JP2873041B2

JP2873041B2 - 血栓溶解酵素、その取得法、血栓溶解剤及び血栓溶解酵素含有飲食品

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Publication number: JP2873041B2
Application number: JP2074781A
Authority: JP
Inventors: 博喜浜田; 伸佳中島; 和彦鈴木; 洋行須見
Original assignee: SODETSUKUSU KK
Current assignee: SODETSUKUSU KK
Priority date: 1990-03-23
Filing date: 1990-03-23
Publication date: 1999-03-24
Anticipated expiration: 2014-03-24
Also published as: JPH03277279A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はテンペ、テンペ菌又はその培養液から抽出さ
れた新規な血栓溶解酵素、その取得法及び該血栓溶解酵
素を含有する飲食品又は血栓溶解剤に関する。

（従来の技術）血栓症は末梢動静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞症、
冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈血栓症をはじ
め最近では老人性の痴呆症など、種々の疾患に関連し病
原因子として大きな問題となつている。

現在血栓症の治療にはこれまで微生物由来のストレプ
トキナーゼ（SK）、ヒト尿から得られるウロキナーゼ
（UK）或いはメラノーマ培養液から得られる組織プラス
ミノーゲンアクチベーター（TPA）などが点滴剤として
用いられていた。しかし、いずれも血中での半減期が20
分以内と極めて短く、従つて一時的な効果しか期待でき
なかつた。又いずれも静注されるため高純度である必要
上極めて高価であつた。

我々は1980年以降、経口線溶療法の開発を試み、ある
種の薬剤を口から飲むことで極めて長時間血中の血栓溶
解酵素の活性を高めることに成功した（H.Sumiら、Thro
mbos.Res.20:711〜714,1980;J.Clin.Invest.75:1212〜1
220,1985）。その後、こうした療法に適した飲食品、薬
品の検索に鋭意努力を継続している。

（発明が解決しようとする課題）本発明の目的は更に新たな血栓溶解酵素、その取得法
及びそれを有効成分とする飲食品又は血栓溶解剤を提供
することにある。

（課題を解決するための手段）本発明はテンペ、テンペ菌又はその培養液から抽出さ
れ、下記の特性を有することを特徴とする血栓溶解酵素
に係る。

（ａ）分子量：約20,000〜50,000（Zymography法によ
る）。

（ｂ）性状：白色粉末。

（ｃ）熱安定性:pH7.4で50℃、10分間保持しても安定。

（ｄ）基質特異性：フイブリンに対する強い分解活性と
共に、プラスミノーゲン活性化能を有する。又合成基質
であるＨ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA,H−Ｄ−Phe−Pip−
Arg−pNA,H−Ｄ−Val−Leu−Arg−pNAに対する強い分解
活性を有する。

（ｅ）阻害剤の影響：ジイソプロピルフルオロホスフエ
ートで強く阻害される。

又、本発明は上記血栓溶解酵素の取得法及び該血栓溶
解酵素を含有する飲食品又は血栓溶解剤に係る。

本発明の血栓溶解酵素（以下、テンペキナーゼ又はTK
と略称することがある）はテンペ或いはテンペ菌に水性
媒体を加えてホモゲナイズし、適当な時間、適当な温度
に保持して抽出した抽出液、又はテンペ菌の培養液をそ
のまま、又は適当な時間、適当な温度に保持した後、濃
縮、透析又は乾燥した後、極性有機溶媒、塩析、限外
過、吸着、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、
アフイニテイクロマトグラフイー又は等電点電気泳動の
１種類以上を組み合わせて処理することにより得ること
ができる。即ち、この新規な線溶酵素はテンペ、テンペ
菌由来であり、強い線溶活性を有する。

以下この新規線溶酵素について詳述する。

（ａ）分子量：約20,000〜50,000（Zymography法によ
る）。

（ｂ）性状：白色粉末。

（ｃ）熱安定性:pH7.4で50℃、10分間保持しても安定。

線溶酵素はテンペ、テンペ菌又はその培養物中に含ま
れる。これらはそのまま用いても良いが、線溶活性を一
定にし、投与を容易にするため、テンペやテンペ菌は水
もしくは塩類水溶液のような水性媒体で抽出する。抽出
はpH6ないし11で、60℃以下で行うのがよい。

又テンペ菌の培養物が液体培養物である場合は過し
て上清をとる。これらの抽出液や上清はそのまま用いて
も良いが、アセトンやエタノールを加えて析出する蛋白
を除去したり、或いはゲル過して精製することができ
る。ゲル過には、例えば、セフアデツクスＧ−100、
同150を用いることもできる。又、前記の抽出液や上清
は水や緩衝液を用いて透析し、酵素を含む透析内液を得
ることもできる。これらの精製法は単独もしくは組み合
わせて行うことができる。

上記のようにして得られる粗製若しくは精製酵素はそ
のまま又は減圧乾燥、凍結乾燥などにより乾燥又は濃縮
物として用いることができる。

本発明で用いられるテンペはインドネシアで昔から伝
統的に食用されている大豆、ピーナツ、油カスなどから
得られる食品であり、安全性に問題がなく人体に無害で
ある。従つて本発明の飲食品又は血栓溶解剤は毒性を示
さず、有効である。摂取量は線溶酵素の精製の程度にも
よるが、一般に0.05ないし20g、好ましくは0.2ないし10
gを１日１ないし３回程度摂取するのが良く、この用量
単位に分割調製するのが好ましい。

本発明の飲食品又は血栓溶解剤は経口摂取することも
可能であり、又、酵素が吸収される前に分解するのをな
るべく防ぐため、腸溶製剤の形で摂取するのも望まし
い。腸溶製剤は既知の方法により、例えば酵素含有粉末
ないし顆粒をエンテリツクコーテイングし、或いは腸溶
カプセルに充填することにより行うことができる。

（発明の効果）本発明の新規な線溶酵素は前記したように、テンペ、
テンペ菌又はその培養液からはじめて得られた物質であ
り、従来より認められているヒト血漿中のプラスミン或
いはウロキナーゼよりも分子量が小さい。また基質特異
性も特徴的でフイブリンに対し非常に強い分解活性を持
つ。即ち本発明の新規線溶酵素は本発明者が初めてテン
ペ、テンペ菌又はその培養液から得た物質であり、優れ
た線溶活性を持つことからマイクロカプセル化などして
直接静注することにより、一般に線溶酵素が用いられて
いる血栓症、塞栓症の治療へ応用することができる。ま
たウロキナーゼで最近行われているように経口投与を行
うことによつて、特に長時間投与して害のないことから
血栓症などの治療のみならず、その予防薬としても有用
である。

（実施例）次に本発明を実施例にて詳細に説明する。

実施例１市販テンペを、マイルズ社の牛フイブリノーゲン及び
持田製薬製の牛トロンビンを使い、T.Astrup,S.Mullert
zらの方法（Archs.Biochem.Biophys.40:346〜356,195
2）で調製したフイブリン（人工血栓）平板上にのせ、3
7℃で18時間インキユベイシヨンした結果、テンペのま
わりが明瞭に溶解された。尚、同条件下でフイブリン平
板に蒸した大豆をそのままのせても全く溶解はみられな
かつた。

実施例２ 1kgの市販テンペに2.5の生理食塩水を加え、室温で
１時間撹拌した後、ガーゼで過し得られた抽出液の30
μを実施例１と同条件でフイブリン平板にのせた結
果、37℃で18時間のインキユベイシヨンにより63±15mm
²（５回の実験の平均値）の溶解面積が確認された。
尚、テンペ抽出液に1mM濃度のジイソプロピルフルオロ
ホスフエート（和光純薬）を加えた場合、そのフイブリ
ン分解活性は完全に阻害された。

実施例３フイブリン平板の代りに0.6％カゼイン、１％寒天、
それに10mM CaCl₂を含む10mlの5mM Tris−HCl緩衝液、
pH7.4を用いて調製したカゼイン寒天平板に実施例１と
同方法で調製したテンペ抽出液を10μのせた結果、37
℃で18時間のインキユベイシヨン後42±12mm²の面積
（６回の実験の平均値）と、溶解することが確認され
た。又、この平板調製にミドリ十字社製のヒト血漿プラ
スミノーゲンを各々5CU及び25CU加えたものを調製し、
それに同量のテンペ抽出液をのせたところ、溶解面積は
55±11及び81mm²（６回の実験の平均値）と増加した。

即ち、テンペ中には直接の血栓溶解活性と共にプラス
ミノーゲンをプラスミンに活性化するという間接的な作
用（プラスミノーゲンアクチベーター）もあることがわ
かつた。

実施例４実施例２で行つた生理食塩水に変えて、蒸留水或いは
0.01〜0.15Mのリン酸緩衝液、pH7.4を抽出に用いそのフ
イブリン及びカゼイン寒天平板の溶解面積を比較してみ
たが、その結果は生理食塩水で抽出した場合とほぼ同様
であつた。

実施例５実施例２と同様にして得たテンペ抽出液をTK酵素液と
して各種合成アミド基質に対する分解能を調べた。反応
系は1mlで、0.1Mリン酸緩衝液、pH7.4を用い、基質濃度
は５×10^-4M、37℃による分解速度を測定した結果を第
１表に示す。

TKはＨ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNAに対する分解能が高
く、即ちプラスミンの基質特異性に最も似ていることが
わかつた。そしてまたＨ−Ｄ−Ile−Pro−Arg−pNAとか
pyro−Glu−Gly−Arg−pNAなど一般にプラスミノーゲン
アクチベーター基質とされるものへの分解能も確認でき
たが、トリプシン基質であるＨ−Ｄ−Ile−Pro−Arg−p
NA、白血球エラスターゼ基質であるpyro−Glu−Pro−Va
l−pNAなどには殆ど活性を示さなかつた。

実施例６実施例２と同様にして得たテンペ抽出液中のTKの分子
形態を調べるため、J.D.Tissotらの方法によるZymograp
hy（J.Clin.Invest.70:1320〜1323,1982）を行つた。同
方法に用いたフイブリン調製にはマイルズ社製の牛フイ
ブリノーゲンを最終濃度0.4％として使用した。その結
果、標準として使用した高分子量UK（分子量約5.3万）
及び低分子量UK（分子量約2.2万）の間の泳動位置に明
瞭なフイブリン溶解帯が認められ、TKが分子量約２〜５
万であることがわかつた。

実施例７ 3.7〜4.3kgの家兎（雄）の直腸より、実施例２と同様
にして得たテンペ抽出液を、蒸留水で透析し、凍結乾燥
したもの3.2gを10mlの生理食塩水に溶解し投与した。経
時的に採血し、その血漿の希釈液を使つてトロンボエラ
ストグラフイーパターンを調べた。その結果、投与前に
比べてｋ値及びｒ値に有意の変化はなかつたが、Ma値は
約29％（ｐ＜0.05;n＝５）高まつており、TK投与によつ
て血中線溶亢進の起こることがわかつた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】テンペ、テンペ菌又はその培養液から抽出
され、下記の特性を有することを特徴とする血栓溶解酵
素。（ａ）分子量：約20,000〜50,000（Zymography法によ
る）。（ｂ）性状：白色粉末。（ｃ）熱安定性:pH7.4で50℃、10分間保持しても安定。（ｄ）基質特異性：フイブリンに対する強い分解活性と
共に、プラスミノーゲン活性化能を有する。又合成基質
であるＨ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA,H−Ｄ−Phe−Pip−
Arg−pNA,H−Ｄ−Val−Leu−Arg−pNAに対する強い分解
活性を有する。（ｅ）阻害剤の影響：ジイソプロピルフルオロホスフエ
ートで強く阻害される。
【請求項２】テンペ、テンペ菌を水性媒体による抽出に
付すことを特徴とする請求項１に記載の血栓溶解酵素の
取得法。
【請求項３】テンペ、テンペ菌を慣用の増殖倍地中で培
養し、血栓溶解酵素を含有する培養液を回収し得られた
液より精製することを特徴とする請求項１に記載の血栓
溶解酵素の取得法。
【請求項４】請求項２又は３において、得られた抽出液
及び培養液をそのまま、又は適当な時間、適当な温度に
保持した後、濃縮、透析又は乾燥した後、極性有機溶
媒、塩析、限外濾過、吸着、イオン交換クロマトグラフ
イー、ゲル濾過、アフイニテイクロマトグラフイー又は
等電点電気泳動の操作を１種類以上組み合わせて精製す
ることを特徴とする血栓溶解酵素の取得法。
【請求項５】請求項１に記載の血栓溶解酵素を含有する
血栓溶解剤。
【請求項６】請求項１に記載の血栓溶解酵素を含有する
飲食品。