JP2019178096A - プロスタグランジンｅ２産生抑制用組成物及びアグリカナーゼ１（ａｄａｍｔｓ−４）産生抑制用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】日常的に安全に摂取でき、プロスタグランジンＥ２の産生を抑制し得る機能性素材、及びアグリカナーゼ１の産生を抑制し得る機能性素材、並びに、これらを利用した医薬組成物及び飲食品組成物を提供することを目的とする。【解決手段】シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分とするプロスタグランジンＥ２産生抑制用組成物である。また、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分とするアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制用組成物である。【選択図】なし

Description

本発明は、プロスタグランジンＥ２産生抑制用組成物及びアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制用組成物に関する。

変形性関節症（Osteoarthritis; OA）は、関節軟骨の変形や破壊により関節に炎症が起こり、痛みや腫れをきたす疾患である。変形性関節症では、関節の変形や運動痛、可動域制限等により、本来の関節の滑らかな動きが障害され、起立や歩行に大きな影響を与えるため、生活の質（Quality of Life; QOL）を著しく低下させる。

変形性関節症は、例えば、体内で炎症や痛み等を引き起こす物質であるプロスタグランジンＥ２（Prostaglandin E2; 以下、「ＰＧＥ２」とも記載する。）が関与することが知られている。ＰＧＥ２はサイトカイン、増殖因子等の存在によって様々な細胞から産生され、様々な生理活性を示す。ＰＧＥ２は破骨細胞に作用し、その分化や活性化を誘導して骨吸収作用を促進する（非特許文献１）。

また、関節軟骨の主要構成要素であるＩＩ型コラーゲンとアグリカンの分解に寄与している蛋白質分解酵素が、変形性関節症における関節軟骨の変形、破壊に関与していることが知られている。このような蛋白質分解酵素として、メタロプロテアーゼ類、とくにマトリックスメタロプロテアーゼ(matrix metalloproteinase: 以下、「ＭＭＰ」とも記載する。)及びアグリカナーゼ(a distintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-like repeat: 以下、「ＡＤＡＭＴＳ」とも記載する。)が重要であることが知られている（非特許文献２）。

プロスタグランジンＥ２の産生を抑制する化合物として、例えばクービ、ハイビスカス等の植物の抽出物が知られている（特許文献１）。また、ＭＭＰと、アグリカナーゼのうちアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）及びアグリカナーゼ２（ＡＤＡＭＴＳ−５）の産生を抑制する化合物として、クスノキ科ゲッケイジュ属の葉の抽出物が知られている（特許文献２）。

ところで、植物ステロールのうち、シクロラノスタン骨格を有する化合物やロフェノール骨格を有する化合物が、ＭＭＰの産生を阻害し、ＭＭＰの活性により引き起こされる症状を予防又は改善するのに有効であることが知られている（特許文献３）。
しかしながら、これらの化合物のプロスタグランジンＥ２産生及びアグリカナーゼ産生に対する作用は一切知られていなかった。

日本内科学会雑誌，第８７巻，第１２号，第５８−６５頁，１９９８ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｗｏｍｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ，Ｖｏｌ．９，ｐ．４６−５０，２００８

特許第６２９０３５３号公報 特開２０１６−１７９９４７号公報 国際公開第２０１６／０８４９５７号

特許文献１、２に開示されているように、プロスタグランジンＥ２産生抑制及びアグリカナーゼ１産生抑制の作用を示す素材が提案されている中、安全に摂取できる素材の開発が更に求められていた。

本発明は前記事情に鑑みてなされたもので、日常的に安全に摂取でき、プロスタグランジンＥ２の産生を抑制し得る機能性素材、及びアグリカナーゼ１の産生を抑制し得る機能性素材、並びに、これらを利用した医薬組成物及び飲食品組成物を提供することを目的とする。

前記課題を解決する本発明は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分とするプロスタグランジンＥ２産生抑制用組成物である。

また、前記課題を解決する本発明は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分とするアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制用組成物である。

さらに、前記組成物において、シクロラノスタン化合物は９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される１又は複数の化合物であり、並びに、ロフェノール化合物は４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールからなる群から選択される１又は複数の化合物である。

前記組成物が医薬組成物又は飲食品組成物であることが好ましい。

本発明によれば、日常的に安全に摂取でき、プロスタグランジンＥ２の産生を抑制し得る機能性素材、及びアグリカナーゼ１の産生を抑制し得る機能性素材、並びに、これらを利用した医薬組成物及び飲食品組成物を提供することができる。

次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。

本発明の組成物は、シクロラノスタン化合物（化合物１）及びロフェノール化合物（化合物２）からなる群から選択される化合物を有効成分として含有する。

［シクロラノスタン化合物］
シクロラノスタン化合物（シクロラノスタン骨格を有する化合物）は、以下の一般式（１）で表される。

一般式（１）において、Ｒ１は炭素原子数６〜８の、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基、２重結合を１つ又は２つ含むアルケニル基、又はこれらのアルキル基及びアルケニル基の水素原子の１つ又は２つがヒドロキシル基及び／若しくはカルボニル基で置換された置換アルキル基又は置換アルケニル基であり、Ｒ２、Ｒ３は各々独立に水素原子又はメチル基であり、Ｒ４は環を構成する炭素原子とともにＣ＝Ｏを形成するか、又は下記式の何れかである。

前記一般式（１）において、Ｒ１は、下記式で表される基の何れかであることが好ましい。

好ましいシクロラノスタン化合物としては、９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールが挙げられる。各化合物は、それぞれ、以下の式（２）及び（３）で表される構造を有する。

シクロラノスタン化合物は、公知の製造方法に準じて化学的に製造することができる。例えば、式（３）で表される２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール（慣用名：２４−メチレンシクロアルタノール）は、特開昭５７−０１８６１７号公報に開示される方法にて製造することが可能である。また、シクロラノスタン化合物は、特開２００３−２７７２６９号公報に開示される方法にて、γ−オリザノールからのシクロアルテノールフェルレート（式（４））の加水分解物を出発物質として製造することが可能である。

また、シクロラノスタン化合物は、ユリ科、マメ科、イネ科、ナス科及びバショウ科等の植物に含まれていることが知られている（〔フィトケミストリー（Phytochemistry）、米国、１９７７年、第１６巻、第１４０〜１４１ページ〕、〔ハンドブック・オブ・フィトケミカル・コンスティチュエンツ・オブ・ＧＲＡＳ・ハーブ・アンド・アザー・エコノミック・プランツ（Handbook of phytochemical constituents of GRAS herbs and other economic plants）、１９９２年、米国、シーアールシープレス〕、又は〔ハーゲルズ・ハントブーフ・デア・ファルマツォイティシェン・プラクシス（Hager's Handbuch derPharmazeutischen Praxis）、第２〜６巻、１９６９〜１９７９年、ドイツ、シュプリンガー・フェアラークベルリン〕参照）。よって、これらの植物より、有機溶媒抽出法又は熱水抽出法等の方法を用いて抽出することも可能である。
また、シクロラノスタン化合物は、微生物等を利用して生物学的に製造してもよい。あるいは、微生物由来の酵素を用いて製造しても良い。
前記のようにして製造した化合物は、例えば、マススペクトル（ＭＳ）法、及び核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）法等によって、その分子量や構造等を決定又は確認することができる。

また、シクロラノスタン化合物は、医薬に許容される塩であってもよい。医薬に許容可能な塩として、金属塩（無機塩）と有機塩との両方が含まれ、それらのリストは「レミントン・ファーマシューティカル・サイエンシーズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）、第１７版、１９８５年、第１４１８頁」に掲載されているものが例示される。
具体的には塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、及び硫酸塩等の無機酸塩や、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩、サリチル酸塩、及びステアリン酸塩等の有機酸塩が非限定的に含まれる。
また、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の金属の塩、リジン等のアミノ酸との塩とすることもできる。また、前記化合物若しくはその医薬上許容される塩の水和物等の溶媒和物も使用できる。

［ロフェノール化合物］
ロフェノール化合物（ロフェノール骨格を有する化合物）は、以下の一般式（５）で表される。

一般式（５）中、Ｒ１は炭素原子数５〜１６の、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル基、又は２重結合を１つ又は２つ含むアルケニル基である。尚、これらのアルキル基又はアルケニル基は、少なくとも１つの水素原子がヒドロキシル基及び／若しくはカルボニル基で置換された、置換アルキル基又は置換アルケニル基であってもよい。Ｒ２、Ｒ３は各々独立に水素原子、炭素原子数１〜３のアルキル基、又は置換アルキル基であり、Ｒ４は環を構成する炭素原子とともにＣ＝Ｏを形成するか、又は−ＯＨ、−ＯＣＯＣＨ3の何れかである。尚、前記炭素原子数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基等が好ましく、メチル基が特に好ましい。

前記一般式（５）において、Ｒ１は、下記式で表される基の何れかであることが好ましい。

好ましいロフェノール化合物としては、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールが挙げられる。各化合物は、それぞれ、以下の式（６）〜（８）で表される構造を有する。

ロフェノール化合物は、シクロラノスタン化合物と同様に、植物に含まれていることが公知であり、植物を原料として公知のロフェノールの製造方法に準じて製造することができる（例えば、特許第３９０５９１３号公報参照）。さらに、ロフェノール化合物は、例えばVitali Matyash et al., PLOS BIOLOGY, Volume 2, Issue 10, e280, 2004に記載されたサプリメントデータに準じて合成することも可能である。
前記のようにして製造した化合物は、例えば、マススペクトル（ＭＳ）法、及び核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）法等によって、その分子量や構造等を決定又は確認することができる。

また、ロフェノール化合物は、医薬に許容される塩であってもよい。このような塩としては、シクロラノスタン化合物の場合と同様の塩が挙げられる。

［本発明の組成物］
本発明の組成物は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される化合物を、有効成分として含有する。該化合物は、１種でも、複数種でもよい。
化合物１又は化合物２を単独で用いる場合としては、化合物１（主に、９，１９−シクロラノスタン−３−オール若しくは２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール）、又は化合物２（主に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、若しくは４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）の何れかであることが好ましい。
中でも化合物１としては、９，１９−シクロラノスタン−３−オールが特に好ましく、化合物２としては、４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール特に好ましい。
また、化合物１又は化合物２各々においても、１種の化合物を用いてもよいし、複数の化合物を混合して用いてもよい。
本発明の組成物は、好ましくは、９，１９−シクロラノスタン−３−オール若しくは２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールからなる群から選択される化合物を有効成分として含有する。

本発明の組成物は、好ましくはシクロラノスタン化合物から選択される化合物、及びロフェノール化合物から選択される化合物の両者を組み合わせて含有することが可能である。シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物は、それぞれ１種でも、複数種でもよい。
この場合において、シクロラノスタン化合物とロフェノール化合物の質量比の範囲は、好ましくは以下の通りである。
シクロラノスタン化合物：ロフェノール化合物＝５：１〜１：５
該特定の質量比の範囲は、天然のアロエベラ中に含まれる、シクロラノスタン化合物（特に、９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール）と、ロフェノール化合物（特に、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）の質量比にほぼ相当する。

本発明の組成物におけるシクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物から選ばれる化合物の含有量は、対象疾患、投与対象等に応じて適宜選択することができるが、総量で、好ましくは少なくとも０．０００１質量％、より好ましくは少なくとも０．００１質量％、さらに好ましくは少なくとも０．００５質量、特に好ましくは少なくとも０．０１質量％である。また本発明の医薬組成物における当該量の上限は特に制限されないが、総量で、９０質量％以下、好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下が例示される。

本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品組成物等の態様で用いることができる。

本発明の組成物を医薬組成物として用いる形態では、経口的、又は非経口的にヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
前記化合物が有効成分として機能し、プロスタグランジンＥ２の産生を抑制する。また、前記化合物が有効成分として機能し、アグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）の産生を抑制する。そのため、本発明の組成物は、プロスタグランンジンＥ２及び／又はアグリカナーゼ１の活性に起因する症状の予防、改善、治療作用を有する。
プロスタグランジンＥ２の活性に起因する症状としては、例えば変形性関節症、軟骨の破壊、軟骨の損傷がある。
アグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）の活性に起因する症状としては、例えば変形性関節症、軟骨の破壊、軟骨の損傷がある。

本発明の医薬組成物の製剤形態は特に限定されず、治療目的、用法に応じて適宜選択できる。
具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤等を例示できる。

本発明の医薬組成物の投与時期は特に限定されず、対象となる疾患に応じて、適宜選択することが可能である。また、投与量は製剤形態、用法、患者の年齢、性別、その他の条件、症状の程度等に応じて決定されることが好ましい。
本発明の医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等により適宜選択される。通常、有効成分の量に換算して、好ましくは０．００１〜５０ｍｇ／日、より好ましくは、０．０１〜１０ｍｇ／日の範囲を目安とする。
従って、本発明の医薬組成物の好ましい形態の一つは、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される化合物を、総量で、好ましくは０．００１〜５０ｍｇ／日、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／日投与されるように用いられる医薬組成物である。

本発明の医薬組成物は、医薬組成物に汎用される添加剤を含有していてもよい。添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、注射剤用溶剤等が挙げられる。また、本発明の医薬組成物は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物のプロスタグランジンＥ２産生抑制効果及びアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制効果を損なわない限り、予防や治療の対象となる疾患や症状に応じた有効成分、例えば、変形性関節症、軟骨の破壊、軟骨の損傷の予防、改善、治療作用を有する他の成分を含有していてもよい。

本発明の医薬組成物は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物から選ばれる化合物を有効成分として医薬組成物用担体に配合することで製造することができる。本発明の医薬組成物は、例えば、前記化合物を、前記の添加剤と共に製剤化することで製造することができる。
また、本発明の医薬組成物は、前記化合物を含む公知の植物等を原料として、熱水や各種溶媒を用いた抽出、超臨界抽出、亜臨界抽出することにより得た抽出物を、前記の添加剤と共に製剤化することで製造することもできる。
特に、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物を前記特定の質量比の範囲で含む本発明の医薬組成物は、各化合物を前記質量比の範囲で混合することで製造することができる。また、このような医薬組成物は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物が含まれている公知の植物等を原料として、各種溶媒を用いた抽出、超臨界抽出、亜臨界抽出等の方法にて製造することも可能である。

本発明の医薬組成物は、例えば、アロエベラの葉皮を含まない葉肉（透明ゲル）部分を凍結乾燥又は熱風乾燥して調製した粉末アロエベラ葉肉を、超臨界抽出することによって製造することができる。

この場合、抽出溶媒としては、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物の抽出効率を向上させる観点からは、超臨界プロパン、超臨界エチレン、超臨界１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を使用することも可能であるが、安全性を向上させる観点からは、炭酸ガスを使用することが好ましい。また、抽出温度としては、２８℃〜１２０℃の温度範囲で適宜選択することも可能であるが、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物の抽出効率を向上させ、かつ緩下作用を有するアントラキノン系化合物（例えば、アロエエモジン）の抽出量を少なくする観点からは、５０〜６９℃の範囲が好ましく、５０〜５９℃の範囲がさらに好ましい。また、圧力としては、５．５〜６０ＭＰａの範囲で適宜選択することが可能であるが、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物の抽出効率を向上させ、かつアントラキノン系化合物の含有量を少なくする観点からは、１５〜６０ＭＰａの範囲が好ましく、１５〜２４ＭＰａの範囲がさらに好ましい。また、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物の抽出効率を向上させる観点からは、エタノール等のエントレーナーを使用することも可能であるが、アントラキノン系化合物の抽出量を少なくする観点からは、エントレーナーを使用しないことが好ましい。

本発明の医薬組成物は、単独で使用しても良いが、公知の前記疾患の予防、改善、治療剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、前記疾患の予防、改善、治療効果を高めることができる。併用する前記疾患の予防、改善、治療剤は、本発明の医薬組成物の成分として含有させても良いし、本発明の医薬組成物と別に製剤化し、本発明の医薬組成物と組み合わせて配置し、使用時に併用するタイプのキットとしても良い。

本発明の医薬組成物は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される化合物により、優れたプロスタグランジンＥ２産生抑制効果及び／又はアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制効果を発揮する。

（本発明の飲食品組成物）
本発明の組成物を飲食品組成物として用いる形態（「本発明の飲食品組成物」という。）では、プロスタグランジンＥ２及び／又はアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）の活性に起因する症状の予防、改善のために用いることができる。
本発明の飲食品組成物は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物から選ばれる化合物を、有効成分として含有する。該化合物は、１種でも、複数種でもよい。
本発明において、「飲食品組成物」には、人間が摂取する飲食品の他、人間以外の動物が摂取する飼料も含まれる。
本発明の飲食品組成物は、好ましくはシクロラノスタン化合物から選ばれる化合物、及びロフェノール化合物から選ばれる化合物の両者を組み合わせて含有する。シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物は、それぞれ１種でも、複数種でもよい。
この場合において、シクロラノスタン化合物とロフェノール化合物の質量比の範囲は、好ましくは以下の通りである。
シクロラノスタン化合物：ロフェノール化合物＝５：１〜１：５

本発明の飲食品組成物におけるシクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される化合物の量は、飲食品の形態によって適宜設定されるが、総量で、好ましくは少なくとも０．０００１質量％、より好ましくは少なくとも０．００１質量％、さらに好ましくは少なくとも０．００５質量、特に好ましくは少なくとも０．０１質量％である。また本発明の飲食品組成物における当該量の上限は特に制限されないが、総量で、９０質量％以下、好ましくは７０質量％以下、より好ましくは５０質量％以下が例示される。
また、本発明の飲食品組成物における前記化合物の量は、飲食品の形態に応じて、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される化合物を、総量で、好ましくは０．００１〜５０ｍｇ／日、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／日の範囲で摂取するのに適した量とすることもできる。従って、本発明の飲食品組成物の好ましい形態の一つは、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物から選ばれる化合物を、総量で、好ましくは０．００１〜５０ｍｇ／日、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／日摂取するように用いられる飲食品組成物である。

本発明の飲食品組成物は、好ましくは、さらに乳化剤を含む。このような乳化剤としては、食用として利用できるものであれば特に制限されない。例えば、日本において、食品添加剤として認可されているような、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、レシチン類等を使用することが好ましい。
さらに乳化剤を含有する飲食品組成物は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物の分散性が高いため、効果の安定性に優れる。

前記飲食品組成物は、好ましくは保健機能食品である。「保健機能食品」とは、疾患の予防効果、又は疾患の発生リスクの低減効果が、直接的又は間接的に表示された食品、及び事業者の責任で科学的根拠を基に商品パッケージに機能性を表示するものとして、消費者庁に届け出られた食品を意味する。例えば、現在、日本において、特定保健用食品、機能性表示食品、健康補助食品等の態様で販売される食品が挙げられる。

また、保健機能食品の形態としては、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントであることも、摂取者が有効成分の摂取量を把握し易いという点で好ましい。

また、このような保健機能食品には、「プロスタグランジンＥ２産生抑制のため」、「アグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制のため」の用途の表示が付された形態とすることも好ましい。すなわち、本発明の飲食品組成物は、例えば、「プロスタグランジンＥ２産生抑制のため」、「アグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制のため」、「変形性関節症の予防、改善のため」の用途が付された、化合物１及び化合物２からなる群から選択される化合物を有効成分として含有する、プロスタグランジンＥ２及び／又はアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）の活性により引き起こされる症状の予防又は改善のための飲食品組成物として販売することが好ましい。

前記「表示」は、需要者に対して前記用途を知らしめる機能を有する全ての表示を含む。すなわち、前記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、すべて前記「表示」に該当する。
また、前記「表示が付された」とは、前記表示と、飲食品（製品）を関連付けて認識させようとする表示行為が存在していることをいう。
表示行為は、需要者が前記用途を直接的に認識できるものであることが好ましい。具体的には、本発明の飲食品組成物に係る商品又は商品の包装への前記用途の記載行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類（電磁的方法により提供されるものを含む）への前記用途の記載行為が例示できる。

一方、表示される内容（表示内容）としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましい。
例えば、健康食品、機能性飲食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品、医薬用部外品等の表示を例示することができる。特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができ、詳細にいえば、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示が、典型的な例として列挙することが可能である。

前記用途を表す文言は、「プロスタグランジン産生抑制のため」、「アグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制のため」、「変形性関節症の予防、改善のため」という文言に限られるものでなく、それ以外の文言であっても、プロスタグランジンＥ２及び／又はアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）により起こる症状を予防、改善する作用又は効果を表現する文言であれば、本発明の範囲に包含されることは言うまでもない。
また、本発明の飲食品組成物は、前記用途の表示に加え、前記有効成分の表示、さらには、前記用途と前記有効成分の関連性を示す表示を含むことも好ましい。

本発明の飲食品組成物の形態としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；惣菜；パン類；その他、経腸栄養食品、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料が挙げられる。

本発明の飲食品組成物は、シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物から選ばれる化合物を、有効成分として配合することで製造することができる。本発明の飲食品組成物は、例えば、前記化合物を、飲食品原料に混合して、加工することで製造することができる。
また、本発明の飲食品組成物は、前記化合物を含む公知の植物等を原料として、熱水や各種溶媒を用いた抽出、超臨界抽出、亜臨界抽出することにより得た抽出物を、飲食品原料と共に加工することで製造することもできる。抽出物を得る具体的な方法については、「本発明の医薬組成物」の項で例示したとおりである。

また、本発明の飲食品組成物の形態を、顆粒状、タブレット状又は液状のサプリメントとする場合には、有効成分である前記化合物を、例えば、ラクチュロース、マルチトール、及びラクチトール等の糖類、及びそれ以外の糖類、例えばデキストリン、デンプン等；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等と共に、製剤化することも好ましい。

以下に実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［製造例１］
（シクロラノスタン化合物（化合物１）の製造）
γ−オリザノール（オリザ油化社製）８．０ｇに蒸留水２５０ｍｌ、水酸化ナトリウム５０ｇ、イソプロパノール１５０ｍｌ、エタノール１５０ｍｌ、メタノール１５０ｍｌを加え、マントルヒーターを用いて２時間加熱還流を行った。反応後に、反応液を１３００ｍｌの水に添加し、生じた白色の析出物を吸引ろ過し、固形物を得た。残存するアルカリを洗浄するために、得られた残渣を１０００ｍｌの水の中に懸濁させた後、再び吸引ろ過を行った。この操作を２回繰り返し、最終的な残渣を凍結減圧乾燥させることによりオリザノール加水分解物５．９１ｇを得た。当該加水分解物はＨＰＬＣにて精製を行い、２４３５ｍｇのシクロアルテノール、及び１５４３ｍｇの２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オール（化合物１）を得た。

次に、得られたシクロアルテノールを用いて、９，１９−シクロラノスタン−３−オール（化合物１）の合成を行った。
シクロアルテノールを３０２ｍｇ、イソプロパノールを１５０ｍｌ、及び粉末状の５％パラジウム担持炭素触媒１．０ｇを仕込み、これをオートクレーブ内で密閉して、窒素ガスで置換した後、水素ガス３ｋｇ／ｃｍ2の圧力をかけながら導入した。攪拌しながら加熱していき、５０℃になったところで、水素の圧力を５ｋｇ／ｃｍ2とし、吸収された水素を補うことで圧力を保ちながら６時間反応させた。反応液について、ろ過により触媒を除去し、濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム１００％）により精製を行い、９，１９−シクロラノスタン−３−オール２７５ｍｇを得た。

［製造例２］
（ロフェノール化合物（化合物２）の製造）
アロエベラの葉肉（透明ゲル部分）１００ｋｇを、ホモジナイザーを用いて液状化し、ここに１００Ｌの酢酸エチル／ブタノール（３：１）混合液を添加して攪拌した。一晩放置した後、酢酸エチル／ブタノール混合液と水層を分液して、酢酸エチル／ブタノール混合液を回収した。この酢酸エチル／ブタノール混合液を減圧下で濃縮した。回収された酢酸エチル／ブタノール混合液抽出物の質量は、１３．５ｇであった。
シリカゲル６０（メルク社製）を４００ｇ充填したカラムに、当該抽出物１３ｇを１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：１）混合液に溶解させた溶液を通液し、カラムに吸着させた後、クロロホルム／メタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝１００：１、２５：１、１０：１、５：１及び１：１の各混合比）を使用して、メタノール濃度を段階的に上昇させるステップワイズグラジエント法により溶出し、前記混合液の混合比毎に溶出液を分画した。これらのフラクションのうち、クロロホルム：メタノール＝２５：１で溶出してきたフラクションに本発明のロフェノール化合物が存在することを、順相及び逆相薄層クロマトグラフィー（メルク社製、シリカゲル６０Ｆ２５４及びＲＰ−１８Ｆ２５４３）にて確認した。

このフラクションの溶媒を除去した後、１ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：１）混合液に溶解し、シリカゲル６０を１００ｇ充填したカラムに通液し、カラムに吸着させた後、ヘキサン／酢酸エチル（４：１）混合液１１００ｍｌで溶出した。溶出フラクションを、順に３００ｍｌ（フラクションＡ）、 ３００ｍｌ（フラクションＢ）、５００ｍｌ（フラクションＣ）ずつ分取した。
本発明の化合物２であるロフェノール化合物が、フラクションＡに濃縮されたことを、順相及び逆相薄層クロマトグラフィーにて確認し、さらに、コスモシールＣ１８（ナカライテスク社製）を装着したＨＰＬＣを用いて、クロロホルム／ヘキサン（８５：１５）混合液にて分離し、４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールを、それぞれ１．３ｍｇ、１．２ｍｇ、１ｍｇ得た。各々の化合物の構造は質量（ＭＳ）分析及びＮＭＲにて確認した。

［実施例１］
（１）目的
実施例１は、１Ｌ−１βによるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生量増加に対する、シクロラノスタン化合物又はロフェノール化合物を添加した場合のＰＧＥ２の産生量の変化に与える影響を検討した。

（２）試料の調製
実施例１では製造例１で製造したシクロラノスタン化合物（９，１９−シクロラノスタン−３−オール；試験試料１）、及び製造例２で製造したロフェノール化合物（４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール；試験試料２）を用いた。なお、対照試料としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた。

（３）試験方法
（ａ）ＨＣＨ細胞培養及びＨＣＨ細胞が含まれるアルギン酸ビーズの作製
凍結されたヒト膝軟骨細胞（Human Chondrocytes; HCH）（Promocell社製、#C−12710）を解凍し、増殖培地（Promocell社製、#C−27101）にて３７℃、ＣＯ_２濃度５％の条件にて増殖させ、４週間経過後のものを実施例１に用いた。１バイアル中の凍結ＨＣＨ細胞の数は５×１０^５ｃｅｌｌｓ程度であったが、４週間経過後の１バイアル中のＨＣＨ細胞の数は約１×１０^８ｃｅｌｌｓ程度であった。
なお、ＨＣＨ細胞数は、ＨＣＨ細胞をトリパンブルー（gibco社製、Trypan Blue Stain(0.4%)）にて染色し、血球計算版にて測定した。
アルギン酸三次元培養キット（PGリサーチ社製、#ABC−KIT）のプロトコールに従い、アルギン酸ビーズ１球中に約１×１０^４ｃｅｌｌｓのＨＣＨ細胞が含まれるアルギン酸ビーズを作製した。
（ｂ）培養上清の回収
４８個のウェルを有する４８ウェルプレートに、前記（ａ）にて作製したＨＣＨ細胞が含まれるアルギン酸ビーズを５球／増殖培地０．５ｍｌ／１ウェルとなるように添加して３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。３日間培養後、基本培地（Promocell社製、＃Ｃ−２７１１１）０．５ｍｌ／１ウェルに培地交換を行い、無血清条件下にて馴化させた。１日間馴化後、培地を除去し、試験試料１（９，１９−シクロラノスタン−３−オール）、試験試料２（４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）をそれぞれＤＭＳＯに溶解し、試験試料１、２の最終濃度が２μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌ、並びにＤＭＳＯの最終濃度が０．１％となるようにウェルに添加し、４８時間培養した。試験試料１を使用した試験を試験群１とし、試験試料２を使用した試験を試験群２とした。
その後、基本培地にて１ｎｇ／μｌに調製した１Ｌ−１β（PEPROTECH社製、#2001−00B）を５μｌ／１ウェル添加し、ＨＣＨ細胞に炎症を惹起させた。１Ｌ−１βの最終濃度は０．１ｎｇ／μｌであった。
１Ｌ−１β添加した後、１８時間経過後に培養上清を回収した。
なお、コントロールとして対照試料（ＤＭＳＯ）を最終濃度が０．１％となるように添加して１Ｌ−１βを添加しないもの（対照群１）、対照試料（ＤＭＳＯ）を最終濃度が０．１％となるように添加し、さらに１Ｌ−１βを最終濃度が０．１ｎｇ／μｌとなるように添加したもの（対照群２）の２種類を作製した。
（ｃ）プロスタグランジンＥ２濃度の測定
回収した培養上清中のプロスタグランジンＥ２濃度は、PGE2 ELISA Kit（Enzo社製、ADI−900−001）を用いて測定した。

（４）試験結果
実施例１の結果を表１に示す。表１のＰＧＥ２濃度は、検出キットに基づくＥＬＩＳＡ法により測定された実測値である。また、表中のｐ値は、ｔ検定による有意確率（^＃＃：ｐ＜０．０１ ｖｓ 対照群１、^＊：ｐ＜０．０５ ｖｓ 対照群２）を示す。

表１に示されるように、１Ｌ−１βを添加して炎症を惹起させた対照群２、試験群１、２では、１Ｌ−１βを添加しない対照群１と比べてＰＧＥ２濃度が増加した。
試験群１、２では、試料の最終濃度が２μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌのいずれにおいても、対照群２と比較してＰＧＥ２濃度が顕著に減少した。特に、試料の最終濃度が２μｇ／ｍｌである場合はプロスタグランジンＥ２産生を有意に抑制していた。
以上より、９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールはプロスタグランジンＥ２の産生を抑制する作用を有することが明らかとなった。

［実施例２］
（１）目的
実施例２は、１Ｌ−１βによるアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）遺伝子の発現量増加に対する、シクロラノスタン化合物又はロフェノール化合物を添加した場合のアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）の発現量の変化に与える影響を検討した。

（２）試料の調製
実施例２では、実施例１と同様、製造例１で製造したシクロラノスタン化合物（９，１９−シクロラノスタン−３−オール；試験試料１）及び製造例２で製造したロフェノール化合物（４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール；試験試料２）を用いた。なお、対照試料としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた。

（３）試験方法
（ａ）ＨＣＨ細胞培養及びＨＣＨ細胞が含まれるアルギン酸ビーズの作製
前記実施例１と同様の方法により細胞培養及びＨＣＨ細胞が含まれるアルギン酸ビーズの作製を行った。
（ｂ）遺伝子発現解析用の細胞の回収
１２個のウェルを有する１２ウェルプレートに、前記（ａ）にて作製したＨＣＨ細胞が含まれるアルギン酸ビーズを２０球／増殖培地２ｍｌ／１ウェルとなるように添加して（ｎ＝３）、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。３日間培養後、基本培地（Promocell社製、#C−27111）２ｍｌ／１ウェルに培地交換を行い、無血清条件下にて馴化させた。１日間の馴化後、培地を除去し、前記調製した試験試料１（９，１９−シクロラノスタン−３−オール）、試験試料２（４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オール）をそれぞれＤＭＳＯに溶解し、試験試料１、２の最終濃度が２μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌ、並びにＤＭＳＯの最終濃度が０．１％となるようにウェルに添加し、４８時間培養した。試験試料１を使用した試験を試験群１とし、試験試料２を使用した試験を試験群２とした。
その後、基本培地にて１ｎｇ／μｌに調製したＩＬ−１β（PEPROTECH社製、#2001−00B）を２０μｌ／１ウェル添加し、ＨＣＨ細胞に炎症を惹起させた。１Ｌ−１βの最終濃度は０．１ｎｇ／μｌであった。
１Ｌ−１βを添加した後、４時間経過後に培養上清を除去した。さらに各ウェルにクエン酸ナトリウムを添加してアルギン酸を溶解させ、遠心分離（３００ｇ、１０分間）を行い、細胞を回収した。
なお、コントロールとして対照試料（ＤＭＳＯ）を最終濃度が０．１％となるように添加して１Ｌ−１βを添加しないもの（対照群１）、対照試料（ＤＭＳＯ）を最終濃度が０．１％となるように添加し、さらに１Ｌ−１βを最終濃度が０．１ｎｇ／μｌとなるように添加したもの（対照群２）の２種類を作製した。
（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子の発現量の評価
前記回収した細胞からＲＮＡを抽出、精製し、リアルタイムＰＣＲにてＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子の発現量を評価した。ＲＮＡの抽出は、TRIZOL Reagentキット（Thermo Fisher SCIENTIFIC社製、15596-018）を用いて行った。
ＰＣＲの反応液はSYBR Green Real−Time PCR Master Mixes（Thermo Fisher SCIENTIFIC社製、#A25742）を用いた。ＰＣＲ装置は7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems社製、型番4377354）を用いた。増幅条件は９５℃にて３秒保持し、その後６０℃にて３０秒間保持するサイクルを１サイクルとし、これを４０サイクル行った。
ＰＣＲのプライマーは以下のものを使用した。

＜プライマーの配列＞
ＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子増幅用のプライマーは以下の配列を有するものを用いた。
ＡＤＡＭＴＳ−４（フォワード）：ＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＡＣ
ＡＤＡＭＴＳ−４（リバース）：ＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＡＴＣＴＴＧＴＣＡＴＣ
ハウスキーピンク遺伝子として以下の配列を有するものを用いた。
ＨＰＲＴ１（フォワード）：ＧＧＣＡＧＴＡＴＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡ
ＨＰＲＴ１（リバース）：ＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＡＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣ

（４）試験結果
実施例２の結果を表２に示す。表２の「相対ＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子発現量」とは、対照試料１のＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子発現量を「１」とした場合の各試料のＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子発現量を意味する。表２のｐ値は、ｔ検定による有意確率（^＃＃：ｐ＜０．０１ ｖｓ 対照群１、^＊：ｐ＜０．０５ ｖｓ 対照群２）を示す。

表２に示されるように、１Ｌ−１βを添加して炎症を惹起させた対照群２、試験群１、２では、１Ｌ−１βを添加しない対照群１と比べてＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子発現量が増加した。
一方、試験群１、２では、試料の最終濃度が２μｇ／ｍｌ及び０．２μｇ／ｍｌのいずれにおいても、対照群２と比較してＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子発現量が顕著に減少した。特に、試料の最終濃度が２μｇ／ｍｌである場合はアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）遺伝子発現を有意に抑制していた。
以上より、９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールはＡＤＡＭＴＳ−４遺伝子発現の抑制作用を有する、すなわちアグリカナーゼ１の産生抑制作用を有することが明らかとなった。

本発明は、プロスタグランジンＥ２産生抑制、及びアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制、並びにプロスタグランンジンＥ２及びアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）の活性に起因する症状の予防、改善、治療に利用できる。

Claims (5)

1. シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分とするプロスタグランジンＥ２産生抑制用組成物。
2. シクロラノスタン化合物及びロフェノール化合物からなる群から選択される１又は複数の化合物を有効成分とするアグリカナーゼ１（ＡＤＡＭＴＳ−４）産生抑制用組成物。
3. シクロラノスタン化合物が９，１９−シクロラノスタン−３−オール及び２４−メチレン−９，１９−シクロラノスタン−３−オールからなる群から選択される１又は複数の化合物である、請求項１又は２に記載の組成物。
4. ロフェノール化合物が４−メチルコレスト−７−エン−３−オール、４−メチルエルゴスト−７−エン−３−オール、及び４−メチルスチグマスト−７−エン−３−オールからなる群から選択される１又は複数の化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記組成物が医薬組成物又は飲食品組成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。