JP2019528169A - 耐塩性ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）による高塩分環境からのギ酸塩触媒反応 - Google Patents

Abstract

本発明は、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞を用いて高塩分廃水のギ酸塩含有量を減少させる方法に関する。本発明はさらに、塩素および／または水酸化ナトリウムの製造方法に関する。高塩分廃水とハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞とを含む組成物が本発明によってさらに包含される。【選択図】図３

Description

本発明は、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞を用いて高塩分廃水のギ酸塩含有量を減少させる方法に関する。本発明はさらに、塩素および／または水酸化ナトリウムの製造方法に関する。高塩分廃水およびハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞を含む組成物が、本発明にさらに包含される。

塩化ナトリウム電解法（ｃｈｌｏｒａｌｋａｌｉ ｐｒｏｃｅｓｓ）は、ＮａＣｌを電気分解するための工業的方法である。それは塩素と水酸化ナトリウムを製造するのに使用される技術である。高塩分溶液は、塩化ナトリウム電解法にとって重要な材料である。しかし、非常に純粋な高塩分溶液が必要とされている。したがって、リサイクルされた高塩分廃水を塩化ナトリウム電解法に使用することは困難である。例えば、ポリウレタン製造の高塩分廃水は、除去しなければならない約３００〜５００ｍｇ／ｌのギ酸塩を含有し、そうでなければ塩素はＣＯ_２で汚染されるであろう。

望ましくない全有機体炭素（ＴＯＣ）の除去は、活性炭への吸着によって達成することができる。しかしながらこれは活性炭に吸着しないギ酸塩については不可能である。

ギ酸塩はある種の微生物細胞によって、例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼなどの酵素の形成によって分解され得る。しかしながら、微生物細胞は通常、１０％を超える塩濃度を有するポリウレタン塩水などの高塩分溶液中では増殖しない。

したがって、高塩分廃水のギ酸塩含有量を減少させるための手段および方法が非常に必要とされている。

国際公開第２０１３／１２４３７５号は、ある種の好塩性および／または好塩好アルカリ性（ｈａｌｏａｌｋａｌｉｐｈｉｌｉｃ）微生物による全有機体炭素の減少を開示している。

Ｐｅｎｄａｓｈｔｅｈらは、単離された好塩性微生物のコンソーシアムによる、順次バッチリアクターの生産水の生物学的処理を開示している（Ｐｅｎｄａｓｈｔｅｈ，Ｆａｋｈｒｕ’ｌ Ｒａｚｉ，Ｃｈｕａｈ，Ｒａｄｉａｈ，Ｍａｄａｅｎｉ，ａｎｄ Ｚｕｒｉｎａ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．３１，（２０１０）ｐｐ １２２９−１２３９）。

ＨｉｎｔｅｒｅｇｇｅｒおよびＳｔｒｅｉｃｈｓｂｉｅｒは、フェノール性塩廃水の生物処理のための中程度に好塩性のハロモナ（Ｈａｌｏｍｏｎａ）株を開示している（Ｈｉｎｔｅｒｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｓｔｒｅｉｃｈｓｂｉｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１９（１９９７）ｐｐ １０９９−１１０２）。

ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）の菌株の詳細な表現型の特徴付けは、ＭａｔａＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓら（Ｍａｔａ Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ，Ｑｕｅｓａｄａ，ａｎｄ Ｂｅｊａｒ，Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２５（２００２）ｐｐ ３６０−３７５）によって提供されている。

ＷｏｏｌａｒｄおよびＩｒｖｉｎｅは、連続バッチリアクターにおける高塩分廃水の処理を開示している（Ｗｏｏｌａｒｄ ａｎｄ Ｉｒｖｉｎｅ，Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２９（１９９５）ｐｐ １１５９−１１６８）。

Ａｚａｃｈｉらは、ホルムアルデヒドの貯蔵場所で集めた土壌からの耐塩性グラム陰性真正細菌の単離を開示している（Ａｚａｃｈｉ，Ｈｅｎｉｓ，Ｏｒｅｎ，Ｇｕｒｅｖｉｃｈ，ａｎｄ Ｓａｒｉｇ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．４１（１９９５）：５４８−５５３）。この株は、ＭＡ−Ｃと命名され、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）（ＤＳＭ ７３２８）として同定され、高い塩濃度で増殖した。誘導性ＮＡＤ依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ活性が検出された。ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の抽出物を用いた実験は、ギ酸デヒドロゲナーゼの至適温度が４５℃であることを示した。ギ酸デヒドロゲナーゼの活性は塩の存在により強く阻害された。１．５％ＮａＣｌの濃度で、５０％の阻害が観察された。

国際公開第２０１３／１２４３７５号

Ｐｅｎｄａｓｈｔｅｈ，Ｆａｋｈｒｕ’ｌ Ｒａｚｉ，Ｃｈｕａｈ，Ｒａｄｉａｈ，Ｍａｄａｅｎｉ，ａｎｄ Ｚｕｒｉｎａ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．３１，（２０１０）ｐｐ１２２９−１２３９ Ｈｉｎｔｅｒｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｓｔｒｅｉｃｈｓｂｉｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．１９（１９９７）ｐｐ１０９９−１１０２ Ｍａｔａ Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ，Ｑｕｅｓａｄａ，ａｎｄ Ｂｅｊａｒ，Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２５（２００２）ｐｐ３６０−３７５ Ｗｏｏｌａｒｄ ａｎｄ Ｉｒｖｉｎｅ，Ｗａｔｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２９（１９９５）ｐｐ１１５９−１１６８ Ａｚａｃｈｉ，Ｈｅｎｉｓ，Ｏｒｅｎ，Ｇｕｒｅｖｉｃｈ，ａｎｄ Ｓａｒｉｇ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．４１（１９９５）：５４８−５５３

本発明の根底にある技術的問題は、前述の必要性を満たすための方法の提供と見ることができる。

この技術的問題は、特許請求の範囲および本明細書の以下に特徴付けられる実施形態によって解決される。

有利には、本発明の研究において、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株は、１０％を超える高濃度のＮａＣｌの存在下でさえも廃水のギ酸塩含有量の効率的な減少を可能にする。興味深いことに、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株はギ酸塩において増殖しなかった。したがって、本発明によるギ酸塩の除去は、ギ酸塩に対するＭＡ−Ｃ細胞の触媒作用を介して起こる。ギ酸塩の触媒的除去は迅速で効率的であり、その結果はギ酸塩単独での増殖は観察されなかったので、触媒反応によって生成された代謝産物がＣＯ_２であることを示唆している（図２参照）。

したがって、本発明は、高塩分廃水のギ酸塩含有量を減少させるための方法であって、
（ｉ）高塩分廃水を含む組成物Ａを提供する工程、および
（ｉｉ）前記組成物Ａをハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞と混合し、それによって、高塩分廃水とハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株とを含む組成物Ｂを生成する工程、
を含む方法に関する。

本発明の方法の工程（ｉ）において、高塩分廃水を含む組成物Ａを提供するものとする。前記組成物Ａはギ酸塩を含む溶液である。好ましくは、組成物Ａは、ギ酸塩を２５ｍｇ／ｌを超える量、特に５０ｍｇ／ｌを超える量で含む。より好ましくは、組成物Ａは、ギ酸塩を５０ｍｇ／ｌを超える量であるが２０００ｍｇ／ｌ未満の量で含む。さらにより好ましくは、組成物Ａは、ギ酸塩を１００ｍｇ／ｌを超える量であるが１０００ｍｇ／ｌ未満の量で含む。最も好ましくは、組成物Ａは、ギ酸塩を１００ｍｇ／ｌを超える量であるが５００ｍｇ／ｌ未満の量で含む。

ギ酸塩に加えて、組成物Ａは高濃度のＮａＣｌを含むものとする。好ましい実施形態では、組成物Ａは、組成物Ａの総体積に基づいて１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含む。さらに好ましい実施形態では、組成物Ａは、組成物Ａの総体積に基づいて１２．５％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含む。さらに、組成物Ａは、組成物Ａの総体積に基づいて１４％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含むことが想定される。さらに、組成物Ａは、組成物Ａの総体積に基づいて、１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含み得る。

原則として、組成物Ａは、２０．０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ濃度でもギ酸塩含有量が減少したことが本発明の基礎となる研究で示されているので、ＮａＣｌを飽和ＮａＣｌ濃度までの濃度で含むことができる。したがって、濃度の上限は、原則として、飽和ＮａＣｌ濃度である。しかしながら、組成物Ａは飽和濃度未満の濃度でＮａＣｌを含むと考えられる。好ましくは、組成物Ａ中のＮａＣｌ濃度は、この場合もまた組成物Ａの総体積に基づき２２％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは２０％（ｗ／ｖ）未満、最も好ましくは１８％（ｗ／ｖ）未満である。したがって、例えば、ＮａＣｌの濃度は、１０％（ｗ／ｖ）を超えるが２０％（ｗ／ｖ）未満、または１２．５％、１４％、もしくは１５％（ｗ／ｖ）を超えるが、２０％未満（ｗ／ｖ）であり得る。

高塩分廃水は、好ましくは工業廃水、特にブラインである。上記のようなＮａＣｌの濃度は、様々な工業廃水中に見出すことができる。好ましい実施形態では、高塩分廃水は、ポリウレタンの予備生成物としてのメチレンジアミンの製造に由来する。したがって、本発明の方法の工程ｉ）は、メチレンジアミン製造からの高塩分廃水の単離を含み得る。高塩分廃水は、前工程に供しておくこともできる一実施形態では、高塩分廃水は活性炭を用いた精製工程に供されており、それによってＴＯＣ含有量が減少している。さらに、廃水は濾過しておくこともできる。さらに、廃水のＮａＣｌ濃度が本発明の方法の工程ｉ）の前に濃縮されることが想定される。ＮａＣｌを含む組成物を濃縮するための好ましい方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。

上記のように、組成物Ａは高塩分廃水を含むものとする。好ましい実施形態では、組成物Ａは本質的に高塩分廃水からなる。特に好ましい実施形態では、組成物Ａは高塩分廃水からなる。この場合、「高塩分廃水」（すなわち未処理の高塩分廃水）および「組成物Ａ」という用語は互換的に使用することができる。

高塩分廃水、したがって組成物Ａは、アニリン、フェノラートおよび／またはＭＤＡ（４，４’−メチレンジアニリン）などの追加の有機化合物を含んでいてもよい。一実施形態では、組成物Ａは、０．１〜２０ｍｇ／ｌ、特に１〜１０／ｍｇ／ｌのアニリン、および／または０．１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、特に１〜５ｍｇ／ｌのＭＤＡ、および／または２〜１００ｍｇ／ｌ、特に５〜２０ｍｇ／ｌのフェノラートを含む。

好ましくは、組成物Ａは、５０ｍｇ／ｌを超える、より好ましくは６０ｍｇ／ｌを超える、さらにより好ましくは６０ｍｇ／ｌを超える、最も好ましくは６５ｍｇ／ｌを超える全有機体炭素（「ＴＯＣ」）含有量を有する。さらに、組成物Ａは、７０ｍｇ／ｌを超える、特に７０ｍｇ／ｌを超えるＴＯＣ（全有機体炭素）含有量を有すると考えられる。好ましくは、組成物Ａは、最大１０００ｍｇ／ｌ以上の全有機体炭素（「ＴＯＣ」）含有量を有することができる。

本発明によれば、高塩分廃水のギ酸塩含有量は減少されるはずである。本明細書で使用される「減少する」という用語は、高塩分廃水のギ酸塩含有量の大幅な減少を指すものとする。好ましくは、この用語は、組成物Ａ中に存在する総ギ酸塩含量の少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、特に少なくとも９０％または少なくとも９５％のギ酸塩含量の減少を意味する。さらに、ギ酸塩含有量の完全な削除が想定される。

好ましくは、処理された廃水は、本発明の方法が実施された後、１５ｍｇ／ｌ未満、より好ましくは１０ｍｇ／ｌ未満、最も好ましくは５ｍｇ／ｌ未満の量でギ酸塩を含む。

本発明の方法を実行することによって、ＴＯＣ含有量も（すなわち、ギ酸塩含有量に加えて）減少するであろう。好ましくは、処理された廃水は、（特に本明細書の他の箇所に記載のように細胞を分離した後）４０ｍｇ／ｌ未満、より好ましくは３０ｍｇ／ｌ未満、最も好ましくは２０ｍｇ／ｌ未満のＴＯＣ含有量を有する。

好ましくは、ギ酸塩含有量は、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞の存在によって、特にギ酸塩の二酸化炭素への酸化を触媒するギ酸デヒドロゲナーゼの活性によって減少される。ギ酸デヒドロゲナーゼは、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞によって発現される。

本発明の方法の工程ｉｉ）によれば、工程ｉ）で提供される組成物Ａはハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株（ＤＳＭ７３２８）の細胞と混合される。それによって、組成物Ａ（したがって高塩分廃水）およびハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株（すなわちこの株の細胞）を含む組成物Ｂが生成される。

ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株（ＤＳＭ７３２８）は当技術分野において記載されている。例えば、この菌株はＡｚａｃｈｉら（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．４１（１９９５）：５４８−５５３）およびＯｒｅｎら（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ（１９９２），３：３８７−３９８）に記載されており、それらは両方ともそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＭＡ−Ｃ株は、Ａ．ＯｒｅｎおよびＭ．ＡｚａｃｈｉによりＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にＤＳＭ番号７３２８で寄託されている。「ＭＡ−Ｃ」は菌株表示である。この株はＤＳＭの公的コレクションに保管されており、制限なくＤＳＭに注文することができる。

工程ｉｉ）において組成物Ａと混合される細胞は生存可能である、すなわち生細胞である。したがって、ハロモナス（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）ＭＡ−Ｃ株の酵素抽出物などの抽出物を使用することは想定されていない。細胞が生存可能であるか否かをどのように評価するかは、周知の方法によって評価することができる。当然のことながら、組成物Ａと混合されるべき細胞のある割合は生存可能ではないかもしれない。しかしながら、このことを当業者は考慮に入れている。

好ましくは、ＭＡ−Ｃ株の細胞懸濁液が組成物Ａと混合される。細胞は、好ましくはＭＡ−Ｃ株の細胞の前培養物に由来する。一実施形態では、細胞の前培養はギ酸塩の存在下で行われている、すなわち前培養のための培地はギ酸塩を含有するものとする。

組成物Ａと混合されるＭＡ−Ｃ株の細胞の量は、当業者によって決定され得る。混合される細胞量は、ギ酸塩含有量の十分な減少を可能にしなければならない。この量は、例えば本発明の方法によって処理される組成物Ａの体積に依存する。一般に、処理されるべき組成物Ａの体積が大きいほど、使用されるべき細胞の量は多くなるはずである。このことを当業者は考慮に入れていると思われる。

混合は適切な容器中で行うことができる。一実施形態では、混合はバイオリアクター内で行われる。本明細書で使用される「バイオリアクター」という用語は、ギ酸塩含有量の減少を可能にするように条件が厳密に制御されているシステムを指す。一実施形態では、前記バイオリアクターは撹拌槽型リアクターである。好ましくは、バイオリアクターはステンレス鋼などの非腐食性材料でできている。バイオリアクターは、組成物Ｂのインキュベーションに有用である限り、任意のサイズのものであってよい。好ましくは、バイオリアクターは、高塩分廃水のギ酸塩含有量の大規模な減少を可能にする。したがって、バイオリアクターは、少なくとも１、１０、１００、５００、１０００、２５００、または５０００リットルの体積、または任意の中間の体積を有することが想定される。しかしながら、５〜１００ｍｌの組成物Ｂなどの小規模で本発明の方法を実施することも想定される。

組成物Ｂは、ＭＡ−Ｃ株の細胞によるギ酸塩含有量の減少を可能にする培地成分をさらに含み得る。そのような培地成分は当技術分野において周知であり、例えば、ＮＨ_４Ｃｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＭｇＣｌ_２（例えば、ＭｇＣｌ_２＊６ Ｈ_２Ｏ）、ＣａＣｌ_２（例えばＣａＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏ）およびＫＣｌを含む。一実施形態では、組成物Ｂは、（培地成分として）リン源、窒素源、硫黄源、カリウム源および／またはマグネシウム源を含む。組成物Ｂは、鉄、銅、亜鉛およびコバルトなどの微量元素をさらに含み得る。一実施形態では、培地成分は、組成物Ａと細胞とを混合する工程（工程ｉｉ）に記載の通り）の後に組成物Ｂに添加される。

適切な培地成分の選択は、当業者によってさらなる実験作業を伴わずに実施され得る。さらに、当業者は、培地成分の適切な濃度をさらなる実験作業を伴わずに決定することができる。

例えば、以下の培地成分についての以下の濃度範囲および濃度が適切であると考えられる。しかしながら、本発明は、上記で言及した培地成分および以下の濃度範囲に限定されない。

組成物Ｂ中の濃度：
・ＮＨ_４Ｃｌ：０．５〜３ｇ／ｌ、例えば１．５ｇ／ｌ
・ＫＨ_２ＰＯ_４：０．０５〜０．５ｇ／ｌ、例えば、０．１５ｇ／ｌ
・ＭｇＣｌ_２＊６ Ｈ_２Ｏ：０．５〜３ｇ／ｌ、例えば、１．１ｇ／ｌ
・ＣａＣｌ_２＊２ Ｈ_２Ｏ：０．１〜２ｇ／ｌ、例えば、０．５５ｇ／ｌ
・ＫＣｌ：０．５〜３ｇ／ｌ、例えば１．６６ｇ／ｌ
・Ｎａ_２ＳＯ_４：０．５〜１ｇ／ｌ、例えば０．７５ｇ／ｌ
培地成分についてのさらなる好ましい濃度は、実施例の節の表３に明記されている。

本発明の好ましい実施形態では、組成物Ｂは適切な基質、すなわちＭＡ−Ｃ株の増殖を可能にする基質を含み得る。基質は好ましくは組成物Ｂに添加される。一実施形態では、前記基質は有機酸または糖である。好ましくは、基質は酢酸塩、グルコース、スクロース、乳酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩およびグリセロールから選択される。特に好ましい態様において、基質は酢酸塩である。本発明の基礎をなす研究において、培地中の酢酸塩の存在が（他の被験基質と比較して）ＭＡ−Ｃ株の最良の増殖を可能にすることが示されている。

好ましくは、インキュベーションが連続プロセスとして行われる場合、組成物Ｂは基質を含む。基質は、連続モードでギ酸塩の触媒反応の安定性を達成するために、緩慢な速度でのバイオマスの増殖を可能にするものとする。

基質についての適切な濃度または濃度範囲は、当業者によってさらなる実験作業を伴わずに決定され得る。ギ酸塩含有量の減少、したってＭＡ−Ｃの培養は、好ましくは炭素制限下で行われる。したがって、酢酸塩などの基質の濃度が、緩慢な速度でバイオマスの成長を可能にすると想定される。それによって、ギ酸塩から二酸化炭素への酸化を連続的に触媒する新鮮なバイオマスが生成される。好ましくは、基質は、細胞によって完全に取り込まれる量で組成物Ｂに添加される。したがって、ＴＯＣ含有量は、基質の添加によって増加しないことが想定される。

例えば、組成物Ｂ中の基質、特に上記の基質の濃度は、０．５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、特に０．５ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌであることが想定される。追加の基質が連続的に添加されない場合、基質の濃度はプロセス中に低下することを理解すべきである。

本発明の一実施形態では、さらなる培地成分および／または適切な基質が、特に組成物ＡとＭＡ−Ｃ株の細胞とを混合した後に、組成物Ｂに添加される。例えば、さらなる培地成分および／または適切な基質は、組成物Ｂのインキュベーションの開始時または組成物Ｂのインキュベーション中（例えば、連続的にまたはパルスとして）においてであってもよい。

当然のことながら、基質は一定の速度で組成物Ｂに含まれる細胞によって代謝されるため、基質の濃度はインキュベーション中に変化する。したがって、基質濃度は一定ではない可能性がある。それでも、基質含有量の減少を補うために、インキュベーション中に追加の基質を添加することができる。

細胞と組成物Ａとを混合した後、ＭＡ−Ｃ細胞によるギ酸塩含有量の減少を可能にするために、得られた組成物Ｂはインキュベートされる。したがって、本発明の方法は、組成物Ｂをインキュベートするさらなる工程を含むことが好ましい。前記インキュベーションは、適切な条件下、すなわちＭＡ−Ｃ細胞によるギ酸塩含有量の減少を可能にする条件下で行われる。好ましくは、インインキュベーションはバイオリアクター内で行われる。

好ましくは、ギ酸塩含有量の減少（したがって組成物Ｂのインキュベーション）は、１５℃〜４５℃の温度、より好ましくは１８℃〜３２℃の温度、より好ましくは２０℃〜３０℃の温度、最も好ましくは２５℃〜３０℃の温度、特に２７℃〜３０℃の温度で行われる。減少は一定の温度における実施が想定される。しかし、インキュベーション中に温度が変化する可能性があることも予期される。本発明の好ましい実施形態では、組成物Ｂの温度はインキュベーション中にモニターされる。

本発明の方法の好ましい実施形態では、組成物Ｂは（インキュベーション中に）撹拌される。好ましくは、組成物Ｂは１００ｒｐｍ〜７００ｒｐｍの範囲、より好ましくは１００ｒｐｍ〜５００ｒｐｍの範囲、最も好ましくは２００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍの範囲で撹拌される。

インキュベーションは好気条件下で行われる。好ましくは、好気条件は、空気または精製酸素を組成物Ｂに連続的に添加することによって維持される。

好ましくは、組成物Ｂは、５．５〜８．５の範囲、より好ましくは６．０〜８．０の範囲、最も好ましくは６．６〜７．４の範囲のｐＨ値を有する。したがって、インキュベーションはそのようなｐＨ値において実施することが好ましい。好ましい実施形態では、組成物ＢのｐＨ値はインキュベーション中にモニターされる。ｐＨ値は培養中一定に保たれることが想定される。これは例えば使用される補助基質に応じてＨＣｌまたはＮａＯＨを添加することによって達成される。

本発明の方法によれば、上記の工程ｉｉ）で述べたような混合は、（組成物Ａの体積と比較して）得られる組成物Ｂの体積を有意に増加させないことが想定される。したがって、組成物Ｂの主成分は組成物Ａとなるであろう。したがって、混合により組成物Ａは著しく希釈されない。希釈係数は好ましくは１．２未満、より好ましくは１．１未満、最も好ましくは１．０５未満である。さらに、希釈係数は１．０３または１．０２未満であることが想定される。本明細書で使用される「希釈係数」という用語は、好ましくは組成物Ａの体積に対する組成物Ｂの体積の比を指す。

言い換えれば、組成物Ｂは、組成物Ｂの総重量に基づいて、少なくとも８０重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９５重量％の組成物Ａを含む（特にからなる）。さらに、組成物Ｂは、組成物Ｂの総重量に基づいて、少なくとも９７重量％または９８重量％の組成物Ａを含むことが想定される。

希釈係数は無視できるので、組成物Ｂは、組成物Ａと同じ、または本質的に同じ含有量のギ酸塩およびＮａＣｌを含むことが想定される。

したがって、組成物Ｂは、２５ｍｇ／ｌを超える量、特に５０ｍｇ／ｌを超える量のギ酸塩を含むことが想定される。より好ましくは、組成物Ｂは、ギ酸塩を５０ｍｇ／ｌを超えるが２０００ｍｇ／ｌ未満の量で含む。さらにより好ましくは、組成物Ｂは、ギ酸塩を１００ｍｇ／ｌを超えるが１０００ｍｇ／ｌ未満の量で含む。最も好ましくは、組成物Ｂはギ酸塩を１００ｍｇ／ｌを超えるが５００ｍｇ／ｌ未満の量で含む。ギ酸塩含有量はインキュベーション中に減少することを理解すべきである。

さらに、組成物Ｂは、組成物Ｂの総体積に基づいて、１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌおよびギ酸塩を含むことが想定される。さらに好ましい実施形態では、組成物Ｂは、組成物Ｂの総体積に基づいて、１２．５％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む。さらに、組成物Ｂは、組成物Ｂの総体積に基づいて、１４％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含むことが想定される。さらに、組成物Ｂは、組成物Ｂの総体積に基づいて、１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含むことができる。また好ましくは、組成物Ｂ中のＮａＣｌ濃度は、この場合もまた組成物Ｂの総体積に基づいて、２２％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは２０％（ｗ／ｖ）未満、最も好ましくは１８％（ｗ／ｖ）未満である。したがって、例えばＮａＣｌの濃度は、１０％（ｗ／ｖ）を超えるが２０％（ｗ／ｖ）未満、または１２．５％、１４％もしくは１５％（ｗ／ｖ）を超えるが２０％（ｗ／ｖ）未満であり得る。

上記のように、組成物Ｂは原則として、組成物Ａと同じＮａＣｌ含有量を本質的に含み得る。したがって、組成物Ａは、組成物Ａの総体積に基づいて１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含み、組成物Ｂは、組成物Ｂの総体積に基づいて１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含むことが想定される。したがって、組成物Ａは、組成物Ａの総体積に基づいて１２．５％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含み、組成物Ｂは、組成物Ｂの総体積に基づいて１２．５％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含むことが想定される。さらに、組成物Ａおよび組成物Ｂの両方が、それぞれ組成物ＡおよびＢの総体積に基づいて１４％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含むことが想定される。さらに、組成物ＡおよびＢの両方とも、それぞれ組成物ＡおよびＢの総体積に基づいて、１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含み得る。さらに好ましくは、組成物ＡおよびＢ中のＮａＣｌ濃度は、この場合もまた組成物Ｂの総体積に基づいて２２％（ｗ／ｖ）未満、より好ましくは２０％（ｗ／ｖ）未満、最も好ましくは１８％（ｗ／ｖ）未満である。したがって、例えばＮａＣｌの濃度は、１０％（ｗ／ｖ）を超えるが２０％（ｗ／ｖ）未満、または１２．５％、１４％もしくは１５％（ｗ／ｖ）を超えるが２０％（ｗ／ｖ）未満であり得る。

バイオマスの濃度、すなわちＭＡ−Ｃ株の細胞の濃度は、ギ酸塩含有量の減少を可能にする任意の濃度であり得る。様々なバイオマス範囲が試験された（実施例２参照）。例えば、バイオマス濃度は、０．２〜１０ｇ／ｌの間の範囲、特に０．５〜４．５ｇ／ｌの間の範囲であり得る。２５０ｍｇ／ｌのギ酸塩に対する最適バイオマス濃度は１．６ｇ／ｌである。したがって、バイオマス濃度は１．３から１．９ｇ／ｌの間の範囲にあることも想定される。

さらに、組成物Ｂは、組成物Ａについて本明細書において上記したアニリン、フェノラートおよび／またはＭＤＡを含み得る。さらに、組成物は、組成物Ａについて本明細書において上記したようなＴＯＣ含有量を（インキュベーションの開始時に）有し得る。

上記のように、本発明の方法は大規模で実施することが好ましい。したがって、組成物Ｂは、好ましくは少なくとも１、１０、１００、５００、１０００、２５００、もしくは５０００リットルの体積、または任意の中間の体積を有する。しかしながら、少なくとも５ｍｌまたは１００ｍｌの体積などのより小さな体積も（例えば試験のために）同様に本発明によって想定されている。

本発明の方法、特に本明細書で言及されるインキュベーションは、好ましくはバッチ、フェドバッチまたは連続プロセスとして、特に細胞保持を伴うバッチ、フェドバッチまたは連続プロセスとして（好ましくはバイオリアクター内で）行われる。したがって、組成物Ｂはバッチ、フェドバッチまたは連続条件下でインキュベートされる。用語「バッチプロセス」は、好ましくは、基質およびさらなる培地成分、組成物Ａならびに細胞自体を含む、細胞のインキュベーションに最終的に使用されるすべての成分がインキュベーションプロセスの開始時に提供される、細胞をインキュベートする方法を指す。バッチプロセスは、好ましくはある時点で停止され、処理された高塩分廃水は分離される。本明細書で使用される「フェドバッチプロセス」という用語は、追加の培地成分および／または基質などの追加の成分が、培養プロセスの開始後のある時点で培養物に提供される、細胞をインキュベートするプロセスを指す。フェドバッチ培養は、好ましくはある時点で停止され、培地中の細胞および／または成分は回収され、処理された高塩分廃水は分離される。

特に好ましい実施形態では、本発明の方法、したがって本明細書で言及されるインキュベーションは、上記で言及されたような基質（酢酸塩など）を使用して混合供給システムで連続培養を実施する。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞を組成物Ｂから分離して、それによって組成物Ｃを得る工程をさらに含む。組成物Ｂからの細胞の分離は、組成物Ｂのインキュベーション後、すなわちギ酸塩含有量の減少後に実施されるものとする。

得られた組成物Ｃ（本明細書では「処理された廃水」とも呼ばれる）は、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞を本質的に含まないものとする。言い換えれば、組成物Ｃは細胞を含まないものとする。

組成物Ｂからの細胞の分離は、適切と考えられるすべての細胞保持手段によって達成することができる。例えば、細胞の分離は、遠心分離、濾過、またはデカントによって達成することができる。好ましくは、細胞は濾過により組成物Ｂから分離される。

さらに、細胞はビーズまたは固体支持体上に固定化することができ、それによって組成物Ｂからの細胞の分離が可能になる。

連続プロセスを実施する場合、分離した細胞を廃水にフィードバックすることが企図される。

本方法がバイオリアクター内で行われる場合、バイオリアクターは細胞保持のための手段を備えることが想定される。好ましくは、バイオリアクターは濾過により組成物Ｂから細胞を分離するために適した膜を備える。

得られた組成物Ｃ、すなわち処理された廃水は、好ましくは１５ｍｇ／ｌ未満の量でギ酸塩を含む。より好ましくは、組成物Ｃは１０ｍｇ／ｌ未満、最も好ましくは５ｍｇ／ｌ未満の量でギ酸塩を含む。同じことが組成物Ｂにも当てはまる。

さらに、組成物Ｃは、好ましくは４０ｍｇ／ｌ未満、より好ましくは３０ｍｇ／ｌ未満、最も好ましくは２０ｍｇ／ｌ未満のＴＯＣ含有量を有する。

本発明の好ましい実施形態では、この方法は組成物Ｃを濃縮し、それによって組成物Ｃ^＊を得る工程をさらに含む。

この工程は処理された廃水のＮａＣｌ濃度を増加させる、すなわちＮａＣｌは組成物中で高濃度化される。好ましくは、濃縮組成物Ｃ^＊は、組成物Ａの総体積に基づいて２０．０％（ｗ／ｖ）を超える濃度、特に２２％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含む。これらのＮａＣｌ濃度は、塩化ナトリウム電解法の供給流に使用される場合に理想的な濃度である。

本発明によれば、組成物Ｃの高濃度化は、適切と思われる任意の方法によって濃縮することができる。好ましい方法は、逆浸透、限外濾過およびナノ濾過である。これらの方法では、濾過膜の片側に正浸透圧がかかる。さらに、高濃度化は蒸発によって達成することができる。

上記のように、組成物ＡおよびＢは、２０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含み得る。これらの濃度が使用される場合、処理された廃水を塩化ナトリウム電解法に供する場合、原則として、濃縮工程は省略することができる。

本明細書の上記の定義および説明は、本発明の以下の主題、特に塩素および／または水酸化ナトリウムの製造のための以下の本発明の方法、本発明の組成物、本発明のバイオリアクター、および本発明の使用に準用される。

本発明はまた、塩素および／または水酸化ナトリウムの製造方法であって、
（ａ）本発明の方法による組成物Ｃまたは本発明の方法による組成物Ｃ^＊を提供する工程、および
（ｂ）（ａ）による組成物を塩化ナトリウム電気分解に供し、それによって塩素および水酸化ナトリウムを製造する工程、
を含む方法に関する。

塩化ナトリウムの電気分解は、当技術分野において周知の方法によって実施することができる。好ましくは、電気分解は塩化ナトリウムの膜セル電気分解、特に酸素消費電極を使用する膜電気分解、塩化ナトリウムの隔膜セル電気分解または塩化ナトリウムの水銀セル電気分解である。

上述の方法の工程（ａ）、すなわち本発明の方法による組成物Ｃまたは本発明の方法による組成物Ｃ^＊の提供は、好ましくは高塩分溶液のギ酸塩含有量を減少させる方法の工程を含む。

したがって、工程（ａ）は、好ましくは、
（ｉ）高塩分廃水を含む組成物Ａを提供する工程、および
（ｉｉ）前記組成物Ａをハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞と混合し、それによって、高塩分廃水とハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株とを含む組成物Ｂを生成する工程、および
（ｉｉｉ）ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞を組成物Ｂから分離して、それによって組成物Ｃを得る工程、
を含む。

組成物Ｃ^＊を使用する場合、工程ａ）は、組成物Ｃを濃縮し、それによって組成物Ｃ^＊を得るさらなる工程を含むことが好ましい。

好ましくは、組成物Ｂは混合工程（ｉｉ）の後にインキュベートされる。前記インキュベーションは適切な条件下で、すなわちＭＡ−Ｃ細胞によるギ酸塩含有量の減少を可能にする条件下で行われるものとする。好ましくは、インインキュベーションはバイオリアクター内で行われる。

本発明はさらに、本発明の方法に関連して本明細書中上記で定義された組成物Ｂに関する。したがって、本発明は、１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌおよびギ酸塩を含む、高塩分廃水とハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞との組成物Ｂに関する。

ギ酸塩含有量を減少させるための本発明の方法に関連して、ギ酸塩の好ましい含有量およびさらに好ましいＮａＣｌ濃度が開示されている。さらに、組成物は、上記のような成分（さらなる培地成分および／または適切な基質、フェノール、アニリンなど）を含み得る。

さらに、本発明は、少なくとも１リットルの本発明の組成物Ｂを含むバイオリアクターに関する。

さらに、本発明は、高塩分廃水を含む組成物Ａのギ酸塩含有量を減少させるための、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞の使用を扱う。前記組成物Ａは、好ましくは、組成物Ａの総体積に基づいて１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌおよびギ酸塩を含む。

最後に、本発明は、組成物Ｂのギ酸塩含有量を減少させるための、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞の使用を扱う。

前述の使用によれば、ギ酸塩含有量は、本発明の方法に関連して本明細書で上述したように減少させるのが好ましい。上記の定義および説明が準用される。

本発明の好ましい実施形態：
以下に、本発明の好ましい実施形態を記載する。上記の定義および説明が準用される。

１．高塩分廃水のギ酸塩含有量を減少させるための方法であって、
（ｉ）高塩分廃水を含む組成物Ａを提供する工程、および
（ｉｉ）前記組成物Ａをハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞と混合し、それによって、高塩分廃水とハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株とを含む組成物Ｂを生成する工程、
を含み、
組成物Ａが、組成物Ａの総体積に基づいて１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む方法。

２．組成物Ａが、組成物Ａの総体積に基づいて１２．５％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む、実施形態１に記載の方法。

３．組成物Ａが、組成物Ａの総体積に基づいて１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む、実施形態１に記載の方法。

４．組成物Ａが高塩分廃水からなる、実施形態１から３のいずれか一つに記載の方法。

５．組成物Ａが５０ｍｇ／ｌを超えるＴＯＣ含有量を有する、実施形態１から４のいずれか一つに記載の方法。

６．組成物Ａが５０ｍｇ／ｌを超える量でギ酸塩を含む、実施形態１から５のいずれか一つに記載の方法。

７．組成物Ｂが６．０〜８．０の範囲、好ましくは６．６〜７．４の範囲のｐＨ値を有する、実施形態１から６のいずれか一つに記載の方法。

８．ギ酸塩含有量の減少が１５℃〜４５℃の温度、好ましくは１８℃〜３２℃の温度で行われる、実施形態１から７のいずれか一つに記載の方法。

９．バイオリアクターにおけるバッチ、フェドバッチまたは連続プロセスとして実施され、特に細胞が保持される実施形態１から８のいずれか一つに記載の方法。

１０．工程（ｉ）が、メチレンジアミン製造から高塩分廃水を単離する工程を含む、実施形態１から９のいずれか一つに記載の方法。

１１．組成物Ｂが１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含む、実施形態１から１０のいずれか一つに記載の方法。

１２．組成物Ｂが１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度でＮａＣｌを含む、実施形態１から１０のいずれか一つに記載の方法。

１３．組成物Ｂが、組成物Ｂに添加される酢酸塩、グルコース、スクロース、乳酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、およびグリセロールからなる群から選択される少なくとも１つの基質をさらに含む、実施形態１から１２のいずれか一つに記載の方法。

１４．組成物Ｂが少なくとも１リットルの体積を有する、実施形態１から１３のいずれか一つに記載の方法。

１５．ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞を組成物Ｂから分離し、それによって組成物Ｃを得る工程をさらに含む、実施形態１から１４のいずれか一つに記載の方法。

１６．組成物Ｃが３０ｍｇ／ｌ未満のＴＯＣ含有量を有する、実施形態１５のいずれか一つの方法。

１７．組成物Ｃが１５ｍｇ／ｌ未満の量でギ酸塩を含む、実施形態１５および１６に記載の方法。

１８．組成物Ｃを濃縮し、それによって組成物Ｃ^＊を得る工程をさらに含む、実施形態１５から１７のいずれか一つに記載の方法。

１９．塩素および水酸化ナトリウムの製造方法であって、
（ａ）実施形態１５から１７のいずれか一つに記載の方法による組成物Ｃ、または実施形態１８に記載の方法による組成物Ｃ^＊を提供する工程、および
（ｂ）（ａ）による組成物を塩化ナトリウム電気分解に供し、それによって塩素および水酸化ナトリウムを製造する工程、
を含む方法。

２０．１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌおよびギ酸塩を含む、高塩分廃水とハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞との組成物Ｂ。

２１．少なくとも１リットルの実施形態２０に記載の組成物を含むバイオリアクター。

２２．組成物Ａの総体積に基づいて１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌとギ酸塩とを含む、高塩分廃水を含む組成物Ａのギ酸塩含有量を減少させるためのハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞の使用。

本明細書に引用されたすべての参考文献は、それらの全開示内容および本明細書において具体的に言及された開示内容に関して参照により本明細書に組み込まれる。

ＭＡ−Ｃ細胞の触媒活性および混合供給システムを使用した、ギ酸塩含有廃水の連続モードでの生物学的処理を示す図である。 様々な糖および有機酸に対する、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ細胞のバイオマス増加を示す図である。グラフは、基質としてのギ酸塩に対してバイオマスの増加がないことを示している。 様々な塩濃度における２５０ｍｇ／ｌのギ酸塩に対するハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ細胞の触媒活性を示す図である。塩濃度が低いほど（０〜７％ｗ／ｖのＮａＣｌ）ギ酸塩触媒反応が速く起こるが、効率的なギ酸塩触媒反応は塩濃度が高くても（１５〜２０％ｗ／ｖのＮａＣｌ）観察された。 レスポンスカウンタープロットは、ＮａＣｌ濃度が低く、初期ギ酸塩濃度が高いほど最適なギ酸塩触媒反応が起こることを示す図である。 ギ酸塩触媒反応に対するＭＡ−Ｃ細胞のバイオマス濃度の効果を表す図である。２５０ｍｇ／ｌのギ酸塩に対する最適バイオマス濃度は１．６ｇ／ｌである。 係数プロットは、ギ酸塩触媒反応における初期ギ酸塩濃度およびバイオマス濃度の２つの要因の有意性を示す図である。 １４％ｗ／ｖのＮａＣｌおよび２５０ｍｇ／ｌのギ酸塩を含有するブラインにおけるＭＡ−Ｃ細胞を用いたフェドバッチ培養を示す図である。バイオマスはプロセスの２８時間まで減少し、ギ酸塩はわずかに触媒作用を受けた。酢酸塩（３．５ｇ／ｌ）のパルスは、プロセスの２８時間においてバイオマスの成長を促進し、ギ酸塩の即時触媒反応が起こる。酢酸塩はプロセスの１２０時間で完全に利用されている。 １４％ｗ／ｖのＮａＣｌ、２５０ｍｇ／ｌのギ酸塩および３．５ｇ／ｌの酢酸塩を含有するブラインにおけるＭＡ−Ｃ細胞を用いたバッチプロセスを表す図である。バイオマスの増加は酢酸塩により得られる。プロセスの１９０および２３５時間における２回のギ酸塩パルスの添加もバイオマスの増殖にはつながらない。オフガスでのＣＯ_２パーセンテージは、リアクター内のバイオマスがギ酸塩の最初のパルスを完全にＣＯ_２に触媒できることを示している。ギ酸塩の第２のパルスは完全には触媒されない。

本発明を以下の実施例によって単に例示する。これらの実施例は、何であれ本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。

実施例
実施例１：振盪フラスコ実験におけるギ酸塩触媒反応
菌株および培地
ＭＡ−Ｃと命名されたハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）．（ＤＳＭ７３２８）の野生株は、微生物および細胞培養物のドイツのコレクション−ｄｓｍｚから購入した。接種材料調製のための振盪フラスコ培養物を、実験室用インキュベーター（Ｉｎｆｏｒｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において１２０ｒｐｍおよび３０℃で、培地番号１４２８により増殖させ、この培地は、ｄｓｍｚにより以下の組成（ｇ／ｌ）：ＮａＣｌ １００、ＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ １０、ＫＣｌ １．０、Ｎａ_２ＳＯ_４ ０．５、酵母エキス５．０、トリプトン５．０；ｐＨ７．０であることが示唆されている５００ｍｌの三角フラスコと培地は常に滅菌した。

分析論
細胞増殖の指標としての濁度は、島津のＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用して６００ｎｍにおいて１２時間間隔で測定した。培養上清中の残留ギ酸塩濃度はＨＰＬＣを用いて測定した。ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）法は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製のＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラムを用いて３０℃、ＭＱ水中０．１％ＴＦＡの定組成溶離液、０．５ｍｌ／分の流速で行い、続いて２１０ｎｍにおいてＵＶ検出した。注入量２０μｌでの定量限界は、ギ酸塩で５ｍｇ／ｌであった。定量に使用される標準は、サンプルと同じ塩分のマトリックスで調製した。

振盪フラスコ中のギ酸塩研究
ギ酸塩の取り込み研究のために、合成的に規定された培地を調製した。培地組成（ｇ／ｌ）は次の通りであった：ＮａＣｌ １００、ＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ １０、ＫＣｌ １．０、およびＮａ_２ＳＯ_４ ０．５、であり、異なる濃度のギ酸ナトリウム（５０〜２０００ｍｇ／ｌ）を添加した。ｐＨを７．０に調整した。酵母エキス５．０、トリプトン５．０、ＮａＣｌ １００、ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ １０、ＫＣｌ １．０、およびＮａ_２ＳＯ_４ ０．５を含有する複合培地において増殖する細胞を、３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって回収した。細胞を洗浄し、炭素源としてギ酸塩のみを含む１００ｍｌの規定培地を含む振盪フラスコに溶解し、３０℃および１２０ｒｐｍにおいて撹拌しながらインキュベートした。０時間のＯＤ_６００を測定し、１ｍｌの試料を０時間のＨＰＬＣ分析用に保存した。ギ酸塩における増殖および残留ギ酸塩濃度をモニターした。

ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃの細胞は、増殖源としてギ酸塩を使用できないが、経時的残留ギ酸塩濃度を決定するためのＨＰＬＣ分析は、ギ酸塩が合成培地および実際のブラインの両方で培養された培地から完全に除去されたことを示している。他のプロセスパラメータを制御可能にするために、ギ酸塩に対する細胞の触媒作用を、振盪フラスコおよびバイオリアクターにおいてさらに多くの実験でより詳細に調べた。

実施例２：より多くの基質でのハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ
この菌株を、基質として様々な糖および有機酸において増殖について研究した。以下のいずれかを含有する滅菌培地を２５ｍＭの濃度で調製した：グルコース、スクロース、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩および糖アルコールグリセロール。１００ｍｌの滅菌培地を５００ｍｌの三角フラスコに移し、均一濃度の細胞を各フラスコに加え、フラスコをさらに１２０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃においてインキュベートした。

ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃはこの研究で使用されたすべての糖および有機酸を成長源として利用することができる（図２）。フマル酸塩での増殖は観察されず、培養上清中のフマル酸塩濃度はそのままであった。ここで本発明者らは、ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃのギ酸塩に対する触媒活性が特異的であることを結論づけた。

実施例３：ギ酸塩触媒反応のための最適培養条件
ギ酸塩に対するＭＡ−Ｃ細胞の触媒活性を様々な塩濃度で調べたところ、すべてのＮａＣｌ濃度（０〜２０）％ｗ／ｖで効率的なギ酸塩触媒反応が起こるが、塩濃度が低いほどより良好なギ酸塩触媒反応が起こることが観察された（図３）および（図４）。

ギ酸塩に対するＭＡ‐Ｃ細胞の触媒活性に対する最適条件と他のプロセスパラメータの影響を見出すために、実験の一部実施要因計画法を実施して、３つのパラメータ（Δバイオマス濃度、残留ギ酸塩濃度およびｐＨ）に対する４つの要因（温度、ｐＨ、ギ酸塩濃度およびバイオマス濃度）の影響を評価した。この実験で検討した要因をそれぞれの範囲とともに（表１）に示す。

この研究のための統計的ツール、Ｍｏｄｄｅによって１９の実験が示唆された。実験は、振盪フラスコ中で１４％ｗ／ｖのＮａＣｌを含有する実際のブラインにおいて行った。バイオマス濃度、ｐＨ変化および残留ギ酸塩濃度を２４時間間隔で測定した。得られた測定値をＭｏｄｄｅによって分析した。

Δギ酸塩について有効なモデルが得られた。係数プロットにより、ギ酸塩触媒反応に対する初期バイオマス濃度の影響が示された（図５）。バイオマス濃度が高いほど、より良好なギ酸塩除去が得られた。温度はギ酸塩触媒反応に影響を及ぼさないように思われるが、細胞生存についてはより低い温度が示唆される。研究した範囲（６〜８）ではｐＨはギ酸塩触媒反応には重要ではない（図６）。

実施例４：バイオリアクターにおける培養
振盪フラスコ実験の制限のために、さらなる調査を、プロセスパラメータおよび培養条件が制御されるリアクターにおいて行った。この場合の実験は、高塩分環境での培養に適した特別な耐食性バイオリアクター装置で行った。

特別な非腐食性のＬａｂｏｒｆｏｒｓ ＰＥＥＫ（Ｉｎｆｏｒｓ、ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄｓ）リアクターを以下の仕様で利用した。

ホウケイ酸ガラス培養容器：１Ｌ
ホウケイ酸ガラス排ガス冷却
特殊耐腐食性ポリマー（ＰＥＥＫ）バイオリアクターの上蓋
特殊耐腐食性ポリマー（ＰＥＥＫ）温度計ホルダー
ホウケイ酸ガラス製サンプリング管およびガス導入管
特殊耐腐食性撹拌機
リアクター容器のホウケイ酸ガラスジャケット
以下のオンライン分析：
排ガスＣＯ_２
排ガスＯ_２
ガラスｐＨプローブ
Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ Ｃｌａｒｋ ｐＯ_２および
空気用熱式質量流量コントローラ
１４％ｗ／ｖのＮａＣｌおよび２５０ｍｇ／ｌのギ酸塩を含有する実際のブラインでのバイオリアクターにおけるハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃの培養の実現可能性を調べるためにバッチプロセスを行った。以下の培地成分をブラインにさらに添加した：ＫＣｌ １ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ １０ｇ／ｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４ ０．５ｇ／ｌおよび（Ｆｅ、Ｃｕ、Ｍｎ、およびＺｎ）を含有する微量元素溶液２．５ｍｌ。

温度：３０℃
ｐＨ：７．０（０．５Ｍ ＨＣｌをｐＨ調整に使用した）
撹拌：３００ｒｐｍ
吸気口：０．２ｖｖｍ（ＮＬ／分）
リアクターに３．５時間のプロセスで約０．５ｇ／ｌのバイオマス濃度まで接種した。ＯＤ_６００および残留ギ酸塩濃度を様々な時間間隔で測定した。バイオマス濃度は減少を示し、ギ酸塩はある程度まで触媒作用を受け（図７）、この場合もまたギ酸塩に対するＭＡ−Ｃ細胞の触媒作用を確認した。ギ酸塩触媒反応の生成物をオフガス分析計によって測定し、ＣＯ_２であった。ＭＡ−Ｃ細胞はギ酸塩を触媒することしかできず、基質がバイオマスを形成しなかった場合、バイオマスを生産させるために第２の基質を供給した。以前の実験は、酢酸塩での増殖が他の単純な基質と比較して最高速度で起こり得、安価な基質である酢酸塩が工業プロセスにおいて適切な代替物であることを示していた。そのために、酢酸塩をこのプロセスにおける第２の基質として選択した。ギ酸塩の減少が遅いのでプロセス時間２８時間目に酢酸塩のパルス（３ｇ／ｌ）をリアクターに供給した。バイオマスは増加し始め、そして新たに形成されたバイオマスは、３６．７時間でギ酸塩を完全に触媒した。１２０時間のプロセス後、酢酸塩の完全な除去もまた観察できた（図７）。連続モードで酢酸塩の取り込みおよびギ酸塩の分解を促進するために、培地の最適化を行った。

実施例５：連続モードにおける最適ギ酸塩触媒反応のための培地最適化
培地最適化の目的のために、実験の完全実施要因計画法を行い、３つのパラメータ（バイオマス濃度、Δギ酸塩およびΔ酢酸塩）に対する５つの要因（マグネシウム、カリウム、硫黄、窒素およびリン）の影響を評価した。すべての実験は、振盪フラスコ中で２５０ｍｇ／ｌのギ酸塩および３．５ｇ／ｌの酢酸塩および接種物として等濃度のＭＡ−Ｃ細胞を用いて実施した。１９の実験が統計的ツール、一部実施要因計画法のためのＭｏｄｄｅによって提案され、２つの対照実験もマトリックスに追加された。バイオマスと残留ギ酸塩と酢酸塩の濃度を２４時間ごとに測定した。７２時間後に得られた結果を、反応について分析した。係数プロットは、他の要因と比較して最終バイオマス濃度に対する窒素とカリウムの有意な影響を示した。また、５つの実験から得られたデータは、最高の最終バイオマス濃度ならびに完全な酢酸塩およびギ酸塩の取り込みを有することを示した。この実験で使用した成分および範囲を（表２）に示す。

最高のバイオマス濃度ならびに酢酸塩およびギ酸塩の完全な取り込みを伴う実験は、以下の濃度（ｇ／ｌ）の培地成分を有した（表３）。

実施例６：連続モードにおけるハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ細胞によるギ酸塩触媒反応。
ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株のバイオリアクターにおける培養に成功し、補助基質として酢酸塩を用いてギ酸塩を完全に触媒反応させた後、連続的に制限された方法を混合供給システムを用いて確立した。第一の課題は、産業規模での使用にも適用可能なほど十分に高く、最大比増殖速度よりも低い、ＭＡ−Ｃの最適希釈速度の選択肢を指定することである。以下の希釈率を実験した。

０．００８ｌ／時
０．０１１ｌ／時
０．０１５ｌ／時
０．０２ｌ／時の洗い流しが起こり、これは、この希釈速度が酢酸塩での細胞の最大比増殖速度よりも高いことを意味する。事実、最大増殖速度はバッチ実験から０．０２ｌ／時に近いと決定された。より高い希釈速度を適用し、洗い流しを避けるために、細胞保持の使用が必要と思われる。

実験の前に、すべての培地成分を３．５ｇ／ｌの酢酸塩と併せてブラインに添加して、０．５ＭのＨＣｌを添加することによりｐＨを７．０に一定に保った。連続プロセスから定常状態を得るため、プロセスからバイオマス濃度を測定するためにサンプルを得た。ＨＰＬＣによりギ酸塩および酢酸塩の残留濃度を測定したところ、定常状態で酢酸塩およびギ酸塩が完全に除去されていることが示された。処理されたブラインのＴＯＣ含有量の分析は外部で行われ、ＴＯＣ含有量は約１５ｐｐｍへの有意な減少を示した。酢酸塩およびギ酸塩の両方についての速度および基質に対する収率（酸素：Ｙｏ_２／秒、二酸化炭素：Ｙｃｏ_２／秒バイオマス：Ｙｘ／秒）を計算した。全体の炭素収支は、計算により０．９１８Ｃｍｏｌ／Ｃｍｏｌであった。

Claims (15)

1. 高塩分廃水のギ酸塩含有量を減少させるための方法であって、
   （ｉ）高塩分廃水およびギ酸塩を含む組成物Ａを提供する工程、および
   （ｉｉ）前記組成物Ａをハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞と混合し、それによって、前記高塩分廃水と前記ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株とを含む組成物Ｂを生成する工程、
   を含み、
   組成物Ａが、組成物Ａの総体積に基づいて１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む方法。
2. 組成物Ａが、組成物Ａの総体積に基づいて１２．５％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む、または組成物Ａが、組成物Ａの総体積に基づいて１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む、請求項１に記載の方法。
3. 組成物Ａが高塩分廃水からなる、請求項１または２に記載の方法。
4. 組成物Ａが５０ｍｇ／ｌを超える量でギ酸塩を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記ギ酸塩含有量の減少が１５℃〜４５℃の温度、好ましくは１８℃〜３０℃の温度で行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 工程（ｉ）が、メチレンジアミン製造から前記高塩分廃水を単離する工程を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記組成物Ｂが１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む、または前記組成物Ｂが１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 組成物Ｂが、組成物Ｂに添加される酢酸塩、グルコース、スクロース、乳酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、およびグリセロールからなる群から選択される少なくとも１つの基質をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞を前記組成物Ｂから分離し、それによって組成物Ｃを得る工程をさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 組成物Ｃが３０ｍｇ／ｌ未満のＴＯＣ含有量を有する、および／または組成物Ｃが１５ｍｇ／ｌ未満の量でギ酸塩を含む、請求項９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記組成物Ｃを濃縮し、それによって組成物Ｃ^＊を得る工程をさらに含む、請求項９および１０に記載の方法。
12. 塩素および／または水酸化ナトリウムの製造方法であって、
    （ａ）請求項９または１０に記載の方法による組成物Ｃ、または請求項１１に記載の方法による組成物Ｃ^＊を提供する工程、および
    （ｂ）（ａ）による組成物を塩化ナトリウム電気分解プロセスに供し、それによって塩素および水酸化ナトリウムを製造する工程、
    を含む方法。
13. 前記塩化ナトリウム電気分解が、塩化ナトリウムの膜セル電気分解、特に酸素消費電極を使用する膜電気分解、塩化ナトリウムの隔膜セル電気分解または塩化ナトリウムの水銀セル電気分解から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. １０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌおよびギ酸塩を含む、高塩分廃水と前記ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞との組成物Ｂ、および／または少なくとも１ｌの前記組成物を含むバイオリアクター。
15. 組成物Ａの総体積に基づいて１０％（ｗ／ｖ）を超える濃度のＮａＣｌとギ酸塩とを含む、高塩分廃水を含む組成物Ａのギ酸塩含有量を減少させるための前記ハロモナス種（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＡ−Ｃ株の細胞の使用。

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