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JP3059481B2 - 遺伝子を組込むことによって、受容体中に存在する遺伝子を特異的に置換する方法 - Google Patents

遺伝子を組込むことによって、受容体中に存在する遺伝子を特異的に置換する方法

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JP3059481B2
JP3059481B2 JP2505154A JP50515490A JP3059481B2 JP 3059481 B2 JP3059481 B2 JP 3059481B2 JP 2505154 A JP2505154 A JP 2505154A JP 50515490 A JP50515490 A JP 50515490A JP 3059481 B2 JP3059481 B2 JP 3059481B2
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gene
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dna
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receptor
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ル・ムーリツク，エルベ
ブリユレ，フイリツプ
Original Assignee
アンステイテユ・パストウール
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Publication date
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Application filed by アンステイテユ・パストウール filed Critical アンステイテユ・パストウール
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、真核性受容体生物のゲノム中に存在する遺
伝子のコピーを、不活化される遺伝子とは異なる遺伝子
の組込みによって特異的に置換する方法に係る。好まし
くは、受容体遺伝子（以下、レセプター遺伝子とも称す
る）はトランスフェクトされた宿主細胞中に少なくとも
２つ存在する。受容体遺伝子はこれと異なる別の遺伝子
が挿入される遺伝子として定義される。
より詳細には、本発明は動物の正常な遺伝機能を維持
すると同時に内在プロモーターの制御下に外来遺伝子を
発現させるようにターゲッティングにより外来遺伝子を
導入されたトランスジェニック動物の生産に係る。
「別の又は外来遺伝子」なる用語は、ゲノム（RNA又
はDNA）中に通常見いだされるようなレセプター遺伝子
に対して「外来又は別の」遺伝子の全体又は一部に対応
する全ヌクレオチド配列を意味するか、又は正常遺伝子
の人工的に修飾された配列又はこの配列のフラグメント
に対応する。
本発明は更に、これらのトランスジェニック動物の生
産方法にも係る。
トランスジェニック動物の生産において、胚細胞系に
異種DNA配列を導入するために使用されている慣用方法
は、外来遺伝子のゲノム組込み部位も、こうして導入し
たコピーの数も制御することができない。外来遺伝子の
組込みはランダムに行われ、一般に、遺伝子の複数のコ
ピーが多くの場合は双頭−尾形として同時に組込まれ、
組込み部位及び組込まれるコピー数はトランスジェニッ
ク動物により異なる。
その結果、挿入点に位置する内在細胞遺伝子がこうし
て不活化され、ランダムな挿入が多数であるためにこの
ことを容易に検出できないという事態が生じ得る。これ
らの遺伝子の産物が動物の発生に重要である場合、動物
は大いに撹乱される。また、外来遺伝子のランダムな挿
入は遺伝子の発現に不適当な部位で行われる可能性があ
る。更に、動物間で挿入部位及び挿入数が異なるため、
発現調査の解釈は極めて困難になる。
トランスジェニック動物の生産に伴う主要な問題は、
外来遺伝子の発現を得ることである。一般に、２つの型
の実験がマウスで実施されている。
胚系に導入された遺伝子は、 −固有の調節配列を有するコーディング配列を含む「完
全」遺伝子、又は −別の遺伝子のプロモーター配列に融合された遺伝子の
コーディング配列から形成される複合遺伝子であり、２
つのフラグメントは多くの場合２つの異なる動物種に属
する。
こうして種々の組織における遺伝子の発現の特異性は
それらの遺伝子の調節配列により決定されるという事実
を確認することができた。
従って、トランスジェニック動物で外来遺伝子を発現
するために適当なプロモーターの選択は極めて重要であ
る。
他方、胚性幹細胞におけるマウス遺伝子の部位特異的
突然変異は、「遺伝子ターゲッティング（gene targeti
ng）」（Thomas他,1987;Thompson他,.1989）の方法を使
用することにより最近実現された。
前者では、マウス遺伝子HPRTを挿入及び置換により突
然変異誘発させ、後者では、突然変異遺伝子HPRTを修正
した。Thompson他なキメラマウスが獲得されるまで実験
を拡大し、胚細胞系における遺伝子修飾の継代を確認し
た。
引用文献の各々では、外来プロモーターの制御下でベ
クターに含まれる突然変異又は修正を含む外来配列と、
それらのゲノム相同染色体との間の相同組換により、厳
密な組込み部位をターゲッティングした、ここで留意す
べきことであるが、従来技術の著者は突然変異による活
性化が検出可能な表現型を伴う特異的遺伝子（HPRT）で
実験を行っている。Thomas他により記載されたターゲッ
テイングによる突然変異は、遺伝子HPRTを不活性化し、
従って、通常HPRTと結合している検出可能な表現型を消
滅させる効果があった。従って、プロモーターTKの制御
下の選択遺伝子NeoRは形質転換細胞を選択できるように
挿入DNAに組み込まれていた。留意すべき点として、従
来技術に記載されている実験はレセプター遺伝子（例え
ばHPRT）又は挿入遺伝子（例えばNeoR）によるによる選
択を含むものであった。従って、挿入部位及び／又は挿
入される遺伝子の型は選択可能な形質を与える遺伝子に
制限される。
更に、従来技術によるとベクター上の外来配列は組込
み部位をターゲッティングすると同時に修飾を導入する
ように機能する。相同組換後、修飾された遺伝子は正常
な遺伝子環境に常に存在する。
トランスジェニック動物の生産過程で生じる問題は、
外来遺伝子の挿入点に存在する内在細胞遺伝子を不活化
する危険であることに留意されたい。
不活化遺伝子の産物の機能に従い、このような不活化
はトランスジェニック動物に重大な生理学的又は形態学
的障害を招き、又はその生存を妨げさえする。
一方、遺伝子の不活化は該当遺伝子がウイルスレセプ
ター又は他の感染性物質をコードしているならば有利で
あるとみなされ得る。
本発明者らは上記欠点を解決する可能性を検討し、所
定のケースでトランスジェニック動物の生産過程に重要
な機能を有する１又は複数の内在細胞遺伝子の可能な不
活化に結び付けた。
本発明の目的は、真核細胞のゲノムに完全組換遺伝子
を供給するために相補的DNAと組換えられると、機能性
にされ得るか又はその機能がより有効にされ得る遺伝子
の一部により構成される所謂挿入DNAの特にターゲッテ
ィングによる特異的置換方法を提供することであり、該
方法は、 −挿入部位が相補的DNAを含む選択されたレセプター遺
伝子に存在しており、 −それ自体挿入DNAと、挿入DNAの両側に位置し且つレセ
プター遺伝子中の所望の挿入部位の側にある２つのゲノ
ム配列に夫々相同である２つの所謂「フランキング」配
列とを含む挿入物を含むベクターで真核細胞をトランス
フェクトし、 −挿入DNAがレセプター遺伝子に対して異種（ｈｔr
ologue）であり、 −フランキング配列が、該相補的DNAを構成し且つレセ
プター遺伝子の対応配列との相同組換により、真核細胞
のゲノムにおける完全組換遺伝子の再構成を可能にする
配列から選択されることを特徴とする。
本発明はトランスジェニック動物の生産方法にも係
り、該方法は、相同組換（即ち外来遺伝子の正確な組込
み）のために選択された上記条件下でE.S.細胞をトラン
スフェクトし、トランスフェクトした細胞を組み込むこ
とが可能な段階（例えば胚盤胞段階）の胚に該トランス
フェクトした細胞を注入し、次に該胚を保有母体に再移
植し、妊娠期に得られたキメラ個体を対合させる（acco
upler）ことを特徴とする。E.S.細胞がキメラ動物の胚
系に転移移植したならば、置換した遺伝子に対してヘテ
ロ接合性のトランスジェニック動物が子孫で対合（acco
uplement）（F1）により得られる。
受精後まもない（即ち24時間以内）卵細胞に、本発明
のベクターにより担持される遺伝子を挿入することも可
能である。こうして、卵細胞が単細胞状態にある間に挿
入が行われる。
本発明は更に、真核細胞のゲノムに組換遺伝子（即ち
挿入遺伝子）のターゲッティング挿入を実施することが
可能なプラスミドにも係り、該プラスミドはそれ自体挿
入遺伝子と、挿入遺伝子の両側に位置し且つレセプター
遺伝子中の所望の挿入部位に側にある２つのゲノム配列
に夫々相同である２つの所謂「フランキング」配列とを
含む挿入物を含むことを特徴とする。
本発明は更に、少なくとも１個の内在遺伝子が不活化
遺伝子と異なる遺伝子の挿入による不活化されたトラン
スジェニック動物にも係り、挿入遺伝子は不活化内在遺
伝子の調節配列の制御下にこの遺伝子の発現を可能にす
る位置に挿入される。
従って本発明の方法は、相同組換現象により、外来遺
伝子、特に正常時に関連するプロモーターの欠失するコ
ーディング配列を、真核生物のゲノム中で、挿入が行わ
れる遺伝子の内在プロモーターの制御下に外来遺伝子の
発現を可能にする部位にターゲッティングにより挿入す
ることができ、その結果、ターゲッティングした内在遺
伝子を不活化することができる。
本発明の好適態様によると、ターゲッティングされた
レセプター遺伝子は、ゲノム中に少なくとも２つ存在す
る遺伝子である。エレクトロポレーション（参考資料1
1）を使用することにより、外来遺伝子のコピーのみの
導入を確保することができる。
本発明のこの変形例によると、該当遺伝子（即ち所謂
挿入遺伝子）のターゲッティング挿入は、挿入が行われ
る内在細胞遺伝子のコピーのみを不活化し、この遺伝子
の該コピー又は他のコピーを無傷且つ機能性のままにし
ておく。
こうして、挿入が動物の発生のために必須のレセプタ
ー遺伝子の単一コピーを不活化するとしても、トランス
ジェニック動物の遺伝子機能は外来遺伝子の導入により
全く又はほとんど撹乱されない。従って、動物の発生は
外来遺伝子の挿入により影響されず、必須遺伝子の不活
化の場合に僅かな撹乱が生ずるとしても動物に致死的で
はあり得ない。ホモ接合状態における外来遺伝子の挿入
の効果は自明であり、ヘテロ接合個体の相互交差（F1）
後の第２世代（F2）で観察される。
一方、遺伝子の全コピーの不活化が所望される場合、
例えば遺伝子が感染性物質のレセプターをコードする場
合には、外来遺伝子の複数のコピーを導入する。導入さ
れる量の調節は既知の方法を使用することにより確保さ
れ得る。
従って、外来遺伝子のターゲッティング挿入は、挿入
が行われる内在遺伝子の調節配列の制御下遺伝子が発現
されるような部位への導入を可能にする。
したがって本発明の方法は、所望の機能（例えば種々
の組織における発現特異性）を有する内在プロモーター
の後に外来遺伝子を挿入することができ、これは、場合
によりレセプター遺伝子の他のコピーを不活化すること
なく可能である。
本発明の特に好適な態様によると、挿入DNAはフラン
キング配列の間に、組換遺伝子を提供するためにレセプ
ター遺伝子中で相補的DNAと組み換えられるように構成
されたDNA配列と、形質転換細胞の選択を可能にする選
択物質及び選択物質の発現を可能とするプロモーターを
コードする配列とを含み、レセプター遺伝子及び発現産
物をコードする組換遺伝子は選択可能な表現型を与えな
い。
このように、形質転換細胞の選択はレセプター遺伝子
及び挿入される遺伝子の性質に完全に独立しているが、
これに対して従来記載されている方法では、挿入される
遺伝子又はレセプター遺伝子が必要に応じて形質転換細
胞の選択を可能にする発現産物をコードする必要があっ
た。本発明者により開発されたシステムは、レセプター
遺伝子及び挿入遺伝子又は相同組換により形成される遺
伝子の性質に関して完全な融通性を可能にする。本発明
者らは驚くべきことに、かなりの寸法（例えば約7.5k
b）の配列を挿入しても相同組換頻度に影響しないこと
を確認した。
本発明のこの特徴に従ってDNA配列の挿入が及ぼし得
る効果は、挿入される配列の型に応じて、例えばコーデ
ィング配列の置換、調節配列の置換、突然変異による遺
伝子の不活化もしくは再活性化、又は遺伝子の発現率の
改良を含む。本発明によると、挿入遺伝子の発現が置換
遺伝子の発現に完全に置換えられるように、コーディン
グ相又はコーディング相の一部を置換遺伝子の開始コド
ンから開始する異種配列により置換することが可能であ
る。この結果、トランスジェニック動物で望ましくない
融合タンパク質の形成を避けることができる。
本発明のこの態様によると、挿入DNAはプロモーター
を欠失する異種コーディング配列をフランキング配列間
に含み得、コーディング配列は選択物質をコードする遺
伝子以外の配列である。挿入DNAは更に、フランキング
配列の間でコーディング配列の下流に、選択物質をコー
ドし且つ標的細胞におけるその発現を可能にするプロモ
ーターに関連する遺伝子を含む。
こうして所望の特性（例えば所定の発現特異性、又は
転写地図等）を有する内在プロモーターに後に異種コー
ディング配列を挿入することができ、形質転換された細
胞の選択性は異種コーディング配列の発現から完全に独
立している。この型の構築によると例えば、異種コーデ
ィング配列により置換された遺伝子が標的細胞で正常に
発現されない場合にも形質転換細胞を選択することがで
きる。遺伝子のかなりの割合は動物の発生の更に進んだ
段階まで不活性のままであるので、このことはE.S.細胞
（Embryonic Stem Cells）からトランスジェニック動物
を生産するのに特に重要である。遺伝子Hox−3.1はこの
型の遺伝子の１例である。他方、コーディング配列が容
易に検出可能なタンパク質（例えばｂ−Gal）をコード
する場合、置換された内在遺伝子の転写地図を作成する
ことができる。ベクターpGNはこの型の構築の１例であ
る。
本発明の他の態様によると、挿入DNAは外来調節配列
を含み得る。挿入部位、従ってフランキング配列は所望
の目的、即ち内在調節配列と共に「二重プロモーター」
の効果を与えるために外来調節配列を挿入するのか、あ
るいは内在プロモーターを外来プロモーターに置換する
のかに応じて選択される。調節配列の制御下にあるコー
ディング配列は内在配列であり得る。
他の可能性は調節配列とコーディング配列とを同時に
含む外来DNAの標的挿入である。調節配列はコーディン
グ配列と自然に会合する配列である可能性がある。
本発明の方法は、外来遺伝子の両側に２つの「フラン
キング」配列を含むベクターを使用する。これらのフラ
ンキング配列は少なくとも150塩基対を有しており、好
ましくはレセプター遺伝子の長さよりも短い。これらの
２つのフランキング」配列は所望の挿入部位の側の２つ
のゲノム配列に相同である点が重要である。導入すべき
外来遺伝子の上流に存在するベクターのフランキング配
列は通常、挿入部位の５′側に位置するゲノム配列に相
同である。同様に、外来遺伝子の下流に存在するベクタ
ーのフランキング配列は通常、挿入部位の３′側に位置
するゲノム配列に相同である。
フランキング配列の一方又は他方と外来遺伝子との間
に「挿入」配列（例えば形質転換細胞の選択を可能にす
る配列、マーカー、ベクターのクローニングを可能にす
る配列等）を導入することが可能である。
しかしながら、外来遺伝子に対するこれらの挿入配列
の位置は、外来遺伝子の発現を妨げないように、特に内
在プロモーターの制御下の外来コーディングDNA配列、
又は逆に挿入配列によりもたらされる外来調節成分の制
御下の内在DNAのコーディング配列から選択されなけれ
ばならない。
相同組換を助長するフランキング配列の存在にも拘わ
らず、所定数の組込みがランダムに生じる場合がある。
標的挿入が標的部位で正しく行われ、他の場所では行わ
れなかったことを確認するためには、「ポリメラーゼ鎖
反応（P.C.R.）（参考資料10）」法を使用して、挿入が
行われるべきであった遺伝子座のDNA配列を増幅する。
こうして、相同組換後により形質転換されたクローンの
みが選択される。
ベクターのフランキング配列は自明の通り、相同組換
が行われ得るために所望される挿入部位に応じて選択さ
れる。場合により、フランキング配列は内在プロモータ
ーの反復配列及び／又は翻訳率を改良するために開始コ
ドンに先行する配列（上流の配列）及び特にポリアデニ
ル化部位の終止配列の反復配列（下流配列）の修飾を含
み得る。
挿入遺伝子は任意の該当遺伝子であり得る。非限定的
な具体例として遺伝子lac.Z（後述のモデル）、インタ
ーロイキン又はインターフェロンをコードする遺伝子、
レセプター（例えばレチノン酸又はβ−３アドレナリン
又はH.I.V.）の遺伝子、及び所定の疾患（例えば筋萎縮
症等）に関連するとして知られる遺伝子を挙げることが
できる。
本発明の好適変形例によると、真核細胞は胚性幹細胞
である（参考資料14及び15）。
実際に、突然変異E.S.細胞は早期の胚に注入され得、
胚は再注入後、キメラ形で発生し得る。胚系が突然変異
細胞の転移移植を受けるならば、キメラ動物はその子孫
に突然変異を伝達する。この結果、この突然変異が所定
の個体でホモ接合体状態で該個体の発生、挙動、代謝、
病理等に及ぼす効果を観察することができる。
第１図はプラスミドpGNを示す。
第2a及びｂ図は夫々プラスミドpGNから構築される分
子pGMA及びpGMDを遺伝子Hox−3.1に比較して示す。これ
らのプラスミドは突然変異誘発プラスミドである。遺伝
子Hox−3.1のコーディング相の２部分を染色体15上に黒
い四角で示す。Hox−3.1の対応配列をプラスミドpGNに
クローニングした。（A:ポリアデニル化信号、Enh/Pro:
エンハンサー−プロモーター）。07及び08はPCRで使用
した２つのオリゴヌクレオチドを示す。
第３〜６図はpGNの構築に使用したプラスミドを示
す。
第７図はトランスフェクトしたE.S.細胞上のポリメラ
ーゼ鎖反応（P.C.R.）法による相同組換検出を示す。
第８図（ａ）及び（ｂ）は陽性固体クローン（L5及び
F2）及びE.S.細胞（C.C.E.）のサザン分析を示す。
本発明の方法は非常に広い工業用途があり、導入され
る外来遺伝子の種類に応じて変形可能である。
任意の遺伝子を特異的に突然変異誘発することが最近
可能になり、こうしてその役割をよりよく規定できるよ
うになったため、哺乳動物の遺伝学は著しく前進しつつ
ある。相同組換及びE.S.細胞に介入させるこの方法によ
り、腫瘍遺伝子、交差因子、転写因子等、基本研究又は
応用研究の目下のテーマである遺伝子に貴重な情報がも
たらされる。医療研究に重要な手掛かりは、遺伝子決定
が既知の人体疾患（デュシェンミオパシーのような病理
に係る所定の人体疾患）を再現し、そのメカニズムを調
査すると共に治療法を研究できるようにすることであ
る。
本発明の方法を適用することにより、所定の疾患に関
与するとして知られている遺伝子を、E.S.細胞のゲノム
にターゲッティングにより挿入する。その結果として生
産されるトランスジェニック動物はこの疾患の有効なモ
デルを表す。
必要に応じて上述のように、正常な遺伝子機能は外来
遺伝子の挿入にも拘わらずほぼ維持され得る。
本発明の方法の他の適用は、容易に検出され（例えば
lac.Z遺伝し）、従って細胞マーカーの役割を果し得る
挿入遺伝子を挿入することである。こうして、例えば群
動物における血統の調査が容易になり、家系をたどるこ
とができる。
挿入遺伝子としてのlac.Z遺伝子の挿入は同様にプロ
モーターの調査も可能にする。β−ガラクトシダーゼ活
性を検出できるため、同一型又は異なる型の細胞で種々
の部位をターゲッティングすることにより、種々の内在
プロモーターの活性及び特異性を調査することができ
る。キメラ又はトランスジェニック動物法を使用するこ
とにより、発生過程又は成長状態で完全な生物に同一の
調査を実施することができる。
本発明者は驚くべきことに、相同組換頻度がかなりの
寸法のフラグメント（例えばLac Z）の挿入により影響
されないことを確認した。本発明者はこの知見から、相
同組換法が大きい寸法を有する他の異種遺伝子の挿入に
適合するものと想到した。
動物のゲノムを修飾できるため、本発明の方法は「遺
伝子治療」にも使用することができる。最も明白な使用
は感染性物質（ウイルス又は細菌）又は毒性物質のレセ
プターをコードする遺伝子を不活性化することである。
この突然変異誘発が致死性であることが判明したなら
ば、無害物質に対する感受性を回復することなく失われ
た機能を回復する必要があろう。このようなレセプター
をコードする修飾遺伝子は、修飾が相同組換により生じ
るのでない限り突然変異細胞に再導入され得ないと思わ
れる。遺伝形質のこの修飾は該当疾患に対する免疫を動
物に与えると考えられる。
このプロトコルは自己移植の枠にも介入し得る。患者
から採取した障害又は健常細胞は治療及び免疫され、そ
の後、同一固体に再注入され得る。
本発明の方法は、疾患に関連する病理遺伝子の発現産
物に対する活性を有すると予想される医薬製品の活性の
調査にも適する。この場合、挿入遺伝子は病理遺伝子に
より構成され、疾患に対する活性を評価するために医薬
生成物をトランスジェニック動物に投与する。
以下、プラスミドpGNと、マウスのE.S.細胞のゲノム
への外来遺伝子（大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ酵素を
コードするlac.Z）の標的挿入におけるその使用とに関
して本発明を調査する。lac.Z遺伝子を選択したのは、
その発現を容易に検出することができるという理由から
であり、単なる例示に過ぎない。
マウス遺伝子Hox.3−１（参考資料１）のゲノム配列
（7292−３）と融合した大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ
酵素のコーディング相（lac.Z;1−3057）は、この遺伝
子の開始コドンから開始する。実際に、Hox−3.1の開始
コドンに先行する配列は脊椎動物に観察されるコンセン
サス配列と同一であり（参考資料２）、従って、脊椎動
物の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの良好な翻訳率
を実現する。lac.Z遺伝子は真核遺伝子の大部分と同様
に、メッセンジャーRNAを安定化するために、ポリアデ
ニル化信号（例えばウイルスSV40）を伴う。
真核細胞において機能的な大腸菌のβ−ガラクトシダ
ーゼの活性は、種々の方法で検出され得る。lac.Z遺伝
子を発現する細胞は、β−ガラクトシダーゼの基質であ
るＸ−Galの存在下で固定後に青色に呈色する（参考資
料３）。新規基質FDG（フルオレセインジ−βガラクト
ピラノシド）は、生存細胞を維持しながらβ−gal活性
を検出及び定量することができる（参考資料４）。lac.
Zを発現する細胞は蛍光産物を蓄積し、細胞ソーター又
はFACS（蛍光活性化細胞ソーター）により単離され得
る。
ミオシン耐性遺伝子の転写単位の大部分はプラスミド
pRSV neoに由来する（参考資料５）。ラウス肉腫ウイル
スのLTR（long terminal repeat）は多数の真核細胞で
非常に強力なは活性及びプロモーター配列を与える（参
考資料６）。細菌トランスポゾンTn5からは、大腸菌中
の活性プロモーターと、ウイルスSV40のポリアデニル化
信号を伴うホスホトランスフェラーゼ酵素のコーディン
グ相とが得られる（参考資料７）。プロモーターRSV及
びTn5の二重制御下の同一遺伝子は、細菌にネオマイシ
ン又はカナマイシン耐性、真核細胞にG418耐性を与え得
る。
単なる点突然変異の結果として、ポリオーマウイルス
のPyEC F9.1株の活性配列（エンハンサー）のＢ単位
は、種々の型の細胞、特に胚性癌（EC）細胞で更に著し
く活性になった（参考資料８）。このエンハンサーPy F
9.1の２つのコピーをLTR−RSVの上流でプラスミドpGN
に、ポリオームの調節領域の「後期プロモーター」の方
向に双頭形で挿入した。
ホスホトランスフェラーゼの翻訳率を改良するため
に、オリゴヌクレオチドによる突然変異誘発時に開始コ
ドンに先行する配列を修飾した。こうして配列TTCGCAUG
は脊椎動物における翻訳の開始コンセンサス配列により
よく対応するGCACCAUGになった（参考資料２）。
マウスの胚性幹（ES）細胞をトランスフェクトするこ
とにより、ネオマイシン耐性遺伝子の転写単位に加えら
れた改良を評価することができた。プラスミド中のモル
濃度が等しいとき、エンハンサーPy F9.1を用いて構築
するとpRSV neoの7.5倍及びCapecchi他（参考資料13）
により記載されているpMCl Neoの２〜３倍のG418耐性ク
ローンが産生された。更に、翻訳開始配列を修飾するこ
とにより、クローンの数はpRSV neoの60倍、又は450倍
に増加した。相同組換は適用される実験条件に応じて非
常に低頻度であり得る（例えば参考資料13によるとHPRT
で1/1000）。したがって、電気泳動条件が主に単独コピ
ーの主に組込みを与えるのであれば、高い選択効率を有
するベクターは非常に有用である。
プラスミドpGNは更に、大腸菌におけるクローニング
及び調製を可能にするcolE1,pBR322型の細菌複製開始点
を含む。
最後に、このプラスミドを使用し易くするために、in
vitroで合成され、pGNに独自の切断部位しか含まない
多重クローニング部位（M.C.S.）をlac.Zの上流に挿入
した。
lac.Zの上流でMCS部位によるプラスミドの直鎖化後、
相同組換を生じるプラスミド性「フランキング」配列を
プラスミドpGNの末端に加える（第２図）。この場合、
選択されたフランキング配列は、相同組換に後で介入す
る以前にHox−3.1に由来する染色体配列に相同であっ
た。
第２図は、プラスミドpGNから構築される分子の位置
を遺伝子Hox−3.1と比較して示す。この場合、Hox−3.1
のプラスミド配列と染色体配列との組換はこの遺伝子の
コーディング相の始点への挿入をもたらし、したがっ
て、その完全な不活化をもたらす筈である。
プラスミドpGNは任意の遺伝子に適用可能なこの方法
のための複数の利点を兼備する。相同組換は低頻度（非
相同組込の約1/1000）であり得、G418の耐性がゲノムの
任意の部分で発現されるために十分強力であるような多
数のクローンを分析できることが必要である。ホスホト
ランスフェラーゼの転写単位に加えられる修飾はこれら
の問題を完全に解決する。相同組換による突然変異誘発
法は挿入又は置換による遺伝子の不活化と等価である
が、プラスミドpGNは突然変異遺伝子の発現をβガラク
トシダーゼの発現に置換えることができるという付加的
な利点を有する。最後に、MCSはゲノムフラグメントの
クローニングを容易にする。
実施例： Ｉ−プラスミドpGNの構築 中間プラスミドを段階に従って番号付けした。
第１段階： pRSV neoのBgl I部位へのXho I部位の挿入 大腸菌のDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントに
より充填されたpRSV neoのBgl I部位へリンカーXho Iの
挿入。
第２段階： プラスミドp1のNde I部位へのCla I部位の挿入 クレノウフラグメントにより充填されたp2のNde I部
位へリンカーCla Iの挿入。
第３段階： プラスミドp2のCla I部位へのエンハンサーPy F9.1の挿
入 単独部位Acc Iにより単離されたエンハンサーPy F9.1
Pvu II−Pvu IIをp2のCla I部位に挿入。「後期プロモ
ーター」方向に方向付けられた２つのエンハンサーを含
むクローンの選択。
第４段階： プラスミドp3のSma I−Hpa I欠失 「自由端（bouts−francs）」末端を与える２種の酵
素は直接結合され得る。この欠失はさほど有用ではない
SV 40のｔ抗原のイントロンを除去し、ホスホトランス
フェラーゼの転写単位の寸法を著しく減少させる。
第５段階： pCHl10のBamH I部位へのXho I部位の挿入 クレノウポリメラーゼにより充填されたプラスミドpC
H110（Pharmacia）のBamH I部位へのリンカーXho Iの挿
入。
第６段階： プラスミドp4への３′lac.Z−polyA SV 40の挿入 ウイルスSV 40のポリアデニル化シグナルを伴うβ−
ガラクトシダーゼのコーディング相の３′部分をXho I
−Abat II部位によりプラスミドp5から単離し、同一部
位によりプラスミドp4にクローニングした。
第７段階： ベクターKS−への５′lac.Zの挿入 β−ガラクトシダーゼのコーディング相の５′部分を
Pst I−Sac I部位でプラスミドpMC 1871（Pharmacia）
から単離し、同一部位でベクターKS−（Stratagene）に
クローニングした。
第８段階： ゲノム配列Hox−3.1と５′lac.Zとの融合 ベクターKS−にクローニングした遺伝子Hox−3.1のゲ
ノム配列を酵素Sac I、ヤエナリ（Mung bean）ヌクレア
ーゼ及び酵素Apa Iによる連続消化により精製した。こ
の挿入物をApa I−Sma Iにより消化したプラスミドp7へ
のクローニングによりβ−ガラクトシダーゼのコーディ
ング相の５′部分と融合した。こうして融合したタンパ
ク質は遺伝子Hox−3.1の翻訳開始コドンと、それに続く
β−ガラクトシダーゼのコーディング相とを含む（配列
決定により確認）。
第９段階： プラスミドp6へのHox−3.1−５′lac.Zの挿入 融合物Hox−3.1−５′lac.Zをプラスミドp8からApa I
−Sac I部位で単離し、同一部位でプラスミドp6にクロ
ーニングした。このクローニングはβ−ガラクトシダー
ゼのコーディング相を完全に再構成する効果を有する。
第10段階： ベクターKS＋への遺伝子NeoRの挿入 ネオマイシン耐性遺伝子（ホスホトランスフェラーゼ
の細菌性プロモーター及びコーディング相）をpRSV neo
からHind III−EcoR I部位で単離し、ベクターKS＋（St
ratagene）にクローニングした。
第11段階： p10におけるNeoRの開始配列の突然変異誘発 ホスホトランスフェラーゼの翻訳開始配列を、脊椎動
物で観察されるコンセンサス配列と同一になるように修
飾し、こうして高い翻訳開始率、従って哺乳動物細胞の
高いG418耐性を可能にした。修飾は更に、突然変異誘発
効率を調節することを可能にするApaL I部位を生成す
る。
pRSV neoの配列との不一致領域（下線部）を含むオリ
ゴクレオチド（CTTGTTCAATCATGGTGCACGATCCTCA）を合成
し（Gene Assembler,Pharmacia）、その後、バクテリオ
ファージT4のポリヌクレオチドキナーゼによりホスホリ
ル化した。プラスミドKS＋のf1起源によりプラスミドp1
0の一重鎖マトリックスを調製し、突然変異誘発オリゴ
クレオチドとハイブリダイズした。クレノウポリメラー
ゼ及びバクテリオファージT4のDNAリガーゼにより第２
の鎖を合成及び修飾した。細菌の形質転換後、突然変異
クローンを32Pで標識したオリゴクレオチドによりスク
リーニングした。Apa L Iによる消化及び配列決定によ
り突然変異誘発を確認した。
第12段階： プラスミドp9における開始配列の置換 ネオマイシン耐性遺伝子の翻訳を開始する修飾配列を
含むフラグメントを酵素Hind III−Eag Iによりプラス
ミドp11から単離し、同一部位でプラスミドp9にクロー
ニングした。
第13段階： プラスミドp12への多重クローニング部位の挿入 ２つの相補的オリゴクレオチドを合成（Gene Assembl
er,Pharmacia）し、その後、ホスホリル化した。対合
後、付着末端によりMCSをプラスミドp12のApa I−Sac I
I部位にクローニングした。
多重クローニング部位を同様に配列決定により確認し
た。
II−lac.Z′の上流でM.C.S.の部位により直鎖化したプ
ラスミドpGNの末端への「フランキング」配列の付加 使用した配列は、所望の挿入部位に応じて選択した
（例えばHox−3.1、第2a及びｂ図pGMA及びpGMD参照）。
突然変異誘発プラスミドpGMDの構築において、遺伝子
座Hox−3.1に相同の２つのDNA末端をベクターpGNのApa
I−Nsi I及びNsi I−Sac II部位にクローニングした。
５′アームはHox−3.1のcDNA c21のヌクレオチド219のS
ac II部位（CCGCGG）で開始した。このフラグメントは
５′から第１のBamH I部位まで6.8kbにわたって伸びて
いる。３′アームはcDNA c21の885ヌクレオチドのApa I
部位（GGGCCC）で開始する。このフラグメントは３′か
ら第１のPst I部位まで1.5kbにわたって伸びている。リ
ンカーNsi Iを５′フラグメントのBamH I部位及び３′
フラグメントのPst I部位に挿入した。５′及び３′ア
ームをベクターpGNのNsi I−Sac II及びApa I−Nsi I部
位に夫々クローニングした。Hox−3.1 c21のcDNAの配列
は文献に開示されている（参考資料１）。
突然変異誘発プラスミドをE.S.細胞の電気泳動前にNs
i I消化により直鎖化した。ベクターpGNのApa I−Nsi I
及びNsi I−Sac II部位にクローニングした２つのゲノ
ムアームからその末端を形成した。
プラスミドpGMDは耐性遺伝子の後にポリアデニル化シ
グナルをもたず、逆に、プラスミドのHox−3.1のイント
ロンの配列に挿入されたmRNAの選択的分解に関与するAU
濃度の高い配列を有する。
別の突然変異誘発プラスミドpGMAは、pGMDと同一構造
を有するが、SV40のポリアデニル化及び転写終結シグナ
ルを含み、遺伝子Neorの下流にmRNAの分解に関与するAU
配列を示さない。これらの修飾の目的は、ランダムな組
込みに由来するクローンにおけるNeorの転写物の割合を
減少させることである。一方、pGMDと遺伝子座Hox−3.1
との間の相同組換に由来するクローンはG418選択の間に
変わることなく増加すべきであり、mRNAの分解のAT配列
は組換方法自体により除去するか又はイントロンHox−
3.1でつないだ。
その後の実験段階では、Thompson他、1989により記載
されているプロトコルに従い、キメラ動物を生産した。
III−マウスの胚性細胞のトランスフェクション Thompson他、1989により記載されている方法を使用し
てマウスの胚性細胞をトランスフェクトした。電気泳動
法を使用することにより、細胞当たり外来遺伝子（lac.
Z）のただ１つの導入を確保した。トランスフェクショ
ン後、β−ガラクトシダーゼを発現する複数のクローン
を単離した。
突然変異誘発プラスミドpGMD及びpGMAを直鎖化し、エ
レクトロポレーションによりE.S.細胞に導入し、１つの
コピーのみをゲノム挿入にし易いようにした（参考資料
11）。
プラスミドpGMA及びpGMDのHox−3.1のターゲッティン
グの効果を比較（第１表）するために初期トランスフェ
クションを実施した。
E.S.細胞系C.C.E.（参考資料16）をフィブロブラスト
栄養層に連続的に維持した（参考資料17）。実験Ｉ及び
IIでは1.5mlのHeBS中1.5×107個のE.S.細胞を0mgの直鎖
化プラスミドと共に200Vでエレクトロポレーションを行
い（参考資料11）、その後、４個の培養箱（直径100m
m）に広げた。実験IIIでは、24ウェルを有する４個のプ
レートに細胞の４分の１を広げた以外は同一条件で衝撃
を加えた。翌日、250μg/mlのG418を加えた。各トラン
スフェクションの結果、pGMAで約2400クローン及びpGMD
で約1000クローンが得られた。
各集合におけるG418耐性E.S.細胞のクローンの平均数
と、P.C.R.法で陽性の結果を与える集合の数とを第１表
に示す。陽性の結果とは、臭化エチジウムで染色したア
ガロースゲル上に1.6kbのバンドを観察できたことを意
味する（第７図）。P.C.R.混合物のサザン分析及びプラ
イマー配列を含まない特異的プローブのハイブリダイゼ
ーション後に陽性の結果を与える集合数を括弧内に示す
（第８図）。
P.C.R.による相同組換の検出 トランスフェクションIIの250クローンの集合の105個
の細胞でP.C.R.を実施した（第７図のレーンＤ参照）。
他のレーンでは約４×5000個の細胞を混合することによ
りトランスフェクションIIIの４つの集合を同時に分析
した。P.C.R.で使用したプライマー07及び08は突然変異
誘発プラスミドの３′Hox−3.1配列を囲んでいる（第２
図）。この３′配列を含む1.6kbのフラグメントは相同
組換の場合にしか増幅され得ない。レーン２、３及びＤ
は陽性の結果を示す。
「沸騰−プロテイナーゼＫ消化沸騰」法（参考資料1
8）を使用することにより、フィルター上で複製時にE.
S.クローンのDNAを調製した。67mM Tris−HCl（pH8.
6）、16.7mM（NH4）2SO4、6.7mM MgCl2、10mM 2−メル
カプトエタノール、0.01％（p/v）ゼラチン、200μM dA
TP、dTTP及びdCTP、100μM dGTP、100μM 7−デアザdG
T、各プライマー（07:AACTTCCCTCTCTGCTATTC及び08:CAG
CAGAAACATACAAGCTG）600ng並びに3UポリメラーゼTaq（P
erkin Elmer Cetus）を含む反応混合物100μをパラフ
ィン100μで被覆し、この反応混合物中で40回の増幅
サイクル（94℃で40秒、60℃で１分間、72℃で７分間）
を実施した。反応混合物の半分を臭化エチジウムで染色
した0.7％アガロースゲルに加えた。サイズマーカーは
λDNAのEcoR I＋Hind III消化物とした。
サザン分析 ピペットを使用することにより、突然変異Hox−3.1
（P.C.R.により同定）を含むE.S.細胞の３つの独立した
クローンを陽性集合から単離した。特異的標的を確認し
且つ組換遺伝子座と野生遺伝子座とを区別するために、
第８図に示す制限酵素で消化後にサザン分析によりDNA
を試験した。２つの異なるプローブを使用し、突然変異
クローン及び対照として非突然変異E.S.細胞における遺
伝子座Hox−3.1の３′末端を分析した（第８図ｃ）。第
１のプローブａは突然変異誘発プラスミドの配列Hox−
3.1に含まれており、ベクターの組み込み数及びその物
理的結合を立証した。組換えた３個のクローンのうちの
１個は更に、ランダムに組込まれたプラスミドのコピー
（第８図ａ、クローンF2）を含んでいた。突然変異誘発
ベクターに含まれていなかった第２のプローブｂは、組
換及び野生対立遺伝子Hox−3.1を区別していた（第８図
ｂ）。組換遺伝子座Hox−3.1は、突然変異誘発ベクター
及び無傷の遺伝子座の制限地図から予想されるハイブリ
ダイゼーション像を２つのプローブで示した。更に、ベ
クターの３′アームにおける２つの組換領域の存在は組
換遺伝子座Hox−3.1における配列ATの有無により確認さ
れた（例えば第８図、クローンL5）。遺伝子座Hox−3.1
の５′末端を同様に相同組換の場合について分析した。
突然変異誘発ベクターの6.8kbのHox−3.1 5′配列に部
位を含まない制限酵素を組換クローンのDNAの消火に使
用した。これらのDNAをその後、パルス電界で電気泳動
にかけ、高分子量フラグメントを識別した。このゲルの
サザン分析の結果、突然変異誘発プラスミドの上流に配
列を有するプローブを使用することにより、正確に組換
えられた対立遺伝子と野生対立遺伝子Hox−3.1とが判明
した。
サザン分析の結果、予想通り遺伝子Hox−3.1の対立遺
伝子が組換えられたことが判明した。相同組換は突然変
異誘発プラスミドのゲノムアームと相同染色体配列との
間の二重「交差（crossing−over）」に等価であった
（第２図）。
組換クローンで遺伝子lac ZはAUGコドンの上流のHox
−3.1のプロモーター及び調節配列の制御下におかれた
が、mRNAの成熟３′シグナルはSV40から由来していた。
これらの組換配列において、lac Zの発現はβ−Gal染色
により検出することができず、これは、RNアーゼの保護
分析により決定されたE.S.細胞中のHox−3.1の転写の不
在に一致していた。β−Galの活性は、Hox−3.1の転写
を誘導するとして知られている条件である５×10-7Mレ
チノイン酸の存在下に３又は４日間培養後に所定の細胞
で誘導可能であった（参考資料19）。
8.3kb DNAと遺伝子座Hox−3.1との完全な相同を示す
突然変異誘発ベクターpGMAを使用することにより、120b
pのフラグメントを7.2kbの挿入により置換した。この標
的置換の頻度（1/900）はHPRT（参考資料13）又はEn−
２（参考資料20）で最近得られた頻度（夫々1/1000及び
1/260）に匹敵し、しかもこれらの文献で挿入した異種
フラグメントのほうが著しく小さいサイズ（夫々1.1及
び1.5kb）であった。驚くべきことに、ベクターpGMDで
非常に高い相同組換頻度（1/40）が得られることが確認
された。mRNAの成熟３′シグナルの除去及びネオマイシ
ン耐性遺伝子へのmRNA分解配列の付加は、G418耐性クロ
ーンの総数を2.4倍減少させる効果があった（第１
表）。特異的ターゲッティング比はほぼ10倍に増加した
（900/40）。pGMDを用いる実験でも同一の相同組換メカ
ニズムが作用を受ける筈であった。これらの結果は、51
bpのAT配列がより低い融合温度のために突然変異誘発プ
ラスミドでin vivoで開環を提供し得るのであろうと説
明することができる。pGMDの隣接配列Hox−3.1がこの開
環によりAT領域の各側で作用され得るならば、該配列は
一重鎖状態で染色体遺伝子座Hox−3.1とより有効に反応
し得るであろう。相同組換メカニズムはより複雑な真核
生物では依然解明されていないが、酵母での分裂組換モ
デルによるとこのような鎖交換により誘導されると予想
される。
第８図は陽性個体クローン（L5及びF2）とE.S.細胞
（C.C.E.）で実施したサザン分析の結果を示す。
使用したプローブはベクターに含まれる（ａ）か又は
突然変異誘発ベクターから除外される（ｂ）配列Hox−
3.1にしかハイブリダイズしない。組換遺伝子座Hox−3.
1のハイブリダイゼーション像（白三角）は野生遺伝子
座（黒三角）と明白に区別される。星印はランダムに組
込まれたプラスミドのコピーのハイブリダイゼーション
バンドを示す。サイズマーカーはλDNAのEcoR I＋Hind
III消化物である。
第８図（ｃ）は組換（rec）及び野生（wt）対立遺伝
子Hox−3.1の制限地図を示す。突然変異誘発ベクター及
び遺伝子座Hox−3.1の部分を、第２図に使用したと同一
の記号で示す。この場合、AT配列は相同組換により組込
んだ。鉛直方向の矢印は突然変異誘発プラスミドの３′
末端を示す。サザン分析で使用したプローブａ及びｂの
位置も示す。第８図で使用した略記は、B,BamH I;D,Dra
I;E,EcoR I;H,Hind III;S,Sal I;X,Xho Iである。
IV−キメラ胚の生成 無傷の対立遺伝子Hox−3.1及び組換対立遺伝子を含み
且つ突然変異誘プローブの他のコピーを含まない２つの
組換E.S.クローンを使用して胚盤胞へのマイクロインジ
ェクションを実施した。これらの細胞の核型は正常であ
った。
10〜15個の突然変異細胞の胚盤胞によりマイクロイン
ジェクションした。保有母体への再移植後、胚をp.c.9.
5、10.5及び12.5日に集め、lac Zの発現を分析した。こ
れらの段階におけるHox−3.1の転写地図は予めin situ
ハイブリダイゼーション分析により決定されている（参
考資料１）。転写物Hox−3.1は後期原腸形成段階で最初
に検出可能であり、動物の後部の全組織に分配されてい
る。より後期では、分配は徐々に空間に限定され、組織
に特異的になる。p.c.12.5日の段階で、転写は神経管の
頸管領域で中心レベルに位置付けられる。胚形成の過程
でHox−3.1の転写分配は修飾を受ける。p.c.10.5日の段
階は遷移期間であると思われ、転写は２つの後部領域と
神経頸管とで同時に行われる。
p.c.9.5及び10.5日のキメラ胚で、後部芽の尾部分は
強いβ−Gal活性を示し、一方、前部胸郭領域又は頭部
ではマーカーは検出されなかった（第9a図）。後部領域
において、β−Galにより染色された細胞は全組織及び
全胚層で観察された。肢を形成する２つの芽の間で、染
色細胞は後部領域（第9c図）と同様に表面外胚葉（第9b
図）の制限されたゾーンに分配されており、神経管（第
9b図）には細線又は筋状に分配されていた。これらの筋
は神経管の壁に不規則且つ非対称に分配されていた。Ho
x−3.1の転写は神経管の閉鎖部付近の細胞の薄い層には
検出されなかった。これらの細胞はin situハイブリダ
イゼーション時に加えられた処理に抵抗できなかったも
のと思われる。神経外胚葉の細胞は非常に早く神経系の
種々の部分の一部を形成し、狭い横運動にしたがって径
方向に移動することが観察されている（参考資料21）。
したがって、これらの結果はこの観察に一致する。
したがって、Lac Zの発現はp.c.9.5及び10.5日の胚の
尾領域の全組織で相同遺伝子Hox−3.1の転写の第１の部
分を正確に示し、Hox−3.1の転写モードに関する新しい
情報を提供した。
一方、Lac Zの発現は12.5日のキメラ胚の神経管の頸
管領域にも10.5日の胚の後部領域にも観察されなかっ
た。これはin situハイブリダイゼーション調査から予
想される結果ではなかった。神経管の非常に局限された
ゾーンで10.5日から観察されたHox−3.1の転写の後期相
は、β−Galの活性により立証されていなかった。この
結果については、Lac Zの発現がプロモーターHox−3.1
の制御下にあるにも拘わらず、Hox−3.1の３′配列がリ
ポーター遺伝子内に不在であるという説明が可能であ
る。Hox−3.1のAUG開始コドンの３′配列が前部領域でH
ox−3.1の後期発現に影響したという可能性もある。
「遺伝子量」効果もこの結果を説明し得る。Drosophila
における複数の相同遺伝子の自己活性化は、遺伝的に立
証され、又はDNAとホメオボックス（homeobox）のタン
パク質との複合体の形成により示唆された。
神経管におけるHox−3.1の転写の後期化合物が類似の
機構により維持されるならば、対立遺伝子の不活化は神
経外胚葉の細胞で主要な効果をもち得る。ただ１つの対
立遺伝子がタンパク質Hox−3.1を産生するので、活性化
信号は２つのプロモーターで希釈される。２つの遺伝子
座における自己不活化の還元はこうして転写開始の完全
な阻止を誘導し得る。これは、Lac Zの発現が10.5及び1
2.5日の胚の神経管の頸管領域で全く検出されなかった
ことを説明し得る。
Ｖ−胚細胞系における修飾の継代：トランスジェニック
動物の生産 標的挿入により加えられる修飾のF1及びF2における効
果がキメラの生殖後に観察された。胚細胞系における修
飾の継代が確認された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 A01K 67/027 C12N 5/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】真核細胞のゲノムにおいて完全組換遺伝子
    を得るために相補的DNAと再結合したときに機能的にさ
    れ得るか又はその機能がより有効にされ得るような遺伝
    子の全体又は一部により構成されるDNA（挿入DNAとい
    う）の特にターゲッティングによって遺伝子を特異的に
    置換又は挿入する方法であって、挿入部位が相補的DNA
    を含む選択された遺伝子（受容体遺伝子という）中にあ
    り、挿入DNAの両側に位置し且つ受容体遺伝子中の所望
    の挿入部位に隣接する２つのゲノム配列に夫々相同であ
    る２つの「フランキング」配列と挿入DNAとを含む挿入
    物を含むベクターで真核細胞をトランスフェクトするこ
    とからなり、挿入DNAが受容体遺伝子に対して異種であ
    り、フランキング配列が、該相補的DNAを構成し且つ受
    容体遺伝子の対応配列との相同組換により真核細胞のゲ
    ノムにおける完全組換遺伝子の再構成を可能とする配列
    から選択される（但し、挿入DNAがコーディング配列で
    構成されているときは選択可能な物質をコードする遺伝
    子のコーディング配列ではない）ことを特徴とする方
    法。
  2. 【請求項２】真核細胞のゲノムにおいて完全組換遺伝子
    を得るために相補的DNAと再結合したときに機能的にさ
    れ得るか又はその機能がより有効にされ得るような遺伝
    子の全体又は一部により構成されるDNA（挿入DNAとい
    う）の特にターゲッティングによって遺伝子を特異的に
    置換又は挿入する方法であって、挿入部位が相補的DNA
    を含む選択された遺伝子（受容体遺伝子という）中にあ
    り、挿入DNAの両側に位置し且つ受容体遺伝子中の所望
    の挿入部位に隣接する２つのゲノム配列に夫々相同であ
    る２つの「フランキング」配列と挿入DNAとを含む挿入
    物を含むベクターで真核細胞をトランスフェクトするこ
    とからなり、挿入DNAが受容体遺伝子に対して異種であ
    り、フランキング配列が、該相補的DNAを構成し且つ受
    容体遺伝子の対応配列との相同組換により真核細胞のゲ
    ノムにおける完全組換遺伝子の再構成を可能とする配列
    から選択され、受容体遺伝子が真核細胞内で通常は転写
    されない遺伝子であることを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】該挿入DNAがコーディング配列又は調節配
    列を含んでおり、フランキング配列が、相同組換によ
    り、場合に応じて受容体遺伝子の調節配列の制御下に全
    挿入DNAのコーディング配列を発現させ得るか、又は挿
    入DNAの調節配列の制御下に受容体遺伝子のコーディン
    グ配列を発現させ得るように選択されることを特徴とす
    る請求項１又は２に記載の方法。
  4. 【請求項４】挿入DNAが調節要素、特に固有のプロモー
    ターを欠失するコーディング配列を含むことを特徴とす
    る請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 【請求項５】挿入DNAが調節配列を含むことを特徴とす
    る請求項３に記載の方法。
  6. 【請求項６】受容体遺伝子の内因性プロモーターが、ト
    ランスフェクトされた真核細胞内で不活性であることを
    特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】DNA（挿入DNAという）のターゲッティング
    によって遺伝子（受容体遺伝子という）の調節配列を特
    異的に置換する方法であって、該挿入DNAが調節配列を
    含んでおり、挿入DNAの両側に位置し且つ受容体遺伝子
    中の所望の挿入部位に隣接する２つのゲノム配列に夫々
    相同である２つの「フランキング」配列と挿入DNAとを
    含む挿入物を含むベクターで真核細胞をトランスフェク
    トすることからなり、挿入DNAが受容体遺伝子に対して
    異種であり、フランキング配列が、相同組換により挿入
    DNAの調節配列の制御下に受容体遺伝子のコーディング
    配列を発現させ得るように選択されることを特徴とする
    方法。
  8. 【請求項８】受容体遺伝子の内因性プロモーターが、ト
    ランスフェクトされた真核細胞内で通常不活性であるこ
    とを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】受容体遺伝子が真核細胞のゲノム中に少な
    くとも２つのコピーで存在することを特徴とする請求項
    １から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】フランキング配列の各々が150塩基対よ
    りも長く且つ受容体遺伝子の長さよりも短い長さを有す
    ることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】真核細胞が胚性幹（ES）細胞であること
    を特徴とする請求項１から10のいずれか一項に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】挿入DNAがトランスフェクトされた種に
    対して異種の遺伝子であるか又は異種の遺伝子の一部で
    あることを特徴とする請求項１から11のいずれか一項に
    記載の方法。
  13. 【請求項１３】ベクターが挿入DNAとフランキング配列
    との間に介在する配列を含むことを特徴とする請求項１
    から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】介在配列が形質転換体の選択を可能にす
    る選択物質をコードする配列、適当な場合にはマーカー
    遺伝子（例えばlacZ遺伝子）を含むことを特徴とする請
    求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】トランスフェクションがエレクトロポレ
    ーションにより実施されることを特徴とする請求項１か
    ら14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】挿入が所望の部位で行われたことを確認
    するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を使用し
    て、挿入が行われる遺伝子座のDNA配列を増幅すること
    を特徴とする請求項１から15のいずれか一項に記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】挿入DNAが、インターフェロン若しくは
    インターロイキンの遺伝子、β３−アドレナリン性レチ
    ノイン酸レセプター若しくはHIVレセプターのようなレ
    セプターの遺伝子、疾患に関連する遺伝子、又はlacZ遺
    伝子の一部を含むことを特徴とする請求項１から16のい
    ずれか一項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】挿入DNAが、組換遺伝子を得るべく受容
    体遺伝子において相補的DNAと再結合させるためのDNA配
    列と、形質転換体の選択を可能にする選択物質をコード
    する配列及び選択物質の発現を可能にするプロモーター
    とをフランキング配列間に含むことを特徴とする請求項
    １から17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】請求項１から18のいずれか一項に記載の
    方法によりES細胞をトランスフェクトし、相同組換事
    象、即ち外来遺伝子の正確な組込みに関してスクリーニ
    ングし、トランスフェクトした細胞を組込むことが可能
    な段階（例えば胚盤胞段階）の胚に該トランスフェクト
    した細胞を注入し、次に胚を代用母体に再移植し、妊娠
    終期に得られ且つ胚系（germ line）のES細胞による転
    移増殖が観察されるキメラ個体を対合させ、置換遺伝子
    に対してヘテロ接合性のトランスジェニック動物を得る
    ことを特徴とする、ヒトを除くトランスジェニック動物
    の生産方法。
  20. 【請求項２０】前記挿入物が、さらに、形質転換体の選
    択を可能にする選択物質をコードする配列と選択物質の
    発現を可能にするプロモーターとをフランキング配列間
    に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記挿入物が、さらに、相同組換過程に
    よって除去される配列であって相同組換事象に由来する
    形質転換体の選択を可能にする配列を含むことを特徴と
    する請求項１又は２に記載の方法。
  22. 【請求項２２】請求項１、２又は７に記載の方法により
    形質転換された真核細胞。
  23. 【請求項２３】ES細胞であることを特徴とする請求項22
    に記載の細胞。
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