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JP2019501208A - 呼吸器合胞体ウイルスワクチン - Google Patents

呼吸器合胞体ウイルスワクチン Download PDF

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Abstract

本開示は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）リボ核酸（ＲＮＡ）ワクチン、ならびに当該ワクチンを使用する方法及び当該ワクチンを含む組成物に関する。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１５年１０月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／２４５，２０８号、２０１５年１０月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／２４７，５６３号、及び２０１５年１０月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／２４８，２５０号の利益を主張するものであり、各出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。本出願はまた、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１５年１０月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／２４５，０３１号の利益を主張するものであり、当該出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ属に属する一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスである。成人における症状は、典型的に副鼻腔感染症または感冒に似ているが、この感染症には症状がないこともある。高齢の成人（例えば、６０歳超）において、ＲＳＶ感染症は、細気管支炎または肺炎に進行し得る。子供における症状は、多くの場合、より深刻であり、細気管支炎及び肺炎が含まれる。米国では、ほとんどの子供が３歳までにＲＳＶに感染すると推定されている。ＲＳＶビリオンは、核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）及び大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）に結合したウイルスＲＮＡからなる内部ヌクレオカプシドから構成される。ヌクレオカプシドは、マトリックスタンパク質（Ｍ）に取り囲まれ、ウイルス融合（Ｆ）タンパク質及び吸着（Ｇ）タンパク質ならびに小型疎水性タンパク質（ＳＨ）が組み込まれた脂質二重層に内包されている。ウイルスゲノムはまた、Ｉ型インターフェロン活性を阻害する２つの非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）及びＭ２タンパク質をコードしている。
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ワクチン接種は、ＲＳＶ抗原などの外来抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答を刺激するために使用される１つの技術である。遺伝子操作されたＤＮＡ（例えば、ネイキッドプラスミドＤＮＡ）を生きている宿主に直接注入すると、宿主細胞うちの少数が抗原を直接産生し、その結果、防御免疫応答が生じる。しかしながら、この技術では、癌遺伝子の活性化または癌抑制遺伝子の抑制を引き起こし得る挿入突然変異誘発の可能性を含む、潜在的な問題が生じる。
本開示のＲＮＡワクチンを使用すると、例えば、挿入突然変異誘発の可能性というリスクを負うことなく、ＲＳＶに対して、細胞性免疫と体液性免疫の両方を含むバランスの取れた免疫応答を誘導することができる。
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、感染症の罹患率またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な環境で利用することができる。ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶの様々な遺伝子型、菌株及び分離株による感染を治療及び／または予防するために利用することができる。本明細書で提供されるＲＮＡワクチンは、市販の抗ウイルス治療法と比べて、抗体力価がより大きく、より早い応答をもたらす点で、優れた特性を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、本開示のＲＮＡワクチンは、ＲＮＡワクチンが天然の細胞機構を利用することから、翻訳の際に適切なタンパク質コンフォメーションを生じるように良好に設計されると考えられる。ｅｘ ｖｉｖｏで製造され、望ましくない細胞性応答を惹起し得る従来型ワクチンとは異なり、本明細書で提供されるＲＮＡワクチンは、より自然な方法で、細胞系にもたらされる。
本開示のいくつかの実施形態は、（ｉ）少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、ＲＳＶに対する免疫応答を惹起することができる免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む、ＲＳＶワクチンを提供する。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有する。
いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、糖タンパク質Ｇまたはその免疫原性断片である。
いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、糖タンパク質Ｆまたはその免疫原性断片である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、糖タンパク質Ｆであり、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、Ｇ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｌ、ＳＨ、Ｍ２、ＮＳ１及びＮＳ２から選択される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、糖タンパク質Ｆであり、少なくとも２つの抗原性ポリペプチドは、Ｇ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｌ、ＳＨ、Ｍ２、ＮＳ１及びＮＳ２から選択される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、アジュバントを更に含む。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８もしくは２５９に記載される少なくとも１つの核酸配列、または配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８もしくは２５９に記載される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するホモログによってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８もしくは２５９に記載される少なくとも１つの核酸配列、または配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８もしくは２５９に記載される核酸配列と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．８％または９９．９％）の同一性を有するホモログによってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８または２５９に記載される核酸配列の少なくとも１つの断片（例えば、少なくとも１つの抗原性配列または少なくとも１つのエピトープを有する断片）によってコードされる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号２６０〜２８０のうちのいずれかに記載される少なくとも１つの核酸配列、または配列番号２６０〜２８０のうちのいずれかに記載される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するホモログを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号２６０〜２８０のうちのいずれかに記載される少なくとも１つの核酸配列、または配列番号２６０〜２８０のうちのいずれかに記載される核酸配列と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．８％または９９．９％）の同一性を有するホモログを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号２６０〜２８０のうちのいずれかに記載される核酸配列の少なくとも１つの断片（例えば、少なくとも１つの抗原性配列または少なくとも１つのエピトープを有する断片）を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３または配列番号４に記載されるアミノ酸配列であるか、その断片であるか、当該配列に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の同一性を有するホモログである。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３または２４５に記載されるアミノ酸配列であるか、その断片であるか、当該配列に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の同一性を有するホモログである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する、抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する、抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する、抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する、抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する、抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する、抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有し、かつ膜融合活性を有する、抗原性ポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードしており、コドン最適化されたｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードし、（対応する）野生型ｍＲＮＡ配列に対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードし、野生型ｍＲＮＡ配列に対して７５％、８５％または９５％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードし、野生型ｍＲＮＡ配列に対して３０〜８０％、４０〜８０％、５０〜８０％、６０〜８０％、７０〜８０％、７５〜８０％または７８〜８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードし、野生型ｍＲＮＡ配列に対して３０〜８５％、４０〜８５％、５０〜８５％、６０〜８５％、７０〜８５％、７５〜８５％または８０〜８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列を有する抗原性ポリペプチドをコードし、野生型ｍＲＮＡ配列に対して３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、７５〜９０％、８０〜９０％または８５〜９０％の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、本開示の核酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸（例えば、ＤＮＡ）によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の核酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の核酸配列に対して少なくとも９６％の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の核酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の核酸配列に対して少なくとも９８％の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の核酸配列に対して少なくとも９９％の同一性を有する核酸によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の核酸配列に対して９５〜９９％の同一性を有する核酸によってコードされる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の配列を有する核酸によってコードされ、野生型ｍＲＮＡ配列に対して８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の配列を有する核酸によってコードされ、野生型ｍＲＮＡ配列に対して７５％、８５％または９５％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の配列を有する核酸によってコードされ、野生型ｍＲＮＡ配列に対して３０〜８０％、４０〜８０％、５０〜８０％、６０〜８０％、７０〜８０％、７５〜８０％または７８〜８０％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の配列を有する核酸によってコードされ、野生型ｍＲＮＡ配列に対して３０〜８５％、４０〜８５％、５０〜８５％、６０〜８５％、７０〜８５％、７５〜８５％または８０〜８５％未満の同一性を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドは、本開示の配列を有する核酸によってコードされ、野生型ｍＲＮＡ配列に対して３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％、７５〜９０％、８０〜９０％または８５〜９０％未満の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、本開示のアミノ酸配列を有し、かつ野生型ｍＲＮＡ配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する抗原性ポリペプチドをコードするが、野生型ｍＲＮＡ配列を含まない。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、当該ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有する。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、当該ＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾及び少なくとも１つの５’末端キャップを有し、当該ＲＳＶワクチンは、脂質ナノ粒子内に製剤化される。
いくつかの実施形態において、５’末端キャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾は、プソイドウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、Ｎ１−エチルプソイドウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質と、ＰＥＧ修飾脂質と、ステロールと、非カチオン性脂質とを含む。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質はイオン性カチオン性脂質であり、非カチオン性脂質は中性脂質であり、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、脂質は、
である。
いくつかの実施形態において、脂質は、
である。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも８０％は化学修飾を有し、任意選択により、脂質ナノ粒子内に製剤化される、ＲＳＶワクチンを提供する。
いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が化学修飾を有する。いくつかの実施形態において、化学修飾は、ウラシルの５位にある。いくつかの実施形態において、化学修飾は、Ｎ１−メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態において、化学修飾は、ウラシルの５位にあるＮ１−メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態において、オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％がＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾される。
本開示のいくつかの実施形態は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量でＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に投与することを含む、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答は、Ｔ細胞もしくはＢ細胞の応答またはその両方を含む。
いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答をもたらす方法は、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの単回投与を伴う。いくつかの実施形態において、方法は、ブースター用量のＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に投与することを更に含む。本発明によるブースターワクチンは、本明細書で開示される任意のＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを含み得、最初に投与されるＲＳＶ ＲＮＡワクチンと同じであり得る。いくつかの実施形態において、同じＲＳＶ ＲＮＡワクチンがＲＳＶのシーズンごとに毎年投与される。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、皮内、鼻腔内または筋肉注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、筋肉注射によって対象に投与される。
また、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法にて使用するためのＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンが本明細書で提供され、この方法は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量でＲＳＶワクチンを対象に投与することを含む。
更に、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法にて使用するための薬剤の製造におけるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの使用が本明細書で提供され、この方法は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量でＲＳＶワクチンを対象に投与することを含む。
本開示のいくつかの態様は、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で製剤化されたＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。
本開示の他の態様は、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で本明細書に記載されるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、１〜３ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、少なくとも２倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、少なくとも５倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、少なくとも１０倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、２〜１０倍増加する。
いくつかの実施形態において、対照は、ＲＳＶワクチンの投与を受けたことがない対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、弱毒化生ＲＳＶワクチンまたは不活化ＲＳＶワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、ＲＳＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／２に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／４に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１０に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１００に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１０００に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を１／２〜１／１０００に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、有効量は、２５μｇ〜１０００μｇ、または５０μｇ〜１０００μｇ、または２５〜２００μｇの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、４００μｇ、８００μｇまたは１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計２回投与される、２５μｇの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計２回投与される、５０μｇの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計２回投与される、１００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計２回投与される、２００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計２回投与される、４００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計２回投与される、５００μｇの用量である。
いくつかの実施形態において、対象に投与される有効量は、５０μｇ〜１０００μｇの総用量（ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン）である。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶに対するＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効性（または有効率）は、６０％超である。
ワクチン有効性は、標準的な分析を使用して評価することができる（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７−１０参照）。例えば、ワクチン有効性は、二重盲検無作為化比較臨床試験によって決定することができる。ワクチン有効性は、非接種者（ＡＲＵ）と接種者（ＡＲＶ）の試験コホート間の罹患率（ＡＲ）の比例的低下で表すことができ、次式を使用して、接種者群における疾患の相対危険度（ＲＲ）から算出することができる。
有効性＝（ＡＲＵ−ＡＲＶ）／ＡＲＵ×１００、及び
有効性＝（１−ＲＲ）×１００
同様に、ワクチン有効率は、標準的な分析を使用して評価することができる（例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２０１０ Ｊｕｎ １；２０１（１１）：１６０７−１０参照）。ワクチン有効率は、ワクチン（ワクチンの有効性の高さが既に証明されている場合もある）が集団においてどの程度疾患を低下させるかの評価である。この尺度は、ワクチン自体だけではなく、予防接種プログラムの利点と有害作用の正味のバランスを比較臨床試験よりも自然な条件下で評価することができる。ワクチン有効率は、ワクチン有効性（効力）に比例するが、集団中の標的群がどの程度良好に免疫化されているかということに影響され、また、入院、外来診察または費用の「実際の」結果に影響を与える他の非ワクチン関連因子にも影響される。例えば、一連の感染症例と適切な対照との間の接種率を比較する、後ろ向き症例対照分析を使用することができる。ワクチン有効率は、ワクチン接種を受けたにもかかわらず感染症を発症したオッズ比（ＯＲ）を使用した率差として表すことができる。
有効率＝（１−ＯＲ）×１００
いくつかの実施形態において、ＲＳＶに対するＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効性（または有効率）は、６５％超である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶに対するワクチンの有効性（または有効率）は、７０％超である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶに対するワクチンの有効性（または有効率）は、７５％超である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶに対するワクチンの有効性（または有効率）は、８０％超である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶに対するワクチンの有効性（または有効率）は、８５％超である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶに対するワクチンの有効性（または有効率）は、９０％超である。
いくつかの実施形態において、ワクチンは、１年まで（例えば、１回のＲＳＶシーズンの間）、対象をＲＳＶに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、最大２年間、対象をＲＳＶに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、２年を超える間、対象をＲＳＶに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、３年を超える間、対象をＲＳＶに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、４年を超える間、対象をＲＳＶに対して免疫にする。いくつかの実施形態において、ワクチンは、５〜１０年間、対象をＲＳＶに対して免疫にする。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの投与を受ける対象は、約５歳以下であるか、約１歳〜約５歳の間の年齢（例えば、約１、２、３、４、５または６歳）であるか、約６ヶ月〜約１歳の間の年齢（例えば、約６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月）であるか、約６ヶ月以下であるか、約１２ヶ月以下（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２ヶ月または１ヶ月）である。いくつかの実施形態において、対象は、正期産（例えば、約３７〜４２週）で生まれている。いくつかの実施形態において、対象は、妊娠約３６週より前（例えば、約３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６または２５週）の早産で生まれたか、対象は、妊娠約３２週より前に早産で生まれたか、対象は、妊娠約３２週〜約３６週の間の早産で生まれている。
いくつかの実施形態において、対象は、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの投与を受けるとき、妊娠している（例えば、第１期、第２期、第３期）。ＲＳＶは、主に乳幼児において、下気道の感染症を引き起こす。ＲＳＶ関連死の１／３が生後１年で発生し、これらの死亡例の９９％が低資源国で生じている。米国では極めて一般的であるため、ほぼ全ての子供が２歳の誕生日を迎える前にこのウイルスに感染する。したがって、本開示は、ＲＳＶに対する母子感染予防を改善する母体免疫化のためのＲＳＶワクチンを提供する。
いくつかの実施形態において、対象は、慢性肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息）を有する。ＣＯＰＤには、粘液性の長期咳嗽を伴う慢性気管支炎、及び経時的な肺への損傷を伴う肺気腫の２つの形態がある。したがって、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの投与を受ける対象は、慢性気管支炎または肺気腫を有し得る。
いくつかの実施形態において、対象は、ＲＳＶに曝露したことがある、ＲＳＶに感染しいる、またはＲＳＶによる感染のリスクがある。
いくつかの実施形態において、対象は、免疫不全状態である（免疫系の障害、例えば、免疫系疾患または自己免疫疾患がある）。
いくつかの実施形態において、対象は、約６０歳、約７０歳またはそれ以上の年齢（例えば、約６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０歳）の高齢者対象である。
いくつかの実施形態において、対象は、約２０歳〜約５０歳の間の年齢（例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０歳）の若年成人である。
本開示のいくつかの態様は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドに連結されたシグナルペプチドを含有するＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。したがって、いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ＲＳＶ抗原性ペプチドに連結されたシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含有する。また、本明細書で開示されるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンをコードする核酸も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、ＲＳＶ吸着タンパク質（Ｇ）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、ＲＳＶ融合（Ｆ）糖タンパク質またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、核タンパク質（Ｎ）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、リンタンパク質（Ｐ）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、マトリックスタンパク質（Ｍ）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、小型疎水性タンパク質（ＳＨ）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、非構造タンパク質１（ＮＳ１）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ペプチドは、非構造タンパク質２（ＮＳ２）またはその免疫原性断片である。
いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＩｇＥシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＩｇＥ ＨＣ（Ｉｇ重鎖ε−１）シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号２８１）を有する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＩｇＧκシグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２８２）を有する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列ＴＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡＴＡＣＣＡＣＣＧＧＣ（配列番号２８７）またはＡＵＧＧＡＧＡＣＵＣＣＣＧＣＵＣＡＧＣＵＧＣＵＧＵＵＵＵＵＧＣＵＣＣＵＣＣＵＡＵＧＧＣＵＧＣＣＧＧＡＵＡＣＣＡＣＣＧＧＣ（配列番号２８８）によってコードされる。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、日本脳炎ＰＲＭシグナル配列（ＭＬＧＳＮＳＧＱＲＶＶＦＴＩＬＬＬＬＶＡＰＡＹＳ、配列番号２８３）、ＶＳＶｇタンパク質シグナル配列（ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＡ、配列番号２８４）及び日本脳炎ＪＥＶシグナル配列（ＭＷＬＶＳＬＡＩＶＴＡＣＡＧＡ、配列番号２８５）から選択される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣ（配列番号２８９）である。
また、膜結合呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質、膜結合ＤＳ−Ｃａｖ１（安定した融合前のＲＳＶ Ｆタンパク質）または膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質と膜結合ＤＳ−Ｃａｖ１の組み合わせをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む、ＲＳＶワクチンが本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号５の配列及び／または配列番号７の配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量（例えば、ＲＳＶワクチンの単回用量）は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、２倍〜２００倍（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００倍）のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの単回用量は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、約５倍、５０倍または１５０倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの単回用量は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、約２倍〜１０倍または約４０〜６０倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、血清中和抗体は、ＲＳＶ Ａ及び／またはＲＳＶ Ｂに対するものである。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に製剤化される（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２４５１０７Ａ１号及び国際出願第ＷＯ２０１０／０５４４０１号参照）。
また、対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法が本明細書で提供され、この方法は、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で、膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質、膜結合ＤＳ−Ｃａｖ１（安定した融合前のＲＳＶ Ｆタンパク質）または膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質と膜結合ＤＳ−Ｃａｖ１の組み合わせをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、ブースター用量のＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与することを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、第２のブースター用量のＲＳＶワクチンを投与することを更に含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の有効性は、フラジェリンアジュバントと組み合わされたとき、特に、１つ以上の抗原をコードするｍＲＮＡが、フラジェリンをコードするｍＲＮＡと組み合わされたとき、著しく向上し得る。
フラジェリンアジュバント（例えば、ｍＲＮＡコード化フラジェリンアジュバント）と組み合わされたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、市販のワクチン製剤と比べて、抗体力価がより大きく、より早い応答をもたらし得る点で、優れた特性を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、ＲＮＡワクチン、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンが天然の細胞機構を利用することから、翻訳の際に抗原及びアジュバントの両方にとって適切なタンパク質コンフォメーションを生じるように良好に設計されると考えられる。ｅｘ ｖｉｖｏで製造され、望ましくない細胞性応答を惹起し得る従来型ワクチンとは異なり、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、より自然な方法で、細胞系にもたらされる。
本開示のいくつかの実施形態は、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片（例えば、抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、フラジェリンアジュバントをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）とを含む、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのフラジェリンポリペプチド（例えば、コードされたフラジェリンポリペプチド）は、フラジェリンタンパク質である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのフラジェリンポリペプチド（例えば、コードされたフラジェリンポリペプチド）は、免疫原性フラジェリン断片である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのフラジェリンポリペプチド及び少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、単一のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドによってコードされる。他の実施形態において、少なくとも１つのフラジェリンポリペプチド及び少なくとも１つの抗原性ポリペプチドは、異なるＲＮＡポリヌクレオチドによってそれぞれコードされる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのフラジェリンポリペプチドは、配列番号１７３〜１７５の配列を有するフラジェリンポリペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸ワクチンは、化学修飾されている。他の実施形態において、核酸ワクチンは、修飾されていない。
更に他の態様は、第１の呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含み、当該ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素を含まず、ワクチンにアジュバントが共配合または共投与されない、対象にワクチン接種を行うための組成物及びその方法を提供する。
他の態様において、本発明は、第１のウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含み、１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの用量の核酸ワクチンが対象に投与される、対象にワクチン接種を行うための組成物及びその方法である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドの用量は、１〜５μｇ、５〜１０μｇ、１０〜１５μｇ、１５〜２０μｇ、１０〜２５μｇ、２０〜２５μｇ、２０〜５０μｇ、３０〜５０μｇ、４０〜５０μｇ、４０〜６０μｇ、６０〜８０μｇ、６０〜１００μｇ、５０〜１００μｇ、８０〜１２０μｇ、４０〜１２０μｇ、４０〜１５０μｇ、５０〜１５０μｇ、５０〜２００μｇ、８０〜２００μｇ、１００〜２００μｇ、１２０〜２５０μｇ、１５０〜２５０μｇ、１８０〜２８０μｇ、２００〜３００μｇ、５０〜３００μｇ、８０〜３００μｇ、１００〜３００μｇ、４０〜３００μｇ、５０〜３５０μｇ、１００〜３５０μｇ、２００〜３５０μｇ、３００〜３５０μｇ、３２０〜４００μｇ、４０〜３８０μｇ、４０〜１００μｇ、１００〜４００μｇ、２００〜４００μｇまたは３００〜４００μｇ／用量である。いくつかの実施形態において、核酸ワクチンは、皮内注射または筋肉注射によって対象に投与される。いくつかの実施形態において、核酸ワクチンは、０日目に対象に投与される。いくつかの実施形態において、第２の用量の核酸ワクチンが２１日目に対象に投与される。
いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、２５μｇの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、１００μｇの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、５０μｇの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、７５μｇの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、１５０μｇの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、４００μｇの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、対象に投与される核酸ワクチン中には、２００μｇの用量のＲＮＡポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、遠位リンパ節と比較して、局所リンパ節において、１００倍高いレベルで蓄積する。他の実施形態において、核酸ワクチンは、化学修飾されており、他の実施形態において、核酸ワクチンは、化学修飾されていない。
本発明の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、当該ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含まず、アジュバントがワクチン中に含まれない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、安定化要素は、ヒストンステムループである。いくつかの実施形態において、安定化要素は、野生型配列と比較してＧＣ含量の多い核酸配列である。
本発明の態様は、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、当該ＲＮＡポリヌクレオチドは、ヒト対象に許容されるパーセンテージで第１の抗原に対する抗体保有基準を上回る抗体力価を付与する、宿主へのｉｎ ｖｉｖｏ投与用の製剤中に存在する、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡワクチンによって産生される抗体の力価は、中和抗体の力価である。いくつかの実施形態において、中和抗体の力価は、タンパク質ワクチンよりも大きい。他の実施形態において、本発明のｍＲＮＡワクチンによって産生される中和抗体の力価は、アジュバント添加タンパク質ワクチンよりも大きい。更に他の実施形態において、本発明のｍＲＮＡワクチンによって産生される中和抗体の力価は、１，０００〜１０，０００、１，２００〜１０，０００、１，４００〜１０，０００、１，５００〜１０，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜４，０００、１，８００〜１０，０００、２０００〜１０，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００、３，０００〜５，０００、３，０００〜４，０００または２，０００〜２，５００である。中和力価は、典型的に、プラーク数の５０％減少を達成するのに必要な最大血清希釈として表される。
また、第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、当該ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素を有するか、アジュバントとともに製剤化された第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによって誘発される抗体力価よりも長く持続する高い抗体力価を誘発する、宿主へのｉｎ ｖｉｖｏ投与用の製剤中に存在する、核酸ワクチンが提供される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、単回投与後１週間以内に中和抗体を産生するように製剤化される。いくつかの実施形態において、アジュバントは、カチオン性ペプチド及び免疫活性化核酸から選択される。いくつかの実施形態において、カチオン性ペプチドは、プロタミンである。
いくつかの態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、任意選択によりヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第１の抗原性ポリペプチドをコードする、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンであって、当該ＲＮＡポリヌクレオチドは、宿主の抗原発現レベルが、安定化要素を有するか、アジュバントとともに製剤化された第１の抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡワクチンによってもたらされる抗原発現レベルを著しく超えるように、宿主へのｉｎ ｖｉｖｏ投与用の製剤中に存在する、核酸ワクチンを提供する。
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むか、任意選択によりヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第１の抗原性ポリペプチドをコードする、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンであって、非修飾型ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なＲＮＡポリヌクレオチドよりも、ＲＮＡポリヌクレオチドが少なくとも１／１０少ない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５〜１００μｇの用量で存在する。
本発明の態様はまた、少なくとも１つの化学修飾を含むか、任意選択によりヌクレオチド修飾を含まないオープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第１の抗原性ポリペプチドをコードする、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチド１０μｇ〜４００μｇと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、ヒト対象への送達用に製剤化された、使用単位のワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、ワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子を更に含む。
本発明の態様は、個体または個体集団において呼吸器ウイルス株に対する抗原記憶を形成、維持または修復する方法を提供し、この方法は、当該個体または集団に抗原記憶ブースター核酸ワクチンを投与することを含み、当該核酸ワクチンは、（ａ）少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドであって、少なくとも１つの化学修飾を含むか、任意選択によりヌクレオチド修飾を含まず、かつ２つ以上のコドン最適化オープンリーディングフレームを含み、当該オープンリーディングフレームは、一連の参照抗原性ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドと、（ｂ）任意選択により薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、筋肉内投与、皮内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して個体に投与される。いくつかの実施形態において、投与ステップは、組成物の注射に適した装置と対象の筋肉組織とを触させることを含む。いくつかの実施形態において、投与ステップは、エレクトロポレーションと組み合わせて、組成物の注射に適した装置と対象の筋肉組織とを接触させることを含む。
本発明の態様は、対象にワクチン接種を行う方法を提供し、この方法は、有効量で第１の抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンの２５μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの単回用量を対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む。
他の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含むオープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第１の抗原性ポリペプチドをコードする、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む、核酸ワクチンであって、非修飾型ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なＲＮＡポリヌクレオチドよりも、ＲＮＡポリヌクレオチドが少なくとも１／１０少ない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５〜１００μｇの用量で存在する。
他の態様は、ヌクレオチド修飾を含まない（非修飾）オープンリーディングフレームを有し、当該オープンリーディングフレームは第１の抗原性ポリペプチドをコードする、ＬＮＰ製剤化ＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンであって、ＬＮＰで製剤化されていない非修飾型ｍＲＮＡワクチンが同等の抗体力価をもたらすのに必要なＲＮＡポリヌクレオチドよりも、ＲＮＡポリヌクレオチドが少なくとも１／１０少ない、核酸ワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、２５〜１００μｇの用量で存在する。
実施例で示されるデータは、本発明の製剤を使用すると、免疫応答が著しく向上することを示している。化学修飾されたＲＮＡワクチンと修飾されていないＲＮＡワクチンのどちらも本発明で有用である。驚くべきことに、ワクチンの製造には化学修飾されていないｍＲＮＡを使用して担体中に製剤化することが好ましいという先行技術の方向とは対照的に、化学修飾されたｍＲＮＡ−ＬＮＰワクチンは、必要とされる有効ｍＲＮＡ用量が非修飾型ｍＲＮＡよりもかなり低く、すなわち、ＬＮＰ以外の担体中に製剤化された非修飾型ｍＲＮＡよりも１／１０少ないことが本明細書に記載される。本発明のＲＮＡワクチンは化学修飾型及び非修飾型のどちらも、異なる脂質担体中に製剤化されたｍＲＮＡワクチンよりも良好な免疫応答をもたらす。
他の態様において、本発明は、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、年齢が６０歳以上の高齢者対象を治療する方法を包含する。
他の態様において、本発明は、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、年齢が１７歳以下の若年者対象を治療する方法を包含する。
他の態様において、本発明は、呼吸器ウイルス抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを有効量で対象に投与して、対象にワクチン接種を行うことを含む、成年対象を治療する方法を包含する。
いくつかの態様において、本発明は、呼吸器抗原をコードする少なくとも２つの核酸配列を含む混合ワクチンを用いて対象にワクチン接種を行う方法であり、ここで、ワクチンの用量は、併用治療用量であり、抗原をコードするそれぞれ個々の核酸の用量は、治療未満用量である。いくつかの実施形態において、併用用量は、対象に投与される核酸ワクチン中、ＲＮＡポリヌクレオチド２５μｇである。いくつかの実施形態において、併用用量は、対象に投与される核酸ワクチン中、ＲＮＡポリヌクレオチド１００μｇである。いくつかの実施形態において、併用用量は、対象に投与される核酸ワクチン中、ＲＮＡポリヌクレオチド５０μｇである。いくつかの実施形態において、併用用量は、対象に投与される核酸ワクチン中、ＲＮＡポリヌクレオチド７５μｇである。いくつかの実施形態において、併用用量は、対象に投与される核酸ワクチン中、ＲＮＡポリヌクレオチド１５０μｇである。いくつかの実施形態において、併用用量は、対象に投与される核酸ワクチン中、ＲＮＡポリヌクレオチド４００μｇである。いくつかの実施形態において、抗原をコードするそれぞれ個々の核酸の治療未満用量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０μｇである。他の実施形態において、核酸ワクチンは、化学修飾されており、他の実施形態において、核酸ワクチンは、化学修飾されていない。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８または２５９のうちの１つであり、少なくとも１つの化学修飾を含む。他の実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８または２５９のうちの１つであり、いかなるヌクレオチド修飾も含まないか、非修飾である。更に他の実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３または２４５のうちのいずれかの抗原性タンパク質をコードし、少なくとも１つの化学修飾を含む。他の実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３または２４５のうちのいずれかの抗原性タンパク質をコードし、いかなるヌクレオチド修飾も含まないか、非修飾である。
本発明の種々の実施形態の詳細については、以下の発明を実施するための形態に記載される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、発明を実施するための形態及び図面ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
前述その他の目的、特徴及び利点は、添付の図面に示される、以下の本発明の具体的な実施形態の説明から明らかになるであろう。図面中、同じ参照記号は、各種図を通して同じ部分を指す。図面は、必ずしも縮尺とおりではなく、本発明の様々な実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された種々のｍＲＮＡワクチンを使用して送達されたＲＳＶワクチン抗原に対する免疫応答をタンパク質抗原と比較して評価するために設計された、マウスにおける免疫原性試験のデータを示す。データは、強い中和抗体力価を示した。 ＲＮＡ／ＬＮＰワクチンがタンパク質抗原よりもはるかに強い細胞性免疫応答を与えたことを示す。 図３Ａ〜３Ｃは、マウスにおける免疫原性を試験するための細胞内サイトカイン染色アッセイのデータを示す。データは、ＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原ではなく、ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ／ＮＬＰワクチン及びＲＳＶ−Ｇ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ４＋免疫応答をマウスで誘発することを示している。 図４Ａ〜４Ｃは、マウスにおける免疫原性を試験するための細胞内サイトカイン染色アッセイのデータを示す。データは、ＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原ではなく、ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ／ＮＬＰワクチン及びＲＳＶ−Ｇ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ８＋免疫応答をマウスで誘発することを示している。 マウスにおける免疫原性試験のデータを示す。データは、ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標）でアジュバント化されたタンパク質抗原により達成された中和抗体力価と同等の強い中和抗体力価を示している。 図６Ａ〜６Ｃは、マウスにおける免疫原性を試験するための細胞内サイトカイン染色アッセイのデータを示す。データは、ＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原ではなく、ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチン及びＲＳＶ−Ｇ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ４＋免疫応答をマウスで誘発することを示している。 図６Ａ〜６Ｃは、マウスにおける免疫原性を試験するための細胞内サイトカイン染色アッセイのデータを示す。データは、ＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原ではなく、ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチン及びＲＳＶ−Ｇ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ４＋免疫応答をマウスで誘発することを示している。 図７Ａ〜７Ｃは、マウスにおける免疫原性を試験するための細胞内サイトカイン染色アッセイのデータを示す。データは、ＲＳＶ−Ｇ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンまたはＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原ではなく、ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、ＴＨ１に偏った強いＣＤ８＋免疫応答をマウスで誘発することを追認している。 図７Ａ〜７Ｃは、マウスにおける免疫原性を試験するための細胞内サイトカイン染色アッセイのデータを示す。データは、ＲＳＶ−Ｇ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンまたはＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原ではなく、ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、ＴＨ１に偏った強いＣＤ８＋免疫応答をマウスで誘発することを追認している。 アッセイのデータを示す。データは、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化されたＲＳＶ ｍＲＮＡワクチンで免疫化したマウスのいずれの肺からもウイルスは回収されず、低用量のＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質／ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標）ワクチンの動物１匹だけが鼻内に検出可能なウイルスを有していたことを示している。 コットンラットにおける免疫原性試験のデータを示す。データは、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された種々のＲＳＶ ｍＲＮＡワクチンで免疫化した動物における強い中和抗体力価を示している。 種々のＲＳＶ ｍＲＮＡワクチンに対する抗原性φ及び抗原性部位ＩＩの応答を特徴付ける、コットンラット競合ＥＬＩＳＡのデータを示す。 コットンラット抗原刺激アッセイのデータを示す。データは、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化されたＲＳＶ ｍＲＮＡワクチンの保護効果を示している。 ＲＳＶ ｍＲＮＡワクチン及び対照製剤によってアフリカミドリザルで誘導されたＲＳＶ Ａに対する血清中和抗体力価（個々のＮＴ５０及び９５％信頼区間とＧＭＴ）を表すグラフを示す。 図１３Ａ〜１３Ｂは、１０週目（ＰＤ３から２週間）に測定したパリビズマブ（部位ＩＩ）（図１３Ａ）及びＤ２５（部位φ）（図１３Ｂ）に対する血清抗体競合ＥＬＩＳＡ力価を（個々のＩＴ５０で、及びＧＭＴを９５％信頼区間とともに）表すグラフを示す。 図１４Ａ〜１４Ｂは、アフリカミドリザルにおいて抗原刺激後に検出された平均肺ウイルス血症（図１３Ａ）及び抗原刺激に検出された平均鼻ウイルス血症（図１３Ｂ）を９５％信頼区間とともに表すグラフを示す。 種々のＲＳＶ ｍＲＮＡワクチン及び対照製剤によってＲＳＶ経験アフリカミドリザルで誘導されたＲＳＶ Ａに対するワクチン接種後２週間の血清中和抗体力価を（個々のＮＴ５０で、及びＧＭＴを９５％信頼区間とともに）表すグラフを示す。 種々のＲＳＶ ｍＲＮＡワクチン及び対照製剤によってＲＳＶ経験アフリカミドリザルで誘導されたＲＳＶ Ａに対する血清中和抗体力価を（ＧＭＴを９５％信頼区間とともに）表すグラフを示す。 図１７Ａ〜１７Ｂは、ベースライン時及び免疫付与後４週間に測定したパリビズマブ（部位ＩＩ）（図１７Ａ）及びＤ２５（部位φ）（図１７Ｂ）に対する血清抗体競合ＥＬＩＳＡ力価を（個々のＩＴ５０で、及びＧＭＴを９５％信頼区間とともに）表すグラフを示す。 図１８Ａ〜１８Ｂは、種々のワクチン及び対照製剤によってＲＳＶ経験アフリカミドリザルで誘導されたＲＳＶ Ｆ特異的ＣＤ４＋（図１８Ａ）及びＣＤ８＋（図１８Ｂ）Ｔ細胞応答を表すグラフを示す。 種々のワクチン及び対照製剤によってコットンラットで誘導されたＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂに対する、４週目（ＲＳＶ Ａ（丸）及びＲＳＶ Ｂ（四角）に対して、投与１後４週間）及び８週目（ＲＳＶ Ａ（上向き三角）及びＲＳＶ Ｂ（下向き三角）に対して、投与２後４週間）の血清中和抗体力価を（個々のＮＴ５０で、及びＧＭＴを９５％信頼区間ともに）を表すグラフを示す。 ＲＳＶ Ｂ １８３５７による抗原刺激後のコットンラットで測定した肺（丸）及び鼻（四角）のウイルスコピーの平均を９５％信頼区間とともに表すグラフを示す。
本開示の実施形態は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原をコードする（少なくとも１つの）ポリヌクレオチドを含むＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを提供する。ＲＳＶは、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ属の一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスである。このウイルスには、主に表面のＧ糖タンパク質の違いに起因するＡ型及びＢ型として知られる、少なくとも２つの抗原サブグループがある。ＧとＦの２つのＲＳＶ表面糖タンパク質が呼吸器上皮細胞との結合及び付着を媒介する。Ｆ表面糖タンパク質は、隣接する細胞の融合を媒介する。これにより、合胞体細胞の形成が生じる。ＲＳＶは、細気管支炎の最も一般的な原因である。感染した成人のほとんどは、鬱血、微熱及び喘鳴などの軽度の感冒様症状を発症する。乳幼児及び小児は、細気管支炎及び肺炎などのより深刻な症状を呈することがある。この疾患は、呼吸器からの分泌物との接触を介してヒトに感染し得る。
ＲＳＶのゲノムは、少なくとも３つの表面糖タンパク質（Ｆ、Ｇ及びＳＨを含む）と、４つのヌクレオカプシドタンパク質（Ｌ、Ｐ、Ｎ及びＭ２を含む）と、１つのマトリックスタンパク質Ｍをコードする。糖タンパク質Ｆは、ビリオンと宿主膜との間の融合によってウイルス侵入を誘導する。糖タンパク質Ｇは、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、主要な吸着タンパク質である。ＳＨは、短い内在性膜タンパク質である。マトリックスタンパク質Ｍは、脂質二重層の内層に存在し、ビリオン形成を助ける。ヌクレオカプシドタンパク質Ｌ、Ｐ、Ｎ及びＭ２は、ＲＳＶゲノムの複製及び転写を調節する。糖タンパク質Ｇがウイルス粒子を気管支上皮細胞表面に係留及び安定化させ、糖タンパク質Ｆが細胞のグリコサミノグリカンと相互作用して宿主細胞への融合及びＲＳＶビリオン内容物の宿主細胞への送達を媒介すると考えられている（Ｋｒｚｙｚａｎｉａｋ ＭＡ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ２０１３；９（４））。
本明細書で提供されるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ＤＮＡワクチン接種に関連するリスクの多くを伴うことなく、細胞性免疫と体液性免疫の両方を含むバランスの取れた免疫応答を誘導するために使用することができる。
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４０号の内容全体を参照により本明細書に援用する。
本明細書に記載されるｍＲＮＡワクチンは、現行ワクチンよりもいくつかの点で優れることが見出された。第１に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達は、文献に記載されているプロタミン系手段を含む他の製剤よりも優れ、追加のアジュバントを必要としない。ＬＮＰの使用により、化学修飾型または非修飾型ｍＲＮＡワクチンの有効的な送達が可能になる。更に、ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンは、修飾型と非修飾型のどちらも、従来型ワクチンよりも著しく優れていることが本明細書で示された。いくつかの実施形態において、本発明のｍＲＮＡワクチンは、従来型ワクチンよりも少なくとも１０倍、２０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１，０００倍優れている。
ｍＲＮＡワクチン及び自己複製ＲＮＡワクチンを含む機能性ＲＮＡワクチンは、その作製が試みられてきたが、これらのＲＮＡワクチンの治療有効性は、まだ完全に確立されていない。実に驚くべきことに、本発明者らは、本発明の態様に従って、抗原生成及び中和能力を有する機能性抗体産生の増大を含む、著しく増強され、また多くの点で相乗的である免疫応答をもたらす、ｍＲＮＡワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ送達のための製剤クラスを見出した。これらの結果は、他の種類の脂質系製剤で使用されるｍＲＮＡの用量と比較して極めて低用量のｍＲＮＡが投与された場合でも、達成することができる。本発明の製剤は、機能性ｍＲＮＡワクチンの予防薬及び治療薬としての有効性を確立するのに十分な予想外に著しいｉｎ ｖｉｖｏ免疫応答を示した。更に、自己複製ＲＮＡワクチンは、免疫原性応答をもたらすのに十分なＲＮＡを細胞に送達するのに、ウイルス複製経路に依存している。本発明の製剤は、強い免疫応答をもたらすのに十分なタンパク質を産生するのにウイルス複製を必要としない。したがって、本発明のｍＲＮＡは、自己複製ＲＮＡではなく、ウイルス複製に必要な構成要素を含まない。
本発明は、いくつかの態様において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤が、化学修飾型及び非修飾型ｍＲＮＡワクチンを含むＲＮＡワクチンの有効性を著しく増強するという驚くべき発見に関係する。ＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンの有効性について、いくつかの異なる抗原を使用してｉｎ ｖｉｖｏで試験した。本明細書に示される結果は、他の市販のワクチンよりも予想外に優れたＬＮＰ製剤化ｍＲＮＡワクチンの有効性を示している。
増強された免疫応答をもたらすことに加えて、本発明の製剤は、試験した他のワクチンよりも少ない用量で、より迅速な免疫応答をもたらす。本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤はまた、異なる担体で製剤化されたワクチンに比べて、定量的及び定性的に良好な免疫応答をもたらす。
本明細書に記載されるデータは、本発明の製剤が、既存の抗原ワクチンを超える予想外の著しい改善をもたらしたことを示している。更に、本発明のｍＲＮＡ−ＬＮＰ製剤は、ｍＲＮＡの用量が他のワクチンより低い場合であっても、他のワクチンよりも優れている。ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化された種々のｍＲＮＡワクチンをタンパク質抗原ワクチンとマウスで比較した。データは、既存のワクチンと比較すると、ｍＲＮＡワクチンが、タンパク質抗原よりも強い中和抗体力価、はるかに高い細胞性免疫応答を与え、マウスにおいて、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ４＋及びＣＤ８＋免疫応答と、肺のウイルス減少とをもたらしたことを示した。低用量のタンパク質／アジュバントワクチン製剤では動物１匹にのみウイルスが回収されたのに対し、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化されたＲＳＶ ｍＲＮＡワクチンで免疫化したマウスではいずれの肺からもウイルスは回収されなかった。著しい中和抗体力価がラット及びサルでも達成された。
本明細書に記載される試験で使用したＬＮＰは、ｓｉＲＮＡを送達するために種々の動物モデル及びヒトにおいて以前から使用されているものである。ＬＮＰ製剤のｓｉＲＮＡ送達に関してなされた観察を考慮すると、ＬＮＰがワクチンに有用であるという事実は、実に驚くべきことである。ＬＮＰ製剤化ｓｉＲＮＡの治療的送達は、一過性ＩｇＭ応答に関連する望ましくない炎症応答の原因となり、典型的に、抗原生成の低減及び免疫応答の低下につながることが観察されている。ｓｉＲＮＡについて観察された知見とは対照的に、本発明のＬＮＰ−ｍＲＮＡ製剤は、一過性のＩｇＭ応答ではなく、予防法及び治療法に十分なＩｇＧレベルの増大をもたらすことが本明細書で示される。
核酸／ポリヌクレオチド
本明細書で提供されるＲＳＶワクチンは、少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つの（１つ以上の）リボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味で、ヌクレオチドの重合体を含む任意の化合物及び／または物質を含む。これらの重合体は、ポリヌクレオチドと呼ばれる。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８もしくは２５９に記載される少なくとも１つの核酸配列、または配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８もしくは２５９に記載される核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するホモログによってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８もしくは２５９に記載される少なくとも１つの核酸配列、または配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８もしくは２５９に記載される核酸配列と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．８％または９９．９％）の同一性を有するホモログによってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２４２、２４６、２５７、２５８または２５９に記載される核酸配列の少なくとも１つの断片（例えば、少なくとも１つの抗原性配列または少なくとも１つのエピトープを有する断片）によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡポリヌクレオチドであり、当該ｍＲＮＡポリヌクレオチドの各ウラシル（ウラシルの１００％）は、化学修飾される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡポリヌクレオチドであり、当該ｍＲＮＡポリヌクレオチドの各ウラシル（ウラシルの１００％）は、Ｎ１−メチルプソイドウリジンを含むように化学修飾される。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、２４３または２４５に記載されるアミノ酸配列であるか、その（抗原性）断片であるか、当該配列に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）の同一性を有するホモログである。
核酸（ポリヌクレオチドともいう）は、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、例えば、β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能基を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能基を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）もしくはこれらのキメラもしくは組み合わせであってよく、またはこれらを含み得る。
いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、（少なくとも１つの）ポリペプチド（天然、非天然または修飾されたアミノ酸重合体）をコードする任意のポリヌクレオチドであって、これが翻訳されて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕまたはｅｘ ｖｉｖｏで、コードされているポリペプチドを生成できる任意のポリヌクレオチドを指す。当業者であれば、別途記載される場合を除き、本出願に記載されるポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列を表す場合には「Ｔ」を用い、配列がＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を表す場合には、「Ｔ」は「Ｕ」に置き換えられることを理解するであろう。したがって、特定の配列識別番号によって識別されるＤＮＡによってコードされるＲＮＡポリヌクレオチドはいずれも、ＤＮＡによってコードされた対応するＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）配列を含み得、当該ＲＮＡ配列は、ＤＮＡ配列の各「Ｔ」が「Ｕ」に置き換えられているものである。
ｍＲＮＡ分子の基本構成要素は、典型的に、少なくとも１つのコーディング領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ及びポリＡテールを含む。本開示のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、その設計上の機能的及び／または構造的特徴から野生型ｍＲＮＡとは区別することができ、この特徴は、核酸治療法を用いた有効的なポリペプチド発現に関する既存の課題を解決するのに役立つ。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンのＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９または９〜１０個の抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンのＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個の抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンのＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１００個の抗原性ポリペプチドまたは少なくとも２００個の抗原性ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンのＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、１〜５０、１〜１００、２〜５０または２〜１００個の抗原性ポリペプチドをコードする。
本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、いくつかの実施形態において、コドン最適化される。コドン最適化法は、当該技術分野において知られており、本明細書に記載のとおりに使用することができる。コドン最適化を用いると、いくつかの実施形態において、標的生物及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて適切な折り畳みを確保すること、ＧＣ含量に偏りをもたせてｍＲＮＡの安定性を向上させ、もしくは二次構造を低減させること、遺伝子構築物もしくは発現を損なう可能性のあるタンデム反復コドンもしくは塩基ラン（ｂａｓｅ ｒｕｎ）を最小にすること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること、コードタンパク質に翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去もしくはシャッフルすること、制限部位を挿入もしくは欠失すること、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を改変すること、翻訳率を調整してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にすること、またはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは排除することができる。コドン最適化のツール、アルゴリズム及びサービスは、当該技術分野において知られており、非限定的な例には、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）によるサービス及び／または独自の方法が挙げられる。いくつかの実施形態において、最適化アルゴリズムを使用してオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列が最適化される。
いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して７５％未満の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して６５％〜８５％（例えば、約６７％〜約８５％または約６７％〜約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、天然または野生型配列（例えば、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、抗原性タンパク質またはポリペプチド）をコードする天然または野生型ｍＲＮＡ配列）に対して６５％〜７５％または約８０％の配列同一性を共有する。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、少なくとも１つの修飾を有する少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、少なくとも１つの５’末端キャップを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含み、かつ脂質ナノ粒子内に製剤化される。ポリヌクレオチドの５’キャッピングは、以下の化学的ＲＮＡキャップアナログを製造元のプロトコールに従って使用して５’−グアノシンキャップ構造を生じさせることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応中に同時に達成することができる：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））。修飾ＲＮＡの５’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を使用して「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））を生じさせることによって転写後に達成され得る。キャップ１構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素と２’−Ｏメチルトランスフェラーゼの両方を使用してｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルを生じさせることで生成することができる。キャップ２構造は、キャップ１構造から、２’−Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して３番目の５’−ヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル化することによって生成することができる。キャップ３構造は、キャップ２構造から、２’−Ｏメチルトランスフェラーゼを使用して４番目の５’−ヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル化することによって生成することができる。酵素は、組み換え供給源に由来してもよい。
修飾ｍＲＮＡは、哺乳動物細胞にトランスフェクトされた場合、１２〜１８時間または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２もしくは７２時間超の安定性を有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化ＲＮＡは、Ｇ／Ｃレベルを増加させたものであり得る。核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響し得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）の残基量を増加させたＲＮＡは、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）のヌクレオチドを多量に含有するＲＮＡよりも機能的に安定であり得る。一例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域における配列改変によって安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を開示している。遺伝コードの縮重により、この改変は、既存のコドンを、結果として得られるアミノ酸を変更することなく、より大きなＲＮＡ安定性を助長するコドンに置き換えることによってなされる。このアプローチは、ＲＮＡのコーディング領域に限定される。
抗原／抗原性ポリペプチド
ＲＳＶには、少なくとも２つの抗原サブグループ（Ａ及びＢ）があることが知られている。この抗原二型性は、主に、表面のＧ糖タンパク質の違いによるものである。２つの表面糖タンパク質Ｇ及びＦは、エンベロープ中に存在し、呼吸器上皮細胞との吸着及び融合を媒介する。Ｆタンパク質はまた、隣接する細胞の融合を媒介して、このウイルスの名前の由来となっている、特徴的な合胞体細胞を形成する。２つのＲＳＶ抗原バリアントの疫学的及び生物学的な重要性は、はっきりとわかっていない。しかし、Ａ型感染のほうが重症になる傾向を示唆するいくつかの証拠がある。
ＲＳＶゲノムは、約１５，０００ヌクレオチド長であり、負の極性を有する一本鎖ＲＮＡから構成される。ＲＳＶゲノムは、１１個のタンパク質をコードする１０個の遺伝子を有し、２つのＭ２のオープンリーディングフレームがある。当該ゲノムは、ＮＳ１からＬへと順次転写され、その長さに沿って発現は減少する。
ＮＳ１及びＮＳ２は、Ｉ型インターフェロン活性を阻害する。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、ＮＳ１、ＮＳ２またはその免疫原性断片の産物をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
Ｎは、ヌクレオカプシドを形成するゲノムＲＮＡに会合するヌクレオカプシドタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、ヌクレオカプシドタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
Ｍは、ウイルスの組み立てに必要なマトリックスタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、マトリックスタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
ＳＨ、Ｇ及びＦは、ウイルスコートを形成する。Ｇタンパク質は、高度にグリコシル化されている表面タンパク質であり、吸着タンパク質として機能する。Ｆタンパク質は、もう１つの重要な表面タンパク質であり、融合を媒介することにより、ウイルスの細胞質への侵入を可能にし、また合胞体の形成を可能にする。ＲＳＶの双方のサブタイプにおいて、Ｆタンパク質は相同であり、Ｆタンパク質を指向する抗体で中和される。対照的に、Ｇタンパク質は、２つのサブタイプで大幅に異なる。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、ＳＨ、ＧもしくはＦタンパク質またはこれらの組み合わせまたはこれらの免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
細胞表面にあるヌクレオリンがＲＳＶ融合タンパク質の受容体である。ヌクレオリンとＲＳＶ融合タンパク質の相互作用の阻害が、細胞培養物及び動物モデルでのＲＳＶ感染に対して治療効果があることが示されている。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、ヌクレオリンまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
Ｍ２は、転写にも必要とされる第２のマトリックスタンパク質であり、Ｍ２−１（伸長因子）及びＭ２−２（転写調節）をコードする。Ｍ２は、ＣＤ８エピトープを含有する。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、第２のマトリックスタンパク質またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
Ｌは、ＲＮＡポリメラーゼをコードする。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）またはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
リンタンパク質Ｐは、Ｌタンパク質の補因子である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、リンタンパク質Ｐまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。
本開示のいくつかの実施形態は、糖タンパク質Ｇまたはその免疫原性断片（例えば、ＲＳＶに対する免疫応答を惹起することが可能な免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ＲＳＶワクチンを提供する。
本開示のいくつかの実施形態は、糖タンパク質Ｆまたはその免疫原性断片（例えば、ＲＳＶに対する免疫応答を惹起することが可能な免疫原性断片）をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ＲＳＶワクチンを提供する。
本発明のいくつかの実施形態は、融合後の形態のポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ＲＳＶワクチンを開示する。本発明の更なる実施形態は、融合前の形態のポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ＲＳＶワクチンを開示する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドまたはその抗原性断片は、融合前のコンフォメーションの糖タンパク質、例えば、限定するものではないが、融合前の糖タンパク質ＦまたはＤＳ−ＣＡＶ１を含む。理論に束縛されることを望むものではないが、ある特定のポリペプチドまたはその抗原性断片は、融合前のコンフォメーションにあるとき、同じタンパク質またはその免疫原性断片の融合後のコンフォメーションと比較して、中和抗体に対するエピトープをより多く含有し得る。例えば、融合前の糖タンパク質Ｆまたはその免疫原性断片は、その膜の遠位先端に固有の抗原部位（「抗原性部位０」）を有する。抗原性部位０は、必須ではないが、ＲＳＶ Ｆタンパク質配列の残基６２〜６９及び１９６〜２０９を含み得る。いくつかの場合において、限定するものではないが、融合前の糖タンパク質Ｆまたはその免疫原性断片などの融合前のポリペプチドまたはその免疫原性断片は、融合後のポリペプチドまたはその免疫原性断片により達成される免疫応答よりも数倍大きな免疫応答を呈し得る。融合前のＲＳＶ糖タンパク質及びその使用方法は、ＷＯ／２０１４／１６０４６３に記載されており、その全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、ＲＳＶ Ａ２株（ＲＳＶ Ａ２）から得られた糖タンパク質Ｆもしくは糖タンパク質Ｇまたはこれらの免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む。サブタイプＡ株及びサブタイプＢ株を含む、他のＲＳＶ株も本開示に包含される。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶワクチンは、少なくとも１つの化学修飾を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの修飾を有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を有する。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドは、２５アミノ酸よりも長く、５０アミノ酸よりも短い。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物、天然ポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片ならびに前述の他の等価物、バリアント及びアナログが含まれる。ポリペプチドは、単一分子であってもよいし、二量体、三量体または四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、単鎖ポリペプチドまたは抗体もしくはインスリンなどの多鎖ポリペプチドを含み得、会合または連結され得る。多鎖ポリペプチドには、最も一般的に、ジスルフィド結合が認められる。ポリペプチドという用語はまた、少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学的アナログになっているアミノ酸高分子に対しても適用され得る。
「ポリペプチドバリアント」という用語は、そのアミノ酸配列が天然配列または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列バリアントは、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失及び／または挿入を有し得る。通常、バリアントは、天然配列または参照配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、バリアントは、天然配列または参照配列と少なくとも８０％または少なくとも９０％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態において、「バリアント模倣体」が提供される。本明細書で使用されるとき、「バリアント模倣体」は、活性化配列を模倣し得る少なくとも１つのアミノ酸を含有する。例えば、グルタミン酸は、リン酸化スレオニン及び／またはリン酸化セリンの模倣体として作用し得る。あるいは、バリアント模倣体は、失活化をもたらすか、模倣体を含有する不活性化産物をもたらすことができる。例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換として作用し、アラニンは、セリンの不活性化置換として作用することができる。
「オルソログ」は、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持する。オルソログの特定は、新たに配列決定されるゲノムの遺伝子機能の信頼性の高い予測に重要である。
「アナログ」は、１つ以上のアミノ酸の変更、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失による違いはあるが、親ポリペプチドまたは出発ポリペプチドの特性のうちの１つ以上を引き続き保持している、ポリペプチドバリアントを含むことを意味する。
「パラログ」は、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持しているが、パラログは、元の機能に関連しているとしても、新しい機能を進化させている。
本開示は、バリアント及び誘導体を含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをベースにしたいくつかの種類の組成物を提供する。これらには、例えば、置換、挿入欠失及び共有結合によるバリアント及び誘導体が含まれる。「誘導体」という用語は、「バリアント」という用語と同義的に使用されるが、一般的に、参照分子または出発分子と比較して、任意の方法で修飾及び／または変更されている分子を指す。
したがって、参照配列、特に本明細書で開示されるポリペプチド配列に対して置換、挿入及び／または付加、欠失ならびに共有結合による修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグまたは１つ以上のリジンなどのアミノ酸をペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）付加することができる。配列タグは、ペプチドの検出、精製または位置決定のために使用することができる。リジンは、ペプチドの溶解性を増大させ、またはビオチニル化を可能にするために使用することができる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基を任意選択的に欠失させて、切断型配列を提供してもよい。あるいは、その配列の用途、例えば、可溶性であり、または固体支持体に連結されたより大きな配列の一部として配列を発現させるなどに応じて、特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）を欠失させてもよい。代替的な実施形態において、シグナル配列、終結配列、膜貫通ドメイン、リンカー、多量体形成ドメイン（例えば、ｆｏｌｄｏｎ領域など）及び同等物のための配列（またはこれらをコードする配列）を、同一または類似の機能を達成する代替配列と置換してもよい。そのような配列は、当業者には容易に特定可能である。本明細書で提供される配列のいくつかは、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの調製直前に削除され得る配列タグまたは末端ペプチド配列を（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）含有することも理解されたい。
ポリペプチドに関する「置換バリアント」は、天然配列または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が削除され、その代わりに同じ位置に別のアミノ酸が挿入されたものである。置換は、分子中のアミノ酸が１つのみ置換された単一の置換であってもよいし、同一分子中の２つ以上のアミノ酸が置換された複数の置換であってもよい。
本明細書で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸を、同様の大きさ、電荷または極性を有する別のアミノ酸で置き換える置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基を別の非極性残基にする置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例には、ある極性（親水性）残基を別の極性残基にする置換、例えば、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、及びグリシンとセリンの間の置換が挙げられる。加えて、リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基を別の塩基性残基にする置換、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などのある酸性残基を別の酸性残基にする置換も保存的置換の更なる例である。非保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニンもしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基をシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリジンなどの極性（親水性）残基にする置換、及び／または極性残基を非極性残基にする置換が挙げられる。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する「特徴」は、分子のうち、明確に異なる、アミノ酸配列ベースの構成要素またはヌクレオチドベースの構成要素としてそれぞれ定義される。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面発現、局所的高次構造形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
ポリペプチドに関して本明細書で使用されるとき、「ドメイン」という用語は、１つ以上の特定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、結合能力、タンパク質−タンパク質相互作用の部位としての機能）を有するポリペプチドモチーフを指す。
ポリペプチドに関して本明細書で使用されるとき、「部位」という用語は、それがアミノ酸に基づく実施形態に関する場合、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。ポリペプチドに関して本明細書で使用されるとき、「部位」という用語は、それがヌクレオチドに基づく実施形態に関する場合、「ヌクレオチド」と同義的に使用される。部位は、ポリペプチドベースの分子またはポリヌクレオチドベースの分子内のうちで修飾、操作、改変、誘導体化または変更され得るペプチドまたはポリペプチドまたはポリヌクレオチド内の位置を表す。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書で使用されるとき、「末端」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの端部をそれぞれ指す。かかる端部は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの最初の部位または最後の部位のみに限定されるものではなく、末端領域に付加されたアミノ酸またはヌクレオチドを含み得る。ポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で終わる）と、Ｃ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終わる）の両方を有することを特徴とし得る。タンパク質は、場合によって、ジスルフィド結合または非共有結合性の力によって一緒になった複数のポリペプチド鎖から構成される（多量体、オリゴマー）。これらのタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、状況に応じて、有機コンジュゲートなどの非ポリペプチドベースの部分で開始または終結するように修飾されてもよい。
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン及び相同タンパク質もまた、目的のポリペプチドの範囲内であるとみなされる。例えば、参照タンパク質の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１００超のアミノ酸長の任意のタンパク質断片（すなわち、参照ポリペプチド配列よりも少なくとも１アミノ酸残基短いがそれ以外では同一であるポリペプチド配列）が本明細書で提供される。別の例において、本明細書に記載される配列のうちのいずれかに対して、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％同一である２０、３０、４０、５０または１００アミノ酸のストレッチを含む任意のタンパク質を本開示に従って利用することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載または参照される配列のうちのいずれも、示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の変異を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質断片は、２５アミノ酸よりも長く、５０アミノ酸よりも短い。
本開示のポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子は、参照分子（例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド）、例えば、当該技術分野に記載の分子（例えば、操作または設計された分子または野生型分子）とある程度の配列類似性または配列同一性を共有し得る。「同一性」という用語は、当該技術分野において知られているように、配列を比較することによって決定される２つ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係性を指す。当該技術分野において、同一性はまた、２つ以上のアミノ酸残基または核酸残基のストリング間のマッチ数によって決定される配列間の配列関係性の度合いを意味する。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（例えば、「アルゴリズム」）によって処理されたギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうちより小さい配列間での同一マッチ率を評価する。関連するペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に算出することができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント」は、配列をアライメントし、必要に応じて、最大同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後に、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列中の残基と同一であるアミノ酸または核酸の候補配列中の残基（アミノ酸残基または核酸残基）のパーセンテージとして定義される。アライメントのための方法及びコンピュータープログラムは、当該技術分野においてよく知られている。同一性は、同一性パーセントの算出に依存するが、算出に導入されるギャップ及びペナルティーによって値が異なり得ることは理解される。一般に、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載され、当業者に知られている配列アライメントプログラム及びパラメーターによって決定したとき、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列に対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列の同一性を有する。そのようなアライメントツールには、ＢＬＡＳＴスイートのものが含まれる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。別の多く用いられるローカルアライメント手法は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づくものである（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）。動的計画法に基づいた一般的なグローバルアライメント手法は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３．）。より最近では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適グローバルアライメント法よりも高速にヌクレオチド及びタンパク質配列のグローバルアライメントを生成するといわれるＦａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発されている。他のツールについては、本明細書において、具体的には、以下の「同一性」の定義において記載される。
本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、高分子、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関係性を指す。マッチする残基のアライメントによって決定された類似性または同一性の閾値レベルを共有する高分子（例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）及び／またはポリペプチド分子）は、相同と呼ばれる。相同性は、分子間の関係を記述する定性的用語であり、定量的な類似性または同一性に基づき得る。類似性または同一性は、２つの比較配列間の配列マッチの程度を定義する定量的用語である。いくつかの実施形態において、高分子は、その配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一または類似であれば、互いに「相同」であるとみなされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。２つのポリヌクレオチド配列は、当該配列がコードするポリペプチドが、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または更には９９％であれば、相同であるとみなされる。いくつかの実施形態において、相同なポリヌクレオチド配列は、一意に指定された少なくとも４〜５アミノ酸のストレッチをコードする能力を特徴とする。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、一意に指定された少なくとも４〜５アミノ酸のストレッチをコードする能力によって決定される。２つのタンパク質配列は、当該タンパク質が、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチについて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一であれば、相同であるとみなされる。
相同性は、比較される配列が進化上共通の起源から分化したことを示唆する。「ホモログ」という用語は、共通の祖先配列に由来することにより第２のアミノ酸配列または核酸配列に関連する第１のアミノ酸配列または核酸配列（例えば、遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質配列）を指す。「ホモログ」という用語は、種分化の事象によって分離した遺伝子間及び／もしくはタンパク質間の関係、または遺伝子重複の事象によって分離した遺伝子間及び／もしくはタンパク質間の関係に適用され得る。
多タンパク質及び多成分ワクチン
本開示は、単一の抗原性ポリペプチドをそれぞれコードする複数のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＲＳＶワクチン、及び１つを超える抗原性ポリペプチドを（例えば、融合ポリペプチドとして）コードする単一のＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＳＶワクチンを包含する。したがって、第１のＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、第２のＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドとを含むワクチン組成物は、（ａ）第１のＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードする第１のＲＮＡポリヌクレオチドと、第２のＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードする第２のＲＮＡポリヌクレオチドとを含むワクチン、ならびに（ｂ）第１及び第２のＲＳＶ抗原性ポリペプチドを（例えば、融合ポリペプチドとして）コードする単一のＲＮＡポリヌクレオチドを含むワクチンを包含することを理解されたい。本開示のＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、いくつかの実施形態において、それぞれが異なるＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する２〜１０個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）またはそれ以上のＲＮＡポリヌクレオチド（または２〜１０個もしくはそれ以上の異なるＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードする単一のＲＮＡポリヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ融合（Ｆ）糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶ吸着（Ｇ）タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶ核タンパク質（Ｎ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶリンタンパク質（Ｐ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶ大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶマトリックスタンパク質（Ｍ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶ小型疎水性タンパク質（ＳＨ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶ非構造タンパク質１（ＮＳ１）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶ非構造タンパク質２（ＮＳ２）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドと、ＲＳＶ吸着タンパク質（Ｇ）をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ Ｎタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ Ｍタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ Ｌタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ Ｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ ＳＨタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ ＮＳ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶ ＮＳ２タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有するＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（例えば、配列番号２８１または配列番号２８２）に融合されたＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードする。したがって、ＲＳＶ抗原性ペプチドに連結されたシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含むＲＳＶワクチンが提供される。
更に、シグナルペプチドに融合された本明細書で開示される任意のＲＳＶ抗原性ポリペプチド（例えば、Ｆ、Ｇ、Ｍ、Ｎ、Ｌ、Ｐ、ＳＨ、ＮＳ１、ＮＳ２またはこれらの任意の抗原性断片）を含むＲＳＶワクチンが本明細書で提供される。シグナルペプチドは、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
シグナルペプチド
いくつかの実施形態において、ＲＳＶポリヌクレオチドによってコードされる抗原性ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、Ｎ末端の１５〜６０アミノ酸タンパク質を含み、典型的に、分泌経路において膜を通過する移行に必要であり、したがって、真核生物及び原核生物の両生物において、大部分のタンパク質が分泌経路へ入ることを普遍的に制御している。シグナルペプチドは、一般に、長さの異なるＮ末端領域（通常、正に荷電したアミノ酸を含む）と、疎水性領域と、短いカルボキシ末端ペプチド領域の３つの領域からなる。真核生物において、新生前駆タンパク質（プレタンパク質）のシグナルペプチドは、リボソームを粗面小胞体（ＥＲ）膜に向かわせ、膜を通過して伸長するペプチド鎖の輸送を開始する。しかしながら、シグナルペプチドは、成熟タンパク質の最終目的地に関与しない。その配列中にアドレスタグを欠いている分泌タンパク質は、普通は外部環境に分泌される。シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）に存在するシグナルペプチダーゼによって前駆タンパク質から切断されるか、切断されないまま膜アンカーとして機能する。近年、シグナルペプチドのより進んだ見解が導き出されており、ある特定のシグナルペプチドの機能及び免疫優性は、これまで予想されていたよりも極めて多岐にわたることが示されている。
シグナルペプチドは、典型的に、プロセシングのために、新規合成タンパク質の小胞体（ＥＲ）への標的化を促進するように機能する。ＥＲプロセシングにより成熟エンベロープタンパク質が生成され、そこでシグナルペプチドは、典型的に、宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって切断される。シグナルペプチドはまた、タンパク質の細胞膜への標的化を促進し得る。本開示のＲＳＶワクチンは、例えば、人工シグナルペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチドを含み得、シグナルペプチドをコードする配列は、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドのコード配列に作動可能に連結され、当該配列とインフレームである。したがって、本開示のＲＳＶワクチンは、いくつかの実施形態において、シグナルペプチドに融合されたＲＳＶ抗原性ポリペプチドを含む抗原性ポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドのＣ末端に融合される。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドに融合されるシグナルペプチドは、人工シグナルペプチドである。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされるＲＳＶ抗原性ポリペプチドに融合される人工シグナルペプチドは、免疫グロブリンタンパク質、例えば、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧシグナルペプチドから得られる。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされるＲＳＶ抗原性ポリペプチドに融合されるシグナルペプチドは、ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号２８１）の配列を有するＩｇ重鎖ε−１シグナルペプチド（ＩｇＥ ＨＣ ＳＰ）である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされるＲＳＶ抗原性ポリペプチドに融合されるシグナルペプチドは、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２８２）の配列を有するＩｇＧｋ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域のＨＡＨシグナルペプチド（ＩｇＧｋＳＰ）である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされるＲＳＶ抗原性ポリペプチドは、配列番号２８１または配列番号２８２のシグナルペプチドに融合された配列番号１〜配列番号２８のうちの１つに記載されるアミノ酸配列を有する。本明細書で開示される例は、限定を意図するものではなく、プロセシングのためのタンパク質のＥＲへの標的化及び／またはタンパク質の細胞膜への標的化を促進することが当該技術分野において知られているあらゆるシグナルペプチドを本開示に従って使用することができる。
シグナルペプチドは、１５〜６０アミノ酸長を有し得る。例えば、シグナルペプチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０アミノ酸長を有し得る。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、２０〜６０、２５〜６０、３０〜６０、３５〜６０、４０〜６０、４５〜６０、５０〜６０、５５〜６０、１５〜５５、２０〜５５、２５〜５５、３０〜５５、３５〜５５、４０〜５５、４５〜５５、５０〜５５、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、１５〜４５、２０〜４５、２５〜４５、３０〜４５、３５〜４５、４０〜４５、１５〜４０、２０〜４０、２５〜４０、３０〜４０、３５〜４０、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、１５〜２５、２０〜２５または１５〜２０アミノ酸長を有し得る。
シグナルペプチドは、典型的に、ＥＲプロセシング中に切断部位で新生ポリペプチドから切断される。本開示のＲＳＶ ＲＮＡワクチンによって産生される成熟ＲＳＶ抗原性ポリペプチドは、典型的に、シグナルペプチドを含まない。
化学修飾
本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、当該ＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾を含む。
「化学修飾」及び「化学修飾された（化学修飾型）」という用語は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）のリボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドに対する、その位置、パターン、パーセントまたは集団のうちの少なくとも１つにおける修飾を指す。一般に、これらの用語は、天然に存在する５’末端のｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すものではない。
ポリヌクレオチドの修飾には、限定するものではないが、本明細書に記載されるものが含まれ、化学修飾を含む修飾が含まれるが、これらに明示的に限定されるものではない。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、天然、非天然である修飾を含み得、またはポリヌクレオチドは、天然及び非天然修飾の組み合わせを含み得る。ポリヌクレオチドは、任意の有用な修飾を含み得、例えば、糖、核酸塩基またはヌクレオシド間結合（例えば、リン酸、ホスホジエステル連結またはホスホジエステル主鎖への結合）の修飾を含み得る。
ポリペプチドに関して、「修飾」という用語は、標準形の２０アミノ酸セットに対する修飾を指す。本明細書で提供されるポリペプチドは、アミノ酸の置換、挿入または置換と挿入の組み合わせを含有する場合も、「修飾された」とみなされる。
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、いくつかの実施形態において、種々の（１つを超える）異なる修飾を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの特定領域は、１つ、２つまたはそれ以上の（任意選択により異なる）ヌクレオシド修飾またはヌクレオチド修飾を含有する。いくつかの実施形態において、修飾型ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾型ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、細胞または生物に導入されると、非修飾型ポリヌクレオチドと比べて、細胞または生物のそれぞれにおいて低減された分解を示す。いくつかの実施形態において、修飾型ＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、修飾型ｍＲＮＡポリヌクレオチド）は、細胞または生物に導入されると、細胞または生物のそれぞれにおいて低減された免疫原性（例えば、低減された先天性応答）を示し得る。
ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、いくつかの実施形態において、所望の機能または特性を達成するために、ポリヌクレオチドの合成中または合成後に導入される非天然修飾型ヌクレオチドを含む。修飾は、ヌクレオチド間結合、プリン塩基もしくはピリミジン塩基、または糖に存在してもよい。修飾は、化学合成またはポリメラーゼ酵素を用いて、鎖の末端または鎖の他の場所に導入することができる。ポリヌクレオチドのいずれの領域も化学修飾され得る。
本開示は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書において「核酸塩基」ともいう）との組み合わせで含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、任意の有用な方法によって、例えば、化学的、酵素的または組み換え的に、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたは非天然ヌクレオシドを含むように合成することができる。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの１つまたは複数の領域を含み得る。そのような領域は、様々な主鎖結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、この場合、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含むことになる。
修飾されたヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシルまたはグアノシン−シトシンの塩基対だけでなく、ヌクレオチド及び／または非標準的塩基もしくは修飾された塩基を含む修飾ヌクレオチドの間で形成される塩基対も包含され、ここで、水素結合ドナーと水素結合アクセプターの配置は、非標準的塩基と標準的塩基との間、または２つの相補的な非標準的塩基構造（例えば、少なくとも１つの化学修飾を有するポリヌクレオチドにおけるものなど）との間の水素結合を可能にするものである。そのような非標準的塩基対合の一例は、修飾されたヌクレオチドのイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本開示のポリヌクレオチドに組み込むことができる。
化学修飾を含むがこれらに限定されない、本開示の組成物、ワクチン、方法及び合成手順に有用なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾は、限定するものではないが、次のものが含まれる：２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、１，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、１−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）、２−メチルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）、イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、Ｎ６−アセチルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、７−デアザ−アデノシン、Ｎ１−メチル−アデノシン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、Ｎ６−シス−ヒドロキシ−イソペンテニル−アデノシン、α−チオ−アデノシン、２（アミノ）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２−（アミノプロピル）アデニン、２−（ハロ）アデニン、２−（ハロ）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＡＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アミノアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アジドアデノシンＴＰ、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、６−（アルキル）アデニン、６−（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８−（アルキニル）アデニン、８−（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８−（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、８−アジド−アデノシン、アザアデニン、デアザアデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデノシン、７−メチルアデニン、１−デアザアデノシンＴＰ、２’フルオロ−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ、２’−ＯＭｅ−２−アミノ−ＡＴＰ、２’Ｏ−メチル−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ、２’−ａ−エチニルアデノシンＴＰ、２−アミノアデニン、２−アミノアデノシンＴＰ、２−アミノ−ＡＴＰ、２’−ａ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２−アジドアデノシンＴＰ、２’−ｂ−エチニルアデノシンＴＰ、２−ブロモアデノシンＴＰ、２’−ｂ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、２−クロロアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトアデノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシアデノシンＴＰ、２−フルオロアデノシンＴＰ、２−ヨードアデノシンＴＰ、２−メルカプトアデノシンＴＰ、２−メトキシ−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、３−デアザ−３−ブロモアデノシンＴＰ、３−デアザ−３−クロロアデノシンＴＰ、３−デアザ−３−フルオロアデノシンＴＰ、３−デアザ−３−ヨードアデノシンＴＰ、３−デアザアデノシンＴＰ、４’−アジドアデノシンＴＰ、４’−炭素環式アデノシンＴＰ、４’−エチニルアデノシンＴＰ、５’−ホモ−アデノシンＴＰ、８−アザ−ＡＴＰ、８−ブロモ−アデノシンＴＰ、８−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ、９−デアザアデノシンＴＰ、２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、２−チオシチジン、３−メチルシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン、リシジン、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４−ジメチル−２’−ＯＭｅ−シチジンＴＰ、４−メチルシチジン、５−アザ−シチジン、プソイド−イソ−シチジン、ピロロ−シチジン、α−チオ−シチジン、２−（チオ）シトシン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＣＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＣＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アミノシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アジドシチジンＴＰ、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３（メチル）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３−（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（メチル）シチジン、４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５−（ハロ）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（トリフルオロメチル）シトシン、５−ブロモ−シチジン、５−ヨード−シチジン、５−プロピニルシトシン、６−（アゾ）シトシン、６−アザ−シチジン、アザシトシン、デアザシトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、２−メトキシ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、ピロロ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）シチジンＴＰ、２，２’−無水−シチジンＴＰ塩酸塩、２’フルオロ−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ、２’フルオロ−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ、２’−Ｏ−メチル−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ、２’Ｏ−メチル−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ、２’−ａ−エチニルシチジンＴＰ、２’−ａ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’−ｂ−エチニルシチジンＴＰ、２’−ｂ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトシチジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシシチジンＴＰ、２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）シチジンＴＰ、３’−エチニルシチジンＴＰ、４’−アジドシチジンＴＰ、４’−炭素環式シチジンＴＰ、４’−エチニルシチジンＴＰ、５−（１−プロピニル）アラ−シチジンＴＰ、５−（２−クロロ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ、５−（４−アミノ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ、５−アミノアリル−ＣＴＰ、５−シアノシチジンＴＰ、５−エチニルアラ−シチジンＴＰ、５−エチニルシチジンＴＰ、５’−ホモ−シチジンＴＰ、５−メトキシシチジンＴＰ、５−トリフルオロメチル−シチジンＴＰ、Ｎ４−アミノ−シチジンＴＰ、Ｎ４−ベンゾイル−シチジンＴＰ、プソイドイソシチジン、７−メチルグアノシン、Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、ワイオシン、１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン、１−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）、７−アミノメチル−７−デアザグアノシン、７−シアノ−７−デアザグアノシン、アルカエオシン、メチルワイオシン、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン、６−チオ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２（プロピル）グアニン、２−（アルキル）グアニン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＧＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＧＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アミノグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アジドグアノシンＴＰ、６（メチル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６−（メチル）グアニン、６−メチル−グアノシン、７（アルキル）グアニン、７（デアザ）グアニン、７（メチル）グアニン、７−（アルキル）グアニン、７−（デアザ）グアニン、７−（メチル）グアニン、８（アルキル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８（ハロ）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８−（アルキル）グアニン、８−（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８−（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８−（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、アザグアニン、デアザグアニン、Ｎ（メチル）グアニン、Ｎ−（メチル）グアニン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、６−メトキシ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、２’フルオロ−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ、２’Ｏ−メチル−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ、２’−ａ−エチニルグアノシンＴＰ、２’−ａ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’−ｂ−エチニルグアノシンＴＰ、２’−ｂ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオログアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−クロログアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオログアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトグアノシンＴＰ、２’−デオキシ−２’−
ｂ−チオメトキシグアノシンＴＰ、４’−アジドグアノシンＴＰ、４’−炭素環式グアノシンＴＰ、４’−エチニルグアノシンＴＰ、５’−ホモ−グアノシンＴＰ、８−ブロモ−グアノシンＴＰ、９−デアザグアノシンＴＰ、Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ、１−メチルイノシン、イノシン、１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン、２’−Ｏ−メチルイノシン、７−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルイノシン、エポキシクエオシン、ガラクトシル−クエオシン、マンノシルクエオシン、クエオシン、アリルアミノ−チミジン、アザチミジン、デアザチミジン、デオキシ−チミジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチルウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−タウリノメチル−２−チオウリジン、５−タウリノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−５−カルボキシプロピル）プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン、１−エチル−プソイドウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、３−メチル−プソイド−ウリジンＴＰ、４−チオウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン、５，６−ジヒドロ−ウリジン、５−アミノメチル−２−チオウリジン、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルバモイルメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５−カルバモイルメチルウリジンＴＰ、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メチルウリジン，）、５−メトキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルジヒドロウリジン、５−オキシ酢酸−ウリジンＴＰ、５−オキシ酢酸−メチルエステル−ウリジンＴＰ、Ｎ１−メチル−プソイド−ウラシル、Ｎ１−エチル−プソイド−ウラシル、ウリジン５−オキシ酢酸、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−ウリジンＴＰ、５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジンＴＰ、５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンＴＰ、５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ、５−プロピニルウラシル、α−チオ−ウリジン、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチルエニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチルエニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチルエニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチルエニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチルエニル）−プソイドウラシル、１置換２（チオ）−プソイドウラシル、１置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１置換４（チオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１−（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチルエニル）−２−（チオ）−プソイドウラシル、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−プソイド−ＵＴＰ、１−エチル−プソイド−ＵＴＰ、２（チオ）プソイドウラシル、２’デオキシウリジン、２’フルオロウリジン、２−（チオ）ウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−グアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＵＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＵＴＰ、２’−アジド−デオキシウリジンＴＰ、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、２’デオキシウリジン、２’フルオロウリジン、２’−デオキシ−２’−ａ−アミノウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−アジドウリジンＴＰ、２−メチルプソイドウリジン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、４（チオ）プソイドウラシル、４−（チオ）プソイドウラシル、４−（チオ）ウラシル、４−チオウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（ｌ，３−ジアゾール−ｌ−アルキル）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５−（メチル）２（チオ）ウラシル、５−（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５−（メチル）４（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、５−アミノアリル−ウリジン、５−ブロモ−ウリジン、５−ヨード−ウリジン、５−ウラシル、６（アゾ）ウラシル、６−（アゾ）ウラシル、６−アザ−ウリジン、アリルアミノ−ウラシル、アザウラシル、デアザウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、プソイド−ＵＴＰ−１−２−エタン酸、プソイドウラシル、４−チオ−プソイド−ＵＴＰ、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、１−プロピニル−ウリジン、１−タウリノメチル−１−メチル−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、２−メトキシ−４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、（±）１−（２−ヒドロキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、（２Ｒ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、（２Ｓ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ、（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ、（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ、（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ、１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−プソイド−ＵＴＰ、１−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）プソイドウリジンＴＰ、１−（２，２−ジエトキシエチル）プソイドウリジンＴＰ、１−（２，４，６−トリメチルベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（２，４，６−トリメチル−ベンジル）プソイド−ＵＴＰ、１−（２，４，６−トリメチル−フェニル）プソイド−ＵＴＰ、１−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）プソイド−ＵＴＰ、１−（２−アミノ−エチル）プソイド−ＵＴＰ、１−（２−ヒドロキシエチル）プソイドウリジンＴＰ、１−（２−Ｍエトキシエチル）プソイドウリジンＴＰ、１−（３，４−ビス−トリフルオロメトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（３，４−ジメトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイド−ＵＴＰ、１−（３−アミノ−プロピル）プソイド−ＵＴＰ、１−（３−シクロプロピル−プロパ−２−イニル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−アミノ−４−カルボキシブチル）プソイド−ＵＴＰ、１−（４−アミノ−ベンジル）プソイド−ＵＴＰ、１−（４−アミノ−ブチル）プソイド−ＵＴＰ、１−（４−アミノ−フェニル）プソイド−ＵＴＰ、１−（４−アジドベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−ブロモベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−クロロベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−フルオロベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−ヨードベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−メタンスルホニルベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−メトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−メトキシ−ベンジル）プソイド−ＵＴＰ、１−（４−メトキシ−フェニル）プソイド−ＵＴＰ、１−（４−メチルベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−メチル−ベンジル）プソイド−ＵＴＰ、１−（４−ニトロベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−ニトロ−ベンジル）プソイド−ＵＴＰ、１（４−ニトロ−フェニル）プソイド−ＵＴＰ、１−（４−チオメトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−トリフルオロメトキシベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−トリフルオロメチルベンジル）プソイドウリジンＴＰ、１−（５−アミノ−ペンチル）プソイド−ＵＴＰ、１−（６−アミノ−ヘキシル）プソイド−ＵＴＰ、１，６−ジメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−［３−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオニル］プソイドウリジンＴＰ、１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−プロピオニル｝プソイドウリジンＴＰ、１−アセチルプソイドウリジンＴＰ、１−アルキル−６−（１−プロピニル）−プソイド−ＵＴＰ、１−アルキル−６−（２−プロピニル）−プソイド−ＵＴＰ、１−アルキル−６−アリル−プソイド−ＵＴＰ、１−アルキル−６−エチニル−プソイド−ＵＴＰ、１−アルキル−６−ホモアリル−プソイド−ＵＴＰ、１−アルキル−６−ビニル−プソイド−ＵＴＰ、１−アリルプソイドウリジンＴＰ、１−アミノメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−ベンゾイルプソイドウリジンＴＰ、１−ベンジルオキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１−ベンジル−プソイド−ＵＴＰ、１−ビオチニル−
ＰＥＧ２−プソイドウリジンＴＰ、１−ビオチニルプソイドウリジンＴＰ、１−ブチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シアノメチルプソイドウリジンＴＰ、１−シクロブチルメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロブチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロヘプチルメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロヘプチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロヘキシルメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロヘキシル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロオクチルメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロオクチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロペンチルメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロペンチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロプロピルメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−シクロプロピル−プソイド−ＵＴＰ、１−エチル−プソイド−ＵＴＰ、１−ヘキシル−プソイド−ＵＴＰ、１−ホモアリルプソイドウリジンＴＰ、１−ヒドロキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１−イソ−プロピル−プソイド−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−２−チオ−プソイド−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−４−チオ−プソイド−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−アルファ−チオ−プソイド−ＵＴＰ、１−メタンスルホニルメチルプソイドウリジンＴＰ、１−メトキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１−メチル−６−（２，２，２−トリフルオロエチル）プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−（４−モルホリノ）−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−（４−チオモルホリノ）−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−（置換フェニル）プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−アミノ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−アジド−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−ブロモ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−ブチル−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−クロロ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−シアノ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−ジメチルアミノ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−エトキシ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−エチルカルボキシレート−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−エチル−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−フルオロ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−ホルミル−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−ヒドロキシアミノ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−ヒドロキシ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−ヨード−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−イソ−プロピル−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−メトキシ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−メチルアミノ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−フェニル−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−プロピル−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−ｔｅｒｔ−ブチル−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−トリフルオロメトキシ−プソイド−ＵＴＰ、１−メチル−６−トリフルオロメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−モルホリノメチルプソイドウリジンＴＰ、１−ペンチル−プソイド−ＵＴＰ、１−フェニル−プソイド−ＵＴＰ、１−ピバロイルプソイドウリジンＴＰ、１−プロパルギルプソイドウリジンＴＰ、１−プロピル−プソイド−ＵＴＰ、１−プロピニル−プソイドウリジン、１−ｐ−トリル−プソイド−ＵＴＰ、１−ｔｅｒｔ−ブチル−プソイド−ＵＴＰ、１−チオメトキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１−チオモルホリノメチルプソイドウリジンＴＰ、１−トリフルオロアセチルプソイドウリジンＴＰ、１−トリフルオロメチル−プソイド−ＵＴＰ、１−ビニルプソイドウリジンＴＰ、２，２’−無水−ウリジンＴＰ、２’−ブロモ−デオキシウリジンＴＰ、２’−Ｆ−５−メチル−２’−デオキシ−ＵＴＰ、２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−ＵＴＰ、２’−ＯＭｅ−プソイド−ＵＴＰ、２’−ａ−エチニルウリジンＴＰ、２’−ａ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’−ｂ−エチニルウリジンＴＰ、２’−ｂ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトウリジンＴＰ、２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシウリジンＴＰ、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、２−メトキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）ウリジンＴＰ、３−アルキル−プソイド−ＵＴＰ、４’−アジドウリジンＴＰ、４’−炭素環式ウリジンＴＰ、４’−エチニルウリジンＴＰ、５−（１−プロピニル）アラ−ウリジンＴＰ、５−（２−フラニル）ウリジンＴＰ、５−シアノウリジンＴＰ、５−ジメチルアミノウリジンＴＰ、５’−ホモ−ウリジンＴＰ、５−ヨード−２’−フルオロ−デオキシウリジンＴＰ、５−フェニルエチニルウリジンＴＰ、５−トリ重水素メチル−６−重水素ウリジンＴＰ、５−トリフルオロメチル−ウリジンＴＰ、５−ビニルアラウリジンＴＰ、６−（２，２，２−トリフルオロエチル）−プソイド−ＵＴＰ、６−（４−モルホリノ）−プソイド−ＵＴＰ、６−（４−チオモルホリノ）−プソイド−ＵＴＰ、６−（置換フェニル）−プソイド−ＵＴＰ、６−アミノ−プソイド−ＵＴＰ、６−アジド−プソイド−ＵＴＰ、６−ブロモ−プソイド−ＵＴＰ、６−ブチル−プソイド−ＵＴＰ、６−クロロ−プソイド−ＵＴＰ、６−シアノ−プソイド−ＵＴＰ、６−ジメチルアミノ−プソイド−ＵＴＰ、６−エトキシ−プソイド−ＵＴＰ、６−エチルカルボキシレート−プソイド−ＵＴＰ、６−エチル−プソイド−ＵＴＰ、６−フルオロ−プソイド−ＵＴＰ、６−ホルミル−プソイド−ＵＴＰ、６−ヒドロキシアミノ−プソイド−ＵＴＰ、６−ヒドロキシ−プソイド−ＵＴＰ、６−ヨード−プソイド−ＵＴＰ、６−イソ−プロピル−プソイド−ＵＴＰ、６−メトキシ−プソイド−ＵＴＰ、６−メチルアミノ−プソイド−ＵＴＰ、６−メチル−プソイド−ＵＴＰ、６−フェニル−プソイド−ＵＴＰ、６−フェニル−プソイド−ＵＴＰ、６−プロピル−プソイド−ＵＴＰ、６−ｔｅｒｔ−ブチル−プソイド−ＵＴＰ、６−トリフルオロメトキシ−プソイド−ＵＴＰ、６−トリフルオロメチル−プソイド−ＵＴＰ、アルファ−チオ−プソイド−ＵＴＰ、プソイドウリジン１−（４−メチルベンゼンスルホン酸）ＴＰ、プソイドウリジン１−（４−メチル安息香酸）ＴＰ、プソイドウリジンＴＰ１−［３−（２−エトキシ）］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−（２−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−｛２（２−エトキシ）−エトキシ｝−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−［２−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ１−［３−｛２−（２−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸、プソイドウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸、プソイドウリジンＴＰ１−メチルホスホン酸ジエチルエステル、プソイド−ＵＴＰ−Ｎ１−３−プロピオン酸、プソイド−ＵＴＰ−Ｎ１−４−ブタン酸、プソイド−ＵＴＰ−Ｎ１−５−ペンタン酸、プソイド−ＵＴＰ−Ｎ１−６−ヘキサン酸、プソイド−ＵＴＰ−Ｎ１−７−ヘプタン酸、プソイド−ＵＴＰ−Ｎ１−メチル−ｐ−安息香酸、プソイド−ＵＴＰ−Ｎ１−ｐ−安息香酸、ワイブトシン、ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、低修飾ヒドロキシワイブトシン、４−デメチルワイオシン、２，６−（ジアミノ）プリン、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル：１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−ｌ−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、２（アミノ）プリン、２，４，５−（トリメチル）フェニル、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−シチジン、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−アデニン、２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−ウリジン、２’−アミノ−２’−デオキシリボース、２−アミノ−６−クロロ−プリン、２−アザ−イノシニル、２’−アジド−２’−デオキシリボース、２’フルオロ−２’−デオキシリボース、２’−フルオロ−修飾塩基、２’−Ｏ−メチル−リボース、２−オキソ−７−アミノピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、２−ピリジノン、３ニトロピロール、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、５ニトロインドール、５置換ピリミジン、５−（メチル）イソカルボスチリリル、５−ニトロインドール、６−（アザ）ピリミジン、６−（アゾ）チミン、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、６−クロロ−プリン、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アザ）インドリル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、７−デアザ−イノシニル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、アミノインドリル、アントラセニル、ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ジフルオロトリル、ヒポキサンチン、イミジゾピリジニル、イノシニル、イソカルボスチリリル、イソグアニシン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｎ−アルキル化誘導体、ナフタレニル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロイミダゾリル、ニトロインダゾリル、ニトロピラゾリル、ヌブラリン、Ｏ６−置換プリン、Ｏ−アルキル化誘導体、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オキソホルミシンＴＰ、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ペンタセニル、フェナントラセニル、フェニル、プロピニル−７−（アザ）イン
ドリル、ピレニル、ピリドピリミジン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピロロピリミジニル、ピロロピリジニル、スチルベンジル、置換１，２，４−トリアゾール、テトラセニル、ツベルシジン、キサンチン、キサントシン−５’−ＴＰ、２−チオ−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、２−アミノ−リボシド−ＴＰ、ホルマイシンＡＴＰ、ホルマイシンＢＴＰ、ピロロシンＴＰ、２’−ＯＨ−アラ−アデノシンＴＰ、２’−ＯＨ−アラ−シチジンＴＰ、２’−ＯＨ−アラ−ウリジンＴＰ、２’−ＯＨ−アラ−グアノシンＴＰ、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ、及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）アデノシンＴＰ。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾核酸塩基は、プソイドウリジン（ψ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、α−チオ−グアノシン、α−チオ−アデノシン、５−シアノウリジン、４’−チオウリジン７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び２，６−ジアミノプリン、（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、２，８−ジメチルアデノシン、２−ゲラニルチオウリジン、２−リシジン、２−セレノウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−５，６−ジヒドロウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン、３−メチルプソイドウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンメチルエステル、５−アミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−アミノメチル−２−セレノウリジン、５−アミノメチルウリジン、５−カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−シアノメチルウリジン、５−ヒドロキシシチジン、５−メチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、７−アミノカルボキシプロピル−デメチルワイオシン、７−アミノカルボキシプロピルワイオシン、７−アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８−メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４−ジメチルシチジン、Ｎ６−ホルミルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環式Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル−クエオシン、メチル化低修飾ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチルシチジン、ゲラニル化５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、ゲラニル化５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、Ｑ塩基、ｐｒｅＱ０塩基、ｐｒｅＱ１塩基、ならびにこれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、１−エチル−プソイドウリジン、５−メチルシトシン、５−メトキシウリジン及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリリボヌクレオチドなどのＲＮＡポリリボヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾核酸塩基は、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、プソイドウリジン（ψ）、α−チオ−グアノシン及びα−チオ−アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、前述の修飾核酸塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４つまたはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、プソイドウリジン（ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１−エチル−プソイドウリジン（ｅ１ψ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、１−エチル−プソイドウリジン（ｅ１ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチドなどのＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾のために均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体にわたって修飾される）。例えば、ポリヌクレオチドは、１−メチル−プソイドウリジンで均一に修飾され得、すなわち、ｍＲＮＡ配列中の全てのウリジン残基が１−メチル−プソイドウリジンで置き換えられる。同様に、ポリヌクレオチドは、配列中に存在するあらゆる種類のヌクレオシド残基が上記のものなどの修飾残基で置き換えられることによって、均一に修飾され得る。
修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）及び２−チオ−５−メチル−シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシウリジン、２−チオウリジン、５−シアノウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン及び４’−チオウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）及びＮ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン及び７−メチル−８−オキソ−グアノシンが挙げられる。
本開示のポリヌクレオチドは、分子の全長にわたって部分的にまたは完全に修飾され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはその所定の配列領域（例えば、ポリＡテールを含む、または含まないｍＲＮＡ）中の１つ以上または全てまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上もしくは全て）が均一に修飾され得る。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチド（またはその所与の配列領域）中の全てのヌクレオチドＸが、修飾ヌクレオチドであり、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つである。
ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを約１％〜約１００％（全体的なヌクレオチド含有量に対して、またはヌクレオチドの１つ以上の種類（すなわち、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣのうちのいずれか１つ以上）に対して）、またはその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％及び９５％〜１００％）含有し得る。任意の残りのパーセンテージは、非修飾のＡ、Ｇ、ＵまたはＣの存在によって占められることは理解されるであろう。
ポリヌクレオチドは、最小１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、またはその間の任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、修飾ウラシルまたは修飾シトシンなどの修飾ピリミジンを含有し得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾ウラシル（例えば、５−置換ウラシル）によって置き換えられる。修飾ウラシルは、単一の特有な構造を有する化合物によって置き換えられてもよいし、異なる構造（例えば、２、３、４つまたはそれ以上の特有な構造）を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、修飾シトシン（例えば、５−置換シトシン）によって置き換えられる。修飾シトシンは、単一の特有な構造を有する化合物によって置き換えられてもよいし、異なる構造（例えば、２、３、４つまたはそれ以上の特有な構造）を有する複数の化合物によって置き換えられてもよい。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、及び５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−アラ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン及び５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、α−チオ−シチジン、２’−Ｏ−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４ ２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−アラ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン及び２’−ＯＨ−アラ−シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６ ２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−アラ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−アラ−アデノシン及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノンアデシル）−アデノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基及びヌクレオシドには、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ）、低修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯｈｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、クエオシン（Ｑ）、エポキシクエオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−クエオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−クエオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２ ２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、Ｏ６−メチル−グアノシン、２’−Ｆ−アラ−グアノシン、及び２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、５’ＵＴＲエレメント、任意選択によりコドン最適化オープンリーディングフレームならびに３’ＵＴＲエレメント、ポリ（Ａ）配列及び／またはポリアデニル化シグナルを含み、当該ＲＮＡは、化学修飾されていない。
ＲＳＶ ＲＮＡワクチン：ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
本開示のＲＳＶワクチンは、ｍＲＮＡ（例えば、修飾されたｍＲＮＡ）などの少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡは、例えば、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型」と呼ばれる鋳型ＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を有する。少なくとも１つの化学修飾には、明示的に限定されるものではないが、本明細書に記載の任意の修飾が含まれ得る。
ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、当該技術分野において知られており、国際公開第ＷＯ／２０１４／１５２０２７号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写産物は、ＲＮＡ転写産物を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応において、増幅されていない線状ＤＮＡ鋳型を使用して生成される。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写産物は、酵素的キャッピングによりキャッピングされる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写産物は、クロマトグラフ法により、例えば、オリゴｄＴ基質を使用して精製される。いくつかの実施形態は、ＤＮａｓｅの使用を除外する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ転写産物は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ及び所望の化学物質のヌクレオチド三リン酸を利用する酵素的ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応により、目的遺伝子をコードする増幅されていない線状ＤＮＡ鋳型から合成される。任意数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントを本発明の方法で使用することができる。ポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮａポリメラーゼ及び／または変異ポリメラーゼ（例えば、限定するものではないが、化学修飾された核酸及び／またはヌクレオチドを含む修飾核酸及び／または修飾ヌクレオチドを組み込むことができるポリメラーゼ）から選択され得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、増幅されていない線状化プラスミドＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型ＤＮＡとして利用する。いくつかの実施形態において、鋳型ＤＮＡは、単離されたＤＮＡである。いくつかの実施形態において、鋳型ＤＮＡは、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、限定するものではないが、ＲＳＶ ＲＮＡ、例えば、ＲＳＶ ｍＲＮＡの逆転写によって形成される。いくつかの実施形態において、細胞は、例えば、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉであり、例えば、ＤＨ−１細胞にプラスミドＤＮＡ鋳型をトランスフェクトする。いくつかの実施形態において、トランスフェクトした細胞を培養してプラスミドＤＮＡを複製し、その後、プラスミドＤＮＡを単離及び精製する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ鋳型は、５’側に位置し、目的遺伝子に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型は、５’非翻訳（ＵＴＲ）領域をコードし、オープンリーディングフレームを含有し、３’ＵＴＲ及びポリＡテールをコードする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写鋳型の特定の核酸配列の組成及び長さは、鋳型によってコードされるｍＲＮＡに依存する。
「５’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写産物の最初のコドン）から直接上流（すなわち、５’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「３’非翻訳領域」（ＵＴＲ）は、ポリペプチドをコードしていない終止コドン（すなわち、翻訳の終結を伝達するｍＲＮＡ転写産物のコドン）から直接下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域を指す。
「オープンリーディングフレーム」は、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わり、かつポリペプチドをコードするＤＮＡの連続ストレッチである。
「ポリＡテール」は、多数の連続したアデノシン一リン酸を含有する、３’ＵＴＲから下流、例えば、直接下流（すなわち、３’側）にあるｍＲＮＡの領域である。ポリＡテールは、１０〜３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。例えば、ポリＡテールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００個のアデノシン一リン酸を含有し得る。いくつかの実施形態において、ポリＡテールは、５０〜２５０個のアデノシン一リン酸を含有する。関連する生物学的環境内（例えば、細胞内、ｉｎ ｖｉｖｏ）において、ポリ（Ａ）テールは、例えば、細胞質内での酵素分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、かつ／または転写終結、核からのｍＲＮＡの輸送及び翻訳を助ける。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２００〜３，０００個のヌクレオチドを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、２００〜５００、２００〜１０００、２００〜１５００、２００〜３０００、５００〜１０００、５００〜１５００、５００〜２０００、５００〜３０００、１０００〜１５００、１０００〜２０００、１０００〜３０００、１５００〜３０００または２０００〜３０００個のヌクレオチドを含み得る。
治療方法
ヒト及び他の動物におけるＲＳＶの予防及び／または治療のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット及び試薬が本明細書で提供される。ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。これは、感染症の予防及び／または治療のための薬剤として使用することができる。例示的な態様において、本開示のＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ＲＳＶからの予防的保護を提供するために使用される。ＲＳＶからの予防的保護は、本開示のＲＳＶ ＲＮＡワクチンの投与後に達成され得る。ワクチンは、１回、２回、３回、４回またはそれ以上投与することができるが、ワクチンを１回投与すれば十分であり得る（その後、任意選択により１回のブースターを行う）。あまり望ましくはないが、感染個体にワクチンを投与して治療応答を達成することが可能である。用量は適宜調整する必要があり得る。
本発明の態様において、ＲＳＶに対する対象の免疫応答を誘発する方法が提供される。方法は、少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＳＶ ＲＮＡワクチンを対象に投与することを伴い、これにより、当該対象において、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、当該対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、ＲＳＶに対する従来型（例えば、非核酸）ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して増加する。「抗抗原性ポリペプチド抗体」は、抗原性ポリペプチドに特異的に結合する血清抗体である。
予防上有効な用量は、臨床的に許容されるレベルでウイルスの感染を防ぐ治療上有効な用量である。いくつかの実施形態において、治療上有効な用量は、ワクチンの添付文書に列挙される用量である。従来型ワクチンは、本明細書で使用されるとき、本発明のｍＲＮＡワクチン以外のワクチンを指す。例えば、従来型ワクチンには、生きた微生物のワクチン、死滅した微生物のワクチン、サブユニットワクチン、タンパク質抗原ワクチン、ＤＮＡワクチンなどが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、ＲＳＶに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、１ｌｏｇ〜１０ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、ＲＳＶに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、１ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、ＲＳＶに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、２ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、ＲＳＶに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、３ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、ＲＳＶに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、５ｌｏｇ増加する。
いくつかの実施形態において、対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価は、ワクチン接種後、ＲＳＶに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象の抗抗原性ポリペプチド抗体力価と比較して、１０ｌｏｇ増加する。
本発明の他の態様において、ＲＳＶに対する対象の免疫応答を誘発する方法が提供される。方法は、少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＳＶ ＲＮＡワクチンを対象に投与することを伴い、これにより、当該対象において、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、当該対象における免疫応答は、ＲＳＶに対する従来型ワクチンをＲＮＡワクチンに対して２倍〜１００倍の用量レベルで接種した対象における免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して２倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して３倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して４倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して５倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して１０倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して５０倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して１００倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して１０〜１０００倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
いくつかの実施形態において、対象の免疫応答は、従来型ワクチンをＲＳＶ ＲＮＡワクチンに対して１００〜１０００倍の用量レベルで接種した対象の免疫応答と同等である。
他の実施形態において、免疫応答は、対象における［タンパク質］抗体力価を決定することによって評価される。
他の態様において、本発明は、少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＳＶ ＲＮＡワクチンを対象に投与することによって、当該対象において、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であり、これにより、当該対象において、ＲＳＶ抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片に特異的な免疫応答を誘導するものであり、当該対象における免疫応答は、ＲＳＶに対する従来型ワクチンを予防上有効な用量で接種した対象において誘発される免疫応答と比較して２日〜１０週間早く誘導される。いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、ＲＮＡワクチンに対して２倍〜１００倍の用量である予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、２日早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、３日早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、１週間早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、２週間早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、３週間早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、５週間早く誘導される。
いくつかの実施形態において、対象における免疫応答は、予防上有効な用量の従来型ワクチンを接種した対象において誘発される免疫応答と比較して、１０週間早く誘導される。
広域スペクトルＲＳＶワクチン
２種以上のＲＳＶ株に感染するリスクのある状況が想定される。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）治療用ワクチンは、限定するものではないが、製造スピード、認められた地理的脅威に適合するようにワクチンを迅速に調整できる能力などを含むいくつかの因子により、混合ワクチン手法に特に適している。更に、当該ワクチンは、人体を利用して抗原性タンパク質を産生するので、より大きくより複雑な抗原性タンパク質の産生に適しており、これにより、ヒト対象における適切な折り畳み、表面発現、抗原提示などが可能となる。２種以上のＲＳＶ株から保護するために、第１のＲＳＶの少なくとも１つの抗原性ポリペプチドタンパク質（またはその抗原性部分）をコードするＲＮＡを含み、第２のＲＳＶの少なくとも１つの抗原性ポリペプチドタンパク質（またはその抗原性部分）をコードするＲＮＡを更に含む、混合ワクチンを投与することができる。ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、例えば、単一の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に一緒に製剤化されてもよいし、共投与が予定されている別々のＬＮＰ中に製剤化されてもよい。
フラジェリンアジュバント
フラジェリンは、約５００アミノ酸の単量体タンパク質であり、重合することにより、細菌の動きに関与する鞭毛を形成する。フラジェリンは、種々の有鞭毛型細菌（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及び無鞭毛型細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなど）によって発現されている。自然免疫系細胞（樹状細胞、マクロファージなど）によるフラジェリンの感知は、Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）ならびにＮｏｄ様受容体（ＮＬＲ）Ｉｐａｆ及びＮａｉｐ５によって媒介される。ＴＬＲ及びＮＬＲは、自然免疫応答及び適応免疫応答を活性化する役割を担うことが特定されている。したがって、フラジェリンは、ワクチンにおいて、アジュバント効果をもたらす。
既知のフラジェリンポリペプチドをコードするヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公開されている。なかでも、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．Ｃｈｏｌｅｒａ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｅｎｓ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｔ．Ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｅｉ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｒ．ｌｕｐｉｎｉ、Ｂ．ｃｌａｒｒｉｄｇｅｉａｅ、Ｐ．Ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＥ．ｃｏｌｉに由来するフラジェリン配列が知られている。
フラジェリンポリペプチドは、本明細書で使用されるとき、完全長フラジェリンタンパク質、その免疫原性断片、及びフラジェリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチドを指す。例示的なフラジェリンタンパク質には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（ＵｎｉＰｒｏエントリー番号Ｑ５６０８６）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＤＧ０９）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（Ａ０Ａ０Ｃ９ＢＡＢ７）、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（Ｑ６Ｖ２Ｘ８）ならびに配列番号１７３〜１７５に由来するフラジェリンが挙げられる。いくつかの実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、フラジェリンタンパク質またはその免疫原性断片に対して、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、フラジェリンポリペプチドは、免疫原性断片である。免疫原性断片は、免疫応答を惹起するフラジェリンタンパク質の一部である。いくつかの実施形態において、免疫応答は、ＴＬＲ５免疫応答である。免疫原性断片の一例は、ヒンジ領域の全てまたは一部が欠失しているか、他のアミノ酸で置き換えられているフラジェリンタンパク質である。例えば、抗原性ポリペプチドは、ヒンジ領域に挿入され得る。ヒンジ領域は、フラジェリンの超可変領域である。フラジェリンのヒンジ領域は、「Ｄ３ドメインまたはＤ３領域」、「プロペラドメインまたはプロペラ領域」、「超可変ドメインまたは超可変領域」及び「可変ドメインまたは領可変域」とも呼ばれる。「ヒンジ領域の少なくとも一部」は、本明細書で使用されるとき、フラジェリンのヒンジ領域の任意の部分またはヒンジ領域全体を指す。他の実施形態において、フラジェリンの免疫原性断片は、フラジェリンの２０、２５、３０、３５または４０アミノ酸Ｃ末端断片である。
フラジェリン単量体は、ドメインＤ０〜Ｄ３によって形成される。ステムを形成する０及びＤ１は、縦に並んだ長いアルファヘリックスから構成され、種々の細菌間で高度に保存されている。Ｄ１ドメインは、ＴＬＲ５活性化に有用ないくつかのアミノ酸ストレッチを含む。Ｄ１ドメイン全体または当該ドメイン内の活性領域のうちの１つ以上がフラジェリンの免疫原性断片である。Ｄ１ドメイン内の免疫原性領域の例には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＦｌｉＣフラジェリンの残基８８〜１１４及び残基４１１〜４３１が挙げられる。８８〜１００領域の１３アミノ酸のうち、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａフラジェリンとＴＬＲ５活性化を保持したままの他のフラジェリンとの間で少なくとも６置換が可能である。したがって、フラジェリンの免疫原性断片は、ＴＬＲ５を活性化し、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのＦｌｉＣの８８〜１００の配列（ＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮ、配列番号２８６）に対して５３％以上同一である１３アミノ酸モチーフを含有する、フラジェリン様配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、フラジェリンと１つ以上の抗原性ポリペプチドの融合タンパク質をコードするＲＮＡを含む。本明細書で使用される「融合タンパク質」とは、構築物の２つの構成要素の連結を指す。いくつかの実施形態において、抗原性ポリペプチドのカルボキシ末端がフラジェリンポリペプチドのアミノ末端に融合または連結される。他の実施形態において、抗原性ポリペプチドのアミノ末端がフラジェリンポリペプチドのカルボキシ末端に融合または連結される。融合タンパク質は、例えば、１，２、３、４、５、６個またはそれ以上の抗原性ポリペプチドに連結した１、２、３、４、５、６個またはそれ以上のフラジェリンポリペプチドを含み得る。２つ以上のフラジェリンポリペプチド及び／または２つ以上の抗原性ポリペプチドが連結される場合、そのような構築物は、「多量体」と呼ばれることがある。
融合タンパク質の各構成要素は、互いに直接連結されてもよいし、リンカーを介して接続されてもよい。例えば、リンカーは、アミノ酸リンカーであってよい。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによってコードされる、融合タンパク質の構成要素を連結するためのアミノ酸リンカーは、例えば、リジン残基、グルタミン酸残基、セリン残基及びアルギニン残基からなる群から選択される少なくとも１つの要素を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、１〜３０、１〜２５、１〜２５、５〜１０、５、１５または５〜２０アミノ酸長である。
他の実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、少なくとも２つの個別のＲＮＡポリヌクレオチドを含み、一方は１つ以上の抗原性ポリペプチドをコードし、他方はフラジェリンポリペプチドをコードする。少なくとも２つのＲＮＡポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子などの担体中に一緒に製剤化され得る。
治療及び予防組成物
例えば、ヒト及び他の動物におけるＲＳＶの予防、治療及び／または診断のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キット及び試薬が本明細書で提供される。ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、治療薬または予防薬として使用することができる。これは、感染症の予防及び／または治療のための薬剤として使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＲＳＶワクチンは、免疫エフェクター細胞のプライミングにおける使用が想定され得、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｅｘ ｖｉｖｏで活性化させた後、対象に注入（再注入）する。
例示的な実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡポリヌクレオチドを含有するＲＳＶワクチンは、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に投与することができ、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで翻訳されて抗原性ポリペプチドを産生する。
ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、細胞、組織または生物において、ポリペプチド（例えば、抗原または免疫原）の翻訳を誘導し得る。例示的な実施形態において、かかる翻訳は、ｉｎ ｖｉｖｏで生じるが、かかる翻訳がｅｘ ｖｉｖｏ、培地またはｉｎ ｖｉｔｒｏで生じる実施形態も想定され得る。例示的な実施形態において、細胞、組織または生物を、抗原性ポリペプチドをコードする少なくとも１つの翻訳可能領域を有するポリヌクレオチドを含有するＲＳＶ ＲＮＡワクチンを含有する組成物の有効量と接触させる。
ＲＳＶ ＲＮＡワクチンの「有効量」は、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性（例えば、大きさ及び修飾ヌクレオシドの程度）及びＲＳＶ ＲＮＡワクチンの他の構成要素、ならびに他の決定因子に基づいて提供される。一般に、ＲＳＶ ＲＮＡワクチン組成物の有効量は、細胞中の抗原産生に相関して誘導されたまたはブーストされた免疫応答をもたらす。一般に、少なくとも１つの化学修飾を有するＲＮＡポリヌクレオチドを含有するＲＳＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、好ましくは、同じ抗原またはペプチド抗原をコードする同様の非修飾型ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも有効である。抗原産生の増加は、細胞トランスフェクションの増加（ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の低下（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳期間の延長によって示される）、または宿主細胞の抗原特異的免疫応答の変化によって示され得る。
「医薬組成物」という用語は、有効物質と不活性または活性担体との組み合わせを指し、これにより、組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける診断用途または治療用途に特に適したものになる。「薬学的に許容される担体」は、対象への投与後または投与時に、望ましくない生理学的作用を引き起こさない。医薬組成物中の担体は、有効成分と適合性があり、有効成分を安定化することが可能であるという意味においても「許容される」ものでなければならない。有効物質の送達のための薬学的担体として１つ以上の可溶化剤を利用することができる。薬学的に許容される担体の例には、剤形として使用可能な組成物を達成する、生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤及び希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体の例には、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。更なる好適な薬学的担体及び希釈剤ならびにその使用のための薬学的必要物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。
いくつかの実施形態において、本開示によるＲＮＡワクチン（ポリヌクレオチド及びそのコードされたポリペプチド含む）は、ＲＳＶの治療または予防のために使用することができる。
ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、能動免疫スキームの一環として健康な個体に対して、または潜伏期間中もしくは発症後の活動性感染中の感染初期に、予防的または治療的に投与することができる。いくつかの実施形態において、細胞、組織または対象に提供される本開示のＲＮＡワクチンの量は、免疫予防に有効な量であり得る。
ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、他の予防化合物または治療化合物とともに投与することができる。非限定的な例として、予防化合物または治療化合物は、アジュバントまたはブースターであり得る。ワクチンなどの予防組成物に関して本明細書で使用されるとき、「ブースター」という用語は、予防（ワクチン）組成物の追加投与を指す。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防組成物の先の投与後に投与され得る。予防組成物の初回投与からブースター投与までの時間は、限定するものではないが、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週、１０日、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年または９９年超であり得る。例示的な実施形態において、予防組成物の初回投与からブースター投与までの時間は、限定するものではないが、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月または１年であり得る。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、当該技術分野において知られている不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、鼻腔内または皮内に投与することができる。
ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、感染症の罹患率またはアンメットメディカルニーズの程度もしくはレベルに応じて、様々な環境で利用することができる。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンは、種々の感染症を治療及び／または予防するために利用することができる。ＲＮＡワクチンは、多くの場合、一般に利用可能な抗ウイルスと比べて、抗体力価がより大きく、早い応答をもたらす点で、優れた特性を有する。
ＲＳＶ ＲＮＡワクチン及びＲＮＡワクチン組成物ならびに／または複合体を、任意選択により、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物が本明細書で提供される。
ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、単独で、または１つ以上の他の構成成分とともに、製剤化または投与することができる。例えば、ＲＳＶ ＲＮＡワクチン（ワクチン組成物）は、限定するものではないが、アジュバントを含む他の構成成分を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、アジュバントを含まない（アジュバントフリーである）。
ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、製剤化または投与することができる。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、少なくとも１つの追加の有効物質、例えば、治療上有効な物質、予防上有効な物質または両方の組み合わせなどを含む。ワクチン組成物は、無菌でも、パイロジェンフリーでも、無菌とパイロジェンフリーの両方であってもよい。ワクチン組成物などの医薬品の製剤化及び／または製造において一般的に検討すべき項目は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体を参照により本明細書に援用する）に認めることができる。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的上、「有効成分」という文言は、一般に、その中に含有されるＲＮＡワクチンまたはポリヌクレオチド、例えば、抗原性ポリペプチドをコードするＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）を指す。
本明細書に記載されるワクチン組成物の製剤は、薬理学分野で知られているまたはこれ以後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製法は、有効成分（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）と、賦形剤及び／または１つ以上の他の副成分とを一緒にするステップと、次いで、必要であり、かつ／または望ましい場合には、製品を所望の単回または複数回用量単位に分割、成形及び／または包装するステップとを含む。
本開示による医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容される賦形剤及び／または任意追加の成分の相対量は、治療を受ける対象の特性、体格及び／または状態に応じて、更には、組成物が投与される経路に応じて、変動し得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。
ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、（１）安定性を高め、（２）細胞トランスフェクションを増加させ、（３）（例えば、デポ製剤からの）持続放出もしくは遅延放出を可能にし、（４）体内分布を変え（例えば、特定の組織または細胞型への標的化）、（５）コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳を増加させ、かつ／または（６）コードされたタンパク質（抗原）のｉｎ ｖｉｖｏでの放出プロファイルを変える、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化することができる。賦形剤には、従来の賦形剤、例えば、溶媒、分散媒、希釈剤または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤のいずれか及び全てに加えて、限定するものではないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェル型ナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンがトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体及びこれらの組み合わせが含まれ得る。
安定化要素
真核生物の天然ｍＲＮＡ分子は、５’キャップ構造または３’ポリ（Ａ）テールなどの他の構造的特徴に加えて、安定化要素、例えば、限定するものではないが、その５’端にある非翻訳領域（ＵＴＲ）（５’ＵＴＲ）及び／またはその３’端にあるＵＴＲ（３’ＵＴＲ）を含有することがわかっている。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲはいずれも、典型的に、ゲノムＤＮＡから転写されるものであり、未成熟ｍＲＮＡの要素である。５’キャップ及び３’ポリ（Ａ）テールなどの成熟ｍＲＮＡの特徴的な構造特徴は、通常、ｍＲＮＡプロセシング中に、転写された（未成熟）ｍＲＮＡに付加される。３’ポリ（Ａ）テールは、典型的に、転写されたｍＲＮＡの３’端に付加される一続きのアデニンヌクレオチドであり、最大約４００個のアデニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、３’ポリ（Ａ）テールの長さは、個々のｍＲＮＡの安定性に関して必須の要素であり得る。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、１つ以上の安定化要素を含み得る。安定化要素には、例えば、ヒストンステムループが含まれ得る。３２ｋＤａのタンパク質であるステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）が特定されている。ＳＬＢＰは、核と細胞質の両方において、ヒストンメッセージの３’端にあるヒストンステムループに会合する。その発現レベルは、細胞周期によって調節され、Ｓ期中にピークを迎え、そのときにヒストンｍＲＮＡレベルも上昇する。このタンパク質は、Ｕ７ ｓｎＲＮＰによるヒストンｐｒｅ−ｍＲＮＡの効率的な３’端プロセシングに必要であることがわかっている。ＳＬＢＰは、プロセシング後もステムループに会合し続け、次いで、細胞質中で、成熟ヒストンｍＲＮＡのヒストンタンパク質への翻訳を刺激する。ＳＬＢＰのＲＮＡ結合ドメインは、後生動物及び原生動物にわたって保存されており、そのヒストンステムループへの結合は、ループ構造に依存する。最小結合部位は、ステムループに対して、５’側の少なくとも３つのヌクレオチド及び３’側の２つのヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、コーディング領域、少なくとも１つのヒストンステムループ及び任意選択によりポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルを含む。ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルは、一般に、コードされたタンパク質の発現レベルを向上させるものとされる。コードされたタンパク質は、いくつかの実施形態において、ヒストンタンパク質、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ、ＥＧＦＰ）またはマーカーもしくは選択タンパク質（例えば、α−グロビン、ガラクトキナーゼ及びキサンチン：グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ））ではない。
いくつかの実施形態において、ポリ（Ａ）配列またはポリアデニル化シグナルと少なくとも１つのヒストンステムループの組み合わせは、この両方は、自然では代替的機構を示すが、相乗的に作用して、個々の要素のいずれかで観察されるレベルを超えてタンパク質発現を増加させる。ポリ（Ａ）と少なくとも１つのヒストンステムループの組み合わせの相乗効果は、要素の順序またはポリ（Ａ）配列の長さに依存しないことがわかっている。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、ヒストン下流要素（ＨＤＥ）を含まない。「ヒストン下流要素」（ＨＤＥ）は、天然ステムループの３’側に約１５〜２０個のヌクレオチドのプリンリッチポリヌクレオチドストレッチを含み、これは、ヒストンｐｒｅ−ｍＲＮＡの成熟ヒストンｍＲＮＡへのプロセシングに関与するＵ７ ｓｎＲＮＡの結合部位を表す。いくつかの実施形態において、核酸は、イントロンを含まない。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、エンハンサー配列及び／またはプロモーター配列を含有しても含有しなくてもよく、当該配列は、修飾されていても非修飾でもよく、活性化されていても不活性化されていてもよい。いくつかの実施形態において、ヒストンステムループは、通常、ヒストン遺伝子に由来し、当該構造のループを形成する、短い配列からなるスペーサーによって隔てられた２つの隣接する部分的または完全に逆相補的な配列の分子内塩基対合を含む。不対合ループ領域は、典型的に、ステムループ要素のいずれとも塩基対合できない。これは、多くのＲＮＡ二次構造に重要な構成要素であるため、ＲＮＡでより頻繁に生ずるが、同様に一本鎖ＤＮＡにも存在し得る。ステムループ構造の安定性は、通常、対合領域の長さ、ミスマッチまたはバルジの数、及び塩基組成に依存する。いくつかの実施形態において、ゆらぎ塩基対合（非ワトソン−クリック塩基対合）が生じ得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのヒストンステムループ配列は、１５〜４５の長さのヌクレオチドを含む。
他の実施形態において、ＲＮＡワクチンは、１つ以上のＡＵリッチ配列が除去され得る。これらの配列は、ＡＵＲＥＳと呼ばれることもあり、３’ＵＴＲ中に認められる不安定化配列である。ＡＵＲＥＳは、ＲＮＡワクチンから除去され得る。あるいは、ＡＵＲＥＳをＲＮＡワクチン中に残してもよい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、安定化要素を含まない。
ナノ粒子形成
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子中に製剤化される。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、カチオン性脂質ナノ粒子と呼ばれる脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化される。脂質ナノ粒子の形成は、当該技術分野において知られている方法及び／または米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって達成することができる。非限定的な例として、ポリカチオンには、カチオン性のペプチドまたはポリペプチドを挙げることができ、限定するものではないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び／またはポリアルギニンならびに国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号または米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているカチオン性ペプチドなどがある。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、限定するものではないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの非カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子中に製剤化される。
脂質ナノ粒子製剤は、限定するものではないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質の飽和の程度、ＰＥＧ化の性質、全成分の比率、及び大きさなどの生物物理的パラメーターによる影響を受け得る。Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２−１７６、その全体を参照により本明細書に援用する）による一例では、脂質ナノ粒子製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール及び１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡで構成される。別の例として、カチオン性脂質の組成を変えると、ｓｉＲＮＡが種々の抗原提示細胞により効率的に送達されることが示された（Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６−２２００、その全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、３５〜４５％のカチオン性脂質、４０％〜５０％のカチオン性脂質、５０％〜６０％のカチオン性脂質及び／または５５％〜６５％のカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子の脂質とＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の比は、５：１〜２０：１、１０：１〜２５：１、１５：１〜３０：１及び／または少なくとも３０：１であってよい。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤におけるＰＥＧ比を増やしても減らしてもよく、かつ／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に変更して脂質ナノ粒子製剤の薬物動態及び／もしくは体内分布を変えてもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ及びコレステロールと比較して、０．５％〜３．０％、１．０％〜３．５％、１．５％〜４．０％、２．０％〜４．５％、２．５％〜５．０％及び／または３．０％〜６．０％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン）（本明細書においてＰＥＧ−ＤＯＭＧとも呼ばれる）を含有し得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、限定するものではないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール）及び／またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質で置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００及びＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどの当該技術分野において知られている任意の脂質から選択することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１３０２４５１０７Ａ１号参照）。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン製剤は、少なくとも１つの脂質を含むナノ粒子である。脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質及びアミノアルコール脂質から選択することができる。いくつかの実施形態において、脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であってよい。アミノアルコールカチオン性脂質は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１５０６２５号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている脂質であってもよく、かつ／または当該特許出願公開に記載されている方法によって作製されてもよい。非限定的な例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物１）、２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物２）、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物３）、及び２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物４）、またはこれらの任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であってよい。
脂質ナノ粒子製剤は、典型的に、脂質、特に、イオン性カチオン性脂質、例えば、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、またはＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）を含み、中性脂質のステロール及び粒子の凝集を減少させることができる分子、例えばＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を更に含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される少なくとも１つの脂質と、（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭから選択される中性脂質と、（ｉｉｉ）ステロール、例えば、コレステロールと、（ｉｖ）ＰＥＧ脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡとから、カチオン性脂質２０〜６０％：中性脂質５〜２５％：ステロール２５〜５５％：ＰＥＧ脂質０．５〜１５％のモル比で、本質的に構成される。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択されるカチオン性脂質を、モル基準で２５％〜７５％、例えば、モル基準で３５〜６５％、４５〜６５％、６０％、５７．５％、５０％または４０％含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で０．５％〜１５％、例えば、モル基準で３〜１２％、５〜１０％または１５％、１０％もしくは７．５％の中性脂質を含む。中性脂質の例には、限定するものではないが、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭが挙げられる。いくつかの実施形態において、製剤は、モル基準で５％〜５０％（例えば、モル基準で１５〜４５％、２０〜４０％、４０％、３８．５％、３５％または３１％）のステロールを含む。ステロールの非限定的な例は、コレステロールである。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で０．５％〜２０％（例えば、モル基準で０．５〜１０％、０．５〜５％、１．５％、０．５％、１．５％、３．５％または５％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００ＤａのＰＥＧ分子を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質は、平均分子量が２，０００未満、例えば、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａまたは約５００ＤａのＰＥＧ分子を含む。ＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例は、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（本明細書においてＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡが挙げられる（Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）において更に考察されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される２５〜７５％のカチオン性脂質と、０．５〜１５％の中性脂質と、５〜５０％のステロールと、０．５〜２０％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される３５〜６５％のカチオン性脂質と、３〜１２％の中性脂質と、１５〜４５％のステロールと、０．５〜１０％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される４５〜６５％のカチオン性脂質と、５〜１０％の中性脂質と、２５〜４０％のステロールと、０．５〜１０％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される６０％のカチオン性脂質と、７．５％の中性脂質と、３１％のステロールと、１．５％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される５０％のカチオン性脂質と、１０％の中性脂質と、３８．５％のステロールと、１．５％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される５０％のカチオン性脂質と、１０％の中性脂質と、３５％のステロールと、４．５％または５％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質と、０．５％の標的化脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される４０％のカチオン性脂質と、１５％の中性脂質と、４０％のステロールと、５％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される５７．２％のカチオン性脂質と、７．１％の中性脂質と、３４．３％のステロールと、１．４％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、モル基準で、ＰＥＧ脂質、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（ＰＥＧ−ｃＤＭＡは、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）において更に考察されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する）から選択される５７．５％のカチオン性脂質と、７．５％の中性脂質と、３１．５％のステロールと、３．５％のＰＥＧ脂質またはＰＥＧ修飾脂質とを含む。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質２０〜７０％：中性脂質５〜４５％：コレステロール２０〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％のモル比の脂質混合物から本質的に構成される。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質２０〜６０％：中性脂質５〜２５％：コレステロール２５〜５５％：ＰＥＧ修飾脂質０．５〜１５％のモル比の脂質混合物から本質的に構成される。
いくつかの実施形態において、脂質モル比は、５０／１０／３８．５／１．５（ｍｏｌ％ カチオン性脂質／中性脂質（例えばＤＳＰＣ）／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧまたはＰＥＧ−ＤＰＧ））、５７．２／７．１１３４．３／１．４（ｍｏｌ％ カチオン性脂質／中性脂質（例えばＤＰＰＣ）／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ｃＤＭＡ））、４０／１５／４０／５（ｍｏｌ％ カチオン性脂質／中性脂質（例えばＤＳＰＣ）／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＭＧ））、５０／１０／３５／４．５／０．５（ｍｏｌ％ カチオン性脂質／中性脂質（例えばＤＳＰＣ）／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＳＧ））、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質（例えばＤＳＰＣ）／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＭＧ））、４０／１０／４０／１０（ｍｏｌ％ カチオン性脂質／中性脂質（例えばＤＳＰＣ）／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ））、３５／１５／４０／１０（ｍｏｌ％ カチオン性脂質／中性脂質（例えばＤＳＰＣ）／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ））、または５２／１３／３０／５（ｍｏｌ％ カチオン性脂質／中性脂質（例えばＤＳＰＣ）／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ修飾脂質（例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。
脂質ナノ粒子組成物及びその作製方法の非限定的な例は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２−１７６；Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９−８５３３、及びＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０−１５７８（そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質と、ＰＥＧ脂質と、構造的脂質とを含み得、任意選択により、非カチオン性脂質を含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、４０〜６０％のカチオン性脂質と、５〜１５％の非カチオン性脂質と、１〜２％のＰＥＧ脂質と、３０〜５０％の構造的脂質とを含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質５０％と、非カチオン性脂質１０％と、ＰＥＧ脂質１．５％と、構造的脂質３８．５％とを含み得る。更に別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質５５％と、非カチオン性脂質１０％と、ＰＥＧ脂質２．５％と、構造的脂質３２．５％とを含み得る。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、Ｌ３１９、Ｌ６０８及びＬ５２０などの本明細書に記載される任意のカチオン性脂質であってよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される脂質ナノ粒子製剤は、４成分脂質ナノ粒子であり得る。脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、ＰＥＧ脂質と、構造的脂質とを含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、４０〜６０％のカチオン性脂質と、５〜１５％の非カチオン性脂質と、１〜２％のＰＥＧ脂質と、３０〜５０％の構造的脂質とを含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質５０％と、非カチオン性脂質１０％と、ＰＥＧ脂質１．５％と、構造的脂質３８．５％とを含み得る。更に別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質５５％と、非カチオン性脂質１０％と、ＰＥＧ脂質２．５％と、構造的脂質３２．５％とを含み得る。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、Ｌ３１９、Ｌ６０８及びＬ５２０などの本明細書に記載される任意のカチオン性脂質であってよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質と、非カチオン性脂質と、ＰＥＧ脂質と、構造的脂質とを含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡと、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣと、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧと、３８．５％の構造的脂質コレステロールとを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡと、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣと、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧと、３８．５％の構造的脂質コレステロールとを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡと、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣと、１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧと、３８．５％の構造的脂質コレステロールとを含む。更に別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、５５％のカチオン性脂質Ｌ３１９、Ｌ６０８またはＬ５２０と、１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣと、２．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧと、３２．５％の構造的脂質コレステロールとを含み得る。
ワクチン組成物中の有効成分、薬学的に許容される賦形剤及び／または任意追加の成分の相対量は、治療を受ける対象が何であるか、体格及び／または状態に応じて、更には、組成物が投与される経路に応じて、変動し得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば、０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチン組成物は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含み得、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡと、コレステロールと、ＤＳＰＣと、ＰＥＧ２０００−ＤＭＧとを含む脂質ナノ粒子、クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース及び注射用水中で製剤化される。非限定的な例として、組成物は、２．０ｍｇ／ｍＬの薬剤物質（例えば、ＲＳＶをコードするポリヌクレオチド）と、２１．８ｍｇ／ｍＬのＭＣ３と、１０．１ｍｇ／ｍＬのコレステロールと、５．４ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣと、２．７ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ２０００−ＤＭＧと、５．１６ｍｇ／ｍＬのクエン酸三ナトリウムと、７１ｍｇ／ｍＬのスクロースと、１．０ｍＬの注射用水とを含む。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、１０〜５００ｎｍ、２０〜４００ｎｍ、３０〜３００ｎｍ、４０〜２００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、５０〜１５０ｎｍ、５０〜２００ｎｍ、８０〜１００ｎｍまたは８０〜２００ｎｍの平均直径を有する。
リポソーム、リポプレックス及び脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、限定するものではないが、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ））、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ））、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系リポソーム（例えば、卵巣癌のためのｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８−１７１３）、その全体を参照により本明細書に援用する）及びヒアルロナン被覆リポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｉｓｒａｅｌ））などのリポソーム中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０６０２９３号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている凍結乾燥されたゲル相リポソーム組成物で製剤化され得る。
ナノ粒子製剤は、リン酸コンジュゲートを含み得る。リン酸コンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を延長させ得、かつ／またはナノ粒子の標的化送達を増大させ得る。本発明で使用されるリン酸コンジュゲートは、ＷＯ２０１３０３３４３８または米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号（そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって作製することができる。非限定的な例として、リン酸コンジュゲートは、国際公開第ＷＯ２０１３０３３４３８号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている式のうちのいずれか１つの化合物を挙げることができる。
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含み得る。ポリマーコンジュゲートは、水溶性コンジュゲートであってよい。ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている構造を有し得る。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドとのポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３００７２７０９号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載の方法及び／またはセグメント化ポリマー試薬を使用して作製することができる。他の態様において、ポリマーコンジュゲートは、限定するものではないが、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載のポリマーコンジュゲートなどのように、環部分を含むペンダント側鎖基を有し得る。
ナノ粒子製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含み得る。更に、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の食作用クリアランスを抑制し得る。いくつかの態様において、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計された「自己」ペプチド（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３，３３９，９７１−９７５、その全体を参照により本明細書に援用する）によって記載された「自己」粒子）であってよい。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらによって示されたように、自己ペプチドは、マクロファージが媒介するナノ粒子のクリアランスを遅延させ、ナノ粒子の送達を向上させた。他の態様において、コンジュゲートは、膜タンパク質ＣＤ４７であってもよい（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３，３３９，９７１−９７５参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらは、ＣＤ４７が、「自己」ペプチドと同様に、スクランブルペプチド及びＰＥＧ被覆ナノ粒子と比較して、対象における循環粒子の比率を増大し得ることを示した。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡワクチンは、対象における本発明のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含むナノ粒子中に製剤化される。コンジュゲートは、ＣＤ４７膜であってもよいし、コンジュゲートは、先に記載された「自己」ペプチドなどの、ＣＤ４７膜タンパク質に由来するものであってもよい。他の実施形態において、ナノ粒子は、ＰＥＧと、ＣＤ４７のコンジュゲートまたはその誘導体とを含み得る。更に他の実施形態において、ナノ粒子は、上述の「自己」ペプチドと、膜タンパク質ＣＤ４７の両方を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、「自己」ペプチド及び／またはＣＤ４７タンパク質は、本発明のＲＮＡワクチンの送達のために、本明細書に記載されるように、ウイルス様粒子または偽ビリオンにコンジュゲートされ得る。
他の実施形態において、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドと、分解可能な結合を有し得るコンジュゲートとを含む。コンジュゲートの非限定的な例には、イオン性水素原子を含む芳香族部分、スペーサー部分、及び水溶性ポリマーが挙げられる。非限定的な例として、分解可能な結合を有するコンジュゲートを含む医薬組成物及び当該医薬組成物を送達するための方法は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１８４４４３号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体と、ＲＮＡワクチンとを含む炭水化物ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、炭水化物担体は、無水物変性フィトグリコーゲンもしくはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルコハク酸，フィトグリコーゲンβ−デキストリン、無水物変性フィトグリコーゲンβ−デキストリンを挙げることができるが、これらに限定されない（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーで被覆されてもよい。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、限定するものではないが、ＰＥＧコーティング及び／または中性の表面電荷を有するコーティングなどの親水性コーティングで被覆され得る。親水性コーティングは、限定するものではないが、ＲＮＡワクチンなどの大きなペイロードを含むナノ粒子を中枢神経系内に送達するのに役立ち得る。非限定的な例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及び当該ナノ粒子を作製する方法は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であり得る。親水性ポリマー粒子及び親水性ポリマー粒子の作製方法の非限定的な例は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０２１０９９１号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
他の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、迅速に排除される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られる生分解性カチオン性脂質に置き換えることによって改善され得る。限定するものではないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン性カチオン性脂質は、時間の経過とともに血漿中及び組織中に蓄積することがわかっており、潜在的な毒性原になり得る。迅速に排除される脂質の迅速な代謝により、ラットにおける脂質ナノ粒子の忍容性及び治療指数が１ｍｇ／ｋｇの用量から１０ｍｇ／ｋｇの用量の大きさで改善し得る。酵素的に分解されるエステル結合を含めると、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を維持したまま、カチオン性構成成分の分解及び代謝プロファイルが改善し得る。エステル結合は、脂質鎖中に内在してもよいし、脂質鎖の末端に終端で位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置き換えてもよい。
いくつかの実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。
いくつかの実施形態において、免疫応答は、ナノ化学種、ポリマー及び免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって誘発され得る（米国特許出願公開第２０１２０１８９７００号及び国際公開第ＷＯ２０１２０９９８０５号、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
ポリマーは、ナノ化学種を封入し得、またはナノ化学種を部分的に封入し得る。免疫原は、組み換えタンパク質、修飾ＲＮＡ及び／または本明細書に記載されるポリヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、ワクチン、限定するものではないが、病原体に対するワクチンなどにおける使用のために製剤化され得る。
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを通過するように粒子の表面特性を操作して変更してもよい。粘液は、限定するものではないが、口腔（例えば、頬及び食道の膜ならびに扁桃腺組織）、眼、消化管（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管及び気管支の膜）、生殖器（例えば、膣、子宮頸部及び尿道の膜）などの粘膜組織に位置する。１０〜２００ｎｍよりも大きいナノ粒子は、薬剤封入効率が高く、幅広い薬物の持続的送達をもたらす能力において好ましいが、粘膜バリアに迅速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、連続的に、分泌され、排出され、廃棄または消化され、再利用されるので、捕捉された粒子の大部分は、数秒内または数時間内に粘膜組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で高密度に被覆された大きなポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中で拡散する同じ粒子よりもわずかに４〜６倍遅く、粘液を通って拡散した（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００７ １０４（５）：１４８２−４８７；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００９ ６１（２）：１５８−１７１、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。ナノ粒子の輸送は、通過速度ならびに／または蛍光顕微鏡法、例えば、限定するものではないが、光褪色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）及び高解像多重粒子追跡法（ＭＰＴ）を使用して決定することができる。非限定的な例として、粘膜バリアを通過できる組成物は、米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号（そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているように作製することができる。
粘液を通過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（例えば、ポリマーコア）及び／またはポリマー−ビタミンコンジュゲート及び／またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル及びポリアリレートを挙げることができるが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性及び／または生体適合性であり得る。生体適合性ポリマーの非限定的な例は、国際公開第ＷＯ２０１３１１６８０４号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。ポリマー材料は、更に、照射されてもよい。非限定的な例として、ポリマー材料は、ガンマ照射され得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２８２１６５号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。具体的なポリマーの非限定的な例には、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレンビニルアセテートポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルハライド、例えば、ポリ（ビニルクロリド）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）及びこれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ならびにトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、ブロックコポリマー（国際公開第ＷＯ２０１３０１２４７６号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている分岐ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマーなど）及び（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（プロピレンオキシド））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２１７１８号、米国特許出願公開第２０１００００３３３７号及び米国特許第８，２６３，６６５号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）などのコポリマーで被覆され得、またはこれらと会合し得る。コポリマーは、ＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）ポリマーであってよく、脂質ナノ粒子の形成は、新規の化学実体が生じないような方法で作製され得る。例えば、脂質ナノ粒子は、新規の化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液を迅速に通過することができる、ポロキサマー被覆ＰＬＧＡナノ粒子を含み得る（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１ ５０：２５９７２６００、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。ヒト粘液を通過することができるナノ粒子を生成するための非限定的な拡張可能な方法は、Ｘｕらによって記載されている（例えば、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１３，１７０（２）：２７９−８６参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
ポリマー−ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンＥであってよい。コンジュゲートのビタミン部分は、限定するものではないが、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分または他の界面活性剤の疎水性構成成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖及びアルキレンオキシド鎖）などの他の好適な構成成分で置換されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン医薬組成物は、限定するものではないが、ＤｉＬａ２リポソーム（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ））、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ））、中性ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）系リポソーム（例えば、卵巣癌のためのｓｉＲＮＡ送達（Ｌａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｙ ２００６ ５（１２）１７０８−１７１３、その全体を参照により本明細書に援用する））及びヒアルロナン被覆リポソーム（Ｑｕｉｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｉｓｒａｅｌ））などのリポソーム中に製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０６０２９３号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている凍結乾燥されたゲル相リポソーム組成物で製剤化され得る。
ナノ粒子製剤は、リン酸コンジュゲートを含み得る。リン酸コンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を延長させ得、かつ／またはナノ粒子の標的化送達を増大させ得る。本発明で使用されるリン酸コンジュゲートは、ＷＯ２０１３０３３４３８または米国特許出願公開第２０１３０１９６９４８号（そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって作製することができる。非限定的な例として、リン酸コンジュゲートは、国際公開第ＷＯ２０１３０３３４３８号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている式のうちのいずれか１つの化合物を挙げることができる。
ナノ粒子製剤は、ポリマーコンジュゲートを含み得る。ポリマーコンジュゲートは、水溶性コンジュゲートであってよい。ポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３００５９３６０号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている構造を有し得る。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドとのポリマーコンジュゲートは、米国特許出願公開第２０１３００７２７０９号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載の方法及び／またはセグメント化ポリマー試薬を使用して作製することができる。他の態様において、ポリマーコンジュゲートは、限定するものではないが、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載のポリマーコンジュゲートなどのように、環部分を含むペンダント側鎖基を有し得る。
ナノ粒子製剤は、対象における本発明のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含み得る。更に、コンジュゲートは、対象におけるナノ粒子の食作用クリアランスを抑制し得る。いくつかの態様において、コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計された「自己」ペプチド（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３，３３９，９７１−９７５、その全体を参照により本明細書に援用する）によって記載された「自己」粒子）であってよい。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらによって示されたように、自己ペプチドは、マクロファージが媒介するナノ粒子のクリアランスを遅延させ、ナノ粒子の送達を向上させた。他の態様において、コンジュゲートは、膜タンパク質ＣＤ４７であってもよい（例えば、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３，３３９，９７１−９７５参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらは、ＣＤ４７が、「自己」ペプチドと同様に、スクランブルペプチド及びＰＥＧ被覆ナノ粒子と比較して、対象における循環粒子の比率を増大し得ることを示した。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡワクチンは、対象における本開示のナノ粒子の送達を向上させるコンジュゲートを含むナノ粒子中に製剤化される。コンジュゲートは、ＣＤ４７膜であってもよいし、コンジュゲートは、先に記載された「自己」ペプチドなどの、ＣＤ４７膜タンパク質に由来するものであってもよい。他の態様において、ナノ粒子は、ＰＥＧと、ＣＤ４７のコンジュゲートまたはその誘導体とを含み得る。更に他の態様において、ナノ粒子は、上述の「自己」ペプチドと、膜タンパク質ＣＤ４７の両方を含んでもよい。
他の態様において、「自己」ペプチド及び／またはＣＤ４７タンパク質は、本発明のＲＮＡワクチンの送達のために、本明細書に記載されるように、ウイルス様粒子または偽ビリオンにコンジュゲートされ得る。
他の実施形態において、ＲＮＡワクチン医薬組成物は、本発明のポリヌクレオチドと、分解可能な結合を有し得るコンジュゲートとを含む。コンジュゲートの非限定的な例には、イオン性水素原子を含む芳香族部分、スペーサー部分、及び水溶性ポリマーが挙げられる。非限定的な例として、分解可能な結合を有するコンジュゲートを含む医薬組成物及び当該医薬組成物を送達するための方法は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１８４４４３号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体と、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンとを含む炭水化物ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、炭水化物担体は、無水物変性フィトグリコーゲンもしくはグリコーゲン型物質、フィトグリコーゲンオクテニルコハク酸，フィトグリコーゲンβ−デキストリン、無水物変性フィトグリコーゲンβ−デキストリンを挙げることができるが、これらに限定されない（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
本発明のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤またはポリマーで被覆されてもよい。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、限定するものではないが、ＰＥＧコーティング及び／または中性の表面電荷を有するコーティングなどの親水性コーティングで被覆され得る。親水性コーティングは、限定するものではないが、ＲＮＡワクチンなどの大きなペイロードを含むナノ粒子を中枢神経系内に送達するのに役立ち得る。非限定的な例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及び当該ナノ粒子を作製する方法は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、親水性ポリマー粒子であり得る。親水性ポリマー粒子及び親水性ポリマー粒子の作製方法の非限定的な例は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０２１０９９１号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
他の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、疎水性ポリマー粒子であり得る。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、迅速に排除される脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）として知られる生分解性カチオン性脂質に置き換えることによって改善され得る。限定するものではないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン性カチオン性脂質は、時間の経過とともに血漿中及び組織中に蓄積することがわかっており、潜在的な毒性原になり得る。迅速に排除される脂質の迅速な代謝により、ラットにおける脂質ナノ粒子の忍容性及び治療指数が１ｍｇ／ｋｇの用量から１０ｍｇ／ｋｇの用量の大きさで改善し得る。酵素的に分解されるエステル結合を含めると、ｒｅＬＮＰ製剤の活性を維持したまま、カチオン性構成成分の分解及び代謝プロファイルが改善し得る。エステル結合は、脂質鎖中に内在してもよいし、脂質鎖の末端に終端で位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖中の任意の炭素を置き換えてもよい。
いくつかの実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。
いくつかの実施形態において、免疫応答は、ナノ化学種、ポリマー及び免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって誘発され得る（米国特許出願公開第２０１２０１８９７００号及び国際公開第ＷＯ２０１２０９９８０５号、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜バリアを通過するように粒子の表面特性を操作して変更してもよい。粘液は、限定するものではないが、口腔（例えば、頬及び食道の膜ならびに扁桃腺組織）、眼、消化管（例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸）、鼻、呼吸器（例えば、鼻、咽頭、気管及び気管支の膜）、生殖器（例えば、膣、子宮頸部及び尿道の膜）などの粘膜組織に位置する。１０〜２００ｎｍよりも大きいナノ粒子は、薬剤封入効率が高く、幅広い薬物の持続的送達をもたらす能力において好ましいが、粘膜バリアに迅速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、連続的に、分泌され、排出され、廃棄または消化され、再利用されるので、捕捉された粒子の大部分は、数秒内または数時間内に粘膜組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で高密度に被覆された大きなポリマーナノ粒子（直径２００ｎｍ〜５００ｎｍ）は、水中で拡散する同じ粒子よりもわずかに４〜６倍遅く、粘液を通って拡散した（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００７ １０４（５）：１４８２−４８７；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００９ ６１（２）：１５８−１７１、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。ナノ粒子の輸送は、通過速度ならびに／または蛍光顕微鏡法、例えば、限定するものではないが、光褪色後蛍光回復法（ＦＲＡＰ）及び高解像多重粒子追跡法（ＭＰＴ）を使用して決定することができる。非限定的な例として、粘膜バリアを通過できる組成物は、米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号（そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているように作製することができる。
粘液を通過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）及び／またはポリマー−ビタミンコンジュゲート及び／またはトリブロックコポリマーを含み得る。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル及びポリアリレートを挙げることができるが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性及び／または生体適合性であり得る。生体適合性ポリマーの非限定的な例は、国際公開第ＷＯ２０１３１１６８０４号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。ポリマー材料は、更に、照射されてもよい。非限定的な例として、ポリマー材料は、ガンマ照射され得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２８２１６５号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。具体的なポリマーの非限定的な例には、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレンビニルアセテートポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＥＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−ＰＰＯ−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ（ビニルアセテート）、ポリビニルハライド、例えば、ポリ（ビニルクロリド）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）及びこれらのコポリマー及び混合物、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ、ならびにトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、ブロックコポリマー（国際公開第ＷＯ２０１３０１２４７６号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている分岐ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマーなど）及び（ポリ（エチレングリコール））−（ポリ（プロピレンオキシド））−（ポリ（エチレングリコール））トリブロックコポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１２０１２１７１８号及び米国特許出願公開第２０１００００３３３７号ならびに米国特許第８，２６３，６６５号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）などのコポリマーで被覆され得、またはこれらと会合し得る。コポリマーは、ＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）ポリマーであってよく、脂質ナノ粒子の形成は、新規の化学実体が生じないような方法で作製され得る。例えば、脂質ナノ粒子は、新規の化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液を迅速に通過することができる、ポロキサマー被覆ＰＬＧＡナノ粒子を含み得る（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１ ５０：２５９７２６００、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。ヒト粘液を通過することができるナノ粒子を生成するための非限定的な拡張可能な方法は、Ｘｕらによって記載されている（例えば、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１３，１７０（２）：２７９−８６参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
ポリマー−ビタミンコンジュゲートのビタミンは、ビタミンＥであってよい。コンジュゲートのビタミン部分は、限定するものではないが、ビタミンＡ、ビタミンＥ、他のビタミン、コレステロール、疎水性部分または他の界面活性剤の疎水性構成成分（例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖及びアルキレンオキシド鎖）などの他の好適な構成成分で置換されてもよい。
粘液を通過するように操作された脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、例えばジメチルジオクタデシル−臭化アンモニウムなどのカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ムグワート、ブロメライン、パパイン、クレロデンドラム、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アムブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）及びｒｈＤＮａｓｅを含む各種ＤＮａｓｅなどの表面改質剤を含み得る。表面改質剤は、粒子表面に埋め込むか、粒子表面にからませてもよいし、脂質ナノ粒子の表面上に配置してもよい（例えば、コーティング、吸着、共有結合または他のプロセスによって）（例えば、米国特許出願公開第２０１００２１５５８０号及び米国特許出願公開第２００８０１６６４１４号及びＵＳ２０１３０１６４３４３参照、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、粘液を通過する脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子中に封入され得、かつ／または粒子の表面上に配置され得る。ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に共有結合的に結合され得る。粘液を通過する脂質ナノ粒子製剤は、複数のナノ粒子を含み得る。更に、製剤は、粘液と相互作用し、かつ粘液を通過する脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増大させ得る粘膜付着を低減させる周辺粘液の構造特性及び／または付着性を変え得る粒子を含有してもよい。
他の実施形態において、粘液を通過する脂質ナノ粒子は、粘膜通過を向上させるコーティングを含む低張製剤であり得る。製剤は、送達される上皮に対して低張であり得る。
低張製剤の非限定的な例は、国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に認めることができ、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、粘膜バリアを通過する送達を向上させるために、ＲＮＡワクチン製剤は、低張液を含んでもよいし、低張液であってもよい。低張液は、限定するものではないが、粘液を通過する粒子などの粘液不活性粒子が膣上皮表面に到達できる速度を上げることが可能であることがわかった（例えば、Ｅｎｓｉｇｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１３，３４（２８）：６９２２−９参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、限定するものではないが、Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）社のＡＴＵＰＬＥＸ（商標）系、ＤＡＣＣ系、ＤＢＴＣ系及び他のｓｉＲＮＡリポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）社のＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンに基づいた標的化及び非標的化核酸送達などのリポプレックスとして製剤化される（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８−９７９８；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６−７８；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４−３４４；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６−２９３；Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８−５０７；Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０−１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４；Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ ６；１０４：４０９５−４１００；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５−１３２、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、そのような製剤はまた、限定するものではないが、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞及び白血球を含む様々な細胞種をｉｎ ｖｉｖｏで受動的または能動的に指向するように、構築または組成変更され得る（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９−７１７；Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００９ １１９：６６１−６７３；Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６−２９３；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４−３４４；Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６−２２００；Ｆｅｎｓｋｅ ａｎｄ Ｃｕｌｌｉｓ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：２５−４４；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７−６３０；Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７−１１３３、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。製剤の肝細胞への受動的標的化の一例には、アポリポタンパク質Ｅに結合し、ｉｎ ｖｉｖｏで当該製剤の肝細胞への結合及び取り込みを促進することが示されている、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ系脂質ナノ粒子製剤が挙げられる（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４、その全体を参照により本明細書に援用する）。製剤はまた、限定するものではないが、葉酸、トランスフェリン、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及び抗体標的化アプローチによって例示されるように、その表面上に異なるリガンドを発現させることによって選択的に標的化され得る（Ｋｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ ８：１９７−２０６；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１ １６：１３８８−１４１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１０ ２７：２８６−２９８；Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８ ２５：１−６１；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１ １２：２７０８−２７１４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：３０９−３１９；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７−１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ８２０：１０５−１１６；Ｂｅｎ−Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ７５７：４９７−５０７；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３−６８；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ １０４：４０９５−４１００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ ７２１：３３９−３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：２０２８−２０３７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ ２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７−６３０；Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７−１１３３、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、固形脂質ナノ粒子として製剤化される。固形脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、平均直径が１０００ｎｍまでの間である球形であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、かつ界面活性剤及び／または乳化剤で安定化し得る固形脂質コアマトリックスを有する。他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質ポリマーナノ粒子であり得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ，２００８，２（８），ｐｐ １６９６−１７０２参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。非限定的な例として、ＳＬＮは、国際公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているＳＬＮであってもよい。別の非限定的な例として、ＳＬＮは、国際公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法またはプロセスによって作製することができる。
当該製剤は、ＲＮＡワクチンによって細胞のトランスフェクションを増やし、かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を増やすことができ得るが、リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子を利用して、ポリヌクレオチドが目的とするタンパク質産生の効率を改善することができる。かかる例の１つには、脂質封入を使用してポリプレックスプラスミドＤＮＡの効果的な全身送達を可能にすることがある（Ｈｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７ １５：７１３−７２０、その全体を参照により本明細書に援用する）。リポソーム、リポプレックスまたは脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を増大させるために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、制御放出及び／または標的化送達用に製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「制御放出」は、治療成果を達成する特定の放出パターンに一致する、医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、制御放出及び／または標的化送達のために、本明細書に記載され、かつ／または当該技術分野において知られている送達物質中に、封入され得る。本明細書で使用されるとき、「封入する」という用語は、閉じ込められること、取り囲むこと、または包み込むことを意味する。本発明の化合物の製剤に関するとき、封入は、実質的なものであっても、完全なものであっても、部分的なものであってもよい。「実質的に封入された」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９超または９９．９９９％超が送達物質内に閉じ込められ、取り囲まれ、または包み込まれることを意味する。「部分的な封入」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０％未満、１０、２０、３０、４０、５０以下が送達物質内に閉じ込められ、取り囲まれ、または包み込まれることを意味する。有利には、封入は、蛍光及び／または電子顕微鏡写真を使用して本発明の医薬組成物または化合物の漏出または活性を測定することによって決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９または９９．９９％超が送達物質中に封入される。
いくつかの実施形態において、制御放出製剤は、限定するものではないが、トリブロックコポリマーを含み得る。非限定的な例として、製剤は、２つの異なる種類のトリブロックコポリマーを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１２１３１１０４号及び同第ＷＯ２０１２１３１１０６号、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）。
他の実施形態において、ＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子中または迅速に排除される脂質ナノ粒子中に封入することができ、次いで、この脂質ナノ粒子または迅速に排除される脂質ナノ粒子は、本明細書に記載され、かつ／または当該技術分野において知られているポリマー、ヒドロゲル及び／または外科用シーラント内に封入され得る。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲルまたは外科用シーラントは、ＰＬＧＡ、エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ））、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ））、フィブリノゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ））、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ））、ＰＥＧ系シーラント及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ））などの外科用シーラントであってよい。
他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、対象に注射されたときにゲルを形成し得る、当該技術分野において知られている任意のポリマー内に封入されてもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックス内に封入されてもよい。
いくつかの実施形態において、制御放出及び／または標的化送達のためのＲＮＡワクチン製剤はまた、少なくとも１つの制御放出コーティングを含み得る。制御放出コーティングには、ＯＰＡＤＲＹ（登録商標）、ポリビニルピロリドン／ビニルアセテートコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）、及びエチルセルロース水性分散体（ＡＱＵＡＣＯＡＴ（登録商標）及びＳＵＲＥＬＥＡＳＥ（登録商標））などのセルロース誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン制御放出及び／または標的化送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含み得る。分解性ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲートを含み得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチン制御放出及び／または標的化送達製剤は、米国特許第８，４０４，２２２号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている少なくとも１つのＰＥＧ及び／またはＰＥＧ関連ポリマー誘導体を含み得る。
他の実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＲＮＡワクチン制御放出送達製剤は、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている制御放出ポリマー系であってよい。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、治療用ナノ粒子中に封入され得、これは、本明細書において「治療用ナノ粒子ＲＮＡワクチン」と呼ばれる。治療用ナノ粒子は、本明細書に記載される方法及び当該技術分野において知られている方法、例えば、限定するものではないが、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号、同第ＷＯ２０１０００５７２１号、同第ＷＯ２０１０００５７２３号、同第ＷＯ２０１２０５４９２３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号、同第ＵＳ２０１０００６８２８５号、同第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、同第ＵＳ２０１０００６８２８６号、同第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、同第ＵＳ２０１３０１２３３５１号及び同第ＵＳ２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、同第８，２９３，２７６号、同第８，３１８，２０８号及び同第８，３１８，２１１号（そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載の方法によって製剤化され得る。他の実施形態において、治療用ポリマーナノ粒子は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０１４０７９０号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載の方法によって特定することができる。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子ＲＮＡワクチンは、持続放出用に製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「持続放出」は、特定の期間にわたってある放出速度に従う、医薬組成物または化合物を指す。特定の期間には、時間、日、週、月、及び年が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、持続放出性ナノ粒子は、ポリマーと、限定するものではないが、本発明のポリヌクレオチドなどの治療薬とを含み得る（国際公開第２０１００７５０７２号ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、同第ＵＳ２０１１０２１７３７７号及び同第ＵＳ２０１２０２０１８５９号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。別の非限定的な例において、持続放出性製剤は、限定するものではないが、結晶、巨大分子ゲル及び／または微粒子懸濁液などの、持続的なバイオアベイラビリティを可能にする作用物質を含み得る（米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１５０２９５号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子ＲＮＡワクチンは、標的特異的になるように製剤化することができる。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、コルチコステロイドを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１８号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、同第ＷＯ２０１０００５７２６号、同第ＷＯ２０１０００５７２５号、同第ＷＯ２０１１０８４５２１号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、同第ＵＳ２０１２０００４２９３号及び同第ＵＳ２０１００１０４６５５号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているナノ粒子中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。非限定的な例として、ナノ粒子は、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはこれらの組み合わせなどの２つ以上のポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含み得る。いくつかの実施形態において、ジブロックコポリマーは、ＰＥＧを、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）またはこれらの組み合わせなどのポリマーとの組み合わせで含み得る。更に他の実施形態において、ジブロックコポリマーは、国際公開第ＷＯ２０１３１２００５２号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているものなどの高Ｘジブロックコポリマーであってよい。
非限定的な例として、治療用ナノ粒子は、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む（米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号及び米国特許第８，２３６，３３０号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。別の非限定的な例において、治療用ナノ粒子は、ＰＥＧ及びＰＬＡまたはＰＥＧ及びＰＬＧＡのジブロックコポリマーを含むステルスナノ粒子である（米国特許第８，２４６，９６８号及び国際公開第ＷＯ２０１２１６６９２３号参照、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）。更に別の非限定的な例において、治療用ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているステルスナノ粒子または標的特異型ステルスナノ粒子である。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、多元ブロックコポリマーを含み得る（例えば、米国特許第８，２６３，６６５号及び同第８，２８７，９１０号ならびに米国特許出願公開第２０１３０１９５９８７号参照、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）。
更に別の非限定的な例において、脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ ａｓ ａ Ｔｇｆ−β１ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ．” Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３ ２０（１２）：１９９５−２０００においてＴＧＦ−β１遺伝子の送達ビヒクルとして使用され、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ” Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３ ２０（６）：８８４− ８８８；及びＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎ−ｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｒａｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．” Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００７ １１８：２４５−２５３において制御された遺伝子送達系として使用された、感熱性ヒドロゲル（ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを含む脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるブロックコポリマーは、非ポリマーミセルとブロックコポリマーとを含むポリイオン複合体中に含まれていてもよい（例えば、米国特許出願公開第２０１２００７６８３６号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのアクリルポリマーを含み得る。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、ポリシアノアクリレート及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのポリ（ビニルエステル）ポリマーを含み得る。ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、ランダムコポリマーなどのコポリマーであってよい。非限定的な例として、ランダムコポリマーは、国際公開第ＷＯ２０１３０３２８２９号または米国特許出願公開第２０１３０１２１９５４号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているものなどの構造を有し得る。いくつかの態様において、ポリ（ビニルエステル）ポリマーは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。他の態様において、本発明で使用することができるポリ（ビニルエステル）ポリマーは、本明細書に記載されるものであってよい。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのジブロックコポリマーを含み得る。ジブロックコポリマーは、限定するものではないが、ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーであってよい（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０４４２１９号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。非限定的な例として、治療用ナノ粒子を使用して癌を治療することができる（国際公開第ＷＯ２０１３０４４２１９号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、本明細書に記載され、かつまたは当該技術分野において知られている、少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つのアミン含有ポリマー、限定するものではないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（β−アミノエステル）（例えば、米国特許第８，２８７，８４９号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）及びこれらの組み合わせなどを含み得る。他の実施形態において、本明細書に記載されるナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１３０５９４９６号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているものなどのアミンカチオン性脂質を含み得る。いくつかの態様において、カチオン性脂質は、アミノ−アミンまたはアミノ−アミド部分を有し得る。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも１つの分解性ポリエステルを含み得る。分解性ポリエステルには、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、分解性ポリエステルは、ＰＥＧ化ポリマーを形成するためのＰＥＧコンジュゲートを含み得る。
他の実施形態において、治療用ナノ粒子は、少なくとも１つの標的化リガンドのコンジュゲートを含み得る。標的化リガンドは、当該技術分野において知られている任意のリガンド、限定するものではないが、モノクローナル抗体などであってよい（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ ６６：６７３２−６７４０、その全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子は、水溶液に製剤化され得、これを使用して癌を標的にしてもよい（国際公開第ＷＯ２０１１０８４５１３号及び米国特許出願公開第２０１１０２９４７１７号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、治療用ナノ粒子ＲＮＡワクチン（例えば、少なくとも１つのＲＮＡワクチンを含む治療用ナノ粒子）は、米国特許第８，４０４，７９９号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）においてＰｏｄｏｂｉｎｓｋｉらが記載した方法を使用して製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、合成ナノ担体中に封入され、当該担体に結合し、かつ／または当該担体と会合し得る。合成ナノ担体には、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１２１４９４５４号及び同第ＷＯ２０１３０１９６６９号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号及び同第ＵＳ２０１２０２４４２２２号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。合成ナノ担体は、当該技術分野において知られている方法及び／または本明細書に記載される方法を使用して製剤化することができる。非限定的な例として、合成ナノ担体は、国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、同第ＷＯ２０１００３０７６３号及び同第ＷＯ２０１２１３５０１号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、同第ＵＳ２０１００１０４６４５号、同第ＵＳ２０１０００８７３３７号及び同第ＵＳ２０１２０２４４２２号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって製剤化することができる。他の実施形態において、合成ナノ担体の製剤は、国際公開第ＷＯ２０１１０７２２１８号及び米国特許第８，２１１，４７３号（そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法を使用して凍結乾燥され得る。更に他の実施形態において、限定するものではないが、合成ナノ担体を含む本発明の製剤は、米国特許出願公開第２０１３０２３０５６８号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって凍結乾燥または再構成され得る。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを放出する反応基を含有し得る（国際公開第ＷＯ２０１２０９５２５５２号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１２０１７１２２９号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達からの免疫応答を向上させる免疫活性化剤を含有し得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、免疫系のＴｈ１系応答を向上させ得るＴｈ１免疫活性化剤を含み得る（国際公開第ＷＯ２０１０１２３５６９号及び米国特許出願公開第２０１１０２２３２０１号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、標的化放出用に製剤化され得る。いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、指定のｐＨで、かつ／または所望の時間間隔後にポリヌクレオチドを放出するように製剤化される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、ＲＮＡワクチンを２４時間後、かつ／またはｐＨ４．５で放出するように製剤化され得る（国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９３号及び同第ＷＯ２０１０１３８１９４号ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１１００２０３８８号及び同第ＵＳ２０１１００２７２１７号、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの制御放出及び／または持続放出用に製剤化され得る。非限定的な例として、持続放出用の合成ナノ担体は、当該技術分野において知られている方法、本明細書に記載される方法、ならびに／または国際公開第ＷＯ２０１０１３８１９２号及び米国特許出願公開第２０１００３０３８５０号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、制御放出及び／または持続放出用に製剤化され得、製剤は、結晶性側鎖（ＣＹＳＣ）ポリマーであるポリマーを少なくとも１つ含む。ＣＹＳＣポリマーは、米国特許第８，３９９，００７号に記載されており、その全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、ワクチンとして使用するために製剤化され得る。いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを封入し得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、少なくとも１つの抗原とワクチン剤形のための賦形剤とを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１１１５０２６４号及び米国特許出願公開第２０１１０２９３７２３号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。別の非限定的な例として、ワクチン剤形は、同じ抗原または異なる抗原を含む少なくとも２つの合成ナノ担体と、賦形剤とを含み得る（国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４９号及び米国特許出願公開第２０１１０２９３７０１号参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。ワクチン剤形は、本明細書に記載される方法、当該技術分野において知られている方法、ならびに／または国際公開第ＷＯ２０１１１５０２５８号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１２００２７８０６号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって選択され得る。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つのアジュバント（例えば、フラジェリンタンパク質）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つのアジュバントを含み得る。非限定的な例として、アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムホスフェートまたはジメチルジオクタデシルアンモニウムアセテート（ＤＤＡ）、及びマイコバクテリウム総脂質抽出物の無極性分画または当該無極性分画の一部を含み得る（例えば、米国特許第８，２４１，６１０号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。他の実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも１つのポリヌクレオチドと、アジュバントとを含み得る。非限定的な例として、アジュバントを含む、任意選択により含む、合成ナノ担体は、国際公開第ＷＯ２０１１１５０２４０号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０１１０２９３７００号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、ウイルス由来のペプチド、断片または領域をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを封入し得る。非限定的な例として、合成ナノ担体には、国際公開第ＷＯ２０１２０２４６２１号、同第ＷＯ２０１２０２６２９号及び同第ＷＯ２０１２０２４６３２号ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１２００６４１１０号、同第ＵＳ２０１２００５８１５３号及び同第ＵＳ２０１２００５８１５４号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているナノ担体を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、合成ナノ担体は、体液性応答及び／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘起することが可能であり得るポリヌクレオチドに結合され得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０１９６６９号参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、双性イオン脂質中に封入され、当該脂質に結合し、かつ／または当該脂質と会合し得る。双性脂質及び双性脂質の使用方法の非限定的な例は、米国特許出願公開第２０１３０２１６６０７号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。いくつかの態様において、双性イオン脂質は、本明細書に記載されるリポソーム及び脂質ナノ粒子で使用することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、米国特許出願公開第２０１３０１９７１００号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているコロイド状ナノ担体中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、経口投与用に最適化され得る。ナノ粒子は、限定するものではないが、キトサンまたはその誘導体などの少なくとも１つのカチオン性バイオポリマーを含み得る。非限定的な例として、ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１２０２８２３４３号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって製剤化することができる。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、脂質ＫＬ５２を含む（米国特許出願公開第２０１２／０２９５８３２号に開示されているアミノ脂質、その全体を参照により本明細書に明示的に援用する）。ＬＮＰ投与の活性及び／または安全性（ＡＬＴ／ＡＳＴ、白血球数及びサイトカイン誘導の１つ以上を調べることによって決定される）は、かかる脂質を組み込むことによって改善され得る。ＫＬ５２を含むＬＮＰは、静脈内及び／または１用量以上で投与され得る。いくつかの実施形態において、ＫＬ５２を含むＬＮＰの投与は、ＭＣ３を含むＬＮＰと比較して、同量または改善したｍＲＮＡ及び／またはタンパク質発現をもたらす。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、更に小さなＬＮＰを使用して送達されてもよい。そのような粒子は、直径が０．１μｍ未満から最大１００ｎｍ、例えば、限定するものではないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５μｍ未満、２０μｍ未満、２５μｍ未満、３０μｍ未満、３５μｍ未満、４０μｍ未満、５０μｍ未満、５５μｍ未満、６０μｍ未満、６５μｍ未満、７０μｍ未満、７５μｍ未満、８０μｍ未満、８５μｍ未満、９０μｍ未満、９５μｍ未満、１００μｍ未満、１２５μｍ未満、１５０μｍ未満、１７５μｍ未満、２００μｍ未満、２２５μｍ未満、２５０μｍ未満、２７５μｍ未満、３００μｍ未満、３２５μｍ未満、３５０μｍ未満、３７５μｍ未満、４００μｍ未満、４２５μｍ未満、４５０μｍ未満、４７５μｍ未満、５００μｍ未満、５２５μｍ未満、５５０μｍ未満、５７５μｍ未満、６００μｍ未満、６２５μｍ未満、６５０μｍ未満、６７５μｍ未満、７００μｍ未満、７２５μｍ未満、７５０μｍ未満、７７５μｍ未満、８００μｍ未満、８２５μｍ未満、８５０μｍ未満、８７５μｍ未満、９００μｍ未満、９２５μｍ未満、９５０μｍ未満または９７５μｍ未満であってよい。
他の実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ及び／または約７０〜約９０ｎｍの直径であり得る、更に小さなＬＮＰを使用して送達されてもよい。
いくつかの実施形態において、そのようなＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーを備える方法を使用して合成される。例示的なマイクロ流体ミキサーには、限定するものではないが、スリット型インターデジタルマイクロミキサーを挙げることができ、例えば、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ））社製によるもの及び／またはジグザグヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）があり（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖ，Ｉ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇが公開されている（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２０１２．２８：３６３３−４０；Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．２０１２．１：ｅ３７；Ｃｈｅｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１２．１３４（１６）：６９４８−５１、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、ＳＨＭを備えるＬＮＰの生成方法は、少なくとも２つの流入流れの混合を更に含み、この混合は、微細構造誘導型カオス的移流（ＭＩＣＡ）によって生じる。この方法によれば、流体流れは、ヘリンボーンのパターンに存在する流路を通って流れ、回転流を引き起こし、流体が互いに折り重なる。この方法はまた、流体が循環している間に表面が方向性を変える、流体混合のための表面を含み得る。ＳＨＭを使用してＬＮＰを生成する方法には、米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号及び同第２０１２／０２７６２０９号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に明示的に援用する）に開示されているものが含まれる。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡワクチンは、限定するものではないが、スリット型インターデジタル微細構造ミキサー（ＳＩＭＭ−Ｖ２）または標準スリット型インターデジタルマイクロミキサー（ＳＳＩＭＭ）またはキャタピラー（ＣＰＭＭ）またはジェット衝突（ＩＪＭＭ）（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ）社製）などのマイクロミキサーを使用して生成された脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、マイクロ流体技術を使用して生成された脂質ナノ粒子中に製剤化され得る（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２００６ ４４２：３６８−３７３；及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２ ２９５：６４７−６５１参照、そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）。非限定的な例として、制御されたマイクロ流体製剤は、マイクロ流路内にある低いレイノルズ数の定常圧による駆動流の流れを混合する受動的方法を伴う（例えば、Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２ ２９５：６４７６５１参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、限定するものではないが、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）社製またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）社製のものなどのマイクロミキサーチップを使用して生成された脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。マイクロミキサーチップを、スリット及び再結合メカニズムにより２つ以上の流体流れを迅速に混合するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、国際公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号または米国特許第８，４４０，６１４号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている薬物封入マイクロスフェアを使用した送達用に製剤化され得る。マイクロスフェアは、国際公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）の化合物を含み得る。他の態様において、本発明のＲＮＡワクチンを細胞に送達するには、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質（ＡＰＰＬ）が有用である（国際公開第ＷＯ２０１３０６３４６８号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、本開示のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、約１０〜約１００ｎｍ、例えば、限定するものではないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ及び／または約９０〜約１００ｎｍの直径を有する脂質ナノ粒子中に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有し得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍまたは１０００ｎｍ超の直径を有し得る。
いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１３０５９９２２号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている限界寸法の脂質ナノ粒子であってよい。限界寸法の脂質ナノ粒子は、水性コアまたは疎水性コアを取り囲む脂質二重層を含み得、ここで、脂質二重層は、限定するものではないが、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、セレブロシド、Ｃ８〜Ｃ２０の脂肪酸ジアシルホスファチジルコリン及び１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）などのリン脂質を含み得る。他の態様において、限界寸法の脂質ナノ粒子は、限定するものではないが、ＤＬＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ−ＰＥＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧなどのポリエチレングリコール脂質を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、国際公開第ＷＯ２０１３０６３５３０号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている送達方法を使用して、特定の場所に送達し、局在化させ、及び／または集中させてもよい。非限定的な例として、ＲＮＡワクチンを対象に送達する前に、それと同時に、またはその後に、空のポリマー粒子を対象に投与してもよい。空のポリマー粒子は、対象と接触すると、体積が変化し、対象内の特定の位置に、留まり、埋め込まれ、固定化され、または捕捉される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、有効物質放出系中に製剤化され得る（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１０２５４５号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。有効物質放出系は、１）触媒活性をもつ核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドインヒビター鎖に結合した少なくとも１つのナノ粒子と、２）治療上有効な物質（例えば、本明細書に記載されるポリヌクレオチド）に結合した少なくとも１つの基質分子に結合した化合物とを含み得、ここで、治療上有効な物質は、触媒活性をもつ核酸による基質分子の切断によって放出される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、非細胞性物質を含む内側コアと、細胞膜を含む外表面とを含むナノ粒子中に製剤化され得る。細胞膜は、細胞由来でもよいし、ウイルス由来の膜であってもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１３０５２１６７号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって作製することができる。別の非限定的な例として、本明細書に記載されるＲＮＡワクチンを送達するために、国際公開第ＷＯ２０１３０５２１６７号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているナノ粒子を使用してもよい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡワクチンは、多孔性ナノ粒子に支持された脂質二重層（原細胞）中に製剤化され得る。原細胞については、国際公開第ＷＯ２０１３０５６１３２号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡワクチンは、米国特許第８，４２０，１２３号及び同第８，５１８，９６３号ならびに欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号（そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているポリマーナノ粒子中、またはこれらに記載されている方法によって作製されたポリマーナノ粒子中に製剤化され得る。非限定的な例として、米国特許第８，５１８，９６３号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているナノ粒子または当該特許に記載されている方法によって作製されたナノ粒子などのポリマーナノ粒子は、高いガラス転移温度を有し得る。別の非限定的な例として、経口製剤及び非経口製剤のためのポリマーナノ粒子は、欧州特許第ＥＰ２０７３８４８Ｂ１号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって作製され得る。
他の実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、イメージングで使用されるナノ粒子中に製剤化され得る。ナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１２９６３６号（その全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているものなどのリポソームナノ粒子であってよい。非限定的な例として、リポソームは、ガドリニウム（ＩＩＩ）２−｛４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリルアミドメチル−Ｎ’−アミド−メチル］−１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカ−１−イル｝−酢酸及び中性の完全に飽和したリン脂質成分を含み得る（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１２９６３６号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
いくつかの実施形態において、本発明において使用することができるナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１３０３４８号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって形成される。
本発明のナノ粒子は、限定するものではないが、欠乏すると貧血から神経管欠陥に及ぶ健康被害をもたらし得るものなどの栄養素を更に含み得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０７２９２９号に記載のナノ粒子参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。非限定的な例として、栄養素は、第一鉄塩、第二鉄塩または元素状の鉄、ヨウ素、葉酸、ビタミンまたは微量栄養素であってよい。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、膨潤性ナノ粒子中に製剤化され得る。膨潤性ナノ粒子は、限定するものではないが、米国特許第８，４４０，２３１号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているものであってよい。非限定的な実施形態として、本発明のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを肺系統に送達するために、膨潤性ナノ粒子が使用され得る（例えば、米国特許第８，４４０，２３１号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。
本発明のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、限定するものではないが、米国特許第８，４４９，９１６号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されるものなどのポリ酸無水物ナノ粒子中に製剤化され得る。本発明のナノ粒子及びマイクロ粒子を幾何学的に操作して、マクロファージ応答及び／または免疫応答を制御してもよい。いくつかの態様において、幾何学的に操作された粒子は、限定するものではないが、肺送達などの標的化送達用の本発明のポリヌクレオチドを組み込むために、様々な形状、大きさ及び／または表面電荷を有し得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号参照、その内容全体を参照により本明細書に援用する）。幾何学的に操作される粒子の他の物理的特徴には、限定するものではないが、窓形成、角度のあるアーム、非対称性及び表面粗さ、電荷が含まれ得、これにより、細胞と組織との相互作用を変えることができる。非限定的な例として、本発明のナノ粒子は、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって作製することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、水溶性ナノ粒子、例えば、限定するものではないが、国際公開第ＷＯ２０１３０９０６０１号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されるものなどであってよい。ナノ粒子は、良好な水溶性を示すために、小型で双性イオンのリガンドを有する無機ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子はまた、小さな流体力学的直径（ＨＤ）、時間、ｐＨ及び塩濃度に対する安定性、ならびに低レベルの非特異的タンパク質結合を有し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって開発され得る。
いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子は、限定するものではないが、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているものなどのステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子である。本発明のナノ粒子は、米国特許出願公開第２０１３０１７２４０６号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって作製することができる。
他の実施形態において、ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含み得る。ポリマーマトリックスは、限定するものではないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ酸無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレートまたはこれらの組み合わせなどの２つ以上のポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、高密度の核酸層を有するナノ粒子−核酸ハイブリッド構造であってよい。非限定的な例として、ナノ粒子−核酸ハイブリッド構造は、米国特許出願公開第２０１３０１７１６４６号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されている方法によって作製することができる。ナノ粒子は、限定するものではないが、本明細書に記載されるポリヌクレオチド及び／または当該技術分野において知られているポリヌクレオチドなどの核酸を含み得る。
本発明のナノ粒子の少なくとも１つは、コアナノ構造に埋め込まれ得、またはナノ構造内もしくはナノ構造上で少なくとも１つのペイロードを運搬もしくは会合することが可能である低密度の多孔性３Ｄ構造もしくはコーティングで被覆され得る。少なくとも１つのナノ粒子を含むナノ構造の非限定的な例は、国際公開第ＷＯ２０１３１２３５２３号に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
ワクチン投与方法
ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、治療上有効な成果をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらには、皮内、筋肉内、鼻腔内及び／または皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。本開示は、それを必要とする対象にＲＮＡワクチンを投与することを含む方法を提供する。正確な必要量は、対象の種、年齢及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象ごとに変化し得る。ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、典型的に、投与の容易性及び用量の均一性のために単位剤形で製剤化される。しかしながら、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物の一日の総用量は、堅実な医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効な用量レベル、予防上有効な用量レベル、適切なイメージング用量レベルは、治療対象の疾病及び疾病の重症度、採用される特定の化合物の活性、採用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全身状態、性別及び食生活、採用される特定の化合物の投与の時間、投与経路及び排泄速度、治療の継続期間、採用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医学分野でよく知られている同様の因子を含む、種々の因子に依存し得る。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、１日につき対象の体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な用量レベルで、１日１回以上、週１回以上、月１回以上などで投与されて、所望の治療効果、診断効果、予防効果またはイメージング効果を得ることができる（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０７８１９９号に記載されている単位用量範囲を参照、その全体を参照により本明細書に援用する）。所望の用量は、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、毎週、２週ごと、３週ごと、４週ごと、２ヶ月ごと、３ヶ月ごと、６ヶ月ごとなどに送達され得る。ある特定の実施形態において、所望の用量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回またはそれ以上の投与）を用いて送達され得る。複数回投与が採用される場合、本明細書に記載されるものなどの分割投薬計画を使用してもよい。例示的な実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇまたは約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な用量レベルで投与され得る。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜０．７５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な用量レベルで、１回または２回（またはそれ以上）投与され得る。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０１００ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．０５０ｍｇ、０．０７５ｍｇ、０．１００ｍｇ、０．１２５ｍｇ、０．１５０ｍｇ、０．１７５ｍｇ、０．２００ｍｇ、０．２２５ｍｇ、０．２５０ｍｇ、０．２７５ｍｇ、０．３００ｍｇ、０．３２５ｍｇ、０．３５０ｍｇ、０．３７５ｍｇ、０．４００ｍｇ、０．４２５ｍｇ、０．４５０ｍｇ、０．４７５ｍｇ、０．５００ｍｇ、０．５２５ｍｇ、０．５５０ｍｇ、０．５７５ｍｇ、０．６００ｍｇ、０．６２５ｍｇ、０．６５０ｍｇ、０．６７５ｍｇ、０．７００ｍｇ、０．７２５ｍｇ、０．７５０ｍｇ、０．７７５ｍｇ、０．８００ｍｇ、０．８２５ｍｇ、０．８５０ｍｇ、０．８７５ｍｇ、０．９００ｍｇ、０．９２５ｍｇ、０．９５０ｍｇ、０．９７５ｍｇもしくは１．０ｍｇの総用量またはこれらの総用量を送達するのに十分な用量レベルで、２回（例えば、０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３ヶ月後、０日目及び６ヶ月後、０日目及び９ヶ月後、０日目及び１２ヶ月後、０日目及び１８ヶ月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後または０日目及び１０年後）投与され得る。より高い用量及びより低い用量ならびに投与頻度が本開示に包含される。例えば、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、３回または４回投与され得る。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン組成物は、０．０１０ｍｇ、０．０２５ｍｇ、０．１００ｍｇもしくは０．４００ｍｇの総用量またはこれらの総用量を送達するのに十分な用量レベルで、２回（例えば、０日目及び７日目、０日目及び１４日目、０日目及び２１日目、０日目及び２８日目、０日目及び６０日目、０日目及び９０日目、０日目及び１２０日目、０日目及び１５０日目、０日目及び１８０日目、０日目及び３ヶ月後、０日目及び６ヶ月後、０日目及び９ヶ月後、０日目及び１２ヶ月後、０日目及び１８ヶ月後、０日目及び２年後、０日目及び５年後または０日目及び１０年後）投与され得る。
いくつかの実施形態において、対象にワクチン接種を行う方法にて使用されるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、対象へのワクチン接種に有効な量で、１０μｇ／ｋｇ〜４００μｇ／ｋｇの核酸ワクチンの単回用量が対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象にワクチン接種を行う方法にて使用されるＲＮＡワクチンは、対象へのワクチン接種に有効な量で、１０μｇ〜４００μｇの核酸ワクチンの単回用量が対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象にワクチン接種を行う方法にて使用されるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、２５〜１０００μｇの単回用量（例えば、ＲＳＶ抗原をコードするｍＲＮＡの単回用量）として対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｇの単回用量として対象に投与される。例えば、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、２５〜１００、２５〜５００、５０〜１００、５０〜５００、５０〜１０００、１００〜５００、１００〜１０００、２５０〜５００、２５０〜１０００または５００〜１０００μｇの単回用量として対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、対象にワクチン接種を行う方法にて使用されるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、２回用量として対象に投与され、その用量の組み合わせは、２５〜１０００μｇのＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンに等しい。
本明細書に記載されるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチン医薬組成物は、鼻腔内、気管内または注射可能（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内及び皮下）などの本明細書に記載される剤形に製剤化することができる。
ＲＳＶ ＲＮＡワクチン製剤及び使用方法
本開示のいくつかの態様は、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの製剤を提供し、ここで、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、対象において抗原特異的免疫応答（例えば、抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチドに特異的な抗体の産生）をもたらすのに有効な量で製剤化される。「有効量」は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効なＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの用量である。また、対象の抗原特異的免疫応答を誘導する方法も本明細書で提供される。
いくつかの実施形態において、抗原特異的免疫応答は、本明細書で提供されるＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンを投与した対象において産生された抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価を測定することによって特徴付けられる。抗体力価は、対象内の抗体の量、例えば、特定の抗原（例えば、抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド）または抗原のエピトープに特異的である抗体の量の測定値である。抗体力価は、典型的に、陽性結果をもたらす最大希釈の逆数で表される。例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）が、抗体力価を決定するための一般的なアッセイである。
いくつかの実施形態において、抗体力価は、対象が感染したかどうかを評価し、または免疫付与が必要かどうかを決定するために使用される。いくつかの実施形態において、抗体力価は、自己免疫応答の強さを決定し、ブースター免疫が必要であるかを決定し、以前のワクチンが有効であったかを決定し、かつ最近または以前のあらゆる感染を特定するために使用される。本開示によれば、抗体力価は、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンによって、対象において誘導された免疫応答の強さを決定するために使用される。
いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加する。例えば、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５または少なくとも３ｌｏｇ増加し得る。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、１、１．５、２、２．５または３ｌｏｇ増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、１〜３ｌｏｇ増加する。例えば、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、１〜１．５、１〜２、１〜２．５、１〜３、１．５〜２、１．５〜２．５、１．５〜３、２〜２．５、２〜３または２．５〜３ｌｏｇ増加し得る。
いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、少なくとも２倍増加する。例えば、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍増加し得る。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、２、３、４、５，６、７、８、９または１０倍増加する。いくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、２〜１０倍増加する。例えば、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、対照（例えば、対照ワクチン）と比較して、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９または９〜１０倍増加し得る。
対照は、いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの投与を受けたことがない対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、弱毒化生ＲＳＶワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。弱毒化ワクチンは、毒性を低下させることによって作製された生存能力のある（生きた）ワクチンである。弱毒化されたウイルスは、改変されていない生きたウイルスと比較して、無害または低毒性になるように改変される。いくつかの実施形態において、対照は、ＲＳＶ不活化ワクチンの投与を受けた対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの投与を受けた対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。組み換えタンパク質ワクチンは、典型的に、異種発現系（例えば、細菌または酵母）で産生されたタンパク質抗原または大量の病原性生物から精製されたタンパク質抗原のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、対照は、ＲＳＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチン（例えば、ウイルスカプシドタンパク質を含有するが、ウイルスゲノムを含まないので、子孫ウイルスを複製／産生することができない粒子）の投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である。いくつかの実施形態において、対照は、融合前または融合後のＦタンパク質を含むか、２つの組み合わせを含む、ＶＬＰ ＲＳＶワクチンである。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量と比較して少ない用量である。本明細書で提供される「標準治療」は、医学的または心理学的治療ガイドラインを指し、全般的または特定的であり得る。「標準治療」は、科学的証拠及び所与の状態の治療に関わる医療専門家間の協力に基づいた適切な治療法を規定している。これは、ある特定のタイプの患者、疾病または臨床環境に対して医師／臨床医が従うべき診断及び治療プロセスである。「標準治療用量」は、本明細書に記載されるとき、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの用量であって、医師／臨床医または他の医療専門家が、ＲＳＶまたはＲＳＶ関連状態を治療または予防するための標準治療ガイドラインに従いながら、ＲＳＶまたはＲＳＶ関連状態を治療または予防するために対象に投与する用量である。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンの有効量を投与した対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／２に減らした用量と同等の用量である。例えば、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／３、少なくとも１／４、少なくとも１／５、少なくとも１／６、少なくとも１／７、少なくとも１／８、少なくとも１／９または少なくとも１／１０に減らした用量と同等の用量であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも少なくとも１／１００、少なくとも１／５００または少なくとも１／１０００に減らした用量と同等の用量である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、１／２５０、１／５００または１／１０００に減らした用量と同等の用量である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡワクチンの有効量を投与した対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくはタンパク質ＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を１／２〜１／１０００（例えば、１／２〜１／１００、１／１０〜１／１０００）に減らした用量と同等の用量であり、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を１／２〜１／１０００、１／２〜１／９００、１／２〜１／８００、１／２〜１／７００、１／２〜１／６００、１／２〜１／５００、１／２〜１／４００、１／２〜１／３００、１／２〜１／２００、１／２〜１／１００、１／２〜１／９０、１／２〜１／８０、１／２〜１／７０、１／２〜１／６０、１／２〜１／５０、１／２〜１／４０、１／２〜１／３０、１／２〜１／２０、１／２〜１／１０、１／２〜１／９、１／２〜１／８、１／２〜１／７、１／２〜１／６、１／２〜１／５、１／２〜１／４、１／２〜１／３、１／３〜１／１０００、１／３〜１／９００、１／３〜１／８００、１／３〜１／７００、１／３〜１／６００、１／３〜１／５００、１／３〜１／４００、１／３〜１／３００、１／３〜１／２００、１／３〜１／１００、１／３〜１／９０、１／３〜１／８０、１／３〜１／７０、１／３〜１／６０、１／３〜１／５０、１／３〜１／４０、１／３〜１／３０、１／３〜１／２０、１／３〜１／１０、１／３〜１／９、１／３〜１／８、１／３〜１／７、１／３〜１／６、１／３〜１／５、１／３〜１／４、１／４〜１／１０００、１／４〜１／９００、１／４〜１／８００、１／４〜１／７００、１／４〜１／６００、１／４〜１／５００、１／４〜１／４００、１／４〜１／４００、１／４〜１／２００、１／４〜１／１００、１／４〜１／９０、１／４〜１／８０、１／４〜１／７０、１／４〜１／６０、１／４〜１／５０、１／４〜１／４０、１／４〜１／３０、１／４〜１／２０、１／４〜１／１０、１／４〜１／９、１／４〜１／８、１／４〜１／７、１／４〜１／６、１／４〜１／５、１／４〜１／４、１／５〜１／１０００、１／５〜１／９００、１／５〜１／８００、１／５〜１／７００、１／５〜１／６００、１／５〜１／５００、１／５〜１／４００、１／５〜１／３００、１／５〜１／２００、１／５〜１／１００、１／５〜１／９０、１／５〜１／８０、１／５〜１／７０、１／５〜１／６０、１／５〜１／５０、１／５〜１／４０、１／５〜１／３０、１／５〜１／２０、１／５〜１／１０、１／５〜１／９、１／５〜１／８、１／５〜１／７、１／５〜１／６、１／６〜１／１０００、１／６〜１／９００、１／６〜１／８００、１／６〜１／７００、１／６〜１／６００、１／６〜１／５００、１／６〜１／４００、１／６〜１／３００、１／６〜１／２００、１／６〜１／１００、１／６〜１／９０、１／６〜１／８０、１／６〜１／７０、１／６〜１／６０、１／６〜１／５０、１／６〜１／４０、１／６〜１／３０、１／６〜１／２０、１／６〜１／１０、１／６〜１／９、１／６〜１／８、１／６〜１／７、１／７〜１／１０００、１／７〜１／９００、１／７〜１／８００、１／７〜１／７００、１／７〜１／６００、１／７〜１／５００、１／７〜１／４００、１／７〜１／３００、１／７〜１／２００、１／７〜１／１００、１／７〜１／９０、１／７〜１／８０、１／７〜１／７０、１／７〜１／６０、１／７〜１／５０、１／７〜１／４０、１／７〜１／３０、１／７〜１／２０、１／７〜１／１０、１／７〜１／９、１／７〜１／８、１／８〜１／１０００、１／８〜１／９００、１／８〜１／８００、１／８〜１／７００、１／８〜１／６００、１／８〜１／５００、１／８〜１／４００、１／８〜１／３００、１／８〜１／２００、１／８〜１／１００、１／８〜１／９０、１／８〜１／８０、１／８〜１／７０、１／８〜１／６０、１／８〜１／５０、１／８〜１／４０、１／８〜１／３０、１／８〜１／２０、１／８〜１／１０、１／８〜１／９、１／９〜１／１０００、１／９〜１／９００、１／９〜１／８００、１／９〜１／７００、１／９〜１／６００、１／９〜１／５００、１／９〜１／４００、１／９〜１／３００、１／９〜１／２００、１／９〜１／１００、１／９〜１／９０、１／９〜１／８０、１／９〜１／７０、１／９〜１／６０、１／９〜１／５０、１／９〜１／４０、１／９〜１／３０、１／９〜１／２０、１／９〜１／１０、１／１０〜１／１０００、１／１０〜１／９００、１／１０〜１／８００、１／１０〜１／７００、１／１０〜１／６００、１／１０〜１／５００、１／１０〜１／４００、１／１０〜１／３００、１／１０〜１／２００、１／１０〜１／１００、１／１０〜１／９０、１／１０〜１／８０、１／１０〜１／７０、１／１０〜１／６０、１／１０〜１／５０、１／１０〜１／４０、１／１０〜１／３０、１／１０〜１／２０、１／２０〜１／１０００、１／２０〜１／９００、１／２０〜１／８００、１／２０〜１／７００、１／２０〜１／６００、１／２０〜１／５００、１／２０〜１／４００、１／２０〜１／３００、１／２０〜１／２００、１／２０〜１／１００、１／２０〜１／９０、１／２０〜１／８０、１／２０〜１／７０、１／２０〜１／６０、１／２０〜１／５０、１／２０〜１／４０、１／２０〜１／３０、１／３０〜１／１０００、１／３０〜１／９００、１／３０〜１／８００、１／３０〜１／７００、１／３０〜１／６００、１／３０〜１／５００、１／３０〜１／４００、１／３０〜１／３００、１／３０〜１／２００、１／３０〜１／１００、１／３０〜１／９０、１／３０〜１／８０、１／３０〜１／７０、１／３０〜１／６０、１／３０〜１／５０、１／３０〜１／４０、１／４０〜１／１０００、１／４０〜１／９００、１／４０〜１／８００、１／４０〜１／７００、１／４０〜１／６００、１／４０〜１／５００、１／４０〜１／４００、１／４０〜１／３００、１／４０〜１／２００、１／４０〜１／１００、１／４０〜１／９０、１／４０〜１／８０、１／４０〜１／７０、１／４０〜１／６０、１／４０〜１／５０、１／５０〜１／１０００、１／５０〜１／９００、１／５０〜１／８００、１／５０〜１／７００、１／５０〜１／６００、１／５０〜１／５００、１／５０〜１／４００、１／５０〜１／３００、１／５０〜１／２００、１／５０〜１／１００、１／５０〜１／９０、１／５０〜１／８０、１／５０〜１／７０、１／５０〜１／６０、１／６０〜１／１０００、１／６０〜１／９００、１／６０〜１／８００、１／６０〜１／７００、１／６０〜１／６００、１／６０〜１／５００、１／６０〜１／４００、１／６０〜１／３００、１／６０〜１／２００、１／６０〜１／１００、１／６０〜１／９０、１／６０〜１／８０、１／６０〜１／７０、１／７０〜１／１０００、１／７０〜１／９００、１／７０〜１／８００、１／７０〜１／７００、１／７０〜１／６００、１／７０〜１／５００、１／７０〜１／４００、１／７０〜１／３００、１／７０〜１／２００、１／７０〜１／１００、１／７０〜１／９０、１／７０〜１／８０、１／８０〜１／１０００、１／８０〜１／９００、１／８０〜１／８００、１／８０〜１／７００、１／８０〜１／６００、１／８０〜１／５００、１／８０〜１／４００、１／８０〜１／３００、１／８０〜１／２００、１／８０〜１／１００、１／８０〜１／９０、１／９０〜１／１０００、１／９０〜１／９００、１／９０〜１／８００、１／９０〜１／７００、１／９０〜１／６００、１／９０〜１／５００、１／９０〜１／４００、１／９０〜１／３００、１／９０〜１／２００、１／９０〜１／１００、１／１００〜１／１０００、１／１００〜１／９００、１／１００〜１／８００、１／１００〜１／７００、１／１００〜１／６００、１／１００〜１／５００、１／１００〜１／４００、１／１００〜１／３００、１／１００〜１／２００、１／２００〜１／１０００、１／２００〜１／９００、１／２００〜１／８００、１／２００〜１／７００、１／２００〜１／６００、１／２００〜１／５００、１／２００〜１／４００、１／２００〜１／３００、１／３００〜１／１０００、１／３００〜１／９００、１／３００〜１／８００、１／３００〜１／７００、１／３００〜１／６００、１／３００〜１／５００、１／３００〜１／４００、１／４００〜１／１０００、１／４００〜１／９００、１／４００〜１／８００、１／４００〜１／７００、１／４００〜１／６００、１／４００〜１／５００、１／５００〜１／１０００、１／５００〜１／９００、１／５００〜１／８００、１／５００〜１／７００、１／５００〜１／６００、１／６００〜１／１０００、１／６００〜１／９００、１／６００〜１／８００、１／６００〜１／７００、１／７００〜１／１０００、１／７００〜１／９００、１／７００〜１／８００、１／８００〜１／１０００、１／８００〜１／９００または１／９００〜１／１０００に減らした用量と同等の用量である。前述などのいくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。いくつかの実施形態において、有効量は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチン標準治療用量を１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／６０、１／７０、１／８０、１／９０、１／１００、１／１１０、１／１２０、１／１３０、１／１４０、１／１５０、１／１６０、１／１７０、１／１２８０、１／１９０、１／２００、１／２１０、１／２２０、１／２３０、１／２４０、１／２５０、１／２６０、１／２７０、１／２８０、１／２９０、１／３００、１／３１０、１／３２０、１／３３０、１／３４０、１／３５０、１／３６０、１／３７０、１／３８０、１／３９０、１／４００、１／４１０、１／４２０、１／４３０、１／４４０、１／４５０、１／４３６０、１／４７０、１／４８０、１／４９０、１／５００、１／５１０、１／５２０、１／５３０、１／５４０、１／５５０、１／５６０、１／５７６０、１／５８０、１／５９０、１／６００、１／６１０、１／６２０、１／６３０、１／６４０、１／６５０、１／６６０、１／６７０、１／６８０、１／６９０、１／７００、１／７１０、１／７２０、１／７３０、１／７４０、１／７５０、１／７６０、１／７７０、１／７８０、１／７９０、１／８００、１／８１０、１／８２０、１／８３０、１／８４０、１／８５０、１／８６０、１／８７０、１／８８０、１／８９０、１／９００、１／９１０、１／９２０、１／９３０、１／９４０、１／９５０、１／９６０、１／９７０、１／９８０、１／９９０または１／１０００に減らした用量と同等（または少なくとも同等）の用量である。前述などのいくつかの実施形態において、対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である。
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、５０〜１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、５０〜１０００、５０〜９００、５０〜８００、５０〜７００、５０〜６００、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、５０〜９０、５０〜８０、５０〜７０、５０〜６０、６０〜１０００、６０〜９００、６０〜８００、６０〜７００、６０〜６００、６０〜５００、６０〜４００、６０〜３００、６０〜２００、６０〜１００、６０〜９０、６０〜８０、６０〜７０、７０〜１０００、７０〜９００、７０〜８００、７０〜７００、７０〜６００、７０〜５００、７０〜４００、７０〜３００、７０〜２００、７０〜１００、７０〜９０、７０〜８０、８０〜１０００、８０〜９００、８０〜８００、８０〜７００、８０〜６００、８０〜５００、８０〜４００、８０〜３００、８０〜２００、８０〜１００、８０〜９０、９０〜１０００、９０〜９００、９０〜８００、９０〜７００、９０〜６００、９０〜５００、９０〜４００、９０〜３００、９０〜２００、９０〜１００、１００〜１０００、１００〜９００、１００〜８００、１００〜７００、１００〜６００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、２００〜１０００、２００〜９００、２００〜８００、２００〜７００、２００〜６００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、３００〜１０００、３００〜９００、３００〜８００、３００〜７００、３００〜６００、３００〜５００、３００〜４００、４００〜１０００、４００〜９００、４００〜８００、４００〜７００、４００〜６００、４００〜５００、５００〜１０００、５００〜９００、５００〜８００、５００〜７００、５００〜６００、６００〜１０００、６００〜９００、６００〜９００、６００〜７００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、８００〜９００または９００〜１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００μｇの総用量である。いくつかの実施形態において、有効量は、対象に合計２回投与される、２５〜５００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、対象に合計２回投与される、２５〜５００、２５〜４００、２５〜３００、２５〜２００、２５〜１００、２５〜５０、５０〜５００、５０〜４００、５０〜３００、５０〜２００、５０〜１００、１００〜５００、１００〜４００、１００〜３００、１００〜２００、１５０〜５００、１５０〜４００、１５０〜３００、１５０〜２００、２００〜５００、２００〜４００、２００〜３００、２５０〜５００、２５０〜４００、２５０〜３００、３００〜５００、３００〜４００、３５０〜５００、３５０〜４００、４００〜５００または４５０〜５００μｇの用量である。いくつかの実施形態において、ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンの有効量は、対象に合計２回投与される、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μｇの総用量である。
追加の実施形態
１．５’末端キャップと、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ＲＳＶワクチン。
２．当該少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２５７によって特定される配列によってコードされる、段落１に記載のワクチン。
３．当該少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２５８によって特定される配列によってコードされる、段落１に記載のワクチン。
４．当該少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２５９によって特定される配列によってコードされる、段落１に記載のワクチン。
５．当該少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２７８によって特定される配列を含む、段落１に記載のワクチン。
６．当該少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２７９によって特定される配列を含む、段落１に記載のワクチン。
７．当該少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２８０によって特定される配列を含む、段落１に記載のワクチン。
８．当該５’末端キャップが、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐであるか、これを含む、段落１〜７のいずれか１つに記載のワクチン。
９．当該オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が当該ウラシルの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、段落１〜８のいずれか１つに記載のワクチン。
１０．ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化される、段落１〜９のいずれか１つに記載のワクチン。
１１．当該脂質ナノ粒子が、クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース及び水を更に含む、段落１０に記載のワクチン。
１２．５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐと、配列番号２７８によって特定される配列と、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号２７８によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾され、任意選択によりＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化される、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン。
１３．５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐと、配列番号２７９によって特定される配列と、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号２７９によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾され、任意選択によりＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化される、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン。
１４．５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐと、配列番号２８０によって特定される配列と、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号２８０によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾され、任意選択によりＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化される、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン。
１５．５’末端キャップと、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ＲＳＶワクチン。
１６．当該少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号５によって特定される配列によってコードされる、段落１５に記載のワクチン。
１７．当該少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２６２によって特定される配列を含む、段落１５に記載のワクチン。
１８．当該少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドが、配列番号６によって特定される配列を含む、段落１５に記載のワクチン。
１９．当該少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドが、配列番号２９０によって特定される配列を含む、段落１５に記載のワクチン。
２０．当該ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号７によって特定される配列によってコードされる、段落１５に記載のワクチン。
２１．当該ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２６３によって特定される配列を含む、段落１５に記載のワクチン。
２２．当該少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドが、配列番号８によって特定される配列を含む、段落１５に記載のワクチン。
２３．当該少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドが、配列番号２９１によって特定される配列を含む、段落１５に記載のワクチン。
２４．当該５’末端キャップが、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐであるか、これを含む、段落１５〜２３のいずれか１つに記載のワクチン。
２５．当該オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が当該ウラシルの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、段落１５〜２４のいずれか１つに記載のワクチン。
２６．ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化される、段落１５〜２５のいずれか１つに記載のワクチン。
２７．当該脂質ナノ粒子が、クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース及び水を更に含む、段落２６に記載のワクチン。
２８．５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐと、配列番号２６２によって特定される配列と、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号２６２によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾され、任意選択によりＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化される、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン。
２９．５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐと、配列番号２６３によって特定される配列と、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、当該配列番号２６３によって特定される配列のウラシルヌクレオチドは、当該ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾され、任意選択によりＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化される、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン。
本発明は、その適用において、以下の説明に記載され、または図面に示される構築物の詳細及び構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践または実行することができる。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明を目的としており、限定的なものとみなされるべきではない。本明細書における「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」または「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」、「ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ（伴う）」及びこれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びそれらの等価物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
実施例１：ポリヌクレオチドの製造
本開示によれば，ポリヌクレオチド及び／またはその部分もしくは領域の製造は、「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」と題された国際公開第ＷＯ２０１４／１５２０２７号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に教示されている方法を利用して達成することができる。
精製方法には、国際公開第ＷＯ２０１４／１５２０３０号及び国際公開第ＷＯ２０１４／１５２０３１号（そのそれぞれの全体を参照により本明細書に援用する）に教示されているものが含まれ得る。
ポリヌクレオチドの検知法及び特性評価法は、国際公開第ＷＯ２０１４／１４４０３９号（その全体を参照により本明細書に援用する）に教示されているように実施することができる。
本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素シーケンシング、電荷分布解析、ＲＮＡ不純物の検出または前述の２つ以上の任意の組み合わせを使用して達成することができる。「特徴付け」には、ＲＮＡ転写産物の配列を決定すること、ＲＮＡ転写産物の純度を決定すること、またはＲＮＡ転写産物の電荷不均一性を決定することが含まれる。そのような方法は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／１４４７１１号及び国際公開第ＷＯ２０１４／１４４７６７号に教示されており、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に援用する。
実施例２：キメラポリヌクレオチド合成
本開示によれば、三リン酸化学反応を使用して、キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を連結またはライゲートすることができる。例えば、１００ヌクレオチド以下の第１の領域または部分は、５’リン酸及び末端３’ｄｅｓＯＨまたは遮断ＯＨにより、化学的に合成される。領域が８０ヌクレオチドよりも長い場合、ライゲーション用の２つの鎖として合成することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を使用して第１の領域または部分を非位置的に改変された領域または部分として合成する場合、５’リン酸への変換と、それに続く３’末端キャッピングとが行われ得る。
一リン酸保護基は、当該技術分野において知られているもののいずれかから選択することができる。
キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成またはＩＶＴ方法のいずれかを使用して合成することができる。ＩＶＴ方法は、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができるＲＮＡポリメラーゼを含み得る。あるいは、１３０ヌクレオチドまでのキャップを化学的に合成し、ＩＶＴ領域またはＩＶＴ部分に連結してもよい。
ライゲーション法では、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼによるライゲーションと、それに続くＤＮＡｓｅ処理により、コンカテマー化が容易に回避されるものである。
キメラポリヌクレオチド全体をリン酸−糖骨格で作製する必要はない。領域または部分のうちの１つがポリペプチドをコードする場合、かかる領域または部分は、リン酸−糖骨格を含み得る。
次に、任意の既知のクリックケミストリー、オルトクリックケミストリー、ソルリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）または当業者に知られている他のバイオコンジュゲート化学反応を使用して、ライゲーションを行う。
合成経路
一連の出発セグメントを使用してキメラポリヌクレオチドを作製することができる。かかるセグメントには、
（ａ）通常の３’ＯＨを含む、キャップ及び保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）、
（ｂ）ポリペプチドのコーディング領域及び通常の３’ＯＨを含み得る、５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）、
（ｃ）コルジセピンを含み、または３’ＯＨを含まない、キメラポリヌクレオチドの３’端（例えばテール）用の５’リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）が含まれる。
合成（化学的合成またはＩＶＴ合成）後に、セグメント３（ＳＥＧ．３）をコルジセピンで処理し、次いで、ピロホスファターゼで処理して、５’リン酸を生成させる。
次いで、ＲＮＡリガーゼを使用して、セグメント２（ＳＥＧ．２）をＳＥＧ．３にライゲーションすることができる。次いで、ライゲーションされたポリヌクレオチドを精製し、ピロホスファターゼで処理して、二リン酸を切断する。次いで、処理されたＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３構築物を精製し、５’末端にＳＥＧ．１をライゲーションする。キメラポリヌクレオチドの更なる精製ステップが実施されてもよい。
キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲーションされたセグメントまたは連結されたセグメントは、次のように表すことができる。５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）。
各ステップの収率は、９０〜９５％にもなり得る。
実施例３：ｃＤＮＡ生成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡを調製するためのＰＣＲ工程は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）による２× ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して実施することができる。このシステムは、２× ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ １２．５μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ １００ｎｇを含み、ｄＨ２Ｏで２５．０μｌに希釈される。反応条件は、９５℃で５分であってよく、９８℃で２０秒、次に５８℃で１５秒、次に７２℃で４５秒を２５サイクル、次に７２℃で５分、次に終了まで４℃で反応を実施することができる。
ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造元の説明書に従って使用して、反応をクリーンアップすることができる（５μｇまで）。より大きな反応には、許容量がより大きい製品を使用したクリーンアップが必要とされ得る。クリーンアップに続いて、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してｃＤＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、当該ｃＤＮＡが予想されるサイズであることを確認することができる。次いで、ｃＤＮＡをシーケンシング解析に供した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に進む。
実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応により、ＲＮＡポリヌクレオチドが生成される。かかるポリヌクレオチドは、化学修飾ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、本開示のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドは、均一に修飾されたポリヌクレオチドであり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、カスタムのヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）混合物を利用する。ＮＴＰは、化学修飾ＮＴＰ、または天然ＮＴＰと化学修飾ＮＴＰの混合物を含み得る。
典型的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応は、以下を含む。
１）鋳型ｃＤＮＡ １．０μｇ
２）１０×転写バッファー ２．０μｌ
（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１９０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ スペルミジン）
３）カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ） ０．２μｌ
４）ＲＮａｓｅ阻害剤 ２０Ｕ
５）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ３０００Ｕ
６）ｄＨ２Ｏ 最大２０．０μｌ、及び
７）３７℃で３〜５時間のインキュベーション。
粗ＩＶＴ混合物は、翌日のクリーンアップに備えて、４℃で終夜保存され得る。次いで、１ＵのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅを使用して、元の鋳型を消化する。３７℃で１５分のインキュベーション後に、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を製造元の説明書に従って使用して、ｍＲＮＡを精製することができる。このキットは５００μｇまでのＲＮＡを精製することができる。このクリーンアップに続いて、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を使用してＲＮＡポリヌクレオチドを定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、ＲＮＡポリヌクレオチドが適切なサイズであり、かつＲＮＡの分解が起きていないことを確認することができる。
実施例５：酵素キャッピング
ＲＮＡポリヌクレオチドのキャッピングは、以下のとおりに実施される。この場合、混合物は、ＩＶＴ ＲＮＡ ６０μｇ〜１８０μｇ及びｄＨ２Ｏの最大７２μｌを含む。混合物を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させた後、これを直ちに氷に移す。
次いで、本プロトコールは、１０×キャッピングバッファー（０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）、２０ｍＭ ＧＴＰ（５．０μｌ）、２０ｍＭ Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）、ｄＨ２Ｏ（最大２８μｌ）の混合と、ＲＮＡが６０μｇの場合は３０分間、ＲＮＡが１８０μｇの場合は最大２時間の３７℃でのインキュベーションとを伴う。
次いで、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を製造元の説明書に従って使用して、ＲＮＡポリヌクレオチドを精製することができる。このクリーンアップに続いて、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動で分析して、ＲＮＡポリヌクレオチドが適切なサイズであり、かつＲＮＡの分解が起きていないことを確認することができる。ＲＮＡポリヌクレオチド産物はまた、逆転写ＰＣＲを行ってシーケンシング用のｃＤＮＡを生成させることで、配列決定を行ってもよい。
実施例６：ポリＡテーリング反応
ｃＤＮＡ中にポリＴがない場合は、最終産物のクリーニング前にポリＡテーリング反応を実施する必要がある。これは、キャップされたＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）、１０×テーリングバッファー（０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）、２０ｍＭ ＡＴＰ（６．０μｌ）、ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）、ｄＨ２Ｏ 最大１２３．５μｌを混合し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって行われる。ポリＡテールが転写産物中に既に存在する場合には、テーリング反応を飛ばして、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）によるクリーンアップ（５００μｇまで）に直接進むことができる。ポリ−Ａポリメラーゼは、酵母中で発現された組み換え酵素であってよい。
ポリＡテーリング反応の処理能力または完全性は、常に正確なサイズのポリＡテールをもたらすとは限らないことを理解されたい。したがって、およそ４０〜２００ヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５のポリＡテールは、本開示の範囲内である。
実施例７：キャッピングアッセイ
タンパク質発現アッセイ
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、等しい濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションから６、１２、２４及び／または３６時間後に、培養培地中に分泌されたタンパク質の量を、ＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。より高いレベルのタンパク質を培地中に分泌する合成ポリヌクレオチドは、より高い翻訳能力のあるキャップ構造を有する合成ポリヌクレオチドに該当する。
純度分析合成
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、変性アガロース尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を使用して、純度について比較することができる。電気泳動で単一の統合されたバンドを有するＲＮＡポリヌクレオチドは、複数のバンドまたは縞状のバンドを有するポリヌクレオチドと比較して、純度の高い生成物に該当する。単一のＨＰＬＣピークを有する化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドも、純度の高い生成物に該当する。キャッピング反応の効率が高いほど、より純粋なポリヌクレオチド集団を与える。
サイトカイン分析
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、複数の濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションから６、１２、２４及び／または３６時間後に、培養培地中に分泌されたＴＮＦ−α及びＩＦＮ−βなどの炎症促進性サイトカインの量を、ＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。より高いレベルの炎症誘発性サイトカインを培地中に分泌させるＲＮＡポリヌクレオチドは、免疫活性化キャップ構造を含有するポリヌクレオチドに該当する。
キャッピング反応効率
本明細書で教示されるキャップのいずれかを含有し、ポリペプチドをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理後にＬＣ−ＭＳによって、キャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理により、ＬＣ−ＭＳによって検出可能である、遊離ヌクレオチドとキャップされた５’−５−三リン酸キャップ構造との混合物が得られる。ＬＣ−ＭＳスペクトルにおけるキャップされた生成物の量は、反応からの総ポリヌクレオチドのパーセントとして表すことができ、キャッピング反応効率に対応する。キャッピング反応効率の高いキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳによると、キャップされた生成物の量が多い。
実施例８：修飾ＲＮＡまたはＲＴ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々のＲＮＡポリヌクレオチド（体積２０μｌ中２００〜４００ｎｇ）または逆転写されたＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）を、非変性１．２％アガロースＥ−Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））上のウェルにローディングし、製造元のプロトコールに従って１２〜１５分間、泳動する。
実施例９：ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）による修飾ＲＮＡの定量及びＵＶスペクトルデータ
ＴＥバッファー（１μｌ）中の化学修飾ＲＮＡポリヌクレオチドをＮａｎｏｄｒｏｐ（商標）ＵＶ吸光度測定に使用して、化学合成またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収率を定量する。
実施例１０：リピドイドを使用した修飾ｍＲＮＡの製剤化
ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドは、細胞に加える前に、設定した比で、ポリヌクレオチドをリピドイドと混合することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験用に製剤化することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ製剤は、全身循環を促進するために追加成分の添加を必要とすることがある。これらのリピドイドのｉｎ ｖｉｖｏ作用に好適な粒子を形成する能力を試験するために、ｓｉＲＮＡ−リピドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスを出発点として使用することができる。粒子の形成後に、ポリヌクレオチドを加え、複合体と一体化させる。封入効率は標準的な色素排除アッセイを使用して決定される。
実施例１１：ＲＳＶ ＲＮＡワクチン
ＲＳＶ ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、例えば、以下の配列のうちの少なくとも１つ、または以下の配列のうちの少なくとも１つの断片、またはその誘導体及びバリアントによってコードされる、少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。ＲＳＶ ＲＮＡワクチンは、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み得、例えば、ＲＳＶワクチンは、例えば、以下の（ＤＮＡ）配列のうちの少なくとも１つまたは以下の配列のうちの少なくとも１つの断片またはその誘導体及びバリアントによってコードされる、少なくとも１つの化学修飾されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み得る。
ＲＳＶ＃１
ＲＳＶ＃２
ＲＳＶワクチンは、例えば、以下の抗原性ポリペプチド配列のうちの少なくとも１つまたは以下の配列のうちの少なくとも１つの断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み得る。
ＲＳＶ＃１
下線部は、シグナルペプチド配列を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
ＲＳＶ＃２
下線部は、シグナルペプチド配列を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
実施例１２：マウス免疫原性
本実施例において、ｍＲＮＡ／ＬＮＰプラットフォームを使用して送達されたＲＳＶワクチン抗原に対する免疫応答をタンパク質抗原と比較して評価するためにアッセイを実施した。
雌のＢａｌｂ／ｃ（ＣＲＬ）マウス（６〜８週齢、Ｎ＝マウス１０頭／群）にＲＳＶ ｍＲＮＡワクチンまたはタンパク質ワクチンを投与した。ｍＲＮＡワクチンを作製し、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に製剤化した。本試験で評価するｍＲＮＡワクチンには、以下を含めた。
ＭＲＫ−１ 膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質
ＭＲＫ−４ 膜結合ＤＳ−ＣＡＶ１（安定化融合前Ｆタンパク質）
ＭＲＫ−５ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ−６ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ−７ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ８ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ９ 膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質
ＭＲＫ１１ 切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質（細胞外ドメインのみ）、Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾した構築物
ＭＲＫ１２ ＤＳ−ＣＡＶ１（非膜結合型）、Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾
ＭＲＫ１３：Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−５構築物
ＭＲＫ１４：Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−６構築物
ＭＲＫ１６：Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−８構築物
上記の１２個のｍＲＮＡをコードするＤＮＡ配列及び関連するアミノ酸配列を以下に列挙する。
ＭＲＫ−１ 膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質／ＭＲＫ＿０１＿Ｆ（完全長、Ｍｅｒｃｋ Ａ２株）／ＳＱ−０３０２６８：
下線部は、シグナルペプチド配列を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
ＭＲＫ−４ 膜結合ＤＳ−ＣＡＶ１（安定化融合前Ｆタンパク質）／ＭＲＫ＿０４＿融合前Ｆ／ＤＳ−ＣＡＶ１（完全長、Ｓ１５５Ｃ／Ｓ２９０Ｃ／Ｓ１９０Ｆ／Ｖ２０７Ｌ）／ＳＱ−０３０２７１：
下線部は、シグナルペプチド配列を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
ＭＲＫ−５ ＲＳＶ Ｆ構築物：
下線部は、シグナルペプチド配列を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
ＭＲＫ−６ ＲＳＶ Ｆ構築物：
下線部は、ｆｏｌｄｏｎをコードする配列を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
最初の下線部は、シグナルペプチド配列を表す。最初の下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎを表す。２番目の下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
ＭＲＫ−７ ＲＳＶ Ｆ構築物：
下線部は、シグナルペプチド配列を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
ＭＲＫ８ ＲＳＶ Ｆ構築物：
下線部は、ＧＣＮ４をコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
最初の下線部は、シグナルペプチド配列を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。２番目の下線部は、ＧＣＮ４を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
ＭＲＫ９膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質：
下線部は、膜貫通ドメインをコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
下線部は、膜貫通ドメインを表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
ＭＲＫ１１切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質（細胞外ドメインのみ）、Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾した構築物
最初の下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドをコードする領域を表し、２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎをコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
最初の下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドを表し、２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎを表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
ＭＲＫ１２ ＤＳ−ＣＡＶ１（非膜結合型）、Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾
最初の下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドをコードする領域を表し、２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎをコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
最初の下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドを表し、２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎを表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
ＭＲＫ１３ Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−５構築物
下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドをコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドを表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
ＭＲＫ１４ Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−６構築物
最初の下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドをコードする領域を表し、２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎをコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
最初の下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドを表し、２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎを表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
ＭＲＫ１６ Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−８構築物
最初の下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドをコードする領域を表し、２番目の下線部は、ＧＣＮ４をコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。
最初の下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドを表し、２番目の下線部は、ＧＣＮ４を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または以下に示すように欠失させてもよい。
本試験で評価したタンパク質ワクチンは、ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２，５９２（２０１３）に記載されている、ＤＳ−ＣＡＶ１安定化融合前Ｆタンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）であった。タンパク質を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌで緩衝させ、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓで製剤化した。
簡潔に述べると、マウス１０頭の複数群に以下のワクチンで筋肉内投与により免疫付与した。
実験の０日目及び２１日目に、動物を免疫化した。１４日目及び３５日目に、各動物から採血し、血清学的アッセイに使用した。４２日目及び４９日目に、動物のサブセットを屠殺し、ＥＬＩＳＰＯＴ及び細胞内サイトカイン染色試験に供するために脾臓を採取した。
Ａ．ＲＳＶ中和アッセイ：
各群のマウス血清をプールし、以下の手順を使用して、ＲＳＶ−Ａ（Ｌｏｎｇ株）の中和について評価した。
１．全ての血清試料を、５６℃に設定した乾燥浴インキュベーター内に３０分間入れることによって熱失活させた。次いで、試料血清及び対照血清をウイルス希釈液（２％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ）で１：３に希釈し、試料を２連でアッセイプレートに加え、連続希釈した。
２．ＲＳＶ−Ｌｏｎｇストックウイルスをフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で素早く解凍した。ウイルスをウイルス希釈液で２０００ｐｆｕ／ｍＬに希釈した。
３．希釈したウイルスを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた（細胞の１列を除く）。
４．ＨＥｐ−２細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ウイルス希釈液中に１．５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁し、１００ｍＬの懸濁細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。
５．７２時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に溶解した８０％アセトンを使用して１６〜２４℃で１０〜２０分間固定した。固定液を除去し、プレートを空気乾燥させた。
６．次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで完全に洗浄した。検出用モノクローナル抗体１４３−Ｆ３−１Ｂ８及び３４Ｃ９を２．５に希釈し、次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０５％で完全に洗浄した後、５０プレートをＰＢＳ＋０で完全に洗浄した。９６ウェルプレートのウェル。次いで、プレートを１６〜２４℃の加湿チャンバー中、ロッカー上で６０〜７５分間インキュベートした。
７．インキュベーション後、プレートを完全に洗浄した。
８．ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧをアッセイ希釈液で１：２００に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。プレートを上記のとおりにインキュベートし、洗浄した。
９．ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ストレプトアビジン（１：１０００の最終希釈）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ ７００（１：１０００の希釈）及び５ｍＭ ＤＲＡＱ５溶液（１：１０，０００の希釈）のカクテルをアッセイ希釈液中に調製し、５０ｍＬのカクテルを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。プレートを上記のとおりに暗所でインキュベートし、洗浄し、空気乾燥させた。
１０．次いで、Ａｅｒｉｕｓ Ｉｍａｇｅｒを使用してプレートを読み取った。次いで、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍの４パラメーター曲線フィッティングを使用して血清中和の力価を算出した。
投与１後（ＰＤ１）及び投与２後（ＰＤ２）に測定したマウス免疫原性試験の血清中和抗体の力価を図１に示す。ＰＤ２の血清中和抗体の力価については、以下の表形式でも示す。
結果は、中和抗体の力価が強く、ＲＳＶ ｍＦワクチン及びＲＳＶｍＤＳ−ＣＡＶ１ ｍＲＮＡワクチンを含むｍＲＮＡワクチンのいくつかが、ＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質／ａｄｊｕｖ−ｐｈｏｓワクチンよりも高い中和抗体力価を誘導したことを示した。
Ｂ．細胞性免疫応答のアッセイ：
マウスＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ手順
Ｉ．脾細胞の調製：
脾臓を６０ｍｍ組織培養皿に入れ、シリンジハンドルで上下に触れて細胞を取り出した。次いで、細かくなった脾臓を１５ｍＬチューブに移し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、アンモニウム−クロリド−カリウム（ＡＣＫ）溶解バッファー中に再懸濁し、室温で５分間インキュベートした。Ｒ１０培地をチューブに加え、細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた後、Ｒ１０培地でもう１回洗浄した。２回目の遠心分離後、細胞を１０ｍＬのＲ１０培地中に再懸濁し、７０μｍのナイロンセルストレーナーに通して濾過して５０ｍＬ遠心管に入れた。更なる１０ｍＬの培地でストレーナーをすすぎ、これを細胞に加えた。血球計算盤上で細胞を計数し、細胞濃度を群全体で正規化した。
ＩＩ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：
１）９６ウェルのＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＩＰ滅菌白色濾過プレートを、Ｂｉｏ−Ｈｏｏｄ中、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ（１：１００の希釈）のＭＡＢＴＥＣＨ精製抗マウスＩＦＮ−γクローンＡＮ１８でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。
２）翌朝、プレートを滅菌ＰＢＳで洗浄し、Ｒ１０培地を用いて３７℃で４時間ブロックした。
３）脾細胞を４ｘ１０５細胞／ウェルでプレートに加え、ＲＳＶ−Ｆ及びＲＳＶ−Ｇのペプチドプールで細胞を刺激した。ペプチドプールは、以下のとおりであった。
ＲＳＶ−Ｆの場合：
ＲＳＶ−Ｇの場合：
４）プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした。
５）翌日、プレートを完全に洗浄し、１ウェル当たり１００μＬのＭＡＢＴＥＣＨ検出用抗体クローンＲ４−６Ａ２を、ＰＳＢ／１％ＦＢＳが入った各ウェルに０．２５μｇ／ｍｌになるように加えた（１：４０００の希釈）。プレートを２時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で完全に洗浄した。
６）ストレプトアビジン−ＡＰをＰＳＢ／１％ＦＢＳで１：３０００に希釈し、１００μＬを各ウェルに加えた。
７）プレートを室温で６０分間インキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で完全に洗浄した。
８）１００μｌの１−ＳＴＥＰ ＮＢＴ／ＢＣＩＰを各ウェルに加え、プレートを室温で数分間維持し、水道水で洗浄し、一晩乾燥させた。
９）ＡＩＤイメージャーシステムを使用してプレートの画像を取得し、データを処理して脾細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γ分泌細胞数を算出した。
データは、ＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、ミョウバンで製剤化したタンパク質抗原よりもはるかに高い細胞性免疫応答を与え、ミョウバンで製剤化したタンパク質抗原は、検出可能な細胞性免疫応答をほとんどまたは全く誘発しなかったことを示した。図２を参照されたい。図中、＊のある棒は、インターフェロンγの数が多すぎて正確に計数できなかったことを示す。
ＩＩＩ．細胞内サイトカイン染色：
脾細胞を上記のとおりに採取した。新しく採取した脾細胞を１×１０７細胞／ｍＬでＲ１０培地中で一晩放置した。翌朝、１００μＬの細胞をプレートテンプレートに従って１×１０６細胞／ウェルの最終数で各ウェルに加えた。プールしたＲＳＶ−ＦまたはＲＳＶ−Ｇペプチドを使用して細胞を刺激した。ＲＳＶ−Ｆペプチドプールは、上記のとおりであった。ＲＳＶ−Ｇペプチドプールは、上記のものか、ＪＰＴ（カタログＰＭ−ＲＳＶ−ＭＳＧ）から購入した。細胞を３７℃で１時間インキュベートし、ＢＦＡ及びモネンシンをそれぞれ５μｇの最終濃度になるように各ウェルに加えた。
細胞を染色するために、２０μＬの２０ｍＭ ＥＤＴＡを各細胞ウェルに加え、細胞を室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。プレートを５００×ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を吸引した。次いで、プレートをＰＢＳで洗浄し、再度遠心分離にかけた。ＶｉＶｉｄｙｅをＤＭＳＯで再構成し、ＰＢＳで希釈した。希釈したＶｉｖｉｄｙｅ １２５μＬを各ウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。プレートを遠心分離にかけ、上清を除去し、プレートを１７５μＬのＦＡＣＳＷａｓｈで再度洗浄した。ＢＤ ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液を各ウェルに加え、プレートを２〜８℃で２０〜２５分間インキュベートした。次いで、プレートを遠心分離にかけ、ＢＤ ｐｅｒｍ洗浄バッファーで２回洗浄した。最後に、ＦＣブロックを、ＢＤ ｐｅｒｍ洗浄バッファー中１ウェル当たり１２５ｍＬの体積で最終濃度０．０１ｍｇ／ｍＬになるように加えた。細胞を以下のとおりに作製した細胞内の抗体カクテルで染色した。
ａ）ＩＬ−１０ ＦＩＴＣ：
ｂ）ＩＬ−１７Ａ ＰＥ：
ｃ）ＩＬ−２ ＰＣＦ５９４：
ｄ）ＣＤ４ ＰｅｒＣＰｃｙ５．５：
ｅ）ＴＮＦ ＰＥ Ｃｙ７：
ｆ）ＩＦＮｇ ＡＰＣ：
ｇ）ＣＤ８ａ ＢＶ５１０：
ｈ）ＣＤ３ ＡＰＣ Ｃｙ７：
ｉ）Ｐｅｒｍ Ｗａｓｈ：
細胞を抗体カクテル（試験ウェル当たり２０μＬ）とともに２〜８℃で３５分間インキュベートし、ＢＤ ｐｅｒｍ洗浄バッファーで２回洗浄し、１ウェル当たり２００μＬのＢＤ固定液中に再懸濁した。試料をＬＳＲＩＩで取得し、Ｆｌｏｊｏソフトウェアを使用してデータを解析した。ペプチドプールに応答し、Ｉｆｎ−γ、ＩＬ−２またはＴＮＦαを産生したＣＤ４＋脾細胞のパーセンテージを図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示し、ペプチドプールに応答し、Ｉｆｎ−γ、ＩＬ−２またはＴＮＦαを産生したＣＤ８＋脾細胞のパーセンテージを図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃに示す。データは、ＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原ではなく、ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチン及びＲＳＶ−Ｇ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ４＋免疫応答をマウスで誘発するというものであった。加えて、ＲＳＶ−Ｇ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンまたはＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原ではなく、ＲＳＶ−Ｆ ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ８＋免疫応答をマウスで誘発する。
実施例１３：マウス免疫原性
本実施例において、ｍＲＮＡ／ＬＮＰプラットフォームを使用して送達されたＲＳＶワクチン抗原に対する免疫応答をタンパク質抗原と比較して評価するために更なるアッセイを実施した。
この実施例でも、雌のＢａｌｂ／ｃ（ＣＲＬ）マウス（６〜８週齢、Ｎ＝マウス１０頭／群）にｍＲＮＡワクチンまたはタンパク質ワクチンを投与した。ｍＲＮＡワクチンを作製し、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に製剤化した。本試験で評価するｍＲＮＡワクチンには、以下を含めた。
ＭＲＫ−１ 膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質
ＭＲＫ−２ 分泌型ＲＳＶ Ｆタンパク質
ＭＲＫ−３ 分泌型ＤＳ−ＣＡＶ１
ＭＲＫ−４ 膜結合ＤＳ−ＣＡＶ１（安定化融合前Ｆタンパク質）
ＭＲＫ−５ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ−７ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ８ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ９ 膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質
インフルエンザＭ１
ＭＲＫ−２、ＭＲＫ−３及びインフルエンザＭ１のｍＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を以下に列挙する。対応するアミノ酸配列も示す。他の全ての配列については、本明細書に別途記載されている。
ＭＲＫ−２ 非膜結合型ＲＳＶ Ｆタンパク質／ＭＲＫ＿０２＿Ｆ（可溶性、Ｍｅｒｃｋ Ａ２株）／
下線部は、ｆｏｌｄｏｎをコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
最初の下線部は、シグナルペプチド配列を表す。最初の下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎを表す。２番目の下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
ＭＲＫ−３ 非膜結合型ＤＳ−ＣＡＶ１（安定化融合前Ｆタンパク質）／／ＭＲＫ＿０３＿ＤＳ−ＣＡＶ１（可溶性、Ｓ１５５Ｃ／Ｓ２９０Ｃ／Ｓ１９０Ｆ／Ｖ２０７Ｌ）／ＳＱ−０３０２７１：
下線部は、ｆｏｌｄｏｎをコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
最初の下線部は、シグナルペプチド配列を表す。最初の下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができ、または欠失させてもよい。２番目の下線部は、ｆｏｌｄｏｎを表す。２番目の下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
インフルエンザＭ−１（Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、ＡＣＰ４４１５２）＋ｈＩｇκ
下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドをコードする領域を表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
下線部は、ヒトＩｇκシグナルペプチドを表す。下線部は、同一または類似の機能を達成する代替配列に置換することができる。
インフルエンザＭ１ ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを取り込む細胞にウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成させることによって免疫応答を増加させる目的で、ＭＲＫ−１、ＭＲＫ−４またはＭＲＫ−９と組み合わせた。
本試験で評価したタンパク質ワクチンは、ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２，５９２（２０１３）に記載されている、ＤＳ−ＣＡＶ１安定化融合前Ｆタンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）であった。このタンパク質を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌで緩衝させ、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓで製剤化した。
マウス１０頭の各群を筋肉内投与により免疫化し、マウス１０頭の１００群を１００μＬのワクチンで筋肉内投与により免疫化した（５０μＬの注射液を各四頭筋に送達した）。以下のワクチンを用いて各群にワクチン接種を行った。
実験の０日目及び２１日目に、動物を免疫化した。１４日目及び３５日目に、各動物から採血し、血清学的アッセイに使用した。４２日目に、動物のサブセットを屠殺し、ＥＬＩＳＰＯＴ及び細胞内サイトカイン染色試験に供するために脾臓を採取した。
２７日目に、１×１０６ＰＦＵのＲＳＶ Ａ２でマウスに鼻腔内投与により抗原刺激を行った。接種から４日後に動物をＣＯ２吸入によって屠殺し、肺及び鼻甲介を取り出し、通常の氷上で、１０倍量のＳＰＧ含有ハンクス平衡塩溶液（Ｌｏｎｚａ）中でホモジナイズした。試料を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけることによって清澄化し、等分し、急速凍結させ、直ちに−７０℃で凍結保存した。
Ａ．ＲＳＶ中和アッセイ：
中和抗体の力価を上記のとおりに決定した。力価を図５に示す（ＰＤ１＝投与後に採取した試料１、ＰＤ２＝投与後に採取した試料２）。結果は、先の実験で示されたように、ｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンが強い免疫原性を有し、高い中和抗体力価をもたらしたことを示した。インフルエンザＭ１を発現するｍＲＮＡと膜結合タンパク質抗原を発現するｍＲＮＡとを一緒に送達することによって有意に高い中和抗体を生成させる試みは成功しなかった。
Ｂ．細胞内サイトカイン染色
細胞内サイトカイン染色を実施例１３に上述した方法と同じように実施した。ＲＳＶ−Ｆ及びＧペプチドプールに対するＣＤ４ ＩＣＳの応答を図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃに示す。先の試験と同様に、ＩＣＳの結果は、ＲＳＶ−Ｆ及びＲＳＶ−Ｇを発現するｍＲＮＡワクチンが、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ４免疫応答を誘発することを示した。
ＣＤ８ ＩＣＳの応答を図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃに示す。データは、ＲＳＶ−ＧまたはＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質／ａｄｊｕ ｐｈｏｓを発現するｍＲＮＡではなく、ＲＳＶ−Ｆ抗原を発現するｍＲＮＡが、Ｔｈ１に偏った強いＣＤ８応答を誘発したという先の知見を追認するものである。
Ｃ．マウス抗原刺激の結果
ウイルス力価の測定手順を以下に概説する。簡潔に述べると、試料を希釈し、これをコンフルエントなＨＥｐ−２細胞単層が入った２４ウェルプレートに２連で加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、試料接種物を吸引し、０．７５％メチルセルロースを含有する１ｍｌの重層を加えた。プレートを３７℃で５日間インキュベートした。５日のインキュベーション後、クリスタルバイオレット／グルタルアルデヒド溶液で細胞を固定して染色した。プラークを計数し、力価を組織１ｇ当たりのｐｆｕとして表した。図８に示されるように、ＭＣ３ ＬＮＰで製剤化したｍＲＮＡワクチンで免疫化したマウスのいずれの肺からもウイルスは回収されず、低用量のＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質／ａｄｊｕ ｐｈｏｓワクチンの動物１頭だけが鼻内に検出可能なウイルスを有していた。
実施例１４：コットンラットにおける免疫原性及び有効性
本実施例において、コットンラットＲＳＶ抗原刺激モデルにおけるｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンの免疫原性及び有効性を試験するためにアッセイを実施した。
より具体的には、雌のコットンラット（ＳＡＧＥ）を使用し、３〜７週齢に免疫化を開始した。使用するｍＲＮＡワクチンを作製し、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に製剤化した。本試験で評価するｍＲＮＡワクチンには、以下を含めた。
ＭＲＫ−１ 膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質
ＭＲＫ−２ 分泌型ＲＳＶ Ｆタンパク質（細胞外ドメインを切断）
ＭＲＫ−３ 分泌型ＤＳ−ＣＡＶ１（三量体細胞外ドメイン）
ＭＲＫ−４ 膜結合ＤＳ−ＣＡＶ１（安定化融合前Ｆタンパク質）
ＭＲＫ９ 膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質
インフルエンザＭ１タンパク質
本試験で評価したタンパク質ワクチンは、ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４２，５９２（２０１３）に記載されている、ＤＳ−ＣＡＶ１安定化融合前Ｆタンパク質（１ｍｇ／ｍＬ）であった。タンパク質を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌで緩衝させ、Ａｄｊｕ−ｐｈｏｓで製剤化した。
コットンラット１０頭の各群を１２０μＬのワクチンで筋肉内投与により免疫化した（６０μＬの注射液を各四頭筋に送達した）。表２に記載される以下のワクチンを用いて各群にワクチン接種を行った。
実験の０日目及び２８日目に、動物を免疫化した。２８日目及び５６日目に、各動物から採血し、血清学的アッセイに使用した。５６日目に、１×１０５．５ＰＦＵのＲＳＶ Ａ２でコットンラットに鼻腔内投与により抗原刺激を行った。接種から４日後に動物をＣＯ２吸入によって屠殺し、肺（左葉）及び鼻甲介を取り出し、通常の氷上で、１０倍量のＳＰＧ含有ハンクス平衡塩溶液（Ｌｏｎｚａ）中でホモジナイズした。試料を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけることによって清澄化し、等分し、急速凍結させ、直ちに−７０℃で凍結保存した。
Ａ．ＲＳＶ中和アッセイ
中和抗体の力価を上記のとおりに決定した。
投与１後及び投与２後に決定された力価を図９に示す。コットンラットにおける中和力価は、単回免疫付与後で強く、全体的に、ａｄｊｕ−ｐｈｏｓで製剤化したＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質抗原またはＲＳＶ Ａ２ウイルスによる感染でもたらされた中和力価よりも数倍高かった。最も高い中和抗体力価は、完全長ＲＳＶ−Ｆタンパク質、切断型Ｆ−タンパク質（細胞外ドメイン）、ｍＤＳ−ＣＡＶ１（ＲＳＶ Ｆ膜貫通ドメインを含有する安定化融合前Ｆタンパク質）、及びｓＤＳ−ＣＡＶ１（切断型の安定化融合前Ｆタンパク質）ならびに完全長Ｆタンパク質とインフルエンザＭ１とを含むｍＲＮＡ組み合わせ（上記グラフ中、「ＶＬＰ／ｍＦ」と称する）を発現するＲＮＡワクチンによってもたらされた。
投与後２で決定された力価は、中和抗体力価が全体的にｍＲＮＡワクチンとＤＳ−ＣＡＶ１タンパク質比較物の両方でかなり高かったことを示している。驚くべきことに、本試験において、２つのマウス免疫原性試験と同様に、ｍＧ及びｍＧ＋インフルエンザＭ１ ｍＲＮＡワクチン群ではワクチンの２回目の投与後に比較的高い中和抗体力価が観察された。ＲＳＶ−Ｇ抗原を送達するために使用した他のワクチン様式では、アッセイに補体を含めない限り、中和抗体活性はｉｎ ｖｉｔｒｏで観察されないことが報告された。
Ｂ．競合ＥＬＩＳＡ
中和抗体のＲＳＶ Ｆ−タンパク質上の特異的エピトープに対する免疫応答を特徴付けた。抗原性部位ＩＩは、リスクのある乳幼児においてＲＳＶによる下気道感染を予防するために開発されたモノクローナル抗体パリビズマブの結合部位である。抗原性部位φは、ＲＳＶの自然感染によって誘発される、より強力な中和抗体の結合部位である。種々のｍＲＮＡ系ワクチンに対する抗原性部位φ及び抗原性部位ＩＩの応答を特徴付けるために競合ＥＬＩＳＡを開発した。
方法
ＥＬＩＳＡプレートを融合前Ｆタンパク質または融合後Ｆタンパク質（ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）のいずれかでコーティングした。コーティング後、プレートを洗浄し、ブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ／３％脱脂粉乳）でブロックした。次いで、コットンラット抗原刺激試験の試験血清をブロッキングバッファーで希釈し、ＥＬＩＳＡプレートで滴定した。ビオチン化Ｄ２５（抗原性部位φに結合するモノクローナル抗体）またはビオチン化パリビズマブ（抗原性部位ＩＩに結合するモノクローナル抗体）をブロッキングバッファーで希釈し、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えた（ビオチン化Ｄ２５は、融合前Ｆタンパク質をコーティングしたプレートでのみ使用され、ビオチン化パリビズマブは、抗原性部位ＩＩが両方の抗原型に存在するので、融合前Ｆタンパク質または融合後Ｆタンパク質をコーティングしたプレートで使用できる）。インキュベーション後、プレートを洗浄し、ストレプトアビジンタグ付き西洋ワサビペルオキシダーゼをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄し、ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。１０分間発色させ、次いで、１００μＬの２Ｎ硫酸でクエンチし、プレートをマイクロプレートリーダーで４５０ｎＭで読み取った。結果を図１０に示す。図１０は、融合前Ｆタンパク質に結合するＤ２５または融合後Ｆタンパク質に結合するパリビズマブのいずれかと競合するコットンラット血清の能力を示す。
ナイーブマウスとｍＧまたはＶＬＰ／ｍＧで免疫化したマウス（いずれもＤ２５またはパリビズマブが結合するエピトープを発現しない）の両方でバックグラウンド結合力価が認められた。非標識モノクローナル抗体を陽性対照として実験に含めた。そのデータを図１０の右側の列に示す。ＭＲＫ０１、ＭＲＫ０２、ＭＲＫ０９、ＭＲＫ１０＋ＭＲＫ０１またはＭＲＫ１０＋ＭＲＫ９で免疫化したコットンラットにおいて、Ｄ２５競合力価は明確でなかった。ＤＳ−ＣＡＶ１配列（ＭＲＫ０４、ＭＲＫ０３及びＭＲＫ１０＋ＭＲＫ０４）をコードするｍＲＮＡでの免疫化のみがＤ２５競合抗体力価を誘発した。これは、これらのｍＲＮＡが主に融合前のコンフォメーション状態にある形態のＲＳＶ Ｆタンパク質を産生することを示している。対照的に、パリビズマブ競合力価は、ＭＲＫ０１またはＭＫＲ０２ ｍＲＮＡで免疫化した動物で極めて高かった。これは、これらのｍＲＮＡがコットンラットにおいて融合後のＲＳＶ Ｆタンパク質として産生されたことを示している。
Ｃ．コットンラット抗原刺激の結果
コットンラットの鼻におけるＲＳＶ力価を測定する手順は、マウスに関する上記手順に従った。鼻における力価を図１１に示す。本アッセイにおいて、検出限界は組織１ｇ当たり４０ｐｆｕであった。ワクチン接種した動物の１頭（ＭＣ３ ＬＮＰで封入化したｍＤＳ−ＣＡＶ１（ＭＲＫ４）ｍＲＮＡをワクチン接種したマウス１頭）のみが鼻内に検出可能なウイルスを有したことがわかった。対照的に、ワクチン接種を受けていないが、同試験で抗原刺激を行った動物におけるＲＳＶ Ａ２ウイルスの幾何平均力価は、１０，０００ｐｆｕ超／ｇ組織であった。
実施例１５：アフリカミドリザルにおける免疫原性及び有効性
本実施例において、アフリカミドリザルＲＳＶ抗原刺激モデルにおけるｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンの免疫原性及び有効性を試験するためにアッセイを実施した。
より具体的には、体重が１．３〜３．７５ｋｇの範囲であり、中和抗体力価によりＲＳＶ陰性であることが確認された雌雄の成体アフリカミドリザルを使用した。使用するｍＲＮＡワクチンを作製し、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に製剤化した。本試験で評価するｍＲＮＡワクチンには、以下を含めた。
ＭＲＫ０１ 膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質
ＭＲＫ０４ 膜結合ＤＳ−Ｃａｖ１（安定化融合前Ｆタンパク質）
アフリカミドリザル４頭の各群を１０００μＬのワクチンで筋肉内投与により免疫化した（５００μＬの注射液を各三角筋に送達）。表３に記載される以下のワクチンを用いて各群にワクチン接種を行った。
実験の０、２８及び５６日目に、動物を免疫化した。０、１４、２８、４２、５６及び７０日目に、各動物から採血し、血清学的アッセイに使用した。７０日目に、１×１０５．５ＰＦＵのＲＳＶ Ａ２でアフリカミドリザルに鼻腔内投与により抗原刺激を行った。鼻咽頭スワブを抗原刺激後１〜１２、１４及び１８日目に採取し、肺洗浄液試料を抗原刺激後３、５、７、９、１２、１４及び１８日目に回収し、ウイルスの複製について試験した。
Ａ．ＲＳＶ中和アッセイ
中和抗体の力価（ＮＴ５０）を上記のとおりに決定した。
投与１後及び投与２後に決定されたＮＴ５０力価を図１２に示す。ｍＲＮＡワクチンを投与した群とＲＳＶ Ａ２を投与した群の両群で、各投与後に力価が上昇することが認められた。１０週目（投与後３から２週間）におけるｍＲＮＡワクチンで得られたＧＭＴは、ＲＳＶ Ａ２の投与を受けた動物よりも２桁を超えて高かった。
Ｂ．競合ＥＬＩＳＡ
中和抗体のＲＳＶ Ｆ−タンパク質上の特異的エピトープに対する免疫応答を上記の競合アッセイを使用して特徴付けた。
１０週目（ＰＤ３から２週間）に測定したパリビズマブ及びＤ２５競合抗体力価を図１３Ａ〜１３Ｂに示す。ＧＭＴパリビズマブ競合力価は、ｍＤＳ−Ｃａｖ１を投与した群と比較して、ｍＦまたはｍＦ＋ｍＤＳ−Ｃａｖ１の組み合わせを投与した群で５倍高かった。一方、ＧＭＴ Ｄ２５競合抗体力価は、ｍＦ ｍＲＮＡを投与した群よりもｍＤＳ−Ｃａｖ１またはｍＦ＋ｍＤＳ−Ｃａｖ１の組み合わせを投与した群で２倍高かった。融合前Ｆ安定化抗原（ｍＤＳ−Ｃａｖ１）は、融合前の特異的応答を誘発することができた。
Ｃ．アフリカミドリザル抗原刺激の結果
前述のように、ワクチン有効性を評価するために、ワクチン接種後７０日目に、１×１０５．５ＰＦＵのＲＳＶ Ａ２でアフリカミドリザルに鼻腔内投与により抗原刺激を行った。抗原刺激後に鼻咽頭スワブ及び肺洗浄液試料を回収し、ウイルスの存在について試験した。
アフリカミドリザルの鼻咽頭スワブ及び肺洗浄液試料のＲＳＶ力価を測定するために、ＲＳＶ Ａを検出するためのＲＳＶ ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを以下のとおり実施した。
１）実験及び材料：
Ａ．装置
１．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲシステム及びＭｘＰｒｏソフトウェア
２．Ｊｏｕａｎ ＧＲ４２２遠心分離器または同等物
３．Ｊｏｕａｎプレートキャリアまたは同等物
Ｂ．試薬
１．Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｒｔ−ＰＣＲキット（１０００）カタログ番号２０４４４５
２．水、分子生物学等級のＤＮＡａｓｅフリー及びプロテアーゼフリー、５ Ｐｒｉｍｅ、カタログ番号２９００１３６
３．ＴＥバッファー、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐｈ ８．０、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＢＰ２４７３−１００
４．ウイルスプライマー：ＲＳＶ Ａフォワード及びリバースプライマー、Ｓｉｇｍａカスタム、ＨＰＬＣ精製済み。プライマーストックは、分子学等級の水で１００μＭに再構築し、−２０℃で保存する。
５．ＲＳＶ二重標識プローブ、Ｓｉｇｍａカスタム、ＨＰＬＣ精製済み。プローブストックは、ＴＥバッファーで１００μＭに再構成し、遮光で−２０℃で保存する。
６．ＲＳＶ Ａ標準物は、社内で作製し、−２０℃で保存した。アッセイ標準物は、ＲＳＶ ＡのＮ遺伝子に対するプライマー対を設計することによって作製した。ＲＳＶ Ａ標準物の産物長は８８５ｂｐである。本標準物を作製するために、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを使用した。
７．Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｖｉｒａｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（製品番号ＡＳ１１５０
Ｃ．消耗品
１．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅオプティカルキャップ８×ストリップ、カタログ番号４０１４２５
２．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ９６ウェルプレート、スカート付き、カタログ番号４０１３３４
３．ＡＲＴフィルター付ピペットチップ
２）ＲＴ−ＰＣＲ反応及び設定
Ａ．完全Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘの調製
１．最終反応体積が５０μＬになるように、以下の設定に従って、完全Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを調製する。以下の表は、１ウェル当たりの体積である。最終プライマー濃度は３００ｎＭ、最終プローブ濃度は２００ｎＭである。
２．４５μＬの完全マスターミックスを各ウェルに加える。プレートカバーでプレートを覆い、アルミ箔で包んで遮光する。
Ｂ．標準曲線の作製
１．−２０℃から標準物を取り出す。
２．１０倍希釈を使用して、標準物を最終濃度１×１０６コピー／５μＬ〜１コピー／５μＬに希釈する。
Ｃ．試料調製
１．Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｖｉｒａｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、製品番号ＡＳ１１５０）を使用して、鼻咽頭スワブ及び肺洗浄液試料をＲＴ−ＰＣＲ反応用に調製する。
２．製造元のプロトコールに従って２００μＬの試料を抽出し、５０μＬに溶出してＰＣＲ反応に使用する。
Ｄ．試料の添加
１．抽出した試料５μＬを適切なウェルに加える。試料の添加後、標準曲線を加える前に試料ウェルに慎重に蓋をする。
２．希釈した標準物５μＬを適切なウェルに加え、蓋をする。
３．分子学等級の水５μＬをテンプレートなしのコントロール（ＮＴＣ）ウェルに加える。
４．プレートをアルミ箔で包み、プレートを遠心分離器に移す。
５．プレートを１００ｒｐｍで２分間回転させて、ウェルの側面にある可能性のある試料またはマスターミックスを落とす。
６．プレートをアルミ箔で包み、プレートをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ機器に移す。
Ｅ．サーマルサイクラー：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＸ ３００５Ｐ
１．プレートをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５Ｐ内に置き、熱プロファイル条件を以下に設定する。
２．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５ｐソフトウェアを使用して結果を解析する
肺及び鼻の試料で検出された平均ＲＮＡコピー数を図１４Ａ〜１４Ｂに示す。ＭＣ３中に製剤化されたｍＦ、ｍＤＳ−Ｃａｖ１またはｍＦ＋ｍＤＳ−Ｃａｖ１をコードするｍＲＮＡを投与した動物は、ＲＳＶ Ａ２で免疫化した対照群と同様に、肺の完全な保護（ウイルス検出なし）を示した。ｍＲＮＡワクチンを投与した動物はまた、ワクチンなし対照群と比較して、アッセイ日の大部分で、鼻内で検出されたウイルスが２ｌｏｇを超えて減少したことを示した。
実施例１６：ＲＳＶを経験したアフリカミドリザルにおける免疫原性
ＭＣ３ ＬＮＰ中に製剤化したｍＲＮＡワクチンの免疫原性について、ＲＳＶを経験したアフリカミドリザルで試験した。
ＥＬＩＳＡ及び中和抗体力価によってＲＳＶセロポジティブであることが確認された体重が１．３ｋｇを超える健康な成体アフリカミドリザル（両性別）（ｎ＝５／群）を本試験のために選択した。本試験のために選択された動物プールは、先のワクチン試験でＲＳＶに実験的に感染しており、試験開始時に全群が同様の群ＧＭＴを有するように、試験前のＲＳＶ中和力価に基づいて試験群に分布させた。ＲＳＶ経験動物は、セロポジティブヒト成体において期待され得る応答を反映し得る、ワクチン接種に対する免疫記憶リコール応答のモデルを提供する。
０週目に単一ワクチン用量を各動物に筋肉内（ＩＭ）経路により投与した。ＭＣ３ ＬＮＰのみを投与する対照群も本試験設計に含めた。ワクチンを表７に記載のとおりに投与した。ワクチン接種後、接種部位の変化またはワクチンに対する有害反応を示し得る活動もしくは摂食習慣の他の変化について、動物を毎日観察したが、何も認められなかった。ＲＳＶ中和抗体力価ならびにパリビズマブ（部位ＩＩ）及びＤ２５（部位φ）競合抗体力価を評価するために血清試料を採取した。ＰＢＭＣ試料を収集して細胞性免疫応答を評価した。
上記の方法を使用して、個々の動物のＮＴ５０力価をベースライン時及び接種から２週後に採取した血清試料で測定した。結果を図１５に示す。ｍＲＮＡワクチンによるワクチン接種は、平均で、血清中和力価の１５０倍の増加をもたらした。倍数増加は、全てのｍＲＮＡワクチンで同等であった。ＬＮＰのみのワクチン対照群では、力価の増加は観察されなかった。ワクチン接種後２〜４週ごとに力価を測定することによって血清中和力価の持続性を評価した。ワクチン接種後２４週目まで測定した各群のＧＭＴを図１６に示す。力価は、２４週目で、ベースラインよりも約５０倍高い状態のままである。
ワクチン接種した動物におけるブースター応答の質を評価するために、パリビズマブ（部位ＩＩ）及びＤ２５（部位φ）の両方の競合抗体力価を決定した。上記のとおり、抗原性部位ＩＩは、融合前及び融合後の両方のコンフォメーションのＦタンパク質上に認められる中和エピトープであり、部位φは、融合前の特異的中和エピトープである。上記の方法を使用してワクチン接種から４週後に測定したパリビズマブ（部位ＩＩ）及びＤ２５（部位φ）の競合抗体力価を図１７Ａ〜１７Ｂにまとめる。全てのｍＲＮＡワクチンが、ベースラインから約７倍となるパリビズマブ競合力価の増加をもたらした。免疫付与前のＤ２５競合抗体力価は、ＭＣ３ ＬＮＰのみの対照群における動物１頭を除く全動物でアッセイの検出限界を下回ったが、ｍＲＮＡ系ワクチンを投与した全動物でＤ２５競合抗体力価がもたらされた。ＧＭＴは、ｍＤＳ−Ｃａｖ１またはｍＦ＋ｍＤＳ−Ｃａｖ１の組み合わせを投与した群で最も高かった。ＬＮＰのみの対照群では、パリビズマブまたはＤ２５（部位φ）の競合抗体力価の増加は認められなかった。
ｍＲＮＡワクチンはまた、ワクチン接種から６週後のＩＣＳアッセイによって決定されるように、ＲＳＶ経験アフリカミドリザルにおいてＴ細胞応答を増強することがわかった（図１８Ａ〜１８Ｂ）。
アフリカミドリザルのＩＣＳアッセイを以下のとおり実施した。
Ａ．１日目：ＰＢＭＣの解凍
１．ＰＢＭＣのバイアルを液体窒素から取り出し、解凍の準備が整うまでドライアイス上に置いた。
２．細胞を設定値３７℃の水浴中で穏やかに攪拌しながら迅速に解凍した。
３．各対象について、血清学的ピペットを使用して、適切にラベル付けされた１５ｍＬチューブまたは５０ｍＬチューブに細胞懸濁液を移した。
４．約０．５ｍＬのＲ１０培地を細胞にゆっくり加え、次いで、これを静かに振って培地と細胞懸濁液を混合した。
５．次いで、凍結細胞量の３倍量のＲ１０培地を、０．５ｍＬ〜１．０ｍＬのＲ１０培地の添加ごとに振りながら、各チューブに滴加した。
６．次いで、約１０〜１５ｍＬが各チューブに添加されるまで、Ｒ１０培地を１．０ｍＬ〜２．０ｍＬの割合で一度に加えた。
７．チューブを振って培地と細胞懸濁液を混合し、次いで、２５０×ｇ（設定値）で室温で８〜１０分間遠心分離にかけた。
８．上清を除去し、細胞を５ｍＬのＲ１０培地中に穏やかに再懸濁した。
９．次いで、細胞懸濁液を１２ウェル組織培養プレートに移した。
１０．組織培養プレートを３７℃＋／−２℃、４％〜６％ＣＯ２のインキュベーター内に一晩置いた。
Ｂ．２日目：ＰＢＭＣの計数及び刺激手順
ＰＢＭＣ計数
１．１２ウェル組織培養プレートの各ウェルから得たＰＢＭＣを、ラベルを付けた５０ｍＬコニカルチューブ中に入れた。
２．次いで、血球計算盤上のトリパンブルー排除法またはＧｕａｖａ ＰＣによって細胞を計数し、１×１０７細胞／ｍＬになるように再懸濁した。
刺激設定
１．次いで、再懸濁したＰＢＭＣ １００μＬを９６ウェル滅菌Ｕ底組織培養プレートの各ウェルに、１×１０６細胞／ウェルの最終数で加えた。
２．ＲＳＶ Ｆタンパク質配列に対応するペプチドプールを以下のように作製した。最適の結果を得るために、ペプチドを組み合わせてＲＳＶ Ｆ１及びＲＳＶ Ｆ２の２つのプールにした。ＲＳＶＦ１は、以下のリストの最初の７１ペプチドを含み、ＲＳＶ Ｆ２は、それ以降の７０ペプチドを含む。
３．ペプチドプール（ＲＳＶ Ｆ１またはＲＳＶ Ｆ２プールのいずれか）を最終濃度２．５μｇ／ｍＬになるように細胞に加えた。
４．１つのモックウェルを各対象について用意した。ペプチドプールの体積に対応する体積のＤＭＳＯをモックウェルに加えた。
５．陽性対照ウェルをＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）／イオノマイシン（１．２５μｇ／ｍＬ）溶液で刺激した。
６．ＣＤ２８／ＣＤ４９ｄカクテルを最終濃度２μｇ／ｍＬで各ウェルに加えた。
７．ペプチド及びＣＤ２８／ＣＤ４９ｄカクテルの添加後、プレートを３７℃のインキュベーター内で３０〜６０分インキュベートした。
８．次いで、５ｍＬのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した後、プレートを３７℃ ５％ＣＯ２インキュベーター内で更に４〜５時間インキュベートした。
９．次いで、プレートを取り出し、２０μＬの２０ｍＭ ＥＤＴＡ（１×ＰＢＳ中に溶解）を各細胞ウェルに加えた。
１０．次いで、プレートを４℃で一晩維持した。
Ｃ．３日目：染色
１．プレートを５００×ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した。
２．各ウェルを１７５ｍＬのＦＡＣＳ Ｗａｓｈで洗浄し、プレートを再度５００×ｇで５分間遠心分離にかけ、上清を除去した。
３．製造元の推奨量に従って、ＰＢＭＣを以下のように細胞外抗体で染色した。
ｉ． ＣＤ８ ＡＰＣＨ７： １試験当たり５μＬ
ｉｉ． ＣＤ３ ＰＥ： １試験当たり２０μＬ
ｉｉｉ．ＣＤ４ ＰＣＦ５９４：１試験当たり５μＬ
ｉｖ． ＶｉＶｉＤｙｅ： １試験当たり３μＬ
４．カクテルを全てのウェルに加えた後、１２０μＬのＦＡＣＳｗａｓｈを各ウェルに加え、混合した。プレートを暗所室温で２５〜３０分間インキュベートした。
５．次いで、プレートを５００×ｇで５分間遠心分離にかけ、１ウェル当たり１７５μＬのＦＡＣＳ ｗａｓｈで洗浄した。
６．２００μＬのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液を各ウェルに加え、プレートを４℃で２０〜２５分間インキュベートした。
７．次いで、プレートを５００×ｇで５分間遠心分離にかけ、１ウェル当たり１７５μＬのＰＤ ｐｅｒｍ ｗａｓｈバッファーで２回洗浄した。
８．次いで、細胞内抗体を用いてＰＢＭＣを以下のように染色した。
ｉ． ＩＦＮ−ｇＦＩＴＣ １試験当たり２０μＬ
ｉｉ． ＴＮＦ ＰＥｃｙ７ １試験当たり５μＬ
ｉｉｉ．ＩＬ−２ ＡＰＣ １試験当たり２０μＬ
９．カクテルを全てのウェルに加えた後、１２０μＬのＢＤ ＰｅｒｍＷａｓｈを各ウェルに加え、プレートを暗所室温で２５分間インキュベートした。
１０．接種後、プレートを５００×ｇで５分間遠心分離にかけ、１７５μＬのＢＤｐｅｒｍ洗浄バッファーで洗浄し、次いで、１ウェル当たり２００μＬのＢＤ固定液中に細胞を再懸濁した。次いで、試料を４℃で一晩保存し、固定から２４時間以内にＬＳＲＩＩで取得した。
図１８Ａ〜１８Ｂに示されるように、ｍＲＮＡワクチン（ｍＦ、ｍＤＳ−Ｃａｖ１またはｍＦ＋ｍＤＳ−Ｃａｖ１）は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αが陽性であったＲＳＶ Ｆ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加をもたらした。全体的に、応答は、全ｍＲＮＡワクチン群にわたって同等であった。Ｔ細胞応答は、ＭＣ３ ＬＮＰのみの対照群では増強されなかった。
実施例１７：コットンラットでのＲＳＶ−Ｂに対する免疫原性及び有効性；ＭＣ３で封入化したｍＲＮＡワクチンの有効率
ＲＳＶ−Ｂでの抗原刺激に対する実験用ｍＲＮＡ ＲＳＶワクチン製剤の免疫原性及び有効性をコットンラットで試験した。本試験では、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に封入化した異なる形態のＲＳＶ−Ｆタンパク質をコードするｍＲＮＡを比較した。
より具体的には、雌のコットンラット（ＳＡＧＥ）を使用し、３〜７週齢に免疫化を開始した。本試験で評価するｍＲＮＡワクチンには、以下を含めた。
ＭＲＫ０１ 膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質
ＭＲＫ０４ 膜結合ＤＳ−Ｃａｖ１（安定化融合前Ｆタンパク質）
本試験に含めた群は、表９にまとめるとおりである。本試験は、全てのｍＲＮＡワクチンを２５ｍｇの単回用量で評価した。本試験に含めた対照群は、ＲＳＶ Ａ２（１×１０５．５ｐｆｕ）の投与を受けるか、ワクチンなしのいずれかであった。０週目に単一の鼻腔内接種を受けるＲＳＶ Ａ２投与群を除き、各動物に２回用量のワクチンを投与した（０週目及び４週目）。ＲＳＶ中和抗体力価を評価するために血清試料を採取した。８週目に、ＲＳＶ Ｂ ＲＳＶ １８５３７株でコットンラットに鼻腔内投与により抗原刺激を行った。抗原刺激から４日後、動物を安楽死させ、鼻及び肺組織を採取し、組織中のＲＳＶレベルを測定することによってワクチン有効性を評価した。
４週目（投与１後から４週間）及び８週目（投与２後から４週間；抗原刺激日）に採取した血清試料における個々の動物の中和抗体（ＮＴ５０）力価を測定した。全動物が４週目にｍＲＮＡワクチンによるワクチン接種及びＲＳＶ Ａ２抗原刺激に応答した。両ｍＲＮＡワクチン群で、２回目の免疫付与後に力価が上昇した。ｍＲＮＡワクチン及びＲＳＶ Ａ２感染のいずれもＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂに対して、ほぼ同等の中和抗体力価をもたらした。４週目及び８週目（投与１後（ＰＤ１）から４週間及び投与２後（ＰＤ２）から４週間（抗原刺激日））に測定した個々の動物及び群の幾何平均ＮＴ５０力価を図１９に示す。
種々のワクチン製剤のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を、上記の方法を使用してＲＳＶ Ｂ株１８５３７で抗原刺激した後の免疫化コットンラットの肺及び鼻腔におけるウイルス複製の阻害を測定することによって評価した。データを図２０に示す。ウイルス複製の完全な阻害が、ｗｔ ＲＳＶ Ａ２で免疫化したコットンラットの肺及び鼻で観察された。ｍＦ及びｍＤＳ−Ｃａｖ１の両方のｍＲＮＡは、ＲＳＶ Ａに由来する配列に基づいた設計にもかかわらず、ＲＳＶ Ｂ １８５３７による抗原刺激から肺及び鼻の両方を完全に保護した。ｍＦ及びｍＤＳ−Ｃａｖ１の両ｍＲＮＡワクチンは、ＭＣ３脂質ナノ粒子で製剤化した場合、ＲＳＶ Ｂ抗原刺激に対して等しく有効であった。
本明細書に記載される配列のそれぞれは、化学修飾された配列、またはヌクレオチド修飾を含まない非修飾の配列を包含する。
実施例１８：マウス免疫原性
本実施例において、非化学修飾型ｍＲＮＡ／ＬＮＰプラットフォームを使用して送達されたＲＳＶワクチン抗原に対する免疫応答をタンパク質抗原と比較して評価するためにアッセイを実施する。
雌のＢａｌｂ／ｃ（ＣＲＬ）マウス（６〜８週齢、Ｎ＝マウス１０頭／群）にＲＳＶ ｍＲＮＡワクチンまたはタンパク質ワクチンを投与する。ｍＲＮＡワクチンを作製し、ＭＣ３脂質ナノ粒子中に製剤化する。本試験で評価するｍＲＮＡワクチンには、以下を含める（それぞれ非化学修飾型である）。
ＭＲＫ−１ 膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質
ＭＲＫ−４ 膜結合ＤＳ−ＣＡＶ１（安定化融合前Ｆタンパク質）
ＭＲＫ−５ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ−６ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ−７ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ８ ＲＳＶ Ｆ構築物
ＭＲＫ９ 膜結合ＲＳＶ Ｇタンパク質
ＭＲＫ１１ 切断型ＲＳＶ Ｆタンパク質（細胞外ドメインのみ）、Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾した構築物
ＭＲＫ１２ ＤＳ−ＣＡＶ１（非膜結合型）、Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾
ＭＲＫ１３：Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−５構築物
ＭＲＫ１４：Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−６構築物
ＭＲＫ１６：Ｉｇ分泌ペプチドシグナル配列を含むように修飾したＭＲＫ−８構築物
実験の０日目及び２１日目に、動物を免疫化する。１４日目及び３５日目に、各動物から採血し、血清学的アッセイに使用する。４２日目及び４９日目に、動物のサブセットを屠殺し、ＥＬＩＳＰＯＴ及び細胞内サイトカイン染色試験に供するために脾臓を採取する。
Ａ．ＲＳＶ中和アッセイ：
各群のマウス血清をプールし、以下の手順を使用して、ＲＳＶ−Ａ（Ｌｏｎｇ株）の中和について評価する。
１１．全ての血清試料を、５６℃に設定した乾燥浴インキュベーター内に３０分間入れることによって熱失活させる。次いで、試料血清及び対照血清をウイルス希釈液（２％ＦＢＳ含有ＥＭＥＭ）で１：３に希釈し、試料を２連でアッセイプレートに加え、連続希釈する。
１２．ＲＳＶ−Ｌｏｎｇストックウイルスをフリーザーから取り出し、３７℃の水浴中で素早く解凍する。ウイルスをウイルス希釈液で２０００ｐｆｕ／ｍＬに希釈する。
１３．希釈したウイルスを９６ウェルプレートの各ウェルに加える（細胞の１列を除く）。
１４．ＨＥｐ−２細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ウイルス希釈液中に１．５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁し、１００ｍＬの懸濁細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに加える。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートする。
１５．７２時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に溶解した８０％アセトンを使用して１６〜２４℃で１０〜２０分間固定する。固定液を除去し、プレートを空気乾燥させる。
１６．次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎで完全に洗浄する。検出用モノクローナル抗体１４３−Ｆ３−１Ｂ８及び３４Ｃ９を２．５に希釈し、次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０５％で完全に洗浄した後、５０プレートをＰＢＳ＋０で完全に洗浄する。９６ウェルプレートのウェル。次いで、プレートを１６〜２４℃の加湿チャンバー中、ロッカー上で６０〜７５分間インキュベートする。
１７．インキュベーション後、プレートを完全に洗浄する。
１８．ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧをアッセイ希釈液で１：２００に希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに加える。プレートを上記のとおりにインキュベートし、洗浄する。
１９．ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ ストレプトアビジン（１：１０００の最終希釈）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ ７００（１：１０００の希釈）及び５ｍＭ ＤＲＡＱ５溶液（１：１０，０００の希釈）のカクテルをアッセイ希釈液中に調製し、５０ｍＬのカクテルを９６ウェルプレートの各ウェルに加える。プレートを上記のとおりに暗所でインキュベートし、洗浄し、空気乾燥させる。
２０．次いで、Ａｅｒｉｕｓ Ｉｍａｇｅｒを使用してプレートを読み取る。次いで、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍの４パラメーター曲線フィッティングを使用して血清中和の力価を算出する。
マウス免疫原性試験の血清中和抗体の力価を投与１後（ＰＤ１）及び投与２後（ＰＤ２）に測定する。
更なるｍＲＮＡワクチン
ＭＲＫ＿０４
ＳＱ−０３０２７１
ＭＲＫ＿０４＿ＡＡＡＬｙｓなし
ＳＱ−０３８０５９
ＭＲＫ＿０４＿４Ａなし
ＳＱ−０３８０５８
ＭＲＫ＿０４＿ポリＡなし＿３変異
ＳＱ−０３８０５７
等価物
当業者であれば、通常の実験を用いるだけで、本明細書に記載される本開示の具体的な実施形態の等価物を数多く認識または確認できるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書で開示される全ての参考文献は、特許文書を含め、その全体が参照により本明細書に援用される。

Claims (167)

  1. 少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、薬学的に許容される担体とを含む、ＲＳＶワクチン。
  2. 前記少なくとも１つの抗原性ポリペプチドが、糖タンパク質Ｇまたはその免疫原性断片である、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
  3. 前記少なくとも１つの抗原性ポリペプチドが、糖タンパク質Ｆまたはその免疫原性断片である、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
  4. アジュバントを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  5. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７からなる群から選択される少なくとも１つの核酸配列によってコードされ、かつ／または前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２６０〜２８０のうちのいずれかの少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
  6. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号１、２、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７からなる群から選択される核酸配列の少なくとも１つの断片によってコードされ、かつ／または前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２６０〜２８０のうちのいずれかの核酸配列の少なくとも１つの断片を含む、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
  7. 前記ＲＳＶ抗原性ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のＲＳＶワクチン。
  8. 前記オープンリーディングフロムがコドン最適化された、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  9. 多価である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  10. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが少なくとも２つの抗原性ポリペプチドをコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  11. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが少なくとも１０の抗原性ポリペプチドをコードする、請求項１０に記載のＲＳＶワクチン。
  12. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが少なくとも１００の抗原性ポリペプチドをコードする、請求項１１に記載のＲＳＶワクチン。
  13. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが２〜１００の抗原性ポリペプチドをコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  14. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  15. 前記化学修飾が、プソイドウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、Ｎ１−エチルプソイドウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される、請求項１４に記載のＲＳＶワクチン。
  16. ナノ粒子中に製剤化された、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  17. 前記ナノ粒子が５０〜２００ｎｍの平均直径を有する、請求項１６に記載のＲＳＶワクチン。
  18. 前記ナノ粒子が脂質ナノ粒子である、請求項１６または１７に記載のＲＳＶワクチン。
  19. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質と、ＰＥＧ修飾脂質と、ステロールと、非カチオン性脂質とを含む、請求項１８に記載のＲＳＶワクチン。
  20. 前記カチオン性脂質がイオン性カチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が中性脂質であり、前記ステロールがコレステロールである、請求項１９に記載のＲＳＶワクチン。
  21. 前記カチオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される、請求項２０に記載のＲＳＶワクチン。
  22. 前記ナノ粒子が、０．４未満の多分散値を有する、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  23. 前記ナノ粒子が、中性のｐＨ値で中性の正味電荷を有する、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  24. 少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、少なくとも１つの５’末端キャップと、少なくとも１つの化学修飾とを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、脂質ナノ粒子内に製剤化された、ＲＳＶワクチン。
  25. 前記５’末端キャップが７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである、請求項２４に記載のＲＳＶワクチン。
  26. 前記少なくとも１つの化学修飾が、プソイドウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、Ｎ１−エチルプソイドウリジン、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、５−メチルウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、５−メトキシウリジン及び２’−Ｏ−メチルウリジンからなる群から選択される、請求項２４または２５に記載のＲＳＶワクチン。
  27. 前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質と、ＰＥＧ修飾脂質と、ステロールと、非カチオン性脂質とを含む、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  28. 前記カチオン性脂質がイオン性カチオン性脂質であり、前記非カチオン性脂質が中性脂質であり、前記ステロールがコレステロールである、請求項２７に記載のＲＳＶワクチン。
  29. 前記カチオン性脂質が、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘニコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）及びＮ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン（Ｌ５３０）からなる群から選択される、請求項２８に記載のＲＳＶワクチン。
  30. 少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、前記オープンリーディングフレーム中のウラシルの少なくとも８０％が化学修飾を有する、ＲＳＶワクチン。
  31. 前記オープンリーディングフレーム中の前記ウラシルの１００％が化学修飾を有する、請求項３０に記載のＲＳＶワクチン。
  32. 前記化学修飾が前記ウラシルの５位にある、請求項３０または３１に記載のＲＳＶワクチン。
  33. 前記化学修飾がＮ１−メチルプソイドウリジンである、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  34. 脂質ナノ粒子中に製剤化された、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  35. 対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチンを、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で前記対象に投与することを含む、前記方法。
  36. 前記抗原特異的免疫応答がＴ細胞応答を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記抗原特異的免疫応答がＢ細胞応答を含む、請求項３５に記載の方法。
  38. 抗原特異的免疫応答を誘導する前記方法が、ＲＳＶワクチンの単回投与を伴う、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ワクチンのブースター用量を投与することを更に含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ワクチンが、皮内注射または筋肉注射によって前記対象に投与される、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法にて使用するための請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチンであって、前記方法は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で前記ＲＳＶワクチンを前記対象に投与することを含む、前記ＲＳＶワクチン。
  42. 対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法にて使用するための薬剤の製造における請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチンであって、前記方法は、抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で前記ＲＳＶワクチンを前記対象に投与することを含む、前記ＲＳＶワクチン。
  43. 前記糖タンパク質Ｆまたはその免疫原性断片が、融合前のコンフォメーションを維持するように設計されている、請求項３に記載のＲＳＶワクチン。
  44. 対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で製剤化された、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  45. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加する、請求項４４に記載のＲＳＶワクチン。
  46. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、１〜３ｌｏｇ増加する、請求項４５に記載のＲＳＶワクチン。
  47. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも２倍増加する、請求項４４に記載のＲＳＶワクチン。
  48. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも５倍増加する、請求項４７に記載のＲＳＶワクチン。
  49. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも１０倍増加する、請求項４８に記載のＲＳＶワクチン。
  50. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、２〜１０倍増加する、請求項４７に記載のＲＳＶワクチン。
  51. 前記対照が、ＲＳＶワクチンの投与を受けたことがない対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  52. 前記対照が、弱毒化生ＲＳＶワクチンまたは不活化ＲＳＶワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  53. 前記対照が、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  54. 前記対照が、ＲＳＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  55. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／２に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項４４〜５４のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  56. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／４に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項５５に記載のＲＳＶワクチン。
  57. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１０に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項５６に記載のＲＳＶワクチン。
  58. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１００に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項５７に記載のＲＳＶワクチン。
  59. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１０００に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項５８に記載のＲＳＶワクチン。
  60. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を１／２〜１／１０００に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項５５に記載のＲＳＶワクチン。
  61. 前記有効量が、２５〜１０００μｇまたは５０〜１０００μｇの総用量である、請求項４４〜６０のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  62. 前記有効量が、１００μｇの総用量である、請求項６１に記載のＲＳＶワクチン。
  63. 前記有効量が、前記対象に合計２回投与される、２５μｇの用量である、請求項６１に記載のＲＳＶワクチン。
  64. 前記有効量が、前記対象に合計２回投与される、１００μｇの用量である、請求項６１に記載のＲＳＶワクチン。
  65. 前記有効量が、前記対象に合計２回投与される、４００μｇの用量である、請求項６１に記載のＲＳＶワクチン。
  66. 前記有効量が、前記対象に合計２回投与される、５００μｇの用量である、請求項６１に記載のＲＳＶワクチン。
  67. 前記ＲＳＶワクチンの前記有効量が、対照と比較して、５〜２００倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす、請求項４４〜６６のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  68. 前記ＲＳＶワクチンの単回用量が、対照と比較して、約２〜１０倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす、請求項６７に記載のＲＳＶワクチン。
  69. 前記ＲＳＶワクチンの単回用量が、対照と比較して、約５倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす、請求項６８に記載のＲＳＶワクチン。
  70. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも１ｌｏｇ増加する、請求項３５に記載の方法。
  71. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、１〜３ｌｏｇ増加する、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも２倍増加する、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも５倍増加する、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、少なくとも１０倍増加する、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価が、対照と比較して、２〜１０倍増加する、請求項７２に記載の方法。
  76. 前記対照が、ＲＳＶワクチンの投与を受けたことがない対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記対照が、弱毒化生ＲＳＶワクチンまたは不活化ＲＳＶワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載方法。
  78. 前記対照が、組み換えまたは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記対照が、ＲＳＶ ＶＬＰワクチンの投与を受けたことがある対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価である、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／２に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
  81. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／４に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１０に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１００に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を少なくとも１／１０００に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記有効量が、組み換えＲＳＶタンパク質ワクチンの標準治療用量を１／２〜１／１０００に減らした用量と同等の用量であり、前記対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価は、組み換えもしくは精製されたＲＳＶタンパク質ワクチン、または弱毒化生ＲＳＶワクチンもしくは不活化ＲＳＶワクチン、またはＲＳＶ ＶＬＰワクチンの標準治療用量を投与した対照の対象において産生される抗ＲＳＶ抗原性ポリペプチド抗体の力価と同等である、請求項８０に記載の方法。
  86. 前記有効量が５０〜１０００μｇの総用量である、請求項７０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記有効量が１００μｇの総用量である、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記有効量が、前記対象に合計２回投与される、２５μｇの用量である、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記有効量が、前記対象に合計２回投与される、１００μｇの用量である、請求項８６に記載の方法。
  90. 前記有効量が、前記対象に合計２回投与される、４００μｇの用量である、請求項８６に記載の方法。
  91. 前記有効量が、前記対象に合計２回投与される、５００μｇの用量である、請求項８６に記載の方法。
  92. ＲＳＶに対する前記ワクチンの有効性が６０％を超える、請求項７０〜９１のいずれか一項に記載の方法。
  93. ＲＳＶに対する前記ワクチンの有効性が６５％を超える、請求項９２に記載の方法。
  94. ＲＳＶに対する前記ワクチンの有効性が７０％を超える、請求項９３に記載の方法。
  95. ＲＳＶに対する前記ワクチンの有効性が７５％を超える、請求項９４に記載の方法。
  96. ＲＳＶに対する前記ワクチンの有効性が８０％を超える、請求項９５に記載の方法。
  97. ＲＳＶに対する前記ワクチンの有効性が８５％を超える、請求項９６に記載の方法。
  98. ＲＳＶに対する前記ワクチンの有効性が９０％を超える、請求項９７に記載の方法。
  99. 前記ワクチンが、最大１年間または最大２年間、ＲＳＶに対して前記対象を免疫にする、請求項７０〜９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記ワクチンが、２年を超える間、ＲＳＶに対して前記対象を免疫にする、請求項７０〜９８のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記ワクチンが、３年を超える間、ＲＳＶに対して前記対象を免疫にする、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記ワクチンが、４年を超える間、ＲＳＶに対して前記対象を免疫にする、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記ワクチンが、５〜１０年間、ＲＳＶに対して前記対象を免疫にする、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記対象が約５歳以下であるか、前記対象が約１歳〜約５歳の間の年齢であるか、前記対象が約６ヶ月〜約１歳の間の年齢であるか、前記対象が約６ヶ月以下であるか、前記対象が約１２ヶ月以下である、請求項７０〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記対象が、約６０歳、約７０歳またはそれ以上の年齢の高齢者対象である、請求項７０〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記対象が、約２０歳〜約５０歳の間の年齢の若年成人である、請求項７０〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記対象が、正期産で生まれている、請求項７０〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記対象が妊娠約３６週より前の早産で生まれたか、前記対象が妊娠約３２週より前に早産で生まれたか、前記対象が妊娠約３２週〜約３６週の間の早産で生まれている、請求項７０〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記対象が妊娠している、請求項７０〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
  110. 前記対象が、慢性肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息）を有する、請求項７０〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記対象がＲＳＶに曝露したことがある、前記対象がＲＳＶに感染している、または前記対象がＲＳＶによる感染リスクがある、請求項７０〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 前記対象が免疫不全状態である、請求項７０〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 前記ＲＳＶワクチンの第２の用量（ブースター用量）及び任意選択により第３の用量を投与することを更に含む、請求項７０〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記ＲＳＶワクチンの前記有効量が、対照と比較して、５〜２００倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす、請求項７０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. 前記ＲＳＶワクチンの単回用量が、対照と比較して、約２〜１０倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす、請求項１１４に記載の方法。
  116. 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドに連結されたシグナルペプチドを含む、ＲＳＶワクチン。
  117. 前記抗原性ポリペプチドが、融合（Ｆ）糖タンパク質もしくはその免疫原性断片、吸着（Ｇ）タンパク質もしくはその免疫原性断片、核タンパク質（Ｎ）もしくはその免疫原性断片、リンタンパク質（Ｐ）もしくはその免疫原性断片、大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）もしくはその免疫原性断片、マトリックスタンパク質（Ｍ）もしくはその免疫原性断片、小型疎水性タンパク質（ＳＨ）もしくはその免疫原性断片、非構造タンパク質１（ＮＳ１）もしくはその免疫原性断片、または非構造タンパク質２（ＮＳ２）及びその免疫原性断片である、請求項１１６に記載のＲＳＶワクチン。
  118. 前記シグナルペプチドが、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧκシグナルペプチドである、請求項１１６または１１７に記載のＲＳＶワクチン。
  119. 前記ＩｇＥシグナルペプチドがＩｇＥ ＨＣ（Ｉｇ重鎖ε−１）シグナルペプチドである、請求項１１８に記載のＲＳＶワクチン。
  120. 前記ＩｇＥ ＨＣシグナルペプチドが配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号２８１）を有する、請求項１１９に記載のＲＳＶワクチン。
  121. 前記ＩｇＧκシグナルペプチドが配列ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２８２）を有する、請求項１１８に記載のＲＳＶワクチン。
  122. 前記シグナルペプチドが、日本脳炎ＰＲＭシグナル配列（ＭＬＧＳＮＳＧＱＲＶＶＦＴＩＬＬＬＬＶＡＰＡＹＳ、配列番号２８３）、ＶＳＶｇタンパク質シグナル配列（ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＡ、配列番号２８４）、日本脳炎ＪＥＶシグナル配列（ＭＷＬＶＳＬＡＩＶＴＡＣＡＧＡ、配列番号２８５）及びＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣ（配列番号２８９）から選択される、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  123. 請求項１１６〜１２２のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチンをコードする核酸。
  124. 呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ペプチドに連結されたシグナルペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ＲＳＶワクチン。
  125. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、ＲＳＶ吸着タンパク質（Ｇ）またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  126. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、ＲＳＶ融合（Ｆ）糖タンパク質またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  127. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、核タンパク質（Ｎ）またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  128. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、リンタンパク質（Ｐ）またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  129. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  130. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、マトリックスタンパク質（Ｍ）またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  131. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、小型疎水性のタンパク質（ＳＨ）またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  132. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、非構造タンパク質１（ＮＳ１）またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  133. 前記ＲＳＶ抗原性ペプチドが、非構造タンパク質２（ＮＳ２）またはその免疫原性断片である、請求項１２４に記載のＲＳＶワクチン。
  134. 前記シグナルペプチドが、ＩｇＥシグナルペプチドまたはＩｇＧκシグナルペプチドである、請求項１２４〜１３３のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  135. 前記ＩｇＥシグナルペプチドがＩｇＥ ＨＣ（Ｉｇ重鎖ε−１）シグナルペプチドである、請求項１３４に記載のＲＳＶワクチン。
  136. 前記ＩｇＥ ＨＣシグナルペプチドが配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号２８１）を有する、請求項１３５に記載のＲＳＶワクチン。
  137. 前記ＩｇＧκシグナルペプチドが配列ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２８２）を有する、請求項１３４に記載のＲＳＶワクチン。
  138. 前記シグナルペプチドが、日本脳炎ＰＲＭシグナル配列（ＭＬＧＳＮＳＧＱＲＶＶＦＴＩＬＬＬＬＶＡＰＡＹＳ、配列番号２８３）、ＶＳＶｇタンパク質シグナル配列（ＭＫＣＬＬＹＬＡＦＬＦＩＧＶＮＣＡ、配列番号２８４）及び日本脳炎ＪＥＶシグナル配列（ＭＷＬＶＳＬＡＩＶＴＡＣＡＧＡ、配列番号２８５）から選択される、請求項１２４〜１３７のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  139. 膜結合呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質、膜結合ＤＳ−Ｃａｖ１（安定した融合前のＲＳＶ Ｆタンパク質）または膜結合ＲＳＶ Ｆタンパク質と膜結合ＤＳ−Ｃａｖ１の組み合わせをコードするオープンリーディングフレームを有する少なくとも１つのリボ核酸（ＲＮＡ）ポリヌクレオチドと、
    薬学的に許容される担体と
    を含む、ＲＳＶワクチン。
  140. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号５に記載される配列を含む、請求項１３９に記載のＲＳＶワクチン。
  141. 前記少なくとも１つのＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号７、２５７、２５８または２５９に記載される配列を含む、請求項１３９または１４０に記載のＲＳＶワクチン。
  142. 前記ＲＳＶワクチンの単回用量が、対照と比較して、２〜１０倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす、請求項１３９〜１４１のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  143. 前記ＲＳＶワクチンの単回用量が、対照と比較して、約５倍のＲＳＶに対する血清中和抗体の増加をもたらす、請求項１４２に記載のＲＳＶワクチン。
  144. 前記血清中和抗体がＲＳＶ Ａ及び／またはＲＳＶ Ｂに対するものである、請求項１４２または１４３に記載のＲＳＶワクチン。
  145. ＭＣ３脂質ナノ粒子中に製剤化された、請求項１３９〜１４４のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチン。
  146. 対象において抗原特異的免疫応答を誘導する方法であって、請求項１３９〜１４５のいずれか一項に記載のＲＳＶワクチンを、対象において抗原特異的免疫応答をもたらすのに有効な量で対象に投与することを含む、前記方法。
  147. 前記ＲＳＶワクチンのブースター用量を投与することを更に含む、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記ＲＳＶワクチンの第２のブースター用量を投与することを更に含む、請求項１４７に記載の方法。
  149. ５’末端キャップと、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、ＲＳＶワクチン。
  150. 前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号５によって特定される配列によってコードされる、請求項１４９に記載のワクチン。
  151. 前記少なくとも１つのｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２６２によって特定される配列を含む、請求項１４９に記載のワクチン。
  152. 前記少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドが、配列番号６によって特定される配列を含む、請求項１４９に記載のワクチン。
  153. 前記少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドが、配列番号２９０によって特定される配列を含む、請求項１４９に記載のワクチン。
  154. 前記ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号７によって特定される配列によってコードされる、請求項１４９に記載のワクチン。
  155. 前記ｍＲＮＡポリヌクレオチドが、配列番号２６３によって特定される配列を含む、請求項１４９に記載のワクチン。
  156. 前記少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドが、配列番号８によって特定される配列を含む、請求項１４９に記載のワクチン。
  157. 前記少なくとも１つのＲＳＶ抗原性ポリペプチドが、配列番号２９１によって特定される配列を含む、請求項１４９に記載のワクチン。
  158. 前記５’末端キャップが、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐであるか、これを含む、請求項１４９〜１５７のいずれか一項に記載のワクチン。
  159. 前記オープンリーディングフレーム中のウラシルの１００％が、前記ウラシルの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、請求項１４９〜１５８のいずれか一項に記載のワクチン。
  160. ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む、脂質ナノ粒子中に製剤化された、請求項１４９〜１５９のいずれか一項に記載のワクチン。
  161. 前記脂質ナノ粒子が、クエン酸三ナトリウム緩衝液、スクロース及び水を更に含む、請求項１６０に記載のワクチン。
  162. ５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐと、配列番号２６２によって特定される配列と、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化され、前記配列番号２６２によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが、前記ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン。
  163. ５’末端キャップ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐと、配列番号２６３によって特定される配列と、３’ポリＡテールとを有する少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含み、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）２０００−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子中に製剤化され、前記配列番号２６３によって特定される配列のウラシルヌクレオチドが、前記ウラシルヌクレオチドの５位にＮ１−メチルプソイドウリジンを含むように修飾されている、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン。
  164. 対象のワクチン接種に使用するための医薬組成物であって、
    呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原をコードするｍＲＮＡを有効量で含み、
    前記有効量は、投与後１〜７２時間に前記対象の血清中で測定したときに検出可能な抗原レベルをもたらすのに十分なものである、前記医薬組成物。
  165. 前記抗原のカットオフ指数が１〜２である、請求項１６４に記載の組成物。
  166. 対象のワクチン接種に使用するための医薬組成物であって、
    呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原をコードするｍＲＮＡを有効量で含み、
    前記有効量は、投与後１〜７２時間に前記対象の血清中で測定したときに、前記抗原に対する中和抗体によってもたらされる１，０００〜１０，０００の中和力価をもたらすのに十分なものである前記医薬組成物。
  167. ７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐである５’末端キャップと、配列番号２６０〜２８０のうちのいずれか１つによって特定される配列と、３’ポリＡテールとを含む少なくとも１つのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）ポリヌクレオチドを含む、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ワクチン。
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