも
ののいずれも用いることが出来る。スブチリシン・カー
ルスベルグも既に市販されており、この市販品をさらに
ゲル濾過クロマトで精製するか、或いはバチルス・リヘ
ルニホルミスの生産培養物から、A.V.Guntelbergらの方
法（Comp.−rend.Lab.Carlsberg,Ser.Chim.,29,36,195
4）で精製し、さらにゲル濾過カラムクロマト処理をし
精製したものの何れでもよい。スブチリシン・アミロリ
クエシェンスはバチルス・アミロサッカロティカスの産
生する酵素であり、バチルス・アミロサッカロティカス
の培養生成物をD.TSURUらの方法（Agr.BioChem.,30,126
1,1966）で精製し、さらにブチルセファロース及びゲル
濾過クロマトにより精製したものを用いてもよい。
なお、ATCC（American Type Culture Collection）に
よれば、バチルス・メッセンテリカスはバチルス・リヘ
ルニホルミス種に含まれている。したがって、本発明に
おけるバチルス・リケルホルミスはバチルス・メッセン
テリカスを包含する。
よれば、バチルス・メッセンテリカスはバチルス・リヘ
ルニホルミス種に含まれている。したがって、本発明に
おけるバチルス・リケルホルミスはバチルス・メッセン
テリカスを包含する。
上記に例示した酵素は既知であり、その性質が明らか
にされている。即ち、日本生化学会編、生化学データブ
ックＩによれば、スブチリシンBPN′の分子量は27.5K
d、等電点は7.8であり、スブチリシン・カールスベルグ
の分子量は27.3Kd、等電点は9.4であり、スブチリシン
・アミロサッカリティカスの分子量は27.5Kd、等電点は
7.8とされている。
にされている。即ち、日本生化学会編、生化学データブ
ックＩによれば、スブチリシンBPN′の分子量は27.5K
d、等電点は7.8であり、スブチリシン・カールスベルグ
の分子量は27.3Kd、等電点は9.4であり、スブチリシン
・アミロサッカリティカスの分子量は27.5Kd、等電点は
7.8とされている。
上記の様にして得られた、これらの性質の精製酵素は
そのまま減圧乾燥あるいは凍結乾燥などにより乾燥また
は濃縮物として供用することができる。しかし、本発明
のこれら蛋白質分解酵素は、ヒト由来でない為、ヒト由
来UKなどと異なり、静注投与して線溶療法に利用するこ
とは、抗原−抗体反応を引き起こす原因となり、危険性
が極めて大きい。そこで、本発明者らは、これらの蛋白
質の投与方法を種々を変えて検討した。経口投与は、患
者に最も負担のかからない方法であるが、一般に、蛋白
質は経口投与では血中への移行が起こらないとされてい
る。本発明者らも、この事実を充分予期していたが、念
のため本発明の蛋白質分解酵素を経口投与したところ、
全く予想に反して、血中の線溶活性系を亢進しているこ
とに気がついた。これらの酵素の作用機作は現在、完全
に説明することは出来ないが、経口投与した後の、血中
の組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を亢進して
いることと本発明の蛋白質分解酵素の経口投与による効
果との関連を否定できない。投与量は本発明の酵素の精
製の程度にもよるが、市販されている本発明の酵素を、
さらにヒトに投与できる程度まで精製したものを用いる
のが最も好ましい。
そのまま減圧乾燥あるいは凍結乾燥などにより乾燥また
は濃縮物として供用することができる。しかし、本発明
のこれら蛋白質分解酵素は、ヒト由来でない為、ヒト由
来UKなどと異なり、静注投与して線溶療法に利用するこ
とは、抗原−抗体反応を引き起こす原因となり、危険性
が極めて大きい。そこで、本発明者らは、これらの蛋白
質の投与方法を種々を変えて検討した。経口投与は、患
者に最も負担のかからない方法であるが、一般に、蛋白
質は経口投与では血中への移行が起こらないとされてい
る。本発明者らも、この事実を充分予期していたが、念
のため本発明の蛋白質分解酵素を経口投与したところ、
全く予想に反して、血中の線溶活性系を亢進しているこ
とに気がついた。これらの酵素の作用機作は現在、完全
に説明することは出来ないが、経口投与した後の、血中
の組織プラスミノーゲンアクチベーター活性を亢進して
いることと本発明の蛋白質分解酵素の経口投与による効
果との関連を否定できない。投与量は本発明の酵素の精
製の程度にもよるが、市販されている本発明の酵素を、
さらにヒトに投与できる程度まで精製したものを用いる
のが最も好ましい。
本発明で経口投与による効果を評価するに当たって用
いた本発明の酵素の純度はカゼイン水解能により測定し
た。即ち、カゼインを37℃、pH7.5で加水分解し、生成
したペプチドをフォーリン試液で発色させた時のチロシ
ン１μmolに相当する発色を１分間当たりに示す酵素量
を１単位として求めた。
いた本発明の酵素の純度はカゼイン水解能により測定し
た。即ち、カゼインを37℃、pH7.5で加水分解し、生成
したペプチドをフォーリン試液で発色させた時のチロシ
ン１μmolに相当する発色を１分間当たりに示す酵素量
を１単位として求めた。
本発明の酵素の評価は、酵素が吸収される前に分解し
てしまうのを防ぐことを考慮し、腸溶製剤の形で投与す
るのが好ましい。腸溶製剤は既知の方法により、例え
ば、酵素含有粉末ないしは顆粒をエンテリックコーティ
ングし、あるいは腸溶カプセルに充填することにより行
いうる。これら製剤に含まれる本発明の酵素の量は、広
い範囲で使用することが可能であるが成人１人当り（0.
02〜2g）、好ましくは0.05〜1gを１日１ないしは３回程
度投与するのがよい。以下、本発明の実施例と実施例を
もって具体的に説明する。
てしまうのを防ぐことを考慮し、腸溶製剤の形で投与す
るのが好ましい。腸溶製剤は既知の方法により、例え
ば、酵素含有粉末ないしは顆粒をエンテリックコーティ
ングし、あるいは腸溶カプセルに充填することにより行
いうる。これら製剤に含まれる本発明の酵素の量は、広
い範囲で使用することが可能であるが成人１人当り（0.
02〜2g）、好ましくは0.05〜1gを１日１ないしは３回程
度投与するのがよい。以下、本発明の実施例と実施例を
もって具体的に説明する。
実験例１ フィブリン平板（T.Astrup and S.Mullert
z,Archs.Biochem.Biophys.,40,346−351,1952）法によ
る線溶活性 シグマ社製のスブチリシンBPN′（タイプXXVII）、お
よびスブチリシン・カールスベルグ（タイプVIII）及び
実施例１に記載した方法で得たスブチリシン・アミロサ
ッカリティカスをそれぞれ脱イオン水に溶解し、100,50
および25μg/mlの濃度の溶液を調製した。各試料溶液を
フィブリン平板にのせ、37℃、18時間保温後、フィブリ
ン膜の溶解面積（mm2）を測定した。なお、この実験で
は２種類のフィブリン平板を作製し用いた。
z,Archs.Biochem.Biophys.,40,346−351,1952）法によ
る線溶活性 シグマ社製のスブチリシンBPN′（タイプXXVII）、お
よびスブチリシン・カールスベルグ（タイプVIII）及び
実施例１に記載した方法で得たスブチリシン・アミロサ
ッカリティカスをそれぞれ脱イオン水に溶解し、100,50
および25μg/mlの濃度の溶液を調製した。各試料溶液を
フィブリン平板にのせ、37℃、18時間保温後、フィブリ
ン膜の溶解面積（mm2）を測定した。なお、この実験で
は２種類のフィブリン平板を作製し用いた。
即ち、１つめは第一化学薬品社社製（東京）のウシ由
来フィリノーゲンタイプＩを用いたもので、これを標準
平板（＋Plg）とし、２つめは同社製のウシ由来フィリ
ノーゲンタイプIIを用いたものであり、これをプラスミ
ノーゲンフリー平板（−Plg）とした。トロンビンは持
田製薬社製（東京）のウシ由来のものである。この実験
では、さらにウロキナーゼ（自社製）及びプラスミン
（シグマ社製）を対照酵素として用いた。結果を表１に
示したが、表からも分かるようにスブチリシン族の蛋白
質分解酵素が線溶活性能をもつことは明白であり、特に
プラスミノーゲンからプラスミンへの活性化を介在せず
に線溶活性を示すことが見出された。
来フィリノーゲンタイプＩを用いたもので、これを標準
平板（＋Plg）とし、２つめは同社製のウシ由来フィリ
ノーゲンタイプIIを用いたものであり、これをプラスミ
ノーゲンフリー平板（−Plg）とした。トロンビンは持
田製薬社製（東京）のウシ由来のものである。この実験
では、さらにウロキナーゼ（自社製）及びプラスミン
（シグマ社製）を対照酵素として用いた。結果を表１に
示したが、表からも分かるようにスブチリシン族の蛋白
質分解酵素が線溶活性能をもつことは明白であり、特に
プラスミノーゲンからプラスミンへの活性化を介在せず
に線溶活性を示すことが見出された。
この作用の仕方は明らかに、UKとは異なり、プラスミ
ンと同じ傾向を示したが、このプラスミンとも作用の仕
方は異なることも又、明白である。
ンと同じ傾向を示したが、このプラスミンとも作用の仕
方は異なることも又、明白である。
表１の評価は生体で起こる血栓の起因となるフィブリ
ン凝塊を実験室内で調製した方法であることから、スブ
チリシン族の蛋白質分解酵素の線溶活性が証明される。
ン凝塊を実験室内で調製した方法であることから、スブ
チリシン族の蛋白質分解酵素の線溶活性が証明される。
実施例１ スブチリシンBPN′（シグマ社製）40gを1.5M硫酸アン
モニウムを含む0.01Mリン酸緩衝液,pH7.0,1000mlに溶解
し、予め同じ緩衝液で平衡化した1000mlのブチルセファ
ロース（ファルマシア社製）に吸着した。ついで、平衡
化に用いた緩衝液で充分洗浄した後、300mlの0.01M硫酸
アンモニウムを含まないリン酸緩衝液,pH7.0で溶出する
ことにより、35gの精製品を得た。さらに、この35gを１
％の食塩を含有した0.05Mリン酸緩衝液,pH7.0で平衡化
したセファデックスＧ−100ゲル濾過カラムクロマト（5
cmφ×90cm）を数回行い、同じ緩衝液で流出して、精製
品32gを得た。
モニウムを含む0.01Mリン酸緩衝液,pH7.0,1000mlに溶解
し、予め同じ緩衝液で平衡化した1000mlのブチルセファ
ロース（ファルマシア社製）に吸着した。ついで、平衡
化に用いた緩衝液で充分洗浄した後、300mlの0.01M硫酸
アンモニウムを含まないリン酸緩衝液,pH7.0で溶出する
ことにより、35gの精製品を得た。さらに、この35gを１
％の食塩を含有した0.05Mリン酸緩衝液,pH7.0で平衡化
したセファデックスＧ−100ゲル濾過カラムクロマト（5
cmφ×90cm）を数回行い、同じ緩衝液で流出して、精製
品32gを得た。
この精製スブチリシンBPN′を各0.05gずつ腸溶カプセ
ルに充填し、投与実験を行った。５人の健康成人男子に
この腸溶カプセルを１日３回、0.05gずつ８日間、経口
投与した。各人の血液を経時的に採血し、血中の線溶活
性の変化を測定した。即ち、全血溶解時（Whole blood
clot lysis time、以下WBCLTと略称する。）はChohanら
の方法〔I.S.Chohan et al:Thrombo.Diathes.Haemorrh.
（Stuttg）33,226−229,1975〕に準じて測定した。その
方法は0.2mlの血液に1.7mlnの0.12M酢酸ナトリウム（pH
7.4）および0.1mlのトロンビン溶液（50単位、トロンビ
ンは持田製薬社製、東京）を加え、37℃で形成されたフ
ィブリン塊の溶けるまでの時間を測定した。ユーログロ
ビン分画のフィブリン溶解能力（EFA）はKluftらの方法
〔C.Kluft et al.,:Progress in Chemical Fibrinolysi
s and Thrombolysis.2:57−65,J.F.Dabidson et al（e
d）,Reven Press,New York,1976〕を用いた。即ち、蒸
留水で10倍に希釈した血液をpH5.9に合わせ生じる沈澱
（ユーログロビン分画）をEDTA緩衝液に溶解したもの0.
03mlを標準フィブリン平板（T.Astrup and S.Mullertz,
Archs.Biochem.Biophys.40,346−351,1952）にのせ37
℃、18時間保温後のフィブリン膜の溶解面積（mm2）で
測定した。なお標準フィブリン平板作製に用いたフィブ
リノーゲンは第一化学薬品社製のウシ由来のもの、また
トロンビンは持田製薬社製（東京）のウシ由来のもので
ある。血中のフィブリンあるいはフィブリノーゲンの分
解産物（fibrin and fibrinogen degradation products
以下、FDPと略称する）は帝国臓器製薬社製（東京）のF
DPLテストによるラテクス凝集法を用いて測定した。即
ち、添付説明書に定められた検体希釈用液で被験血清を
希釈（１〜32倍）したもの0.07mlにラテックス試薬0.04
mlを加え、スライド板上で撹拌し、２分後の凝集の有無
をみた。（例えば、血清の２倍希釈で凝集が起こった場
合はFDP濃度は１μg/ml、４倍希釈液で凝集が起こると
２μg/mlである。） 血漿中のTPA活性はBlopool社製（米国）のELISAキッ
トを用いてBergsdorfの方法（N.Bergsdorf et al:Throm
b.Haemostas.,50,740−744,1983）に従って、その抗原
量を生成されたヒトメラノーマTPAを標準として表示（n
g/ml）した。
ルに充填し、投与実験を行った。５人の健康成人男子に
この腸溶カプセルを１日３回、0.05gずつ８日間、経口
投与した。各人の血液を経時的に採血し、血中の線溶活
性の変化を測定した。即ち、全血溶解時（Whole blood
clot lysis time、以下WBCLTと略称する。）はChohanら
の方法〔I.S.Chohan et al:Thrombo.Diathes.Haemorrh.
（Stuttg）33,226−229,1975〕に準じて測定した。その
方法は0.2mlの血液に1.7mlnの0.12M酢酸ナトリウム（pH
7.4）および0.1mlのトロンビン溶液（50単位、トロンビ
ンは持田製薬社製、東京）を加え、37℃で形成されたフ
ィブリン塊の溶けるまでの時間を測定した。ユーログロ
ビン分画のフィブリン溶解能力（EFA）はKluftらの方法
〔C.Kluft et al.,:Progress in Chemical Fibrinolysi
s and Thrombolysis.2:57−65,J.F.Dabidson et al（e
d）,Reven Press,New York,1976〕を用いた。即ち、蒸
留水で10倍に希釈した血液をpH5.9に合わせ生じる沈澱
（ユーログロビン分画）をEDTA緩衝液に溶解したもの0.
03mlを標準フィブリン平板（T.Astrup and S.Mullertz,
Archs.Biochem.Biophys.40,346−351,1952）にのせ37
℃、18時間保温後のフィブリン膜の溶解面積（mm2）で
測定した。なお標準フィブリン平板作製に用いたフィブ
リノーゲンは第一化学薬品社製のウシ由来のもの、また
トロンビンは持田製薬社製（東京）のウシ由来のもので
ある。血中のフィブリンあるいはフィブリノーゲンの分
解産物（fibrin and fibrinogen degradation products
以下、FDPと略称する）は帝国臓器製薬社製（東京）のF
DPLテストによるラテクス凝集法を用いて測定した。即
ち、添付説明書に定められた検体希釈用液で被験血清を
希釈（１〜32倍）したもの0.07mlにラテックス試薬0.04
mlを加え、スライド板上で撹拌し、２分後の凝集の有無
をみた。（例えば、血清の２倍希釈で凝集が起こった場
合はFDP濃度は１μg/ml、４倍希釈液で凝集が起こると
２μg/mlである。） 血漿中のTPA活性はBlopool社製（米国）のELISAキッ
トを用いてBergsdorfの方法（N.Bergsdorf et al:Throm
b.Haemostas.,50,740−744,1983）に従って、その抗原
量を生成されたヒトメラノーマTPAを標準として表示（n
g/ml）した。
表２はこれらの測定結果であるがNK投与によりWBCLT
には大きな変化がみられなかったのであるが、EFA
（Ａ）は投与１〜８時間に渡って次第に高まっているこ
と、またFDP量（Ｂ）はNK投与１日目から有意に高まっ
ていることが分かった。
には大きな変化がみられなかったのであるが、EFA
（Ａ）は投与１〜８時間に渡って次第に高まっているこ
と、またFDP量（Ｂ）はNK投与１日目から有意に高まっ
ていることが分かった。
今日、一般に血中の線溶活性を説明する際に最もよく
確かめられている血管内皮細胞由来とされる線溶酵素TP
A（Ｃ）の血中抗原量もNK投与後次第に高まることが判
明した。本発明者らは、同様の検討をNKを含まない偽カ
プセル（プラセボ）を投与し、血中線溶活性の変化及び
TPA抗原量の変化を測定したが、この場合には変化のな
いことを確認した。
確かめられている血管内皮細胞由来とされる線溶酵素TP
A（Ｃ）の血中抗原量もNK投与後次第に高まることが判
明した。本発明者らは、同様の検討をNKを含まない偽カ
プセル（プラセボ）を投与し、血中線溶活性の変化及び
TPA抗原量の変化を測定したが、この場合には変化のな
いことを確認した。
実施例２ 外側状態在静脈に佐々木らの方法（K.Sasaki et al L
ife Science,27,1659−1655,1980）で0.4mlの５％ウシ
−フィブリノーゲンと0.2mlの50単位/mlのウシ−トロン
ビンを用いて人工血栓を作製した雑種成犬（10〜16kg、
雄）に実施例１で得た精製スブチリシンBPN′腸溶カプ
セル剤（250mg/カプセル）を一度に４個経口投与し、そ
れが十二指腸に移行した後、経時的に採血し、前述の佐
々木らの方法に従ってユーログロブリン溶解時間（EL
T）を測定すると共に鼠経部の大動脈よりAngiografin
（Schering社、西独）を4ml/2秒で注入し、Ｘ線による
血管造影を行った。その結果、被験薬を含まないカプセ
ルを投与した対照群（Ｎ＝３）のELTが0.5〜12時間にわ
たって変化なく（Ｐ＞0.5）、また人工血栓の溶解も血
栓形成後いずれも18時間以上認められなかったのに対し
て、被験薬投与群（Ｎ＝３）ではELTは30分後に32±８
分（Ｐ＜0.02）、１時間目には40±10分（Ｐ＜0.06）、
３時間目には42±13分（Ｐ＜0.15）、そして６時間でも
53±８分（Ｐ＜0.4）とNK投与後に短縮（即ち、亢進）
が認められた。また人工血栓も被験薬投与群では５時間
以内に完全溶解することが確認され、経口スブチリシン
BPN′に血栓溶解効果のあることがわかった。
ife Science,27,1659−1655,1980）で0.4mlの５％ウシ
−フィブリノーゲンと0.2mlの50単位/mlのウシ−トロン
ビンを用いて人工血栓を作製した雑種成犬（10〜16kg、
雄）に実施例１で得た精製スブチリシンBPN′腸溶カプ
セル剤（250mg/カプセル）を一度に４個経口投与し、そ
れが十二指腸に移行した後、経時的に採血し、前述の佐
々木らの方法に従ってユーログロブリン溶解時間（EL
T）を測定すると共に鼠経部の大動脈よりAngiografin
（Schering社、西独）を4ml/2秒で注入し、Ｘ線による
血管造影を行った。その結果、被験薬を含まないカプセ
ルを投与した対照群（Ｎ＝３）のELTが0.5〜12時間にわ
たって変化なく（Ｐ＞0.5）、また人工血栓の溶解も血
栓形成後いずれも18時間以上認められなかったのに対し
て、被験薬投与群（Ｎ＝３）ではELTは30分後に32±８
分（Ｐ＜0.02）、１時間目には40±10分（Ｐ＜0.06）、
３時間目には42±13分（Ｐ＜0.15）、そして６時間でも
53±８分（Ｐ＜0.4）とNK投与後に短縮（即ち、亢進）
が認められた。また人工血栓も被験薬投与群では５時間
以内に完全溶解することが確認され、経口スブチリシン
BPN′に血栓溶解効果のあることがわかった。
実施例３ スブチリシン・カールスベルグをシグマ社から購入
し、さらにセファデックスＧ−100ゲル濾過カラムクロ
マトを実施例１と同様に行い、精製して得た比活性17U/
mgのものを用いて、実施例１と同じ実験を行った。即
ち、精製した酵素を各0.5gずつ腸溶カプセルに充填し、
５人の健康成人男子に１日３回、４日間、経口投与し
た。各人の血液を経時的に採血し、実施例１と同様の項
目の測定を行った。結果は、第１図にグラフ化して示し
た。いずれの測定値も実施例１と同様であり、スブチリ
シン・カールスベルグでも効果が期待できることを確認
した。
し、さらにセファデックスＧ−100ゲル濾過カラムクロ
マトを実施例１と同様に行い、精製して得た比活性17U/
mgのものを用いて、実施例１と同じ実験を行った。即
ち、精製した酵素を各0.5gずつ腸溶カプセルに充填し、
５人の健康成人男子に１日３回、４日間、経口投与し
た。各人の血液を経時的に採血し、実施例１と同様の項
目の測定を行った。結果は、第１図にグラフ化して示し
た。いずれの測定値も実施例１と同様であり、スブチリ
シン・カールスベルグでも効果が期待できることを確認
した。
実施例４ 実施例１で得た精製スブチリシンBPN′を用い、投与
量も変えて実験を行った。即ち、５人の成人健康男子に
合計1gの酵素を含有する腸溶カプセル５個を１日１回、
４日間、経口投与した。採血回数、測定項目は実施例１
と同様にして行い、効果の判定を行った。
量も変えて実験を行った。即ち、５人の成人健康男子に
合計1gの酵素を含有する腸溶カプセル５個を１日１回、
４日間、経口投与した。採血回数、測定項目は実施例１
と同様にして行い、効果の判定を行った。
表３はこれらの測定結果であり、スブチリシンBPN′
の投与により、EFA（Ａ）は投与１〜８に渡って次第に
高まっていること、またFDP量（Ｂ）はNK投与１日目か
ら有意に高まっていることが分かった。
の投与により、EFA（Ａ）は投与１〜８に渡って次第に
高まっていること、またFDP量（Ｂ）はNK投与１日目か
ら有意に高まっていることが分かった。
実施例５ バチラス・アミロリクエシェンスの培養生産物を、明
細書で記載したD.TSURUらの方法で精製した後、さらに
ブチルセファロース（400ml）及びセファデックスＧ−1
00ゲル濾過カラムクロマト（5cmφ×90cm）処理をして
精製した。条件は実施例１の方法に準拠して行い、精製
スブチリシン・アミノサッカリティカス、10gを得た。
投与実験は実施例１と同様にして行った。即ち、精製酵
素0.05gを含有した腸溶カプセルを１日３回、８日間、
連続経口投与した。投与後、実施例１と同じ間隔で採血
し、EFA値、FDP値及びTPA値の測定を行った。
細書で記載したD.TSURUらの方法で精製した後、さらに
ブチルセファロース（400ml）及びセファデックスＧ−1
00ゲル濾過カラムクロマト（5cmφ×90cm）処理をして
精製した。条件は実施例１の方法に準拠して行い、精製
スブチリシン・アミノサッカリティカス、10gを得た。
投与実験は実施例１と同様にして行った。即ち、精製酵
素0.05gを含有した腸溶カプセルを１日３回、８日間、
連続経口投与した。投与後、実施例１と同じ間隔で採血
し、EFA値、FDP値及びTPA値の測定を行った。
各測定値の経時的な結果を表４に示した。スブチリシ
ン・アミロサッカリティカスを経口投与した場合も実施
例１のスブチリシンBPN′とほぼ同様な線溶系に対する
効果が観察された。
ン・アミロサッカリティカスを経口投与した場合も実施
例１のスブチリシンBPN′とほぼ同様な線溶系に対する
効果が観察された。
実施例６ 実施例２と同様の実験を、実施例３で精製して得たス
ブチリシン・カールスベルグを用いて行った。即ち、外
側状態在静脈に佐々木らの方法（K.Sasaki et al Life
Science,27,1659−1665,1980）で0.4mlの５％ウシ−フ
ィブリノーゲンと0.2mlの50単位/mlのウシ−トロンビン
を用いて人工血栓を作製した雑種成犬（10〜16kg、雄）
に実施例１と同じ方法で調製したスブチリシン・カール
スベルグ腸溶カプセル剤（250mg/カプセル）を一度に４
個経口投与し、それが十二指腸に移行した後、経時的に
採血し、前述の佐々木らの方法に従ってユーログロブリ
ン溶解時間（ELT）を測定すると共に鼠経部の大動脈よ
りAngiografin（Schering社、西独）を4ml/2秒で注入
し、Ｘ線による血管造影を行った。結果を表５に示し
た。被験薬を含まないカプセルを経口投与した対照群で
は（Ｎ＝３）のELTが0.5〜12時間にわたって変化なく
（Ｐ＞0.5）、また人工血栓の溶解も血栓形成後いずれ
も18時間以上認められなかったのに対して、被験薬投与
群（Ｎ＝３）では0.5〜６時間にわたって短縮（即ち、
亢進）が認められた。一方、人工血栓の溶解も被験薬投
与群では５時間以内に全例で認められ、経口投与したス
ブチリシン・カールスベルグに血栓溶解効果のあること
が確認できた。
ブチリシン・カールスベルグを用いて行った。即ち、外
側状態在静脈に佐々木らの方法（K.Sasaki et al Life
Science,27,1659−1665,1980）で0.4mlの５％ウシ−フ
ィブリノーゲンと0.2mlの50単位/mlのウシ−トロンビン
を用いて人工血栓を作製した雑種成犬（10〜16kg、雄）
に実施例１と同じ方法で調製したスブチリシン・カール
スベルグ腸溶カプセル剤（250mg/カプセル）を一度に４
個経口投与し、それが十二指腸に移行した後、経時的に
採血し、前述の佐々木らの方法に従ってユーログロブリ
ン溶解時間（ELT）を測定すると共に鼠経部の大動脈よ
りAngiografin（Schering社、西独）を4ml/2秒で注入
し、Ｘ線による血管造影を行った。結果を表５に示し
た。被験薬を含まないカプセルを経口投与した対照群で
は（Ｎ＝３）のELTが0.5〜12時間にわたって変化なく
（Ｐ＞0.5）、また人工血栓の溶解も血栓形成後いずれ
も18時間以上認められなかったのに対して、被験薬投与
群（Ｎ＝３）では0.5〜６時間にわたって短縮（即ち、
亢進）が認められた。一方、人工血栓の溶解も被験薬投
与群では５時間以内に全例で認められ、経口投与したス
ブチリシン・カールスベルグに血栓溶解効果のあること
が確認できた。
（発明の効果） 本発明によれば、バチルス属微生物の培養により容易
に大量生産できるスブチリシン類の酵素が経口投与用の
血栓溶解剤として提供される。
に大量生産できるスブチリシン類の酵素が経口投与用の
血栓溶解剤として提供される。
第１図は、実施例３におけるスブチリシン・カールスベ
ルグ投与後の血中EFA、FDPおよびTPAの経日的変化を示
すグラフである。
ルグ投与後の血中EFA、FDPおよびTPAの経日的変化を示
すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−180834（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−34921（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ ｅｎ，Ｖｏｌ．60（1973），ｐ．54 Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，Ｖｏｌ．99（1983），Ａｂｓｔ．Ｎ ｏ．190337ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，Ｖｏｌ．108（1988），Ａｂｓｔ. Ｎｏ．71231ｋ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 38/46 A61K 9/48 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】パチルス属微生物の生産する蛋白分解酵素
スブチリシンBPN′、スブチリシン・カールスベルグま
たはスブチリシン・アミロサッカリティカスを含有して
なる経口用血栓溶解剤。 - 【請求項２】0.02ないし2g、好ましくは0.05ないし1gの
用量単位に分割された請求項１記載の血栓溶解剤。 - 【請求項３】腸溶剤の形態である請求項１記載の血栓溶
解剤。
Priority Applications (5)
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|---|---|---|---|
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| DE69009706T DE69009706T2 (de) | 1989-11-24 | 1990-11-26 | Thrombolytische Mittel. |
| EP90312823A EP0431811B1 (en) | 1989-11-24 | 1990-11-26 | Thrombolytic agents |
| US07/960,259 US5296223A (en) | 1989-11-24 | 1992-10-13 | Subtilisin as an oral thrombolytic agent |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0431811B1 (ja) |
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| US6883434B2 (en) * | 2001-09-17 | 2005-04-26 | Junghans Feinwerktechnik Gmbh & Co. Kg | Fuse device for a projectile |
| US7838481B2 (en) * | 2006-04-07 | 2010-11-23 | Beckman Coulter, Inc. | Formaldehyde-free cleaner composition for cleaning blood analyzers and method of use |
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| US20100143316A1 (en) * | 2008-12-05 | 2010-06-10 | Taiwan Agricultural Chemicals And Toxic Substances Research Institute, | Novel strain of bacillus amyloliquefaciens and its use |
| US20110081320A1 (en) * | 2009-10-06 | 2011-04-07 | Nubiome, Inc. | Treatment/Cure of Autoimmune Disease |
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|---|---|---|---|---|
| FR2233038A1 (en) * | 1973-05-30 | 1975-01-10 | Innerfield Irving | Thrombosis treatment - by oral administration of a protease |
-
1989
- 1989-11-24 JP JP01305868A patent/JP3113901B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-11-23 CA CA002030770A patent/CA2030770A1/en not_active Abandoned
- 1990-11-26 DE DE69009706T patent/DE69009706T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-26 EP EP90312823A patent/EP0431811B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-10-13 US US07/960,259 patent/US5296223A/en not_active Expired - Lifetime
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|---|
| Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｖｏｌ．１０８（１９８８），Ａｂｓｔ．Ｎｏ．７１２３１ｋ |
| Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｖｏｌ．９９（１９８３），Ａｂｓｔ．Ｎｏ．１９０３３７ｅ |
| Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，Ｖｏｌ．６０（１９７３），ｐ．５４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5296223A (en) | 1994-03-22 |
| CA2030770A1 (en) | 1991-05-25 |
| EP0431811B1 (en) | 1994-06-08 |
| DE69009706T2 (de) | 1994-09-29 |
| EP0431811A1 (en) | 1991-06-12 |
| JPH03167134A (ja) | 1991-07-19 |
| DE69009706D1 (de) | 1994-07-14 |
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