JP2019511458A - 組み換えＩｇＧ Ｆｃ多量体 - Google Patents

Abstract

この開示は、組み換えＩｇＧ Ｆｃ多量体並びにこのような多量体を投与することによる自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置方法を提供する。

Description

分野
本開示は、組み換えIgG Fc多量体、並びにこのような多量体を投与することにより自己免疫疾患及び炎症性疾患を処置する方法を提供する。

背景
血漿由来免疫グロブリンG(IgG)は、原発性及び続発性の免疫不全症を処置するために病院において使用される。この場合、IgGは静脈内(IVIG)又は皮下(SCIG)のいずれかに投与される。両方とも10,000より多いドナーの大きな血漿プールから製造され、多様な抗体レパートリーを確実にする。

しかし、高用量のIVIG (1〜2 g/kg/用量)は、免疫性血球減少症（immune cytopenia）(ITP)、ギラン・バレー症候群、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー(CIDP)、重症筋無力症(MG)、及びいくつかの他の希少疾患のような慢性又は急性の自己免疫及び炎症性疾患を有する患者の処置のためにますます使用されてきた。さらに、例えば関節リウマチ(RA)の処置のための、いくつかの他の適応症のためのIVIGの適応外の使用は、現在調査中である。

高用量IVIGの抗炎症効果について多数の作用機序が提案されてきた。これらとしては、Fcγ受容体(FcγR)の遮断、自己抗体クリアランスを増強させる新生児FcR(FcRn)の飽和、阻害性FcγRIIB(CD32B)の上方調節、補体タンパク質フラグメントの除去及び補体フラグメント沈着の阻害、IVIGにおける抗イディオタイプ抗体(Ab)、免疫メディエーター（例えば、サイトカイン)の結合もしくは中和、又は免疫細胞の調節(例えば、制御性T細胞、B細胞又は免疫寛容原性樹状細胞)の誘導が挙げられる。興味深いことに、上述の特性のいくつかは、IgGのFc部分でのみ再現することができた。Fcは、例えばITP、さらには炎症性関節炎のような疾患のいくつかの動物モデルにおいて治療的であると示された。さらに、Fcは急性ITPを有する児童において治療的に活性であることが実証され、FcγRsの重大な関与を示唆した。

いくつかの最近の研究は、組み換えFcタンパク質ベースの治療学の有効性を調べた。特に、FcγRに対する高い結合力を有する多価分子を生じるFcの多量体化が調べられた。

複数の連続連結したFcドメインを含む見込みのあるIVIG置換タンパク質は、特許文献１に記載される。連続Fcドメインは、IgM尾部（tailpiece）にさらに連結されると記載され、そしてJ鎖がFc五量体構造を作るために組み込まれる。しかし、想定された多量体タンパク質の製造又は有効性に関する実施例は提供されていない。

非特許文献１は、IgM尾部に融合されたCH1、CH2、及びCH3 IgGドメインを含むいくつかのIgG多量体構築物を記載する。他の構築物は、１つ又はそれ以上のIgG重鎖ドメインで置換されたIgMドメインを有していた。この研究は、様々な尾部構築物の多量体化に対するJ鎖の影響の決定に焦点を絞っており、そして主にIgG重鎖ドメインを含む構築物はJ鎖を組み込むことなく重合するということを見出した。この研究はまた、IgG FcドメインにおけるL309C残基変化がより高次の多量体、主に六量体を生じるということを示した。

特許文献２及び特許文献３は、５つのアミノ酸ヒンジ領域、IgG1、IgG4、又はIgG1及びIgG4 CH2及びCH3ドメイン由来のFc領域、並びにIgM又はIgA尾部を含むいくつかのFc多量体構築物を開示する。開示は融合ペプチドのFc領域におけるアミノ酸変化の導入によるIgG Fc多量体の安全性及び有効性の改善に関する。好ましい変異は、FcRnへの結合を改善し、Fc融合単量体の多量体化を増加させ、そして補体経路成分C1qへのFc多量体結合を減少させた。Fc多量体はまた、サイトカイン放出及び血小板活性化の刺激を減少させるために変異で操作された。

特許文献４は、IgG1 Fc領域、４アミノ酸リンカー、及びIgM尾部を含むFc多量体構築物を開示し、これは主に六量体構造へと多量体化する。Fc残基309及び310(L309C及びH310L)での変異は、IgMの配列を模倣するために導入された。期待されたとおり、Fab領域の欠失に起因して、変異体Fc六量体はC1qに不十分に結合し、そしてC5b-9末端複合体の検出がないことにより示されるように、補体系を活性することができなかった。開示されたFc多量体は、ITPのマウスモデルにおける血小板数を回復する際に有効であった。

WO 2008/151088 WO 2015/132364 WO 2015/132365 WO 2014/060712

Sorensen et al. (1996) J Immunol 156: 2858-2856

本発明者らは、本発明の最適化された六量体Fc-μTP構築物が、以前に記載されたものに勝るいくつかの利益を有するということを見出した:
・ 驚くべきことに、Fc-μTP及びFc-μTP-L309CはC1qに結合したが、補体タンパク質C2の切断は誘導せず、したがってC3転換酵素は形成されなかった(C4b2a)。
・ Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cは、完全古典経路の活性化を選択的に阻害する。
・ 代替経路との干渉は観察されず、したがってこの補体経路は、感染性疾患に対する防御についてなおインタクトなままである。補体系の全身性遮断は発生しなかった。
・ Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cは、自己抗体媒介疾患、及び／又は補体系の抗体媒介古典的経路活性化が起こる疾患において特に有益であるかもしれない。

要旨
本開示は、２〜６つのIgG Fc融合単量体を含むFc多量体タンパク質を提供する。IgG Fc融合単量体の各々は２つのFc融合ポリペプチド鎖を含み、そして各Fc融合ポリペプチド鎖はIgG Fcポリペプチド及びIgM尾部を含む。好ましい実施態様において、Fc多量体は、６つのIgG Fc融合単量体を含むFc六量体である。

好ましい実施態様において、Fc融合ポリペプチド鎖はIgGヒンジ領域をさらに含み、そしてFc融合ポリペプチド鎖はFabポリペプチドを含まない。

例えば、本発明の一実施態様において、本発明のFc融合ポリペプチド鎖は、IgG1ヒンジ領域、IgG1 Fcドメイン、及びIgM尾部を含み、かつFabポリペプチドを含まない。好ましい実施態様において、Fc融合ポリペプチド鎖は配列番号1であり、そして5つまでの保存的アミノ酸変化を有する。一実施態様において、Fc融合ポリペプチド鎖は配列番号7である。

好ましい実施態様において、Fc融合ポリペプチド鎖は、IgG1ヒンジ領域、IgG1 Fcドメイン、及びIgM尾部を含み、ここでIgG1 Fcドメインは位置309(EU番号づけに従う)においてロイシンの代わりにシステインを有し、そしてFc融合ポリペプチドはFabポリペプチドを含まず、そしてFc融合ポリペプチド鎖は配列番号2である。一実施態様において、Fc融合ポリペプチド鎖は5つまでの保存的アミノ酸変化を有する配列番号2である。一実施態様において、Fc融合ポリペプチド鎖は配列番号8である。

宿主細胞内で合成されたFc融合ポリペプチド鎖は、シグナルペプチド、例えば配列番号4に示される配列を有するシグナルペプチドをさらに含む。しかしシグナルペプチドは分泌の間に切断され、したがって典型的には得られた成熟Fc六量体にはもはや存在しない。

本発明のさらなる実施態様は、Fc融合ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは、ポリヌクレオチドはFc融合ポリペプチド鎖に連結されたシグナルペプチドもコードする。

好ましい実施態様において、Fc六量体は補体成分C1qに結合する。一実施態様において、C1qに結合するFc六量体は、完全古典的補体経路の活性化を誘導する。

好ましい実施態様において、C1qに結合するFc六量体は、補体経路成分C2の大部分の切断を誘導しない。

好ましい実施態様において、Fc六量体はC2の切断を誘導しない。

好ましい実施態様において、C1qに結合するFc六量体は、補体経路成分C3転換酵素の形成を生じない。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、補体経路成分可溶性C5b-9の形成を誘導しない。一実施態様において、全血とともにインキュベートされたFc六量体1 mg/mlは、全血とともにインキュベートされた熱凝集IgGにより誘導された可溶性C5b-9生成と比較して20%未満の可溶性C5b-9生成を誘導する。一実施態様において、全血とともにインキュベートされたFc六量体は、全血とともにインキュベートされた熱凝集IgGにより誘導される可溶性C5b-9生成と比較して10%未満の可溶性C5b-9生成を誘導する。

好ましい実施態様において、Fc六量体はC5b-9生成を阻害する。一実施態様において、Fc六量体は、全血とともにインキュベートされた熱凝集IgGによる可溶性C5b-9生成を阻害する。

好ましい実施態様において、マウス関節炎モデルにおけるFc六量体の投与は、未処置の関節炎マウスと比較した臨床スコア、関節浸潤細胞の数、又は組織学的スコアの減少を誘導する。一実施態様において、マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける6日目のFc六量体200 mg/kgの投与は、未処置の関節炎マウスと比較した、7〜14日目のいずれかにおける臨床スコアの減少; 7〜14日目に計算された平均臨床スコアの減少; 8日目に膝関節から回収されたCD45+細胞の数の減少; 又は8日目又は14日目における足首関節の組織学的スコアの減少を誘導する。好ましい実施態様において、マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける6日目のFc六量体200 mg/kgの投与は、未処置の関節炎マウスと比較した、7〜14日目のいずれかにおける臨床スコアの50%より大きい減少; 7〜14日目に計算された平均臨床スコアの50%より大きい減少; 8日目に膝関節から回収されたCD45+細胞の数の５０％より大きい減少; 又は8日目における足首関節の組織学的スコアの25%より大きい減少及び／もしくは14日目における足首関節の組織学的スコアの50%より大きい減少を誘
導する。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、組み換え単量体Fcフラグメントと比較して、古典的補体経路についての溶血アッセイにおいてオプソニン化赤血球の溶解を阻害する。一実施態様において、Fc六量体は、配列番号3の組み換えFc単量体と比較して、古典的補体経路についての溶血アッセイにおいてオプソニン化ヒツジ赤血球の溶解を阻害する。一実施態様において、0.5 mg/mlの濃度のFc六量体は、古典的補体経路についての溶血アッセイにおいてオプソニン化ヒツジ赤血球の溶解を、配列番号3の２つのポリペプチドを含む組み換えFc単量体と比較して70%より多く阻害する。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、好中球又は単球でのFcγ受容体II発現又はFcγ受容体III発現の減少を誘導する。一実施態様において、マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける６日目のFc六量体200 mg/kgの投与は、未処置の関節炎マウスと比較した、好中球又は単球でのFcγ受容体II又はFcγ受容体IIIレベルの50%より大きい減少を誘導する。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、単球でのC5a受容体(CD88)の上方調節を阻害する。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、単球でのFcγ受容体I(CD64)レベルの減少を誘導する。一実施態様において、マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける６日目のFc六量体200 mg/kgの投与は、未処置の関節炎マウスと比較した８日目の単球でのFcγ受容体I(CD64)の減少を誘導する。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、インビボで新生児Fc受容体(FcRn)を機能的に遮断する。一実施態様において、Fc六量体200 mg/kgの投与は、ヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウスにおいてトレーサー抗体のクリアランスを有意に増加させる。好ましい実施態様において、Fc六量体200 mg/kgの投与は、トレーサー抗体の半減期を、少なくとも20 %、より好ましくは少なくとも30%、40%、50%、なおより好ましくは少なくとも60%減少させる。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、等濃度のIVIGよりもより効率的に、THP-1細胞によるヒトIgG被覆ビーズの食作用を阻害し、これは受容体媒介食作用の阻害を示す。好ましい実施態様において、IVIG濃度と比較して１０倍低い濃度のFc六量体は、使用されたIVIG濃度を用いて達成されるものと少なくとも同じレベルの阻害を達成することができ、IVIG濃度と比較して、好ましくは30倍低い濃度のFc六量体、なおより好ましくは100倍低い濃度、なおより好ましくは300倍低い濃度、最も好ましくは1000倍低い濃度のFc六量体は、使用されたIVIG濃度と少なくとも同じレベルの阻害を達成することができる。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、3 mg/mlまでの濃度に対する応答におけるカルシウム動員の欠如により示されるように、インビトロでヒト好中球を活性化しない。好ましい実施態様において、ヒト好中球におけるFc六量体によりカルシウム動員は、熱凝集IgGで観察されるカルシウム動員の、50%未満、より好ましくは40%未満、30%未満、なおより好ましくは20%未満、最も好ましくは10%未満である。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、IVIGより２倍低い濃度のFc六量体を使用して、好ましくはIVIGよりも4倍低い濃度、なおより好ましくは8倍低い濃度のFc六量体を使用して、熱凝集IgGによる好中球のカルシウム動員で測定される活性化を阻害し、IVIGより効率的に免疫複合体を刺激する。

好ましい実施態様において、IgG被覆RBCにより誘導される呼吸性バーストのFc六量体による等価なレベルの阻害は、単量体Fcよりも２倍低い濃度のFc六量体を使用して、好ましくは単量体Fcよりも4倍低い濃度、なおより好ましくは8倍低い濃度のFc六量体を使用して達成される。

好ましい実施態様において、高い正常ヒト血清濃度(すなわち、> 20%)の存在下でのヒト単球におけるFc六量体によるカルシウム動員は、最大刺激を達成する熱凝集IgGの濃度で観察されたカルシウム動員の40%未満、好ましくは30%未満、より好ましくは20%未満、なおより好ましくは10%未満である。

本開示はまた、治療有効量のFc六量体の医薬組成物をそれを必要とする被験体に投与することにより、被験体において自己免疫又は炎症性疾患を処置するための方法を提供する。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、静脈内又は非静脈内に投与される。一実施態様において、Fc六量体は皮下投与される。一実施態様において、Fc六量体は、経口もしくは髄腔内、又は吸入投与により肺内に適用される。

好ましい実施態様において、自己免疫疾患又は炎症性疾患は、免疫性血球減少症、ギラン・バレー症候群、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、重症筋無力症、炎症性ニューロパチー、視神経脊髄炎、他の自己免疫性チャネル病、自己免疫性てんかん、皮膚筋炎又は多発性筋炎、天疱瘡又は類天疱瘡、強皮症、全身性エリテマトーデス及び関節リウマチから選択される。一実施態様において、自己免疫疾患は自己抗体媒介される。一実施態様において、炎症性疾患は移植と関連している。一実施態様において、炎症性疾患は再灌流傷害に起因するものであり、又は炎症は脊髄損傷に起因するものである。

好ましい実施態様において、Fc六量体は、約10 mg/kg〜約200 mg/kgの範囲に及ぶ量で投与される。一実施態様において、Fc六量体は、約25 mg/kg〜約500 mg/kgの範囲に及ぶ量で投与される。全ての用量は、Fc六量体が投与される被験体の体重１ｋｇあたりである。

当然のことながら、前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載は、例示であり、かつ説明のためのみのものであり、そして本開示のさらなる非限定的な説明を提供することを意図される。

図1Aは、Fc-μTP及びFc-μTP-L309C六量体構造の略図を示す。 図1BはFc-μTP(左)及びFc-μTP-L309C (右)Fcタンパク質のSDS PAGEを示す。分子量マーカーはkDaで示される。 図1CはFc-μTP(左)及びFc-μTP-L309C(右)のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を示す。クロマトグラムは280 nmにおける正規化されたU.V.吸光度シグナル(A280)を示し、そして太い線は、多角度光散乱(MALS)により決定された示された時間に溶出された物質の分子量(kDa)を示す。 図1Dは、Fc-μTP (左)及びFc-μTP-L309C (右)の非対称流れ場-フローフラクショネーション(AF4)を示す。クロマトグラムは正規化されたA280シグナルを示し、そして太い線は、MALSにより決定された示された時間に溶出された物質の分子量(kDa)を示す。 図2は、LPSによるNFκBの活性化を示すが、Fcタンパク質Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cにより活性化されず、エンドトキシン混入がないことを示す。 図3Aは、Fcタンパク質Fc-μTP及びFc-μTP-L309CのFcγR成分CD16a、CD32a、CD32b/c及びCD64への結合のBiacore分析を示す。 図3Bは、IVIG、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cのヒト単球細胞株THP1への結合を示す。 図3Cは、IVIG、Fc、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの初代ヒト好中球への結合を示す。 図3Dは、IVIG、Fc、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの初代ヒトM1及びM2マクロファージへの結合を実証する免疫蛍光画像を示す。 図3Eは、IgG1、Fc、Fc-μTP及びFc-μTP-L309CのCD16トランスフェクトNFAT-bla Jurkat細胞への結合を示す。Ki値(平均± SEM、n = 4回の実験)をnMで示す。 図4Aは、THP1細胞での(左から右に) CD64 (FcγRI)、CD32 (FcγRII)及びCD16 (FcγRIII)についての染色(モノクロ階調)を示す代表的なフローサイトメトリーを示す。塗りつぶしていないヒストグラムはアイソタイプ対照Ab染色を示す。 図4Bは、THP-1細胞での(左から右に)CD64、CD32及びCD16についてのフローサイトメトリー平均蛍光強度(MFI)値(平均±範囲、n = 2)を示す。 図5Aは、Fc、Fc-μTP及びFc-μTP-L309C (それぞれ25 μg/ml)のFcRnへのpH 6.0での結合のOctet分析を示す。 図5Bは、ヒトIgG1、Fc、Fc-μTP及びFc-μTP-L309CのFcRnトランスフェクトFreeStyle^TM293-F細胞へのpH 5.5での結合を示す。Ki値(平均±SEM、n = 3回の実験)をnMで示す。 図6Aは、時間０での単回静脈内（i.v.）注射後のFcRnトランスジェニックマウスの血液において測定されたIVIG、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの薬物動態を示す。全ての用量は100 mg/kgであった。 図6Bは、時間０での単回i.v.注射後の野生型ラットの血液において測定されたIVIG、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの薬物動態を示す。用量は: IVIG (250 mg/kg)、Fc-μTP (25 mg/kg)、及びFc-μTP-L309C (25 mg/kg)であった。水平破線はアッセイにおける検出下限を示す。 図7Aは、関節炎のCAbIAモデルにおけるFcタンパク質の治療効果を評価するためのプロトコルを示す。 図7Bは、関節炎のCAbIAモデルの６日目におけるIVIG、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの治療投与に対する臨床応答を示す。応答(左)及び7〜14日目にかけての平均臨床スコア(右)の動態を示す。全てのデータは、２回の実験からプールされた平均±SEMである。 図7Cは、関節炎のCAbIAモデルにおける疾患の８日目におけるマウスの膝関節からのCD45+細胞を示す。全てのデータは、２回の実験からプールされた平均±SEMである。PBS対照と比較した、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。 図7Dは、関節炎のCAbIAモデルにおける関節炎関節の病理組織学を示す。PBS、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cのいずれかで６日目に処置された８日目の関節炎マウスからの足根関節の代表的なH&E染色切片。未処置非関節炎マウスの関節も示される。元の倍率x40。 図7Eは、関節炎のCAbIAモデルにおける関節の組織学的分析を示す。データは、PBS、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cのいずれかで６日目に処置された関節炎マウスからの８日目及び１４日目の関節の平均(± SEM)組織学的スコアを示す。全てのデータは、２回の実験からプールされた平均±SEMである。PBS対照と比較した、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。 図8は、関節炎のCAbIAモデルの８日目における関節組織洗浄液中のサイトカイン/ケモカインレベル(pg/ml)を示す。全てのデータは２回の実験からプールされた平均±SEMである。PBS対照と比較した* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。 図８−１の続き。 図9は、関節炎のCAbIAモデルの８日目に採取された関節炎マウス関節洗浄液中の補体成分C1q、C3及びC5aを示す。関節マウスを６日目にPBS、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cのいずれかで処置した。非関節炎未処置マウス関節洗浄液も含まれた。データ(２回の実験からプールされた）は、ELISAにより決定された補体成分濃度(平均±SEM)をpg/mlで示す。PBS対照と比較した* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。 図10は、溶血補体アッセイにおけるFcタンパク質Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの効果を示す。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cは、古典的経路を阻害するが(オプソニン化ヒツジRBCの溶解; 左パネル)、代替経路を阻害しない(ウサギRBCの溶解; 右パネル)。 図11Aは、インビトロでのFc-μTP及びFc-μTP-L309Cによる特定の補体経路(CP、古典的; LP、レクチン; AP、代替)の「非最適化」緩衝条件を使用した阻害を示す。Wieslab^（Ｒ） ELISA補体系スクリーニングキットを使用した。データは正常ヒト血清(NHS)値のパーセンテージを示す。 図11Bは、ELISAにより決定されたFc、Fc-μTP又はFc-μTP-L309CへのC1q結合を示す。 図11Cは、ヒト全血におけるC4a(左)及びsC5b-9(右)の生成に対するIVIG、Fc、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの効果を示す。熱凝集ガンマグロブリン(HAGG)はポジティブコントロールとして役立った。 図11Dは、ヒト全血におけるHAGGに応じたsC5b-9生成のFc-μTP及びFc-μTP-L309C阻害を示す。 図11Eは、C2についてSDS-PAGE及びウェスタンブロットにより実証された、HAGGの存在下及び存在しない場合のC2切断に対するFc-μTP及びFc-μTP-L309Cの効果を示す。C2の位置は矢印により示され、そして分子量マーカーは左にkDaで示される。 図11Fは、Fc単量体ではなくFc-μTP及びFc-μTP-L309CによるHUVECでのC3b沈着の用量依存性阻害を示す。 図12は、HAGG活性化ヒト血清におけるC4a及びC5aの生成に対するFc-μTP及びFc-μTP-L309Cの効果を示す。 図13Aは、PBS、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cのいずれかで６日目に処置された、関節炎のCAbIAモデルの８日目に関節炎マウスの関節及び血液から得られた好中球及び単球でのFcR (CD64、CD16/32)発現を示す。データは、フローサイトメトリーにより決定された平均蛍光強度(MFI)(平均±SEM)を示す。PBS対照と比較した* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。N/A、未評価。 図13Bは、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cがヒト好中球において呼吸性バーストを活性化することができないことを示す。左及び右の欄はそれぞれ1.5及び0.4 mg/ml用量である。 図13Cは、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cがヒト好中球におけるIgG被覆ウサギRBCに応答した呼吸性バーストの活性化を阻害するということを示す。左及び右の欄はそれぞれ1.5及び0.4 mg/ml用量である。 図13Dは、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cが抗D-処理O+ヒト赤血球(平均±SEM、n = 3)のAb依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)を阻害するということを示す。 図13Eは、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cが関節炎のCAbIAモデルの８日目における末梢血単球でのC5aR (CD88)の上方調節を阻害することを示す。 図14は、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cによるヒト血小板の活性化がないことを示す。データは、血小板活性化のマーカーとしてフローサイトメトリーによりヒト血小板でのP-セレクチン(CD62P)発現(MFI)を示す。ADP又はConvulxinは血小板活性化についてのポジティブコントロールとして役立った。データはフローサイトメトリーにより決定された蛍光強度中央値(MFI)(平均±SEM; n=3)を示す。非活性化と比較した*** P < 0.001。 図15は、s.c.と比較したi.p.投与された関節炎のCAbIAモデルの６日目における IVIG、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの治療投与に対する臨床応答を示す。7〜14日目にわたる平均臨床スコアを示す。PBS対照と比較した* P < 0.05、** P < 0.01; ダンの多重比較検定を用いたクラスカル・ウォリス。 図16は、ヒトFcRnトランスジェニックマウスにおけるインビボでのトレーサーmAbのクリアランスに対するFc-μTP-L309C、IVIG又はPBSの効果を示す。データは、1/500希釈でのMSDベースのイムノアッセイにより決定されたマウスの血清チ中のトレーサーmAbの絶対シグナル(平均±SEM; n=3)を示す。 図17は、THP1細胞の食作用活性に対するFc-μTP-L309Cの効果を示す。THP1細胞を、IgG被覆FITC標識ラテックスビーズ及びIVIG、Fc単量体又はFc-μTP-L309Cとともに３時間37度でインキュベートした、その後、ビーズの取り込みをフローサイトメトリーにより分析した。示されるデータは正規化され、すなわち、IgG被覆FITC標識ラテックスビーズ及び培地とのみインキュベートされたTHP1細胞を100%食作用活性を有するとみなした(平均±SD、n=3)。 図18Aは、初代好中球におけるCa²⁺動員に対するFc-μTP-L309Cの効果を示す。代表的データを示す。 図18Bは、IVIG [2500 μg/mL]、Fc-μTP [311 μg/mL]及びFc-μTP-L309C [274 μg/mL]を用いたHAGG誘導Ca²⁺動員の阻害を示す。代表的データを示す。 図19は、s.c.に対してi.v.投与されるFc-μTP-L309Cのバイオアベイラビリティを示す。 図20は、補体及びC4切断のレクチン経路の阻害に対する最適化されたプレインキュベーション方法の効果を示す。 図21Aは、インビトロでのFc-μTP-L309Cによる特定の補体経路(CP、古典的; LP、レクチン; AP、代替)の「最適化された」緩衝液条件を使用した阻害を示す。Wieslab^（Ｒ） ELISA補体系キット(平均± SD、n=3)。 図21Bは、Fc-μTP-L309Cによる正常ヒト血清におけるC4aの生成及びC5aが生成しないことを実証する。ポジティブコントロールとして、熱凝集IgGを使用した(HAGG)。(平均±SD、n=3)。 図21Cは、示された補体因子を枯渇させた血清を使用したWieslab^（Ｒ） ELISA補体系キットの特異性を示す。枯渇血清は、使用された血清の補体活性を実証するためにそれぞれの精製されたタンパク質を用いて再構成された。

詳細な説明
以下の詳細な説明及び実施例は、本開示の特定の実施態様を説明する。当業者には当然のことながら。その範囲に包含されるこの開示の多数の変形及び改変がある。したがって、特定の実施態様の記載は、限定とみなされるべきではない。

本明細書で使用される用語「Fc単量体」は、IgGの重鎖CH2及びCH3ドメイン、又はその変異体もしくはフラグメントを含有する免疫グロブリンG(IgG)重鎖定常領域の部分として定義される。IgG CH2及びCH3ドメインはそれぞれCγ2及びCγ3ドメインとも呼ばれる。

Fc単量体は、ペプチドのN末端部分におけるシステイン残基間のジスルフィド結合により連結された２つの同一のFcペプチドから構成され得る。IgGについて記載されるジスルフィド連結の配置は、天然ヒト抗体に関連する。他の脊椎動物種から抗体間でいくらかの変形があり得るが、このような抗体は本発明の状況において適切であり得る。Fcペプチドは、組み換え発現技術により製造され得、そして天然抗体において存在するようにジスルフィド結合により結合し得る。あるいは、１つ又はそれ以上の新しいシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成を可能にするFcペプチドにおける適切な位置に導入され得る。あるいは、Fc単量体はヘテロ二量体Fc単量体を形成する２つの非同一Fcペプチドから構成され得る。一つの可能なアプローチにおいて、アミノ酸(aa)変化は、２つの相補的Fcペプチドを形成するように行われる。小さなaaは、１つのFcペプチドにおいて「ノブ」を形成するためにより大きなものに置き換えられ、そして大きなaaは、別のFcペプチドの同じ領域（例えば、CH3ドメイン）に「ホール」を形成するためにより小さなものに置き換えられる。このような「ノブ・イントゥ・ホール」技術を用いて、ヘテロ二量体性Fc単量体を形成する２つのFcペプチドの自己集合は増強され得る(Ridgway et al (1996) Protein Engineering 9: 617-621)。

一実施態様において、Fc単量体は、ヒトIgG1 CH2及びCH3ドメインを含む２つの同一のペプチド鎖を含む。

別の実施態様において、Fc単量体は、CH2及びCH3ドメイン全体を含む、そしてそれぞれCH2のN末端又はCH3のC末端で切断されている。典型的には、Fc単量体は免疫グロブリンのFabポリペプチドを欠いている。Fabポリペプチドは、CH1ドメイン及び重鎖可変領域ドメインから構成される。

Fc単量体は、免疫グロブリンのCH2及びCH3部分よりも多くを含み得る。例えば、一実施態様において、単量体は、免疫グロブリンのヒンジ領域、そのフラグメントもしくは変異体、又は改変されたヒンジ領域を含む。天然ヒンジ領域は、天然免疫グロブリンにおけるCH1ドメインとCH2ドメインとの間に存在する免疫グロブリンの領域である。変異体又は改変ヒンジ領域は、天然ヒンジ領域と長さ及び／又は組成が異なるいずれかのヒンジである。このようなヒンジは、他の種由来のヒンジ領域を含み得る。他の改変されたヒンジ領域は、Fc部分由来の異なるクラス又はサブクラスの抗体から誘導された完全ヒンジ領域を含む。あるいは、改変されたヒンジ領域は、天然ヒンジの部分又は反復中の各単位が天然ヒンジ領域から誘導されたものである反復を含む。別の代替において、天然ヒンジ領域は、システイン残基の数を増加させるか又は減少させることにより変更される。他の改変されたヒンジ領域は、全体に非天然であり、そして長さ、システイン組成、及び可動性のような所望の特性を有するように設計される。

多数の改変ヒンジ領域が、例えば、US 5677425、WO 1999/15549、WO 2005/003170、WO 2005/003169、WO 2005/003170、WO 1998/25971、及びWO 2005/003171に記載され、そしてこれらは参照により本明細書に加入される。

一実施態様において、Fcペプチドは、そのN末端にヒトIgG1ヒンジ領域を有する。一実施態様において、ヒンジ領域は配列番号5である。

いくつかの実施態様において、Fcポリペプチド鎖はシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、Fcポリペプチド鎖の分泌を方向づけ、その後Fcポリペプチド鎖の残りの部分から切断される。

一実施態様において、Fcペプチドは、ヒンジ領域のN末端に融合されたシグナルペプチドを含む。一実施態様において、シグナルペプチドは配列番号4である。

２つ又はそれ以上のFc単量体の多量体構造の形成を改善するために、Fcペプチドは尾部（tailpiece）に融合され、これは集合して多量体になる単量体単位を生じる。Fcペプチドの尾部への融合の生成物は、本明細書において使用される「Fc融合ペプチド」である。Fcペプチドは二量体化してFc単量体を形成するので、Fc融合ペプチドは同様に二量体化してFc融合単量体を形成する。

したがって、本明細書で使用される「Fc融合単量体」は、２つのFc融合ポリペプチド鎖を含み、そして各Fc融合ポリペプチド鎖はIgG Fcポリペプチド及びIgM尾部を含む。

適切な尾部は、IgM又はIgA由来である。IgM及びIgAはヒトにおいて共通のH₂L₂抗体単位の共有結合多量体として天然に存在する。IgMは、J鎖を取り込んだ場合には五量体として存在し、又はJ鎖を欠いている場合は六量体として存在する。IgAは単量体として発生し、二量体を形成する。IgM及びIgAの重鎖は、それぞれ尾部として知られるそれぞれ18アミノ酸伸長をC末端定常ドメインに有する。この尾部は、ポリマーにおいて重鎖間のジスルフィド結合を形成し、そして重合において重要な役割を有すると考えられているシステイン残基を含む。尾部はまたグリコシル化部位も含有する。

本開示の尾部はいずれかの適切なアミノ酸配列を含む。尾部は、天然に存在する抗体において見られる尾部であるか、又はあるいは、長さ及び／もしくは組成が天然尾部とは異なる改変された尾部である。他の改変された尾部は、全体に非天然であり、長さ、可動性、及びシステイン組成のような多量体化に望ましい特性を有するように設計される。

一実施態様において、尾部はヒトIgM (配列番号6)からの１８アミノ酸配列の全て又は一部を含む。別の実施態様において、尾部はヒトIgM尾部のフラグメント又は変異体である。

一実施態様において、尾部はFcペプチドのC末端に直接融合されてFc融合ペプチドを形成する。あるいは、尾部は介在するアミノ酸配列を用いて間接的に融合される。例えば、一実施態様において、短いリンカー配列が尾部とFcペプチドとの間に提供される。リンカー配列は、１アミノ酸長と20アミノ酸長との間であり得る。

多量体構造の形成は、Fc融合ペプチドのFc部分のロイシン309をシステインに変異させることによりさらに改善され得る。L309C変異は、Fc融合単量体間の追加のジスルフィド結合形成を可能にし、これがさらにFc融合単量体の多量体化を促進する。IgG Fc部分の残基は、IgGについてEdelman GM et al (1969)、Proc Natl Acad Sci 63、78-85に記載されるEU番号付けシステムに従って番号付けされる ; Kabat et al.、1983、Sequences of proteins of immunological interest、US Department of Health and Human Services、National Institutes of Health、Washington、DCも参照のこと。IgGのLeu 309は、配列相同性により、IgMのCμ3ドメイン中のCys 414及びIgAのCα2ドメイン中のCys 309に対応する。

他の変異は、さらに又はあるいは、所望の効果を達成するためにFc融合ペプチドに導入される。本明細書で使用される用語「変異」は、1つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、付加、又は欠失を含む。いくつかの実施態様において、Fc融合ペプチドは、20まで、10まで、5まで、又は2つまでのアミノ酸変異を含む。

いくつかの実施態様において、変異は保存的アミノ酸変化である。本明細書で使用される用語「保存的アミノ酸変化」は、電荷、疎水性、構造、及び／又はサイズのような同様の生化学的特性を有する異なるアミノ酸へのアミノ酸変化を指す。いくつかの実施態様において、Fc融合ペプチドは、20まで、10まで、5まで、又は2つまでの保存的アミノ酸変化を含む。一実施態様において、Fc融合ペプチドは、5つまでの保存的アミノ酸変化を含む。

保存的アミノ酸変化は、以下の残基のグループの中での変化を含む: Val、Ile、Leu、Ala、Met; Asp、Glu; Asn、Gln; Ser、Thr、Gly、Ala; Lys、Arg、His; 及びPhe、Tyr、Trp。

ペプチド、タンパク質、又はそのフラグメントを記載するために本明細書において使用される場合の「変異体」は、改変されたアミノ酸を有し得る。適切な改変としては、アセチル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ヌクレオチジル化（nucleotidylation）、リン酸化、ADP-リボシル化、及び当該分野で公知の他の改変が挙げられる。このような改変は、ペプチドが組み換え技術により作成される場合に翻訳後に起こり得る。他の方法では、改変は当該分野で公知の技術を使用して合成ペプチドに行われ得る。改変は、アミノ酸のペプチドへの組み込みの前に含まれ得る。カルボン酸基はエステル化され得るかもしくはアミドに変換され得、アミノ基はアルキル化、例えばメチル化され得る。変異体はまた、例えば炭水化物側鎖又は個々の糖部分を除去又は付加するために、翻訳後に改変され得る。

本明細書で使用される用語「Fc多量体」は、2つ又はそれ以上の重合したFc融合単量体を記載する。Fc多量体は２〜６つの融合単量体を含み、Fc二量体、Fc三量体、Fc四量体、Fc五量体、及びFc六量体を生じる。Fc融合単量体は、自然に結合して異なる数の単量体単位を有するポリマーとなる。

一実施態様において、Fc多量体の大部分はFc六量体である。本明細書で使用される用語「大部分」は、50%より多く、60%より多く、70%より多く、80%より多く、又は90%より多くを指す。一実施態様において、Fc多量体の80%より多くがFc六量体である。

特定の数の単量体を含有するFc多量体が必要とされる場合、Fc多量体は、分子サイズによって、例えばゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィー）により分離することができる。

ポリヌクレオチド
本開示はさらに、Fc多量体のためのFc融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」は、通常、未改変のRNAもしくはDNAでも改変されたRNAもしくはDNAでもよいいずれかのポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖DNA、一本鎖又は二本鎖RNAであり得る。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、１つ又はそれ以上の改変された塩基及び／又はイノシンのような普通ではない塩基を含むDNA又はRNAも含む。当然のことながら、当業者に公知の多くの有用な目的に役立つ様々な改変がDNA及びRNAになされ得る。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は、このようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的、又は代謝的に改変された形態、さらにはウイルス並びに例えば単純な及び複雑な細胞を含む細胞に特徴的なDNA及びRNAの化学形態を包含する。

当業者には当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、所定のポリペプチドは、異なるポリヌクレオチドによりコードされ得る。これらの「変異体」は本明細書に開示されるFc多量体に包含される。

Fc多量体のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドであり得る。用語「単離された」ポリヌクレオチドは、限定されないが他の染色体及び染色体外DNA及びRNAのような他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを指す。一実施態様において、単離されたポリヌクレオチドは宿主細胞から精製される。当業者に公知の従来の核酸精製方法を使用して、単離されたポリヌクレオチドが得られ得る。この用語はまた、組み換えポリヌクレオチド及び化学的合成されたポリヌクレオチドも含む。

本開示の別の局面は、本開示に従うポリヌクレオチドを含むプラスミド又はベクターである。一実施態様において、プラスミド又はベクターは発現ベクターを含む。一実施態様において、ベクターは、ヒト遺伝子治療における使用のためのトランスファーベクターである。本開示の別の局面は、本開示のポリヌクレオチド、プラスミド、又はベクターを含む宿主細胞である。

一実施態様において、本開示の宿主細胞は、Fc多量体を製造する方法において使用される。この方法は:
（ａ） 本開示の宿主細胞を、所望の挿入タンパク質が発現されるような条件下で培養すること;及び
（ｂ） 場合により、所望の挿入タンパク質を宿主細胞又は培地から回収すること
を含む。

一実施態様において、Fc多量体は、混入高分子、例えば他のタンパク質及び核酸について≧80%純度、≧90%純度、≧95%純度、≧99%純度、又は≧99.9%純度まで精製され、感染性及び発熱性物質は含まない。本開示の単離されたFc多量体は、他の非関連ポリペプチドを実質的に含まないものであり得る。

本開示の様々な製品は薬剤として有用である。したがって、本開示は、Fc多量体、本開示のポリヌクレオチド、又は本開示のプラスミドもしくはベクターを含む医薬組成物に関する。

本開示はまた、それを必要とする被験体において自己免疫疾患又は炎症性疾患を処置する方法に関する。この方法は、該被験体に治療有効量のFc多量体を投与することを含む。別の実施態様において、この方法は、該被験体に治療有効量の本開示のポリヌクレオチド又は本開示のプラスミドもしくはベクターを投与することを含む。

提案されるFc多量体の発現
適切な宿主細胞における高レベルでの組み換えタンパク質の産生は、当業者に公知の方法に従って様々な発現系において増殖され得る組み換え発現ベクターにおいて適切な調節エレメントと一緒に有効な転写単位へと上述の改変cDNAを組織化することを必要とする。有効な転写調節エレメントは、それらの天然の宿主として動物細胞を有するウイルス又は動物細胞の染色体DNAから誘導され得る。例えば、サルウイルス40、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、もしくはラウス肉腫ウイルスの長期反復から誘導されるプロモーター-エンハンサー組み合わせ、又はベータ-アクチンもしくはGRP78のような動物細胞において強く構成的に転写される遺伝子を含むプロモーター-エンハンサー組み合わせが使用され得る。cDNAから転写される安定な高レベルのmRNAを達成するために、転写ユニットは、その3’-近接部において転写終結−ポリアデニル化配列をコードするDNA領域を含有するべきである。例えば、この配列は、サルウイルス40初期転写領域、ウサギベータグロビン遺伝子、又はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子から誘導され得る。

次いで、cDNAはFc多量体の発現のための適切な宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。いくつかの実施態様において、この細胞株は、正確な折りたたみ、ジスルフィド結合形成、アスパラギン連結グリコシル化及び他の翻訳後修飾、さらには培地への分泌を確実にするために脊椎動物起源の動物細胞株であるべきである。他の翻訳後修飾の例は、チロシンO-硫酸化及び新生ポリペプチド鎖のタンパク質分解プロセシングである。使用され得る細胞株の例は、サルCOS細胞、マウスL細胞、マウスC127細胞、ハムスターBHK-21細胞、ヒト胎児由来293細胞、及びハムスターCHO細胞である。

対応するcDNAをコードする組み換え発現ベクターは、いくつかの異なる方法で動物細胞株に導入され得る。例えば、組み換え発現ベクターは、様々な動物ウイルスに基づくベクターから作製され得る。これらの例は、ベキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及びウシパピローマウイルスに基づくベクターである。

対応するDNAをコードする転写ユニットもまた、それらのゲノムに組み換えDNAを組み込んだ特定の細胞クローンの単離を容易にするためにこれらの細胞において優性選択可能マーカーとして機能し得る別の組み換え遺伝子と一緒に動物細胞中に導入され得る。このタイプの優性選択可能マーカー遺伝子の例は、ジェネテシン(G418)に対する抵抗性を付与するTN4アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、及びピューロマイシンに対する抵抗性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択可能マーカーをコードする組み換え発現ベクターは、所望のタンパク質のcDNAをコードするベクターと同じベクター上に存在しても、同時に導入され、そして宿主細胞のゲノムに組み込まれる別々のベクターでコードされてもよく、しばしば、異なる転写ユニット間に強い物理的連結を生じる。

所望のタンパク質のcDNAと一緒に使用され得る他の種類の選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)をコードする様々な転写ユニットに基づく。内在性dhfr活性のない細胞、例えばCHO細胞(DUKX-B11、DG-44)A中にこのタイプの遺伝子を導入した後、これらはヌクレオシドのない培地中で増殖することが可能となる。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジン、及びグリシンを含まないハムF12である。これらのdhfr−遺伝子は、同じベクター異なるベクターのいずれかに連結されて、IgG Fc融合単量体をコードするcDNAと一緒に上記の種類のCHO細胞に導入され得、したがって組み換えタンパク質を産生するdhfrポジティブ細胞株を生じる。

上記細胞株が細胞傷害性dhfr阻害剤メトトレキサートの存在下で増殖される場合、メトトレキサートに対して抵抗性の新しい細胞株が現れる。これらの細胞株は、連結されたdhfr及び所望のタンパク質の転写ユニットの増幅された数に起因して増加した速度で組み換えタンパク質を産生し得る。増加する濃度のメトトレキサート(1〜10,000 nM)でこれらの細胞株増殖する場合、非常に高速で所望のタンパク質を産生する新しい細胞株を得ることができる。

所望のタンパク質を産生する上記細胞株は、懸濁培養又は様々な固体支持体上のいずれかで大スケールで増殖され得る。これらの支持体の例は、デキストランもしくはコラーゲンマトリックスに基づくマイクロキャリア、又は中空ファイバーもしくは様々なセラミック材料の形態の固体支持体である。細胞懸濁培養又はマイクロキャリアにおいて増殖された場合、細胞株の培養は、長期間にわたって馴化培地の継続的産生を用いて槽培養又は灌流培養のいずれかとして行われ得る。したがって、本開示によれば、上記細胞株は、所望の組み換えタンパク質の製造のための工業的プロセスの開発に十分適している。

精製及び製剤化
組み換えタンパク質は、所望のタンパク質と宿主細胞又は細胞培養培地中の他の物質との間の、サイズ、電荷、疎水性、溶解性、特異的親和性などの差を利用した方法を含む様々な化学的及びクロマトグラフィー方法により濃縮及び精製され得る。

このような精製の例は、固体支持体上に固定された、例えば、Fc多量体のFc部分又は別のFc結合リガンド(例えば、プロテインA又はプロテインG)に特異的なモノクローナル抗体への、組み換えタンパク質の吸着である。Fc多量体の支持体への吸着、洗浄及び脱離後に、タンパク質を、上記の特性に基づいたクロマトグラフィー技術によりさらに精製することができる。精製工程の順序は、例えば工程の容量及び選択性、支持体の安定性又は他の局面に従って選択される。精製工程は、例えば、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー工程、免疫親和性クロマトグラフィー工程、アフィニティークロマトグラフィー工程、色素クロマトグラフィー工程、及びサイズ排除クロマトグラフィー工程であり得る。

ウイルス混入の理論的リスクを最小にするために、ウイルスの効果的な不活化又は排除を可能にする追加の工程がプロセスに含まれ得る。例えば、このような工程としては、液体若しくは固体状態での熱処理、溶媒及び／若しくは界面活性剤での処理、可視若しくはUVスペクトルでの照射、ガンマ線照射、精製の間の分配、又はウイルスろ過(ナノろ過)が挙げられ得る。

本明細書に記載されるFc多量体は、治療用途のための医薬製剤へと製剤化され得る。医薬製剤の成分は、そこに添加され得る従来の生理学的に適合性の水性緩衝液、場合により医薬賦形剤に再懸濁又は溶解されて、医薬製剤を生じ得る。医薬製剤の成分は、全ての必要な医薬、生理学的に適合性の賦形剤をすでに含有していてもよく、そして注射用水中に溶解されて医薬製剤を生じ得る。

このような医薬担体及び賦形剤、さらには適切な医薬製剤の製造は当該分野で周知である(例えば、「Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,」 Frokjaer et al.、Taylor＆Francis (2000)又は「Handbook of Pharmaceutical Excipients,」 3rd edition、Kibbe et al.、Pharmaceutical Press (2000)を参照のこと)。特定の実施態様において、医薬組成物は、増量剤、緩衝剤、又は安定剤のような少なくとも１つの添加剤を含み得る。標準的な医薬製剤化技術は当業者に周知である(例えば、2005 Physicians’ Desk Reference^（Ｒ）、Thomson Healthcare: Monvale、NJ、2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy、20th ed.、Gennaro et al.、Eds. Lippincott Williams＆Wilkins: Philadelphia、PA、2000)。適切な医薬添加剤としては、例えば、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、又はその他のような糖類、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、プロリン、又はその他のようなアミノ酸、塩化ナトリウム又は他の塩のような等張状態を達成するための添加剤、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、塩化カルシウム、又はその他のような安定剤、トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン)のような生理的pH緩衝化剤などが挙げられる。特定の実施態様において、医薬組成物は、pH緩衝化試薬及び湿潤剤又は乳化剤を含有し得る。さらなる実施態様において、組成物は保存料又は安定剤を含有し得る。特に、本明細書に記載されるFc多量体を含む医薬製剤は、凍結乾燥形態又は安定な可溶性形態で製剤化され得る。Fc多量体因子は、当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。凍結乾燥された製剤は、注射用滅菌水又は生理食塩水又は適切な緩衝液のような薬学的に許容しうる１つ又はそれ以上の希釈剤の添加により使用前に再構成される。

Fc多量体の医薬製剤の組成物は、いずれかの薬学的適した手段により個体に送達され得る。様々な送達系が公知であり、そしていずれかの従来の経路により組成物を投与するために使用され得る。Fc多量体の医薬製剤の組成物は、静脈内若しくは非静脈内注射のため、又は経腸(例えば、経口、膣、又は直腸)送達のために従来の方法に従って製剤化され得る。非静脈内投与については、Fc多量体の組成物は、皮下、筋内、関節内、腹腔内、脳内、髄腔内、肺内(例えば、噴霧されて)、鼻腔内、皮内、経口又は経皮投与のために製剤化され得る。一実施態様において、Fc多量体の組成物は静脈内注射のために製剤化される。他の実施態様において、Fc多量体の組成物は、皮下、筋内、又は経皮投与のため、好ましくは皮下投与のために製剤化される。製剤は、注入により継続的に、又はボーラス注射により投与され得る。いくつかの製剤は徐放系を包含し得る。

Fc多量体の医薬製剤の組成物は、治療有効用量で患者に投与される。本明細書で使用される用語「治療有効」は、処置される状態若しくは適応症の重篤度若しくは伝播を予防するか若しくは低下させて、所望の効果を生じるため、又は耐えられない有害副作用を生じる用量を教示することなく、検出可能な治療効果若しくは予防効果を示すために十分である用量を記載する。正確な用量は、例えば、適応症、処方、及び投与形式のような多くの要因に依存する。治療有効量は、最初に細胞培養アッセイ又は動物モデル、例えば、げっ歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ、又は霊長類モデルにおいて予測され得る。次いでこのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定し得る。

一実施態様において、１回の静脈内注射又は１回の非静脈内注射のための Fc多量体の用量は、1,000 mg/kg体重未満、800 mg/kg体重未満、600 mg/kg体重未満、400 mg/kg体重未満、200 mg/kg体重未満、又は100 mg/kg体重未満である。例えば、一実施態様において、Fc多量体の用量は、約1 mg/kg体重〜約1,000 mg/kg体重、約10 mg/kg体重〜約800 mg/kg体重、約20 mg/kg体重〜約700 mg/kg体重、約30 mg/kg体重〜約600 mg/kg体重、約40 mg/kg体重〜約500 mg/kg体重、約50 mg/kg体重〜約400 mg/kg体重、約75 mg/kg体重〜約300 mg/kg体重、又は約100 mg/kg体重〜約200 mg/kg体重である。一実施態様において、Fc多量体の用量は、約25 mg/kg体重〜約1,000 mg/kg体重、約25 mg/kg体重〜約800 mg/kg体重、約25 mg/kg体重〜約600 mg/kg体重、約25 mg/kg体重〜約500 mg/kg体重、約25 mg/kg体重〜約400 mg/kg体重、約25 mg/kg体重〜約300 mg/kg体重、約25 mg/kg体重〜約200 mg/kg体重、又は約25 mg/kg体重〜約100 mg/kg体重である。

一実施態様において、Fc多量体の医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と併せて投与される。一実施態様において、これらの薬剤は、同じ医薬の一部として組み込まれる。一実施態様において、Fc多量体は、ステロイドのような免疫抑制療法と併せて投与される。別の実施態様において、Fc多量体は、いずれかのB細胞又はT細胞調節剤又は免疫調節薬とともに投与される。

Fc多量体の投与頻度は、適応症、処方、投薬量、及び投与様式のような多くの因子に依存する。一実施態様において、Fc多量体の用量は、毎日複数回、1日に1回、1日おきに1回、3日ごとに1回、週に2回、週に1回、2週間ごとに1回、3週間ごとに1回、又は月に1回投与される。

一実施態様において、本開示のFc多量体は、自己免疫疾患又は炎症性疾患を処置するために使用される。本明細書で使用される「自己免疫疾患」は、免疫系が自分の身体組織を攻撃する疾患を含む。本明細書で使用される「炎症性疾患」は、再発するか又は慢性であり得、かつ通常の組織修復と関連しない破壊性炎症を特徴とする疾患を含む。このような疾患は特に、自然免疫系が未知であり得る理由で炎症を引き起こす「自己炎症性疾患」を含む。一実施態様において、本開示のFc多量体は、自己抗体媒介自己免疫疾患を処置するために使用される。一実施態様において、本開示のFc多量体は、移植における補体媒介炎症を処置するために使用される。一実施態様において、本開示のFc多量体は、再還流傷害における補体媒介炎症を処置するために使用される。一実施態様において、本開示のFc多量体は、脊髄損傷における補体媒介炎症を処置するために使用される。

処置に適した自己免疫又は炎症性疾患としては、自己免疫性血球減少、特発性血小板減少性紫斑病/免疫性血球減少(ITP)、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、喘息、川崎病、ギラン・バレー症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、結腸クローン病、糖尿病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、炎症性ニューロパチー、視神経脊髄炎、他の自己免疫性チャネル病、自己免疫性てんかん、重症筋無力症、抗第VIII因子自己免疫疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、強皮症、脈管炎、ブドウ膜炎、天疱瘡、類天疱瘡、脊髄損傷又はアルツハイマー病が挙げられる。

治療効果
いくつかの実施態様において、Fc多量体は治療効果をもたらす。本明細書で使用される用語「治療効果」は、疾患又は傷害を特徴づけるパラメーターの改善を記載する。例えば、治療効果は、ある用量のFc多量体を投与することにより疾患又は障害の動物モデルにおいて決定され得る。Fc多量体の用量は、10〜1000 mg/kg、例えば、200 mg/kgであり得る。Fc多量体は、静脈内若しくは非静脈内の注射又は静脈内注入により投与され得る。動物の臨床評価は、Fc多量体の投与後に最終時点までの所定の時点に行われる。臨床評価は、特定の疾患又は障害の臨床所見に基づいてスコア付することを含み得る。生物学的サンプルもまた、Fc多量体の投与後に最終時点までの所定の時点に動物から採取され得る。本明細書で使用される用語「生物学的サンプル」は、例えば、組織、血液、及び尿を指す。次いで生物学的サンプルを、特定の疾患又は障害のマーカー又は指標の改善について評価し得る。治療効果が決定され得る疾患又は障害としては、自己免疫疾患又は炎症性疾患が挙げられる。

一実施態様において、疾患の動物モデルは関節炎のモデルである。例えば、疾患の動物モデルは、マウスにおける抗コラーゲン抗体誘導関節炎(CAbIA)モデルであり得る。このモデルにおいて、関節炎は、0日目のマウスモノクローナル抗II型コラーゲン5クローン抗体の腹腔内注射、続いてリポ多糖の3日目の注射によりマウスにおいて誘導され得る。マウスにおける関節炎の臨床徴候は毎日評価され、そしてスコア付され得る。例えば、以下の臨床スコアが使用され得る: 0 - 正常; 0.5 - 指に限局される腫脹; 1 - 軽度足腫脹; 2 - 顕著な足腫脹; 3 - 重篤な足腫脹及び／又は関節強直。個々の動物の各足のスコアは、合計臨床スコアのために合計され得る。次いでFc多量体の治療効果は、1又はそれ以上の臨床スコアを有するマウスに6日目にある用量のFc多量体を投与し、その後所定の時点にマウスの臨床スコアを決定し、そして未処置であるか又はPBSのようなビヒクル対照を投与されたマウスについての臨床スコアと臨床スコアを比較することにより評価され得る。例えば、臨床スコアは7日目から14日目の間に決定され得る。平均臨床スコアは、7日目から14日目の臨床スコアを平均することにより決定され得る。Fc多量体の用量は25〜1000 mg/kgであり得る。一実施態様において、Fc多量体の用量は200 mg/kgである。例えば、組織学的スコアは実施例5に記載されるように決定され得る。

本明細書において使用される用語「マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデル」は、Campbell、IK et al.、(2014). J Immunol. 192(11):5031-8により記載されるマウス関節炎モデルを指す。

マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける本明細書において使用される用語「6日目」は、Campbell、IK et al.、(2014). J Immunol. 192(11):5031-8に記載されるように関節炎を誘導するモノクローナル抗体の注射後6番目の日を指す。

本明細書で使用される用語「関節炎マウス」は、Campbell、IK et al.、(2014). J Immunol. 192(11):5031-8により記載される関節炎を誘導するモノクローナル抗体を受けたマウスを指す。

本明細書において使用される用語「誘導する」は、引き起こすこと、産生すること、達成すること、生成すること、生じさせること、もたらすこと、又は促進することと定義される。

Fc多量体の治療効果は、ビヒクル対照又は未処置のマウスを投与されたマウスと比較して、Fc多量体を投与されたマウスにおける減少した臨床スコアにより示され得る。いくつかの実施態様において、Fc多量体は、未処置マウス又はPBSを投与された対照マウスと比較して、7〜14日目のいずれかにおける臨床スコア又は7〜14日目の平均臨床スコアの減少を誘導する。一実施態様において、Fc多量体は、未処置のマウス、又はPBSを投与された対照マウスと比較して、7〜14日目のいずれかにおける臨床スコアの50%より大きい減少、又は7〜14日目の平均臨床スコアの50より大きい減少を誘導する。

上記のコラーゲン抗体誘導関節炎(CAbIA)マウスモデルにおけるFc多量体の治療効果はまた、Fc多量体の投与後の所定の時点でマウスの関節における浸潤細胞の数を評価することにより決定され得る。例えば、8日目に、関節炎マウスの関節を取り出して処理し得る。例えば、脂肪を除く膝蓋及び周囲の軟組織を取り出して、氷上で標準的な培地中に60分間置いてもよい。次いで培地を除去し、そして遠心分離し、上清又は関節洗浄液をその後の分析のために保存し得る。膝蓋及び細胞ペレットを合わせてコラゲナーゼ及びDNAseで消化し、次いで70 μmカットオフでろ過し、洗浄し、そして緩衝液に再懸濁し得る。次いで再懸濁した細胞は、標識した抗体で染色され得る。例えば、細胞を標識した抗CD45抗体で染色し得る。CD45+細胞は浸潤白血球の指標である。次いでマウスにおけるCD45+細胞の数をフローサイトメトリーを使用して計数する。例えば、浸潤CD45+細胞の数は、実施例5に記載されるように決定され得る。

治療効果は、未処置のマウス、又はPBSのようなビヒクル対照を投与されたマウスの関節からのCD45+細胞の数と比較して、Fc多量体を投与されたマウスの関節からのCD45+細胞の減少した数により示され得る。いくつかの実施態様において、Fc多量体は、未処置のマウス、又はPBSを投与された対照マウスと比較して、膝から回収されたCD45+細胞の数の減少を誘導する。一実施態様において、Fc多量体は、未処置のマウス、又はPBSを投与された対照マウスと比較して、8日目に膝関節から回収されたCD45+細胞の数の50%より大きい減少を誘導する。

上記のコラーゲン抗体誘導関節炎(CAbIA)マウスモデルにおけるFc多量体の治療効果はまた、Fc多量体投与後の所定の時点でマウスの関節の組織学的スコアを評価することにより決定され得る。所定の時点は、例えば8日目又は14日目であり得る。例えば、関節炎マウスの足は、取り除かれ、ホルマリンで固定され、脱灰され、そしてパラフィンで包埋され得る。次いで組織切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色し得、そして病理組織学をスコア付し得る。例えば、以下の病理組織学的特徴がスコア付され得る: 滲出液 -
関節腔内の炎症性細胞の存在; 滑膜炎 - 滑膜肥厚及び炎症性細胞浸潤の程度; 組織破壊
- 軟骨組織及び骨びらん及び浸潤。次いで各特徴を、以下のスケールに従ってスコア付し得る: 0 - 正常、1 - 最小、2 - 軽度、3 - 中程度、4 - 顕著、5 - 重篤。次いで３つの病理組織学的特徴についての累積スコアを集計し得る。例えば、組織学的スコアは実施例5に記載されるように決定され得る。

Fc多量体の治療効果は、ビヒクル対照を投与されたマウス又は未処置マウスと比較して、Fc多量体を投与されたマウスにおいて減少した組織学的スコアにより示され得る。いくつかの実施態様において、Fc多量体は、未処置マウス又はPBSを投与された対照マウスと比較して、8日目、14日目、又は8日目及び14日目の両方に、組織学的スコアの減少を誘導する。一実施態様において、Fc多量体は、未処置のマウス、又はPBSを投与された対照マウスと比較して、8日目に組織学的スコアの25%より大きい減少を誘導する。別の実施態様において、Fc多量体は、未処置マウス、又はPBSを投与された対照マウスと比較して14日目に組織学的スコアの50%より大きい減少を誘導する。

FcγRの発現の減少
ヒトFcγ受容体の３つのクラスがある(Gessner et al (1998) Ann Hematol76: 231-48;
Raghavan and Bjorkman (1996) Ann Rev Cell Dev Biol 12: 181-220)。FcγRI (CD64)は高い親和性で単量体IgGに結合する。細胞上のヒトFcγRIは、通常はIgG1に対するその親和性 >> IgG2 / IgG3 / IgG4 (約10^-8)及びこれらのIgGの血清中での総濃度(約10 mg/ml)に起因して、通常の血清条件で単量体IgGにより「占有」されていると考えられる。このようにして、それらの表面上にFcγRIを保有する細胞は、結合した多特異性IgGによりそれらの抗原性環境を代わりに「スクリーニング」又は「サンプリング」することができると考えられる。FcγII (CD32)及びFcγRIII (CD16)は、低親和性受容体(約10^-5〜10^-7 Mの範囲)であり、そして通常は「非占有」であると考えられる。それ故、低親和性受容体は、抗体が関与する免疫複合体の検出及びそれにより活性化に対して本質的に感受性である。

多くの細胞型が多数の型のFcγRを発現し、そしてFcγRを保有する細胞へのIgG又は抗体免疫複合体の結合は、生物学的状況に依存して多数の複雑な結果を有し得る。例えば、細胞は活性化、阻害性、又は混合シグナルのいずれを受けてもよい。これにより、食作用(例えば、マクロファージ及び好中球)、抗原プロセシング(例えば、樹状細胞)、減少したIgG産生(例えば、B細胞)、又は脱顆粒(例えば、好中球及びマスト細胞)のような事象を生じ得る。

いくつかの実施態様において、Fc多量体は、疾患又は障害、例えば自己免疫疾患又は炎症性疾患を有する被験体において好中球、単球、又はマクロファージ上でのFcγRの発現を低減する。FcγRの発現を低減するFc多量体の能力は、上記のコラーゲン抗体誘導関節炎(CAbIA)マウスモデルのような疾患の動物モデルにおいて調査され得る。好中球、単球、又はマクロファージ上のFcγRの発現は、Fc多量体の投与後の所定の時点にマウスの関節及び血液において決定され得る。例えば、８日目に関節炎マウスの関節を取り出し、そして上記のように処理し得る。末梢血サンプルもまたマウスから得ることができる。関節消化物及び末梢血を緩衝液に再懸濁し、次いで特定のFcγRs、例えばFcγRII/FcγRIII (CD32/16)又はFcγRI (CD64)に特異的な標識された抗体で染色し得、そして染色された細胞を、フローサイトメトリーによりFcγR発現について評価し得る。Fc多量体を投与されたマウスの関節及び末梢血からの単球/マクロファージ及び好中球上のFcγR発現を、未処置のマウス、例えばPBSを投与されたマウスの単球/マクロファージ及び好中球上のFcγRと比較することができる。例えば、単球/マクロファージ及び好中球上の相対的FcγR発現を、実施例９において記載されるように決定することができる。

いくつかの実施態様において、Fc多量体は、未処置、又はPBSを投与した関節炎マウスと比較して、CAbIAモデルの８日目において関節好中球、血液好中球、関節単球/マクロファージ、及び／又は血液単球/マクロファージ上でのFcγRII/FcγRIII (CD32/16)の発現を減少させる。一実施態様において、Fc多量体は、PBSを投与されたマウスと比較して、関節好中球、血液好中球、及び関節単球/マクロファージ上のFcγRII/FcγRIII (CD32/16)の発現を50%より多く減少させ、そして血液単球/マクロファージ上のFcγRII/FcγRIII (CD32/16)の発現を25%より多く減少させる。いくつかの実施態様において、Fc多量体は、関節好中球及び血液単球/マクロファージ上のFcγRI (CD64)の発現を減少させる。一実施態様において、Fc多量体は、PBSを投与された関節炎マウスと比較して、関節好中球上のFcγRI (CD64)の発現を50%より多く減少させ、そして血液単球/マクロファージ上のFcγRI (CD64)の発現を75%より多く減少させる。

古典的補体経路の活性化
古典的補体経路は特異的抗体応答を媒介し、そして補体成分のカスケードにより媒介される。カスケードは、主に抗原−抗体複合体により活性化される。経路の初期構成要素はタンパク質複合体C1であり、これは１つのC1q及び２つのC1r2s2のサブユニットから構成される。C1qへの免疫グロブリンの結合は、C1r2s2の活性化を通して触媒的に活性なサブユニットへの古典的補体経路の活性化の第一の工程を達成する。活性化されたC1sはC4をC4aに、そしてC4b及びC2をC2a及びC2bに切断する。次いでC2aはC4bに結合してC4b2aを形成し、これはC3転換酵素としても知られる。C3転換酵素はC3のC3a及びC3bへの切断を触媒する。次いでC3bは活性化されたC4b2aに結合してC4b2a3bを形成し得る（これはC5転換酵素としても知られる）。C5転換酵素はC5をフラグメントC5a及びC5bに転換する。C5bは、C6、C7、C8、及びC9成分と一緒に、C5b-9複合体として知られる複合体を形成する。この複合体は、膜侵襲複合体(MAC)又は終末補体複合体(TCC)としても知られ、そして標的細胞において膜貫通チャネルを形成し、細胞溶解をもたらす。

本明細書で使用される「完全古典的補体経路の活性化」は、上記の古典的補体経路全体の全段階の活性化として定義される。完全古典的補体経路の活性化は、古典的補体経路の第一段階であるFc多量体のC1qへの結合、及びC4a、C5a又は古典的補体経路における最終エフェクターである可溶性若しくは膜結合C5b-9複合体の形成を調べることにより決定され得る。例えば、タンパク質がC1qに結合するが、可溶性C5b-9が本質的に形成されない場合、すなわち、それぞれのポジティブコントロールの50%未満しか形成されない、好ましくは40%未満、好ましくは30%未満、好ましくは20%、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満しか形成されない場合、Fc多量体は、古典的補体経路の完全活性化を誘導しない。Fc多量体のC1qへの結合及びC5b-9形成の誘導の決定は、以下及び実施例７に記載されるように評価され得る。古典的補体経路の活性化は、C4aの生成、C2の切断、又はC3転換酵素の形成を評価することにより決定され得る。例えば、Fc多量体は、C4aの生成を誘導するがC2の切断を誘導しないか又はC3転換酵素の形成を誘導しないいずれかの場合に、完全古典補体経路の活性化を誘導しない。「誘導しない」は、それぞれのポジティブコントロールの50%未満、好ましくは40%未満、好ましくは30%未満、好ましくは20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満が形成されることを意味する。C4aの形成、C2の切断、及びC3転換酵素の形成の決定は、以下及び実施例７に記載されるように評価され得る。

Fc多量体のC1qに結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)のようなインビトロ結合アッセイにより決定され得る。例えば、96ウェルプレートのウェルをヒトC1qでプレコートし得、続いてFc多量体を加える。精製されたペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG結合体が加えられ得、そして結合した結合体は、3,3’,5,5’ テトラメチルベンジジン(TMB)のような発色ペルオキシダーゼ基質を使用することにより可視化され得る。例えば、Fc多量体のC1qに結合する能力は実施例７に示されるように決定され得る。

Fc多量体による古典的補体経路の活性化は、インビトロアッセイにより決定され得、そしてC4a及び可溶性C5b-9の生成により示され得る。例えば、異なる濃度のFc多量体は、全血又は血清中で所定の期間インキュベートされ得、そしてC4a又は可溶性C5b-9(sC5b-9)のいずれかの結果としての生成は、ELISAのような免疫検出により決定され得る。使用されるFc多量体の濃度は、0.01 mg/ml〜2 mg/ml、例えば、0.04 mg/ml、0.2 mg/ml、又は1.0 mg/mlであり得る。例えば、古典的補体経路の活性化は、実施例７において示されるように決定され得る。

Fc多量体により誘導されるC4a及びsC5b-9の生成は、古典的補体経路の潜在的活性化因子である熱凝集ガンマグロブリン(HAGG)により誘導されるこれらの成分の生成に対して比較され得る。例えば、このアッセイは全血で行われ得る。行くつかの実施態様によれば、Fc多量体は、HAGGにより誘導されるsC5b-9と比較して、50%未満のsC5b-9生成、40%未満のsC5b-9生成、30%未満のsC5b-9生成、20%未満のsC5b-9生成、又は10%未満のsC5b-9生成を誘導し得る。一実施態様において、Fc多量体は、全血においてHAGGにより誘導されたsC5b-9生成と比較して、全血において20%未満のsC5b-9生成を誘導する。別の実施態様において、Fc多量体は、全血においてHAGGにより誘導されたsC5b-9生成と比較して、全血において10%未満のsC5b-9生成を誘導する。さらに別の実施態様において、Fc多量体はsC5b-9生成を誘導しない。例えば、sC5b-9生成の誘導は実施例７に示されるように決定され得る。

本明細書で使用される用語「熱凝集IgGで活性化された正常ヒト血清」は、ほとんど全てのC4の切断が熱凝集IgGで誘導された正常ヒト血清サンプルを指す。

Fc多量体による古典的補体経路の活性化はまた、C2タンパク質を検出することにより決定され得る。C2タンパク質が切断されてC2a及びC2bとなる場合、C2タンパク質のレベルは減少し、古典的補体経路の活性化を示す。様々な濃度のFc多量体を全血又は血清中で所定の期間、例えば２時間インキュベートし得、その後、C2タンパク質レベルは、免疫ブロットのような免疫検出により決定され得る。古典的補体経路の活性化は、C2タンパク質の切断により示される。正常ヒト血清中のC2タンパク質のレベルは、C2切断の量、したがって古典的補体経路の活性化を決定するために、Fc多量体とプレインキュベーション後に生じたC2タンパク質レベルと比較され得る。HAGGのような古典的補体経路の公知の活性化因子は、正常ヒト血清におけるC2タンパク質の大部分の切断を誘導するためのポジティブコントロールとして使用され得る。本明細書で使用される用語「大部分」は、50%より多く、60%より多く、70%より多く、80%より多く、又は90%より多くを構成すると定義される。いくつかの実施態様において、Fc多量体はC2タンパク質の大部分の切断を誘導しない。例えば、C2タンパク質の切断は実施例７におけるように決定され得る。

Fc多量体による古典的補体経路の活性化はまた、C3転換酵素の形成を評価することにより決定され得る。上記のように、C3転換酵素はC2a及びC4bサブユニットからなる(C4b2a)。C2タンパク質がC2a及びC2bに切断されない場合、C3転換酵素は形成されることができない。そのようにして、C3転換酵素形成は、C2タンパク質切断を決定するために上記のように評価され得る。いくつかの実施態様において、Fc多量体はC3転換酵素の形成を誘導しない。

古典的補体経路の阻害
Fc多量体による古典的補体経路の阻害は、C5a及びsC5b-9生成の阻害を決定することにより、又はC2タンパク質の切断の阻害を決定することにより決定され得る。様々な濃度のFc多量体は、全血又は血清中で古典的補体経路の既知の活性化因子とともにインキュベートされ得る。次いで、Fc多量体及び古典的補体経路の既知の活性化因子の存在下で生成されたsC5b-9のレベルを、古典的補体経路の既知の活性化因子のみを用いて生成されたsC5b-9のレベルと比較し得る。生成されたsC5b-9のレベルは上記のように決定され得る。使用されるFc多量体の濃度は、0.01 mg/ml〜2 mg/ml、例えば、0.04 mg/ml、0.2 mg/ml、又は1.0 mg/mlであり得る。古典的補体経路の既知の活性化因子はHAGGであり得る。古典的補体経路の活性化因子のみの存在下で生成されたsC5b-9のレベルと比較して、Fc多量体及び古典的補体経路の活性化因子の存在下で生成されたsC5b-9のレベルが低いほど、Fc多量体によるsC5b-9生成の阻害が大きい。例えば、sC5b-9生成の阻害は実施例７におけるように決定され得る。いくつかの実施態様において、Fc多量体は、HAGGにより誘導されるsC5b-9生成と比較して、50%より多くのsC5b-9生成、60%より多くのsC5b-9生成、70%より多くのsC5b-9生成、80%より多くのsC5b-9生成又は90%より多くのsC5b-9生成を阻害する。一実施態様において、Fc多量体は、HAGGにより誘導されるsC5b-9生成の80%より多くを阻害する。

本明細書で使用される用語「阻害する」は、抑制、制限、予防、干渉、停止、又は遮断することとして定義される。

C2タンパク質の切断の阻害は同様に決定され得る。様々な濃度のFc多量体を、全血又は血清中で古典的補体経路の既知の活性化因子とともにインキュベートし得る。古典的補体経路の既知の活性化因子のみの存在下でのC2タンパク質のレベルと比較して、Fc多量体及び古典的補体経路の既知の活性化因子の存在下でのC2タンパク質のレベルが高いほど、Fc多量体によるC2切断の阻害が大きい。C2タンパク質のレベルは上記のように決定され得る。使用されるFc多量体の濃度は、0.01 mg/ml〜2 mg/ml、例えば、0.04 mg/ml、0.2 mg/ml、又は1.0 mg/mlであり得る。古典的補体経路の既知の活性化因子はHAGGであり得る。例えば、C2切断の阻害は実施例７におけるように決定され得る。いくつかの実施態様において、Fc多量体は、HAGGによるC2タンパク質の大部分の切断を阻害する。

古典的補体経路の阻害はまた、抗体感作された、又はオプソニン化された赤血球を使用して古典的補体経路についての溶血アッセイを使用して決定され得る。例えば、ヒツジ赤血球（erythrocytes）、又は赤血球（red blood cells）をウサギ抗ヒツジ抗体を用いてオプソニン化し得る。正常ヒト血清(NHS)はオプソニン化赤血球の溶解を誘導する。Fcタンパク質は、NHSとプレインキュベートされ、次いで赤血球に加えられ、そして１時間37℃でインキュベートされ得る。Fc構築物の濃度は、1〜1000 μg/ml、例えば2.5、25、50、125、250、又は500 μg/mlであり得る。あるいは、Fc単量体はまた、Fc構築物について示される濃度同じ濃度でNHSとともにプレインキュベートされ得る。インキュベーション後に、混合物を遠心分離し、そして溶解の程度を、上清の412 nmでの放出されたヘモグロビンの吸光度を測定することにより決定され得る。例えば、古典的補体経路についての溶血アッセイにおける赤血球溶解は、実施例７に記載されるように決定され得る。
Fc多量体による古典的補体経路の阻害は、NHSを有するがFc多量体は有さない混合物と比較して、Fc多量体を含有する混合物において赤血球の減少した溶解により示され得る。Fc多量体によるオプソニン化赤血球の溶解の阻害はまた、Fc単量体の存在下でのオプソニン化赤血球の溶解と比較され得る。いくつかの実施態様において、Fc多量体は、Fc単量体と比較してオプソニン化ヒツジ赤血球の溶解を阻害する。一実施態様において、Fc多量体はFc単量体と比較して7オプソニン化ヒツジ赤血球の溶解を70%より多く阻害する。

それらの治療的利益を示すFc多量体について実証された他の効果:
自己抗体媒介自己免疫疾患の処置におけるFc多量体の治療的利益はまた、ヒトFcRnを発現するマウスにおいてトレーサー抗体のクリアランスに対する効果により説明される。これは、Fc多量体がFcRnをインビボで遮断することができるということを示し、そして自己免疫疾患における自己抗体レベルを減少させる際に有効だろうということを示す。
特定の自己免疫疾患の処置におけるFc多量体の治療的利益はまた、ヒト単球細胞株(THP-1)によるIgG被覆ビーズの食作用に対する効果により実証される。これは、Fc多量体がFcγ受容体をインビトロで機能的に遮断しているということを示す。これは、Fc多量体が慢性炎症を阻害することができるということを示し、これは特定の自己免疫疾患の処置において有益であるはずである。

Fc多量体の安全性及び治療利益は、Fc多量体により実証される好中球の活性化及び活性化の阻害が無いことにより実証される。

Fc多量体の安全性はまた、肝臓機能に対する効果が無いことにより示される。

実施例1: IgG1 Fc多量体の製造
Fc-μTP (Fig 1A、左図)を、18アミノ酸残基(PTLYNVSLVMSDTAGTCY)のヒトIgM尾部をヒトIgG1 Fcフラグメントの定常領域のC末端(アミノ酸残基216〜447、EU番号付け; UniProtKB - P01857)に融合させることにより生成した。Fc-μTP-L309C (図1A、右図)を、Fc-μTPの309 (EU番号付け)におけるLeu残基をCysに変異させることにより生成した。Fc-μTP及びFc-μTP-L309CをコードするDNAフラグメントを合成し、そしてThermoFisher Scientific (MA、USA)によりヒト細胞発現のためにコドン最適化した。DNAフラグメントを、pRhG4哺乳動物細胞発現ベクターのApaLI及びXbaI部位にInTagポジティブ選択法(Chen、CG et al、(2014). Nucleic Acids Res 42(4):e26; Jostock T、et al (2004). J. Immunol. Methods. 289:65-80)を使用してクローン化した。手短には、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cフラグメントを、ApaLI及びAscI消化により単離した。BGH ポリA付加部位(BGHpA)及びクロラムフェニコール抵抗性遺伝子(CmR)から構成されるCmR InTagアダプターもまたAscI及びSpeI消化により単離した(Chen、CG et al、(2014). Nucleic Acids Res 42(4):e26)。Fc分子及びCmR InTagアダプターを、pRhG4ベクターのApaLI及びXbaI部位にT4 DNAリガーゼを使用して同時クローンした（co-cloned）。ポジティブクローンを、34 μg/mlクロラムフェニコールを含有する寒天プレートで選択した。MiniprepプラスミドDNAを、QIAprep Spin Miniprepキット(QIAGEN、Hilden、Germany)を使用して精製し、そして配列をDNA配列分析により確認した。制限酵素及びT4 DNAリガーゼはNew England BioLabs (MA、USA)から購入した。

Expi293^TM発現系(Life Technologies、NY、USA)を使用した一過性トランスフェクションを製造者の指示に従って行った。手短には、プラスミドDNA(0.8 μg)を0.4 ml Opti-MEMで希釈し、そして穏やかに混合した。Expifectamine 293試薬(21.6 μL)を0.4 ml Opti-MEMで希釈し、穏やかに混合し、そして5分間室温でインキュベートした。次いで希釈したExpifectamineを希釈したDNAに加え、穏やかに混合し、そして室温で20〜30分間インキュベートしてDNA-Expifectamine複合体を形成させた。次いでDNA-Expifectamine複合体を、Expi293細胞6.8 ml(2x 10⁷細胞)を含有する50 mlバイオリアクターチューブに加えた。細胞を37℃インキュベーターで8% CO₂にて250 rpmで振盪しながら約16〜18時間インキュベートした。40 μlエンハンサー1 (Life Technologies、NY、USA)、400 μlエンハンサー2 (Life Technologies、NY、USA)及びLucraTone^TM Lupin 200 μlからなるマスターミックスを調製し、そして各バイオリアクターチューブに加えた。細胞をさらに4日間37℃で8% CO₂にて250 rpmで振盪しながらインキュベートした。4000 rpmで20分間の上清遠心分離からタンパク質を採取し、そして清潔なチューブに0.22 μmフィルターを使用してろ過した後、HPLC定量化及び精製を行った。

IgG1 Fc多量体を製造するために、組み換えヒトIgG1 FcのN末端を、IgMの18アミノ酸尾部に融合した。IgM尾部(μTP)は五量体及び六量体の形成を促進する。Fc融合タンパク質を、野生型(WT)ヒトIgG1 Fcペプチド(Fc-μTP)又はその変異体のいずれかを用いて残基309におけるロイシンのシステインへの点変異で製造した(Fc-μTP-L309C)。ロイシン309からシステインへの点変異(Fc-μTP-L309C)は、Fｃ分子間の共有結合の形成に起因してWT (Fc-μTP)よりも安定な構造を生じると期待された。

Fc-μTP及びFc-μTP-L309C融合単量体サブユニットは、以下の領域を含む２つのペプチドから生じる:
シグナルペプチド 残基1〜19
ヒトIgG1のヒンジ領域 残基20〜34
ヒトIgG1のFc領域 残基35〜251
ヒトIgMの尾部 残基252〜269

Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cペプチドにつてのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1及び配列番号2として提供される。配列をコードする核酸はそれぞれ配列番号9及び配列番号10として提供される。

発現の間、シグナルペプチドは切除されて、成熟Fc-μTP及びFc-μTP-L309C融合ペプチドを形成する。

多量体Fcタンパク質のSDS-PAGEは、Fc構築物の単量体、二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体に対応するはしご状（laddering）パターンを各調製物について示した。Fc-μTP-L309Cは期待された六量体位置に主要なバンドを有していたが、Fc-μTPは有しておらず、これは分裂的電気泳動緩衝液条件下でのより安定な構造と一致していた(図1B)。Fc-μTP及びFc-μTP-L309C六量体について期待される構造の図を図1Aに示す。より高次構造（最も可能性のあるのは六量体の二量体）もまた、Fc-μTP-L309Cについて明らかであった。

Fc-μTP-L309C及びFc-μTPの多量体化もまた、Fc多量体調製物のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)(図1C)及び非対称フロー式フィールド・フロー・フラクショネーション(A4F)(図1D)、続いて280 nmでのU.V.吸光度測定(A280、薄層クロマトグラム)及び多角度光散乱(MALS、太線)を用いて調べた。主要な六量体ピーク(約85%の物質)を有する同様の分布パターンが各手順でのFc多量体調製物の各々について観察された(表1)。これは、SDS-PAGEによる異なるプロフィールと対照的であり(図1B)、Fc-μTP調製物における非共有結合六量体の存在を示唆する。残りの物質は、大部分はFc-μTPについてはより低次(単量体、二量体、三量体)そしてFc-μTP-L309Cについてはより高次(六量体の二量体)であった。

組み換えヒトIgG1 Fc単量体(配列番号3)もまた製造し、対照として使用した。

Fcタンパク質(Fc、Fc-μTP及びFc-μTP-L309C)は、それらがTHP1細胞においてNF-κB活性化を刺激することができないことに基づいてエンドトキシンフリーと考えられた(図2)。ヒト単球細胞株、THP1を、10%ウシ胎仔血清(FCS)、1% (100 U/ml)ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するRoswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培地で培養した。細胞培養培地をおよそ３日ごとに交換した。THP1XBlue細胞を、転写因子NF-κBにより誘導可能なプロモーターの制御下で分泌された胎児性アルカリホスファターゼ(SEAP)を発現するレポータープラスミドを用いたTHP1細胞の安定トランスフェクションにより誘導した。刺激の際に、THP1XBlue細胞はNF-κB、そしてその後SEAPの分泌を活性化し、これは培地がその存在下で紫/青に変わるのでQUANTI-blueを使用して容易に検出可能である。THP1XBlue細胞は全てのPCRにより決定して全てのTLRを発現するが、TLR2、TLR2/1、TLR2/6、TLR4、TLR5及びTLR8に対してのみ応答する。THP1XBlue細胞は選択マーカーZeocinに対して抵抗性である。10% FCS、0.5 % (100 U/ml)ペニシリン/ストレプトマイシン、100 μg/ml Normocin (Invivogen、San Diego、CA)及び200 μg/ml Zeocin (Invivogen)を含有するRPMI 1640培地で細胞を培養した。細胞培養培地を約３日ごとに交換した。リポ多糖(LPS)を、NF-κB活性化についてのポジティブコントロールとして使用した。

実施例2: FcγR及び初代ヒト骨髄系細胞へのFc多量体の結合
Fc媒介効果を、白血球の表面上の特定の受容体に対するFcの結合により開始させた。Fc-μTP及びFc-μTP-L309C六量体の両方が、Biacoreにより決定して、Fcγ受容体(FcγRs) CD16a (FcγRIIIa)、CD32a (FcγRIIa)、CD32b/c (FcγRIIb/c)及びCD64 (FcγRI)に結合した。さらに、Fc-μTP及びFc-μTP-L309C六量体の両方が、組み換えFc単量体と比較して速い結合速度（on-rates）及び遅い解離速度（off-rates）を示し、多数の固定化FcγR分子に対するそれらの結合を通した結合力効果と一致していた(図3A)。２つの組み換えFc分子の間で結合応答の主な差異は観察されなかった。

Fc六量体のヒト骨髄系細胞株及び初代細胞への結合を、フローサイトメトリー及び免疫蛍光法(IF)により、検出のためのFc部分を認識する蛍光標識された抗IgG Abを使用して評価した。細胞をFcタンパク質とともに2時間4℃でインキュベートし、0.1% BSA (Sigma)及び0.01% NaN₃ (Sigma)を含有するPBSで4回洗浄し、そしてヒトIgGに対するFITC標識mAb又はそれぞれのアイソタイプコントロールAb (BD)で45分間4℃で染色した。染色した細胞をさらに4回洗浄し、次いでフローサイトメトリーでBD FACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences AG、Allschwil、Switzerland)を用いて分析し、そしてデータをFlowJoを使用して評価した。

ヒト単球細胞株THP1は、その表面上でFcγR CD64及びCD32を発現するがCD16を発現しない(図4)ので、これを全細胞系におけるFc構築物結合を評価するために使用した。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの両方が、同様の程度でTHP1細胞に結合し、それぞれがIVIGよりも高い結合シグナルを示した(図3B)。検出方法を考慮して、最大応答の差異は、IVIGと比較して多量体Fc分子上に存在するより大きな数のFcエピトープを反映し得る。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cもまた、IVIG又は組み換えFc単量体よりも顕著に高い程度まで初代ヒト好中球に結合し、WT構築物は最も高いレベルの結合を示した(図3C)。

初代ヒトマクロファージのために、末梢血単球を最初にインビトロでM1 (炎症性)及びM2 (抗炎症性)系統マクロファージに分化させ、次いでFcタンパク質とともにインキュベートし、そしてIF染色によりIgG1 Fcについて調べた。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cはそれぞれ２つの初代ヒトマクロファージ系統細胞を強く共染色したが、Fc単量体は弱く染色し(特にM1マクロファージについて)、そしてIVIGは中間であった(図3D)。

Fcタンパク質のFcγRへの結合を、AF488標識IgG1の存在下でCD16トラスフェクトNFAT-bla Jurkat細胞の全細胞系において定量した。アッセイ培地(PBS + 2% FCS)中のJurkat NFAT-bla CD16細胞を、AF488標識ヒトIgG1 (3.75 μg/ml; 25 nM)及び増加する濃度のFc含有試験分子の混合物を含有する96ウェルプレートのU底ウェルにプレーティングした(1 x 10⁵/ウェル)。アッセイ混合物を、一定に振盪しながら2時間室温でインキュベートし、次いで細胞を氷冷した培地ですばやく洗浄した後、15分間氷上で固定した(BD Cytofix)。細胞を培地に再懸濁し、そして各ウェル中の細胞結合蛍光をFortessaフローサイトメーターで読み出した。標識されたIgG1の50%をトランスフェクトされた細胞から置換するために必要な試験サンプルの濃度（ナノモル濃度で[nM])を示すKi値を決定した。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの両方がIgG1をJurkat細胞への結合から同様の程度まで置換し(それぞれKi 1.47 nM及び1.43 nM)、そしてそれぞれのKiは、IgG1又はその組み換えFc成分より>100倍低かった(それぞれKi 225 nM及び240 nM)(図3E)。

実施例3: Fc多量体の新生児FcRへの結合
上皮細胞における新生児FcR (FcRn)は、酸性pHでピノサイト―シスされた（pinocytosed）IgGに結合し、そしてそれを細胞外に放出しようとするリソソーム分解経路から離れるように転換させ、それによりIgGの血清半減期を延長する。多数のIgG1 Fc部分を保有するFc多量体もまたFcRnに結合できるかどうかを決定するために、最初にそれらを、固定化されたヒトFcRnをpH 6.0で使用するOctet分析により調べた。Octet分析は以前に記載されたように行い(Neuber、T et al (2014) MAbs 6(4) 928-942)、そして96ウェルフォーマットでOctet QKeデバイス(ForteBio Inc.、Menlo Park、CA、USA)にて測定した。アッセイを分析し、そしてOctetソフトウェア7.0.1.1 (ForteBio Inc.)を用いてフィッティングした。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの両方がFcRnに結合し、そして組み換えIgG1 Fcと比較してより遅い解離速度を示し(図5A)、結合力効果を示唆した。

結合が全細胞系で起こり得るということを確認するために、Fcタンパク質のヒトFcRnトランスフェクト293FS細胞株(293FS+FcRn+β2m(クローン#2))への結合を無血清アッセイ培地(PBS pH 5.5)で評価した。細胞をプレーティングし(2 x 10⁵/ウェル)、そしてAF488標識IgG1(0.5 μg/ml; 3.33 nM)及び増加する濃度のFcタンパク質とともにコインキュベー
トした。アッセイ混合物を1〜2時間室温で一定に振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後に、各ウェルにおける細胞結合蛍光をFortessaフローサイトメーターで読み出し、そしてKi値を決定した。興味深いことに、WTと変異Fc多量体との間で反応差が得られ、Fc-μTPはIgG1をFcRnからFc-μTP-L309Cよりも容易に置換した(図5B)。Fc-μTP-L309Cは同様の平均KiをIgG1に対して示した(約200 nM)。

内在性免疫グロブリンの半減期に対する機能的影響を、インビボでトレーサーモノクローナル抗体(mAb)の増強されたクリアランスにより実証した。IVIG [2g/kg]、Fc-μTP-L309C [200 mg/kg]又はPBSをヒトFcRnトランスジェニックマウスに腹腔内（i.p.）投与した。5分後に、ヒトIL-3受容体(CSL360)に特異的なヒトモノクローナルIgG1 5mg/kgを静脈内注射した。血清中のトレーサーmAbを、示された時点に(図17)MSDベースのイムノアッセイにより一定の血清希釈で測定した。トレーサーmAbのクリアランスはIVIG及びFc-μTP-L309Cにより加速され、これはこれらの分子によるFcRnの飽和を示す。

実施例4: Fc多量体の薬物動態
Fc-μTP及びFc-μTP-L309CのFcRnに対する結合差が血清半減期の差異に反映されるかどうかを調べるために、Fcタンパク質の薬物動態を、ヒトFcRnトランスジェニックマウス及びWTラットへの単回i.v.注射後にIVIGの薬物動態と比較した。マウスにおいて、全ての用量は100 mg/kgであった。ラットにおいて、IVIGを250 mg/kgの用量で投与し、そしてFc-μTP及びFc-μTP-L309Cを25 mg/kgの濃度で投与した。マウス及びラットの両方において、Fcタンパク質は、IVIGよりも血清からの速いクリアランスを示し、より短い半減期を示した(それぞれ図6A及び図6B)。WTと変異体構築物との間に差異はなかった。

２つの投与経路間、すなわち、i.v.対皮下（s.c.）の差異を評価した。s.c.のバイオアベイラビリティはi.v.と比較して約25%である。

実施例5: Fc多量体は急性炎症性Ab誘導関節炎において治療効果をもたらす
A. Fc多量体は臨床スコアの減少を誘導する
Fcタンパク質を、マウスにおいてコラーゲンAb誘導関節炎(CAbIA)モデルにおける治療効果について調べた。CAbIAは、FcR会合及び補体系の両方に依存するモデルである(Banda、NK et al、(2007) J Immunol 179(6)、4101-9; Kagari T et al (2003)、J Immunol 170(8) 4318-4324)。疾患は図7Aに示されるようにWT Balb/cマウスにおいて誘導された。マウスモノクローナル抗II型コラーゲン5クローンmAbカクテルキットをChondrex Inc. (Redmond、WA)から購入した。0日目にマウスに2 mg mAbカクテルをi.p.注射し、続いて3日目に50 μg LPSをi.p.注射した。マウスを14日目まで関節炎の臨床徴候についてモニタリングした。臨床スコアを以下のように割り当てた: 0 - 正常; 0.5 - 指に限定された腫脹; 1 - 軽度の足腫脹; 2 - 顕著な足腫脹; 3 - 重症な足腫脹及び／又は関節硬直。治療的処置のために、6日目に関節炎の徴候を示したマウス（すなわち、1又はそれ以上の臨床スコア）を無作為化し、そしてFc-μTP、Fc-μTP-L309C、IVIG、又はPBSの単回腹腔内(i.p.)注射を与えた。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cを200 mg/kg投薬量で、IVIGを2 g/kgの投薬量で投与した。各マウスについて、臨床スコアは、6日目に開始して14日目まで毎日各足についての累積臨床スコアを表す。平均臨床スコアはまた、7日目から14日目の各々からの臨床スコアの平均により計算された。PBSを投与されたマウスは未処置対照として役立った。s.c.投与されたFc-μTP及びFc-μTP-L309Cの治療効果を評価した(図15)。s.c.投与されたFc-μTP及びFc-μTP-L309Cは、i.p.投与された場合と同様の治療効果を実証した。

Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの両方は、疾患の臨床徴候を急速に減少させ、効果は24時間以内に明らかとなり(7日目)、そして14日目まで持続した(図7B)。Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cのいずれかを用いた処置の24時間後(7日目)までに、臨床スコアは、PBSを投与された(未処置)マウスと比較して50%減少した。Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cのいずれかを投与されたマウスの臨床スコアは、14日目まで未処置マウスよりも50％より多く低いままであった。7日目から14日目にわたって得られた平均臨床スコアは、Fc-μTP処置マウス及びFc-μTP-L309C処置マウスにおいて未処置マウスより50%より多く低かった。逆に、IVIGを投与されたマウスは、14日目まで未処置のマウスと比較して臨床スコアの有意な減少を示さず、そしてIVIG処置マウスの7〜14日目の平均臨床スコアは、未処置マウスと有意に異なっていなかった。

B. Fcタンパク質は関節浸潤細胞の減少を誘導する
関節炎マウスの関節を、炎症のマーカーのさらなる評価のために処理した。膝蓋及び周囲の軟組織(脂肪を除く)を両後肢から取り出し、そして氷上でRPMI + 5% FCS中に60分間置いた。次いで培地を除去し、遠心分離し、そして上清（関節洗浄液)をその後の分析を待って-30℃で貯蔵した。洗浄した膝蓋及び細胞ペレットを各個々のマウスについて合わせて、30分間37℃で振盪インキュベーター(140サイクル/分)にて1 mg/mlコラゲナーゼ(CLS-1、250 U/mg; Worthington Biochemical Corp、Lakewood、NJ)及び0.1 mg/ml DNAse 1 (ウシ膵臓由来IV型、2100 kU/mg; Sigma)を用いて消化した。消化物（digests）をろ過し(70 μmカットオフ)、洗浄し、そして細胞計数、サイトスピン及びフローサイトメトリーのためにPBS + 2% FCSに再懸濁した。

末梢血及び関節消化物の単細胞懸濁液を、2% (体積/体積) FCSを含有するPBS中に再懸濁した。細胞を以下のmAbで染色した: FITC結合抗マウスLy6G (1A8; BioLegend)、eFluor450結合抗マウスCD11b (M1/70; eBioscience)、APC.Cy7結合抗マウスCD45 (30-F11、BD Pharmingen)、PE結合抗マウスCXCR2 (242216、R&D Systems)、APC結合抗マウスCXCR4 (2B11、eBioscience)、PE.Cy7結合抗マウスCD62L (MEL-14、eBioscience)。7AAD (BD Pharmingen)を使用して死細胞を除去し、そして生存細胞をBD FortessaでFlowJoソフトウェアを使用して分析した。Fc-μTP-及びFc-μTP-L309Cで処置された細胞は、未処置(PBS)対照マウスと比較して、疾患の8日目に膝関節から回収された浸潤(CD45+)細胞が50%超少なかった(図7C)。

C. Fcタンパク質は組織学的スコアの減少を誘導する
関節炎関節の病理組織学もまた評価された。8日目及び14日目において、マウスを殺し、そして左後足を10%中性緩衝化ホルマリンで固定し、脱灰し、そしてパラフィンに包埋した。矢状組織切片をH＆Eで染色し、そして処置群を隠してスコア付した。足首関節を３つの特徴(滲出液 - 関節腔内の炎症性細胞の存在; 滑膜炎 - 滑膜肥厚及び炎症性細胞浸潤の程度; 組織破壊 - 軟骨及び骨侵食及び浸潤)について、それぞれ５つから(0 - 正常、1 - 最小、2 - 軽度、3 - 中程度、4 - 顕著、5 - 重篤)全体的にスコア付し、そしてこれらを１５からの総スコアのために合計した。

関節炎関節の病理組織学は、Fc-μTP-及びFc-μTP-L309Cで処置されたマウスにおける８日目ほどの初期における減少した炎症性細胞浸潤、滑膜炎並びに軟骨及び骨破壊事象で、臨床評価及び関節細胞評価を裏付けた(図7D及び図7E)。８日目に、Fcタンパク質は、PBSを投与されたマウスと比較して、組織学的スコアの25%より大きい減少を誘導した。14日目までに、Fc-μTPで処置されたマウス及びFc-μTP-L309Cで処置されたマウスの組織学的スコアは、PBSを投与された未処置マウスにおけるよりも50%より大きく低下した(図7E)。反対に、IVIGを投与されたマウスの組織学的スコアは、未処置マウスのスコアと有意な差異はなかった。

D. Fcタンパク質は関節炎関節におけるサイトカイン及びケモカインのレベルを減少させる
関節炎関節における局所炎症性応答を、サイトカイン及びケモカインレベルを評価することによりさらに評価した。上記の8日目の関節洗浄液を、市販のキットを使用してタン
パク質アレイにより評価し、そして製造者のプロトコルに従って分析を行った(MilliporeからのキットMCYTOMAG-70K)。両方のFcタンパク質が、炎症性サイトカインIL-6、LIF及びG-CSFのレベルを減少させたが、IL-9は減少しなかった(図8)。ケモカインIP-10(CXCL10)、MCP-1 (CCL2)、KC (CXCL1)、及びMIP-2 (CXCL2)はそれぞれ有意に減少されたが、MIG (CXCL9)、エオタキシン(CCL11)及びRANTES (CCL5)は減少されなかった。対照的に、IVIGはMIP-2のレベルのみが有意に減少されて、８日目のサイトカイン/ケモカインレベルには最小の影響を有していた。このことは、IVIG応答のより遅い動態を反映し得、これはこのモデルにおいて以前に報告されている(Campbell IK et al.、Journal of Immunology. 2014;192(11):5031-5038)。

実施例6: 関節炎マウス関節における補体カスケードに対するFc多量体の影響
Fcタンパク質が補体系に対する効果により疾患を寛解し得るかどうかを決定するために、補体経路の構成要素のレベルを、上記の関節炎マウスからの８日目の関節洗浄液において決定した。C1q、C3、及びC5aのレベルをELISAにより決定した。試験した全ての３つの補体成分は、未処置マウスと比較して関節炎マウスの関節洗浄液において上昇した(図9)。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cはそれぞれ、関節洗浄液における検出可能なC1q、C3及びC5aのレベルを同様の程度まで減少させた。IVIG処置は、C1qにおいて顕著な上昇及びわずかに減少したC3を生じたが、C5aレベルは影響がなかった。

実施例7: Fc多量体はヒト血清及び全血において古典的補体経路を阻害する
A. 補体系に対するFcタンパク質の効果
補体系に対するFcタンパク質の効果を、ヒトインビトロモデルを使用して調べた。古典的(CP)、レクチン(LP)、及び代替経路(AP)の機能に対するFcタンパク質の効果を、Wieslab^（Ｒ）補体系スクリーニング(Euro-Diagnostica、Malmo、Sweden)で調べ、これは共通読み出しとしてC5b-9の沈着を用いる３つの経路の特異的検出のための酵素イムノアッセイである。さらなる希釈を指示書に従って行い、すなわち、古典的及びレクチン経路について1:100及び代替経路について1:18であった。結果を正常ヒト血清(NHS)における活性化に対して比較した。

Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの両方が、古典的補体経路の完全活性化を阻害したが、レクチン経路でも代替経路でも有意な効果を示さなかった(図11A )。逆に、Fc単量体は、補体経路のいずれに対しても効果を有していなかった。試験サンプル(例えば、Fc-μTP-L309C又は対照サンプル)を含有する90% PBSを加えた10%正常ヒト血清を使用してプレインキュベーションを行い、そして5〜15分間37度でインキュベートした。次いで、サンプルをWieslab^（Ｒ）補体キット(レクチン経路)により提供されるアッセイ希釈緩衝液で1:10希釈した。その後、製造者の指示に従ってアッセイを行った。

しかし、レクチン経路に対して効果が観察されなかったのは驚くべきことであった。したがって我々は、上記の条件の最適化を以下のように進めた。最適なC4切断は、20%正常ヒト血清、試験サンプル(例えば、Fc-μTP-L309C又は対照サンプル)を含有する10% PBS及び70%ゼラチン・ベロナール緩衝液(GVB^2+、0.15 mM CaCl₂、0.5 mM MgCl₂)使用して１時間37度で達成された。次いで、Wieslab^（Ｒ）補体キット(レクチン経路)により提供されるアッセイ希釈緩衝液を用いてサンプルを1:20希釈した。その後、製造者の指示に従ってアッセイを行った。図20A及びBに示されるように、最適化されたプレインキュベーションは、さらに（5〜15分の代わりに）１時間インキュベートされたが、切断されたC4(C4aの生成により示される)の、以前に上で記載された非最適化条件(すなわち、10% NHS及び90%
PBS)よりもかなり高いレベルを生じた。その後、レクチン経路に対する強力な阻害性効果がC4枯渇により観察された。しかし、古典的経路の阻害は、古典的経路の活性化に必須であるC1qに対する非常に強い結合がある(実施例7Cに記載される)ので「非最適化」緩衝液条件を使用してすでに観察された。

図21Aに示されるように、Fc-μTP-L309Cは、古典的経路及びレクチン経路の活性化に対して強力な阻害効果を実証したが、代替経路の阻害は観察されなかった。Wieslab^（Ｒ）キットにおいて試験された同じサンプルにおいて、C4a及びC5aが測定された。最適化プレインキュベーション条件は最適なC4切断を誘導したが、C5aの生成は観察されなかった(図21B)。Wieslab^（Ｒ）の特異性は、示された補体タンパク質について枯渇された血清を使用して実証された(図21C)。図21Cに示されるように、C4の枯渇は、古典的経路及びレクチン経路の阻害（又は非機能性）を生じたが、代替経路はなお活性である。

B. Fcタンパク質は古典的補体経路による溶血を阻害する
古典的経路に対するFcタンパク質効果を調べるために、ヒツジ赤血球(Siemens)をウサギ抗ヒツジ抗体(Ambozeptor 6000; Siemens)で感作させ、そして4x10⁸細胞/mL GVB²⁺ (GVB、0.15 mM CaCl₂、0.5 mM MgCl₂)に希釈した。Fc単量体、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cによる溶血の阻害を評価するために、組み換えタンパク質を1/40希釈されたNHS中でプレインキュベーションし(室温で30分)、続いて1/1 (体積/体積)比で赤血球に加え、そして1時間の間37℃でマイクロタイタープレート振盪デバイスでインキュベートした。使用したFc単量体、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの濃度は、2.5、25、50、125、250、及び500 μg/mlであった。氷冷したGVBE (GVB、10 mM EDTA)を加えて遠心分離(1250 x g、4℃で5分)した後、放出されたヘモグロビンの吸光度を412 nmで測定し、そしてNHSにより誘導された溶血と比較することにより、溶血を上清において決定した。

代替経路に対するFc構築物効果を調べるために、ウサギ赤血球(Jackson Laboratories)を洗浄し、そして2x10⁸細胞/mL GVB/MgEGTA (GVB、5 mM MgEGTA)に希釈した。Fc単量体、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cによる溶血の阻害を評価するために、組み換えタンパク質を、1/6希釈されたNHS (室温で30分)中でプレインキュベートし、その後赤血球に2/1 (体積/体積)比で加え、そして1時間の間37℃でマイクロタイタープレート振盪デバイスでインキュベートした。使用したFc単量体、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの濃度は、250、500、及び1000 μg/mlであった。氷冷GVBEを加えて遠心分離(1250 x gで10分)した後、放出されたヘモグロビンの吸光度を412 nmで測定し、そしてNHSにより誘導された溶血と比較することにより、溶血を上清において決定した。

Fc単量体は、古典的補体経路を介したヒツジ赤血球の溶血に対して効果を有しておらず、そして溶血のレベルは、NHSのみを用いたレベルと同等であった。反対に、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cは両方とも、NHSにより誘導される溶血を大いに阻害した(図10A)。2.5 μg/mlに等しいか又はそれ以上の濃度で、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cは両方とも、同じ濃度のFc単量体の存在下で起こった溶血の両と比較して70%より多く溶血を阻害した(表2に示される)。Fc単量体もFcタンパク質のいずれも、ウサギ赤血球における代替補体経路を阻害しなかった(図10B)。

C. C1qへのFc多量体結合
古典的補体経路に対するFcタンパク質の効果を、C1qへの結合を評価することにより調べた。Fcタンパク質のC1qへの結合をELISAにより分析した(Inova Diagnostics、San Diego、CA)。ウェルをヒトC1qでプレコーティングし、そしてFcタンパク質(<16 μg/mL)を加えて結合させた。全ての未結合タンパク質を除去するためにウェルを洗浄した後、精製したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgG結合体を加えた。未結合タンパク質をさらなる洗浄工程により除去し、そして結合した結合体を3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン(TMB)基質を用いて可視化した。Fc多量体は、Fc単量体と比較してC1qへの高度な結合を実証した(図11B)。

D. 古典的補体経路に対するFc多量体効果
補体に対するFc構築物の効果を、ヒト全血及びヒト血清において評価した。アッセイのために、全NHSをGVB²⁺緩衝液(Complement Tech)で1:5希釈した。血清におけるヒト補体の活性化を、ELISA(Quidel、San Diego、CA)によりC3a、C4a及びC5aの生成により分析した。ヒト全血における補体活性化の分析は、補体活性化に影響を及ぼさない高度に特異的なトロンビン阻害剤である組み換えヒルジンを用いた抗凝固に基づくものであった。NHSと同様に、全血をGVB²⁺緩衝液で1:5希釈した。補体活性化をELISA(Quidel)によりC4a及びsC5b-9の生成により分析した。

ヒト全血を様々な濃度のFc-μTP又はFc-μTP-L309Cとともに２時間インキュベーションすることにより、補体タンパク質C4のC4aへの切断が誘導されたが、sC5b-9の増加は観察されなかった(図11C)。同様の結果がヒト血清において見られた(図12A)。Fc単量体又はIVIGのいずれもC4の切断もsC5b-9の形成も誘導しなかった(図11C)。

E. Fc多量体は完全古典的補体経路の活性化を阻害する
熱凝集IgG(HAGG)は古典的補体経路の公知の活性化因子である。ヒト血清又は全血のFc-μTP又はFc-μTP-L309Cとのプレインキュベーションは、HAGGによるC4aの生成に影響を及ぼさなかった(示されていない)が、sC5b-9(図11D)及びC5a(図12B)の減少したレベルにより示されるように、古典的補体経路のさらなる下流活性化を完全に防止した。Fc多量体は、ヒト全血においてHAGG誘導sC5b-9生成を80%より多く阻害した。反対に、Fc単量体及びIVIGは、HAGGによるsC5b-9レベルの誘導に対して効果を有していなかった(図11D)。これらの結果は、六量体Fcが、C1複合体の活性化及びC4の切断とともに、C1qへの結合により古典的経路の活性化を誘導したが、下流補体活性化が検出できなかったので、C3転換酵素(C4b2a)の形成はなかったようである。

C3転換酵素を形成するために、C4及びC2はC1により切断されることが必要である。図11Cに示されるように、C4はFcタンパク質とのヒト全血のインキュベーションにより切断された。C2切断を調べるために、C2のレベルを、Fc単量体、Fc-μTP、又はFc-μTP-L309Cと２時間インキュベートされたヒト血清においてウェスタンブロット法により測定した。等量のヒト血清(レーンあたり1 μl血清)をロードし、そして4〜12% SDS-PAGE(Invitrogen)により分離した。等しいローディングは、抽出されたゲルをGelCode Blue染色試薬(ThermoScientific)を用いて染色することにより確認した。次いでゲルをPVDF膜(Invitrogen）に移した。その後、膜をSuperblock (ThermoScientific)でブロックし(４℃でON)、そして補体タンパク質C2に対する一次マウス抗体(R&D Systems、Superblockで1:1’000希釈)とともにインキュベートし（室温で２時間）た。膜を洗浄し(PBS + 0.05% Tween20)、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギポリクローナル抗マウスIgG (Dako、Superblockで1:1,000希釈)とともにインキュベートした（室温で２時間）。最後に、膜を化学発光検出キット(SuperSignal West Pico chemiluminescent、ThermoScientific)を用いて現像した。

HAGGとのヒト血清のインキュベーション後に、古典的経路が活性化され、そしてC2は、約100 kDのC2バンド(未切断C2の分子量)の消失により示されるように切断された(図11E)。Fc多量体もFc単量体のいずれもC2の顕著な切断を誘導しなかった。血清がHAGGとFc-μTP又はFc-μTP-L309Cのいずれかとインキュベートされた場合、C2切断は阻害された(図11E)。反対に、Fc単量体の添加は、HAGGにより誘導されるC2の切断に対して効果を有していなかった。これらのデータは、流体相において、Fc多量体がC2切断を阻害し、それによりC3転換酵素の形成及びその後の古典的補体経路の活性化工程を防止することを示唆する。

実施例8: Fc多量体は内皮細胞での補体沈着を阻害する
Fc多量体が細胞での補体沈着を防止するかどうかを調べるために、アッセイを使用してヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)での補体フラグメントの沈着について試験した。HUVECをLonza (Lonza、Visp、Switzerland)から購入し、そして製造者の説明に従って培養した。C3b沈着の分析のために、HUVECを抗CD105(Endoglin) mAb (Abcam)を用いてオプソニン化した後、ベロナール緩衝食塩水で希釈された(1:5)正常ヒト血清(Quidel)とともに30〜60分間37℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、そしてC3b沈着をFITC結合抗C3c mAb (Dako)を使用して検出し、そしてフローサイトメトリーにより定量した。

Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cを含有する血清とのオプソニン化HUVECのインキュベーションはC3b沈着の用量依存性阻害を生じたが、単量体FcはC3bの沈着を防止しなかった(図11F)。全体に、これらのデータは、古典的補体経路の完全活性化の阻害が、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cが炎症を減少させるエフェクター機構の１つであり得るということを示唆する。

実施例9: Fc多量体はインビボでFcγR発現を阻害する
上記のCAbIA関節炎モデルにおけるFcγR発現に対するFcタンパク質の効果を調べた。上記のように、CAbIAを有するマウスを６日目にPBS(未処置対照)、Fc-μTP、又はFc-μTP-L309Cで処置した(図7A)。好中球及び単球/マクロファージを関節及び血液から８日目に得た。フローサイトメトリーは、未処置(PBS)関節炎マウスと比較して、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cを投与されたマウスから採取された関節及び血液の両方からの好中球及び単球/マクロファージによるCD16/32 (FcγRIII/ FcγRII)表面発現の有意な減少を示した(図13A)。関節好中球、関節単球/マクロファージ、及び血液好中球でのCD16/32 (FcγRIII/ FcγRII)発現は、PBSを投与された関節炎マウスと比較して、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cで処置された関節炎マウスにおいて50%より多く低かった。血液単球でのCD16/32 (FcγRIII/ FcγRII)発現は、PBSを投与された関節炎マウスと比較して、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cで処置されたマウスにおいて25%より多く低かった。

高親和性FcγR、CD64 (FcγRI)はまた、未処置関節炎マウスと比較して、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cで処置されたマウスにおいて関節炎好中球(50%より多い)及び血液単球/マクロファージ(75%より多い)で有意に減少された(図13A)。これらのデータは、Fc-μTP又はFc-μTP-L309CによるFcγR発現の下方調節、又はFcR遮断のいずれかを示唆し得る。

実施例10: Fc多量体はインビトロでFcγR機能を阻害する
ヒトインビトロ系を使用して、FcγR機能に対するFcタンパク質の効果を調べた。ヒト好中球を、健常ボランティアから得られた抗凝固処理した血液サンプルのバフィーコート画分(Regional Red Cross Blood Donation Center、Bern、Switzerland)からデキストラン沈降(MW 450〜650 kD)、続いてFicoll勾配遠心分離により単離した。残りの赤血球の低浸透圧溶解後に沈降から好中球を得た。呼吸性バーストを、試験品を三連でマイクロタイタープレートのウェルにピペットで移し、続いてルミノール溶液(Sigma)に予め加えられた精製した好中球を移すことにより測定した。化学発光を37℃で90分間記録し、シグナル対時間曲線下の面積を計算し、そして結果をRLU(相対的光単位)として表した。ポジティブコントロールとして、ヒトIgG(CSL Behring)とともに予めインキュベートされたウサギ赤血球(Charles River)を使用した。抗ウサギ赤血球特異的ヒトIgG 抗体は赤血球に特異的に結合し、したがってFcγR特異的な様式でヒト好中球を活性化する。

ヒトIgG処理されたウサギ赤血球により活性化された好中球の呼吸性バーストの阻害を測定するために、好中球を阻害剤(Fc単量体、Fc-μTP又はFc-μTP-L309C)とともに15分間37℃でプレインキュベートし、その後ルミノール溶液及びIgG処理ウサギ赤血球を加え、そして化学発光を上記のように記録した。

ヒト好中球を、Fc-μTP又はFc-μTP-L309CのいずれかとともにIgG被覆ウサギRBCの存在下又は存在しない場合にインキュベートし、そして呼吸性バーストを好中球活性化の尺度として使用した。Fcタンパク質は、IgG被覆ウサギRBCが刺激することができた条件下で呼吸性バーストを刺激することができなかった(図13B)。さらに、両方のFc多量体が、IgG被覆ウサギRBCに応じた呼吸性バーストの活性化を阻害した(図13C)。

第二に、FcγR機能のFcタンパク質の効果を、オプソニン化(抗-D処理O+)ヒト赤血球のAb依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)を読み出しとして使用して評価した。末梢血単核細胞(PBMC)を、血液型O型の健常ボランティアから得られたバフィコート(Regional Red Cross Blood Donation Center、Bern、Switzerland)からFicoll勾配遠心分離により単離した。その後、PBMCはポリスチレン上の粘着性により単球を枯渇させた。得られたリンパ球はエフェクター細胞と考えられる。標的細胞として、血液型O型ボランティアの精製されたヒトRh(D)+赤血球(RBC)(Regional Red Cross Blood Donation Center、Bern、Switzerland)を使用した。RBCをCFSE (Molecular Probes)で細胞内標識し、次いで抗D (Rhophylac CSL Behring AG)でオプソニン化した。

ADCCの阻害を評価するために、リンパ球を阻害剤(IVIG、Fc-μTP又はFc-μTP-L309C)とともに30分間37℃でプレインキュベートし、次いで混合物のアリコートを標的細胞をロードしたマイクロタイタープレートのウェルにエフェクター：標的比1:1で三連で加えた。マイクロタイタープレートを終夜37℃及び5% CO₂でインキュベートし、次いで遠心分離して上清を廃棄した。RBCを0.9% NaClで1回洗浄した後、1% TritonX100を用いて沈降物を溶解させた。溶解物のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルにピペットで移し、そして蛍光を決定した(励起480 nm/発光535 nm)。ADCCを対照サンプル(抗Dとのインキュベーションしない標識赤血球)及び100%溶解サンプル(TritonX100で処理された赤血球)を使用して計算した。

Fc-μTP及びFc-μTP-L309CはADCCを強く阻害したが、IVIGは最小の効果を有していた(図13D)。総合すれば、データは、FcγRの遮断がFc-μTP又はFc-μTP-L309Cの別の可能な抗炎症性エフェクター機構であるということを示唆する。

200 mg/kgでボーラスとして投与されたFc-μTP又はFc-μTP-L309Cは、フローサイトメトリーにより示されたように、CAbIA関節炎モデルにおいて8日目に抹消単球においてC5aR
(CD88)の上方調節を防止した(図13E)。

FcγR媒介食作用に対する機能的影響を評価した。THP1細胞を、IgG被覆FITC標識ラテックスビーズとともにIVIG又はFc-μTP-L309Cの存在下で3時間インキュベートした。その後、ビーズの取り込みをフローサイトメトリーにより分析した。図17に示されるように、Fc-μTP-L309CはIgG被覆ラテックスビーズの食作用の遮断においてIVIGよりかなりより強力であった。

実施例11: インビトロでの精製された白血球及びヒト全血に対するFcタンパク質の効果
精製されたヒト白血球（バフィコート）によるサイトカイン分泌に対するFcタンパク質の効果を、HAGGの存在下及び存在しない場合に6時間の培養後にLuminexアレイを使用して製造者の指示(Invitrogen)に従って評価した。培養上清又は血漿（ヒト全血アッセイ用）におけるサイトカイン/ケモカインレベルを、市販のヒトサイトカイン磁気30-plexパネル(Invitrogen Life Technologies、Paisley、UK)を使用して製造者の指示に従って測定した。パネルは以下の検体からなるものであった: GM-CSF、IL-2、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6、MIP-1α、MIP-1β、エオタキシン、RANTES、MIG、VEGF、HGF、EGF、IL-8、IL-17、IL-1RA、IL-12 (p40/p70) IL-13、FGF-Basic、IFN-γ、G-CSF、MCP-1、IL-7、IL-15、IFN-α、IL-2R、IP-10、IL-10、IL-5。30のサイトカイン/ケモカインのうち、25はHAGGにより誘導されなかった。その後、HAGGにより誘導された5つのサイトカイン/ケモカイン(IL-1RA、MCP-1、MIP-1β、RANTES、及びIL-8)を分析した。Fcタンパク質は、IL-1RA、MCP-1、MIP-1β、RANTES、及びIL-8の分泌を誘導したが、HAGGよりもかなり低い量であった。

Fc単量体、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cのサイトカイン及びケモカイン分泌に対する効果を、ヒト全血を使用して分析した。補体系に干渉しない特異的トロンビン阻害剤ヒルジンを抗凝固剤として使用した。ヒト全血をFc-μTP及びFc-μTP-L309Cとともに終夜インキュベートした。以下の検体をにより製造者の指示(Invitrogen)に従って測定した: GM-CSF、IL-2、IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6、MIP-1α、MIP-1β、エオタキシン、RANTES、MIG、VEGF、HGF、EGF、IL-8、IL-17、IL-1RA、IL-12 (p40/p70) IL-13、FGF-Basic、IFN-γ、G-CSF、MCP-1、IL-7、IL-15、IFN-α、IL-2R、IP-10、IL-10及びIL-5。Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cは、IL-1β、TNF-α、IL-6、MIP-1α、MIP-1β、エオタキシン、RANTES、MIG、HGF、IL-8、IL-1RA、IL-12 (p40/p70)、IL-13、IFN-γ、G-CSF、MCP-1,IL-15、IFN-α、IL-2R、IP-10及びIL-10の検出可能なレベルを誘導した。以下の検体は、LPS (100 ng/mL; Sigma、E.coli 0111:B4、γ線照射;カタログ番号L4391)によるよりも、Fc-μTP及びFc-μTP-L309C (1 mg/mLの最も高い濃度を使用した)によりかなり低い量で誘導された: IL-1β、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、IL-1RA、IL-12 (p40/p70)、G-CSF及びIL-10。

Fcタンパク質はどれも、フローサイトメトリーを使用してP-セレクチン(CD62P)の上方調節により測定して血小板を活性化しなかったので、この応答は、ヒトにおいてFcγRIIA
(CD32A)を発現する夾雑血小板に起因するものではないようであった(図17)。血小板活性化を、フローサイトメトリー(BD FACSCanto II)による血小板表面上のP-セレクチン(CD62P)発現の測定により分析した。手短には、PRPを、300xgで10分間22℃での遠心分離によりクエン酸安定化ヒト血液から得た。血小板凝集を避けるために2.5 μg/ml (最終濃度)のAggrastatをPRPに加えた。PRPをFc単量体、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cとともに15分間インキュベートした。ポジティブコントロールとして、ADP (16 μM)及び／又はConvulxin (20 ng/ml)を使用した。

Ca²⁺流又はカルシウムの動員に対する効果を、精製されたヒト白血球を使用してFACSアッセイにおいて評価した。蛍光により細胞内カルシウム動員を検出することを可能にするカルシウム指標色素を細胞に負荷した。手短には、細胞をカルシウム指標色素Cal-520とともに60分間37℃でインキュベートし、洗浄し、そして5 ml HBSA/Hepesに再懸濁した。サンプルを平衡化した後、Fc-μTP及びFc-μTP-L309C又は熱凝集IgG(対照)を加え、そして蛍光を室温で示された時間記録した。細胞サブセットを前方散乱(FSC)及び側方散乱(SSC)を使用して識別した。図18に示されるように、Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cは好中球においてカルシウム動員を誘導しなかった。

実施例12: インビボでのサイトカイン及び肝臓毒性に対するFcタンパク質の効果
サイトカイン及び肝臓毒性に対するFcタンパク質のインビボ効果を、野生型ラット(CD系統)において調べた。ラットに25 mg/kg用量のFc-μTP若しくはFc-μTP-L309C、250 mg/kg用量のIVIG、又は0.9% NaClを投与した。ラット血漿におけるサイトカインケモカインレベルを、市販のラットサイトカイン磁気24-plexパネル(BioRad)を使用して製造者の指示に従って測定した。パネルは以下の検体からなるものであった: EPO、G-CSF、GM-CSF、GRO/KC、IFN-γ、IL-1α、L-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A、IL-18、M-CSF、MCP-1、MIP-1α、MIP-3α、RANTES、TNF-α、VEGF。肝臓毒性マーカーを、市販のラット5-plexパネル(Merck Millipore)を使用して製造者の指示に従って測定した。パネルは以下の検体を含むものであり: 肝臓型アルギナーゼ1 (ARG1)、アスパラギン酸トランスアミナーゼ1 (GOT1)、α-グルタチオン S-トランスフェラーゼ(GSTα)、ソルビトールデヒドロゲナーゼ(SDH)、5’-ヌクレオチダーゼ/CD73 (5’-NT)、そして分析を製造者の指示(Merck Millipore)に従って行った。表3に示されるように、測定された24のサイトカインのいずれも、静脈内投与された25 mg/kgの使用された用量でFc多量体により上方調節されなかった。さらに、アスパラギントランスアミナーゼ1(GOT1)及び5’-ヌクレオチダーゼ/CD73 (5’-NT)のみ検出されたが、IVIGに匹敵する非常に低いレベルであった(表4に示される)。

さらに、サイトカイン及び肝臓毒性のマーカーを、100 mg/kg i.v.のIVIG、Fc-μTP又はFc-μTP-L309Cを投与されたFcRn^-/-、hFcRN^tg/+ マウスにおいて評価した。マウス血漿におけるサイトカイン/ケモカインレベルを、市販のマウスサイトカインluminexキット(Merck Millipore)を使用して製造者の指示に従って測定した。パネルは以下の検体からなるものであった: G-CSF、GM-CSF、IFNγ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-9、IL12p70、LIX/CXCL5、IL-15、IL-17、IP-10/CXCL10、KC/CXCL1、M-CSF、MIP-2/CXCL2/3、MIG/CXCL9、Rantes/CCL5、VEGF。肝臓毒性を評価するために、以下のマーカーをCOBASを使用して評価した: ALT、AST、LDH、ビリルビン、C-反応性タンパク質。測定された全てのマーカーについて、検出されたレベルはIVIGの投与後に観察されたものに匹敵した。

実施例13: Fc多量体は重症筋無力症のマウスモデルにおいて治療効果を生じる
Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの保護有効性を重症筋無力症のマウスモデルにおいて試験した。マウスにおける実験的自己免疫重症筋無力症(EAMG)は、例えば、ゴマフシビレエイ（Torpedo californica）の電気器官からアフィニティクロマトグラフィーにより精製され、完全フロイントアジュバントに乳化されたアセチル-コリン受容体(ACHR)を皮下（s.c.）で１日目に免疫し、続いて最初の免疫の26日後に不完全フロイントアジュバント中のAChRで追加免疫することにより誘導される。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cを予防的又は治療的に適用した。EAMGの臨床徴候を、例えばM. Thiruppathi et al、J. Autoimmunity 2013に記載されるようにスコア付する: 臨床試験については、マウスは２分間平らな台の上で観察された。次いで、ケージ上部の格子を通して尾の基部により吊るされたマウスを繰り返し（20〜30回）徐々に引っ張ることにより、格子を掴もうとするので運動させた。次いでそれらを平らな台に2分間置き、そして再びEAMGの徴候を観察した。臨床的筋力低下を以下のように等級分けした: グレード0 - ベースライン及び運動後に正常な姿勢、筋力、及び移動性を有するマウス; グレード1 - 安静時は正常であるが、運動後に脊柱後湾姿勢、制限された移動性、及び頭部を起こすことの困難性により特徴的に示される筋力低下を有する; グレード2 - 観察期間の間に運動せずにグレード１の症状; グレード3 - グレード2の低下とともに脱水及び瀕死; 並びにグレード4 - 死亡。

Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cでの処置は、EAMGの臨床経過を有意に改善する。自己抗体及び炎症マーカーは下方調節される。処置はEAMGの抑制において少なくともIVIgと同程度に有効である。

実施例14: Fc多量体は強皮症のマウスモデルにおいて治療効果をもたらす
Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの保護有効性を強皮症のマウスモデルにおいて試験した。マウスにおける実験的強皮症は、例えばRuzek et al、Arth Rheumat 2004:50; 4; 1319-31において記載されるように誘導される。脾臓をB10.D2から採取し、そして組織を適切な方法により単細胞に分離する。赤血球を溶解し、そして2-5x107 B10.D2 (GVHの誘導のため)をレシピエントBALB/c RAG-2 KOマウスに静脈内注射した。5〜9週間の間に、特に四肢の皮膚肥厚の増加、内蔵の進行性線維症、皮膚及び内蔵における血管収縮及び血管マーカーの変更された発現、皮膚及び内蔵における炎症、並びに自己抗体生成のようなヒト強皮症に似た症状及び病理組織学的変更が起こった。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cは予防的又は治療的に適用される。

Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cでの処置は、皮膚及び内蔵の組織学的変更を有意に軽減／改善し、そして血管及び炎症の変更を改善する。

実施例15: Fc多量体は自己免疫性腎臓病のマウスモデル(抗糸球体基底膜自己抗体（anti-glomerular base membrane autoantibodies）により誘導される)において治療効果をもたらす
Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cの保護有効性を、補体媒介疾患、例えば抗糸球体基底膜自己抗体により媒介される腎臓病のマウスモデルにおいて試験した。抗糸球体抗体を、マウス糸球体で免疫されたウサギの血漿から精製した。マウスに0日目にウサギ抗糸球体抗体を静脈内注射し、抗ウサギIgGを6日目に注射して抗糸球体抗体を架橋した。急性及び慢性アルブミン尿を、それぞれ7日目及び30日目に腎臓疾患の尺度として評価した。Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cは予防的又は治療的に適用される。

Fc-μTP及びFc-μTP-L309Cでの処置はアルブミン尿を有意に減少させる。

Claims (24)

1. ６つのＦｃ融合単量体を含む六量体タンパク質であって、ここで各Ｆｃ融合単量体は、配列番号１、配列番号２、又は５つまでの保存的アミノ酸変化を有する配列番号１もしくは配列番号２の変異体の２つのポリペプチド鎖を含み、タンパク質はＦａｂポリペプチドを含まない、上記六量体タンパク質。
2. タンパク質は補体成分Ｃ１ｑに結合し、そしてＣ１ｑに結合するタンパク質は、古典的補体経路の完全なカスケードの活性化を誘導しない、請求項１に記載の六量体タンパク質。
3. Ｃ１ｑに結合するタンパク質は、Ｃ４を切断するが、Ｃ２の大部分の切断を誘導しない、請求項２に記載の六量体タンパク質。
4. Ｃ２の切断を誘導しない、請求項２又は３に記載の六量体タンパク質。
5. 正常ヒト血清とインキュベートされた熱凝集ＩｇＧにより誘導されたＣ２の大部分の切断を阻害する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
6. Ｃ１ｑに結合するタンパク質はＣ３転換酵素の形成を生じない、請求項２に記載の六量体タンパク質。
7. 全血とともにインキュベートされたタンパク質１ｍｇ／ｍｌが、全血とともにインキュベートされた熱凝集ＩｇＧにより誘導された可溶性Ｃ５ｂ−９生成と比較して、２０％未満の可溶性Ｃ５ｂ−９生成を誘導する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
8. 全血とともにインキュベートされたタンパク質が、 全血とともにインキュベートされた熱凝集ＩｇＧにより誘導される可溶性Ｃ５ｂ−９生成と比較して１０％未満の可溶性Ｃ５ｂ−９生成を誘導する、請求項２〜７のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
9. Ｃ５ｂ−９生成を阻害する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
10. 全血とともにインキュベートされた熱凝集ＩｇＧにより誘導されるＣ５ｂ−９生成を阻害する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
11. 熱凝集ＩｇＧで活性化された正常ヒト血清と比較して、古典的補体経路を２０％未満活性する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
12. マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおいて６日目の２００ｍｇ／ｋｇのタンパク質の投与が：
    ａ） ７〜１４日目のいずれかにおける臨床スコアの減少；
    ｂ） ７〜１４日目に計算された平均臨床スコアの減少；
    ｃ） ８日目に膝関節から回収されるＣＤ４５＋細胞の数の減少；又は
    ｄ） ８日目又は１４日目における足首関節の組織学的スコアの減少
    を誘導し、ここで六量体タンパク質を投与されたマウスは、未処置関節炎マウスと比較される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
13. マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける６日目の２００ｍｇ／ｋｇのタンパク質の投与が：
    ａ） ７〜１４日目のいずれかにおける臨床スコアの５０％より大きい減少；
    ｂ） ７〜１４日目に計算される平均臨床スコアの５０％より大きい減少；
    ｃ） ８日目に膝関節から回収されるＣＤ４５＋細胞の数の５０％より大きい減少；又は
    ｄ） ８日目の足首関節の組織学的スコアの２５％より大きい減少及び／又は１４日目の足首関節の組織学的スコアの５０％より大きい減少
    を誘導し、ここで六量体タンパク質を投与されたマウスは、未処置の関節炎マウスと比較される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
14. 配列番号３の２つのポリペプチドを含む組み換えＦｃ単量体と比較して、古典的補体経路についての溶血アッセイにおいてオプソニン化ヒツジ赤血球の溶解を阻害する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
15. ０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、古典的補体経路についての溶血アッセイにおいてオプソニン化ヒツジ赤血球の溶解を、配列番号３の２つのポリペプチドを含む組み換えＦｃ単量体と比較して７０％より多く阻害する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
16. 好中球又は単球でのＦｃγＲＩＩ発現又はＦｃγＲＩＩＩ発現の減少を誘導する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
17. マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける６日目の２００ｍｇ／ｋｇのタンパク質の投与が、８日目に好中球又は単球でＦｃγＲＩＩレベル又はＦｃγＲＩＩＩレベルの５０％より大きい減少を誘導し、ここで六量体タンパク質を投与されたマウスは、未処置の関節炎マウスと比較される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
18. 単球におけるＣ５ａＲ（ＣＤ８８）の上方調節を阻害する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
19. マウス抗コラーゲン抗体誘導関節炎モデルにおける６日目の２００ｍｇ／ｋｇのタンパク質の投与が、８日目に単球におけるＣＤ６４レベルの減少を誘導し、ここで六量体タンパク質を投与されたマウスは、未処置の関節炎マウスと比較される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の六量体タンパク質。
20. 治療有効量の、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の六量体タンパク質を含む医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体において自己免疫疾患又は炎症性疾患を処置する方法。
21. 医薬組成物は静脈内又は非静脈内に投与される、請求項２０に記載の方法。
22. 医薬組成物は皮下投与される、請求項２１に記載の方法。
23. 自己免疫疾患又は炎症性疾患が、免疫性血球減少症、ギラン・バレー症候群、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、重症筋無力症、炎症性ニューロパチー、視神経脊髄炎、他の自己免疫性チャネル病、自己免疫性てんかん、皮膚筋炎、多発性筋炎、天疱瘡、類天疱瘡、全身性エリテマトーデス、移植、再灌流傷害及び関節リウマチから選択される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 医薬組成物が１０ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与される、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。