CN109562968A

CN109562968A - 通过耐盐的盐单胞菌属种从高盐环境的甲酸盐催化

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Publication number: CN109562968A
Application number: CN201780052148.1A
Authority: CN
Inventors: H.黑克罗特; C.赫维希; D.坎拉瓦马内什; P.鲁希茨卡
Original assignee: Bayer MaterialScience AG
Current assignee: Covestro Deutschland AG
Priority date: 2016-08-25
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2019-04-02
Also published as: WO2018037081A1; JP2019528169A; US20190218126A1; EP3504164A1; KR20190039529A

Abstract

本发明涉及用盐单胞菌属种菌株MA‑C的细胞减少高盐废水的甲酸盐含量的方法。本发明进一步涉及用于生产氯气和/或氢氧化钠的方法。由本发明进一步涵盖的是包含高盐废水和盐单胞菌属种菌株MA‑C的细胞的组合物。

Description

通过耐盐的盐单胞菌属种从高盐环境的甲酸盐催化

本发明涉及用盐单胞菌属种(Halomonas sp.)菌株MA-C的细胞减少高盐废水的甲酸盐含量的方法。本发明进一步涉及用于生产氯气和/或氢氧化钠的方法。由本发明进一步涵盖的是包含高盐废水和盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞的组合物。

氯碱工艺(chloralkali process)是用于电解NaCl的工业工艺。它是用于生产氯气和氢氧化钠的技术。高盐溶液是用于氯碱工艺的重要材料。然而，需要非常纯的高盐溶液。因此，难以使用回收的高盐废水用于氯碱工艺。例如，聚氨酯生产的高盐废水含有约300-500 mg/l的甲酸盐，其必须被去除，否则氯气将被CO₂污染。

通过在活性炭上吸附可以实现不需要的总有机碳（TOC）的去除。然而，这对于不吸附到活性炭的甲酸盐是不可能的。

甲酸盐可以被某些微生物细胞降解，例如通过形成酶如甲酸脱氢酶。然而，微生物细胞通常不在高盐溶液、例如盐浓度大于10%的聚氨酯盐水中生长。

因此，高度需要用于减少高盐废水的甲酸盐含量的手段和方法。

WO 2013/124375公开了通过某些嗜盐和/或嗜盐嗜碱（haloalkaliphilic）微生物的总有机碳减少。

Pendashteh等人公开了通过分离的嗜盐微生物的聚生体在序批式反应器中的采出水的生物处理（Pendashteh，Fakhru’l Razi，Chuah，Radiah，Madaeni和Zurina，Environ.Technol.，第31卷，（2010）第1229-1239页）。

Hinteregger和Streichsbier公开了用于含盐含酚废水的生物处理的中度嗜盐盐单胞菌属菌株（Hinteregger和Streichsbier，Biotechnol. Lett.，第19卷（1997）第1099-1102页）。

盐单胞菌属种的菌株的详细表型表征由Mata Martínez-Cánovas等人（Mata Martínez-Cánovas，Quesada和Béjar，Syst. Appl. Microbiol.，第25卷（2002）第360–375页）提供。

Woolard和Irvine公开了序批式反应器中的高盐废水的处理（Woolard和Irvine，Water Res.，第29卷（1995）第1159–1168页）。

Azachi等人公开了从在甲醛贮存场所收集的土壤中分离耐盐的革兰氏阴性真细菌（Azachi，Henis，Oren，Gurevich和Sarig，Can. J. Microbiol.，第41卷（1995）: 548-553）。该菌株命名为MA-C且鉴定为盐单胞菌属种（DSM 7328），在高盐浓度下生长。检测到诱导型NAD依赖性甲酸脱氢酶活性。用盐单胞菌属种菌株MA-C的提取物的实验显示甲酸脱氢酶具有在45℃下的其最适温度。甲酸脱氢酶的活性被盐的存在强烈抑制。在1.5% NaCl的浓度下，观察到50%的抑制。

本发明所基于的技术问题可以视为提供用于顺应上述需求的方法。技术问题通过权利要求和本文下文中表征的实施方案得到解决。

有利地，在本发明的研究中显示，即使在大于10% NaCl的高浓度的存在下，盐单胞菌属种菌株MA-C也允许废水的甲酸盐含量的有效减少。有趣的是，盐单胞菌属种菌株MA-C不在甲酸盐上生长。通过本发明的甲酸盐去除因此经由MA-C细胞对甲酸盐的催化作用而发生。甲酸盐的催化去除是快速有效的，并且结果提示通过催化反应产生的代谢产物是CO₂，因为没有观察到在单独的甲酸盐上的生长（参见图2）。

相应地，本发明涉及用于减少高盐废水的甲酸盐含量的方法，所述方法包括：

（i）提供包含高盐废水的组合物A，和

（ii）将所述组合物A与盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞混合，从而生成包含高盐废水和盐单胞菌属种菌株MA-C的组合物B。

在本发明的方法的步骤（i）中，应该提供包含高盐废水的组合物A。所述组合物A是包含甲酸盐的溶液。优选地，组合物A包含其量大于25 mg/l，特别是其量大于50 mg/l的甲酸盐。更优选地，组合物A包含其量大于50 mg/l但小于2000 mg/l的甲酸盐。甚至更优选地，组合物A包含其量大于100 mg/l但小于1000 mg/l的甲酸盐。最优选地，组合物A包含其量大于100 mg/l但小于500 mg/l的甲酸盐。

除甲酸盐之外，组合物A还应该包含以高浓度的NaCl。在一个优选实施方案中，组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于10%（w/v）的NaCl。在一个进一步优选的实施方案中，组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于12.5%（w/v）的NaCl。进一步地，设想组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于14%（w/v）的NaCl。此外，组合物A可以包含基于组合物A的总体积的浓度大于15%（w/v）的NaCl。

原则上，组合物A可以包含浓度高达NaCl的饱和浓度的NaCl，因为在本发明所基于的研究中已显示，甚至在20.0%（w/v）的NaCl浓度下，甲酸盐含量也减少。因此，关于浓度的上限原则上是NaCl的饱和浓度。然而，设想组合物A包含浓度小于饱和浓度的NaCl。优选地，组合物A中的NaCl浓度小于22%（w/v），更优选小于20%（w/v），且最优选小于18%（w/v），所述浓度再次基于组合物A的总体积。因此，例如NaCl的浓度可以大于10%（w/v）但小于20%（w/v），或大于12.5%、14%或15%（w/v）但小于20%（w/v）。

高盐废水优选是工业废水，特别是卤水。如上文所提及的NaCl浓度可以在各种工业废水中发现。在一个优选实施方案中，高盐废水作为聚氨酯的预产物衍生自亚甲基二胺生产。相应地，本发明的方法的步骤i）可以包括从亚甲基二胺生产中分离高盐废水。高盐废水可能已进行先前步骤。在一个实施方案中，高盐废水已进行使用活性炭的纯化步骤，从而减少了TOC含量。进一步地，废水可能已进行过滤。进一步地，设想在本发明的方法的步骤i）之前浓缩废水的NaCl浓度。用于浓缩包含NaCl的组合物的优选方法在本文其它地方描述。

如上所述，组合物A应该包含高盐废水。在一个优选实施方案中，组合物A基本上由高盐废水组成。在一个特别优选的实施方案中，组合物A由高盐废水组成。在这种情况下，术语“高盐废水”（即未处理的高盐废水）和“组合物A”可以互换使用。

高盐废水和因此的组合物A可以包含另外的有机化合物，例如苯胺、酚盐和/或MDA（4,4'-亚甲基二苯胺）。在一个实施方案中，组合物A包含0.1至20 mg/l、特别是1至10/mg/l苯胺，和/或0.1 mg/l至10 mg/l、特别是1至5 mg/l MDA，和/或2至100 mg/l、特别是5至20mg/l酚盐。

优选地，组合物A具有大于50 mg/l，更优选大于60 mg/l，甚至更优选大于60 mg/l，且最优选大于65 mg/l的总有机碳（“TOC”）含量。进一步地，设想组合物A具有大于70 mg/l，特别是大于70 mg/l的TOC（总有机碳）含量。优选地，组合物A可以具有高达1000 mg/l和更高的总有机碳（“TOC”）含量。

根据本发明，应该减少高盐废水的甲酸盐含量。如本文使用的，术语“减少”应该指高盐废水的甲酸盐含量的显著减少。优选地，该术语指示组合物A中存在的总甲酸盐含量的至少30%、至少50%、至少70%或特别是至少90%或至少95%的甲酸盐含量降低。进一步地，设想甲酸盐含量被完全消除。

优选地，在已进行本发明的方法之后，经处理的废水包含其量小于15 mg/l，更优选小于10 mg/l，且最优选小于5 mg/l的甲酸盐。

通过进行本发明的方法，TOC含量也将减少（即，除甲酸盐含量之外）。优选地，经处理的废水具有小于40 mg/l，更优选小于30 mg/l，且最优选小于20 mg/l的TOC含量（特别是在如本文其它地方所述的细胞分开之后）。

优选地，通过盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞的存在，特别是通过催化甲酸盐氧化为二氧化碳的甲酸脱氢酶的活性，来减少甲酸盐含量。甲酸脱氢酶由盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞表达。

根据本发明的方法的步骤ii），将如步骤i）中提供的组合物A与盐单胞菌属种菌株MA-C（DSM 7328）的细胞混合。由此，生成包含组合物A（和因此的高盐废水）和盐单胞菌属种菌株MA-C（即该菌株的细胞）的组合物B。

盐单胞菌属种菌株MA-C（DSM 7328）已在本领域中得到描述。该菌株例如由Azachi等人（Can. J. Microbiol.，第41卷（1995）: 548-553）和Oren等人（Biodegradation（1992），3: 387-398）描述，所述两个参考文献均通过引用整体并入本文。菌株MA-C已由A.Oren和M. Azachi在DSM编号7328下保藏于DSM (Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany)。“MA-C”是菌株命名。该菌株保存在DSM的公共保藏中，并且可以无限制地从DSM订购。

在步骤ii）中待与组合物A混合的细胞应该是活的，即活细胞。因此，没有设想使用提取物如盐单胞菌属菌株MA-C的酶提取物。如何评价细胞是否是活的，可以通过众所周知的方法进行评价。当然，待与组合物A混合的一定百分比的细胞可以不是活的。然而，这由技术人员加以考虑。

优选地，将菌株MA-C的细胞悬浮液与组合物A混合。细胞优选衍生自MA-C菌株细胞的预培养物。在一个实施方案中，细胞的预培养已在甲酸盐的存在下进行，即用于预培养的培养基应该含有甲酸盐。

待与组合物A混合的菌株MA-C的细胞量可以由技术人员确定。待混合的细胞量应该允许甲酸盐含量的足够减少。量例如取决于待通过本发明的方法处理的组合物A的体积。一般而言，待处理的组合物A的体积越大，待使用的细胞量应该也越大。这由技术人员加以考虑。

混合可以在合适的容器中发生。在一个实施方案中，混合在生物反应器中进行。如本文使用的，术语“生物反应器”指其中严格控制条件以允许减少甲酸盐含量的系统。在一个实施方案中，所述生物反应器是搅拌釜反应器。优选地，生物反应器由非腐蚀性材料例如不锈钢制成。生物反应器可以具有任何尺寸，只要它可用于组合物B的孵育。优选地，生物反应器允许高盐废水的甲酸盐含量的大规模减少。因此，设想生物反应器具有至少1、10、100、500、1000、2500或5000升的体积或任何中间体积。然而，还设想以小规模，例如用5至100 ml的组合物B进行本发明的方法。

组合物B可以进一步包含培养基组分，其允许通过菌株MA-C的细胞的甲酸盐含量减少。此类培养基组分是本领域众所周知的，并且包括例如NH₄Cl、KH₂PO₄、Na₂SO₄、MgCl₂（例如MgCl₂* 6 H₂O）、CaCl₂（例如CaCl₂* 2 H₂O）和KCl。在一个实施方案中，组合物B包含磷源、氮源、硫源、钾源和/或镁源（作为培养基组分）。组合物B可以进一步包含微量元素，例如铁、铜、锌和钴。在一个实施方案中，在混合组合物A和细胞（如步骤ii）中所述）之后，将培养基组分加入组合物B中。

合适的培养基组分的选择可以不费周折地由技术人员进行。此外，技术人员可以不费周折地确定培养基组分的合适浓度。

例如，关于下述培养基组分的下述浓度范围和浓度被认为是合适的。然而，本发明并不限于上文提及的培养基组分和下述浓度范围。

组合物B中的浓度：

· NH₄Cl: 0.5至3 g/l，例如1.5 g/l

· KH₂PO₄: 0.05至0.5 g/l，例如0.15 g/l

· MgCl₂* 6 H₂O: 0.5至3 g/l，例如1.1 g/l

· CaCl₂* 2 H₂O: 0.1至2 g/l，例如0.55 g/l

· KCl: 0.5至3 g/l，例如1.66 g/l

· Na₂SO₄: 0.5至1 g/l. e.g. 0.75g/l

关于培养基组分的进一步优选浓度在实施例部分的表3中详细说明。

在本发明的一个优选实施方案中，组合物B可以包含合适的底物，即允许菌株MA-C生长的底物。优选将底物加入组合物B中。在一个实施方案中，所述底物是有机酸或糖。优选地，底物选自乙酸盐、葡萄糖、蔗糖、乳酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐和甘油。在一个特别优选的实施方案中，底物是乙酸盐。在本发明所基于的研究中已显示，在培养基中乙酸盐的存在允许菌株MA-C的最佳生长（与其它测试的底物相比）。

优选地，如果孵育作为连续法进行，则组合物B包含底物。底物应该允许以缓慢速率的生物质生长，以便实现以连续模式的甲酸盐催化的稳定性。

关于底物的合适浓度或浓度范围可以不费周折地由技术人员确定。甲酸盐含量的减少以及因此MA-C的培养优选在碳限制下完成。因此，设想底物如乙酸盐的浓度允许以缓慢速率的生物质生长。由此产生新鲜的生物质，其以连续的方式催化甲酸盐氧化为二氧化碳。优选地，将底物以完全被细胞摄取的量加入组合物B中。因此，设想TOC含量将不受底物的添加而增加。

例如，设想组合物B中的底物，特别是上述底物的浓度为0.5 g/l至10 g/l，特别是0.5 g/l至5 g/l。应理解，如果不连续添加另外的底物，则底物的浓度在该工艺期间将降低。

在本发明的一个实施方案中，将进一步的培养基组分和/或合适的底物加入组合物B中，特别是在混合组合物A和菌株MA-C的细胞之后。例如，进一步的培养基组分和/或合适的底物可以在组合物B孵育开始时或在组合物B孵育期间（例如连续地或作为脉冲）。

当然，底物的浓度将在孵育期间改变，因为底物将被由组合物B包含的细胞以一定速率代谢。因此，底物浓度可以不是恒定的。然而，在孵育期间可以添加另外的底物，以便补偿底物含量的降低。

在混合细胞和组合物A后，孵育所得到的组合物B，以便允许通过MA-C细胞的甲酸盐含量减少。因此，本发明的方法优选包括孵育组合物B的进一步步骤。所述孵育在合适的条件下，即在允许通过MA-C细胞的甲酸盐含量减少的条件下进行。优选地，孵育在生物反应器中进行。

优选地，甲酸盐含量的减少（以及因此组合物B的孵育）在15℃至45℃的温度下，更优选在18℃至32℃的温度下，更优选在20℃至30℃的温度下，且最优选在25℃至30℃的温度下，特别是在27℃至30℃的温度下进行。设想减少在恒定温度下进行。然而，还考虑温度在孵育期间可以改变。在本发明的一个优选实施方案中，在孵育期间监测组合物B的温度。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，搅拌组合物B（在孵育期间）。优选地，组合物B在100 rpm至700 rpm的范围内，更优选在100 rpm至500 rpm的范围内，且最优选在200 rpm至400 rpm的范围内搅拌。

孵育在好氧条件下进行。优选地，通过连续地向组合物B中添加空气或纯化的氧气来维持好氧条件。

优选地，组合物B具有在5.5至8.5的范围内，更优选6.0至8.0，且最优选在6.6至7.4的范围内的pH值。因此，孵育优选在此类pH值下进行。在一个优选实施方案中，在孵育期间监测组合物B的pH值。设想pH值在培养期间保持恒定。这可以例如通过取决于使用的共底物而加入HCl或NaOH来实现。

根据本发明的方法，设想如上述步骤ii）中所述的混合并不显著增加所得到的组合物B的体积（与组合物A的体积相比）。因此，组合物B的主要组分应该是组合物A。因此，混合不应显著稀释组合物A。稀释因子优选小于1.2，更优选小于1.1，且最优选小于1.05。进一步地，设想稀释因子小于1.03或1.02。如本文使用的，术语“稀释因子”优选指组合物B的体积与组合物A的体积的比率。

换言之，组合物B包含基于组合物B的总重量，按重量计至少80%，更优选至少90%，且最优选至少95%的组合物A（特别是由其组成）。进一步地，设想组合物B包含基于组合物B的总重量按重量计至少97%或98%的组合物A（特别是由其组成）。

因为稀释因子可忽略不计，所以设想组合物B包含与组合物A相同或基本上相同的甲酸盐和NaCl的含量。

因此，设想组合物B包含其量大于25 mg/l，特别是其量大于50 mg/l的甲酸盐。更优选地，组合物B包含其量大于50 mg/l但小于2000 mg/l的甲酸盐。甚至更优选地，组合物B包含其量大于100 mg/l但小于1000 mg/l的甲酸盐。最优选地，组合物B包含其量大于100mg/l但小于500 mg/l的甲酸盐。应理解，甲酸盐含量在孵育期间将降低。

此外，设想组合物B包含NaCl和甲酸盐，所述NaCl基于组合物B的总体积的浓度大于10%（w/v）。在一个进一步优选的实施方案中，组合物B包含基于组合物B的总体积的浓度大于12.5%（w/v）的NaCl。进一步地，设想组合物B包含基于组合物B的总体积的浓度大于14%（w/v）的NaCl。此外，组合物B可以包含基于组合物B的总体积的浓度大于15%（w/v）的NaCl。还优选地，组合物B中的NaCl浓度小于22%（w/v），更优选小于20%（w/v），且最优选小于18%（w/v），所述浓度再次基于组合物B的总体积。因此，例如NaCl的浓度可以大于10%（w/v）但小于20%（w/v），或大于12.5%、14%或15%（w/v）但小于20%（w/v）。

如上所述，组合物B原则上可以包含与组合物A基本上相同的NaCl含量。因此，设想组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于10%（w/v）的NaCl，并且组合物B包含基于组合物B的总体积的浓度大于10%（w/v）的NaCl。因此，设想组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于12.5%（w/v）的NaCl，并且组合物B包含基于组合物B的总体积的浓度大于12.5%（w/v）的NaCl。进一步地，设想组合物A和组合物B两者均包含分别基于组合物A和B的总体积，浓度大于14%（w/v）的NaCl。此外，组合物A和B两者均可以包含分别基于组合物A和B的总体积，浓度大于15%（w/v）的NaCl。还优选地，组合物A和B中的NaCl浓度小于22%（w/v），更优选小于20%（w/v），且最优选小于18%（w/v），所述浓度再次基于组合物B的总体积。因此，例如，NaCl的浓度可以大于10%（w/v）但小于20%（w/v），或大于12.5%、14%或15%（w/v）但小于20%（w/v）。

生物质（即菌株MA-C的细胞）的浓度可以是允许甲酸盐含量减少的任何浓度。测试了各种生物质范围（参见实施例2）。例如，生物质浓度可以在0.2至10 g/l的范围内，特别是在0.5至4.5 g/l的范围内。对于250 mg/l甲酸盐的最佳生物质浓度为1.6 g/l。因此，还设想生物质浓度在1.3至1.9 g/l的范围内。

此外，组合物B可以包含如本文上文对于组合物A所述的苯胺、酚盐和/或MDA。进一步地，组合物可以具有如本文上文对于组合物A所述的TOC含量（在孵育开始时）。

如上所述，本发明的方法优选以大规模进行。因此，组合物B优选具有至少1、10、100、500、1000、2500或5000升的体积或任何中间体积。然而，本发明同样设想了较小的体积，例如至少5 ml或100 ml的体积（例如用于测试）。

本发明的方法，特别是本文所提及的孵育，优选作为分批法、补料分批法或连续法，特别是作为具有细胞截留的分批法、补料分批法或连续法（优选在生物反应器中）进行。因此，组合物B在分批、补料分批或连续条件下孵育。术语“分批法”优选指孵育细胞的方法，其中在孵育过程开始时提供最终将用于孵育细胞的所有组分，包括底物和进一步的培养基组分、组合物A以及细胞本身。分批法优选在某一点处停止，并且分离经处理的高盐废水。如本文使用的，术语“补料分批法”指孵育细胞的方法，其中在培养过程开始后的某个时间向培养物提供另外的组分，例如另外的培养基组分和/或底物。补料分批培养优选在某一点处停止，并且收获培养基中的细胞和/或组分，并且分离经处理的高盐废水。

在一个特别优选的实施方案中，使用如上文所提及的底物（例如乙酸盐），本发明的方法并且因此如本文所提及的孵育使用混合进料系统进行连续培养。

在一个优选实施方案中，本发明的方法进一步包括使盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞与组合物B分开的步骤，从而得到组合物C。细胞与组合物B的分开应该在组合物B孵育后，即在甲酸盐含量减少后进行。

所得到的组合物C（其在本文中也称为“经处理的废水”）应该基本上不含盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞。换言之，组合物C不应该包含细胞。

细胞与组合物B的分开可以通过认为合适的所有细胞截留手段来实现。例如，细胞的分开可以通过离心、过滤或倾析来实现。优选地，通过过滤将细胞与组合物B分开。

进一步地，细胞可以固定在珠或固体支持物上，从而允许细胞与组合物B分开。

如果进行连续法，则考虑将分开的细胞进料回废水中。

如果该方法在生物反应器中进行，则设想生物反应器包括用于细胞截留的手段。优选地，生物反应器包括适合于通过过滤将细胞与组合物B分开的膜。

所得到的组合物C，即经处理的废水，优选包含其量小于15 mg/l的甲酸盐。更优选地，它包含其量小于10 mg/l，且最优选小于5 mg/l的甲酸盐。这同样适用于组合物B。

进一步地，组合物C优选具有小于40 mg/l，更优选小于30 mg/l，且最优选小于20mg/l的TOC含量。

在本发明的一个优选实施方案中，该方法进一步包括浓缩组合物C，从而得到组合物C*。

该步骤将增加经处理的废水的NaCl浓度，即NaCl在组合物中向上浓缩(up-concentrated)。优选地，经浓缩的组合物C*包含基于组合物A的总体积的浓度大于20.0%（w/v），特别是浓度大于22%（w/v）的NaCl。当用于氯碱工艺的进料流时，这些NaCl浓度是理想的浓度。

根据本发明，组合物C的向上浓缩可以是通过认为合适的任何方法的浓缩。优选的方法是反渗透、超滤和纳米过滤。在这些方法中，对过滤膜一侧施加正渗透压。进一步地，可以通过蒸发实现向上浓缩。

如上所述，组合物A和B可以包含浓度大于20%（w/v）的NaCl。当使经处理的废水进行氯碱工艺时，如果使用这些浓度，则原则上可以省略浓缩步骤。

本文上文给出的定义和解释加以必要的变更适用于本发明的下述主题，特别是适用于生产氯气和/或氢氧化钠的本发明的下述方法、本发明的组合物、本发明的生物反应器和本发明的用途。

本发明还涉及生产氯气和/或氢氧化钠的方法，其包括以下步骤：

（a）提供根据本发明的方法的组合物C或根据本发明的方法的组合物C*，和

（b）使根据（a）的组合物进行氯化钠电解，从而产生氯气和氢氧化钠。

氯化钠的电解可以通过本领域众所周知的方法进行。优选地，电解是氯化钠的膜电解槽(membrane cell)电解，特别是使用耗氧电极的膜电解，氯化钠的隔膜电解槽(diaphragm cell)电解或氯化钠的水银电解槽(mercury cell)电解。

上述方法的步骤（a），即根据本发明的方法的组合物C或根据本发明的方法的组合物C*的提供，优选包括用于减少高盐溶液的甲酸盐含量的方法的步骤。

因此，步骤a）优选包括以下步骤

（i）提供包含高盐废水的组合物A，和

（ii）将所述组合物A与盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞混合，从而生成包含高盐废水和盐单胞菌属种菌株MA-C的组合物B，和

（iii）将盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞与组合物B分开，从而得到组合物C，

如果使用组合物C*，则步骤a）优选包括浓缩组合物C从而得到组合物C*的进一步步骤。

优选地，在混合步骤（ii）之后孵育组合物B。所述孵育应该在合适的条件下，即在允许通过MA-C细胞的甲酸盐含量减少的条件下进行。优选地，孵育在生物反应器中进行。

本发明进一步涉及如本文上文结合本发明的方法所定义的组合物B。因此，本发明涉及高盐废水和盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞的组合物B，其中所述组合物包含NaCl和甲酸盐，所述NaCl浓度大于10%（w/v）。

结合用于减少甲酸盐含量的本发明的方法，公开了甲酸盐的优选含量和进一步优选的NaCl浓度。另外，如上所述，组合物可以包含组分（例如进一步的培养基组分和/或合适的底物、苯酚、苯胺等）。

进一步地，本发明涉及包含至少1 l本发明的组合物B的生物反应器。

进一步地，本发明涉及盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞用于减少包含高盐废水的组合物A的甲酸盐含量的用途。所述组合物A优选包含NaCl和甲酸盐，所述NaCl基于组合物A的总体积的浓度大于10%（w/v）。

最后，本发明涉及盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞用于减少组合物B的甲酸盐含量的用途。

根据上述用途，优选结合本发明的方法如本文上文所述减少甲酸盐含量。定义和解释相应地适用。

本发明的优选实施方案：

在下文中，描述了本发明的优选实施方案。定义和解释加以必要的变更适用。

1. 用于减少高盐废水的甲酸盐含量的方法，所述方法包括：

（i）提供包含高盐废水的组合物A，和

（ii）将所述组合物A与盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞混合，从而生成包含高盐废水和盐单胞菌属种菌株MA-C的组合物B，

其中组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于10%（w/v）的NaCl。

2. 实施方案1的方法，其中组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于12.5%（w/v）的NaCl。

3. 实施方案1的方法，其中组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于15%（w/v）的NaCl。

4. 实施方案1至3中任一项的方法，其中组合物A由高盐废水组成。

5. 实施方案1至4中任一项的方法，其中组合物A具有大于50 mg/l的TOC含量。

6. 实施方案1至5中任一项的方法，其中组合物A包含其量大于50 mg/l的甲酸盐。

7. 实施方案1至6中任一项的方法，其中组合物B具有在6.0至8.0的范围内，优选在6.6至7.4的范围内的pH值。

8. 实施方案1至7中任一项的方法，其中所述甲酸盐含量的减少在15℃至45℃的温度下，优选在18℃至32℃的温度下进行。

9. 实施方案1至8中任一项的方法，其中所述方法在生物反应器中、特别是具有细胞截留的生物反应器中作为分批法、补料分批法或连续法进行。

10. 实施方案1至9中任一项的方法，其中步骤（i）包括从亚甲基二胺生产中分离高盐废水。

11. 实施方案1至10中任一项的方法，其中组合物B包含浓度大于10%（w/v）的NaCl。

12. 实施方案1至10中任一项的方法，其中组合物B包含浓度大于15%（w/v）的NaCl。

13. 实施方案1至12中任一项的方法，其中组合物B进一步包含选自乙酸盐、葡萄糖、蔗糖、乳酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐和甘油的至少一种底物，所述底物加入组合物B中。

14. 实施方案1至13中任一项的方法，其中组合物B具有至少1 l的体积。

15. 实施方案1至14中任一项的方法，其进一步包括使所述盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞与所述组合物B分开，从而得到组合物C。

16. 实施方案15中任一项的方法，其中组合物C具有小于30 mg/l的TOC含量。

17. 实施方案15和16的方法，其中组合物C包含其量小于15 mg/l的甲酸盐。

18. 实施方案15至17中任一项的方法，其进一步包括浓缩组合物C，从而得到组合物C*。

19. 用于生产氯气和氢氧化钠的方法，其包括以下步骤：

（a）提供根据实施方案15至17中任一项的方法的组合物C或根据实施方案18的方法的组合物C*，和

（b）使根据（a）的组合物进行氯化钠电解，从而产生氯气和/或氢氧化钠。

20. 高盐废水和盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞的组合物B，其中所述组合物包含NaCl和甲酸盐，所述NaCl浓度大于10%（w/v）。

21. 生物反应器，其包含至少1 l实施方案20的组合物。

22. 盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞用于减少包含高盐废水的组合物A的甲酸盐含量的用途，其中所述组合物包含NaCl和甲酸盐，所述NaCl基于组合物A的总体积的浓度大于10%（w/v）。

本说明书中引用的所有参考文献关于它们的整体公开内容和本说明书中具体提及的公开内容都通过引用并入本文。

在附图中：

图1. 表示使用MA-C细胞的催化活性和混合进料系统，以连续模式的含有甲酸盐的废水的生物处理。

图2. 显示了对于各种糖和有机酸，盐单胞菌属种MA-C细胞的生物质增加。图显示对于作为底物的甲酸盐，生物质没有增加。

图3. 显示了在各种盐浓度下，盐单胞菌属种MA-C细胞对250 mg/l甲酸盐的催化活性。尽管在较低的盐浓度（0至7% w/v NaCl）下发生较快的甲酸盐催化，但在较高的盐浓度（15至20% w/v NaCl）下也观察到有效的甲酸盐催化。

图4. 应答等值线图(response counter plot)显示了最佳甲酸盐催化在较低的NaCl浓度和较高的初始甲酸盐浓度下发生。

图5. 表示MA-C细胞的生物质浓度对甲酸催化的作用。对于250 mg/l甲酸盐的最佳生物质浓度为1.6 g/l。

图6. 协同因素图显示了两种因素初始甲酸盐浓度和生物质浓度对甲酸盐催化的显著性。

图7. 显示了对于含有14% w/v NaCl和250 mg/l甲酸盐的卤水，用MA-C细胞的补料分批培养。生物质减少直至工艺的28小时，甲酸盐被轻微催化。乙酸盐的脉冲(pulse)（3.5 g/l）促进了在该工艺的28小时的生物质生长，并且发生了甲酸盐的立即催化。在该工艺的120小时时完全利用乙酸盐。

图8. 表示对于含有14% w/v NaCl、250 mg/l甲酸盐和3.5 g/l乙酸盐的卤水，用MA-C细胞的分批法。从乙酸盐获得生物质增加。在该工艺的190和235小时添加两个甲酸盐脉冲没有导致生物质生长。废气中的CO₂百分比显示反应器中的生物质可以将甲酸盐的第一脉冲完全催化成CO₂。甲酸盐的第二脉冲未被完全催化。

通过下述实施例仅说明本发明。无论如何，所述实施例都不应以限制本发明范围的方式加以解释。

实施例

实施例1：摇瓶实验中的甲酸盐催化

菌株和培养基

盐单胞菌属种（DSM 7328）命名为MA-C，野生型菌株购自dsmz - 德国微生物和细胞培养物保藏中心。用于接种物制备的摇瓶培养物在120 rpm和30℃下在实验室培养箱(Infors, Switzerland)中生长，使用由dsmz建议的具有以下组成（g/l）的1428号培养基：NaCl 100、MgCl₂. 6H₂O 10、KCl 1.0、Na₂SO₄ 0.5、酵母提取物5.0、胰蛋白胨5.0；pH 7.0。始终对500 ml锥形瓶和培养基进行灭菌。

分析学

使用Shimadzu UV/Vis分光光度计在600 nm处以12小时的间隔测量作为细胞生长指标的浊度。使用HPLC测量培养上清液中残留的甲酸盐浓度。HPLC（Thermo-Fisher）方法如下进行：使用在30℃下的来自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱、在MQ水中的0.1% TFA的等度洗脱液，以0.5 ml/分钟的流动，随后为在210 nm处的UV检测。注射体积为20 μl的定量限值对于甲酸盐为5 mg/l。用于定量的标准品在与样品相同的盐基质中制备。

摇瓶中的甲酸盐研究

对于甲酸盐摄取研究，制备合成确定成分培养基。以g/l计的培养基组成如下：NaCl100、MgCl₂.6H₂O 10、KCl 1.0和Na₂SO₄ 0.5，加入不同浓度的甲酸钠（50至2000 mg/l）。将pH调节至7.0。通过以3000 rpm离心5分钟收获在含有以下的复合培养基上生长的细胞：酵母提取物5.0、胰蛋白胨5.0、NaCl 100、MgCl₂.6H₂O 10、KCl 1.0和Na₂SO₄ 0.5。将细胞洗涤并溶解在含有100 ml仅具有甲酸盐作为碳源的确定成分培养基的摇瓶中，并且在30℃和120rpm搅拌下孵育。测量零小时OD₆₀₀并且贮存1ml样品用于在零小时的HPLC分析。监测在甲酸盐上的生长和残留的甲酸盐浓度。

盐单胞菌属种MA-C的细胞不能使用甲酸盐作为生长来源，然而，用于确定随时间的残留甲酸盐浓度的HPLC分析显示甲酸盐从在合成培养基和实际卤水上培养的培养基中完全去除。在摇瓶以及生物反应器中的更多实验中更详细地研究了细胞对甲酸盐的催化作用，以便能够控制其它工艺参数。

实施例2：在更多底物上的盐单胞菌属种MA-C

研究菌株在作为底物的各种糖和有机酸上的生长。制备以25mM浓度含有以下任一种的无菌培养基：葡萄糖、蔗糖、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐和糖醇甘油。将100 ml无菌培养基转移到500 ml锥形瓶内，并且向每个烧瓶中加入统一浓度的细胞，并且烧瓶在30℃下伴随120 rpm搅拌进一步孵育。

盐单胞菌属种MA-C可以利用本研究中使用的所有糖和有机酸作为生长来源（图2）。在富马酸盐上未观察到生长，并且培养上清液中的富马酸盐浓度保持不变。在此，我们得出结论盐单胞菌属种MA-C的催化活性对于甲酸盐是特异性的。

实施例3：用于甲酸盐催化的最佳培养条件

在各种盐浓度下研究了MA-C细胞对甲酸盐的催化活性，并且观察到在所有NaCl浓度（0至20）% w/v下发生有效的甲酸盐催化，尽管在较低的盐浓度下发生更好的甲酸盐催化（图3）和（图4）。

为了发现最佳条件和其它工艺参数对MA-C细胞对甲酸盐的催化活性的影响，进行了实验的部分析因设计，以评估四种因素（温度、pH、甲酸盐浓度和生物质浓度）对三个参数（Δ生物质浓度、残留甲酸盐浓度和pH）的影响。在该实验中研究的因素连同各自的范围在（表1）中给出。

因素名称	范围
		温度	25℃至45℃
pH	6至8
		甲酸盐浓度	100至1000 mg/l
生物质浓度	0.5至4.5 g/l

通过统计工具Modde对于本研究提出了十九个实验。在含有14% w/v NaCl的实际卤水的摇瓶中进行实验。以24小时的间隔，测定生物质浓度、pH变化和残留甲酸盐浓度。通过Modde分析获得的测量值。

对于Δ甲酸盐获得有效的模型。协同因素图(coefficient plot)显示了初始生物质浓度对甲酸盐催化的影响（图5）。在较高的生物质浓度下可以获得更好的甲酸盐去除。温度似乎对甲酸盐催化没有影响，然而，对于细胞存活，建议较低的温度。pH对甲酸盐催化没有显著性，其中研究了（6至8）的范围（图6）。

实施例4：在生物反应器中的培养

由于摇瓶实验的限制，在反应器中完成了进一步的研究，其中控制了工艺参数和培养条件。在这种情况下的实验在适合于在高盐环境下培养的专用抗腐蚀生物反应器设备中进行。

利用具有下述规格的专用非腐蚀性Laborfors PEEK (Infors, AG, Switzerlands)反应器：

硼硅酸盐玻璃培养容器：1 L体积

硼硅酸盐玻璃排出气冷却

专用抗腐蚀聚合物（PEEK）生物反应器顶盖

专用抗腐蚀聚合物（PEEK）温度计支架

硼硅酸盐玻璃采样管和进气管

专用抗腐蚀搅拌器

在反应器容器上的硼硅酸盐玻璃夹套

以下的在线分析：

排出气CO₂

排出气O₂

玻璃pH探头

Hastelloy Clark pO₂和

用于空气的热质量流量控制器。

进行分批法，以便研究在含有14% w/v NaCl和250 mg/l甲酸盐的实际卤水上，在生物反应器中培养盐单胞菌属种MA-C的可行性。将下述培养基组分进一步加入卤水中：KCl1 g/l、MgCl₂.6H₂O 10 g/l、Na₂SO₄ 0.5 g/l以及含有（Fe、Cu、Mn和Zn）的微量元素溶液2.5ml。

温度：30℃

pH：7.0（0.5M HCl用于pH控制）

搅拌：300 rpm

进气：0.2 vvm（NL/分钟）。

在工艺的3.5小时，将反应器接种至大约0.5 g/l的生物质浓度。以不同的时间间隔测量OD₆₀₀和残留甲酸盐浓度。生物质浓度显示减少，并且甲酸盐在一定程度上被催化（图7），这再次确认了MA-C细胞对甲酸盐的催化作用。甲酸盐催化的产物是CO₂，其通过废气分析仪测量。由于MA-C细胞只能催化甲酸盐，并且在这种情况下底物没有形成生物质，进料第二底物以产生生物质。先前实验显示，与其他简单底物相比，在乙酸盐上的生长可以以最高速率发生，作为廉价底物的乙酸盐是工业工艺中的合适替代物。为此，选择乙酸盐作为该工艺中的第二种底物。由于甲酸盐减少缓慢，在第28小时的工艺时间，将乙酸盐的脉冲（3 g/l）进料到反应器。生物质开始增加，并且形成的新鲜生物质在36.7小时完全催化甲酸盐。在工艺的120小时后，还可以观察到乙酸盐的完全去除（图7）。为了加速在连续模式中的乙酸盐摄取和甲酸盐降解，进行培养基优化。

实施例5：用于连续模式中的最佳甲酸盐催化的培养基优化

为了培养基优化目的，进行了实验的完全析因设计，以评估五种因素（镁、钾、硫、氮和磷）对三个参数（生物质浓度、Δ甲酸盐和Δ乙酸盐）的影响。所有实验都用250 mg/l甲酸盐和3.5 g/l乙酸盐以及作为接种物的等浓度的MA-C细胞在摇瓶中进行。通过统计工具Modde对于部分析因设计提出了十九个实验，并且还将两个对照实验加入矩阵中。每24小时测量生物质以及残留的甲酸盐和乙酸盐浓度。对于应答分析在72小时后获得的结果。协同因素图显示与其它因素相比，氮和钾对最终生物质浓度的显著作用。另外，从五个实验获得的数据显示具有最高的最终生物质浓度以及完全的乙酸盐和甲酸盐摄取。该实验中使用的组分和范围显示于（表2）中。

因素名称	要素	范围（g/l）
			镁	MgCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O	0至10
钾	KCl	0至1
			硫	Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	0至0.5
氮	NH<sub>4</sub>Cl	0至1.5
			磷	NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0至0.15

具有最高生物质浓度以及乙酸盐和甲酸盐的完全摄取的实验具有下述浓度（g/l）的培养基组分（表3）。

实验编号	NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	NH<sub>4</sub>Cl	Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>	KCl	MgCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O
						N16，N21	1	1.5	0.5	1	10
N17,18,19	0.5	0.75	0.25	0.5	5

实施例6：通过盐单胞菌属种MA-C细胞在连续模式中的甲酸盐催化

在菌株盐单胞菌属种MA-C可以在生物反应器中成功地培养，并且使用乙酸盐作为共底物完全催化甲酸盐之后，使用混合进料系统建立连续限制的工艺。第一项任务是指定关于MA-C的最佳稀释速率的选项，所述最佳稀释速率足够高且可以适用于工业规模使用，但仍然低于最大比生长速率。对下述稀释速率进行了实验：

0.008 1/小时

0.011 1/小时

0.0 15 1/小时

0.02 1/小时发生洗净(wash out)，这意味着，这种稀释速率大于细胞在乙酸盐上的最大比生长速率。事实上，最大生长速率从分批实验中确定为接近0.02 1/小时。为了应用更高的稀释速率并避免洗净，使用细胞截留看起来是必要的。

在实验之前，将所有培养基组分连同3.5 g/l乙酸盐加入卤水中。通过添加0.5 MHCl将pH恒定保持在7.0。为了从连续法获得稳态，从工艺中获得样品以便测量生物质浓度。通过HPLC测量甲酸盐和乙酸盐的残留浓度，显示在稳态下乙酸盐和甲酸盐的完全去除。经处理的卤水的TOC含量分析在外部完成，并且TOC含量显示显著减少至约15 ppm。计算对于底物乙酸盐和甲酸盐两者的速率和产率（氧气：Yo₂/s，二氧化碳：Yco₂/s，生物质：Y x/s）。总碳平衡计算为0.918 Cmol/Cmol。

Claims

1.用于减少高盐废水的甲酸盐含量的方法，所述方法包括：

（i）提供包含高盐废水和甲酸盐的组合物A，和

2.权利要求1的方法，其中组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于12.5%（w/v）的NaCl，或其中组合物A包含基于组合物A的总体积的浓度大于15%（w/v）的NaCl。

3.权利要求1和2的方法，其中组合物A由高盐废水组成。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中组合物A包含其量大于50 mg/l的甲酸盐。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述甲酸盐含量的减少在15℃至45℃的温度下，优选在18℃至30℃的温度下进行。

6.权利要求1至5中任一项的方法，其中步骤（i）包括从亚甲基二胺生产中分离所述高盐废水。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述组合物B包含浓度大于10%（w/v）的NaCl，或其中所述组合物B包含浓度大于15%（w/v）的NaCl。

8.权利要求1至7中任一项的方法，其中组合物B进一步包含选自乙酸盐、葡萄糖、蔗糖、乳酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐和甘油的至少一种底物，所述底物加入组合物B中。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其进一步包括使所述盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞与所述组合物B分开，从而得到组合物C。

10.权利要求9中任一项的方法，其中组合物C具有小于30 mg/l的TOC含量，和/或其中组合物C包含其量小于15 mg/l的甲酸盐。

11.权利要求9和10的方法，其进一步包括浓缩所述组合物C，从而得到组合物C*。

12.用于生产氯气和/或氢氧化钠的方法，其包括以下步骤：

（a）提供根据权利要求9或10的方法的组合物C或者根据权利要求11的方法的组合物C*，和

（b）使根据（a）的组合物进行氯化钠电解法，从而产生氯气和氢氧化钠。

13.权利要求12的方法，其中所述氯化钠电解选自氯化钠的膜电解槽电解，特别是使用耗氧电极的膜电解，氯化钠的隔膜电解槽电解和氯化钠的水银电解槽电解。

14.高盐废水和盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞的组合物B，其中所述组合物包含NaCl和甲酸盐，所述NaCl浓度大于10%（w/v），和/或包含至少1 l所述组合物的生物反应器。

15.盐单胞菌属种菌株MA-C的细胞用于减少包含高盐废水的组合物A的甲酸盐含量的用途，其中所述组合物包含NaCl和甲酸盐，所述NaCl基于组合物A的总体积的浓度大于10%（w/v）。