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JP2019517274A - 最適化されたｃｌｎ１遺伝子および発現カセットおよびそれらの使用 - Google Patents

最適化されたｃｌｎ１遺伝子および発現カセットおよびそれらの使用 Download PDF

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JP2019517274A
JP2019517274A JP2018564943A JP2018564943A JP2019517274A JP 2019517274 A JP2019517274 A JP 2019517274A JP 2018564943 A JP2018564943 A JP 2018564943A JP 2018564943 A JP2018564943 A JP 2018564943A JP 2019517274 A JP2019517274 A JP 2019517274A
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スティーブン グレイ
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Abstract

本発明は、ＰＰＴ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチド、それらを含むベクター（ウイルスまたは非ウイルスベクター）、および、オープンリーディングフレームを細胞または対象に送達するため、および小児性神経リポフスチン沈着症（小児性バッテン病）を治療するための、それらの使用方法に関する。ポリヌクレオチドは、最適化されたＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。【選択図】 図１

Description

［優先権の陳述］
本出願は、２０１６年６月１３日に出願された米国仮出願番号６２／３４９，４１１の利益を主張し、その内容全体は、本明細書中に参照により援用される。
［本発明の分野］
本発明は、最適化されたＣＬＮ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含むポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター（ウイルスまたは非ウイルスベクター）、および、細胞または対象へのＣＬＮ１ ＯＲＦの送達のためにポリヌクレオチドを使用する方法および小児性神経リポフスチン沈着症（小児性バッテン病）を治療するためにポリヌクレオチドを使用する方法に関する。
神経セロイドリポフスチン沈着症（ＮＣＬ）は、体の組織における脂肪色素（リポフスチン）の過剰な蓄積に起因する少なくとも８個の遺伝学的に異なる神経変性疾患のファミリーを指す。これらの脂肪色素は、脂肪およびタンパク質で構成される。リポフスチン材料は、神経細胞、および、肝臓、脾臓、心筋および腎臓を含む多くの臓器において蓄積される。
疾患の小児性形態は、小児性神経セロイドリポフスチン沈着症（ＩＮＣＬ）または小児性バッテン病として知られ、ＣＬＮ１遺伝子の突然変異に起因し、常染色体劣性の障害である。ＣＬＮ１に突然変異を有する一部の子どもは、症候の発症がより後であり、疾患の進行がより遅く、若年性発症疾患に似ていて、より典型的には、ＣＬＮ３遺伝子の突然変異と関連する。ＣＬＮ１遺伝子は、１ｐ３２に位置し、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）と呼ばれるリソソーム酵素をコードする。ＰＰＴ１の欠乏は、ニューロンおよび他の細胞内にタンパク質および脂質の異常な貯蔵および細胞の機能不全をもたらす。
ＩＮＣＬに関する効果的な治療はないが、酵素補充療法（例えば、米国特許第７，４４２，３７２号を参照）および遺伝子療法によって試みがされている。神経幹細胞および他の作用物質の投与も試験されているが（例えば、米国特許第８，２４２，０８６号、米国公報番号２０１５／０３１３８６３を参照）、そのような方法の臨床有効性は未だ試験中である。
したがって、ＩＮＣＬのようなＣＬＮ１発現と関連する障害を治療するための新規の効果的な治療に関する必要性が存在する。
本発明は、ＩＮＣＬのようなＣＬＮ１発現と関連する障害を治療するための、治療的レベルのＣＬＮ１発現を提供することが可能な、最適化されたＣＬＮ１遺伝子、発現カセット、およびベクターの開発に少なくとも部分的に基づく。
したがって、本発明の一態様は、ＰＰＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントに関し、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。
本発明のさらなる態様は、ＰＰＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントおよびベクターを含む発現カセット、形質転換された細胞、および、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック動物に関する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体中に含む、医薬製剤に関する。
本発明の別の態様は、細胞においてＰＰＴ１をコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを発現する方法に関し、細胞を、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／または、ベクターと接触させるステップを含み、それにより、細胞においてポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを発現する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、ＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。別の実施態様では、ＣＬＮ１オープンリーディングフレームは、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームである。別の実施態様では、ＣＬＮ１オープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。
本発明のさらなる態様は、対象においてＰＰＴ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する方法に関し、対象に、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞を送達するステップを含み、それにより、対象においてＰＰＴ１ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、ＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。別の実施態様では、ＣＬＮ１オープンリーディングフレームは、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームである。
本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象においてＣＬＮ１遺伝子またはＰＰＴ１ポリペプチドの異常な発現またはＣＬＮ１遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する方法に関し、対象に、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞を送達するステップを含み、それにより、ＰＰＴ１ポリペプチドまたは対象におけるＣＬＮ１遺伝子の異常な発現と関連する障害を治療する。
本発明の別の態様は、それを必要とする対象におけるＣＬＮ１遺伝子の異常な発現と関連する障害を治療する方法での使用のための、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞に関する。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。
ＣＬＮ１発現カセットのマップを示す。 本発明のＣＬＮ１ ＡＡＶベクターによって処置されたＣＬＮ１ノックアウトマウスの全てのコホートに関する生存曲線を示す。ＮＩＶ＝新生児ＩＶ；ＩＴ＝腰部髄腔内注入；ＩＶ＝静脈内注入；ＩＣＭ＝大槽注入；ｄ．ｏ．＝日齢；ｗ．ｏ．＝週齢；ＫＯ＝ノックアウト。年齢は、それらが注入された年齢である。「死亡」は、体重の２０％低減または安楽死を必要とする有意な罹患率によってスコアされる。 ４週齢における、本発明のＣＬＮ１ ＡＡＶベクターによって処置されたＣＬＮ１ノックアウトマウスのコホートに関する生存曲線を示す。 ２６週齢における、本発明のＣＬＮ１ ＡＡＶベクターによって処置されたＣＬＮ１ノックアウトマウスのコホートに関する生存曲線を示す。 本発明のＣＬＮ１ ＡＡＶベクターによって処置されたＣＬＮ１ノックアウトマウスの静脈内コホートに関する生存曲線を示す。 本発明のＣＬＮ１ ＡＡＶベクターによって処置されたＣＬＮ１ノックアウトマウスの髄腔内コホートに関する生存曲線を示す。 ｓｃＡＡＶ９／ＣＬＮ１治療が血清ＰＰＴ１レベルを増大させて、生存を助ける（ｒｅｃｕｅ）ことを示す。Ａ．ＣＬＮ１マウスは、示された年齢でｉ．ｔ．治療が与えられて、３ヶ月後または人道的エンドポイントに血清が取られた。データは、血清（ｍＬ）あたりの１時間あたりの処理された基質（ｎｍｏｌ）として報告される。未処置ＫＯマウスは、スケール脱落（値＜１）のため示されない。Ｂ．異なる年齢で低投与量治療（上パネル）および高投与量治療（下パネル）によって処置されたマウスと比較するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット。未処置ＫＯマウスが参照として両方のパネルに示される。 加速ロータロッド能力を示す。それぞれのポイントは、所定の試験年齢で２つの試験にわたって所定のマウスが落下するまでの平均待ち時間を表わす。Ａ．行動試験を＜１歳で始めたコホート。Ｂ．行動試験を＞１歳で始めたコホート。テューキーの事後多重比較による一元配置分散分析を用いて、未処置ＨＥＴ（＊）または未処置ＫＯ（＃）と比較した群平均（ｇｒｏｕｐ ｍｅａｎｓ）における違いを評価した：＊／＃ｐ＜０．０５、＊＊／＃＃ｐ＜０．０１、＊＊＊／＃＃＃ｐ＜０．００１。 モリス水迷路における水泳速度評価を示す。それぞれのポイントは、１日あたり４回の試験で２〜３日にわたって平均された、試験された年齢での所定のマウスに関する水泳速度を表わす。Ａ．行動試験を＜１歳に始めたコホート。テューキーの事後多重比較による一元配置分散分析を用いて、未処置ＨＥＴ（＊）または未処置ＫＯ（＃）と比較した群平均における違いを評価した：＊／＃ｐ＜０．０５、＊＊／＃＃ｐ＜０．０１、＊＊＊／＃＃＃ｐ＜０．００１。Ｂ．行動試験を＞１歳で始めたコホート。群平均における違いは、独立スチューデントのｔ検定によって判定された：＊＊ｐ＜０．０１。 モリス水迷路においてプラットフォームを見つける時間を示す。それぞれのポイントは、１日あたり４回の試験で２〜３日にわたって平均された、試験された年齢での所定のマウスに関するプラットフォームを見つけるまでの時間を表わす。Ａ．行動試験を＜１歳に始めたコホート。テューキーの事後多重比較による一元配置分散分析を用いて、未処置ＨＥＴ（＊）または未処置ＫＯ（＃）と比較した群平均における違いを評価した：＊／＃ｐ＜０．０５、＊＊／＃＃ｐ＜０．０１、＊＊＊／＃＃＃ｐ＜０．００１。Ｂ．行動試験を＞１歳で始めたコホート。群平均における違いは、独立スチューデントのｔ検定によって判定された：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 モリス水迷路において泳いだ距離を示す。それぞれのポイントは、１日あたり４回の試験で２〜３日にわたって平均された、試験された年齢での所定のマウスに関する泳いだ距離を表わす。Ａ．行動試験を＜１歳に始めたコホート。テューキーの事後多重比較による一元配置分散分析を用いて、未処置ＨＥＴ（＊）または未処置ＫＯ（＃）と比較した群平均における違いを評価した：＊＊／＃＃ｐ＜０．０１、＊＊＊／＃＃＃ｐ＜０．００１。Ｂ．行動試験を＞１歳で始めたコホート。群平均における違いは、独立スチューデントのｔ検定によって判定された：＊＊ｐ＜０．０１。 逆ワイヤハングから（ｆｏｒｍ）落下するまでの時間を示す。それぞれのポイントは、所定の試験年齢での単一のマウスに関するデータを表わす。Ａ．行動試験を＜１歳に始めたコホート。テューキーの事後多重比較による一元配置分散分析を用いて、未処置ＨＥＴ（＊）または未処置ＫＯ（＃）と比較した群平均における違いを評価した：＊＊＊／＃＃＃ｐ＜０．００１。Ｂ．行動試験を＞１歳で始めたコホート。群平均における違いは、独立スチューデントのｔ検定によって判定された。 逆ワイヤハングに関する協調性（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）スコアを示す。それぞれのポイントは、所定の試験年齢での単一のマウスに関するデータを表わす。Ａ．行動試験を＜１歳に始めたコホート。テューキーの事後多重比較による一元配置分散分析を用いて、未処置ＨＥＴ（＊）または未処置ＫＯ（＃）と比較した群平均における違いを評価した：＊＊＊／＃＃＃ｐ＜０．００１。Ｂ．行動試験を＞１歳で始めたコホート。群平均における違いは、独立スチューデントのｔ検定によって判定された。 新生児のときにｉ．ｖ．処置されたＣＬＮ ＫＯおよびＨＥＴマウスは、正常な寿命および行動を有することを示す。全てのプロットは、新生児のときに処置された試験マウスである。Ａ．Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット。§は、ＮＩＶによってＨＥＴ処置された動物は健康であったが、分析のために１８月において屠殺されたことを示す。Ｂ．未処置ＨＥＴと比較したＮＩＶによって処置されたＨＥＴマウスを示す、血清ＰＰＴ１活性アッセイ。Ｃ．加速ロータロッド能力。Ｄ．モリス水迷路においてプラットフォームを見つけるまでの時間。Ｅ．モリス水迷路における水泳速度評価。Ｆ．モリス水迷路において泳いだ距離。Ｇ．逆ワイヤハングから落下するまでの時間。Ｈ．逆ワイヤハングに関する協調性スコア。処置群および未処置ＨＥＴに関する平均（ｍｅａｎｓ）の間の違いは、独立スチューデントのｔ検定によって判定された：＊ｐ＜０．０５。
本発明は、以下に、より詳細に説明される。この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる方法または本発明に加えられ得る全ての特徴の詳細なカタログであることを意図しない。例えば、一実施態様に関して説明される特徴は、他の実施態様に組み込まれてよく、特定の実施態様に関して説明される特徴は、その実施態様から削除されてよい。加えて、本明細書において示唆される様々な実施態様に対する非常に多くの変動および付加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することが意図されて、それらの全ての並べ替え、組み合わせ、および変動を徹底的に特定しない。
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いられ得ることが明確に意図される。さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせが、除外または省略され得ることも検討する。説明すると、複合体は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含む、と明細書が述べる場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせが、単独または任意の組み合わせで省略および放棄され得ることが明確に意図される。
別段の定義がされない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書において本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の制限を意図しない。
ヌクレオチド配列は、別段の明確な指示がない限り、本明細書において、一本鎖のみによって、５’から３’の方向で、左から右に示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用に従って表される。
別段の指示がされる場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組み換えおよび合成ポリペプチド、抗体またはそれらの抗原−結合フラグメントの生産、核酸配列の操作、形質転換された細胞の生産、ｒＡＡＶ構築物、改変型キャプシドタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を発現しているパッケージングベクター、および、一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために、用いられ得る。そのような技術は当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）； Ｆ． Ｍ． ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ． ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ （Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列および他の参照は、それらの全体で参照により援用される。
定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形も同様に含むことが意図される。
本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある挙げられた項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、代替（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。
さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される全ての特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討する。
さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、本発明の化合物または薬剤の量、投与量、時間、温度などのような測定可能な値を指す場合、既定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することが意味される。
本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、挙げられた材料またはステップ、および、特許請求の範囲に記載された発明の基礎および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等と解釈されるべきでない。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される、用語「から本質的になる」（および文法上の変形）は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないように、挙げられた配列（例えば、配列番号）、および、挙げられた配列の５’および／または３’またはＮ末端および／またはＣ末端上、または、２つの末端の間（例えば、ドメインの間）の、合わせて１０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の、両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合わせて１０以下のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸は、一緒に合わせられたさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の合計数を含む。本発明のポリヌクレオチドに適用される、用語「実質的に変更される」は、挙げられた配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い、コードされるポリペプチドを発現する能力の増大または低減を指す。本発明のポリペプチドに適用される、用語「実質的に変更される」は、挙げられた配列からなるポリペプチドの活性と比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い、生物学的活性の増大または低減を指す。
本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、自律的に複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含むパルボウイルスファミリーを包含する。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、およびコントラウイルス属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、野ガモパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
ディペンドウイルス属は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；および表１を参照。
本発明の関連における用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、制限されずに、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）型３Ａおよび３Ｂ）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、および、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。多くのさらなるＡＡＶ血清型およびクレードが同定されていて（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１−６３８８および表１を参照）、それも用語「ＡＡＶ」によって包含される。
本発明のパルボウイルス粒子およびゲノムは、限定されないが、ＡＡＶ由来であってよい。様々な血清型のＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ネイティブのＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースに見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２およびＡＹ５３０５７９を参照；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３−：３７５−３８３；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３０：３７５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ ００／２８０６１、ＷＯ ９９／６１６０１、ＷＯ ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。表１も参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ ＩＴＲ配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６），「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡによって提供される（その全体で本明細書において援用される）。
「キメラ」ＡＡＶ核酸キャプシドコード配列またはＡＡＶキャプシドタンパク質は、２以上のキャプシド配列の部分を組み合わせるものである。「キメラ」ＡＡＶビリオンまたは粒子は、キメラＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。
本明細書において用いられる用語「向性」は、特定の細胞または組織型（単数または複数）へのウイルスの選択的侵入および／または特定の細胞または組織型への侵入を促進する細胞表面との選択的相互作用を指し、任意選択で好ましくは、例えば組み換えウイルスに関する細胞内のウイルスゲノムによって保有される配列の発現（例えば転写、任意選択で翻訳）、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の発現が後に続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば誘導性プロモーターまたは他の方法で制御される核酸配列に関するトランス作用性因子の不存在下では開始され得ないことを理解している。ｒＡＡＶゲノムの場合は、ウイルスゲノム由来の遺伝子発現は、安定して組み込まれたプロウイルスおよび／または組み込まれていないエピソーム、ならびにウイルス核酸が細胞内でとり得る任意の他の形態由来であってよい。
用語「向性プロファイル」は、１つまたは複数の標的細胞、組織および／または臓器の形質導入のパターンを指す。キメラＡＡＶキャプシドの代表的な例は、末梢臓器では低い形質導入しかない、ＣＮＳの細胞の効率的な形質導入によって特徴付けられる向性プロファイルを有する。
本明細書において用いられる用語「ＣＬＮ１遺伝子の異常な発現と関連する障害」は、正常な対象または集団における発現レベルまたは活性と比較した、対象におけるＣＬＮ１遺伝子の低減または変更された発現の兆候、または、引き起こされる疾患、障害、症候群、または状態を指す。
本明細書において用いられる、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）による細胞の「形質導入」は、細胞へのベクターの侵入、および、ウイルスベクターへの核酸の取り込みおよびその後のウイルスベクターを介した細胞への移行による細胞への遺伝物質の移行を意味する。
別段の指示がない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または同様の用語は、適切なポジティブまたはネガティブコントロールに対する参照によって判定され得る（例えば、ポジティブコントロールのそれぞれ少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くの形質導入または向性、または、ネガティブコントロールのそれぞれ少なくとも約１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％、１０００％またはそれよりも多くの形質導入または向性）。
同様に、ウイルスが標的組織に関して「効率的に形質導入しない」または「効率的な向性を有さない」、または同様の用語の場合は、適切なコントロールに対する参照によって判定され得る。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳの外側の組織、例えば、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞に、効率的に形質導入しない（すなわち、効率的な向性を有さない）。特定の実施態様では、組織（単数または複数）（例えば、肝臓）の望ましくない形質導入は、所望の標的組織（単数または複数）（例えば、ＣＮＳ細胞）の形質導入のレベルの２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。
用語「５’部分」および「３’部分」は、２以上のエレメント間の空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの３’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの３’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの５’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの５’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。
本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。本明細書において用いられる用語、所定のペプチドの「フラグメント」は、ペプチドの任意のペプチドサブセットを指すことが意味される。一実施態様では、フラグメントは、ペプチドの配列の少なくとも２個の隣接アミノ酸を含む。別の実施態様では、フラグメントは、ペプチドの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００個の隣接アミノ酸を含む。一部の実施態様では、フラグメントは、所定のペプチドの少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％配列を有する。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「ヌクレオチド配列」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む）であってよいが、好ましくは一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。
本明細書において用いられる用語「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、遺伝子の部分を指す。
本明細書において用いられる用語「コドン最適化」は、コード配列内に通常存在する１つまたは複数のコドンを、同一（同義）アミノ酸に関するコドンによって置換することによってコード配列の発現を増大させるように、野生型コード配列（例えば、ＰＰＴ１に関するコード配列）と比較して最適化されたコード配列を指す。一部の実施態様では、置換は、レアコドン（例えば、ヒトコドン）を最小限にして、合計ＧＣ含有量を増大させて、ＣｐＧ含有量を低減させて、潜在性のスプライスドナーまたはアクセプター部位を除去して、および／または、Ｋｏｚａｋ配列のようなリボソーム侵入部位を付加または除去する。
本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムによって、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブアライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得した。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるギャップ化ＢＬＡＳＴである。
アミノ酸配列同一性パーセンテージの値は、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されるギャップは無視する）。
同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。
アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性パーセントの計算においては、相対的重量は、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な兆候に割り当てられない。
一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算のための、以下に記載される加重したスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである。
本明細書において用いられる「単離された」核酸またはヌクレオチド配列（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、または、核酸またはヌクレオチド配列と関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、核酸またはヌクレオチド配列を意味する。
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、または、ポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される、本明細書において用いられる用語「改変型」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。
本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法的等価物）ことは、ウイルスベクターが、出発原料における他の構成要素の少なくとも一部から、少なくとも部分的に分離されることを意味する。
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（または文法上の同等の用語）によって、対象の状態の重症度が低減または少なくとも部分的に改善または向上されること、および／または、少なくとも１つの臨床症候における何らかの軽減、緩和または低減が達成される、および／または、状態の進行に遅延があることを意味する。
本明細書において用いられる用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（および文法上のその等価物）は、疾患または障害の発症における遅延または疾患または障害の発症の際の症候の減少を指す。用語は、疾患の完全な廃止を暗示することを意味せず、状態の発生率を減少させる、または状態の発症および／または進行を遅延させる、任意のタイプの予防的治療を包含する。
本明細書において用いられる「治療効果的な」量は、対象に何らかの改善または利益を提供するのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候において何らかの軽減、緩和、低減、または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治療的である必要はないことを理解している。
本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延するのに十分な、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を低減および／または遅延するのに十分な量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。
「異種ヌクレオチド配列」または「異種核酸」は、ウイルスにおいて天然起源でない配列である。一般に、異種核酸またはヌクレオチド配列は、非翻訳ＲＮＡおよび／またはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。
本明細書において用いられる用語「ベクター」または「送達ベクター」（および同様の用語）は、細胞または対象への送達が可能なＤＮＡフラグメント、ヌクレオチド分子、または粒子を指す。ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを含む。一実施態様では、ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳類細胞ウイルスベクター、または他のベクターを含む。別の実施態様では、ベクターは、ナノ粒子を含む。用語「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」または「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」は、一般に、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたウイルス核酸（すなわち、ベクターゲノム）を含む。本発明に係るウイルスベクターは、限定されないが、本発明に係るキメラＡＡＶキャプシドを含み、ＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムまたはウイルス核酸を含む任意の他の核酸をパッケージすることができる。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」（および同様の用語）は、ビリオンの不存在下のベクターゲノム（例えば、ｖＤＮＡ）を指すために用いられてよく、および／または、キャプシドに繋がれたまたはキャプシド内にパッケージされた分子を送達するためのトランスポーターとして作用するウイルスキャプシドを指すために用いられてよい。用語「非ウイルスベクター」は、ウイルスエレメントを含まないベクター、プラスミド、構築物、分子、または粒子を指す。非ウイルス粒子は、一部の実施態様では、細菌プラスミド、酵母プラスミド、組み換えベクター、ナノ粒子、または他のベクターを含む、から本質的になる、またはからなる。一実施態様では、非ウイルス粒子は、ナノ粒子を含む。非ウイルスベクターは、限定されないが、注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、流体力学の送達、または他の物理的または化学的方法を含む様々な方法によって、細胞または対象に送達され得る。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公報ＷＯ ０１／９２５５１に記載される二重のパルボウイルス粒子であってよい（その開示はその全体で参照により本明細書中に援用される）。したがって、一部の実施態様では、二本鎖（二重）ゲノムがパッケージされ得る。
「組み換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、少なくとも１つの逆位末端配列（例えば、１つ、２つ、または３つの逆位末端配列）および１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを産生するためにシスで１４５塩基の末端反復（単数または複数）（ＴＲ（単数または複数））を保持するが；部分的または完全に合成の配列を含む非ＡＡＶ ＴＲおよび改変型ＡＡＶ ＴＲも、この目的を果たすことができる。全ての他のウイルス配列は不必要であり、トランスで供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。ｒＡＡＶベクターは、２つのＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含んでもよく、それは一般に、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の５’および３’末端にあるが、それに隣接している必要はない。ＴＲは、同一または互いに異なってよい。ベクターゲノムは、その３’または５’末端に単一のＩＴＲを含んでもよい。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成して逆位末端配列として機能する（すなわち、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであってよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）のもののような非ＡＡＶ ＴＲ配列、または、ＳＶ４０複製起点として作用するＳＶ４０ヘアピンが、ＴＲとして用いられ得て、それは、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変され得る。さらに、ＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載の「ダブル−Ｄ配列」のように、部分的または完全に合成であってよい。
パルボウイルスゲノムは、それらの５’および３’末の両方に回文配列を有する。配列の回文性質は、相補塩基対の間の水素結合の形成によって安定化されるヘアピン構造の形成をもたらす。このヘアピン構造は、「Ｙ」または「Ｔ」形状を採用すると考えられる。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１を含む任意のＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ（例えば、表１を参照）由来であってよい。一部の実施態様では、末端反復が、例えば複製、ウイルスパッケージング、インテグレーション、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する場合は、ＡＡＶ末端反復は、ネイティブの末端反復配列を有さない（例えば、ネイティブのＡＡＶ ＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。別の実施態様では、ＡＡＶ末端反復は、ネイティブの末端反復配列を有する。
用語「ｒＡＡＶ粒子」および「ｒＡＡＶビリオン」は、ここでは相互交換可能に用いられる。「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたｒＡＡＶベクターゲノムを含む。
本発明のウイルスベクターは、さらに、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた向性を有する）および／または国際特許公報ＷＯ ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載される「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＩＴＲおよびウイルスキャプシドは、異なるパルボウイルス由来である）であってよい。
さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムのエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含んでよい。
本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、任意の天然起源アミノ酸、それらの改変された形態、および合成アミノ酸を包含する。
天然起源の、左旋性（Ｌ−）アミノ酸を表２に示す。
あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基であってよく（非限定的な例を表３に示す）、または、翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）によって改変されたアミノ酸であってよい。
さらに、非天然起源アミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５−４９によって説明される「非天然」アミノ酸であってよい。これらの非天然アミノ酸は、目的分子をＡＡＶキャプシドタンパク質に化学的に結合するために有利に用いられ得る。
用語「テンプレート」または「基質」は、本明細書において、パルボウイルスのウイルスＤＮＡを生産するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために用いられる。ベクター生産の目的のために、テンプレートは、典型的に、制限されないが、プラスミド、ネイキッドＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクターなど）を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれる。あるいは、テンプレートは、パッケージング細胞の染色体内に安定的に組み込まれ得る。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するパルボウイルスまたはＡＡＶの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルスおよびＡＡＶの複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。
「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルスまたはＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関しては、Ｒｅｐコード配列は、４つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の全てをコードする必要はなく、実際に、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な、少なくとも複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、または、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。
本明細書において用いられる用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３を含む任意のパルボウイルスまたはＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更され得る。
当業者は、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに理解する。例えば、ＭＶＭに関しては、ＮＳ−１およびＮＳ−２タンパク質（スプライス変異である）は、互いに独立に発現され得る。同様に、ＡＡＶに関しては、ｐ１９プロモーターは不活化され得て、大きなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は１つのポリヌクレオチドから発現され得て、小さなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現することがより便利である。一部のシステムでは、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は、細胞によって認識されなくてよく、したがって、別個の発現カセットから大きなおよび小さなＲｅｐタンパク質を発現する必要がある。他の例では、大きなＲｅｐおよび小さなＲｅｐタンパク質を、別個に、すなわち、別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現することが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きな方の比を低減させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合は、細胞に対する毒性を避けるために、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方調節することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５を参照）。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能性パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする（すなわち、ＤＮＡをパッケージして標的細胞を感染することができる）。典型的に、ｃａｐコード配列は、パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。
自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に説明される。
特質を「実質的に保持する」によって、特質（例えば、活性または他の測定可能な特徴）の少なくとも約７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％が保持されることを意味する。
ＣＬＮ１発現カセットおよびベクター
本発明は、ＣＬＮ１遺伝子によってコードされる酵素であるパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）の最大の発現を提供するＣＬＮ１発現カセットの設計、および、対象において治療的レベルのＰＰＴ１を達成するための発現カセットの使用に関する。
したがって、本発明の一態様は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１（ＰＰＴ１）ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに関し、ここで、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列（またはその相補）またはそれと少なくとも約９０％同一の配列、またはその相補を含むヌクレオチド配列を含む。別の実施態様では、ヌクレオチド配列は、ＰＰＴ１ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする。ＰＰＴ１ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋに見ることができ、限定されないが、アクセションナンバーＮＰ＿０７１９４７．１、ＮＰ＿７７６５７９．１、ＮＰ＿０３２９４３．２、ＡＡＭ４９６１３．１、およびＡＡＨ０８４２６．１を含む。別の実施態様では、ヌクレオチド配列は、細胞での発現に関してコドン最適化されている。細胞は、制限されないが、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、イヌ細胞、または任意の哺乳類または植物細胞を含む。一実施態様では、細胞は、ヒト細胞である。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒト、ラット、マウス、ウシ、または任意の他の種のＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレームは、ＰＰＴ１をコードするＣＬＮ１遺伝子の部分である。
一部の実施態様では、コドン最適化ＣＬＮ１オープンリーディングフレームは、配列番号１のヌクレオチド配列、または、それと少なくとも約７０％同一、例えば、それと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
配列番号１：ヒトコドン最適化ＣＬＮ１オープンリーディングフレーム（加えられたストップコドンは下線が引かれている）
ＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＧＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＧＣＡＣＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＣＴＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＡＡＴＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＡＡＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＡＣＣＣＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＴＡＴＡＡＴＧＣＴＡＴＧＧＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＣＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＣＡＡＣＧＣＴＧＣＣＣＴＡＧＣＣＣＡＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＴＣＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＧＧＣＧＴＧＴＴＣＧＧＡＣＴＴＣＣＣＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＧＧＧＡＡＴＣＣＴＣＴＣＡＴＡＴＣＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＡＧＧＴＣＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＧＣＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＣＡＣＧＡＴＣＣＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＧＡＣＡＴＴＡＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴＡＡＣＧＡＡＴＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴＡＡＣＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＴＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＡＴＧＧＴＴＣＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＡＣＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＧＣＴＴＡＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＣＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＧＡＡＧＡＧＴＧＧＴＴＣＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＣＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡ
本発明の別の態様は、ＰＰＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む発現カセットに関する。一実施態様では、ポリヌクレオチドは、任意の種のＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含む。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトコドン最適化配列、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約７０％同一、例えば、それと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含むポリヌクレオチドである。
発現カセット内のポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの発現を高め得る１つまたは複数の発現エレメントに動作可能に連結され得る。一実施態様では、発現カセット内のＣＬＮ１ポリヌクレオチドは、ＣＬＮ１の発現を高め得る１つまたは複数の発現エレメントに動作可能に連結される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター、例えば、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる、プロモーターに動作可能に連結される。一部の実施態様では、プロモーターは、例えば、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる、ニワトリβ−アクチンエクソン１およびイントロン１をさらに含む。
配列番号２：ニワトリβ−アクチンプロモーター
ＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧ
配列番号３：ニワトリβ−アクチンエクソン１およびイントロン１
ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＧＧＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＴＧＴＡＡＴＴＡＧＣ
一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、エンハンサー、例えば、サイトメガロウイルスエンハンサー、例えば、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなるエンハンサーに、動作可能に連結される。
配列番号４：サイトメガロウイルスエンハンサー
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一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、イントロン、例えば、複合型／改変型ＭＶＭイントロン、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなるイントロンに、動作可能に連結される。イントロンは、発現を高めるのに効果的な、発現カセットの任意の部分、例えば、ＯＲＦの前、ＯＲＦ内、またはＯＲＦとポリアデニル化部位との間に位置してよい。
配列番号５：複合型／改変型ＭＶＭイントロン
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一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ポリアデニル化シグナル、例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、例えば、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなるポリアデニル化シグナルに、動作可能に連結される。
配列番号６：ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル
ＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴ
当業者は、所望のレベルおよび組織特異的な発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが用いられ得ることをさらに理解する。本明細書において用いられる用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、プロモーターに動作可能に連結されている核酸配列（例えば、遺伝子）の転写を開始するＤＮＡ領域を示す。プロモーターは、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターであってよい。ウイルスプロモーターは、制限されないが、ｐＣＭＶ、ＳＶ４０、ＭＭＴＶプロモーターを含む。非ウイルスプロモーターは、制限されないが、ＵｂＣ、ＥＦ、またはＰＧＫプロモーターを含む。用語「エンハンサー」は、シス作用の転写調節エレメントを指す。一実施態様では、エンハンサーは、遺伝子発現の全体的な調節の一態様を与える。別の実施態様では、エンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質に結合し、および／または、ＤＮＡトポロジーに影響して、ＤＮＡテンプレートに対するＲＮＡポリメラーゼのアクセスを選択的に許可または制限する、または転写開始部位における二重らせんの選択的開放を促進する、局所構造を生じさせる。エンハンサーの非限定のリストは、ｅｎｈａｎｃｅｒ．ｌｂｌ．ｇｏｖ／？において利用可能なＶＩＳＴＡ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｂｒｏｗｓｅｒに見ることができる。用語「イントロン」は、遺伝子座と関連する５’および３’非翻訳領域とともに、エクソンの間の非翻訳ＤＮＡ配列を指す。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて構成的または誘導性であってよい。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来によって、転写開始領域は、転写開始領域が導入される野生型宿主内に見られないことが意図される。
プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象に対してネイティブおよび／または異種核酸配列に対してネイティブであってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（単数または複数）において機能するように選択される。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンスエレメントは、構成的または誘導性であってよい。
誘導性の発現制御エレメントは、異種核酸配列（単数または複数）の発現に対して制御を提供するのが望ましい適用において一般に用いられる。遺伝子送達に関する誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または組織好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋を含む）、神経組織特異的または好適（脳特異的を含む）、眼（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または好適、骨髄特異的または好適、膵臓特異的または好適、脾臓特異的または好適、および肺特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、および、メタロチオネインプロモーターを含む。
ＣＬＮ１ ＯＲＦが転写されて、それから標的細胞内で翻訳される実施態様において、特異的な開始シグナルは、一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために用いられる。これらの外因性の翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な起源であってよい。
特定の実施態様では、発現カセットは、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）、例えば、２つのＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。２つのＩＴＲは、同一のヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有してよい。ＡＡＶ ＩＴＲは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ２由来であってよい。それぞれのＩＴＲは、独立に、野生型配列または改変型配列であってよい。一部の実施態様では、発現カセットは、ＡＡＶゲノム、例えば、自己相補ＡＡＶゲノムである。
特定の実施態様では、発現カセットは、ＰＰＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを含む。一実施態様では、発現カセットは、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、および、プロモーター、エクソン、イントロン、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルの１つまたは複数の任意の組み合わせを含む。特定の実施態様では、発現カセットは、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチド、および、プロモーター、エクソン、イントロン、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルの１つまたは複数の任意の組み合わせを含む。特定の実施態様では、発現カセットは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を、場合により挙げられた順番で含む。特定の実施態様では、発現カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを、場合により挙げられた順番で含む。特定の実施態様では、発現カセットは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、複合型／改変型ＭＶＭイントロン、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を、場合により挙げられた順番で含む。特定の実施態様では、発現カセットは、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、複合型／改変型ＭＶＭイントロン、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位、および野生型ＡＡＶ ＩＴＲを、場合により挙げられた順番で含む。
一部の実施態様では、発現カセットは、配列番号７のヌクレオチド配列または、それと少なくとも約７０％同一、例えば、それと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
配列番号７：ＣＬＮ１発現カセット
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本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターに関する。適切なベクターは、限定されないが、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルス、またはバキュロウイルスベクター）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。例えば、核酸は、５’および／または３’末端反復（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復）を含むＡＡＶベクターを含んでよい、からなってよい、またはから本質的になったよい。
一部の実施態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ９であってよい。一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含んでよい。他の実施態様では、ＡＡＶベクターは、野生型キャプシドタンパク質と比較して変更された向性を有する改変型キャプシドタンパク質、例えば、肝臓脱標的化されたまたは神経系細胞に関して高い向性を有する改変型キャプシドタンパク質を含んでよい。神経系細胞向性を有する改変型キャプシドタンパク質の例は、制限されずに、米国特許第９，６３６，３７０号（例えば、カラム４８，５４〜６５行目；表２）および国際公報番号ＷＯ ２０１６／０８１８１１（例えば、段落［０１４４］および［０２８７］）を含み、両方ともそれらの全体で本明細書中に参照により援用される。
一部の実施態様では、ベクターは、自己相補または二重ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。ｓｃＡＡＶベクターは、国際特許公報ＷＯ ０１／９２５５１に記載される（その開示は、その全体で参照により本明細書中に援用される）。ＣＬＮ１ ＯＲＦを発現するためのｓｃＡＡＶの使用は、形質導入される細胞の数、形質導入された細胞あたりのコピー数、または両方の増大を提供し得る。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターを含む、形質転換された細胞に関する。一部の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、細胞ゲノム中に安定して組み込まれる。形質転換された細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ細胞であってよい。一部の実施態様では、形質転換された細胞は、以下に説明されるようにＡＡＶベクターの生産に適切な細胞である。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、ポリペプチド、および／または形質転換された細胞を含む、トランスジェニック動物に関する。一部の実施態様では、トランスジェニック動物は、マウス ラット、イヌ、またはサルのような実験動物である。一部の実施態様では、動物は、疾患のモデルである。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞を、以下に記載されるように薬学的に許容できる担体中に含む医薬製剤に関する。
ウイルスベクターを生産する方法
本発明は、ウイルスベクターを生産する方法をさらに提供する。１つの特定の実施態様では、本発明は、組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法を提供し、ＡＡＶ複製を許容する細胞に：（ａ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットおよび（ｉｉ）ＩＴＲを含む組み換えＡＡＶテンプレート；（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチドを；組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み；それにより、細胞において組み換えＡＡＶ粒子が生産される。組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、ＡＡＶテンプレートの複製およびＡＡＶキャプシド中へのキャプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）、および、アデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、それは、本発明のポリヌクレオチドに対して５’および３’に位置するが、それに直接的に隣接する必要はない。
一部の実施態様では、組み換えＡＡＶテンプレートは、Ｒｅｐによって分解されないＩＴＲを含み、国際特許公報ＷＯ ０１／９２５５１において記載される二重のＡＡＶベクターを作る。
ＡＡＶテンプレートおよびＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたＡＡＶテンプレートを含むウイルスベクターが細胞において生産されるような条件下で提供される。当該方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含んでよい。ウイルスベクターは、培地から、および／または、細胞を溶解させることによって、回収され得る。
細胞は、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞であってよい。当技術分野で知られている任意の適切な細胞が用いられ得る。特定の実施態様では、細胞は、哺乳類の細胞（例えば、霊長類またはヒト細胞）である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を与えるトランス補完パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞であってよい。
ＡＡＶ複製およびキャプシド配列は、当技術分野で知られている任意の方法によって提供され得る。現行のプロトコルは、典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を単一のプラスミド上に発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に与えられる必要はないが、そうすることが便利であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。また、ＥＢＶベクターを用いてＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現してもよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであり、さらに、継続的な細胞分裂にわたって高いコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と指定される染色体外エレメントとして細胞内に安定して組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。
さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定的に組み込まれ得る。
典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐために、ＴＲによって隣接されない。
ＡＡＶテンプレートは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失されたアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。別の説明として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５は、ＡＡＶ ＴＲによって隣接されたレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載する。ＥＢＶベクターは、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述のように、テンプレートを送達するために用いられてもよい。
別の代表的な実施態様では、ＡＡＶテンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに他の実施態様では、ＡＡＶテンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定的に組み込まれる。
ウイルス力価を高めるために、生産的なＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で知られている。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、および、米国特許第６，０４０，１８３号および第６，０９３，５７０号によって説明されるように、効率的なＡＡＶ生産を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、提供され得る
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に埋め込まれた、または、安定した染色体外エレメントとして維持された、ヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージングされ得ず、例えば、ＩＴＲによって隣接されない。
当業者は、ＡＡＶ複製およびキャプシド配列およびヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を、単一のヘルパー構築物上に提供することが有利であり得ることを理解する。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であってよい。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであってよい。
１つの特定の実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、ＡＡＶテンプレートをさらに含んでよい。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入され得る。
さらなる実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施態様によれば、ＡＡＶテンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供され得る。
別の例示的な実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供されて、ＡＡＶテンプレートは、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。あるいは、ＡＡＶテンプレートは、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。
さらなる例示的な実施態様では、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ＡＡＶテンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ＡＡＶテンプレートは、ＡＡＶ粒子または第二の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。
前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’ｃｉｓ配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合は、ＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス主鎖に埋め込まれて、これらの配列がアデノウイルスキャプシド内にパッケージされ得るように、５’および３’ｃｉｓ配列によって隣接される。上述のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列がＡＡＶビリオン内にパッケージされないように、一般に、ＩＴＲによって隣接されない。
Ｚｈａｎｇら（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４−１２）は、アデノウイルスおよびＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含む、キメラヘルパーを記載する。
また、ヘルペスウイルスが、ＡＡＶパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして用いられてもよい。ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質（単数または複数）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなＡＡＶベクター生産スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ−２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現しているハイブリッド単純ヘルペスウイルスタイプＩ（ＨＳＶ−１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９８６およびＷＯ ００／１７３７７。
さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５−４３によって説明されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶテンプレートを送達するために、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞内に生産され得る。
ヘルパーウイルスの汚染がないＡＡＶベクターストックは、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。また、ＡＡＶは、ヘパリン基質に関する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから区別され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。いかなる汚染ヘルパーウイルスも複製能力がないように、欠失された複製欠損ヘルパーウイルスが用いられ得る。さらなる代替として、アデノウイルス初期遺伝子発現のみがＡＡＶのパッケージングを仲介するのに必要とされるので、後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルスヘルパーが用いられ得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス突然変異体は、当技術分野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス突然変異体）。
ＣＬＮ１ベクターを用いる方法
また、本発明は、ＰＰＴ１の生産を増大させるため、例えば、治療的または研究目的のために、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで、ＣＬＮ１ ＯＲＦを細胞または対象に送達するための方法にも関する。したがって、本発明の一態様は、細胞において、ＰＰＴ１ポリペプチドまたはＣＬＮ１オープンリーディングフレームを発現する方法に関し、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／または、ベクターと細胞を接触させるステップを含み、それにより、細胞において、ＰＰＴ１ポリペプチドまたはＣＬＮ１オープンリーディングフレームを発現する。一部の実施態様では、細胞は、インビトロ細胞、エクスビボ細胞、またはインビボ細胞である。
本発明の別の態様は、対象において、ＰＰＴ１ポリペプチドまたはＣＬＮ１オープンリーディングフレームを発現する方法に関し、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞を対象に送達するステップを含み、それにより、対象においてＰＰＴ１ポリペプチドまたはＣＬＮ１オープンリーディングフレームを発現する。一部の実施態様では、対象は、神経セロイドリポフスチン沈着症または異常なＣＬＮ１遺伝子発現と関連する他の障害の動物モデルである。
本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象において、ＣＬＮ１遺伝子の異常な発現またはＣＬＮ１遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する方法に関し、治療的に有効量の本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞を対象に送達するステップを含み、それにより、対象において、ＣＬＮ１遺伝子の異常な発現と関連する障害を治療する。一部の実施態様では、ＣＬＮ１遺伝子の発現と関連する障害は、小児性神経セロイドリポフスチン沈着症、または、制限されないが、遅発型小児性、若年性、または成人発症性神経セロイドリポフスチン沈着症を含む、神経セロイドリポフスチン沈着症のさらに遅い発症形態である。
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞は、対象の神経系に、例えば対象の神経系に直接送達される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞は、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内、または眼周囲送達、またはそれらの任意の組み合わせによって送達される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞は、静脈内に送達される。別の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、および／または、ベクターは、注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、流体力学の送達、または他の物理的または化学的方法によって送達される。
本発明に係る組み換えウイルスベクターは、獣医および臨床適用の両方での使用を見つける。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、霊長類非ヒト霊長類（例えば、サルおよびヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスターなど）等を含む。ヒト対象は、新生児、小児、青年、および成人を含む。例えば、対象が本明細書に記載されるものを含む障害を有する、またはそのリスクがあると考えられる、または、本明細書に記載されるものを含むポリヌクレオチドの送達によって恩恵を受けるため、任意選択で、対象は、本発明の方法を「必要とする」。さらなる選択肢として、対象は、実験動物および／または疾患の動物モデルであってよい。
特定の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、それを必要とする対象に、対象の人生においてできるだけ早く、例えば、対象が異常なＣＬＮ１発現および／または異常なＰＰＴ１活性を有すると診断されたらすぐに、投与される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、新生の対象に、例えば、新生スクリーニングが異常なＣＬＮ１発現および／または異常なＰＰＴ１活性を同定した後に投与される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、子宮内の胎児に、例えば、出生前スクリーニングが異常なＣＬＮ１発現および／または異常なＰＰＴ１活性を同定した後に投与される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、対象が、異常なＣＬＮ１発現および／または異常なＰＰＴ１活性と関連する症候を発症したらすぐに、または、異常なＣＬＮ１発現および／または異常なＰＰＴ１活性を有する疑いがあるまたはそのように診断されたらすぐに、対象に投与される。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、対象が異常なＣＬＮ１発現および／または異常なＰＰＴ１活性と関連する症候を発症する前に対象に、例えば、異常なＣＬＮ１発現および／または異常なＰＰＴ１活性を有する疑いがあるまたはそのように診断されたが症候を示し始めていない対象に、投与される。
特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体、任意選択で、他の薬用剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などの中に、本発明のウイルスベクターを含む、医薬組成物または医薬製剤を提供する。注入については、担体は、典型的に液体である。投与の他の方法については、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与については、担体は呼吸に適していて、好ましくは固体または液体の微粒子形態である。
「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。
本発明の一態様は、ＰＰＴ１ポリペプチドまたはＣＬＮ１ ＯＲＦをコードするポリヌクレオチドを、細胞にインビトロで移行する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入方法に従って適切な感染多重度で細胞に導入され得る。投与するウイルスベクターまたはキャプシドの力価は、標的細胞のタイプおよび数、および、特定のウイルスベクターまたはキャプシドに応じて変化し得て、過度の実験を伴わずに当業者によって決定され得る。特定の実施態様では、少なくとも約１０３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０５感染単位が細胞に導入される。
ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）が導入され得る細胞（単数または複数）は、制限されないが、神経系細胞（末梢および中枢神経系の細胞、具体的には、脳細胞、例えば、ニューロン、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、星状細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、消化管および呼吸性上皮細胞）、骨格筋細胞（筋芽細胞、筋管および筋線維を含む）、横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、消化管の細胞（平滑筋細胞、上皮細胞を含む）、心細胞（心筋細胞を含む）、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞（例えば、軟骨、半月板、滑膜および骨髄を含む）、生殖細胞などを含む、任意のタイプであってよい。あるいは、細胞は、任意の前駆細胞であってよい。さらなる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であってよい。さらに、さらなる代替として、細胞は、癌または腫瘍細胞であってよい（癌および腫瘍は上述される）。さらに、細胞は、上述の任意の種起源由来であってよい。
ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は対象から取り出されていて、ベクターがその中に導入されて、それから、細胞は対象内に元に置かれる。エクスビボでの処置のために対象から細胞を取り出してその後に元の対象に導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組み換えウイルスベクターは、別の対象から細胞内に、培養細胞内に、または、細胞内に、任意の他の適切な由来から導入されて、細胞は、それを必要とする対象に投与される。
エクスビボでの遺伝子治療に適切な細胞は、上述されるとおりである。対象へ投与する細胞の用量は、対象の年齢、症状および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって変化する。典型的に、少なくとも約１０２〜約１０８または約１０３〜約１０６細胞が、薬学的に許容できる担体において投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、調剤担体と組み合わせて有効量で対象に投与される。
本発明のさらなる態様は、本発明のウイルスベクターを対象に投与する方法である。特定の実施態様では、方法は、ＰＰＴ１ポリペプチドまたはそのフラグメントまたはＣＬＮ１ ＯＲＦをコードするポリヌクレオチドを、動物対象に送達する方法を含み、その方法は、本発明に係る有効量のウイルスベクターを動物対象に投与するステップを含む。それを必要とするヒト対象または動物への本発明のウイルスベクターの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によってよい。場合により、ウイルスベクターは、薬学的に許容できる担体において、効果的な投与量で送達される。
対象に投与されるウイルスベクターの用量は、投与モード、治療される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および、送達される核酸に依存して、日常的な様式で決定され得る。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、または１０１８の形質導入単位またはそれよりも多く、例えば、約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、または１０１６形質導入単位、例えば、約１０１２〜約１０１４形質導入単位のウイルス力価である。
特定の実施態様では、１回を超える投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多い投与）が、例えば、時間、日、週、月、年などの様々な間隔の期間にわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成するために用いられ得る。それぞれの投与は、同一または異なる経路によるものであってよく、例えば、１時間あけた２回の投与が、異なる経路によるものであってよい。
例示的な投与モードは、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および気道表面（粘膜表面を含む）の両方に、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳へ）を含む。投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節の中または付近）に対するものであってもよい。任意の所定の場合における最も適切な投与は、治療される状態の性質および重症度、および、用いられる特定のベクターの性質に依存する。
一部の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、または両方に投与される。
一部の実施態様では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、例えば、脳または脊髄に、直接投与される。直接投与は、ＣＮＳ細胞の形質導入の高い特異性をもたらし得て、例えば、ここで、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多くの形質導入細胞は、ＣＮＳ細胞である。ＣＮＳに直接的にベクターを投与する当技術分野で知られている任意の方法が用いられ得る。ベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、大脳、以下を含む、後頭、側頭、頭頂および前頭葉、皮質、基底核、海馬および扁桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘に導入され得る。また、ベクターは、網膜、角膜または視神経のような、眼の異なる領域に投与されてもよい。ベクターは、ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液の中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達され得る。
送達ベクターは、制限されないが、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達またはそれらの任意の組み合わせを含む、当技術分野で知られている任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域（単数または複数）に投与され得る。
送達ベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、および／または他の組織を含む組織の、より広範囲で、びまん性の形質導入を生産する様式で投与され得る。
典型的に、ウイルスベクターは、ＣＮＳおよび／または他の組織内の所望の領域または区画へ直接注入（例えば、定位的注入）によって、液体製剤において投与される。一部の実施態様では、ベクターは、リザーバーおよび／またはポンプを介して送達され得る。他の実施態様では、ベクターは、局所適用によって所望の領域へ、またはエアロゾル製剤の経鼻内投与によって提供され得る。眼または耳への投与は、液滴の局所適用によるものであってよい。さらなる代替として、ベクターは、固体の徐放製剤として投与され得る。パルボウイルスおよびＡＡＶベクターの制御放出は、国際特許公報ＷＯ ０１／９１８０３によって説明される。
注入剤は、液体の溶液または懸濁液のいずれかの従来の形態で、注入前に液体中の溶液または懸濁液に適切な固形形態で、またはエマルションとして、調製することができる。あるいは、全身性の様式よりむしろ局所に、例えば、デポーまたは徐放性製剤で、ウイルスベクターを投与し得る。さらに、ウイルスベクターは、外科的に埋め込み可能なマトリックス、例えば、骨補填材、縫合、ステントなど（例えば、米国特許第７，２０１，８９８に記載）に送達して乾燥させることができる。
用語「医薬組成物」は、制限されないが、錠剤、コーティング錠、粉末、再構成用粉末、ペレット、ビーズ、ミニ錠剤、多層錠剤、二層錠剤、錠剤イン錠剤、丸薬、マイクロペレット、小錠剤ユニット、ＭＵＰＳ（多ユニットペレット系）、崩壊性錠剤、分散性錠剤、顆粒、マイクロスフェア、多微粒子、カプセル（粉末、再構成用粉末、ペレット、ビーズ、ミニ錠剤、丸薬、マイクロペレット、小錠剤ユニット、ＭＵＰＳ、経口崩壊性ＭＵＰＳ、崩壊性錠剤、分散性錠剤、顆粒、スプリンクル、マイクロスフェアおよび多微粒子が充填される）、サシェ（粉末、再構成用粉末、ペレット、ビーズ、ミニ錠剤、丸薬、マイクロペレット、小錠剤ユニット、ＭＵＰＳ、崩壊性錠剤、分散性錠剤、改変された放出錠剤またはカプセル、発泡性顆粒、顆粒、スプリンクル、マイクロスフェアおよび多微粒子が充填される）、またはスプリンクルを含む、任意の剤形を指す。経口投与に適切な医薬組成物は、カプセル、カシェ剤、トローチ、または錠剤のような別々のユニットにおいて提供され得て、それぞれ、粉末または顆粒として；水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として；または水中油または油中水エマルションとして、所定の量の本発明の組成物を含む。経口送達は、本発明のウイルスベクターを動物の消化管における消化酵素による分解に耐えることができる担体に複合することによって行なわれる。そのような担体の例は、当技術分野で知られているプラスチックカプセルまたは錠剤を含む。そのような製剤は、組成物および適切な担体（上記の１つまたは複数のアクセサリ成分を含んでよい）に関連性をもたらすステップを含む、任意の適切な薬学の方法によって調製される。一般に、本発明の実施態様に係る医薬組成物は、液体または細かく分割された固体担体、または両方と、組成物を均一かつ密に混合して、それから、必要ならば、生じた混合物を成形することによって調製される。例えば、錠剤は、１つまたは複数のアクセサリ成分を伴ってもよい組成物を含む粉末または顆粒を、圧縮または成形することによって調製され得る。圧縮された錠剤は、適切な機械において、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または表面活性／分散剤（単数または複数）と混合されていてもよい粉末または顆粒のようなさらさらした形態の組成物を圧縮することによって調製される。成形錠剤は、適切な機械において、不活性の液体結合剤によって湿潤化された粉末状の化合物を成形することによって作製される。一実施態様では、医薬組成物は、治療的に有効量の活性の製剤成分を含む混合物または溶液を指す医薬製剤を含む。活性の製剤成分は、限定されないが、化学物質、ポリペプチド、ヌクレオチド、抗体、または脂質を含む。
口腔（舌下の）投与に適切な医薬組成物は、風味付けられたベース、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント内に、本発明の組成物を含むトローチ；および、不活性ベース、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア内に、組成物を含む菱形錠剤を含む。
非経口投与に適切な医薬組成物は、本発明の組成物の滅菌された水性および非水性の注入溶液を含んでよく、その製剤は、任意選択で、意図されるレシピエントの血液と等張である。これらの製剤は、意図されるレシピエントの血液と等張の組成物を与える、抗酸化剤、バッファー、静菌薬および溶質を含んでよい。水性および非水性の滅菌された懸濁液、溶液およびエマルションは、懸濁剤および増粘剤を含んでよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油類、例えば、オリーブ油、および注入可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝された媒体を含む。非経口ビヒクルは、食塩水、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンガー、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補液、電解質補液（例えば、リンガーブドウ糖に基づくもの）などを含む。防腐剤、および、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような他の添加剤も存在してよい。
組成物は、単位／投与または複数回投与の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中に存在してよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば、生理食塩水または注入用の水を添加することのみ必要な、凍結−乾燥（凍結乾燥）された状態で保管することができる。
即席の注入溶液および懸濁液は、前述した種類の滅菌された粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。例えば、密封された容器中の単位投与形態での本発明の注入可能な安定の滅菌組成物が提供され得る。組成物は、凍結乾燥物の形態で提供することができ、適切な薬学的に許容できる担体を用いて再構成して、対象への注入に適切な液体組成物を形成することができる。単位投与形態は、約１μｇ〜約１０ｇの本発明の組成物であってよい。組成物が実質的に水に不溶性である場合は、生理的に許容できる十分な量の乳化剤を、水性担体中で組成物を乳化するのに十分な量で含んでよい。そのような有用な乳化剤の１つは、ホスファチジルコリンである。
直腸投与に適切な医薬組成物は、単位用量坐薬として提供され得る。これらは、組成物を、１つまたは複数の従来の固形担体、例えばココアバターなどと混合して、それから、生じた混合物を成形することにより調製することができる。
皮膚への局所適用に適切な本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェル、スプレー、エアロゾル、または油の形態をとり得る。使用することのできる担体は、限定されないが、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール類、アルコール類、経皮エンハンサー、およびそれらの２以上の組み合わせを含む。一部の実施態様では、例えば、局所送達は、本発明の医薬組成物を、皮膚の中へ浸透することが可能な、脂溶性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することにより行なうことができる。
経皮投与に適切な医薬組成物は、長期間にわたり対象の表皮との密接な接触を維持するように適合された個別のパッチの形態であってよい。また、経皮投与に適切な組成物は、イオン導入によって送達することもでき（例えば、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照）、典型的に、緩衝されていてもよい本発明の組成物の水溶液の形態をとる。適切な製剤は、シトレートまたはｂｉｓ＼ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含んでよく、０．１〜０．２Ｍの活性成分を含んでよい。
本明細書に開示されるウイルスベクターは、任意の適切な手段によって、例えば、対象が吸入するウイルスベクターからなる呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を投与することにより、対象の肺に投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であってよい。ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、任意の適切な手段によって、例えば、当業者に公知の圧力駆動式のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いて、生産され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照。ウイルスベクターを含む固形粒子のエアロゾルは、同様に、調剤分野で公知の技術によって、任意の固形微粒子薬物エアロゾル発生器を用いて生産され得る。
本発明を説明したが、同じことが、以下の実施例においてより詳細に説明され、それは、例示目的のみのために本明細書に含められ、本発明に対する限定を意図しない。
実施例１
最適化されたＣＬＮ１を含むＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターゲノムカセットは、ＣＬＮ１ ＯＲＦを発現するように開発された。このカセットは、多重ＡＡＶキャプシド内にパッケージされる自己相補ＡＡＶゲノムから最大の発現を提供するように設計された。カセットは、順番に、突然変異ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、複合型／改変型ＭＶＭイントロン、コドン最適化ヒトＣＬＮ１ ＯＲＦ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位、および野生型（ＷＴ）ＡＡＶ２ ＩＴＲからなる（図１）。発現カセットをＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトすることによってＣＬＮ１の発現を確認して、発現されたタンパク質をウエスタンブロットによって細胞および培地中で検出した。
ＣＬＮ１発現カセットをＡＡＶ９キャプシド内にパッケージして、生じたベクターを用いて、髄腔内、静脈内、または大槽注入によって、ＣＬＮ１ノックアウトマウスに投与した。野生型ＡＡＶ９キャプシドを髄腔内注入のために用いて、肝臓脱標的化ＡＡＶ９キャプシド（ＡＡＶ９．４７）を静脈内注入のために用いた。ＡＡＶ９ベクターを、７×１０１０、２．２×１０１１、または７×１０１１ベクターゲノムの投与量で髄腔内に、または、出生時には２．８×１０１１ベクターゲノムの投与量で静脈内に投与した。ＡＡＶ９．４７ベクターを、１×１０１２ベクターゲノムの投与量で投与した。ベクターは、出生時、７〜１０日、４週、２０週、または２６週に投与された。結果を全てのコホートについて図２に、異なるコホートについて図３〜６に示す。
これらの試験は、７×１０１０ｖｇのｓｃＡＡＶ９／ＣＬＮ１が髄腔内に投与された場合、マウスの寿命が８ヶ月から１６ヶ月に２倍になることを示した。ベクターは、静脈内に投与された場合、治療的であることも見いだされた。
図７Ａは、ｓｃＡＡＶ９／ＣＬＮ１治療が投与されたマウスにおける血清ＰＰＴ１レベルの増大を示す。ベクターは、４、２０、および２６週齢において、７×１０１０および７×１０１１ｖｇの投与量で、野生型、異種およびＣＬＮ１ノックアウトマウス中に髄腔内注入された。血清ＰＰＴ１レベルを、投与の３ヶ月後または人道的エンドポイントにおいて測定した。超生理学的ＰＰＴ１レベルが全ての時点および用量において観察された。図７Ｂは、７×１０１０および７×１０１１ｖｇの投与量で異なる年齢においてｓｃＡＡＶ９／ＣＬＮ１を投与されたマウスの群に関する生存曲線を示す。両方の投与量において、より早い投与によって生存率は増大した。
行動的分析を、処置されたマウスに対して行なって、ベクター投与後の行動における改善を検出した。
運動協調性に関するテストにおいて、マウス（異なる年齢における、未処置の異種、未処置のノックアウト、低（７×１０１０ｖｇ）、中（２．２×１０１１ｖｇ）、または高投与量（７×１０１１ｖｇ）により処置されたノックアウト）を、最初のスピードを３ｒｐｍにしてロータロッドの上部に置いた。スピードは、３００秒の試験の工程を通して３０ｒｐｍまで次第に増大した。ロッドの上部から落下するまでの待ち時間を測定した。試験は異なる年齢において行なわれた。結果は、図８Ａ（行動試験を＜１歳で開始した）および図８Ｂ（行動試験を＞１歳で開始した）に示される。ＡＡＶベクターを介したＣＬＮ１発現カセットの遺伝子導入は、示される全ての投与量および処置年齢において、ノックアウトマウスに運動能力における何らかの利益を提供し、より高い投与量でのより早期の介入は、最も大きな利益を与えた。
水泳能力および視覚機能の試験において、マウス（異なる年齢における、未処置の異種、未処置のノックアウト、低（７×１０１０ｖｇ）、中（２．２×１０１１ｖｇ）、または高投与量（７×１０１１ｖｇ）により処置されたノックアウト）を、非常に多くの視覚的手がかりのある部屋の中に置かれた４５ｃｍの深さの水で満たされた１２２ｃｍ直径プールからなるモリス水迷路内に置いた。それぞれのマウスは、２〜３日にわたって１日あたり４回の試験を与えられて、水の表面の上に伸長している模様付きシリンダーが手がかりとなるエスケーププラットフォームまで泳いだ。それぞれの試験に関して、マウスは、４つの可能性のある位置のうちの１つにおいてプール内に置かれて（無作為の順番）、それから、視覚的プラットフォームを見つけるために６０秒与えられた。マウスがプラットフォームを見つけた場合は、試験は終了し、動物は、次の試験が開始する前にプラットフォーム上に１０秒留まることが許された。プラットフォームが見つからなかった場合は、マウスは、１０秒間プラットフォーム上に置かれて、それから、次の試験が与えられた。試験は、異なる年齢において行なわれた。水泳速度（図９Ａ〜９Ｂ）、プラットフォームまでの時間（図１０Ａ〜１０Ｂ）、および泳いだ距離（図１１Ａ〜１１Ｂ）を測定した。処置されたノックアウトマウスは、これらのタスクを未処置のコントロールノックアウトマウスよりも良好に行い、より高い投与量でのより早期の介入は、最も大きな利益を与えた。
握力に関する試験において、マウス（異なる年齢における、未処置の異種、未処置のノックアウト、低（７×１０１０ｖｇ）、中（２．２×１０１１ｖｇ）、または高投与量（７×１０１１ｖｇ）により処置されたノックアウト）を、大きい金属ケージの蓋上に置いた。蓋を優しく振って、金属グリッドをマウスが握るのを誘導した。ケージ上部をそれからひっくり返して、マウスが蓋から落下するまでの待ち時間を記録した。最大の試験の長さは６０秒であった。グリップに関するスコアも測定し、ここで、−６＝マウスは、直ちにまたは１５秒以内にマウスが落下する（蓋の上に最初に不安定に置いたことが原因でマウスが落ちた場合は、２回目の試験が与えられる）；−４＝マウスは、前または後足で不器用なグリップ能力を示し、足でワイヤを逃し、ワイヤ上で非常に不安定である（通常、３０秒以内に落下する）；−２＝マウスは、足（ｐａｗ）よりむしろほとんど肢（ｌｉｍｂ）でワイヤを握り、方向転換能力が低く、ワイヤ上で非常に不安定であり；０＝マウスは、正常な、前肢と後肢の両方で良好に協調されたグリップを示し、方向転換能力が良好である。試験は、異なる年齢で行なわれた。落下するまでの時間（図１２Ａ〜１２Ｂ）、および協調性スコア（図１３Ａ〜１３Ｂ）を測定した。処置されたノックアウトマウスは、未処置コントロールノックアウトマウスよりも、これらのタスクを良好に果たして、より高い投与量でのより早期の介入は、最も大きな利益を与えた。
新生児におけるｓｃＡＡＶ９／ＣＬＮ１治療の効果を試験した。異種およびＣＬＮ１ノックアウトマウスに、新生児のときにベクター（２．８×１０１１ｖｇ）を静脈内投与した。生存（図１４Ａ）、血清ＰＰＴ１レベル（図１４Ｂ）、加速ロータロッド能力（図１４Ｃ）、落下までの時間（図１４Ｄ）、協調性スコア（図１４Ｅ）、水泳速度（図１４Ｆ）、プラットフォームまでの時間（図１４Ｇ）、および、泳いだ距離（図１４Ｈ）を、異なる年齢において測定した。これらの試験の結果は、延長された生存を含んで評価された全ての領域において、未処置コントロールノックアウトマウスと比較して、処置されたノックアウトマウスの有意により優れた機能を示す。結果は、超生理学的レベルの血清ＰＰＴ１酵素活性の長期の発現にもかかわらず、評価された任意の測定によって、処置されたヘテロ接合マウスに対していかなる有害な効果も示さない。
前述は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきでない。
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替のみを指すことまたは代替が相互排他的であることが明確に指示されない限り、「および／または」を意味するために用いられるが、開示は、代替のみ、および「および／または」を指す定義を支持する。
本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義されて、特許請求の範囲の等価物はその中に含まれる。

Claims (41)

  1. ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドであって、
    ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列またはその相補は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている、
    ポリヌクレオチド。
  2. 請求項１のポリヌクレオチドであって、
    前記ポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列、または、それに対してまたはその相補に対して少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
    ポリヌクレオチド。
  3. 発現カセットであって、
    ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを含む、
    発現カセット。
  4. 請求項３の発現カセットであって、
    前記ポリヌクレオチドは、請求項１または２のポリヌクレオチドである、
    発現カセット。
  5. 請求項３または４の発現カセットであって、
    前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結されている、
    発現カセット。
  6. 請求項５の発現カセットであって、
    前記プロモーターは、ニワトリβアクチンプロモーターである、
    発現カセット。
  7. 請求項３から６のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記ポリヌクレオチドは、エンハンサーに動作可能に連結されている、
    発現カセット。
  8. 請求項７の発現カセットであって、
    前記エンハンサーは、サイトメガロウイルスエンハンサーである、
    発現カセット。
  9. 請求項３から８のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記ポリヌクレオチドは、イントロンに動作可能に連結されている、
    発現カセット。
  10. 請求項９の発現カセットであって、
    前記イントロンは、複合型／改変型ＭＶＭイントロンである、
    発現カセット。
  11. 請求項３から１０のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記ポリヌクレオチドは、ポリアデニル化シグナルに動作可能に連結されている、
    発現カセット。
  12. 請求項１１の発現カセットであって、
    前記ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、
    発現カセット。
  13. 請求項３から１２のいずれか一項の発現カセットであって、
    少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）をさらに含む、
    発現カセット。
  14. 請求項１３の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、２つのＡＡＶ ＩＴＲを含む、
    発現カセット。
  15. 請求項１４の発現カセットであって、
    前記の２つのＡＡＶ ＩＴＲは、同一のヌクレオチド配列を有する、
    発現カセット。
  16. 請求項１４の発現カセットであって、
    前記の２つのＡＡＶ ＩＴＲは、異なるヌクレオチド配列を有する、
    発現カセット。
  17. 請求項１３から１６のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、
    発現カセット。
  18. 請求項３から１７のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、自己相補ＡＡＶゲノムである、
    発現カセット。
  19. 請求項３から１８のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、および、ポリアデニル化部位を含む、
    発現カセット。
  20. 請求項１９の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲ、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、および、ＡＡＶ ＩＴＲを含む、
    発現カセット。
  21. 請求項３から１８のいずれか一項の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、複合型／改変型ＭＶＭイントロン、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、および、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位を含む、
    発現カセット。
  22. 請求項２１の発現カセットであって、
    前記発現カセットは、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、複合型／改変型ＭＶＭイントロン、ヒトＣＬＮ１オープンリーディングフレーム、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位、および、野生型ＡＡＶ ＩＴＲを含む、
    発現カセット。
  23. 請求項２２の発現カセットであって、
    配列番号７のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一の配列を含む、
    発現カセット。
  24. 請求項１または２のポリヌクレオチドまたは請求項３から１６のいずれか一項の発現カセットを含む、
    ベクター。
  25. 請求項２４のベクターであって、
    前記ベクターは、ウイルスベクターである、
    ベクター。
  26. 請求項２５のベクターであって、
    前記ベクターは、ＡＡＶベクターである、
    ベクター。
  27. 請求項２６のベクターであって、
    前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９ベクターである、
    ベクター。
  28. 請求項２７のベクターであって、
    前記ＡＡＶベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含む、
    ベクター。
  29. 請求項２７のベクターであって、
    前記ＡＡＶベクターは、野生型キャプシドタンパク質と比較して変更された向性を有する改変型キャプシドタンパク質を含む、
    ベクター。
  30. 請求項２９のベクターであって、
    前記改変型キャプシドタンパク質は、肝臓脱標的化されている、
    ベクター。
  31. 形質転換された細胞であって、
    請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、および／または、請求項２４から３０のいずれか一項のベクターを含む、
    形質転換された細胞。
  32. 請求項３１の形質転換された細胞であって、
    前記のポリヌクレオチド、発現カセット、および／または、ベクターは、前記細胞ゲノム中に安定して組み込まれている、
    形質転換された細胞。
  33. 請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から３０のいずれか一項のベクター、および／または、請求項３１または３２の形質転換された細胞を含む、
    トランスジェニック動物。
  34. 請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から３０のいずれか一項のベクター、および／または、請求項３１または３２の形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体中に含む、
    医薬組成物。
  35. 細胞においてＣＬＮ１オープンリーディングフレームを発現する方法であって、
    前記細胞を、請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、および／または、請求項２４から３０のいずれか一項のベクターと接触させるステップを含み、それにより、前記細胞において前記ＣＬＮ１オープンリーディングフレームを発現する、
    方法。
  36. 対象においてＣＬＮ１オープンリーディングフレームを発現する方法であって、
    前記対象に、請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から３０のいずれか一項のベクター、および／または、請求項３１または３２の形質転換された細胞を送達するステップを含み、それにより、前記対象において前記ＣＬＮ１オープンリーディングフレームを発現する、
    方法。
  37. それを必要とする対象においてＣＬＮ１遺伝子の異常な発現またはＣＬＮ１遺伝子産物の異常な活性と関連する障害を治療する方法であって、
    前記対象に、治療的に有効量の請求項１または２のポリヌクレオチド、請求項３から２３のいずれか一項の発現カセット、請求項２４から３０のいずれか一項のベクター、および／または、請求項３１または３２の形質転換された細胞を送達するステップを含み、それにより、前記対象において前記のＣＬＮ１遺伝子の異常な発現と関連する障害を治療する、
    方法。
  38. 請求項３７の方法であって、
    前記のＣＬＮ１遺伝子の発現と関連する障害は、小児性、遅発型小児性、若年性、または成人発症性神経セロイドリポフスチン沈着症である、
    方法。
  39. 請求項３６から３８のいずれか一項の方法であって、
    前記のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞は、前記の対象の神経系に送達される、
    方法。
  40. 請求項３９の方法であって、
    前記のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞は、髄腔内、脳内、心室内、鼻腔内、耳内、眼内、または眼周囲送達、またはそれらの任意の組み合わせによって送達される、
    方法。
  41. 請求項３６から３８のいずれか一項の方法であって、
    前記のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または、形質転換された細胞は、静脈内に送達される、
    方法。
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