TW202500165A - 一種含有陽離子脂質的醫藥組成物及其用途 - Google Patents

Abstract

本揭露涉及一種含有陽離子脂質的醫藥組成物及其用途，具體而言，提供一種醫藥組成物，其包含載體，該載體包含有陽離子脂質，該陽離子脂質，陽離子脂質與載體莫耳百分比大於等於10%，且小於50%。

Description

一種含有陽離子脂質的醫藥組成物及其用途

本揭露屬醫藥領域，涉及製備一種含有陽離子脂質的醫藥組成物及其用途。

基於核酸類的藥物，例如信使RNA(mRNA)、反義寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA)、質粒等具有廣闊的應用前景，如何安全有效地遞送到體內靶器官和靶細胞是制約該技術發展的難題。

目前核酸藥物遞送載體可分為病毒載體載體和非病毒載體兩大類，脂質奈米顆粒介導的核酸藥物遞送是屬非病毒遞送載體的主要方法。

在基因治療和疫苗應用中，脂質奈米顆粒已經被證明是治療各種疾病的核酸的優良載體。由陽離子脂質和其他輔助脂質，例如膽固醇、磷脂和PEG化的脂質形成的脂質奈米顆粒包封核酸，保護核酸免於降解並且促進細胞攝取，降低免疫反應。另外，脂質奈米顆粒進行生物活性成分的細胞傳遞具有其他優點，如靶向性好、副作用小、穩定性好和轉染效率較高等。

儘管脂質奈米顆粒已經展示遞送的優勢，但安全性、功效和特異性仍有待改良。仍需要開發有助於將治療劑和/或預防劑如核酸遞送至細胞的改進的陽離子脂質組合物。

本揭露提供了一種醫藥組成物，其包含載體，該載體包含有陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，陽離子脂質與載體莫耳百分比大於等於10%，且小於50%，

在一些實施方案中，醫藥組成物中陽離子脂質占載體莫耳量的15~49%，包括但不限於15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，醫藥組成物中陽離子脂質占載體莫耳量的42~49%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中陽離子脂質占載體莫耳量的45%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中陽離子脂質占載體莫耳量的46%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中陽離子脂質占載體莫耳量的47%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中陽離子脂質占載體莫耳量的48%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中陽離子脂質占載體莫耳量的49%。

在另一些實施方案中，醫藥組成物中該載體還含有非陽離子脂質，該非陽離子脂質選自磷脂、膽固醇或其衍生物的中至少一種。

在一些實施方案中，醫藥組成物中非陽離子脂質選自磷脂與膽固醇或其衍生物的混合物。

一些實施方案中提供的醫藥組成物中磷脂的含量占載體莫耳量的5~40%，包括但不限於5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，醫藥組成物中磷脂的含量占載體莫耳量的15%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中磷脂的含量占載體莫耳量的20%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中磷脂的含量占載體莫耳量的10~20%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中磷脂的含量占載體莫耳量的10%。

另一些實施方案中提供的醫藥組成物中磷脂選自1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-雙十一烷醯基-sn-甘油-磷酸膽鹼(DUPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18：0 Diether PC)、1-油醯基-2-膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、二硬脂醯基-磷脂醯-乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂醯基-2-油醯基-硬脂醯乙醇胺(SOPE)、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯膽鹼(SOPC)、鞘磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺(LPE)以及其混合物。

在一些實施方案中，醫藥組成物中磷脂為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)。

在一些實施方案中，醫藥組成物中磷脂為1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。

另一方面，本揭露醫藥組成物中膽固醇或其衍生物占載體莫耳量的30~60%，包括但不限於30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，醫藥組成物中膽固醇或其衍生物含量占載體莫耳量的35~45%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中膽固醇或其衍生物含量占載體莫耳量的40.5%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中膽固醇或其衍生物含量占載體莫耳量的45%。

在另一些實施方案中，膽固醇衍生物包括但不限於穀固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄鹼、熊果酸。

在一些實施方案中，醫藥組成物中非陽離子脂質占載體莫耳量的35~70%，包括但不限於35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，醫藥組成物中非陽離子脂質占載體莫耳量的50~65%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中非陽離子脂質占載體莫耳量的40~55%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中非陽離子脂質占載體莫耳量的55~62%。

另一方面，本揭露醫藥組成物中膽固醇或其衍生物與磷脂的莫耳比為1.0~5.0，包括但不限於1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，醫藥組成物中膽固醇或其衍生物與磷脂的莫耳比2.0~5.0。

另一方面，本揭露所述醫藥組成物中載體還含有綴合脂質，該綴合脂質包括但不限於PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯基甘油、PEG修飾的二烷基甘油。

在一些實施方案中，該醫藥組成物中綴合脂質選自二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻醯甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)。

在一些實施方案中，該醫藥組成物中綴合脂質選自二肉豆蔻醯甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000。

在一些實施方案中，該醫藥組成物中綴合脂質選自二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺聚乙二醇2000。

在一些實施方案中，綴合脂質起抑制載體(顆粒)聚集。在一些實施方案中，醫藥組成物中綴合脂質的含量占載體莫耳量的0.5~4%，包括但不限於0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%、3.2%、3.4%、3.6%、3.8%、4.0%或任意兩數之間的值。

在一些實施方案中，醫藥組成物中綴合脂質的含量占載體莫耳量的0.5~1.0%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中綴合脂質的含量占載體莫耳量的1.5~2.5%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中綴合脂質的含量占載體莫耳量的1~2%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中綴合脂質的含量占載體莫耳量的1.5%。

在一些實施方案中，醫藥組成物中綴合脂質的含量占載體莫耳量的2.0%。

本揭露醫藥組成物中還含有活性劑，該活性劑選自核酸，包括核糖核酸或脫氧核糖核酸。

在一些實施方案中，該活性劑選自小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、環狀RNA、自複製RNA中的任一或其任意組合。

在一些實施方案中，該活性劑選自mRNA。

在一些實施方案中，該mRNA包含ORF，該ORF表達蛋白或多肽。

在一些實施方案中，該mRNA編碼蛋白或多肽。

在一些實施方案中，該mRNA編碼抗原。

在一些實施方案中，該mRNA編碼蛋白或多肽源自傳染因子，或為傳染因子抗原。

在一些實施方案中，該蛋白或多肽為病毒抗原和/或細菌抗原。

在一些實施方案中，該病毒選自腺病毒、皰疹病毒(例如，I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒8型人皰疹病毒)、腦炎病毒、乳頭瘤病毒、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、愛潑斯坦-巴爾病毒、人巨細胞病毒、人乳頭瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、脊髓灰質炎病毒、肝炎病毒(例如，甲型、乙型、丙型、丁型或戊型肝炎病毒)、人博卡病毒、細小病毒(例如，B19)、人星狀病毒、諾沃克病毒、柯薩奇病毒、鼻病毒、嚴重急性呼吸道綜合症病毒、黃熱病毒、登革熱病毒、西尼羅病毒、風疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型或乙型流感病毒、瓜納裡托病毒、胡寧病毒、拉沙病毒、馬丘波病毒、薩比亞病毒、克裡米亞-剛果出血熱病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、狂犬病病毒、輪狀病毒、環狀病毒、科羅拉多壁虱熱病毒、漢坦病毒、中東呼吸道冠狀病毒、基孔肯亞病毒或版納病毒。

在一些實施方案中，該病毒選自流感病毒(例如甲型流感病毒、乙型流感病毒)、冠狀病毒或其組合。例如，該冠狀病毒為SARS-COV-2；該冠狀 病毒抗原為刺突蛋白；該刺突蛋白選自SARS-COV-2、SARS-COV-2 Alpha、SARS-COV-2 Beta、SARS-COV-2 Gamma、SARS-COV-2 Kappa、SARS-COV-2 Delta或SARS-COV-2 Omicron任一病毒株的刺突蛋白。例如，該流感病毒選自A型流感病毒或B型流感病毒；該流感病毒抗原為血凝素蛋白(HA)和/或神經胺酸酶(NA)；該流感病毒抗原選自A型流感病毒H1N1、A型流感病毒H3N2、B型流感病毒Victoria、B型流感病毒Yamagata任一病毒株的血凝素蛋白和/或神經胺酸酶。

在一些實施方案中，該病毒為RSV。例如，該RSV抗原為RSV附著蛋白(G)或其免疫原性片段、RSV融合(F)糖蛋白或其免疫原性片段，或其組合；例如，該RSV抗原為融合前糖蛋白F。此處全文引入WO2017070622A中的RSV抗原性多肽或其免疫原性片段及其序列，WO2014160463A、WO2012158613A、WO2017109629A、WO2017172890A中的融合前糖蛋白F及其序列。

在一些實施方案中，該病毒為VZV。例如，該VZV抗原為VZV糖蛋白。例如，VZV糖蛋白可以是VZV gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN或gM多肽或其免疫原性片段或表位。在一些實施方案中，該VZV糖蛋白是VZV gE蛋白，例如野生型VZV gE蛋白或其截短體、片段、突變體。在一些實施方案中，該野生型VZV gE蛋白來自Oka毒株。在一些實施方案中，野生型VZV gE蛋白包含(或為)SEQ ID NO：1所示胺基酸序列和/或包含(或為)SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。

在一些實施方案中，該截短體可以是任何截短多肽，例如包括胺基酸1至200、1至250、1至300、1至350、1至400、1至450、1至500、1至 540、1至544、1至545、1至546、1至550、1至560、1至561、1至570、1至573、1至574、1至575的截短VZV gE多肽。在一些實施方案中，該VZV gE蛋白進一步包含Y569A點突變。此處全文引入WO2017070601A中的VZV抗原性多肽及其序列。

在一些實施方案中，該截短體的胺基酸序列為野生型gE蛋白的第1-544、1-546、1-561或1-574位胺基酸。在一些實施方案中，該截短體的胺基酸序列為在野生型gE蛋白的第1-574位胺基酸的基礎上，包含Y569A突變。

在一些實施方案中，該VZV gE蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：25中任一項所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該編碼VZV gE蛋白的開放閱讀框的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：8中任一項所示或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同一性的核苷酸序列。

在一些實施方案中，該蛋白或多肽選自果糖二磷酸醛縮酶A(ALDOA)、α-甲基醯基-輔酶A消旋酶(AMACR)、血清澱粉樣蛋白P成分(APCS)、血管生成素1(ANGPT1)、載脂蛋白A-I(APOA1)Milano、載脂蛋白A-I(APOA1)Paris、載脂蛋白A-I(APOA1)、精胺基琥珀酸裂解酶(ASL)、artemin(ARTN)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、殺菌/通透性增加蛋白(rBPI-21)、骨形態發生蛋白2(BMP2)、骨形態發生蛋白7(BMP7)、支鏈酮酸脫氫酶E1α多肽(BCKDHA)、集落刺激因子2(粒細胞-巨噬細胞)(GM-CSF)、集落刺激因子3(粒細胞)(GCSF)、脫氧核糖核酸酶I(DNA酶1)、促紅細胞生成素(EPO)、IX因子、VII因子、XI因子、纖維蛋白原A(FGA)、成纖維細胞生長因子18(FGF18)、成 纖維細胞生長因子23(FGF23)、成纖維細胞生長因子7(FGF7或KGF)、卵泡抑素(FST)、延胡索醯乙醯乙酸水解酶(延胡索醯乙醯乙酸酶)(FAH)、半乳糖激酶1(GALK1)、半乳糖苷酶α(GLA)、葡聚糖(1,4-α-)分支酶1(GBE1)、糖蛋白激素α多肽(CGA或FSH-α)、血紅蛋白β(HBB)、肝細胞生長因子(HGF)、人生長激素(hGH)、門冬胰島素、甘精胰島素、谷賴胰島素、賴脯胰島素、干擾素β(IFNB)、干擾素α2(IFNA2)、白細胞介素10(IL-10)、白細胞介素15(IL-15)、白細胞介素7(IL-7)、klotho(KL)、卵磷脂-膽固醇醯基轉移酶(LCAT)、溶酶體酸性脂肪酶A膽固醇酯酶(LIPA)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、低密度脂蛋白受體(LDLR)、甘露糖苷酶α2B類成員1(MAN2B1)、微粒體甘油三酯轉移蛋白(MTTP)、N-乙醯谷胺酸合成酶(NAGS)、神經調節蛋白1(NRG1)、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶(OTC)、磷酸化酶激酶α2(肝臟)(PHKA2)、纖溶酶原(PLAT)、胞裂蛋白4(ARTS或SEPT4)、serpin肽酶抑制劑分化體C(抗凝血酶)成員1(SERPINC1)、serpin肽酶抑制劑分化體F(α-2抗纖維蛋白溶酶色素上皮衍生因子)成員2(SERPINF2)、sirtuin 1(SIRT1)、sirtuin 6(SIRT6)、溶質載體家族16成員3(單羧酸轉運蛋白4)(SLC16A3)、溶質載體家族2(易化葡萄糖轉運蛋白)成員1(SLC2A1或GLUT1)、分揀蛋白1(SORT1)、血小板生成素(THPO)、轉化生長因子β(TGFB1)、釉叢蛋白1(TUFT1)、腫瘤蛋白p53(TP53)、酪胺酸酶(TYR)、UDP葡萄糖苷醯轉移酶1家族多肽A1(UGT1A1)、血管內皮生長因子(VEGF)和X連鎖細胞凋亡抑制劑(XIAP)，或其任意組合。此處全文引入WO2013151736A中mRNA編碼目標多肽及其序列。

在一些實施方案中，該蛋白或多肽為癌抗原。該癌抗原包括但不限於：一種或多種傳統癌抗原或受試者特異性癌抗原(包括編碼一種或多種已知的為腫瘤所特有的癌抗原或為各受試者所特有的癌抗原的RNA，該癌抗原被稱 為新表位或受試者特異性表位或抗原)。在一些具體實施方案中，該癌抗原是受試者特異性癌抗原。在一些具體實施方案中，受試者特異性癌抗原可代表受試者的腫瘤樣品的外顯子組，或代表受試者的腫瘤樣品的轉錄物組。在一些實施方案中，受試者特異性癌抗原可代表受試者的外來體。此處全文引入WO2012159754A和WO2017070618A中所描述的受試者特異性癌抗原及其鑒定方法。在一些具體實施方案中，該癌抗原是傳統癌抗原。在一些實施方案中，傳統癌抗原是非突變抗原。在一些具體實施方案中，傳統癌抗原是突變抗原。例如，癌抗原可以是癌胚抗原、α1-胎蛋白、異鐵蛋白和胎兒磺基糖蛋白(fetal sulphoglycoprotein)、α2-H-鐵蛋白以及γ-胎蛋白。

在一些實施方案中，該蛋白或多肽為抗體或其抗原結合片段。例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段例如為駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段例如為重組抗體或其片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段為線性抗體、單鏈抗體、奈米抗體、肽抗體peptibody、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、diabody、triabody和tetrabody、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。

在一些實施方案中，該mRNA包含：

(a)開放閱讀框(ORF)，

(b)非轉譯區元件(UTR)，

(c)多聚腺苷酸(poly-A)尾；

其中，(b)非轉譯區元件(UTR)可包含(b1)5’UTR和/或(b2)3’UTR；

其中，(b)非轉譯區元件(UTR)、(c)多聚腺苷酸(poly-A)尾可同時存在，同時不存在，或則一存在。

在一些實施方案中，該mRNA還包含5’Cap結構。

在一些實施方案中，從5'至3'方向上，如上任一項所述的RNA分子含有i)-v)中任一：

i)5'UTR，和開放閱讀框(ORF)；

ii)開放閱讀框(ORF)，和3'UTR；

iii)5'UTR，開放閱讀框(ORF)，和3'UTR；

iv)5'UTR，開放閱讀框(ORF)，3'UTR，和poly-A尾巴；

v)5'帽結構(5'Cap)，5'UTR，開放閱讀框(ORF)，3'UTR，和poly-A尾巴；

其中該ORF與該5'UTR和/或該3'UTR源自相同和/或不同的基因。

在一些實施方案中，該5’UTR選自β-珠蛋白5'UTR、含有強Kozak轉譯起始信號的5’UTR、細胞色素b-245α多肽(CYBA)5'UTR、羥基類固醇(17-β)脫氫酶(HSD17B4)5'UTR、煙草蝕紋病毒(TEV)5'UTR、熱休克蛋白70(Hsp70)5'UTR、eIF4G 5'UTR、ACTG1 5'UTR、CTSB 5’UTR或ARHGAP15基因的5'UTR。一些實施方案中，其中該5'UTR是源自或為ACTG1或ARHGAP15基因的5'UTR序列或其衍生序列。在一些實施方案中，該ARHGAP15基因是來源任意物種的，如人類ARHGAP15、狒狒ARHGAP15、小鼠ARHGAP15等。

一些實施方案中，其中該5'UTR是源自或為人類ARHGAP15基因的5'UTR序列或其衍生序列。一些實施方案中，該ARHGAP15基因的5'UTR包含或為如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的核苷酸序列。

在一些實施方案中，該3'UTR選自α-珠蛋白3'UTR、β-珠蛋白(hemoglobin subunit beta，HBB)3'UTR、β-肌動蛋白3'UTR、CYBA 3'UTR、白蛋白3'UTR、生長激素(GH)3'UTR、VEEV 3'UTR、乙型肝炎病毒(HBV)3'UTR、ACTG1 3'UTR、CTSB 3’UTR或ARHGAP15基因的3'UTR。

一些實施方案中，其中該3'UTR是源自或為HBB、CTSB或ARHGAP15基因的3'UTR序列或其衍生序列。

一些實施方案中，該3'UTR包含或為如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或與之具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，該poly-A尾選自A120、A30L70、HGH polyA、SV40polyA、BGH polyA、rbGlob polyA或SV40late polyA。

一些具體實施方案中，該poly-A尾巴選自120A或A30L70，該A30L70的序列如SEQ ID NO：11所示，該120A的序列如SEQ ID NO：12所示。

一些具體實施方案中，該RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：20中任一項所示。在一些實施方案中，該mRNA包含經修飾的核苷酸或核苷。該經修飾的核苷酸和核苷可為天然存在的經修飾的核苷酸和核苷或非天然存在的經修飾的核苷酸和核苷。該修飾可包括如本領域中公認的在核苷酸和/或核苷的糖、主鏈或核鹼基部分的那些修飾。在一些具體實施方案中，該mRNA中經修飾的核鹼基包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)和/或假尿苷(ψ)。在一些具體實施方案中，該mRNA中的經修飾的核鹼基包含5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些具體實施方案 中，該mRNA包括至少兩種(例如，2、3、4種或更多種)任何上文所提及的經修飾的核鹼基的組合，包括但不限於化學修飾。

在一些具體實施方案中，該5'Cap結構位於5'UTR的上游，例如，位於5'UTR的5'末端。在一些具體實施方案中，5'帽結構是所屬技術領域中具有通常知識者已知的帽結構，如Cap0(第一個核鹼基的甲基化，例如m7GpppN)、Cap1(m7GpppN的相鄰核苷酸的核糖的額外甲基化，例如m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG)、Cap2(m7GpppN下游第3個核苷酸的核糖的額外甲基化)、Cap3(m7GpppN下游第3個核苷酸的核糖的額外甲基化)、Cap4(m7GpppN下游第4個核苷酸的核糖的額外甲基化)、ARCA(抗反向帽類似物)、修飾的ARCA(例如，硫代磷酸酯修飾的ARCA)、肌苷、N1-甲基-鳥苷、2’-氟代-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-側氧-鳥苷、2-胺基-鳥苷、LNA-鳥苷和2-疊氮基-鳥苷。

在一些實施方案中，該醫藥組成物含有：陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，該陽離子脂質與載體的莫耳百分比40-49%，

在一些實施方案中，該醫藥組成物含有：

a)活性劑；

b)陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，該陽離子脂質與載體莫耳百分比大於等於10%，且小於50%，

c)非陽離子脂質，該非陽離子脂質選自磷脂和膽固醇或其衍生物，其中該磷脂占載體莫耳量的5~40%，該膽固醇或其衍生物占載體莫耳量的30~60%；

和d)綴合脂質，該綴合物占載體莫耳量的0.5~4%。

在一些實施方案中，該醫藥組成物含有：

a)活性劑，該活性劑包含mRNA；

b)陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，該陽離子脂質與載體莫耳百分比大於等於10%，且小於50%，

c)非陽離子脂質，該非陽離子脂質選自磷脂DSPC和膽固醇，其中該磷脂DSPC占載體莫耳量的5~40%，該膽固醇占載體莫耳量的30~60%；

和d)綴合脂質，該綴合物占載體莫耳量的0.5~4%。

在一些實施方案中，該醫藥組成物含有：

a)活性劑，該活性劑包含mRNA；

b)陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，該陽離子脂質與載體的莫耳百分比大於等於10%，且小於50%，

c)非陽離子脂質，該非陽離子脂質選自磷脂DSPC和膽固醇，其中該磷脂DSPC占載體莫耳量的5~40%，該膽固醇占載體莫耳量的30~60%；

和d)綴合脂質DMG-PEG，該綴合物占載體莫耳量的0.5~2%。

在一些實施方案中，該醫藥組成物含有：

a)活性劑，該活性劑包含mRNA；

b)陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，該陽離子脂質與載體的莫耳百分比40-49%，

c)非陽離子脂質，該非陽離子脂質選自磷脂DSPC和膽固醇，其中該磷脂DSPC占載體莫耳量的10~15%，該膽固醇占載體莫耳量的35~42%；

和d)綴合脂質DMG-PEG，該綴合物占載體莫耳量的1~2%。

在一些實施方案中，該醫藥組成物含有：

a)活性劑，該活性劑包含mRNA；

b)陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，該陽離子脂質與載體的莫耳百分比45~49%，

c)非陽離子脂質，該非陽離子脂質選自磷脂DSPC和膽固醇，其中該磷脂DSPC占載體莫耳量的10~15%，該膽固醇占載體莫耳量的35~42%；

和d)綴合脂質DMG-PEG，該綴合物占載體莫耳量的1~2%。

另一方面，本揭露醫藥組成物為奈米顆粒製劑，該奈米顆粒製劑的平均粒徑為10nm~220nm。在一些實施方案，該奈米顆粒製劑的平均粒徑為100~150nm。在一些實施方案，該奈米顆粒製劑的平均粒徑為150~200nm。在一些實施方案，該奈米顆粒製劑的平均粒徑為80~160nm。在一些實施方案，該奈米顆粒製劑的平均粒徑為80~150nm。在一些實施方案，該奈米顆粒製劑的平均粒徑為70~160nm。

在一些實施方案中，該奈米顆粒平均粒徑採用動態光散射法測定。

本揭露還提供一種凍乾製劑，其由前述醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。在一些實施方案中，冷凍乾燥包括冷凍步驟、初級乾燥和二次乾燥步驟。在一些實施方案中，本揭露冷凍乾燥參照CN107567497A中方法進行，並將相關內容引入本文以示說明。

本揭露還提供一種複溶溶液，其由前述凍乾製劑經複溶的步驟獲得，其複溶所用溶劑為注射用水。

本揭露還提供前述醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液的製備方法，該方法包括將陽離子脂質、非陽離子脂質和綴合脂質在有機溶劑中混合的步驟。在一些實施方案中，該有機溶劑選自乙醇。

在一些實施方案中，製備醫藥組成物的方法參照期刊文獻(Pharm.Res.22(2005)362-372)或US9504651中方法製備，並將相關內容引入本文中以示說明。

本揭露還提供了前述醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液在製備用於在脊柱動物體內引起保護性免疫應答的藥物中用途。

本揭露還提供了前述醫藥組成物、凍乾製劑或複溶溶液在製備用於在哺乳動物中治療疾病或功能障礙的藥物中用途。在一些實施方案中，該疾病較佳自病毒感染(如冠狀病毒、流感病毒或HIV病毒引起的疾病)、肝疾病、癌症或皰疹。

術語

術語“脂質”是指一類有機化合物，其包括但不僅限於脂肪酸的酯，並且特徵是在水中不溶，但是在許多有機溶劑中是可溶的。通常將它們分成至少三類：(1)“簡單脂質”，其包括脂肪和油以及蠟；(2)“化合物脂質”，其包括磷脂和糖脂；和(3)“衍生的脂質”諸如類固醇。

術語“陽離子脂質”指在選定的pH值，諸如生理pH值(例如，pH為約7.0)下攜帶淨正電荷的許多脂質物種中的任何一種。

術語“陰離子脂質”指在生理pH值下帶負電荷的任何脂質。這些脂質包括，但不限於，磷脂醯甘油、心磷脂、二醯磷脂醯絲胺酸、二醯磷脂酸、N-十二烷醯磷脂醯乙醇胺、N-琥珀醯磷脂醯乙醇胺、N-戊二醯磷脂醯乙醇胺、賴胺醯磷脂醯甘油、棕櫚醯油醯磷脂醯甘油(POPG)，和其它與中性脂質連接的陰離子修飾基團。

術語“中性脂質”指在選定的pH值下以不帶電荷或中性兩性離子形式存在的許多脂質物種中的任何一種。在生理pH值下，這樣的脂質包括，例如，二醯磷脂醯膽鹼、二醯磷脂醯乙醇胺、神經醯胺、鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂和二醯甘油。

術語“兩親性脂質”部分地指任何適合的材料，其中脂質材料的疏水部分定向到疏水相中，而親水部分定向到水相。親水性質來自極性或帶電基團諸如糖類、磷酸根、羧基、硫酸根、胺基、統基、硝基、羥基和其它類似基團的存在。疏水性可以藉由包含非極性基團而賦予，該基團包括但不限於長鏈飽和和不飽和脂族烴基和由一個或多個芳族、脂環族或雜環基團取代的這樣的基團。兩親性化合物的實例包括但不限於磷脂、胺基脂和鞘脂類。

術語“非陽離子脂質”指任何兩親性脂質以及任何其他中性脂質或陰離子脂質。

術語“綴合脂質”指抑制脂質顆粒聚集的結合脂質。該綴合脂質包括，但不僅限於PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯基甘油、PEG修飾的二烷基甘油。

術語“哺乳動物”指任何哺乳動物物種諸如人、小鼠、大鼠、狗、貓、倉鼠、豚鼠、兔、家畜等。

“活性劑”是指當對受試者施用時具有治療、診斷和/或預防作用和/或引起所需的生物學和/或藥理學作用的任何藥劑。活性劑也被稱為“活性物質”或“治療劑”。這類藥劑包括但不限於細胞毒素、放射性離子、化療劑、小分子藥物、蛋白質和核酸。

術語“核酸”用於本文中時，指含有處於單鏈或雙鏈形式的至少兩個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。如本文所用的術語“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”同義。DNA可以採用下列形式：例如，反義分子、質粒DNA、預濃縮DNA、PCR產物、載體(P1，PAC，BAC，YAC，人工染色體)、表達盒、嵌合序列、染色體DNA、或這些組的衍生物和組合。RNA可以採用下列形式：小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、小髮夾RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、環狀RNA、自複製RNA。

“信使RNA”(mRNA)指的是編碼(至少一種)多肽(天然產生、非天然產生或改性的胺基酸聚合物)並且可藉由轉譯以體外、體內或離體產生經過編碼的多肽的任何多核苷酸。所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解，除另外說明以外，本揭露中該多核苷酸序列將在代表性DNA序列中表示“T”，但其中該序列表示RNA(例如，mRNA)，“T”將被“U”取代。因此，由特定序列識別號碼標識的DNA編碼的任何RNA多核苷酸也可包含由該DNA編碼的相應RNA(例如，mRNA)序列，其中該DNA序列的每個“T”被“U”取代。mRNA分子的基本組分通常包括至少一個編碼區、5′非轉譯區(UTR)、3′UTR、5′端帽和聚腺苷酸尾(聚-A尾)。本發明的多核苷酸可充當mRNA，但在其功能性和/或結構設計特徵方面區別於野生型mRNA，該特徵用以使用基於核酸的處理來克服有效多肽表達的現有問題。

術語“抗原”涵蓋將引發免疫應答的任何物質。特別是，“抗原”涉及任何物質，較佳為與抗體或T淋巴細胞(T細胞)特異性反應的肽或蛋白質。本揭露中，術語“抗原”包括包含至少一個表位的任何分子。較佳地，本文中抗原是這樣的分子，其(視需要地在加工後)誘導較佳地對抗原(包括表達該抗原的 細胞)特異的免疫反應。本文中，可使用對於免疫反應而言為候選物的任何合適的抗原，其中該免疫反應較佳地為細胞免疫反應。在一些實施方案的情況下，抗原較佳地被細胞、較佳被抗原呈遞細胞(包括病變細胞、特別是癌症細胞，在MHC分子的環境下)呈遞，這導致針對該抗原的免疫反應。較佳地，抗原是對應於或來源於天然抗原的產物。這種天然抗原包括腫瘤抗原。

術語“癌抗原”與“腫瘤抗原”或“腫瘤相關抗原”通用，其能夠刺激免疫應答，較佳針對抗原或特徵為表達該抗原以及較佳地呈遞該抗原之細胞(例如病變細胞，尤其是癌症細胞)的細胞應答。一些實施方案中，“癌抗原”在正常條件下在有限數目的組織和/或器官中或者在特定的發育階段中特異性表達(例如，腫瘤抗原可在正常條件下在胃組織中(較佳在胃黏膜中)、在生殖器官中(例如，在睾丸中)、在滋養層組織(例如，在胎盤)或在生殖系細胞中特異性表達)，並且在一種或更多種腫瘤或癌組織中表達或異常表達。一些實施方案中，“有限數目”是指不超過3，例如不超過2。

“多肽”、“蛋白”或“蛋白質”可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物，適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。除非另外說明，否則特定的多肽序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體。

術語“水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)”：是球形多層結構形式存在的α皰疹病毒，病毒基因體被覆蓋有非晶形層被膜蛋白的蛋白衣殼結構包圍。由病毒編碼蛋白和酶組成的被膜位於核鞘與病毒包膜之間的空間，病毒包膜由宿主細胞膜獲得並且含有病毒編碼的糖蛋白。

術語“VZV糖蛋白”，編碼糖蛋白gE、gI、gB、gH、gK、gL、gC、gN和gM在病毒複製週期的不同步驟中起作用。在感染細胞中以及在成熟 病毒粒子中發現最多的糖蛋白是糖蛋白E(gE、ORF 68)，它是病毒粒子包膜的主要組分並且為病毒複製所必需。糖蛋白I(gI，ORG 67)與gE在感染細胞中形成複合物，這有利於糖蛋白的胞吞作用並且將其引導至反式高基氏體網絡(TGN)，在此獲得最終的病毒包膜。在TGN中需要糖蛋白I(gI)進行VZV包膜並且在VZV複製期間進行有效膜融合。發現VZV gE和gI在感染宿主細胞表面上複合在一起。作為第二普遍的糖蛋白並且認為在病毒入口中發揮作用的糖蛋白B(ORF 31)與中和抗體結合。認為糖蛋白H具有融合功能，促使病毒在細胞和細胞之間傳播。gE、gB和gH的抗體在天然感染之後而且在疫苗接種後普遍存在，並且已證實在體外中和病毒活性。示例性的gE蛋白的胺基酸序列為本揭露的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：25中任一項所示。

術語野生型VZV gE蛋白的“突變體”、VZV gE蛋白的“突變體”、“VZV gE蛋白突變體”是指相對於野生型VZV gE蛋白展現引入的突變且具有針對野生型VZV gE蛋白的免疫原性的多肽。

術語“突變”是指與參照蛋白或多肽的胺基酸序列相比，蛋白或多肽的胺基酸序列中缺失、添加或取代胺基酸殘基。在說明書和申請專利範圍通篇中，在蛋白序列中的一個特定位置取代胺基酸使用註釋“(野生型蛋白中的胺基酸殘基)(胺基酸位置)(工程改造的蛋白中的胺基酸殘基)”來提及。例如，註釋Y75A是指參照蛋白的胺基酸序列的第75位的酪胺酸(Y)殘基被丙胺酸(A)殘基取代(在參照蛋白的突變體中)。在不同野生型序列間相同位置的胺基酸殘基中存在變異的情況下，該註釋中可省略位置編號之前的胺基酸代碼，諸如“75A”。

“密碼子優化”是指將目標序列中存在的在給定物種的高度表達的基因中一般罕見的密碼子替換為在這類物種的高度表達的基因中一般常見的 密碼子，而替換前後的密碼子編碼相同的胺基酸。各種物種對特定胺基酸的某些密碼子表現出特定的偏好。密碼子偏好(生物體之間密碼子使用的差異)通常與信使RNA(mRNA)的轉譯效率相關，繼而認為該信使RNA尤其取決於轉譯的密碼子的特性和具體的轉運RNA(tRNA)分子的利用度。選擇的tRNA在細胞中的優勢通常是肽合成中最常使用的密碼子的反映。因此，基於密碼子優化，基因可以針對給定生物體中的最佳基因表達進行修改。因此，最佳密碼子的選擇取決於宿主基因組的密碼子使用偏好。

如本領域中已知，術語“同一性”或“同源性”是指如藉由對比序列所測定的兩種或兩種以上多肽或多核苷酸的序列之間的關係。在本領域中，同一性還意謂如由兩個或兩個以上胺基酸殘基或核酸殘基串之間的匹配數所測定的其間的序列相關程度。同一性測量兩種或兩種以上序列中具有由特定數學模型或計算機程序(例如，“算法”)提出之間隙比對(如果存在)的較小者之間的一致匹配百分比。“同一性%”在適用於多肽或多核苷酸序列時定義為在比對序列和必要時引入間隙以達成最大同一性百分比後，候選胺基酸或核酸序列中與第二序列的胺基酸序列或核酸序列中的殘基一致的殘基(胺基酸殘基或核酸殘基)百分比。用於比對的方法和計算機程序在本領域中熟知。應瞭解，同一性取決於同一性百分比的計算，但由於計算中引入之間隙和罰分而其值可不同。通常，如藉由本文該且所屬技術領域中具有通常知識者已知的序列比對程序和參數所測定，特定多核苷酸或多肽的變體與彼特定參考多核苷酸或多肽具有至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、但小於100%的序列同一性。用於比對的此類工具包括BLAST試劑盒的那些工具(Stephen F.Altschul，等 人(1997)，“GappedBLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。另一種受歡迎的局部比對技術是基於Smith-Waterman算法(Smith，T.F.和Waterman，M.S.(1981)“Identification of commonmolecular subsequences.”J.Mol.Biol.147：195-197)。基於動態程序設計的通用全域比對技術為Needleman-Wunsch算法(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)“A generalmethod applicable to the search for similarities in the amino acid sequencesof two proteins.”J.Mol.Biol.48：443-453)。最近已研發出一種快速優化全域序列比對算法(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm，FOGSAA)，據稱其比其他優化全域比對方法(包括Needleman-Wunsch算法)更快地產生對核苷酸和蛋白序列的全域比對。本文中描述其他工具，尤其在下文“同一性”的定義中。

術語“疫苗”涉及藥物製備物(醫藥組成物)或產品，其在施用後誘導識別並攻擊病原體(包括病毒或細菌)或病變細胞如癌症細胞的免疫應答，特別是細胞免疫應答。疫苗可用於預防或治療疾病，例如用於預防病毒感染或治療癌症。

術語“5'非轉譯區元件”(5'UTR)指的是直接位於起始密碼子(即，由核糖體轉譯的mRNA轉錄物的第一密碼子)上游(即，5’)的不編碼多肽的mRNA區域。

術語“3'非轉譯區元件”(3'UTR)指的是直接位於終止密碼子(即，表示轉譯終止的mRNA轉錄物的密碼子)下游(即，3')的不編碼多肽的mRNA區域。

術語“開放閱讀框架”(ORF)是由起始密碼子(例如，甲硫胺酸(ATG))開始並以終止密碼子(例如，TAA、TAG或TGA)結束的DNA連續延伸段並且編碼蛋白或多肽。

術語“聚腺苷酸(polyA)尾”是位於含有多個連續單磷酸腺苷的3’UTR下游，例如直接位於其下游(即3’)的mRNA區域。聚腺苷酸尾可含有10至300個單磷酸腺苷。例如，聚腺苷酸尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個單磷酸腺苷。在一些實施方案中，聚腺苷酸尾含有50至250個單磷酸腺苷。在一種相關生物的情境中(例如，在細胞中、體內)，聚(腺苷酸)尾用來保護mRNA以免酶促降解，例如在細胞質中，並且有助於轉錄終止和/或由核輸出mRNA並轉譯。

本揭露所述“平均粒徑”(Z-average Size)例如“平均粒徑小於2000nm”是光強平均值，由不同種類粒子所貢獻的光強計算而得。該“平均粒徑”可藉由所屬技術領域中具有通常知識者熟知的常規粒度測量技術測量顆粒的平均粒徑。這樣的技術包括沉降場流分級、光子相關光譜、光散射等。

本揭露多分散係數“PDI”(Polydispersity Index)體現了粒子粒徑均一程度，是粒徑表徵的一個重要指數。

術語“混入”、“混合”表示的意思是不限定組分的加入順序，例如將A混入B，可以表達A加入B的意思，也可以表達B加入A的意思，將A和B混合，可以表達A加入B混合的意思，也可以表達B加入A混合的意思。

本揭露中數值為儀器測量值，存在一定程度的誤差，一般而言，正負10%均屬合理誤差範圍內。當然需要考慮該數值所用之處的上下文，例如，活性成分的粒徑，該數值為測量後誤差變化不超過正負10%，可以為正負9%、正負8%、正負7%、正負6%、正負5%、正負4%、正負3%、正負2%或正負1%，較佳正負5%。

本揭露式I化合物參照WO2023125738中方法製備，並將相關內容本揭露以示說明。

本揭露用於測試的mRNA為螢光素酶mRNA。

圖1為脂質組合物1-15對應的脂質體奈米顆粒的體在HEK293細胞轉染後的螢光素酶蛋白表達量。

圖2為脂質組合物4℃粒徑穩定性。

圖3為脂質組合物25℃粒徑穩定性。

圖4為VZV mRNA體外活性表達檢測。

圖5為血清anti-VZV gE IgG檢測。

以下結合實施例進一步描述本揭露中，但這些實施例並非限制本揭露中的範圍。

本揭露中實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1

步驟1)

稱取6-胺基己酸(21.5g,100mmol)溶於乙醇和水的混合液(EtOH/H₂O,v/v=2：1,200mL)，加入CsOH‧H₂O(4.0g,100mmol)，加入苄氧溴乙烷(13.1g,100mmol)，室溫反應40h，濃縮除去絕大部分乙醇，殘留物直接反相管柱層析(乙腈/水/0.1%三氟乙酸)，直接濃縮，抽乾，得到白色固體5.6g，收率：21%。

MS：266.2[M+H]⁺。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ 7.36(s,5H),4.53(s,2H),3.72-3.67(m,2H),3.20-3.14(m,2H),2.95-2.88(m,2H),2.10(t,J=7.3Hz,2H),1.57(dd,J=15.3,7.7Hz,2H),1.47(dd,J=15.0,7.5Hz,2H),1.30-1.22(m,2H).

步驟2)

稱取6-((2-(苄氧)乙基)胺基)己酸(5.6g，21.1mmol)於反應瓶中，加入1,4-二噁烷(80mL)，氫氧化鈉水溶液(42.2mL,1.0M)，滴加Boc₂O(5.5g, 25.2mmol)，室溫反應1h，LC-MS顯示反應完畢，濃縮掉二噁烷，水相用稀鹽酸調PH至5左右，乙酸乙酯萃取(50mL*3)，合併有機相，乾燥，濃縮，得到近無色膠狀物7.2g，收率93%。直接用於下一步反應。

MS：366.2[M+H]⁺。

步驟3)

稱取6-((2-(苄氧)乙基)(叔丁氧羰基)胺基)己酸(6.1g，16.7mmol)於反應瓶中，加二氯甲烷(150mL)，冰浴，依次加入十一醇(2.73g，15.9mmol)，DMAP(408mg，3.34mmol)及DIPEA(4.3g,33.4mmol)，加入EDCI(3.84g,20.0mmol)，攪拌10分鐘，撤冰浴，室溫反應過夜，TLC監測，反應完畢，向反應液加入水(100mL)，分液，有機相依次用稀鹽酸洗，水洗，碳酸氫鈉洗，乾燥，濃縮，管柱層析(PE：EtOAc=20：1~10：1)，得到近無色膠狀物6.8g，收率82%。

MS：520.4[M+H]⁺。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.30-7.20(m,5H),4.44(s,2H),3.98(t,J=6.7Hz,2H),3.51(d,J=18.6Hz,2H),3.32(d,J=21.5Hz,2H),3.16(s,2H),2.21(t,J=7.5Hz,2H),1.55(tt,J=13.3,6.8Hz,6H),1.36(d,J=8.4Hz,9H),1.21(d,J=15.5Hz,18H),0.81(t,J=6.8Hz,3H).

步驟4)

稱取6-((2-(苄氧)乙基)(叔丁氧羰基)胺基)己酸十一酯(7.6g，14.6mmol)溶液二氯甲烷中，加入TFA(20mL)，室溫反應2h，直接濃縮，殘留物用二 氯甲烷(100mL)溶解，加入飽和碳酸氫鈉(100mL)，分液，有機相乾燥，濃縮，得到膠狀物，再用二氯甲烷溶解，加入HCl/dioxane(4.0M,4mL)，直接濃縮，得到白色固體5.0g，收率81%。

MS：420.3[M+H]⁺。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 9.51(s,2H),7.39-7.28(m,5H),4.57(s,2H),4.03(t,J=6.8Hz,2H),3.88(t,J=4.8Hz,2H),3.18(s,2H),3.03(d,J=3.4Hz,2H),2.28(t,J=7.4Hz,2H),2.02(s,1H),1.93-1.84(m,2H),1.61(dd,J=13.8,6.7Hz,4H),1.42-1.17(m,18H),0.88(t,J=6.8Hz,3H).

步驟5)

稱取2-((5-(苄氧基)戊基)氧基)乙酸(製備文獻Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1992,vol.40,# 3,p.617-623)(7.6g，30.12mmol)於反應瓶中，加二氯甲烷(150mL)，冰浴，依次加入十七-9-醇(參照文獻WO2020/219876製備)(6.18g，24.1mmol)，DMAP(3.68g，30.12mmol)，加入EDCI(6.93g,36.14mmol)，攪拌10分鐘，撤冰浴，室溫反應過夜，TLC監測，反應完畢，向反應液加入水(100mL)，分液，有機相依次用稀鹽酸洗，水洗，碳酸氫鈉洗，乾燥，濃縮，管柱層析(PE：EtOAc=50：1~10：1)，得到近無色膠狀物10.9g，收率92%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.36-7.31(m,4H),7.30-7.26(m,1H),4.96(p,J=6.3Hz,1H),4.50(s,2H),4.04(s,2H),3.52(t,J=6.6Hz,2H),3.47 (t,J=6.6Hz,2H),1.69-1.61(m,4H),1.56(d,J=16.5Hz,6H),1.25(s,24H),0.88(t,J=6.8Hz,6H).

步驟6)

稱取十七烷-9-基2-((5-(苄氧基)戊基)氧基)乙酸酯(4.0g，8.15mmol)溶於THF(100mL)中，加入Pd(OH)₂/C(400mg,20%)，通入氫氣，室溫反應2h，TLC監測，反應完畢。過濾，濃縮。得到無色膠狀物3.2g，收率98%。直接用於下一步反應。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 4.97(dd,J=12.4,6.1Hz,1H),4.04(s,2H),3.66(t,J=6.5Hz,2H),3.54(t,J=6.5Hz,2H),1.71-1.57(m,4H),1.56-1.42(m,6H),1.25(s,24H),0.88(t,J=6.8Hz,6H).

步驟7)

稱取十七烷-9-基2-((5-羥基戊基)氧基)乙酸酯(2.4g，6.0mmol)溶於二氯甲烷(100mL)中，冰浴下，加入DMP(3.82g,9.0mmol)，室溫反應1.5h，加入飽和硫代硫酸鈉水溶液(100mL)，攪拌30分鐘，分液，有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液洗(100mL*2)，乾燥，濃縮，得到淺黃色膠狀物2.5g，超重，直接用於下一步反應。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 9.78(s,1H),4.96(p,J=6.3Hz,1H),4.04(s,2H),3.55(t,J=6.1Hz,2H),2.49(td,J=7.2,1.5Hz,2H),1.81-1.72(m,2H),1.68(d,J=7.6Hz,2H),1.60-1.48(m,4H),1.26(s,24H),0.88(t,J=6.8Hz,6H).

步驟8)

稱取十七烷-9-基2-((5-側氧戊基)氧基)乙酸酯(2.4g，6mmol)溶於二氯甲烷(50mL)，加入6-((2-(苄氧)乙基)胺基)己酸十一酯鹽酸鹽(2.46g,5.4mmol)，加入DIPEA(1.16g,9.0mmol)，乙酸(1.08g,18.0mmol)，攪拌溶清，冰浴，加入NaBH(OAc)₃(3.18g,15.0mmol)，室溫反應過夜，TLC監測，反應完畢，加水(100mL)，分液，有機相用飽和碳酸氫鈉水溶液洗(50mL*1)，乾燥，濃縮，管柱層析(PE：EtOAc=5：1~2：1)，得到無色液體4.1g，收率：85%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 7.33(d,J=4.5Hz,4H),7.30-7.26(m,1H),4.99-4.91(m,1H),4.52(s,2H),4.08-4.02(m,4H),3.57-3.47(m,4H),2.68(t,J=5.8Hz,2H),2.45(s,4H),2.28(t,J=7.5Hz,2H),1.67-1.57(m,6H),1.48(dd,J=37.5,6.0Hz,6H),1.38-1.18(m,46H),0.88(t,J=6.8Hz,9H).

步驟9)

稱取十一烷基6-((2-(苄氧基)乙基)(5-(2-(十七烷-9-基氧基)-2-側氧乙氧基)戊基)胺基)己酸酯(1g,1.25mmol)於反應瓶中，加入乙醇溶解，加入Pd(OH)₂/C(500mg,20%)，通入氫氣，室溫反應過夜，TLC監測，反應完畢。過濾，濃縮。得到無色膠狀物，管柱層析(CH₂Cl₂：MeOH=10：1)，得到無色膠狀物450mg，收率51%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 5.00-4.89(m,1H),4.09-4.01(m,4H),3.61(s,2H),3.52(t,J=6.4Hz,2H),2.68(s,2H),2.57(s,4H),2.30(t,J=7.4Hz,2H),1.70-1.59(m,6H),1.53(s,8H),1.43-1.18(m,44H),0.88(t,J=6.7Hz,9H)。

實施例2：

LNP脂質顆粒的製備

分別將化合物1(式I化合物)、DSPC、膽固醇、DMG-PEG 2000溶液，以一定莫耳百分比混合(mol%)，即各組分莫耳量占載體總莫耳量的百分比，混合配製乙醇脂質溶液。四組分的莫耳比按表1中所示進行配製。將編碼螢光素酶蛋白的mRNA(其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示)溶於50mM pH 4乙酸鹽緩衝液，配製mRNA水溶液。將乙醇脂質溶液和mRNA水溶液藉由微流控按1：3體積比混合，其中化合物1與mRNA的重量比為12：1製備脂質體。在20mM Tris溶液中透析除去乙醇，最後置換到20mM Tris 8%蔗糖溶液中，得到包封mRNA的脂質體奈米顆粒組成物。

脂質顆粒組合物表徵

表徵方法

使用Malvern Zetasizer Pro，以173°反向散射檢測模式，利用動態光散射檢測脂質體奈米顆粒的奈米粒徑和多分散係數PDI。

使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit RNA定量檢測試劑盒，測定脂質體包封率。

表1

測試例1：評估脂質顆粒組合物載體遞送mRNA效率

檢測脂質組合物1-15對應的脂質體奈米顆粒的在細胞中遞送mRNA後的蛋白表達量。

將HEK 293細胞接種到96孔板培養過夜，待細胞密度達到80%以上，將包封螢光素酶mRNA的脂質奈米顆粒溶液加入到細胞板孔培養基中，mRNA劑量為100ng/孔。24小時後，使用螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega)和酶標儀檢測表達螢光素酶蛋白的螢光強度。螢光強度值即酶標儀檢測到的螢光數值，代表螢光素酶蛋白的表達量，強光強度越高即蛋白表達量越高。每個化 合物對應的脂質奈米顆粒至少3組重複計算平均螢光值強度，數據見表2和圖1。

表2

測試例2：評估脂質顆粒組成物的穩定性

分別將脂質組合物1-15對應的脂質奈米顆粒置於4℃和25℃環境中，放置3天後分別檢測各組脂質奈米顆粒的粒徑，比較保存過程中的粒徑變化大小，代表脂質奈米顆粒的穩定性。粒徑變化大，即穩定性差。每組重複檢測3次，計算平均粒徑，如表3所示。分別計算4℃和25℃粒徑與脂質奈米顆粒初始粒徑的差值。差值偏離0點越小即在保存期內粒徑變化越小，脂質奈米顆粒更穩定。如表3所示，4℃和25℃環境中放置3天後，動態光散射檢測粒徑的大小的多分散係數。表4和圖2-3所示粒徑變化的大小。

表3

表4

實施例3：mRNA疫苗的製備

本揭露中，我們製備了多種mRNA產品，示例性的出示了VZV mRNA疫苗。以下為其製備和驗證例。

3.1 VZV mRNA疫苗DNA模板的設計和合成

為了在人細胞中提高VZV gE蛋白表達和其結構的穩定性，本實施例進行了密碼子優化，並設計了編碼Oka株gE蛋白的不同C末端變異體分子，其中，該Oka株gE蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。我們設計了6個gE分子，分別為：gE1(Oka gE，1-546aa)、gE2(Oka gE，1-574aa & Y569A)、gE3(Oka gE，1-544aa)、gE4(Oka gE，1-574aa)、gE5(Oka gE，1-561aa)和1個全長gE6(Oka gE，1-623aa)，該gE1-gE6分子的胺基酸序列及其編碼核酸序列如表5所示，其中gE1-gE5為C末端截短gE分子。

表5 VZV mRNA疫苗序列

還設計T7啟動子序列(TAATACGACTCACTATAAG)、5'-UTR序列(其對應RNA序列如SEQ ID NO：9)、3'-UTR序列(其對應RNA序列如SEQ ID NO：10)和poly(A)序列(其對應RNA序列如SEQ ID NO：11)。

然後按照T7啟動子序列、5'-UTR序列、DNA ORF、3'-UTR序列和poly(A)序列的順序連接，以pUC57為載體進行全基因合成(蘇州金唯智生物科技有限公司)，獲得質粒DNA模板。

3.2 VZV mRNA疫苗mRNA原液的製備

以實施例3.1獲得的質粒DNA經XbaI酶切，純化獲取線性化質粒DNA，藉由T7 RNA聚合酶進行共轉錄加帽(Cap1型)反應，進行體外轉錄以 生產所需RNA。體外轉錄中使用(1-甲基)-假尿苷-三磷酸代替三磷酸尿苷(UTP)，轉錄結束後，使用DNaseI消化DNA模板，以降低殘餘DNA模板帶來的風險。使用AKTA對mRNA進行純化，將純化的mRNA溶解於無菌水中，並在-80℃下冷凍保存直至使用。

3.3 VZV mRNA疫苗mRNA-LNP製劑的製備

將化合物1(式I化合物)、DSPC、膽固醇、DMG-PEG 2000以48：10：40.5：1.5的莫耳比溶於乙醇配製脂質溶液。將mRNA溶於50mM pH 4乙酸緩衝液，配製mRNA水溶液。將乙醇脂質溶液和mRNA水溶液藉由微流控按體積比1：3混合，脂質中化合物1與mRNA的重量為12：1製備脂質奈米粒。在20mM Tris pH 7.5溶液中透析除去乙醇，最後置換到20mM Tris 8%蔗糖溶液中凍存，得到包封mRNA的脂質奈米粒，並在-80℃下冷凍保存直至使用。

實施例4：VZV mRNA疫苗在細胞中的表達及其在小鼠中的免疫原性

4.1 VZV mRNA疫苗的體外表達活性檢測

HEK 293T細胞(人腎上皮細胞系)在添加了10% FBS和1%青黴素-鏈黴素的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)中，在37℃和5% CO2條件下培養。首先地，我們在HEK293細胞中驗證了以30L70A為poly A設計的6個gE-LNP mRNAs的體外表達。本實施例使用如實施例3製備了利用(1-甲基)-假尿苷-三磷酸代替UTP的含30L70A的6個gE-mRNA LNPs液體製劑，核苷酸序列分別為gE1-LNP(SEQ ID NO：13)，gE2-LNP(SEQ ID NO：14)，gE3-LNP(SEQ ID NO：15)，gE4-LNP(SEQ ID NO：16)，gE5-LNP(SEQ ID NO：17)和gE6-LNP(SEQ ID NO：18)。

將HEK-293T細胞鋪在六孔板中，HEK-293T細胞每孔種1.2×10⁶個細胞，37℃培養箱孵育18-24小時；將含1μg mRNA的gE-mRNA LNPs製劑直接加入到HEK-293T細胞中，繼續孵育24小時，收集培養上清或細胞沉澱進行Western Blot檢測，Western Blot檢測使用的mouse anti-VZV gE Ab購於Abcam，Goat anti-mouse IgG HRP Ab購於TransGen。Western Blot結果如圖4所示，結果顯示：1)6個gE-mRNA-LNPs均能表達出對應的gE蛋白；2)保留C端跨膜區的gE2，gE4，gE5和gE6以gE2，gE5和gE6的體外表達活性相對較高。

4.2 VZV mRNA疫苗免疫C57小鼠

本實施例使用雌性，6~8週齡的C57小鼠。動物研究嚴格按照《上海實驗動物飼養管理和使用指南》中的建議進行。

本實施例使用如實施例4.1製備的6條gE-LNP mRNAs製劑免疫C57小鼠，評估其在小鼠中誘導的gE特異性抗體水平。

將小鼠隨機分為7組(n=7)，其中6組分別施用如實施例3製備的gE-LNP mRNAs製劑免疫(單次劑量為含2μg mRNA的gE-mRNA LNPs製劑)；另一組施用磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)作為陰性對照組。各組藉由肌肉注射分別在第0天(初免)和第14天(二免)施用。在小鼠二免後的第14天(即第28天)眼眶取血收集小鼠血清，進行抗體檢測。

血清anti VZV gE IgG檢測(gPELISA法)如下：使用ELISA coating Buffer稀釋VZV-gE antigen(ACROBiosystems)，配置成0.25μg/mL，使用排槍，每孔加100μL 0.25μg/mL VZV-gE antigen，4℃，孵育過夜；待檢測樣品室溫平衡30分鐘，將板在PBST(0.05% Tween-20)中洗滌，並用PBST中的5%脫脂奶封閉。使用含2.5%脫脂奶粉稀釋樣品血清，起始稀釋滴度為1：50，後以2倍 比稀釋待檢血清樣品，在每塊板中設置陰性血清對照。加入稀釋的血清樣品，每孔100μl，37℃(恆溫箱)孵育1小時；棄去血清樣品，使用排槍，每孔加入250μl PBST洗液，洗滌3次；每孔加入100μl稀釋50000倍的goat anti-mouse IgG HRP(abcam)，37℃(恆溫箱)孵育0.5小時；棄去二抗，使用排槍，每孔加入300μl PBST洗液，洗滌5次；清洗後，每孔加入100μl 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)(ebioscience)顯色液避光顯色5分鐘；每孔加入100μl 2N H2SO4終止反應並檢測；使用酶標儀(BioTek)在450nm波長處讀取OD值。將終點滴度確定為最後一次稀釋血清的倒數。樣品OD450nm大於2.1倍陰性對照組OD450nm判定為陽性值。結果如圖5所示，結果顯示這6種gE LNP-mRNA分子誘導了相當的體液免疫水平。

本揭露部分序列如下所示：

>Oka株gE蛋白的胺基酸序列

SEQ ID NO：1

>Oka株gE蛋白的核苷酸序列

SEQ ID NO：2

>gE1核苷酸序列

SEQ ID NO：3

>gE2核苷酸序列

SEQ ID NO：4

>gE3核苷酸序列

SEQ ID NO：5

>gE4核苷酸序列

SEQ ID NO：6

>gE5核苷酸序列

SEQ ID NO：7

>gE6核苷酸序列

SEQ ID NO：8

>5'UTR

GAGUUAGGAGUUGGUGGCAGUUUCAAUAACAGGUCAUUGCCGAGAAAAGGAUAGCACUAUAAU SEQ ID NO：9

>3'UTR

SEQ ID NO：10

>30L70A polyA

SEQ ID NO：11

>120A polyA

SEQ ID NO：12

>gE1(30L70A)mRNA序列

SEQ ID NO：13

>gE2(30L70A)mRNA序列

SEQ ID NO：14

>gE3(30L70A)mRNA序列

SEQ ID NO：15

>gE4(30L70A)mRNA序列

SEQ ID NO：16

>gE5(30L70A)mRNA序列

SEQ ID NO：17

>gE6(30L70A)mRNA序列

SEQ ID NO：18

>gE2 120A mRNA序列

SEQ ID NO：19

>gE6 120A mRNA序列

SEQ ID NO：20

>gE1胺基酸序列

SEQ ID NO：21

>gE2胺基酸序列

SEQ ID NO：22

>gE3胺基酸序列

SEQ ID NO：23

>gE4胺基酸序列

SEQ ID NO：24

>gE5胺基酸序列

SEQ ID NO：25

>螢光素酶mRNA序列

SEQ ID NO：26

TW202500165A_113124438_SEQL.xml

Claims (19)

1. 一種醫藥組成物，其包含載體，該載體包含有陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，陽離子脂質與載體莫耳百分比大於等於10%，且小於50%，

   
2. 如請求項1所述的醫藥組成物，其中該載體還含有非陽離子脂質，該非陽離子脂質選自磷脂、膽固醇或其衍生物中的至少一種。
3. 如請求項2所述的醫藥組成物，其中該磷脂選自1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-雙十一烷醯基-sn-甘油-磷酸膽鹼(DUPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18：0 Diether PC)、1-油醯基-2-膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-rac- (1-甘油)鈉鹽(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、二硬脂醯基-磷脂醯-乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂醯基-2-油醯基-硬脂醯乙醇胺(SOPE)、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯膽鹼(SOPC)、鞘磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯乙醇胺(LPE)以及其混合物，較佳1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)或1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
4. 如請求項2或3所述的醫藥組成物，其中該磷脂的含量占載體莫耳量的5~40%，較佳10~20%，例如10%。
5. 如請求項2至4中任一項所述的醫藥組成物，其中該膽固醇或其衍生物占載體莫耳量的30~60%，較佳35~45%，例如40.5%。
6. 如請求項1至5中任一項所述的醫藥組成物，其中該載體還含有綴合脂質，該綴合脂質較佳PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯基甘油、PEG修飾的二烷基甘油，更佳二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻醯甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇雙十四烷基乙醯胺(ALC-0159)。
7. 如請求項6所述的醫藥組成物，其中該綴合脂質占載體莫耳量的0.5~4%，較佳1.5~2.5%，例如1.5%。
8. 如請求項1至7中任一項所述的醫藥組成物，其中含有活性劑，該活性劑選自核酸，較佳核糖核酸或脫氧核糖核酸，更佳小干擾RNA、微RNA、小髮卡RNA、信使RNA(mRNA)、環狀RNA、自複製RNA以及其混合物。
9. 如請求項8所述的醫藥組成物，該mRNA包含開放閱讀框(ORF)，該ORF編碼蛋白或多肽；

   較佳地，該mRNA還包含5’非轉譯區元件(5’UTR)、3’非轉譯區元件(3’UTR)、多聚腺苷酸(poly-A)尾的任一或其任意組合；

   較佳地，該mRNA還包含5’帽結構(5'Cap)。
10. 如請求項9所述的醫藥組成物，其中，該蛋白或多肽為抗原，

    較佳地，該抗原選自病毒抗原、細菌抗原、癌抗原；

    更佳地，該病毒毒株選自流感病毒、冠狀病毒、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、呼吸道合胞病毒(RSV)。
11. 如請求項10所述的醫藥組成物，其中，該抗原為水痘帶狀皰疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：25中任一項所示；

    較佳地，該抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：8中任一項所示；

    更佳地，該mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：20中任一項所示。
12. 如請求項9所述的醫藥組成物，其中，該蛋白或多肽為肝細胞生長因子(HGF)、抗體或其抗原結合片段。
13. 如請求項1至12中任一項所述的醫藥組成物，其中含有

    a)活性劑，較佳mRNA；

    b)陽離子脂質，該陽離子脂質包含式I所示化合物或其可藥用鹽，該陽離子脂質與載體莫耳百分比大於等於10%，且小於50%，

    

    c)非陽離子脂質，該非陽離子脂質選自磷脂和膽固醇或其衍生物，其中該磷脂占載體莫耳量的5~40%，該膽固醇或其衍生物占載體莫耳量的30~60%；

    和d)綴合脂質，該綴合物占載體的莫耳百分含量為0.5~4%。
14. 如請求項1至13中任一項所述的醫藥組成物，其為奈米顆粒製劑，該奈米顆粒製劑的平均粒徑為10nm~220nm。
15. 一種凍乾製劑，其由如請求項1至14中任一項所述的醫藥組成物經冷凍乾燥獲得。
16. 一種複溶溶液，其由如請求項15所述的凍乾製劑經複溶的步驟獲得，其複溶所用溶劑較佳注射用水。
17. 一種製備如請求項1至14中任一項所述的醫藥組成物的方法，包括：將陽離子脂質、非陽離子脂質和綴合脂質在有機溶劑中混合的步驟。
18. 一種如請求項1至14中任一項所述的醫藥組成物、如請求項15所述的凍乾製劑或、如請求項16所述的複溶溶液在製備用於在哺乳動物體內引起保護性免疫應答的藥物中用途，較佳製備疫苗的用途。
19. 一種如請求項1至14中任一項所述的醫藥組成物、如請求項15所述的凍乾製劑或、如請求項16所述的複溶溶液在製備用於在哺乳動物中治療疾病或功能障礙的藥物中用途，該疾病較佳病毒感染、癌症。