[go: up one dir, main page]

JP2022516797A - 発酵ブロスおよびその使用 - Google Patents

発酵ブロスおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2022516797A
JP2022516797A JP2021540177A JP2021540177A JP2022516797A JP 2022516797 A JP2022516797 A JP 2022516797A JP 2021540177 A JP2021540177 A JP 2021540177A JP 2021540177 A JP2021540177 A JP 2021540177A JP 2022516797 A JP2022516797 A JP 2022516797A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fermented broth
animal
fermented
broth
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021540177A
Other languages
English (en)
Inventor
ギアツィス クリストス
ペルツァー シュテファン
シュタネク－ゲーベル ロレーナ
ファルケ ルーカス
エアハート フランク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Operations GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Operations GmbH filed Critical Evonik Operations GmbH
Publication of JP2022516797A publication Critical patent/JP2022516797A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/163—Sugars; Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/174—Vitamins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
    • A23K20/28—Silicates, e.g. perlites, zeolites or bentonites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • A23K30/20—Dehydration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Figure 2022516797000001
本発明によれば、プロバイオティクス微生物の発酵ブロスは、これらを飼料添加物としてだけでなく、他の飼料添加物の特性を改善する手段としても適切なものにする有益な特質を示すことが見出された。

Description

本発明によれば、プロバイオティクス微生物の発酵ブロスは、これらを飼料添加物としてだけでなく、他の飼料添加物の特性を改善する手段としても適切なものにする有益な特質を示すことが見出された。
プロバイオティクス微生物は、プロバイオティクス微生物の試料を発酵培地中で培養した後に、こうして得られた発酵ブロスからプロバイオティクス微生物を分離することによって得られる。
残りの発酵ブロスは通常は廃棄される。ところが、発酵ブロスの代替用途も文献に開示されている。例えば、米国特許第６，０６０，０５１号明細書は、真菌性および細菌性の植物病害に対して有用であり、特にコーンルートワームに対して活性を有する代謝産物を単離するための残りの発酵ブロスの使用を開示している。
驚くべきことに、本発明によれば、残留発酵ブロスの乾燥は、残留発酵ブロスに含まれる活性物質の活性、特に酵素活性および抗微生物活性に有害な影響を及ぼさないようであることが見出された。
さらに、発酵ブロスを乾燥させると、取り扱いが容易であり、そのため飼料添加物として適用して、さらなる飼料添加物と混合することができる製品が得られる。
特に、種々の乾燥発酵ブロスを混合することにより、および／または乾燥発酵ブロスをプロバイオティクス微生物と混合することにより、特にタンパク質分解活性、病原体に対する抗微生物活性、および有益な細菌に対するプレバイオティクス活性に関して優れた特質を有する飼料製品を得ることができることが分かった。
したがって、本発明の第１の発明主題は、乾燥発酵ブロスを製造する方法であって、以下の工程：
ａ）微生物を発酵培地中で培養して、微生物を含む発酵ブロスを得る工程、
ｂ）発酵ブロスから微生物の少なくとも２０％を分離する工程、
ｃ）こうして得られた発酵ブロスを乾燥させて、乾燥発酵ブロスを得る工程、
を含む、方法である。
分離工程において、発酵ブロスから微生物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％、より好ましくは少なくとも９８％、９９％または９９．５％が除去される。本発明の非常に好ましい実施形態では、発酵ブロスは、微生物を一切含まないか、またはほとんど含まない。
発酵ブロスからの微生物の分離は、特に遠心分離、浮選、濾過、特に限外濾過または精密濾過および／またはデカンテーションによって実施され得る。
発酵ブロスの乾燥は、好ましくは、発酵ブロスの凍結乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥、トレイ乾燥、ドラム乾燥、流動床乾燥、または噴霧造粒によって実施される。
発酵ブロスの凍結乾燥は、最初に液体窒素もしくはドライアイスを使用することによりブロスを凍結させるか、または－２０℃で冷凍した後に、これを高真空下で乾燥させることによって実施され得る（Ａｎａｎｔａら，２００４年，「健康および疾患における微生物生態学（Microbial Ecology in Health and Disease）」，１６（２－３）：１１３－１２４）。凍結乾燥には、発酵ブロスの蒸発冷却も含まれ得る（Ｂｏｎｄ，２００７年，「分子生物学における方法（Methods in Molecular Biology）」 Ｎｏ．３６８．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡにおける第９９頁～第１０７頁）。
発酵ブロスを噴霧乾燥するには、加熱されたノズルを通じた噴霧によって霧化されたブロスの微細液滴を乾燥チャンバーへと熱風に対して噴霧する。発酵ブロスの内容物は、そのチャンバーの底部に収集される（Ｍａｓｔｅｒｓ，１９７２，「噴霧乾燥（Spray drying）」．Ｌｅｏｎａｒｄ Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）。
噴霧造粒は、発酵ブロスが適切な粒子サイズの流動性のある造粒物粒子に直接的に変換される好ましいプロセスである。
本発明の特定の実施形態では、微生物の培養後、および微生物の分離前、および／または微生物の分離後のいずれかで、濃縮工程を実施して、発酵ブロスの総乾物量を高めることができる。発酵ブロスの濃縮は、特に溶媒蒸発によって実施され得る。溶媒蒸発は、好ましくは、該当する場合に、回転式蒸発器、薄膜蒸発器、または流下薄膜型蒸発器を使用して単一段階プロセスまたは多段階プロセスで実施される。
発酵ブロスから微生物を除去した後に、発酵ブロスは、好ましくは１重量％～１０重量％、特に１重量％～６重量％の固体含量（総乾物量）を有し、かつ／または好ましくは１ｍｌ当たり１×１０１０個（ｃｆｕ）以下の濃度、より好ましくは１ｍｌ当たり１×１０９個（ｃｆｕ）以下の濃度、特に１ｍｌ当たり１×１０４個～１×１０９個（ｃｆｕ）の濃度、または１ｍｌ当たり１×１０４個～１×１０８個（ｃｆｕ）の濃度で微生物を含む。
微生物を除去した後で、かつ発酵ブロスの乾燥を開始する前に、特に酵素を保存するために、特定の物質を添加することができる。これらの物質は、特に固化防止剤、酸化防止剤、増量剤、および／または保護剤から選択され得る。有用な物質の例としては、多糖類（特にデンプン、セルロース、メチルセルロース、マルトデキストリン、ガム、デキストラン、キトサンおよび／またはイヌリン）、ポリエチレングリコール、アミノ酸（特にプロリン、グリシンおよび／またはグルタミン酸）、タンパク質源（特にペプトン、スキムミルク粉末および／またはスイートホエイパウダー）、ペプチド、糖類（特にラクトース、キシロース、フルクトース、トレハロース、スクロースおよび／またはデキストロース）、ポリオール（特にマンニトール、グリセロールおよび／またはソルビトール）、酵母抽出物、麦芽抽出物、大豆粉、脂肪（特にレシチン、植物油および／または鉱油）、塩類（特に塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、白亜、石灰石、炭酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウムおよび／またはクエン酸ナトリウム）、およびケイ酸塩（特に粘土、特にベオライト粘土（beolite clay）、非晶質シリカ、フュームドシリカ／沈降シリカ、ゼオライト、フラー土、バイリット（baylith）、クリントポライト（clintpolite）、モンモリロナイト、珪藻土、タルク、ベントナイト、および／またはケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムおよび／またはケイ酸カルシウムのようなケイ酸塩）が挙げられる。
好ましくは、これらの物質の少なくとも１つおよび／またはこれらの物質の組み合わせは、使用されるのであれば、これらが、補充された発酵ブロス懸濁液中に、該物質の添加前に発酵ブロス中に含まれる総乾物量に対して１０分の１から２倍の間、好ましくは５分の１から等量の間の量で含まれるような量で添加される。
得られた乾燥産物を、例えばミル粉砕または造粒によってさらに加工して、特定の粒子サイズまたは物理的形態を達成することができる。
さらに、発酵ブロスの製造に使用される微生物は、好ましくはプロバイオティクス微生物、特にプロバイオティクス細菌、好ましくはバチルス（Bacillus）、特にＢ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．アトロファエウス（B. atrophaeus）、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．フレクサス（B. flexus）、Ｂ．フシフォルミス（B. fusiformis）、Ｂ．レンツス（B. lentus）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．メセントリカス（B. mesentricus）、Ｂ．モジャベンシス（B. mojavensis）、Ｂ．ポリミキシア（B. polymixa）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、Ｂ．スミシイ（B. smithii）、Ｂ．トヨネンシス（B. toyonensis）およびＢ．バリスモルティス（B. vallismortis）、エンテロコッカス（Enterococcus）、特にＥ．フェシウム（E. faecium）およびＥ．ファエカリス（E. faecalis）、ゲオバチルス（Geobacillus）、特にＧ．ステアロサーモフィラス（G. stearothermophilus）、クロストリジウム（Clostridium）、特にＣ．ブチリカム（C. butyricum）、ならびにストレプトコッカス（Streptococcus）、特にＳ．ファエカリス（S. faecalis）、Ｓ．フェシウム（S. faecium）、Ｓ．ガロリティカス（S. gallolyticus）、Ｓ．サリバリウス（S. salivariu）亜種サーモフィラス（thermophilus）およびＳ．ボビス（S. bovis）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、特にＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）、Ｌ．アミロリティカス（L. amylolyticus）、Ｌ．アミロボラス（L. amylovorus）、Ｌ．アリメンタリウス（L. alimentarius）、Ｌ．アビアリエス（L. aviaries）、Ｌ．ブレビス（L. brevis）、Ｌ．ブフネリ（L. buchneri）、Ｌ．カゼイ（L. casei）、Ｌ．セロビオサス（L. cellobiosus）、Ｌ．コリニフォルミス（L. coryniformis）、Ｌ．クリスパタス（L. crispatus）、Ｌ．クルバタス（L. curvatus）、Ｌ．デルブルエッキイ（L. delbrueckii）、Ｌ．ファルシミニス（L. farciminis）、Ｌ．ファーメンタム（L. fermentum）、Ｌ．ガリナラム（L. gallinarum）、Ｌ．ガッセリ（L. gasseri）、Ｌ．ヘルベティカス（L. helveticus）、Ｌ．ヒルガルディイ（L. hilgardii）、Ｌ．ジョンソニイ（L. johnsonii）、Ｌ．ケフィラノファシエンス（L. kefiranofaciens）、Ｌ．ケフィリ（L. kefiri）、Ｌ．ムコサエ（L. mucosae）、Ｌ．パニス（L. panis）、Ｌ．コリノイデス（L. collinoides）、Ｌ．パラカゼイ（L. paracasei）、Ｌ．パラプランタラム（L. paraplantarum）、Ｌ．ペントサス（L. pentosus）、Ｌ．プランタラム（L. plantarum）、Ｌ．ポンティス（L. pontis）、Ｌ．ロイテリ（L. reuteri）、Ｌ．ラムノサス（L. rhamnosus）、Ｌ．サケイ（L. sakei）、Ｌ．サリバリウス（L. salivarius）およびＬ．サンフランシセンシス（L. sanfranciscensis）、ペディオコッカス（Pediococcus）、特にＰ．アシディラクティシ（P. acidilactici）、Ｐ．デキストリニカス（P. dextrinicus）およびＰ．ペントサセウス（P. pentosaceus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、特にＳ．ラクティス（S. lactis）およびＳ．サーモフィラス（S. thermophiles）、ビフィジバクテリウム（Bifidibacterium）、特にＳ．アドレセンティス（S. adolescentis）、Ｂ．アニマリス（B. animalis）、Ｂ．ビフィダム（B. bifidum）、Ｂ．ブレーベ（B. breve）およびＢ．ロンガム（B. longum）から選択される。
本発明の非常に好ましい実施形態では、プロバイオティクス微生物は、バチルス属のプロバイオティクス微生物であり、特に以下の菌株：Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２３１５、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５９２、Ｂ．リケニフォルミスＤＳＭ ３２３１４、Ｂ．プミルスＤＳＭ ３２５３９、Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０およびそれらの組み合わせから選択される。
したがって、本発明のさらなる発明主題はまた、本発明による方法によって得ることができる乾燥発酵ブロスである。
本発明の乾燥発酵ブロスは、好ましくは、乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０１１（ｃｆｕ）以下の量で、より好ましくは乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０１０（ｃｆｕ）以下の量で、特に乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０１１（ｃｆｕ）の量で、または乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０１０（ｃｆｕ）の量で、または乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０９（ｃｆｕ）の量で微生物を含む。
したがって、本発明のさらなる主題はまた、乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０１１（ｃｆｕ）以下の量で、より好ましくは乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０１０（ｃｆｕ）以下の量で、特に乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０１１（ｃｆｕ）の量で、または乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０１０（ｃｆｕ）の量で、または乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０９（ｃｆｕ）の量で微生物を含む乾燥発酵ブロスであって、該微生物が、好ましくはＢ．サブチリスおよびＢ．アミロリケファシエンスから選択される、乾燥発酵ブロスである。
したがって、本発明の乾燥発酵ブロス中の細胞の量（ｃｆｕ）は、好ましくは１重量％未満、特に０．５重量％または０．２重量％未満、より好ましくは０．１重量％未満、特に０．０５重量％または０．０２重量％未満である。特定の実施形態では、乾燥発酵ブロス中の細胞の量（ｃｆｕ）は、それどころか０．０１重量％未満、特に０．００５重量％、０．００２重量％、または０．００１重量％未満でさえある。
したがって、本発明のさらなる主題はまた、１重量％未満、特に０．５重量％または０．２重量％未満、より好ましくは０．１重量％未満、特に０．０５重量％または０．０２重量％未満の量で細胞（ｃｆｕ）を含む乾燥発酵ブロスであって、特定の実施形態では、乾燥発酵ブロス中の細胞の量（ｃｆｕ）が、それどころか０．０１重量％未満、特に０．００５重量％、０．００２重量％または０．００１重量％未満でさえあり、ここで、微生物が、好ましくは、Ｂ．サブチリスおよびＢ．アミロリケファシエンスから選択される、乾燥発酵ブロスである。重量パーセントでの細胞の量（ｃｆｕ）は、好ましくは、Ｊｅｏｎｇら（１９９０年）によって、「バイオテクノロジーおよび生物工学（Biotechnology and Bioengineering）」，第３５巻，第１６０頁～第１８４頁に開示された細胞数（ｃｆｕ）に基づいて計算される。
したがって、本発明のさらなる発明主題は、特に、固化防止剤、酸化防止剤、増量剤、および／または保護剤から選択される、特に多糖類（特にデンプン、セルロース、メチルセルロース、マルトデキストリン、ガム、デキストラン、キトサンおよび／またはイヌリン）、ポリエチレングリコール、アミノ酸（特にプロリン、グリシンおよび／またはグルタミン酸）、タンパク質源（特にペプトン、スキムミルク粉末および／またはスイートホエイパウダー）、ペプチド、糖類（特にラクトース、キシロース、フルクトース、トレハロース、スクロースおよび／またはデキストロース）、ポリオール（特にマンニトール、グリセロールおよび／またはソルビトール）、酵母抽出物、麦芽抽出物、大豆粉、脂肪（特にレシチン、植物油および／または鉱油）、塩類（特に塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、白亜、石灰石、炭酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウムおよび／またはクエン酸ナトリウム）、およびケイ酸塩（特に粘土、特にベオライト粘土、非晶質シリカ、フュームドシリカ／沈降シリカ、ゼオライト、フラー土、バイリット、クリントポライト、モンモリロナイト、珪藻土、タルク、ベントナイト、および／またはケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムおよび／またはケイ酸カルシウムのようなケイ酸塩）から選択される少なくとも１種の物質を含む、微生物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％または９０％が除去された微生物の乾燥発酵ブロスである。乾燥発酵ブロス中に含まれる少なくとも１種の物質および／またはそのような物質の混合物は、乾燥発酵ブロス中に、好ましくは少なくとも０．１重量％の量で、より好ましくは少なくとも０．５重量％または少なくとも１重量％の量で、特に０．１重量％～６７重量％または１０重量％～６７重量％の量で、好ましくは０．５重量％～５０重量％または１０重量％～５０重量％の量で、より好ましくは１重量％～３０重量％または１０重量％～３０重量％の量で存在する。
本発明によれば、「乾燥発酵ブロス」とは、少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％、とりわけ９０重量％超、特に少なくとも９５重量％の総乾物含量を有する発酵ブロスを意味する。
本発明のさらなる発明主題はまた、特に上述の細菌の少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、特に２種、３種、４種または５種の異なる種類の乾燥発酵ブロスを含む組成物である。
本発明によれば、驚くべきことに、バチルス・アミロリケファシエンスの発酵ブロスが、非常に高いタンパク質分解活性のような予想外の有益な特質を示すことがさらに見出された。
したがって、本発明のさらなる態様は、バチルス・アミロリケファシエンスの発酵ブロスである。したがって、本発明のさらなる発明主題は、Ｂ．アミロリケファシエンスの発酵ブロスを含む組成物、特に飼料組成物であって、該発酵ブロスが、好ましくはＢ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の発酵ブロスである、組成物である。
Ｂ．アミロリケファシエンスの発酵ブロスは、好ましくは、Ｂ．アミロリケファシエンス種のプロバイオティクス微生物を発酵培地中で培養して、上記プロバイオティクス微生物を含む発酵ブロスを得た後に、微生物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％または８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％または９８％を発酵ブロスから分離することによって得られるため、Ｂ．アミロリケファシエンス、特にＢ．アミロリケファシエンスの発酵物は、微生物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が除去されたものである。
微生物を除去／分離した後に、発酵ブロスは、好ましくは１重量％～１０重量％、特に１重量％～６重量％の固体含量（総乾物量）を有し、かつ／または好ましくは１ｍｌ当たり１×１０１０個以下の濃度、より好ましくは１ｍｌ当たり１×１０９個以下の濃度、特に１ｍｌ当たり１×１０４個～１×１０９個の濃度、または１ｍｌ当たり１×１０４個～１×１０８個の濃度で微生物を含む。
本発明の好ましい実施形態では、Ｂ．アミロリケファシエンスの発酵ブロスは、濃縮形または乾燥形で使用され、ここで、濃縮および／または乾燥は、好ましくは、上記詳細な説明に開示されるように実施され、および／または濃縮発酵ブロスもしくは乾燥発酵ブロスは、詳細な説明で上述した特質を有する。
したがって、本発明の特定の発明主題はまた、Ｂ．アミロリケファシエンス、特にＢ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の濃縮発酵ブロスおよび／または乾燥発酵ブロスである。
したがって、本発明のさらなる主題はまた、乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０１１（ｃｆｕ）以下の量で、より好ましくは乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０１０（ｃｆｕ）以下の量で、特に乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０１１（ｃｆｕ）の量で、または乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０１０（ｃｆｕ）の量で、または乾燥発酵ブロス１ｇ当たり１×１０４～１×１０９（ｃｆｕ）の量でＢ．アミロリケファシエンス、特にＢ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０を含む乾燥発酵ブロスである。
したがって、本発明のさらなる主題はまた、１重量％未満、特に０．５重量％または０．２重量％未満、より好ましくは０．１重量％未満、特に０．０５重量％または０．０２重量％未満の量でＢ．アミロリケファシエンス、特にＢ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の細胞（ｃｆｕ）を含む乾燥発酵ブロスであって、特定の実施形態では、乾燥発酵ブロス中の細胞の量（ｃｆｕ）が、それどころか０．０１重量％未満、特に０．００５重量％、０．００２重量％または０．００１重量％未満でさえある、乾燥発酵ブロスである。
本発明によるＢ．アミロリケファシエンスの発酵ブロスは、好ましくは、実施例に開示された方法で測定された少なくとも５００ｍＵ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０００ｍＵ／ｍｌのタンパク質分解活性を有する。
驚くべきことに、本発明によれば、最終的な飼料を調製する前に、動物飼料またはその添加物を微生物の発酵ブロスで処理すると、飼料の特性を改善することができることがさらに見出された。
したがって、本発明の別の発明主題は、飼料または飼料添加物の特性を改善する方法であって、動物飼料または飼料添加物を、好ましくは微生物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％または９０％が除去された少なくとも１種の微生物の少なくとも１種の発酵ブロスで処理し／該発酵ブロスと一緒にインキュベートし、ここで、好ましくは、処理／インキュベートを実施することで、最終的な飼料製品の特性が改善される、方法である。
発酵ブロスの製造に使用される微生物はここでも、好ましくは、プロバイオティクス微生物、特にプロバイオティクス細菌、好ましくはバチルス、特にＢ．サブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．フレクサス、Ｂ．フシフォルミス、Ｂ．レンツス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセントリカス、Ｂ．モジャベンシス、Ｂ．ポリミキシア、Ｂ．プミルス、Ｂ．スミシイ、Ｂ．トヨネンシスおよびＢ．バリスモルティス、エンテロコッカス、特にＥ．フェシウムおよびＥ．ファエカリス、ゲオバチルス、特にＧ．ステアロサーモフィラス、クロストリジウム、特にＣ．ブチリカム、ならびにストレプトコッカス、特にＳ．ファエカリス、Ｓ．フェシウム、Ｓ．ガロリティカス、Ｓ．サリバリウス亜種サーモフィラスおよびＳ．ボビス、ラクトバチルス、特にＬ．アシドフィルス、Ｌ．アミロリティカス、Ｌ．アミロボラス、Ｌ．アリメンタリウス、Ｌ．アビアリエス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．セロビオサス、Ｌ．コリニフォルミス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．クルバタス、Ｌ．デルブルエッキイ、Ｌ．ファルシミニス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガリナラム、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ヒルガルディイ、Ｌ．ジョンソニイ、Ｌ．ケフィラノファシエンス、Ｌ．ケフィリ、Ｌ．ムコサエ、Ｌ．パニス、Ｌ．コリノイデス、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．パラプランタラム、Ｌ．ペントサス、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ポンティス、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サケイ、Ｌ．サリバリウスおよびＬ．サンフランシセンシス、ペディオコッカス、特にＰ．アシディラクティシ、Ｐ．デキストリニカスおよびＰ．ペントサセウス、ストレプトコッカス、特にＳ．ラクティスおよびＳ．サーモフィラス、ビフィジバクテリウム、特にＳ．アドレセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベおよびＢ．ロンガムから選択され、ここで、本発明の非常に好ましい実施形態では、プロバイオティクス微生物は、バチルス属のプロバイオティクス微生物であり、特に以下の菌株：Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２３１５、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５９２、Ｂ．リケニフォルミスＤＳＭ ３２３１４、Ｂ．プミルスＤＳＭ ３２５３９、Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０およびそれらの組み合わせから選択される。
発酵ブロスはまた、この目的のために、好ましくは、最初に微生物を適切な発酵培地中で培養した後に、微生物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％または９０％を発酵ブロスから分離することによって得られる。
微生物を除去／分離した後に、発酵ブロスは、好ましくは１重量％～１０重量％、特に１重量％～６重量％の固体含量（総乾物量）を有し、かつ／または好ましくは１ｍｌ当たり１×１０１０個以下の濃度、より好ましくは１ｍｌ当たり１×１０９個以下の濃度、特に１ｍｌ当たり１×１０４個～１×１０９個の濃度、または１ｍｌ当たり１×１０４個～１×１０８個の濃度で微生物を含む。
本発明の好ましい実施形態では、発酵ブロスは、濃縮形または乾燥形で使用され、ここで、濃縮および／または乾燥は、好ましくは、上記詳細な説明に開示されるように実施され、および／または濃縮発酵ブロスもしくは乾燥発酵ブロスは、詳細な説明で上述した特質を有する。
特に、最終的な飼料を調製する前に、飼料またはその添加物を発酵ブロスで処理すると、抗栄養因子（ＡＮＦ）の量を大幅に減らすことができることが見出された。
トウモロコシ、特に大豆粕（ＳＢＭ）としての動物飼料の原材料には、ＡＮＦが含まれている。ＳＢＭは家禽およびブタにおける主な食物タンパク質源であるが、水産飼料用の飼料添加物としてもますます重要になっている。飼料原料中に存在するＡＮＦ（例えば、タンパク質阻害剤、非デンプン多糖類、レクチン、抗原性タンパク質）は、飼料栄養素の利用を妨げ、動物に健康上の問題を引き起こす場合がある。したがって、飼料の消費前にＡＮＦを低減または除去することが重要である。
乳酸桿菌および桿菌による大豆粕の発酵は、ＡＮＦを低減し、飼料の栄養価を高めることが知られている。例えば、特定の細菌株によるＳＢＭの発酵が、抗原性タンパク質β－コングリシニンおよびグリシニンの分解をもたらし得るという示唆が存在する。これらのＡＮＦは、ＳＢＭを給餌したハタで観察されるように、腸および肝臓の異常な形態学的変化の原因であると考えられている。原材料のＡＮＦの低減に加えて、宿主の病原性細菌を阻害し得る原材料の発酵の間に抗微生物性ペプチド（ＡＭＰ）が産生され得る。
驚くべきことに、本発明によれば、微生物の発酵ブロスを使用することで、飼料添加物の特性を改善し、特にＡＮＦを効果的に低減および／または排除することもできることが見出されたことから、したがって、本発明のさらなる発明主題は、動物飼料または動物飼料添加物の特性を改善する方法であって、動物飼料または動物飼料添加物を、好ましくは微生物の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、７０％または９０％が除去された少なくとも１種の微生物の発酵ブロスで処理する、方法である。
本発明のこの態様の好ましい発明主題は、動物飼料または動物飼料添加物中の抗栄養因子（ＡＮＦ）、特にβ－コングリシニンおよび／またはグリシニンの量を減少させる方法であって、動物飼料または動物飼料添加物を、少なくとも１種の微生物の発酵ブロスで処理する、方法である。
本発明のこの態様のさらなる好ましい発明主題は、動物飼料または動物飼料添加物中のマイコトキシンを分解する方法であって、動物飼料または動物飼料添加物を、少なくとも１種の微生物の発酵ブロスで処理する、方法である。
飼料または飼料添加物を発酵ブロスとインキュベートすることによって達成され得る飼料または飼料添加物の特性のさらなる改善は、特にｐＨを下げることによる、および／または飼料もしくは飼料添加物中の汚染微生物の量を低下させることによる、飼料または飼料添加物中に含まれるタンパク質の動物によるより良好な使用可能性、飼料または飼料添加物の保存である。したがって、そのような特性を改善する方法は、本発明のさらなる好ましい実施形態である。
好ましくは発酵ブロスで処理することで特性および／または最終的な飼料の特性が改善される飼料添加物は、好ましくは、トウモロコシ、大豆、大麦、米、オート麦、モロコシ、大豆粕、菜種粕および綿実粕から選択される。
動物飼料または動物飼料添加物を処理するために本発明により好ましくは使用される微生物の発酵ブロスは、プロバイオティクス微生物、特にプロバイオティクス細菌の発酵ブロス、好ましくは上記の詳細な説明にすでに開示されたプロバイオティクス微生物の発酵ブロス、すなわち、バチルス、特にＢ．サブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．フレクサス、Ｂ．フシフォルミス、Ｂ．レンツス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセントリカス、Ｂ．モジャベンシス、Ｂ．ポリミキシア、Ｂ．プミルス、Ｂ．スミシイ、Ｂ．トヨネンシスおよびＢ．バリスモルティス、エンテロコッカス、特にＥ．フェシウムおよびＥ．ファエカリス、ゲオバチルス、特にＧ．ステアロサーモフィラス、クロストリジウム、特にＣ．ブチリカム、ならびにストレプトコッカス、特にＳ．ファエカリス、Ｓ．フェシウム、Ｓ．ガロリティカス、Ｓ．サリバリウス亜種サーモフィラスおよびＳ．ボビス、ラクトバチルス、特にＬ．アシドフィルス、Ｌ．アミロリティカス、Ｌ．アミロボラス、Ｌ．アリメンタリウス、Ｌ．アビアリエス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．セロビオサス、Ｌ．コリニフォルミス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．クルバタス、Ｌ．デルブルエッキイ、Ｌ．ファルシミニス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガリナラム、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ヒルガルディイ、Ｌ．ジョンソニイ、Ｌ．ケフィラノファシエンス、Ｌ．ケフィリ、Ｌ．ムコサエ、Ｌ．パニス、Ｌ．コリノイデス、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．パラプランタラム、Ｌ．ペントサス、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ポンティス、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サケイ、Ｌ．サリバリウスおよびＬ．サンフランシセンシス、ペディオコッカス、特にＰ．アシディラクティシ、Ｐ．デキストリニカスおよびＰ．ペントサセウス、ストレプトコッカス、特にＳ．ラクティスおよびＳ．サーモフィラス、ビフィジバクテリウム、特にＳ．アドレセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベおよびＢ．ロンガムからの発酵ブロスから選択され、ここで、本発明の非常に好ましい実施形態では、発酵ブロスは、バチルス属のプロバイオティクス微生物、特に以下の菌株：Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２３１５、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５９２、Ｂ．リケニフォルミスＤＳＭ ３２３１４、Ｂ．プミルスＤＳＭ ３２５３９、Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０およびそれらの組み合わせから選択されるバチルス属のプロバイオティクス微生物からの発酵ブロスである。
飼料または飼料添加物の前処理を実施するために、飼料または飼料添加物と発酵ブロスとは、好ましくは１：２～２０：１、より好ましくは１：１～１０：１の比率で混合される。好ましい混合比は、発酵ブロスが液体形、濃縮形、または乾燥形のいずれの形で使用されるかに依存する。それというのも、濃縮形および乾燥形では、活性物質がより高い濃度で存在するからである。非濃縮発酵ブロスの場合に、飼料添加物と発酵ブロスとの好ましい混合比は、１：２～２：１（重量／重量基準で）であるのに対して、乾燥発酵ブロスの場合に、飼料添加物と発酵ブロスとの好ましい混合比は、５：１～２０：１（重量／重量基準で）である。
飼料または飼料添加物の特性の効率的な改善を可能にするには、飼料または飼料添加物と発酵ブロスとのインキュベートは、好ましくは少なくとも１時間、特に１時間～１００時間、より好ましくは少なくとも２時間、特に２時間～８０時間、とりわけ少なくとも４時間、好ましくは４時間～５０時間にわたって行われる。
本発明の発酵ブロス、特に乾燥発酵ブロスは、以下の特質：
ａ）プロテアーゼ活性、
ｂ）セルラーゼ活性、
ｃ）キシラナーゼ活性、
ｄ）アミラーゼ活性、
ｅ）フィターゼ活性、
ｆ）カタラーゼ活性、
ｇ）スーパーオキシドジスムターゼ活性、
ｈ）ラクトナーゼ活性、
ｉ）抗栄養因子（ＡＮＦ）、特にβ－コングリシニンおよび／またはグリシニンに対する活性、
ｊ）マイコトキシンに対する活性、
ｋ）病原性微生物、特にＣ．パーフリンジェンス（C. perfringens）および／またはＳ．スイス（S. suis）に対する活性、
ｌ）クオラムクエンチング活性、
ｍ）有益な微生物に関するプレバイオティクス活性、
のうちの、好ましくは少なくとも１個、より好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個、特にすべてを有する。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の発酵ブロスは、少なくとも、以下の特質：
ａ）プロテアーゼ活性、
ｂ）セルラーゼ活性、
ｃ）キシラナーゼ活性、
ｄ）アミラーゼ活性、
ｅ）抗栄養因子（ＡＮＦ）、特にβ－コングリシニンおよび／またはグリシニンに対する活性、
ｆ）病原性微生物、特にＣ．パーフリンジェンスおよび／またはＳ．スイスに対する活性、
を有する。
本発明の発酵ブロス、特に乾燥発酵ブロスは、好ましくは少なくとも５種、より好ましくは少なくとも６種、７種、８種、９種、１０種または１２種の代謝産物を含む。代謝産物は、好ましくは２００ダルトンから５０００ダルトンの間、より好ましくは３００ダルトンから４０００ダルトンの間の分子量を有する。
本発明のさらなる発明主題はまた、本発明による少なくとも１種の発酵ブロス、特に少なくとも１種の乾燥発酵ブロスを含む組成物、特に飼料組成物であって、飼料組成物が、好ましくは少なくとも１種のさらなる飼料添加物、特に以下でさらに開示される飼料添加物を含む、組成物である。
本発明のさらなる発明主題は、詳細な説明で上述されたさまざまな種類の発酵ブロス、特にさまざまな種類の乾燥発酵ブロスを含む組成物、特に飼料組成物であって、飼料組成物が、好ましくは少なくとも１種のさらなる飼料添加物、特に以下でさらに開示される飼料添加物を含む、組成物である。
本発明の発酵ブロスおよびこれらを含む組成物は、動物に投与される場合に、好ましくはそのような動物の健康を増進し、かつ／またはそのような動物の全身健康状態を改善し、かつ／またはそのような動物の飼料要求率を改善し、かつ／またはそのような動物の死亡率を減少させ、かつ／またはそのような動物の生存率を増加させ、かつ／またはそのような動物の体重増加を改善し、かつ／またはそのような動物の生産性を増加させ、かつ／またはそのような動物の耐病性を高め、かつ／またはそのような動物の免疫応答を増加させ、かつ／またはそのような動物における健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持し、かつ／またはそのような動物の糞便を通じて放出される病原体を減少させる。特に、本発明の発酵ブロスおよび組成物を使用することで、治療目的で抗生物質を投与した後に腸内細菌叢の健康的なバランスを再確立するのを助けることができる。
したがって、本発明のさらなる主題は、動物の健康を増進し、かつ／または動物の全身健康状態を改善し、かつ／または動物の飼料要求率を改善し、かつ／または動物の死亡率を減少させ、かつ／または動物の生存率を増加させ、かつ／または動物の体重増加を改善し、かつ／または動物の生産性を増加させ、かつ／または動物の耐病性を高め、かつ／または動物の免疫応答を増加させ、かつ／または動物における健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持し、かつ／または動物の糞便を通じて放出される病原体を減少させる方法であって、本発明の発酵ブロスまたはそのような発酵ブロスを含む本発明の組成物を動物に投与する、方法である。
「動物の生産性を増加させる」とは、特に、以下の、より多くのまたはより高品質の卵、ミルクもしくは肉を生産すること、または離乳子の生産を増加させることのいずれかを指す。
本発明による発酵ブロスはまた、水質を改善するためにも使用され得る。したがって、本発明のさらなる主題はまた、本発明による発酵ブロスを水に適用する工程を含む、水または水溶液、特に飲料水および／または飼育水の質を制御および／または改善する方法である。
さらに、本発明による発酵ブロスはまた、植物を治療するために、特に植物の微生物病を治療するためにも使用され得る。したがって、本発明のさらなる主題はまた、本発明の少なくとも１種の発酵ブロスを植物に適用する工程を含む、植物を治療する方法、特に植物、特に栽培植物の微生物病を治療および／または予防する方法である。適用は、液体形で噴霧などによって、または固体形で、特に粉末として実施され得る。
特に、本発明の発酵ブロスは、動物の腸内の病原性細菌の増殖を阻害する、および／または減少させるのに有効な量で動物に投与または供給され得る。このような病原性細菌には、クロストリジウム菌（Clostridia）、リステリア菌（Listeria）、サルモネラ菌（Salmonella）、エンテロコッカス菌（Enterococci）、スタフィロコッカス菌（Staphylococci）、アエロモナス菌（Aeromonas）、ストレプトコッカス菌（Streptococci）、カンピロバクター菌（Campylobacter）、大腸菌（Escherichia coli）、およびビブリオ菌（Vibrio）が含まれる。関連して、本発明の方法を使用して、動物の糞便中に放出される病原性細菌の量を減少させることができる。本発明の方法を使用して、動物の腸内の乳酸菌などの有益な細菌の増殖を維持または増加させることもできる。病原性細菌を減少させること、および／または有益な細菌を増加させるもしくは維持することによって、本発明の組成物は、全体的に健康な腸内細菌叢を維持することができる。
したがって、本発明のさらなる主題は、有害細菌または病原性細菌の増殖を阻害および／または減少させる方法、および／または動物の腸内の有益な細菌の増殖を維持するおよび／または増加させる方法であって、本発明の発酵ブロスが動物に投与され、上記病原性細菌が、好ましくは、クロストリジウム菌、特にＣ．パーフリンジェンスおよびＣ．ディフィシル（C. difficile）、リステリア菌、特にＬ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）、Ｌ．シーリゲリ（L. seeligeri）およびＬ．ウェルシメリ（L. welshimeri）、サルモネラ菌、特にＳ．エンテリカ（S. enterica）、Ｓ．ガリナラム（S. gallinarum）、Ｓ．プロラム（pullorum）、Ｓ．アリゾナエ（S. arizonae）、Ｓ．ティフィムリウム（S. typhimurium）、Ｓ．エンテリティディス（S. enteritidis）およびＳ．ボンゴリ（S. bongori）、エンテロコッカス菌、特にＥ．ファエカリス（E. faecalis）、Ｅ．フェシウム（E. faecium）およびＥ．セコラム（E. cecorum）、スタフィロコッカス菌、特にＳ．アウレウス（S. aureus）、アエロモナス菌、ストレプトコッカス菌、特にＳ．スイスおよびＳ．ガリナセウス（S. gallinaceus）、カンピロバクター菌、特にＣ．ジェジュニ（C. jejuni）およびＣ．コリ（C. coli）、大腸菌、ならびにビブリオ菌、特にＶ．パラヘモリティカス（V. parahemolyticus）およびＶ．ハーベイ（V. harveyi）から選択され、かつ上記有益な細菌が、好ましくは乳酸菌、特に乳酸桿菌（Lactobacilli）およびビフィズス菌（Bifidobacteria）から選択される、方法である。
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも１種の病原性細菌の量、特にＣ．パーフリンジェンスの量は、少なくとも０．５ｌｏｇ、より好ましくは少なくとも１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、または３ｌｏｇだけ低減される。
したがって、本発明のさらなる主題はまた、病原性細菌の増殖を阻害および／または減少させるための、および／または動物の腸内の有益な細菌の増殖を維持するおよび／または増加させるための本発明の発酵ブロスであって、上記病原性細菌が、好ましくは、クロストリジウム菌、特にＣ．パーフリンジェンスおよびＣ．ディフィシル、リステリア菌、特にＬ．モノサイトゲネス、Ｌ．シーリゲリおよびＬ．ウェルシメリ、サルモネラ菌、特にＳ．エンテリカ、Ｓ．ガリナラム、Ｓ．プロラム、Ｓ．アリゾナエ、Ｓ．ティフィムリウム、Ｓ．エンテリティディスおよびＳ．ボンゴリ、エンテロコッカス菌、特にＥ．ファエカリス、Ｅ．フェシウムおよびＥ．セコラム、スタフィロコッカス菌、特にＳ．アウレウス、アエロモナス菌、ストレプトコッカス菌、特にＳ．スイスおよびＳ．ガリナセウス、カンピロバクター菌、特にＣ．ジェジュニおよびＣ．コリ、大腸菌、ならびにビブリオ菌、特にＶ．パラヘモリティカスおよびＶ．ハーベイから選択され、かつ上記有益な細菌が、好ましくは乳酸菌、特に乳酸桿菌およびビフィズス菌から選択される、発酵ブロスである。
病原性細菌の発生および／または増殖の増加は、或る特定の疾患の大発生を起こす、またはその大発生につながる可能性がある。例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンスの発生および／または増殖の増加は、腸疾患の大発生、特に家禽における壊死性腸炎の大発生につながる可能性がある。クロストリジウム・パーフリンジェンスの発生および／または増殖の増加はまた、細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎、および肝胆管炎のようなさらなる疾患の大発生にもつながる可能性がある。Ｃ．パーフリンジェンスによる感染症の最も軽度の形態でさえも、すでに下痢を伴う場合があることから、敷料が濡れる結果となり、それにより趾蹠皮膚炎のような二次的な疾患が引き起こされる可能性がある。
したがって、本発明のさらなる主題はまた、上述の本発明の少なくとも１種の発酵ブロスを含む治療用組成物である。
したがって、この文脈における好ましい主題は、上述の本発明の少なくとも１種の発酵ブロスを含む、動物、好ましくは家禽における壊死性腸炎、特に無症候性壊死性腸炎の治療および／または予防のための治療用組成物である。
したがって、この文脈における別の好ましい主題は、上述の少なくとも１種の発酵ブロスを含む、動物、好ましくは家禽における細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎、肝胆管炎、クロストリジウム症、下痢および／または趾蹠皮膚炎の治療および／または予防のための治療用組成物である。
したがって、本発明のさらなる主題はまた、家禽における疾患、特に腸疾患、好ましくは壊死性腸炎、特に無症候性壊死性腸炎の治療および／または予防であって、本発明の少なくとも１種の発酵ブロスをそれを必要とする動物に投与する、治療および／または予防である。
したがって、本発明のさらなる主題はまた、細菌性腸炎、壊疽性皮膚炎、肝胆管炎、クロストリジウム症、下痢および／または趾蹠皮膚炎から選択される疾患、好ましくは家禽の疾患の治療および／または予防であって、本発明の少なくとも１種の発酵ブロスをそれを必要とする動物に投与する、治療および／または予防である。
本発明の発酵ブロスは、動物の生涯を通じて、または動物の生涯の特定の段階もしくは特定の部分の間に、複数日にわたって飼料および／または飲料水中で動物に投与され得る。例えば、菌株および／または組成物は、畜類の離乳飼料中でのみ、または仕上げ飼料中でのみ投与され得る。
本発明の組成物、特に飼料、食品および医薬組成物、ならびに飲料水または飼育水は、好ましくは、本発明の発酵ブロスを０．１重量％～１０重量％、より好ましくは０．２重量％～５重量％、特に０．３重量％～３重量％の量で含む。
本発明の方法は、あらゆる種類の動物、特にあらゆる種類の非ヒト動物および非昆虫動物、より好ましくは、哺乳動物、水生動物および鳥類などのあらゆる種類の脊椎動物に使用され得る。
本発明から恩恵を受けることができる動物には、限定されるものではないが、畜類、ペット、エキゾチックアニマル、動物園の動物、水生動物、スポーツ、娯楽または仕事に使用される動物が含まれる。
ペットは、好ましくは、犬、猫、飼育鳥類および飼育エキゾチックアニマルから選択される。
好ましくは、水生動物は、好ましくはヒトの栄養を目的とする魚介類から選択される。水生動物には、特に、コイ、ティラピア、ナマズ、マグロ、サーモン、マス、バラマンディ、ブリーム、パーチ、タラ、小エビ、ロブスター、カニ、クルマエビ、およびザリガニが含まれる。この文脈で好ましい種類のサーモンは、アトランティックサーモン、レッドサーモン、サクラマス、キングサーモン、ケタサーモン、ギンザケ、ドナウサーモン、パシフィックサーモン、およびピンクサーモンである。
さらなる好ましい水生動物は、後に加工して魚粉または魚油を得る養殖魚である。この関連において、魚は、好ましくはニシン、ポラック、メンハーデン、カタクチイワシ、シシャモ、またはタラである。
さらなる好ましい実施形態では、動物は、消費のためにまたは食料生産動物として育てられる家禽、ブタ、および反芻動物などの畜類である。
家禽は、生産用家禽または飼育用家禽から選択され得るが、愛玩用家禽または野鳥からも選択され得る。この文脈で好ましい生産用家禽は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、およびガチョウである。この文脈での生産用家畜は、好ましくは、若齢畜を生産するために最適化された家禽、または肉を生産するために最適化された家禽である。好ましい愛玩用家禽または野鳥は、クジャク、キジ、ヤマウズラ、イワシャコ、ホロホロチョウ、ウズラ、キバシオオライチョウ、ライチョウ、ハト、およびハクチョウであり、ウズラが特に好ましい。さらなる好ましい家禽は、走禽類、特にダチョウおよびエミュー、ならびにオウムである。
本発明による反芻動物は、好ましくは、ウシ、ヤギおよびヒツジから選択される。一実施形態では、本発明の組成物を前反芻動物に給餌して、それらの健康を増進し、特にこれらの動物における下痢の発生率を減少させることができる。前反芻動物は、出生から約１２週までの年齢範囲の仔ウシを含む反芻動物である。
本発明の組成物は、少なくとも１種の担体または典型的な飼料添加物またはそれらの組み合わせを含み得る。
適切な担体は、回復、効力、もしくは物理的特性を改善するために、および／または包装および投与を助けるために添加される不活性製剤添加物である。そのような担体は、個別にまたは組み合わせて添加され得る。これらの担体は、固化防止剤、酸化防止剤、増量剤、および／または保護剤から選択され得る。有用な担体の例としては、多糖類（特にデンプン、マルトデキストリン、メチルセルロース、ガム、キトサンおよび／またはイヌリン）、タンパク質源（特にスキムミルク粉末および／またはスイートホエイパウダー）、ペプチド、糖類（特にラクトース、トレハロース、スクロースおよび／またはデキストロース）、脂肪（特にレシチン、植物油および／または鉱油）、塩類（特に塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、白亜、石灰石、炭酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウムおよび／またはクエン酸ナトリウム）、およびケイ酸塩（特に粘土、特にベオライト粘土、非晶質シリカ、フュームドシリカ／沈降シリカ、ゼオライト、フラー土、バイリット、クリントポライト、モンモリロナイト、珪藻土、タルク、ベントナイト、および／またはケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムおよび／またはケイ酸カルシウムのようなケイ酸塩）が挙げられる。動物飼料添加物に適した担体は、毎年発行されるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ，Ｉｎｃ．社の公式出版物に示されている。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓの公式出版物，編集者Ｓｈａｒｏｎ Ｋｒｅｂｓ，２００６年版，ＩＳＢＮ １－８７８３４１－１８－９を参照のこと。担体は、発酵ブロスを濃縮した後に、および／または乾燥の間におよび／または乾燥後に添加され得る。本発明による好ましい担体は、炭酸カルシウム、珪藻土および植物油から選択される。
本発明の組成物、特に飼料組成物はまた、追加の飼料添加物としてプロバイオティクスを含むことができ、ここで、該プロバイオティクスは、好ましくは、上述のプロバイオティクスの列記から、すなわち、バチルス、特にＢ．サブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．フレクサス、Ｂ．フシフォルミス、Ｂ．レンツス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセントリカス、Ｂ．モジャベンシス、Ｂ．ポリミキシア、Ｂ．プミルス、Ｂ．スミシイ、Ｂ．トヨネンシスおよびＢ．バリスモルティス、エンテロコッカス、特にＥ．フェシウムおよびＥ．ファエカリス、ゲオバチルス、特にＧ．ステアロサーモフィラス、クロストリジウム、特にＣ．ブチリカム、ならびにストレプトコッカス、特にＳ．ファエカリス、Ｓ．フェシウム、Ｓ．ガロリティカス、Ｓ．サリバリウス亜種サーモフィラスおよびＳ．ボビス、ラクトバチルス、特にＬ．アシドフィルス、Ｌ．アミロリティカス、Ｌ．アミロボラス、Ｌ．アリメンタリウス、Ｌ．アビアリエス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．セロビオサス、Ｌ．コリニフォルミス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．クルバタス、Ｌ．デルブルエッキイ、Ｌ．ファルシミニス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガリナラム、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ヒルガルディイ、Ｌ．ジョンソニイ、Ｌ．ケフィラノファシエンス、Ｌ．ケフィリ、Ｌ．ムコサエ、Ｌ．パニス、Ｌ．コリノイデス、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．パラプランタラム、Ｌ．ペントサス、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ポンティス、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サケイ、Ｌ．サリバリウスおよびＬ．サンフランシセンシス、ペディオコッカス、特にＰ．アシディラクティシ、Ｐ．デキストリニカスおよびＰ．ペントサセウス、ストレプトコッカス、特にＳ．ラクティスおよびＳ．サーモフィラス、ビフィジバクテリウム、特にＳ．アドレセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベおよびＢ．ロンガムから選択され、ここで、本発明の非常に好ましい実施形態では、発酵ブロスは、特に以下の菌株：Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２３１５、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５９２、Ｂ．リケニフォルミスＤＳＭ ３２３１４、Ｂ．プミルスＤＳＭ ３２５３９、Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０およびそれらの組み合わせから選択されるバチルス属のプロバイオティクス微生物からの発酵ブロスである。さらなる適切なプロバイオティクスは、Ｋｅｍｉｎ社によりＣＬＯＳＴＡＴ（登録商標）の商標で販売されているバチルス・サブチリスＰＢ６（米国特許第７，２４７，２９９号明細書に記載され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ－６７３７として寄託されている）、カルピス株式会社によりＣＡＬＳＰＯＲＩＮ（登録商標）として販売されているバチルス・サブチリスＣ－３１０２（米国特許第４，９１９，９３６号明細書に記載され、日本の産業技術総合研究所の微生物工業技術研究所によりＦＥＲＭ ＢＰ－１０９６として寄託されている）、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ社によりＧａｌｌｉＰｒｏ（登録商標）の商標で販売されているバチルス・サブチリスＤＳＭ １７２９９、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ社によりＧａｌｌｉＰｒｏＴｅｃｔ（登録商標）の商標で販売されているバチルス・リケニフォルミスＤＳＭ １７２３６、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ社によりＢｉｏＰｌｕｓ（登録商標）ＹＣの商標で販売されているバチルス・リケニフォルミスＤＳＭＺ ５７４９およびバチルス・サブチリスＤＳＭＺ ５７５０胞子の混合物、Ａｄｉｓｓｅｏ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社によりＡｌｔｅｒｉｏｎ（登録商標）の商標で販売されているＢ．サブチリスＤＳＭ ２９７８４、Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ社によりＰＯＲＣＢＯＯＳＴ（登録商標）の商標で販売されているバチルス・サブチリス、または米国特許第６，８４９，２５６号明細書に記載されているバチルス・コアギュランス菌株から選択される。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、またはハンゼヌラ（Hansenula）などの他の非バチルスのプロバイオティクスを、本発明の組成物に使用することもできる。
さらに本発明による組成物に含まれ得る、および／または本発明による濃縮発酵ブロスもしくは乾燥発酵ブロスから出発する飼料組成物の調製に使用され得る適切な典型的な動物飼料添加物には、以下の、タンパク質、炭水化物、脂肪、プレバイオティクス、酵素、ビタミン、免疫調節剤、代用乳、ミネラル、アミノ酸、コクシジウム抑制薬、酸ベースの製品および／または医薬品、例えば抗生物質のうちの１つ以上が含まれる。
本発明により使用され得る炭水化物含有構成材料は、例えば、飼草、粗飼料、小麦全粒粉、ひまわり粕または大豆粕、およびそれらの混合物である。
本発明により使用され得るタンパク質含有構成材料は、例えば、大豆タンパク質、エンドウ豆タンパク質、小麦グルテンまたはコーングルテン、およびそれらの混合物である。
本発明により使用され得る脂肪含有構成材料は、特に、植物油、例えば、大豆油、菜種油、ヒマワリ種子油、亜麻仁油、またはパーム油、魚油、およびそれらの混合物のような動物由来および植物由来の両方の油である。
本発明により使用され得るさらに脂肪を含むタンパク質含有構成材料は、例えば、魚粉、オキアミ粉末、二枚貝粉末、イカ粉末、または小エビ殻、ならびにそれらの組み合わせである。
本発明により使用され得るプレバイオティクスは、好ましくはオリゴ糖類であり、特にガラクトオリゴ糖、シアリルオリゴ糖（silayloligosaccharide）、ラクツロース、ラクトスクロース、フルクトオリゴ糖、パラチノースまたはイソマルトースオリゴ糖、グリコシルスクロース、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、シクロデキストリン、ゲンチオオリゴ糖、大豆オリゴ糖、キシロオリゴ糖、デキストラン、ペクチン、ポリガラクツロナン、ラムノガラクツロナン、マンナン、ヘミセルロース、アラビノガラクタン、アラビナン、アラビノキシラン、レジスタントスターチ、メリビオース（mehbiose）、キトサン、アガロース、イヌリン、タガトース、ポリデキストロース、およびアルギン酸塩から選択される。
本発明による飼料組成物に使用することができ、飼料の消化を助けることができる酵素は、好ましくは、フィターゼ（ＥＣ ３．１．３．８またはＥＣ ３．１．３．２６）、キシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８）、ガラクタナーゼ（ＥＣ ３．２．１．８９）、ガラクトシダーゼ、特にα－ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２２）、プロテアーゼ（ＥＣ ３．４）、ホスホリパーゼ、特にホスホリパーゼＡ１（ＥＣ ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ ３．１．１．４）、ホスホリパーゼＣ（ＥＣ ３．１．４．３）、およびホスホリパーゼＤ（ＥＣ ３．１．４．４）、リゾホスホリパーゼ（ＥＣ ３．１．１．５）、アミラーゼ、特にα－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、リゾチーム（ＥＣ ３．２．１．１７）、グルカナーゼ、特にβ－グルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４またはＥＣ ３．２．１．６）、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、またはそれらの任意の混合物から選択される。
市販のフィターゼの例としては、Ｂｉｏ－Ｆｅｅｄ（商標）フィターゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰおよびＨｉＰｈｏｓ（商標）（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）、Ｎａｔｕｐｈｏｓ（商標）（ＢＡＳＦ社）、Ｆｉｎａｓｅ（登録商標）およびＱｕａｎｔｕｍ（登録商標）Ｂｌｕｅ（ＡＢ Ｅｎｚｙｍｅｓ社）、Ｐｈｙｚｙｍｅ（登録商標）ＸＰ（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ／ＤｕＰｏｎｔ社）およびＡｘｔｒａ（登録商標）ＰＨＹ（ＤｕＰｏｎｔ社）が挙げられる。他の好ましいフィターゼとしては、例えば、国際公開第９８／２８４０８号、国際公開第００／４３５０３号、および国際公開第０３／０６６８４７号に記載されるフィターゼが挙げられる。
市販のキシラナーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＷＸおよびＧ２（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）、Ｅｃｏｎａｓｅ（登録商標）ＸＴおよびＢａｒｌｅｙ（ＡＢ Ｖｉｓｔａ社）、Ｘｙｌａｔｈｉｎ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ社）およびＡｘｔｒａ（登録商標）ＸＢ（キシラナーゼ／β－グルカナーゼ、ＤｕＰｏｎｔ社）が挙げられる。市販のプロテアーゼの例としては、Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標）ＰｒｏＡｃｔ（ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）が挙げられる。
本発明により使用され得るビタミンは、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、例えば、ビタミンＫ３、ビタミンＢ１２、ビオチン、コリン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシン、葉酸、およびパントテン酸塩、例えば、Ｄ－パントテン酸カルシウム、またはそれらの組み合わせである。
使用され得る免疫調節剤は、例えば、抗体、サイトカイン、噴霧乾燥血漿、インターロイキン、もしくはインターフェロン、またはそれらの組み合わせである。
本発明により使用され得るミネラルは、例えば、ホウ素、コバルト、塩化物、クロム、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マンガン、モリブデン、セレン、亜鉛、カルシウム、マグネシウム、カリウム、もしくはナトリウム、またはそれらの組み合わせである。
本発明により使用され得るアミノ酸は、例えば、リシン、アラニン、トレオニン、メチオニン、バリン、もしくはトリプトファン、またはそれらの組み合わせである。
したがって、本発明のさらなる実施形態は、動物飼料組成物を調製する方法であって、少なくとも１種の発酵ブロス、特に乾燥発酵ブロス、または本発明による発酵ブロスの混合物を、特に動物の健康を増進するのに有効な量で、タンパク質、脂肪および／または炭水化物などの飼料添加物、ならびに任意に、好ましくは上述の有益な物質と混合して、飼料製品を得ることを含む、方法である。この方法は、例えば、ペレット化工程も含み得る。
乾燥飼料または半湿性飼料の押出加工を含む当業者に知られる標準的なペレット化プロセスを使用することができる。好ましいペレット化温度は、約６５℃から約１２０℃の間である。
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の飼料組成物を調製する際に、本発明による発酵ブロスが、後続の工程において、すでに調製された飼料製品、特に飼料ペレットへと添加され、ここで、発酵ブロスをすでに調製された飼料製品、特に飼料ペレットに添加することは、好ましくは、吹き付けコーティングまたは真空コーティングによって行われる。この方法は、発酵ブロスに含まれる酵素の熱分解を完全に回避することができるという特定の利点を有する。
さらに、油および／または酵素のような影響を受けやすい他の材料を、吹き付けコーティングまたは真空コーティングによって、飼料製品、特に飼料ペレットに添加することができる。
本発明の発酵ブロスは、例えば、米国特許第６，０６０，０５１号明細書、欧州特許第０２８７６９９号明細書、米国特許出願公開第２０１４／００１０７９２号明細書またはＦＡＯ Ｒｅｐｏｒｔ １７９（２０１６年）：「動物の栄養におけるプロバイオティクス（Probiotics in Animal Nutrition）」に記載される培地、条件および方法を使用することを含む当該技術分野でよく知られる方法に従って本発明の菌株を培養することによって得ることができる。慣用の大規模微生物培養プロセスとしては、深部発酵、固体発酵、または液体表面培養が挙げられる。発酵の終わりに向けて栄養が枯渇すると、バチルス菌株の細胞は増殖期から胞子形成期へと移行し始めるため、発酵の最終産物は主に胞子、代謝産物、および残留発酵培地である。胞子形成はこれらの菌株の天然のライフサイクルの一部であり、一般的に栄養の制限に応答して細胞によって開始される。発酵は、高レベルのコロニー形成単位のプロバイオティクス細胞が得られ、胞子形成が促進されるように構成されている。
好ましくは、本発明によれば、本発明の実施形態では、常に有効量の本発明の発酵ブロスが使用される。「有効量」という用語は、本発明の発酵ブロスが投与されていないが、それ以外には同じ食餌（飼料および他の化合物を含む）が投与されている動物と比較して、特にすでに上述の特徴に関して、動物および／または環境に少なくとも１つの有益な効果をもたらす量を指す。
治療的適用の場合に、好ましくは、治療的量の本発明の発酵ブロスが使用される。「治療的量」という用語は、動物における病状を改善、回復、または予防するのに十分な量を指す。さまざまな動物に最適な投与量レベルは、とりわけ、組成物が（ｉ）さまざまな用量で腸内の病原性細菌を阻害もしくは低減する能力、（ｉｉ）有益な細菌のレベルを増加もしくは維持する能力、および／または（ｉｉｉ）さまざまな用量で動物の健康を増進する能力を評価することにより、当業者によって容易に決定され得る。
ａ）Ｂ．サブチリス菌株ＤＳＭ ３２５４０の栄養細胞、ｂ）Ｂ．アミロリケファシエンス菌株ＣＥＣＴ ５９４０の栄養細胞、ｃ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清、ｄ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清のセルラーゼ活性を示す図である。セルラーゼ活性は、寒天プレート上でセルロース加水分解の区域周辺に清澄化を引き起こす。 ａ）Ｂ．サブチリス菌株ＤＳＭ ３２５４０の栄養細胞、ｂ）Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０発酵物の滅菌濾過された上清、ｃ）Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清、ｄ）Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０発酵物の滅菌濾過していない非乾燥上清、ｅ）Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０発酵物の滅菌濾過していない上清のセルラーゼ活性を示す図である。セルラーゼ活性は、寒天プレート上でセルロース加水分解の区域周辺に清澄化を引き起こす。 ａ）～ｄ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された（凍結乾燥されて溶解された）上清、ｅ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の栄養細胞のセルラーゼ活性を示す図である。セルラーゼ活性は、寒天プレート上でセルロース加水分解の区域周辺に清澄化を引き起こす。 ａ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の栄養細胞、ｂ）Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０の栄養細胞、ｃ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清、ｄ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清のキシラナーゼ活性を示す図である。キシラナーゼ活性は、寒天プレート上でキシラン加水分解の区域周辺に清澄化を引き起こす。 ａ）～ｄ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された（凍結乾燥されて溶解された）上清、ｅ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０菌株の栄養細胞のアミラーゼ活性を示す図である。アミラーゼ活性は、寒天プレート上でデンプン加水分解の区域周辺に清澄化を引き起こす。 ａ）Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０の栄養細胞、ｂ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の栄養細胞、ｃ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清、ｄ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清のプロテアーゼ活性を示す図である。プロテアーゼ活性は、寒天プレート上で基質加水分解の区域周辺に清澄化を引き起こす。 ａ）～ｄ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された（凍結乾燥されて溶解された）上清、ｅ）Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の栄養細胞のプロテアーゼ活性を示す図である。プロテアーゼ活性は、寒天プレート上で基質加水分解の区域周辺に清澄化を引き起こす。 Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０の発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清で２４時間処理された大豆タンパク質抽出物のＳＤＳ－ＰＡＧＥパターンを示す図である。 Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清で２４時間処理された大豆タンパク質抽出物のＳＤＳ－ＰＡＧＥパターンを示す図である。示されるタンパク質バンドは、ｎＬＣ／ＭＳ分析によって以下のように特定された：１－ ダイズ（Glycine max）のβ－コングリシニンのα’鎖、２－ ダイズのβ－コングリシニンのαサブユニット、３－ ダイズのβ－コングリシニンのαサブユニット、４－ ダイズのグリシニン、５－ ダイズのβ－コングリシニンのα’サブユニット、６－ ダイズのβ－コングリシニンのα’サブユニット、７－ ダイズのβ－コングリシニンのαサブユニット。
実施例
実施例１．消化酵素活性の定性的評価および定量的評価
プロバイオティクスＢ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０およびＢ．アミロリケファシエンス菌株ＣＥＣＴ ５９４０の標準培地での発酵物の上清を、消化酵素活性、特に好気的セルロース分解活性（図１～図３）、キシラン分解活性（図４）、アミラーゼ活性（図５）、およびタンパク質分解活性（図６～図７）について評価した。
セルラーゼ活性を評価するために、プロバイオティクスバチルス発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清および／または凍結乾燥されて溶解された上清３μｌを、５ｇ／ｌのＳｉｇｍａｃｅｌｌセルロースを含むＬＢ寒天上にスポットした。プロテアーゼ活性についてスクリーニングするために、プロバイオティクスバチルス菌株発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清および／または凍結乾燥されて溶解された上清３μｌを、１０％のスキムミルクを含むＬＢ寒天上にスポットした。キシラナーゼ活性は、０．５％のキシランを含むＬＢ寒天上で同様に分析した。アミラーゼ活性は、１０ｇ／ｌの可溶性デンプンを含むＬＢ寒天上で分析した。
ポジティブコントロールとして、それぞれのプロバイオティクス菌株の栄養細胞の酵素活性を分析した。したがって、３μｌの液体培養物をそれぞれの寒天プレート上に直接スポットし、それらを好気的条件下にて３７℃でインキュベートした。読み取られたパラメーターは、酵素活性に起因する加水分解区域の出現であった。セルラーゼアッセイおよびアミラーゼアッセイで使用されたプレートをルゴールのヨウ素溶液で染色した（図１～図３、図５）。
定性的な方式での消化酵素活性の分析により、それぞれの活性が滅菌濾過された上清だけでなく、凍結乾燥されて溶解された滅菌濾過された上清においても見出され得ることが分かった。
さらに、バチルス菌株発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清のタンパク質分解活性を定量的な方式で評価した。１０μＬの滅菌濾過された上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（二塩基性、無水）と１５０ｍＭの塩化ナトリウムとからなる２０μＬの緩衝液を含む２０μＬの０．５％のフルオレセインイソチオシアネートカゼイン（ＦＩＴＣ；Ｃ３７７７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液（すべての成分はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）に添加した後に、３７℃で１時間インキュベートした。１５０μＬの１０％（容量／容量）トリクロル酢酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加して３７℃でさらに３０分間インキュベートした後に、試料を１９０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次いで２μＬの上清を２００μＬの５００ｍＭのＴＲＩＳ ＨＣｌ溶液（Ｔｒｉｚｍａ ＢａｓｅＴＲＩＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に移した。タンパク質分解的放出による可溶性ペプチドの蛍光を、励起４９４ｎｍ、発光５１８ｎｍで測定した（ＴＥＣＡＮ ＧＥＮｉｏｓマイクロプレートリーダー、Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．社、スイス、メンネドルフ）。２回の独立した実行で分析を実施した後に、溶液１マイクロリットル当たりのミリ単位として平均化した。結果は表１に見られる。
Figure 2022516797000002
直接的な比較において、Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０の発酵物の上清は、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０の発酵物の上清よりも１０倍を超えて高められたプロテアーゼ活性を有する。
実施例２．プロバイオティクスバチルス菌株の発酵物の上清による病原体阻害
発酵の間にプロバイオティクスバチルス菌株によって産生された二次代謝産物を介した上清による病原体阻害を、ウェル拡散拮抗作用試験（well diffusion antagonism test）を使用して評価した（Ｐａｒｅｎｔｅら．１９９５年）。
種々の病原体、すなわち、ＴｅｏおよびＴａｎ（２００５年）からのクロストリジウム・パーフリンジェンス基準株ＡＴＣＣ １３１２４およびストレプトコッカス・スイスＡＴＣＣ ４３７６５を用いたウェル拡散拮抗作用試験を実施した（凍結乾燥されて溶解された滅菌濾過された上清を用いてアッセイを実施した）。菌株ＡＴＣＣ １３１２４は、クロストリジウム菌についての基準株としての役割を果たすα毒素産生Ａ型菌株であることが知られている。
Ｓ．スイスは、ブタにおける重要な病原体であり、敗血症、髄膜炎、およびその他の多くの感染症を引き起こす離乳後の仔ブタにおける細菌性死亡の最も重要な原因の１つである（Ｇｏｙｅｔｔｅ－Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓら．２０１４年）。ＡＴＣＣ ４３７６５は血清群：Ｒ；血清型２に属し、ブタから分離された。
病原性菌株を、適切な条件下で液体培養として少なくとも１の６００ｎｍの光学密度まで増殖させた後に、１３０μｌを寒天プレートの表面上に滅菌スパチュラで広げた。すべての病原体に関して、ＴＳＢＹＥ寒天プレートが使用される。乾燥プレートに９ｍｍ直径のウェルの切り込みを入れた。１つ目のウェルは培養物なしの非接種培地コントロールとして使用され、他のウェルにはプロバイオティクスバチルス菌株の発酵物の１００μＬの滅菌濾過された上清（熱処理を伴うまたは伴わない）を接種した。適切な条件下にて３７℃で２４時間インキュベートした後に、切り込んだウェルの縁部から清澄化された菌叢の境界までを測定して、清澄化区域をｍｍ単位で測定した。各コロニーを２回（水平、垂直）測定して、平均を取った。結果は以下の表２および表３に見られる。
Figure 2022516797000003
データは、Ｂ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の非乾燥上清（熱処理もされている）がＣ．パーフリンジェンスの増殖を非常に効果的に阻害することを示している。
Figure 2022516797000004
データは、Ｂ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０発酵物の上清（熱処理もされている）がＳ．スイスＡＴＣＣ ４３７６５の増殖を非常に効果的に阻害することを示している。さらに、凍結乾燥後にも依然として阻害効果を観察することができた。
Ｔｅｏ，Ａ．Ｙ．－Ｌ．およびＴａｎ，Ｈ．－Ｍ．（２００５年）．「健康なニワトリの胃腸管由来のバチルス・サブチリスの新規菌株によるクロストリジウム・パーフリンジェンスの阻害（Inhibition of Clostridium perfringens by a novel strain of Bacillus subtilis from the gastrointestinal tracts of healthy chickens）」．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７１：４１８５～９０．
Ｐａｒｅｎｔｅ，Ｅ．，Ｂｒｉｅｎｚａ，Ｃ．，Ｍｏｌｅｓ，Ｍ．，＆ Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ，Ａ．（１９９５年）．「バクテリオシン活性の測定方法の比較（A comparison of methods for the measurement of bacteriocin activity）」．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ，２２（１），９５～１０８．
Ｇｏｙｅｔｔｅ－Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ，Ｇ．，Ａｕｇｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｓｅｇｕｒａ，Ｍ．およびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｍ．（２０１４年）．「重要なブタ病原体であり、浮上しつつある人獣共通感染症の病原体であるストレプトコッカス・スイス－血清型別および配列型別に基づく世界的分布の最新情報（Streptococcus suis,an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing）」．Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２０１４年６月；３（６）：ｅ４５．
実施例３．大豆粕の抗栄養因子に対するプロバイオティクスバチルス菌株発酵物の滅菌濾過された上清の加水分解活性の評価
ＩｗａｂｕｃｈｉおよびＹａｍａｕｃｈｉ（１９８７年）から改変された方法を使用して、脱脂大豆粕からタンパク質を抽出した。１０ｍＭのβ－メルカプトエタノールを含む１００ｍｌの０．０３ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）を使用して、脱脂大豆粕を室温で１時間撹拌しながら抽出した。試料を遠心分離し、上清を滅菌濾過し、試料を－２０℃で貯蔵した。
プロバイオティクスＢ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０発酵物およびＢ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清を、大豆タンパク質抽出物とともに２：１の比率にて３７℃でインキュベートした。試料を０時間、６時間、および２４時間で採取し、遠心分離し、さらなる分析をするために上清を－２０℃で貯蔵した。未使用の培地を添加したコントロール試料を並行して分析した。
Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、米国）を使用して、タンパク質濃度を測定した。ＳＤＳ－Ｐａｇｅを使用して、タンパク質加水分解を確認した。タンパク質濃度を調整し、タンパク質を９５℃で５分間熱処理することにより変性させてから、ゲルへとロードした。２０μｇの抽出されたタンパク質を、１０％ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｔｅａｎ ＴＧＸプレキャストＳＤＳゲルの各ウェルにロードした。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓタンパク質ラダーをマーカー（１０ｋＤａ～２５０ｋＤａ）として使用した。タンパク質を４０ｍＡで１時間分離した。ゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２５０溶液およびクマシーブリリアントブルーＲ２５０溶液で染色し、酢酸溶液で脱色した。時間の経過に伴うタンパク質バンドの消失により、大豆タンパク質の分解を観察することができた（図８および図９）。
大豆タンパク質抽出物のタンパク質分解は、培地および大豆タンパク質抽出物のみを含むコントロール試料では検出することができなかった。大豆タンパク質抽出物をそれぞれＢ．サブチリスＤＳＭ ３２５４０発酵物およびＢ．アミロリケファシエンスＣＥＣＴ ５９４０発酵物の滅菌濾過された上清とともに６時間および２４時間インキュベートした後に、顕著なタンパク質の加水分解を検出することができた。より小さなペプチド（２５ｋＤａ未満）の増加に伴って、複数のより大きなタンパク質のバンド（２５ｋＤａ～７５ｋＤａ）が減少した。時間の経過とともに分解されたタンパク質バンドおよび培地のみとインキュベートされた大豆抽出物のコントロール試料からの特定のバンドを、ナノＬＣ／ＭＳによって分析したところ、これらは、高分解能質量分析によりダイズのβ－コングリシニンおよびグリシニンであると特定された。したがって、大豆の抗原性タンパク質であるβ－コングリシニンおよびグリシニンは、バチルス発酵物の滅菌濾過された非乾燥上清とのインキュベーションの間に分解された。
Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｓ．およびＹａｍａｕｃｈｉ，Ｆ．（１９８７年）：「免疫学的方法による大豆タンパク質中のグリシニンおよびβ－コングリシニンの測定（Determination of glycinin and β-conglycinin in soybean proteins by immunological methods）」．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．３５，２００～２０５．

Claims (19)

  1. 乾燥発酵ブロスを製造する方法であって、以下の工程：
    ａ）微生物を発酵培地中で培養して、微生物を含む発酵ブロスを得る工程、
    ｂ）前記発酵ブロスから前記微生物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％または９０％を分離する工程、
    ｃ）こうして得られた発酵ブロスを乾燥させて、乾燥発酵ブロスを得る工程、
    を含む、方法。
  2. 前記発酵ブロスの乾燥は、凍結乾燥、噴霧乾燥、真空乾燥、流動床乾燥、または噴霧造粒によって実施される、請求項１記載の方法。
  3. 前記微生物は、プロバイオティクス微生物であり、好ましくはバチルス、特にＢ．サブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．フレクサス、Ｂ．フシフォルミス、Ｂ．レンツス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセントリカス、Ｂ．モジャベンシス、Ｂ．ポリミキシア、Ｂ．プミルス、Ｂ．スミシイ、Ｂ．トヨネンシスおよびＢ．バリスモルティス、エンテロコッカス、特にＥ．フェシウムおよびＥ．ファエカリス、ゲオバチルス、特にＧ．ステアロサーモフィラス、クロストリジウム、特にＣ．ブチリカム、ならびにストレプトコッカス、特にＳ．ファエカリス、Ｓ．フェシウム、Ｓ．ガロリティカス、Ｓ．サリバリウス亜種サーモフィラスおよびＳ．ボビス、ラクトバチルス、特にＬ．アシドフィルス、Ｌ．アミロリティカス、Ｌ．アミロボラス、Ｌ．アリメンタリウス、Ｌ．アビアリエス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．セロビオサス、Ｌ．コリニフォルミス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．クルバタス、Ｌ．デルブルエッキイ、Ｌ．ファルシミニス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガリナラム、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ヒルガルディイ、Ｌ．ジョンソニイ、Ｌ．ケフィラノファシエンス、Ｌ．ケフィリ、Ｌ．ムコサエ、Ｌ．パニス、Ｌ．コリノイデス、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．パラプランタラム、Ｌ．ペントサス、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ポンティス、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サケイ、Ｌ．サリバリウスおよびＬ．サンフランシセンシス、ペディオコッカス、特にＰ．アシディラクティシ、Ｐ．デキストリニカスおよびＰ．ペントサセウス、ストレプトコッカス、特にＳ．ラクティスおよびＳ．サーモフィラス、ビフィジバクテリウム、特にＳ．アドレセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベおよびＢ．ロンガムから選択され、ここで、Ｂ．サブチリスおよびＢ．アミロリケファシエンスが特に好ましい、請求項１または２記載の方法。
  4. 発酵培地中で少なくとも１種の微生物を培養し、前記発酵ブロスから前記微生物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、７０％または９０％を除去し、引き続きこうして得られた発酵ブロスを乾燥させることによって得ることができる微生物の乾燥発酵ブロスであって、前記乾燥発酵ブロスは、微生物を１重量％未満の量で、好ましくは０．５重量％、０．２重量％または０．１重量％未満の量で含む、乾燥発酵ブロス。
  5. 前記乾燥発酵ブロスは、固化防止剤、酸化防止剤、増量剤、および／または保護剤から選択される、特に多糖類（特にデンプン、セルロース、メチルセルロース、マルトデキストリン、ガム、デキストラン、キトサンおよび／またはイヌリン）、ポリエチレングリコール、アミノ酸（特にプロリン、グリシンおよび／またはグルタミン酸）、タンパク質源（特にペプトン、スキムミルク粉末および／またはスイートホエイパウダー）、ペプチド、糖類（特にラクトース、キシロース、フルクトース、トレハロース、スクロースおよび／またはデキストロース）、ポリオール（特にマンニトール、グリセロールおよび／またはソルビトール）、酵母抽出物、麦芽抽出物、大豆粉、脂質（特にレシチン、植物油および／または鉱油）、塩類（特に塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、白亜、石灰石、炭酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネシウムおよび／またはクエン酸ナトリウム）、およびケイ酸塩（特に粘土、特にベオライト粘土、非晶質シリカ、フュームドシリカ／沈降シリカ、ゼオライト、フラー土、バイリット、クリントポライト、モンモリロナイト、珪藻土、タルク、ベントナイト、および／またはケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムおよび／またはケイ酸カルシウムのようなケイ酸塩）から選択される少なくとも１種の物質を含む、請求項４記載の乾燥発酵ブロス。
  6. 前記乾燥発酵ブロスは、プロバイオティクス微生物の発酵ブロスであり、好ましくはバチルス、特にＢ．サブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．フレクサス、Ｂ．フシフォルミス、Ｂ．レンツス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセントリカス、Ｂ．モジャベンシス、Ｂ．ポリミキシア、Ｂ．プミルス、Ｂ．スミシイ、Ｂ．トヨネンシスおよびＢ．バリスモルティス、エンテロコッカス、特にＥ．フェシウムおよびＥ．ファエカリス、ゲオバチルス、特にＧ．ステアロサーモフィラス、クロストリジウム、特にＣ．ブチリカム、ならびにストレプトコッカス、特にＳ．ファエカリス、Ｓ．フェシウム、Ｓ．ガロリティカス、Ｓ．サリバリウス亜種サーモフィラスおよびＳ．ボビス、ラクトバチルス、特にＬ．アシドフィルス、Ｌ．アミロリティカス、Ｌ．アミロボラス、Ｌ．アリメンタリウス、Ｌ．アビアリエス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．セロビオサス、Ｌ．コリニフォルミス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．クルバタス、Ｌ．デルブルエッキイ、Ｌ．ファルシミニス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガリナラム、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ヒルガルディイ、Ｌ．ジョンソニイ、Ｌ．ケフィラノファシエンス、Ｌ．ケフィリ、Ｌ．ムコサエ、Ｌ．パニス、Ｌ．コリノイデス、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．パラプランタラム、Ｌ．ペントサス、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ポンティス、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サケイ、Ｌ．サリバリウスおよびＬ．サンフランシセンシス、ペディオコッカス、特にＰ．アシディラクティシ、Ｐ．デキストリニカスおよびＰ．ペントサセウス、ストレプトコッカス、特にＳ．ラクティスおよびＳ．サーモフィラス、ビフィジバクテリウム、特にＳ．アドレセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベおよびＢ．ロンガムの発酵ブロス、またはそのような発酵ブロスの少なくとも２種、特に少なくとも３種の混合物から得られ、ここで、Ｂ．サブチリスおよびＢ．アミロリケファシエンスの発酵ブロスならびにそれらの混合物が特に好ましい、請求項４または５記載の乾燥発酵ブロス。
  7. バチルス・アミロリケファシエンスの発酵ブロス。
  8. 前記発酵ブロスは、以下の特質：
    ａ）プロテアーゼ活性、
    ｂ）セルラーゼ活性、
    ｃ）キシラナーゼ活性、
    ｄ）アミラーゼ活性、
    ｅ）フィターゼ活性、
    ｆ）カタラーゼ活性、
    ｇ）スーパーオキシドジスムターゼ活性、
    ｈ）ラクトナーゼ活性、
    ｉ）抗栄養因子（ＡＮＦ）に対する活性、
    ｊ）マイコトキシンに対する活性、
    ｋ）病原性微生物、特にＣ．パーフリンジェンスおよび／またはＳ．スイスに対する活性、
    ｌ）クオラムクエンチング活性、
    ｍ）有益な微生物に関するプレバイオティクス活性、
    のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは３つを有する、請求項４から７までのいずれか１項記載の発酵ブロス。
  9. 請求項４から８までのいずれか１項記載の発酵ブロスと、好ましくは、特にプロバイオティクスおよびプロバイオティクスの混合物、炭水化物、脂肪、プレバイオティクス、酵素、ビタミン、免疫調節剤、代用乳、ミネラル、アミノ酸、コクシジウム抑制薬、酸ベースの製品および／または医薬品、例えば抗生物質、ならびにそれらの混合物から選択される少なくとも１種のさらなる飼料添加物とを含む組成物。
  10. 請求項４から８までのいずれか１項記載の発酵ブロスまたは請求項９記載の組成物を動物に給餌する、動物の給餌方法。
  11. 動物の健康を増進し、かつ／または動物の全身健康状態を改善し、かつ／または動物の飼料要求率を改善し、かつ／または動物の死亡率を減少させ、かつ／または動物の生存率を増加させ、かつ／または動物の体重増加を改善し、かつ／または動物の耐病性を高め、かつ／または動物の免疫応答を増加させ、かつ／または動物における健康な腸内細菌叢を確立もしくは維持し、かつ／または動物の糞便を通じて放出される病原体を減少させる方法であって、請求項４から８までのいずれか１項記載の少なくとも１種の発酵ブロスおよび／または請求項９記載の少なくとも１種の組成物を動物に投与する、方法。
  12. 水または水溶液、特に飲料水および／または飼育水の質を制御および／または改善する方法であって、請求項４から８までのいずれか１項記載の少なくとも１種の発酵ブロスおよび／または請求項９記載の少なくとも１種の組成物を水または水溶液に適用する工程を含む、方法。
  13. 栽培植物の微生物病を治療および／または予防する方法であって、請求項４から８までのいずれか１項記載の少なくとも１種の発酵ブロスおよび／または請求項９記載の少なくとも１種の組成物を栽培植物に適用する工程を含む、方法。
  14. 動物飼料または飼料添加物の特性を改善する方法であって、前記動物飼料または前記飼料添加物を、好ましくは前記微生物の少なくとも２０％が除去された微生物の発酵ブロスで処理する、方法。
  15. 改善させる前記特性は、抗栄養因子（ＡＮＦ）、特にβ－コングリシニンおよび／またはグリシニンの量を減少させること、および／またはマイコトキシンを分解すること、および／または動物によるタンパク質の使用可能性を高めること、および／または特にｐＨを下げることにより、および／または飼料もしくは飼料添加物中の汚染微生物の量を低下させることにより飼料もしくは飼料添加物の保存を高めることから選択される、請求項１４記載の方法。
  16. 前記飼料添加物は、トウモロコシ、大豆、大麦、米、オート麦、モロコシ、大豆粕、菜種粕および綿実粕から選択される、請求項１４または１５記載の方法。
  17. 前記動物飼料または前記飼料添加物と前記発酵ブロスとを、２：１～１：２０の比率、特に１：１～１：１０の比率で混合する、請求項１４から１６までのいずれか１項記載の方法。
  18. 前記動物飼料または前記飼料添加物と前記発酵ブロスとを、少なくとも１時間、特に１時間～１００時間、好ましくは少なくとも２時間、特に２時間～８０時間、より好ましくは少なくとも４時間、特に４時間～５０時間にわたってインキュベートする、請求項１４から１７までのいずれか１項記載の方法。
  19. 前記発酵ブロスは、プロバイオティクス細菌、好ましくはバチルス、特にＢ．サブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．アトロファエウス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．フレクサス、Ｂ．フシフォルミス、Ｂ．レンツス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．メセントリカス、Ｂ．モジャベンシス、Ｂ．ポリミキシア、Ｂ．プミルス、Ｂ．スミシイ、Ｂ．トヨネンシスおよびＢ．バリスモルティス、エンテロコッカス、特にＥ．フェシウムおよびＥ．ファエカリス、ゲオバチルス、特にＧ．ステアロサーモフィラス、クロストリジウム、特にＣ．ブチリカム、ならびにストレプトコッカス、特にＳ．ファエカリス、Ｓ．フェシウム、Ｓ．ガロリティカス、Ｓ．サリバリウス亜種サーモフィラスおよびＳ．ボビス、ラクトバチルス、特にＬ．アシドフィルス、Ｌ．アミロリティカス、Ｌ．アミロボラス、Ｌ．アリメンタリウス、Ｌ．アビアリエス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、Ｌ．カゼイ、Ｌ．セロビオサス、Ｌ．コリニフォルミス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．クルバタス、Ｌ．デルブルエッキイ、Ｌ．ファルシミニス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガリナラム、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ヒルガルディイ、Ｌ．ジョンソニイ、Ｌ．ケフィラノファシエンス、Ｌ．ケフィリ、Ｌ．ムコサエ、Ｌ．パニス、Ｌ．コリノイデス、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．パラプランタラム、Ｌ．ペントサス、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ポンティス、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サケイ、Ｌ．サリバリウスおよびＬ．サンフランシセンシス、ペディオコッカス、特にＰ．アシディラクティシ、Ｐ．デキストリニカスおよびＰ．ペントサセウス、ストレプトコッカス、特にＳ．ラクティスおよびＳ．サーモフィラス、ビフィジバクテリウム、特にＳ．アドレセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．ブレーベおよびＢ．ロンガムの発酵ブロス、ならびにそのような発酵ブロスの混合物から選択され、ここで、Ｂ．サブチリスおよびＢ．アミロリケファシエンスの発酵ブロスならびにそれらの混合物が特に好ましい、請求項１４から１８までのいずれか１項記載の方法。
JP2021540177A 2019-01-10 2020-01-08 発酵ブロスおよびその使用 Pending JP2022516797A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19151165.8 2019-01-10
EP19151165 2019-01-10
PCT/EP2020/050267 WO2020144207A1 (en) 2019-01-10 2020-01-08 Fermentation broths and their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2022516797A true JP2022516797A (ja) 2022-03-02

Family

ID=65013571

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021540177A Pending JP2022516797A (ja) 2019-01-10 2020-01-08 発酵ブロスおよびその使用

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220117264A1 (ja)
EP (1) EP3908651A1 (ja)
JP (1) JP2022516797A (ja)
CN (1) CN113330107A (ja)
BR (1) BR112021013484A2 (ja)
MX (1) MX2021008060A (ja)
WO (1) WO2020144207A1 (ja)
ZA (1) ZA202105751B (ja)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111972564A (zh) * 2020-09-04 2020-11-24 安佑生物科技集团股份有限公司 一种缓解仔猪断奶应激的液态人工乳及其制备方法
CN116322355A (zh) * 2020-10-07 2023-06-23 诺维信公司 用于动物饲料的新颗粒
WO2022074164A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Novozymes A/S Bacterial superoxide dismutases
CN112280707A (zh) * 2020-10-22 2021-01-29 黑龙江益菌生物科技有限公司 一种饲料用益生菌的制备方法
CN112410257B (zh) * 2020-11-26 2022-05-20 北京长兴泰华科技发展有限公司 一种抑制循环水系统底泥中病原菌的微生物菌剂及其方法
CN112574929B (zh) * 2021-01-11 2022-06-07 吉林大学 一株吉林类芽孢杆菌ypg26及其医用用途
CN112877253B (zh) * 2021-03-10 2022-06-07 闽江学院 一种饲用微生态制剂及其应用
CN113424896B (zh) * 2021-06-18 2022-04-26 北京爱蓝生物科技有限公司 一种菌酶饲料的发酵工艺
CN113430131B (zh) * 2021-06-18 2022-04-15 北京爱蓝生物科技有限公司 一种用于发酵饲料的曲块及其制备方法
EP4166002A1 (en) * 2021-10-12 2023-04-19 Evonik Operations GmbH Microbial preparations containing specific cryoprotectants
CN113831167B (zh) * 2021-11-09 2022-10-11 沈阳农业大学 一种利用沼液制备的微生物生根剂及其制备方法
CN114231445B (zh) * 2021-11-30 2024-03-26 唐山仟客莱生物科技有限公司 一种复合益生菌的混合发酵培养基及其应用
CN114410514B (zh) * 2021-12-31 2024-04-02 上海新溢生物科技工程研究中心(有限合伙) 斯密氏芽孢杆菌及其用途
CN114451485B (zh) * 2022-01-26 2022-12-30 江苏省淡水水产研究所 中药多糖提取物冻干保护剂、直投发酵剂及其制备方法
CN114982968A (zh) * 2022-05-11 2022-09-02 广州市沐家健康产业有限公司 一种利用复合菌种制备的蜂蜜荷花酵素及制备方法与应用
CN114873739B (zh) * 2022-05-17 2023-12-08 山东圣奥生物科技有限公司 一种亚硝酸盐还原酶促进剂及其应用
CN114916611B (zh) * 2022-07-20 2022-10-18 山东益得来生物科技有限公司 一种促进育肥羊胃肠道健康的菊芋益生菌剂
CN115316538A (zh) * 2022-09-01 2022-11-11 上海市农业科学院 一种适用于仔猪的发酵制剂和饲料
CN115838659B (zh) * 2022-10-09 2024-06-21 集美大学 一株粪肠球菌及其应用
CN116391793B (zh) * 2022-12-01 2023-10-24 山东中牧兽药有限公司 一种微生物发酵饲料的工艺及应用
CN115814016B (zh) * 2022-12-09 2024-03-29 山东泰山生力源集团股份有限公司 一种凝结芽孢杆菌和大蒜皮的组合物及其应用
CN116570640B (zh) * 2023-07-12 2023-09-05 清枫链食苏打饮品(吉林)有限公司 葵花盘生物碱及衍生物在降尿酸溶解痛风石产品中的应用
CN117016793A (zh) * 2023-08-10 2023-11-10 广州金叶健康科技有限公司 一种改善肠道的牛脾肽组合物及其制备方法与应用
CN117089496B (zh) * 2023-08-22 2024-07-05 轩凯生物科技(山东)有限公司 一株具有噬菌体抗性的地衣芽孢杆菌及其在制备聚谷氨酸中的应用
CN117322558A (zh) * 2023-09-28 2024-01-02 山东丰唐生态农业科技有限公司 一种构树鱼料及其制备方法
CN117286079B (zh) * 2023-11-22 2024-03-15 广东容大生物股份有限公司 一种肠源性凝结魏茨曼氏菌及其应用、包括该菌株的饲用微生态制剂及其制备方法
CN117481255B (zh) * 2023-12-06 2024-03-19 圣道生物(山东)集团有限公司 畜禽抗应激促生长制剂及其在提高饲料利用率方面的应用
CN118127104B (zh) * 2024-02-07 2024-10-11 北京伍冠肽斗生物科技有限责任公司 一种板蓝根复合肽和制备方法及其用途
CN117900254B (zh) * 2024-03-18 2024-06-14 河北雄安红鲤鱼环保科技有限公司 一种原位治理污染土壤中重金属的方法
CN118406590B (zh) * 2024-04-16 2025-03-14 青岛康迈臣生物科技有限责任公司 利用新型干酪乳酪杆菌株中药发酵及其应用
CN118303515A (zh) * 2024-04-26 2024-07-09 昆明理工大学 一种中草药饲料添加剂及其应用
CN119184226B (zh) * 2024-10-10 2025-05-27 天津现代天骄水产饲料股份有限公司 一种增强虾类抗病性的复合微生物水产饲料及其制备工艺
CN119264245B (zh) * 2024-12-06 2025-03-14 烟台融科生物科技有限公司 一种同时提取鱼骨中硫酸软骨素和胶原蛋白肽的方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5581585A (en) * 1972-01-24 1980-06-19 Upjohn Co Amino acid producing microorganism
WO2000030661A1 (fr) * 1998-11-26 2000-06-02 Meito Sangyo Kabushiki Kaisha Compositions bacteriostatiques contre les salmonelles
WO2001080665A1 (en) * 2000-04-26 2001-11-01 Land O'lakes, Inc. A method of treating soy proteins and a soy protein product produced by this method
JP2008179595A (ja) * 2006-12-28 2008-08-07 Nisshin Pharma Inc 新規乳酸菌および脂肪細胞分化促進用乳酸菌発酵産物
WO2010024413A1 (ja) * 2008-08-29 2010-03-04 明治飼糧株式会社 抗コクシジウム組成物
JP2012000093A (ja) * 2010-06-21 2012-01-05 Rakuno Gakuen 新規乳酸菌及び新規乳酸菌含有組成物
JP2015534457A (ja) * 2012-08-14 2015-12-03 マローネ バイオ イノベーションズ，インコーポレイテッド 抗真菌、抗細菌および成長促進活性を有するバチルス種（ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）菌株
JP2016523104A (ja) * 2013-12-24 2016-08-08 ムハンメド マジード バチルス・コアグランスから部分精製された細胞外代謝産物の生成方法およびそれらの生物学的用途
JP2017521369A (ja) * 2014-05-28 2017-08-03 バイエル クロップサイエンス エルピーBayer Cropscience Lp 植物における菌類病及び細菌病を防除するための組成物及び方法
WO2019002471A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Evonik Degussa Gmbh DEBACILLUS SUBTILIS STRAIN HAVING PROBIOTIC ACTIVITY

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2090243A (en) * 1980-12-31 1982-07-07 Pfizer Ltd Polycyclic ethers "antibiotics"
US4751317A (en) * 1986-08-29 1988-06-14 Pfizer Inc. Inophore antibacterial agent from streptomyces
JPS63209580A (ja) 1987-02-25 1988-08-31 Karupisu Shokuhin Kogyo Kk バチルス・ズブチリスｃ−３１０２
WO1998028408A1 (en) 1996-12-20 1998-07-02 Novo Nordisk A/S Peniophora phytase
DK0981540T3 (da) 1997-05-09 2006-11-06 Agraquest Inc Ny Bacillus-stamme til bekæmpelse af plantesygdomme og af majsrodgnaver
AU2003203147B2 (en) 1998-03-23 2008-05-29 Novozymes A/S Phytase variants
WO2000043503A1 (en) 1999-01-22 2000-07-27 Novozymes A/S Improved phytases
US6849256B1 (en) 1999-11-08 2005-02-01 Ganeden Biotech Incorporated Inhibition of pathogens by probiotic bacteria
US7247299B2 (en) 2002-11-27 2007-07-24 Kemin Industries, Inc. Antimicrobial compounds from Bacillus subtilis for use against animal and human pathogens
BRPI0511629A (pt) * 2004-05-28 2008-01-02 Cargill Inc composição alimentar e método para aumentar produção de leite em um ruminante
US8021654B2 (en) 2008-03-14 2011-09-20 Danisco A/S Methods of treating pigs with Bacillus strains
US20100092428A1 (en) * 2008-09-17 2010-04-15 Joseph Earl Schmidt Method For Using A Bacillus Subtilis Strain To Enhance Animal Health
MX347345B (es) * 2011-05-24 2017-04-21 Bayer Cropscience Lp Combinaciones sinergicasde fungicidas polienicos y peptidos no ribosomales y metodos de uso relacionados.
ES2447090B1 (es) * 2012-08-01 2014-12-19 Norel, S.A Aditivos para alimentación de animales acuáticos que contienen probióticos.
US11331351B2 (en) * 2015-01-23 2022-05-17 Novozymes A/S Bacillus strains improving health and performance of production animals
WO2017083196A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed additive composition
US11173184B2 (en) * 2016-05-31 2021-11-16 Evonik Operations Gmbh Bacillus subtilis strain with probiotic activity

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5581585A (en) * 1972-01-24 1980-06-19 Upjohn Co Amino acid producing microorganism
WO2000030661A1 (fr) * 1998-11-26 2000-06-02 Meito Sangyo Kabushiki Kaisha Compositions bacteriostatiques contre les salmonelles
WO2001080665A1 (en) * 2000-04-26 2001-11-01 Land O'lakes, Inc. A method of treating soy proteins and a soy protein product produced by this method
JP2008179595A (ja) * 2006-12-28 2008-08-07 Nisshin Pharma Inc 新規乳酸菌および脂肪細胞分化促進用乳酸菌発酵産物
WO2010024413A1 (ja) * 2008-08-29 2010-03-04 明治飼糧株式会社 抗コクシジウム組成物
JP2012000093A (ja) * 2010-06-21 2012-01-05 Rakuno Gakuen 新規乳酸菌及び新規乳酸菌含有組成物
JP2015534457A (ja) * 2012-08-14 2015-12-03 マローネ バイオ イノベーションズ，インコーポレイテッド 抗真菌、抗細菌および成長促進活性を有するバチルス種（ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）菌株
JP2016523104A (ja) * 2013-12-24 2016-08-08 ムハンメド マジード バチルス・コアグランスから部分精製された細胞外代謝産物の生成方法およびそれらの生物学的用途
JP2017521369A (ja) * 2014-05-28 2017-08-03 バイエル クロップサイエンス エルピーBayer Cropscience Lp 植物における菌類病及び細菌病を防除するための組成物及び方法
WO2019002471A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Evonik Degussa Gmbh DEBACILLUS SUBTILIS STRAIN HAVING PROBIOTIC ACTIVITY
JP2020525034A (ja) * 2017-06-30 2020-08-27 エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー プロバイオティクス活性がある枯草菌株

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL DIAZ (COURTESY OF NOREL & NATURE NUTRICION S.A.), BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS CECT-5940 SPORES ON BROILER EFFECT OF BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS CECT-594, JPN6023003958, 8 November 2007 (2007-11-08), ISSN: 0004984028 *
INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY, vol. 254, JPN6023003960, 2017, pages 47 - 53, ISSN: 0004984029 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2021008060A (es) 2021-08-05
CN113330107A (zh) 2021-08-31
BR112021013484A2 (pt) 2021-09-14
EP3908651A1 (en) 2021-11-17
US20220117264A1 (en) 2022-04-21
ZA202105751B (en) 2022-07-27
WO2020144207A1 (en) 2020-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2022516797A (ja) 発酵ブロスおよびその使用
US20240389620A1 (en) Feed additive composition
JP7104078B2 (ja) プロバイオティクス活性がある枯草菌株
JP6991162B2 (ja) プロバイオティック活性を示すバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株
US11173184B2 (en) Bacillus subtilis strain with probiotic activity
JP2019522468A (ja) プロバイオティック活性を示すバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株
EP3645750A1 (en) Bacillus pumilus
JP7607080B2 (ja) バシラエン産生細菌またはその調製物を含有する組成物
JP2025507411A (ja) 増殖が改善されたバシラス門株
EP3447122A1 (en) Bacillus subtilis strain with probiotic activity
WO2019038153A1 (en) DEBACILLUS SUBTILIS STRAIN HAVING PROBIOTIC ACTIVITY
RU2810249C2 (ru) Ферментационные бульоны и их применение
TW201809264A (zh) 具有益生菌活性之地衣芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株
RU2804144C2 (ru) Композиции, содержащие бактерии, продуцирующие бациллен, или его препараты

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210806

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220816

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221115

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230207

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230501

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230707

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20230808

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231208

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240115

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20240116

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20240222