JP2018515324A - 連続フローマイクロ流体システム - Google Patents

Abstract

本開示は、治療的材料の送達のために使用されるナノ粒子の大規模生産のための改良されたシステム及び方法に関する。この装置を使用して、治療的材料を含有する多数のナノ粒子を製造することができ、治療的材料を含有するナノ粒子としては、脂質ナノ粒子及びポリマーナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、連続フロー運転及びマイクロ流体ミキサーの並列化が、ナノ粒子生成量の増加に寄与する。【選択図】図２

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年２月２４日に出願された米国特許出願第６２／１２０１７９号、及び２０１６年１月６日に出願された米国特許出願第６２／２７５６３０号の利益を主張し、これらの出願の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

背景
臨床開発及び商業的生産のために大規模に医薬組成物を製造することは、従来困難であった。医薬の小規模生産のために実験室で使用される技術はしばしば、スケールアップしにくい。これらの課題は、ナノ粒子などの複合医薬コロイド系を製造する際に、より困難になる。ナノ粒子は、複数の成分を含む。この成分としては、脂質、ポリマー、低分子量化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、及び無機分子を含むイメージング剤が含まれるが、これらに限定されない。ナノ粒子の製造のための従来のプロセスは、バッチ系システムであり、準安定性ナノ粒子がしばしば生成される。ここで、サイズ、多分散性及びカプセル化効率などの粒子特性は、バッチ製造プロセス内の（局所的な）環境変化に影響を受ける。この環境変化としては、温度、ｐＨ、イオン強度、バッファー組成、溶媒濃度が含まれるが、これらに限定されない。結果として、ナノ粒子の製造のための従来のバッチプロセスは、高価で、時間がかかり、再現するのが難しい。このため、バッチサイズを増大させてかなりの最適化をする必要があるが、これは商業的リスクを増加させる。さらに、従来のナノ粒子製造プロセスは、ナノ粒子生成物を製造装置に接触させることを必要とし、そのため、コスト及び時間がかかる洗浄及び滅菌バリデーションが必要となる。なぜならば、各バッチの製造後に装置を廃棄することは、経済的に実行可能ではないからである。

これらの課題を考慮すると、より大きな生成量をもたらす、改良されたナノ粒子製造システムが望まれる。

概要
この概要は、詳細な説明において以下にさらに説明される概念の選択を、簡略化された形で紹介するために提供される。この概要は、特許請求の範囲に記載の発明特定事項の重要な特徴を同定することを意図するものでもなければ、特許請求の範囲に記載の発明特定事項の範囲を決定する際の助けとして使用されることを意図するものでもない。

一つの態様において、マイクロ流体チップの連続フロー運転のためのシステムが提供される。一つの実施形態において、本システムは、以下の（１）〜（４）を含む。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）を含むマイクロ流体チップ
（ａ）第１の溶液を受容するように構成される、第１の入口
（ｂ）第２の溶液を受容するように構成される、第２の入口
（ｃ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む第１のミキサー
（ｉ）第１の入口から第１の溶液を受容するように構成される、第１の入口マイクロチャネル
（ｉｉ）第２の入口から第２の溶液を受容するように構成される、第２の入口マイクロチャネル
（ｉｉｉ）第１の溶液及び第２の溶液を混合して、ミキサー出口でナノ粒子溶液を提供するように構成される、混合マイクロチャネル
（ｄ）ナノ粒子溶液マイクロチャネルを通してミキサー出口と流体連通する、チップ出口
（２）第１の溶液を、第１の溶液リザーバから、マイクロ流体チップの第１の入口内へ、連続して駆動するように構成される、第１の連続フロー流体駆動装置
（３）第２の溶液を、第２の溶液リザーバから、マイクロ流体チップの第２の入口内へ、連続して駆動するように構成される、第２の連続フロー流体駆動装置
（４）チップ出口と流体連通し、ナノ粒子溶液をアウトプットするように構成される、システム出口

一つの態様において、ナノ粒子を形成する方法が提供される。一つの実施形態において、本方法は、開示される実施形態に係るシステムを通して第１の溶液及び第２の溶液を流すステップ及びマイクロ流体チップの第１のミキサーにおいてナノ粒子溶液を形成するステップを含む。

本発明の前述の態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することによって、よりよく理解されるようになるにつれて、より容易に理解されるだろう。

図１は、本開示の連続フローシステムの略図である。

図２は、本開示の連続フローシステムの略図である。

図３は、本開示の代表的な流体デバイスの略図である。

図４は、マニホールドを使用する、並列に配列された４つの単一マイクロ流体ミキサーデバイス、又は図３に示される、代表的な単一デバイスに並列に配列された４つのマイクロ流体ミキサーに対する、代表的なｓｉＲＮＡ−脂質ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ）の粒子直径（ｎｍ）及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、モル比が５０：１０：３８．５：１．５の１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成され、ｓｉＲＮＡ−総脂質の比は０．０６ｗｔ／ｗｔであった。そして、マニホールドを使用する、並列に配列された４つの単一マイクロ流体ミキサーデバイス（４Ｘマニホールド）、又は図３に示される、単一デバイスに並列に配列された４つのマイクロ流体ミキサー（４Ｘオンチップ）のいずれかを備える、図２に示される例示的な連続フローシステムを使用して、ナノ粒子を生成した。マイクロ流体デバイスを通る全流量は凡例に示されている。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。

図５は、製造容量に対する、代表的なｓｉＲＮＡ−脂質ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ）の粒子直径（ｎｍ）及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、モル比が５０：１０：３８．５：１．５の１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成され、ｓｉＲＮＡ−総脂質の比は０．０６ｗｔ／ｗｔであった。そして、マニホールドを使用する、並列に配列された８つの単一マイクロ流体ミキサーデバイスを備える、図２に示される例示的な連続フローシステムを使用して、ナノ粒子を生成した。ナノ粒子を０ｍＬから５００ｍＬまで１００ｍＬごとにサンプリングし、結果を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して調製した同一のｓｉＲＮＡ−ＬＮＰの２ｍＬ調製物と比較した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、マイクロ流体を使用して、固定容量バッチのナノ粒子を製造する、市販の実験室装置である。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。

図６は、本開示の代表的なシステム、連続フローねじれ型ヘリンボン（ＳＨＭ）マイクロミキサーの略図である。２つの別個のストリームの混合は、パターン化された中央チャネルで生じる。この中央チャネルでは、溝付き壁が、交互の二次流れを駆動し、この交互の二次流れが、注入された流体をカオス的に撹拌する。カオス的混合は界面積の指数関数的増加をもたらし、したがって２つの流体の間の拡散距離を低減する。２つの相（水性相及び完全に溶媒和された脂質を含有するエタノール相）の迅速な相互拡散は、ＬＮＰの自己集合をもたらし、そのサイズは主として、それらの脂質組成及び水性相／エタノール相流量比に依存する。

図７は、限界寸法の脂質ナノ粒子を作製するのに有用な、代表的な平行流体構造の３次元図である。

図８Ａは、図７に示される代表的な平行流体構造の上面図を示し、図８Ｂは、図７に示される代表的な平行流体構造の側面図を示す。図８Ａの上面図は、並列の２つの平面ヘリンボン構造を示す。図８Ｂの側面図は、平行流体構造が３つの層を有して、全部で６つのヘリンボン構造を有していることを示す。

図９は、限界寸法の脂質ナノ粒子を作製するのに有用な、第２の代表的な平行流体構造を示す。

図１０は、「垂直」連結を備える（すなわち、デバイスの主平面に対して垂直に延在する）例示的な４ｘ平行マイクロ流体システムのラベル付き写真であり、２つの連続フローポンプ、並びに入口マニホールド及び出口マニホールドに接続された４つのマイクロ流体混合チップを含む。

図１１は、「水平」連結を備える（すなわち、デバイスの主平面に対して平行に延在する）例示的な８ｘ平行マイクロ流体システムのラベル付き写真であり、２つの連続フローポンプ、並びに２つの入口マニホールド及び１つの出口マニホールドに接続された８つのマイクロ流体混合チップを含む。

図１２Ａは、開示される実施形態に係るトロイダル対ディーン渦分岐ミキサー（ＤＶＢＭ）を示す。図１２Ｂは、開示される実施形態に係る例示的なトロイダルＤＶＢＭミキサーの写真である。

詳細な説明
本開示は、治療的材料の送達のために使用されるナノ粒子の大規模生産のための改良されたシステム及び方法に関する。この装置を使用して、治療的材料を含有する多数のナノ粒子を製造することができ、この治療的材料を含有するナノ粒子としては、脂質ナノ粒子及びポリマーナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、連続フロー運転及びマイクロ流体ミキサーの並列化は、ナノ粒子生成量の増加に寄与する。本明細書は主として、溶液の混合によるナノ粒子の製造に関するが、デバイス、システム、及び方法は、これらの用途を超えて一般に適用可能であることが理解されるだろう。それ故に、開示される実施形態によって、任意の組成の２以上の溶液の混合が企図される。

マイクロ流体ミキサーは、マイクロ流体チップ上でマイクロ流体デバイスに一体化されているマイクロ流体要素である。本明細書で使用されるように、マイクロ流体チップは、プラットフォームであって、そこに配置された１又は複数のマイクロ流体デバイス、並びに流体のインプット及びアウトプットをマイクロ流体デバイスに連結するための入口及び出口を含むプラットフォームとして定義される。マイクロ流体デバイスは、少なくとも１つの入口、１つの出口、及び混合、加熱、ろ過、反応、などの流体機能を実施する１つの部分を含む、マイクロ流体要素として定義される。本明細書中に開示されるいくつかの例示的な実施形態において、説明されるマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体混合デバイスであり、このマイクロ流体混合デバイスは、ミキサーにおいて第１の溶液を第２の溶液と混合して、混合された溶液を提供するように構成される。しかしながら、他のマイクロ流体デバイスもまた、開示されるシステムに適合する。

具体的には、本開示は、ナノ粒子の製造のための連続フロー装置を提供し、この装置は、前臨床開発のための小規模（例えば、５０ｍＬ未満）生産から、臨床開発及び商業的供給のための大規模生産（例えば、１０００Ｌ超）への、単純、迅速且つ再現性のあるナノ粒子の製造を可能にする。さらに、本開示は、製造中の環境因子に対して優れた制御の利点を有するマイクロ流体を採用する。そしてマイクロ流体は、さらなるプロセス最適化を必要とせずに、マイクロ流体ミキサーの並列化によってアウトプットを増加させることができるという、さらなる利点を保有する。並列のマイクロ流体ミキサーの数は、バッチサイズ要件、及びバッチの製造に要求される時間枠によって決定される。さらなる実施形態において、本開示は、完全に使い捨ての流体経路を備えるナノ粒子の製造のための連続フロースケールアップ装置を提供する。完全に使い捨ての流体経路により、ユーザは、ＧＭＰ製造のための高価で時間がかかる洗浄バリデーションプロトコルを排除することができる。

図１は、本開示の範囲の略図であり、大規模ナノ粒子生産のための連続フローマイクロ流体系製造装置である。代表的なシステム１００は、製造パラメーターを制御するソフトウェアシステム１０２を使用し、製造パラメーターとしては、流体流量、独立した流体ストリームの流量の比、装置内の圧力、及び温度制御などがあるが、これらに限定されない。装置１００は、２以上の（ｎ_１）独立した流体入口ストリームを含む。この流体入口ストリームは、流体駆動装置１０６（例えば、ポンプ）によって駆動されて、リザーバ１０４からマニホールドシステム１０７内へナノ粒子及び治療的材料を流す。マニホールドシステム１０７は、連続フローストリームを分割し、均等な流れが、並列化されたマイクロ流体ミキサーアレイ１０８内に含まれる各マイクロ流体ミキサーの入口に駆動される。マイクロ流体ミキサーの数（ｎ_２）は、スループット要件に応じて規模調整される。一つの実施形態において、ミキサーの数が２以上である。一つの実施形態において、ミキサーの数が２である。一つの実施形態において、ミキサーの数が３以上である。一つの実施形態において、ミキサーの数が３である。一つの実施形態において、ミキサーの数が４以上である。一つの実施形態において、ミキサーの数が４である。一つの実施形態において、ミキサーの数が８以上である。一つの実施形態において、ミキサーの数が８である。一つの実施形態において、ミキサーの数が１０以上である。一つの実施形態において、ミキサーの数が１０である。一つの実施形態において、ミキサーの数が２０以上である。

ある実施形態において、ミキサーアレイ１０８の後に、１又は複数（ｎ_３）の形成後マイクロ流体ミキサー１１０が順番に配置され、これにより、１又は複数の追加の成分（ｎ_４）（例えば、ターゲティングリガンド）を、最初のマイクロ流体ミキサーアレイ１０８から出てくるナノ粒子に添加することができ、又は迅速なバッファー交換又は希釈がナノ粒子製造の直後に起こることができる。１又は複数の形成後マイクロ流体ミキサー１１０はまた、ミキサーアレイ１０８と同様に並列であることができ、流体駆動装置１１２からの連続フローを介してリザーバ１１４から材料が供給される。

ナノ粒子は、ミキサーアレイ１０８内での流体ストリームの迅速混合に起因するナノ沈殿を介して形成される。一つの実施形態において、マイクロ流体ミキサーアレイ１０８、又は１又は複数の形成後マイクロ流体ミキサー１１０からの、出口ストリームは、（例えば、マニホールドを使用して）単一ストリームに再び統合され、それに続いて、結果として得られるナノ粒子／水性／有機混合物が、流体駆動装置１１６を介して送達される水性試薬１１８の１又は複数（ｎ_５）のストリームで希釈されて、さらなる処理の前にナノ粒子生成物を安定化する。希釈ステップは、水性バッファーがアウトプットストリームと直接接触するインライン希釈によって達成することができる。代替的に、１又は複数の形成後マイクロ流体ミキサー１１０の一部として、さらなるマイクロ流体ミキサーアレイを使用して、希釈を達成することができる。連続フロープロセスにおける１つの追加の利益は、粒子生成物の希釈の際の時間遅延が、粒子の品質及び安定性に影響を及ぼすことができることである。したがって、ミキサーと希釈との間の管長さ及びホールドアップ容量を調整して、希釈される前に粒子が「成熟する」のに十分な時間を与えることができる。管は、希釈の前に生成物を（「保持時間」の間）回収及び保持するためのアキュムレーターとして機能する。一つの実施形態において、最後のミキサー（例えば、１０８又は１１０）と希釈合流点との間の距離は約１ｃｍ〜約５０ｃｍである。一つの実施形態において、最後のミキサー（例えば、１０８又は１１０）と希釈合流点との間の距離は約１ｃｍ〜約１０ｃｍである。一つの実施形態において、最後のミキサー（例えば、１０８又は１１０）と希釈合流点との間の距離は約１０ｃｍ〜約５０ｃｍである。

別の実施形態において、システムは、管寸法及び流れ特性を含み、特定の保持時間を生じるように構成される。一つの実施形態において、保持時間が、約５秒間〜約１時間である。一つの実施形態において、保持時間が、約３０分間〜約１時間である。一つの実施形態において、保持時間が、約５秒間〜約６０秒間である。一つの実施形態において、保持時間が、約５秒間〜約１０秒間である。一つの実施形態において、保持時間が、約５秒間超である。一つの実施形態において、保持時間が、約１０秒間超である。一つの実施形態において、保持時間が、約６０秒間超である。一つの実施形態において、保持時間が、約１０分間超である。一つの実施形態において、保持時間が、約３０分間超である。一つの実施形態において、保持時間が、約４５分間超である。

システムが定常状態に達するより前は、バルブは流れを廃棄物回収部１１９へ導く。定常状態になると、バルブは、流れが最終ナノ粒子生成物回収部１２８へ導かれるように、構成される。

ある実施形態において、ナノ粒子製造は、滅菌生成物を保証するためのろ過の必要性を排除する特殊なバリア施設において実施される。

図２は、本開示の代表的なシステムの略図であり、大規模ナノ粒子生産のための連続フローマイクロ流体系製造装置である。代表的なシステム２００は、２つの流体駆動装置２０６、２０８を含み、システム全体を連結する管２２６を通して、水性バッファー２０４及び水混和性有機物含有溶解脂質ストリーム２０２の連続フローを提供する。マニホールド２１０及び２１１は連続フローストリームを分割し、均等な流れが、各並列化されたミキサーの入口に駆動される。マイクロ流体ミキサーの数は、スループット要件に応じて規模調整され、例２１２においては、８つのミキサーが存在する。ナノ粒子は、マイクロ流体ミキサー内での水性ストリーム及び有機ストリームの迅速混合に起因するナノ沈殿を介して形成される。８つの並列化されたミキサーからの出口ストリームは、マニホールド２１４を使用して単一ストリームに再び統合され、それに続いて、結果として得られるナノ粒子／水性／有機混合物が、Ｔ字コネクタ２２０を通してポンプ２１８で送られた水性試薬２１６で希釈されて、さらなる処理の前にナノ粒子生成物を安定化する。一つの実施形態において、各マイクロ流体ミキサーから形成されたナノ粒子は、最終アウトプットストリームに統合される前に、品質及び所望の特性について分析される。システムが定常状態に達するより前は、システムの末端にあるバルブ２２２は、廃棄物回収部２２４に流れを導く。定常状態になると、流れはサンプル回収部２２８へ向けられる。説明されるシナリオ中の流体接触材料は、再使用してよく、又は単回使用使い捨てであってよい。単回使用使い捨ては、流体接触部分の洗浄及び洗浄バリデーションを実施する必要性を排除し、したがって、時間と資源が大幅に節約される。

図２は、本開示の１つの実施形態である装置２００を示す。一つの実施形態において、本装置は、核酸を含有する脂質ナノ粒子の製造のためのシステムを提供する。別の実施形態において、本装置は、限界寸法の脂質ナノ粒子の製造のためのシステムを提供し、限界寸法の脂質ナノ粒子としては、治療的材料を含有するナノエマルジョン及びリポソームが含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本装置は、治療的材料を含有するポリマーナノ粒子の製造のためのシステムを提供する。

一つの態様において、マイクロ流体チップの連続フロー運転のためのシステムが提供される。一つの実施形態において、本システムは、以下の（１）〜（４）を含む。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）を含むマイクロ流体チップ
（ａ）第１の溶液を受容するように構成される、第１の入口
（ｂ）第２の溶液を受容するように構成される、第２の入口
（ｃ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む第１のミキサー
（ｉ）第１の入口から第１の溶液を受容するように構成される、第１の入口マイクロチャネル
（ｉｉ）第２の入口から第２の溶液を受容するように構成される、第２の入口マイクロチャネル
（ｉｉｉ）第１の溶液及び第２の溶液を混合して、ミキサー出口でナノ粒子溶液を提供するように構成される、混合マイクロチャネル
（ｄ）ナノ粒子溶液マイクロチャネルを通してミキサー出口と流体連通する、チップ出口
（２）第１の溶液を、第１の溶液リザーバから、マイクロ流体チップの第１の入口内へ、連続して駆動するように構成される、第１の連続フロー流体駆動装置
（３）第２の溶液を、第２の溶液リザーバから、マイクロ流体チップの第２の入口内へ、連続して駆動するように構成される、第２の連続フロー流体駆動装置
（４）チップ出口と流体連通し、ナノ粒子溶液をアウトプットするように構成される、システム出口

本システム及び方法が、ここでさらに詳細に説明される。

＜連続フロー＞

連続フローは、従来の小容量生産システムであるマイクロ流体を使用して、大容量の生成物（例えば、ナノ粒子）を生成することを可能にする。以下により詳細に説明される、並列化の使用は、連続フローと組み合わせると、生成能力をさらに増加させる。

本明細書で使用される用語「連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）」及び「連続して（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ）」は、長時間にわたって比較的一定の流量のシステム流れ運転を指す。この一定の流量は変化しないが、長期間の運転にわたってごくわずかに変化する。流れの変動は、「パルス」又は「脈動」と呼ばれる。脈動のレベルは、流体駆動装置の運転条件（例えば、流量及び背圧）に依存する。一つの実施形態において、この一定の流量は、５０ｍＬ／ｍｉｎの流量及び２５０ＰＳＩの背圧で、＋／−１０％以下だけ変化する。さらなる実施形態において、この一定の流量は、５０ｍＬ／ｍｉｎの流量及び２５０ＰＳＩの背圧で、＋／−４％以下である。これらの値は、パルスダンプナーが存在しない場合の値である。

ある実施形態において、連続フロー流体駆動装置のうち１又は複数からの流れ脈動を最小限にするために、システムにパルスダンプナーが組み込まれる。

一つの実施形態において、１又は複数のパルスダンプナーは、（ポンプ運転条件に依存して）流れ脈動の３：１の減少を有する。１つの例示的な実施形態において、パルスダンプナーは、流体接触材料として、可撓性ＰＴＦＥ膜及びステンレス鋼及びポリエーテルエーテルケトンを含む。

一つの実施形態において、連続運転中に生成される容量としては、少なくとも１００ｍＬが１０分間の時間内に完了する。さらなる実施形態において、連続運転中に生成される容量としては、少なくとも１００ｍＬが２．５分間の時間内に完了する。さらなる実施形態において、連続運転中に生成される容量としては、少なくとも１００ｍＬが１．３分間の時間内に完了する。

マイクロ流体デバイスが経験する圧力は、高いスループットが望まれることと高い流量が必要であることに起因して、比較的高い。一つの実施形態において、システムは、５００ＰＳＩまでの圧力で動作する。システムのピーク圧力は、ポンプの出口の圧力である。ポンプ出口での背圧は、下流の各部品（管、マニホールド、チップ、など）の背圧の合計である。システム中のマイクロ流体要素に関して、最大圧力は、チップの入口で生じる。マイクロ流体チップ入口圧力は、最大２００ＰＳＩに達する可能性がある。一つの実施形態において、マイクロ流体チップのピーク圧力は、約１００ＰＳＩ〜約２００ＰＳＩである。一つの実施形態において、システムは、約５ＰＳＩ〜約２００ＰＳＩの圧力で動作する。

一つの実施形態において、システムは、１マイクロ流体ミキサーあたり、１時間あたり５００ｍＬ超の生成物を生成することができる。一つの実施形態において、システムは、１マイクロ流体ミキサーあたり、１時間あたり７５０ｍＬ超の生成物を生成することができる。これらの生成速度は、単一システムについて、１時間あたり複数リットルの生成物をもたらすために、並列化によって倍加させることができる。

マイクロ流体による生成の小型化及び連続フロー運転により得られる能力の増加の結果、単位時間あたり同様の容量を生成することのできる既知のシステムと比較して、開示されるシステムのフットプリントは、大幅に低減される。一例として、最も小さい市販のバッチシステムであるＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（バンクーバー、ＢＣのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．によって製造されている）は、小さいフットプリントを有するマイクロ流体システムである。しかしながら、バッチ処理の性質がゆっくりであるため、８０分間で１Ｌのナノ粒子を生成するためには、４０個のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒが必要となり、その結果、フットプリントは約２ｍ^２となる。これは、本明細書中に開示される最も基本的な連続フローシステムのフットプリントの少なくとも２倍である。

一つの実施形態において、システムが、１ｍ^２以下のフットプリント面積を有する。一つの実施形態において、システムが、０．８ｍ^２以下のフットプリント面積を有する。２つのポンプを有する代表的なシステムの写真が、図１０に示されており、ここで２つのポンプは４つのマイクロ流体混合チップ（４ｘ）を駆動し、マイクロ流体混合チップはそれぞれ、単一ミキサーを備える。このシステムのフットプリントは約０．８ｍ^２であり、１時間あたり１Ｌを超えるナノ粒子溶液を生成することができる。さらなる並列化によって、本質的に同一のフットプリントを維持しながらも、この生成速度を向上させることができる。

図１０のシステムは、３：１（ポンプ＃２：ポンプ＃１）の流れ比及びマニホールドとマイクロ流体チップとの間の「垂直」連結（これは、チップの主面に対して垂直である）を含む。

図１１を参照すると、２つのポンプによって駆動される８ｘシステムが示されている。２つのマニホールドが、溶液を分配し、この溶液は８つのチップ上で混合される。各チップは、図６に示されるものと同様の単一ＳＨＭ混合デバイスを含む。単一の第３のマニホールドは、混合された溶液を８つのチップから受容し、これらの混合された溶液を、混合後の処理、希釈、及び／又は生成物捕捉のために、単一ストリームに集結させる。図１１のシステムはまた、マニホールドからチップへの連結が、チップの主面に対して平行の、「水平」構成であるという点で、図１０のシステムと異なる。連結のための水平構成は、垂直構成と比較して意外にも有益である。垂直構成は、各ミキサーアセンブリの占める空間がより少ないため、優れているように思われる。しかしながら、垂直コネクタによって形成される限られた空間では、ユーザによる連結の操作が困難になる。水平コネクタを使用することによって、連結は、容易に操作できるものとなり、よりユーザーフレンドリーになる。

一つの実施形態において、システムは、１時間あたり０．７６Ｌのナノ粒子溶液の生成量を有する。（例えば、同一の１つのマイクロ流体チップ又は別個の複数のマイクロ流体チップ上に）複数のミキサーを備える実施形態において、生成量は、ミキサーの数、Ｎによって増加させることができる。例えば、４つのミキサーは、４ｘ０．７６リットル／時間の容量を生成することができる。別の実施形態において、システムは、１時間あたり０．５Ｌのナノ粒子溶液の生成量を有する。別の実施形態において、システムは、１時間あたり１．０Ｌのナノ粒子溶液の生成量を有する。

一つの実施形態において、システムは、０．０２５Ｌ〜５０００Ｌの生成物溶液を生成するように規模調整可能である。

一つの実施形態において、システムのアウトプットは、出発物の量によってのみ制限される。すなわち、システムは、開始溶液が利用可能である限り、開始溶液から生成物を生成することができる。それ故に、単一の運転セッションにおける生成量は、連続フローの使用に起因して、システム制約によって本質的に制限されない。

＜マイクロ流体ミキサー＞

マイクロ流体チップは、混合領域を介して、第１の溶液を第２の溶液と混合するように構成される。この混合プロセスのための多くの方法が知られている。一つの実施形態において、混合はカオス的移流である。適合するマイクロ流体混合方法及びデバイスが、以下の（１）〜（６）に開示される。
（１）米国特許出願第１３／４６４６９０号。これは、ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１７６６（２０１０年１１月４日出願）の継続であり、ＵＳＳＮ ６１／２８０５１０号（２００９年１１月４日出願）の利益を主張する。
（２）米国特許出願第１４／３５３４６０号。これは、ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０００９９１（２０１２年１０月２５日出願）の継続であり、ＵＳＳＮ ６１／５５１３６６号（２０１１年１０月２５日出願）の利益を主張する。
（３）ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９１１６号（２０１４年３月１４日出願（ＷＯ ２０１４／１７２０４５として、２０１４年１０月２３日に公開））。これは、ＵＳＳＮ ６１／７９８４９５号（２０１３年３月１５日出願）の利益を主張する。
（４）ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８６５号（２０１４年７月２５日出願（ＷＯ ２０１５／０１３５９６として、２０１５年１月２９日に公開））。これは、ＵＳＳＮ ６１／８５８９７３号（２０１３年７月２６日出願）の利益を主張する。
（５）ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６０９６１号。これは、ＵＳＳＮ ６１／８９１７５８号（２０１３年１０月１６日出願）の利益を主張する。
（６）米国特許出願第６２／２７５６３０号（２０１６年１月６日出願）
上記（１）〜（６）の開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。さらに、代表的なマイクロ流体デバイスが、本明細書においてさらに詳細に開示される。

ある実施形態において、本明細書中に開示されるタイプのナノ粒子を作製するためのデバイスが提供される。このマイクロ流体デバイスは、本明細書中に開示される連続フローシステム及び方法に組み込まれる。一つの実施形態において、図６を参照すると、本デバイスは、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む。
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための、第１の入口３０２；
（ｂ）第１の入口と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネル３０４；
（ｃ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための、第２の入口３０６；
（ｄ）第２の入口と流体連通して、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネル３０８；及び
（ｅ）第１のストリーム及び第２のストリームを受容するための、第３のマイクロチャネル３１０であって、この第３のマイクロチャネルが、第１のストリーム及び第２のストリームを流すように適合された第１の領域３１２、及び第１のストリーム及び第２のストリームの内容物を混合して、限界寸法の脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように適合された第２の領域３１４を有する、第３のマイクロチャネル３１０
このように形成された脂質ナノ粒子は、第２の（混合）領域から、マイクロチャネル３１６によって、出口３１８に案内される。

一つの実施形態において、マイクロチャネルの第２の領域は、浅浮き彫り構造を含む。ある実施形態において、マイクロチャネルの第２の領域は、１つの主要な流れ方向及び１又は複数の表面を有し、この１又は複数の表面は、そこに画定された少なくとも１つの溝又は突出部を有し、この溝又は突出部は、主要な方向と角度をなす幾何学的配置を有する。他の実施態様において、第２の領域がマイクロミキサーを含む。

本デバイス及びシステムにおいて、第１のストリーム及び第２のストリームの流量を変化させる手段が使用されて、ストリームを迅速に混合し、これによりナノ粒子を提供する。

ある実施形態において、本開示のデバイスは、１０ｍｓ未満で完全な混合を提供する。

ある実施形態において、デバイスの１又は複数の領域が加熱される。

一つの実施形態において、第１のミキサーが、マイクロ流体ミキサーを含む混合領域を含み、このマイクロ流体ミキサーが、第１の溶液及び第２の溶液を混合して、第１の溶液及び第２の溶液の混合から形成されるナノ粒子溶液を提供するように構成される。

一つの実施形態において、第１のミキサーがカオス的移流ミキサーである。

一つの実施形態において、混合領域がヘリンボンミキサーを含む。ある特定の図（例えば、図６）において、ＳＨＭミキサーが示されてはいるが、他の混合構成もまた企図されることが理解されるだろう。一つの実施形態において、ミキサーが、ディーン渦ミキサーである。別の実施形態において、ミキサーが、ディーン渦分岐ミキサー（ＤＶＢＭ）であり、このＤＶＢＭについては、以下でより詳細に論じられる。一つの実施形態において、マイクロ流体チップが、２つの異なるタイプのカオス的移流ミキサーを含む。さらなる実施形態において、２つの異なるタイプのカオス的移流ミキサーが、ＳＨＭ及びディーン渦である。一つの実施形態において、マイクロ流体チップが、２つの異なるタイプのカオス的移流ミキサーを含み、ここで、２つのカオス的移流ミキサーのうち少なくとも１つが、ＳＨＭ及びディーン渦からなる群より選択される。

一つの実施形態において、混合領域が、約２０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの流体力学直径を有する。一つの実施形態において、混合領域が、約１１３マイクロメートル〜約１８１マイクロメートルの流体力学直径を有する。一つの実施形態において、混合領域が、約１５０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの流体力学直径を有する。本明細書で使用されるように、流体力学直径は、チャネルの幅及び高さの寸法を使用して、（２＊幅＊高さ）／（幅＋高さ）として定義される。

混合領域はまた、標準の幅及び高さの測定値を使用して定義することもできる。一つの実施形態において、混合領域は、約１００〜約５００マイクロメートルの幅及び約５０〜約２００マイクロメートルの高さを有する。一つの実施形態において、混合領域は、約２００〜約４００マイクロメートルの幅及び約１００〜約１５０マイクロメートルの高さを有する。

層流を維持し、マイクロ流体デバイス中の溶液の挙動を予測可能に保ち、且つ本方法を繰り返し可能に保つために、システムは、低いレイノルズ数で流れを支持するように設計される。一つの実施形態において、第１のミキサーが、２０００未満のレイノルズ数で第１の溶液及び第２の溶液を混合するような大きさ及び構成である。一つの実施形態において、第１のミキサーが、１０００未満のレイノルズ数で第１の溶液及び第２の溶液を混合するような大きさ及び構成である。一つの実施形態において、第１のミキサーが、９００未満のレイノルズ数で第１の溶液及び第２の溶液を混合するような大きさ及び構成である。一つの実施形態において、第１のミキサーが、５００未満のレイノルズ数で第１の溶液及び第２の溶液を混合するような大きさ及び構成である。

一つの実施形態において、マイクロ流体ミキサーデバイスが、１つのマイクロミキサーを含む。一つの実施形態において、単一ミキサーマイクロ流体デバイスが、２つの領域を有し、ここで第１の領域は、少なくとも２つのストリーム（例えば、１又は複数の第１のストリーム及び１又は複数の第２のストリーム）を受容して流すためのものである。第１のストリーム及び第２のストリームの内容物が、第２の領域のマイクロチャネルにおいて混合される。ここで、第１の領域及び第２の領域のマイクロチャネルが、約２０〜約５００マイクロメートルの流体力学直径を有する。さらなる実施形態において、マイクロチャネルの第２の領域は、１つの主要な流れ方向及び１又は複数の表面を有し、この１又は複数の表面は、そこに画定された少なくとも１つの溝又は突出部を有し、この溝又は突出部は、主要な方向と角度をなす幾何学的配置（例えば、ねじれ型ヘリンボンミキサー）を有する。このような幾何学的配置はＵＳ ２００４／０２６２２２３号に説明されており、これは参照によりその全体が本明細書に明確に組み込まれる。一つの実施形態において、マイクロチャネルの第２の領域が、浅浮き彫り構造を含む。ある実施形態において、第２の領域がそれぞれ、１〜約５０ｍＬ／ｍｉｎの流体流量を有する。好ましい一実施形態において、マイクロ流体デバイスの混合チャネルは、幅が３００マイクロメートル及び高さが１３０マイクロメートルである。ヘリンボン構造は、高さが４０マイクロメートル及び厚さが５０−７５マイクロメートルである。

他の実施態様において、第１のストリーム及び第２のストリームが、他のマイクロミキサーで混合される。適切なマイクロミキサーには、小滴ミキサー、Ｔ−ミキサー、ジグザグ型ミキサー、複数層ミキサー、又は他の活性ミキサーが含まれる。

一つの実施形態において、マイクロ流体ミキサーデバイスが、クランピングシステムを組み込むデバイスホルダーに取り付けられる。デバイスホルダー及びクランピングシステムは、マイクロ流体ミキサーデバイスに機械的な力を提供して、デバイス入口及び出口ポートを封止する。さらなる実施形態において、デバイスホルダー及びクランピングシステムは、マイクロ流体ミキサーデバイス及びデバイスホルダーの入口ポートと出口ポートとの間を密封するためのシーリングガスケットを含む。一つの実施形態において、シーリングガスケットは、クランピングシステムによってデバイスホルダーに取り付けられたときに、平面のマイクロ流体ミキサーデバイスに力を均一に分配するためのスプリングとして機能する。好ましい一実施形態において、シーリングガスケットがＯリングである。一つの実施形態において、デバイスホルダー及びクランピングシステムが固体ポリカーボネートプレートを含み、この固体ポリカーボネートプレートは、ねじを締め付けることによって機械的な力を加える。さらなる実施形態において、マイクロ流体ミキサーデバイス及びデバイスホルダーが、ガスケット系クランピングシステムを必要としない単一の使い捨てのプラスチックピースである。

＜溶液及び生成物＞

本明細書中に開示されるシステム及び方法の１つの機能は、溶液中のナノ粒子（「生成物」）を形成することである。参照によりこれまでに組み込まれている出願などの、本発明者によるこれまでの開示は、本システムに適合するナノ粒子の発生に関するものである。既知の及び将来開発されるナノ粒子の方法は、この方法が、本明細書中に開示されるように、ナノ粒子生成物を形成するために第１の溶液と第２の溶液との制御された組み合わせを必要とする限りは、本開示のシステムで実施することができる。

第１の溶液は、本明細書では「水性試薬」とも呼ばれ、第１の溶液リザーバにおいて提供される。一つの実施形態において、第１の溶液が第１の溶媒を含む。一つの実施形態において、第１の溶液が活性医薬成分を含む。一つの実施形態において、第１の溶液が、第１の溶媒中に核酸を含む。別の実施形態において、第１の溶液がバッファーを含む。一つの実施形態において、第１の溶液がバッファーから本質的に成る。

第２の溶液は、本明細書では「溶媒試薬」とも呼ばれ、第２の溶液リザーバにおいて提供される。一つの実施形態において、第２の溶液が第２の溶媒を含む。一つの実施形態において、第２の溶液が、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む。一つの実施形態において、第２の溶媒が水混和性溶媒（例えば、エタノール又はアセトニトリル）である。ある実施形態において、第２の溶液が、ポリマーナノ粒子形成試薬を含む水性バッファーである。

一つの実施形態において、第１の溶液が、第１の溶媒中に核酸を含み、第２の溶液が、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む。

＜並列化＞

開示されるシステムの最も基本的な構成において、単一マイクロ流体ミキサーが、１つのマイクロ流体チップ上の１つのマイクロ流体デバイスに含まれる。しかしながら、オンチップ並列化を介しても、複数のチップの使用を介しても、又はそれらの両方を介しても、いずれにせよミキサーを並列化することによって、生成量の増加が達成される。

一つの実施形態において、システムが、複数のミキサーをさらに含み、複数のミキサーのそれぞれが、第１の入口、第１の入口マイクロチャネル、第２の入口、第２の入口マイクロチャネル、混合マイクロチャネル、ミキサー出口、及びチップ出口を含み、複数のミキサーが第１のミキサーを含む。一つの実施形態において、複数のミキサーが全て同一の寸法である。別の実施形態において、複数のミキサーが異なる寸法を有する。

一つの実施形態において、複数のミキサーが、複数のマイクロ流体チップ内にある。別の実施形態において、複数のミキサーが、単一マイクロ流体チップ上にある。

一つの実施形態において、マイクロ流体ミキサーアレイが、並列に配列された１−１２８マイクロ流体ミキサーを組み込んで、製造システムのスループットを増加させる。一例として、開示される実施形態に係る１２８−ミキサーシステムは、約１．５Ｌ／ｍｉｎのナノ粒子溶液を生成することができる。

さらなる実施形態において、マイクロ流体ミキサーデバイスが、１つより多いマイクロミキサーを含む。一つの実施形態において、単一デバイスが、４つのマイクロ流体ミキサーを含む（図３）。１つの例示的な実施形態において、マイクロ流体ミキサーが、単一デバイスに並列に配列される。図３は、代表的なデバイス２５０を示しており、これは、２つの入口チャネル２５５を含み、この入口チャネル２５５は流体マニホールドシステム２６０（すなわち、オンチップマニホールド）に流れ込む。流体マニホールドシステムは、単一デバイス２６０に並列に配列された４つのマイクロ流体ミキサーに均等に入口ストリームを分割する。マイクロ流体ミキサーのアウトプットは、出口２６５で回収される。さらなる実施形態において、各ミキサーの出口２６５は、出口マニホールドシステム（示されず）と流体連通し、この出口マニホールドシステムは、図２の出口マニホールド２１４と類似の様式で、４つのデバイス全てから、混合された溶液を回収する。

図３のデバイスは、単一デバイスにおけるマイクロ流体ミキサーの平面並列化の一例である。平面並列化は、１又は複数のミキサーを同一の水平面上に配置することを指す。これらのミキサーは、（例えば、４つの出口２６５を連結する）流体バスチャネルによって、連結されていても、連結されていなくてもよい。入口と出口との間に同一の流体経路を形成することにより、各ミキサーを通る流れが確実に均等になる。垂直並列化は、平面状のミキサーを形成し、共通の入口を共有するような形でそれらを共に重ね合わせることによって達成される。理論的には、入口から下部ミキサーに流れる流体は、上部ミキサーに流れる流体よりも高い抵抗に遭遇し、それ故に流量がより低くなる。しかしながら、ミキサー間の分離を最小限にすることによって、混合構造（これは各層について同一である）の全体の抵抗と比較すると、増加した抵抗は無視できる。加えて、マイクロ流体ミキサー入口に至る流体バスの直径を増加させることによって、バスのインピーダンス及び結果として得られる個々のミキサー間のインピーダンス差が低減される。

別の実施形態において、単一デバイスは、高密度３次元マイクロ流体並列化のために、チップの平面方向及び垂直方向にマイクロ流体ミキサーアレイを有する。他の実施態様において、マイクロ流体ミキサーアレイは、複合ナノ粒子システムの多段階製造のために、順番に配置することができる。ある実施形態において、本開示のシステムは、１マイクロ流体ミキサーあたり１ｍＬ／ｍｉｎ〜５０ｍＬ／ｍｉｎの流量で動作する。別の実施形態において、システムの少なくとも１つのマイクロ流体ミキサーは、約１０ｍＬ／ｍｉｎ〜約２５ｍＬ／ｍｉｎの流量で動作する。さらなる実施形態において、各独立した連続フロー流体駆動装置は、１．０Ｌ／ｍｉｎの流量で動作する。

一つの実施形態において、複数のミキサーの少なくとも一部が、並列に配置された並列化されたミキサーであり、複数のミキサーの一部のそれぞれが、システム出口と流体連通するミキサー出口を有する。

一つの実施形態において、並列化されたミキサーが、マイクロ流体チップ上に積み重ねられた構成で配置される。

一つの実施形態において、並列化されたミキサーが、マイクロ流体チップ上に、実質的に同一の面内に、水平構成で配置される。

一つの実施形態において、並列化されたミキサーが、マイクロ流体チップ上に、水平構成及び積み重ねられた構成の両方で配置される。

ある実施形態において、本開示は、１つより多い流体混合構造（すなわち、流体構造のアレイ）を含むデバイスを提供する。ある実施形態において、本開示は、２〜約４０個の平行の流体混合構造を含む単一デバイス（すなわち、アレイ）を提供し、この流体混合構造は、約２〜約２０００ｍＬ／ｍｉｎの速度で脂質ナノ粒子を生成することができる。これらの実施形態において、デバイスは、脂質ナノ粒子特性を変化させることなく、１００ｍＬ〜約４００Ｌを生成する。

一つの実施形態において、マイクロ流体デバイスが、以下の（ａ）〜（ｆ）を含む。
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための、第１の入口；
（ｂ）第１の入口と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネル；
（ｃ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための、第２の入口；
（ｄ）第２の入口と流体連通して、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む第２のストリームを提供する、第２の入口マイクロチャネル；
（ｅ）第１のストリーム及び第２のストリームを受容するための、複数のマイクロチャネルであって、複数のマイクロチャネルのそれぞれが、第１のストリーム及び第２のストリームを流すように適合された第１の領域、及び第１のストリーム及び第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子を含む複数のストリームを提供するように適合された第２の領域を有する、複数のマイクロチャネル；及び
（ｆ）脂質ナノ粒子を含む複数のストリームを受容し組み合わせるための、第４のマイクロチャネル

ある実施形態において、第１のストリーム及び第２のストリームを受容するための、複数のマイクロチャネルのそれぞれが、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む。
（ａ）第１の入口マイクロチャネルと流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネル；
（ｂ）第２の入口マイクロチャネルと流体連通して、第２の溶媒を含む第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネル；及び
（ｃ）第１のストリーム及び第２のストリームを受容するための、第３のマイクロチャネルであって、第３のマイクロチャネルのそれぞれが、第１のストリーム及び第２のストリームを流すように適合された第１の領域、及び第１のストリーム及び第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子を含む複数のストリームを提供するように適合された第２の領域を有する、第３のマイクロチャネル

ある実施形態において、デバイスが、第１のストリーム及び第２のストリームを受容するための、２〜約４０個のマイクロチャネルを含む。これらの実施形態において、デバイスが、２〜約１６００ｍＬ／ｍｉｎの全流量を有する。

ある実施形態において、第２の領域がそれぞれ、約２０〜約３００μｍの水力直径を有する。ある実施形態において、第２の領域がそれぞれ、１〜約４０ｍＬ／ｍｉｎの流体流量を有する。

加熱要素を含む実施形態について、加熱要素は、第１のマイクロチャネル及び第２のマイクロチャネルにおける第１のストリーム及び第２のストリームの温度を、それらが第３のマイクロチャネルに入る前に、所定の温度に上昇させるのに有効である。これらの実施形態において、入口流体が所望の温度に加熱される。そして、脂質ナノ粒子形成の前に流体温度が明らかには変化しないほど十分迅速に、混合が起こる。

一つの実施形態において、本開示は、平行のマイクロ流体構造を含む、限界寸法のナノ粒子を作製するためのシステムを提供する。平行の構造において、Ｎ個の単一ミキサーが配列され、これによりＮｘＦの全流量が達成される（ここで、Ｆは、並列化されていない実装において使用される流量である）。代表的な平行のマイクロ流体構造が、図７−９に概略的に示されている。

代表的な平行のマイクロ流体構造の斜視図が図７に示され、平面図が図８Ａに示され、図８Ａのデバイスの側面図が図８Ｂに示されている。

図７を参照すると、デバイス５００は、垂直に配置された３つの流体システム４００ａ、４００ｂ、及び４００ｃ（ここで、各システムは、１つの第１の溶媒入口４０２、２つの第２の溶媒入口４０６及び４０６'を含む）、２つの混合領域４１０及び４１０'、及び単一出口４０８を含む。各システムは、第１のストリーム及び第２のストリーム４０２及び４０６及び４０６'をそれぞれ受容するための、マイクロチャネルを含む。

図８Ａ及び図８Ｂを参照すると、各流体システムは、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む。
（ａ）第１の入口３０２ａを介して第１の入口マイクロチャネル３０４ａと流体連通し、第１の溶媒を含む第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネル４０２；
（ｂ）第２の入口３０６ａを介して第２の入口マイクロチャネル３０８ａと流体連通し、第２の溶媒を含む第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネル４０６；及び
（ｃ）第１のストリーム及び第２のストリームを受容するための、第３のマイクロチャネル３１０ａであって、第３のマイクロチャネル３１０ａのそれぞれが、第１のストリーム及び第２のストリームを流すように適合された第１の領域３１２ａ、及び第１のストリーム及び第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子を含む複数のストリームを提供するように適合された第２の領域３１４ａを有する、第３のマイクロチャネル３１０ａ
マイクロチャネル３１６ａは、混合領域からの複数のストリームのうちの１つを、出口３１８ａを介して第４のマイクロチャネル４０８に案内し、出口３１８ａは、デバイスから脂質ナノ粒子を案内する。

依然として図８Ａ及び図８Ｂを参照すると、デバイスのこの実施形態において、流体システム３００ａが、第２の第２の溶媒入口４０６'及び混合領域３１０ａ'を含み、参照番号３０２ａ'、３０４ａ'、３０６ａ'、３０８ａ'、３１２ａ'、３１４ａ'、３１６ａ'及び３１８ａ'によって示される部品を備えることが理解されるだろう。これらの参照番号は、図８Ａ及び図８Ｂ中の、プライムのついていないそれらの対応部分３０２、３０４、３０６、３０８、３１２、３１４、３１６、及び３１８に対応する。

この構造は、単一ミキサーチップと比較してより高い流量でベシクルを生成し、単一ミキサーチップによって生成されたベシクルと同一のベシクルを生成する。この代表的な実施形態において、３つの試薬入口を使用して、６つのミキサーが一体化されている。これは、図７、図８Ａ、及び図８Ｂに示されるように、平面並列化及び垂直並列化の両方を使用して達成される。

平面並列化は、１又は複数のミキサーを同一の水平面上に配置することを指す。これらのミキサーは、流体バスチャネルによって、連結されていても、連結されていなくてもよい。入口と出口との間に同一の流体経路を形成することにより、各ミキサーを通る流れが確実に均等になる。又は、図９に示されるような低インピーダンスバスチャネル（ミキサーの流体インピーダンスよりも顕著に低い流体インピーダンスを有するチャネル）を使用して、入口と出口を連結することにより、効果的に均等な流れが達成される。

図９は、並列化されたデバイス５００を示す。この並列化されたデバイス５００は、水平に配置された５つの流体システム３００ａ、３００ｂ、３００ｃ、３００ｄ、及び３００ｅ（各システムは、１つの第１の溶媒入口、１つの第２の溶媒入口、１つの混合領域を含む）、及び単一出口４０８を含む。デバイス５００は、第１のストリーム及び第２のストリームを受容するためのマイクロチャネル４０２及び４０６、及びデバイスにおいて生成された脂質ナノ粒子をデバイスから案内するためのマイクロチャネル４０８を含む。

図９を参照すると、流体システム５００ａは、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む。
（ａ）第１の入口３０２ａを介して第１の入口マイクロチャネル３０４ａと流体連通し、第１の溶媒を含む第１のストリームを受容する、第１のマイクロチャネル４０２（これは入口４０３を備える）；
（ｂ）第２の入口３０６ａを介して入口マイクロチャネル３０４ａと流体連通し、第２の溶媒を含む第２の入口ストリームを受容する、第２のマイクロチャネル４０６（これは入口４０５を備える）；及び
（ｃ）第１のストリーム及び第２のストリームを受容するための、第３のマイクロチャネル３１０ａであって、この第３のマイクロチャネルが、第１のストリーム及び第２のストリームを流すように適合された第１の領域３１２ａ、及び第１のストリーム及び第２のストリームの内容物を混合して、脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように適合された第２の領域３１４ａを有する、第３のマイクロチャネル３１０ａ
図９において、マイクロチャネル３１６ａは、混合領域から、第４のマイクロチャネル４０８に、出口３１８ａを介して、第３のストリームを案内する。マイクロチャネル４０８は、デバイスから、出口４０９を介して、脂質ナノ粒子を案内する。

図９の流体システムにおいて、５つの流体システム３００ａ−３００ｅが単一面内に配置され、この単一面は、第１のマイクロチャネル４０２、第２のマイクロチャネル４０６、又は第４のマイクロチャネル４０８の面ではない。それ故に、（４０２、４０６、及び４０８により具現化される）流体バスは、１つの面内にあり、（３００ａ−３００ｅにより具現化される）ミキサーは、別の１つの面内にある。この構成は、（例えば、ミキサーを備える層を画定するリソグラフィーの追加の層を必要とすることによって）製造が複雑な追加の層をデバイスに追加するが、そのような並列化されたデバイスは、比例した量のデバイス面積を必要とすることなく、劇的に強化されたスループットを提供する。例えば、図９のデバイスにおいて、チップ上のデバイス５００のフットプリントは、匹敵する全混合容量アウトプットを有する５つの個々のデバイスのフットプリントの合計よりもはるかに小さい。したがって、一つの実施形態において、並列化されたデバイスは、ｎ個の流体システム（例えば、３００ａなど）を有し、ｎ個の独立型ミキサー（例えば、図６に示されるようなもの）のアウトプットと同じかそれより大きい混合アウトプット容量を生成するように構成され、全デバイス面積がより小さい（すなわち、並列化されたデバイスは、ｎ個の独立型ミキサーの合計された全面積よりも小さいデバイス面積を有する）。

図８Ａ及び図８Ｂを参照すると、デバイスのこの実施形態において、流体システム３００ａが、第２の第２の溶媒入口４０６'及び混合領域３１０ａ'を含み、参照番号３０２ａ'、３０４ａ'、３０６ａ'、３０８ａ'、３１２ａ'、３１４ａ'、３１６ａ'及び３１８ａ'によって示される部品を備えることが理解されるだろう。これらの参照番号は、図８Ａ及び図８Ｂ中の、プライムのついていないそれらの対応部分３０２、３０４、３０６、３０８、３１２、３１４、３１６、及び３１８に対応する。

一つの実施形態において、本開示は、限界寸法の脂質ナノ粒子を生成するためのデバイスを提供する。このデバイスは、ｎ個の流体デバイスを含み、各流体デバイスは、以下の（ａ）〜（ｄ）を含む。
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための、第１の入口３０２ａ；
（ｂ）第１の入口と流体連通して、第１の溶媒を含む第１のストリームを提供する、第１の入口マイクロチャネル３０４ａ；
（ｃ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む第２の溶液を受容するための、第２の入口３０６ａ；
（ｄ）第１のストリーム及び第２のストリームを受容するための、第３のマイクロチャネル３１０ａであって、この第３のマイクロチャネルが、第１のストリーム及び第２のストリームを流すように適合された第１の領域３１２ａ、及び第１のストリーム及び第２のストリームの内容物を混合して、マイクロチャネル３１６ａによって混合領域から案内される、限界寸法の脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように適合された第２の領域３１４ａを有する、第３のマイクロチャネル３１０ａ
ここで、各流体デバイス３００ａ−１００ｎの第１の入口３０２ａ−３０２ｎが、第１のバスチャネル４０２を通じて液体連通しており、第１のバスチャネル４０２が、第１の溶液を第１の入口のそれぞれに提供し、
各流体デバイス３００ａ−３００ｎの第２の入口３０６ａ−３０６ｎが、第２のバスチャネル４０６を通じて液体連通しており、第２のバスチャネル４０６が、第２の溶液を第２の入口のそれぞれに提供し、
各流体デバイス３００ａ−３００ｎの出口３１８ａ−３１８ｎが、第３のバスチャネル４０８を通じて液体連通しており、第３のバスチャネル４０８が、デバイスから第３のストリームを案内する。参照番号は、図９の代表的なデバイス５００を参照する。

ある実施形態において、ｎが、２〜４０の整数である。

垂直並列化は、平面状のミキサーを形成し、それらを共に積み重ね、垂直バスを介して入口と出口を連結することによって達成される。理論的には、入口から下部ミキサーに流れる流体は、上部ミキサーに流れる流体よりも高い抵抗に遭遇し、それ故に流量がより低くなる。しかしながら、これらの２つのミキサーを隔てる距離が５００マイクロメートル未満であるため、混合構造（これは各層について同一である）の全体の抵抗と比較すると、増加した抵抗は無視できる。このことは、実験結果及び流体の流れシミュレーションの両方によって確認される。この条件が真である場合の、混合層を隔てる距離は、バスの幅に依存する。

並列化されたデバイスは、最初に、平面状のバスチャネルによって並列に連結された１又は複数のマイクロ流体ミキサーを有する、平面並列化されたミキサーのポジティブモールドを形成することによって、形成される。次いで、これらのモールドを使用して、平面並列化されたミキサーの層を、鋳造、エンボス加工、又は他の方法で形成する。次いでこれらの層のうちの１又は複数を、垂直バスチャネルを使用して、積み重ね、結合し、連結することができる。ある特定の実装において、平面状のミキサー及びバスは、垂直に積み重ねる前に、２つの別個のモールドから形成してよい（必要に応じて）。一つの実施形態において、ケイ素ウェーハ上の２ｘ平面構造のポジティブモールドは、標準のリソグラフィーを使用して形成される。１つの例示的な製造方法において、次いで、等量比の（ｏｎ−ｒａｔｉｏ）ＰＤＭＳの厚い層をモールドに注ぎ、脱気し、８０℃で２５分間硬化する。次いで硬化したＰＤＭＳを剥がし、次いで、１０：１のＰＤＭＳの第２の層を、５００ｒｐｍで６０秒間、ウェーハ上にスピンし、次いで８０℃で２５分間焼成する。焼成後、両方の層を酸素プラズマに暴露し、次いで整列させる。次いで、整列されたチップを８０℃で１５分間焼成する。次いで、このプロセスを繰り返して、所望の数の層を形成する。整列は、チップをダイシングし、それぞれ個別に整列させることによって容易にすることができ、また、硬化中のポリマーの収縮を考慮して、各層について個々のウェーハを作製することによっても、容易にすることができる。

特注チップホルダーを使用して、このチップは、標準のねじ式コネクタを使用してポンプに接合している。これにより、７２ｍｌ／ｍｉｎという高い流量が達成されている。従来、単一要素ミキサーにおいては、しばしばピンがチップから放出物を漏出するために、約１０ｍｌ／ｍｉｎの流れは信頼性がなかった。これらのホルダーと接合するために、チップは、裏面がガラスに封止され、表面が、接合穴が予め開けられたポリカーボネート又はガラスの特注カットピースに封止される。ＰＣとＰＤＭＳとの結合は、シラン処置を使用して達成される。Ｏリングと信頼性のある封止を形成するためには、硬い表面が必要とされる。シランの化学的性質がナノ粒子の形成に影響を及ぼすことが示されているため、ミキサーを封止するためにガラスバッキングが維持される。

本開示のデバイス及びシステムは、限界寸法のナノ粒子の規模調整可能な生成を提供する。以下の結果は、図７−図８Ｂに示されるマイクロ流体ミキサーを使用して、同一の平均直径によって示唆される同一のベシクルを生成する能力を実証する。

＜マニホールド＞

一つの実施形態において、本開示はマニホールドシステムを含み、このマニホールドシステムは、２以上の独立した連続フローポンピングシステムからの流体ストリームを、複数の流体ストリームに分割し、この複数の流体ストリームをマイクロ流体ミキサーアレイに導く。別の実施形態において、単一デバイスは、オンデバイス又はオフデバイス流体分配スキーム（例えば流体バスなどがあるが、これに限定されない）を備える複数のマイクロ流体ミキサーを含む。

本明細書で使用される用語「マニホールド」は、液体流れを分割又は統合する任意の流体導管を指す。マニホールドは、マイクロ流体デバイスの外部にあることができ（例えば、入口又は出口ポートを介してマイクロ流体チップに接合される、図１０に示されるように）、又はマイクロ流体チップと一体化することができる（図３に示されるように）。

一つの実施形態において、図２に示されるように、独立した連続フローポンピングシステムによって駆動される流体流れは、２つのマニホールド、すなわち水溶液流体駆動装置２０８に連結された第１のマニホールド２１０及び溶媒流体駆動装置２０６に連結された第２のマニホールド２１１に入る。マニホールド２１０及び２１１は、その中を流れる溶液を、複数の流体ストリームに分割し、この複数の流体ストリームは、並列化されたマイクロ流体混合デバイス２１２に流れる。

別の実施形態において、第３のマニホールド２１４を使用して、マイクロ流体ミキサーアレイから出てくる複数のストリームを、単一アウトプットストリームに回収する。一つの実施形態において、マイクロ流体ミキサーアレイ（これは、単一マイクロ流体ミキサーを含む８つの並列化されたマイクロ流体ミキサーデバイスから成る）から出てくる、ナノ粒子を含む８つの別個の流体ストリームは、マニホールドを通して統合されて、単一アウトプットストリームを形成する。

一つの実施形態において、システムが、第１のマニホールドをさらに含み、この第１のマニホールドが、第１の溶液リザーバから第１の溶液を受容し、第１の溶液を複数のミキサーの第１の入口に分配するように構成される。

一つの実施形態において、システムが、第２のマニホールドをさらに含み、この第２のマニホールドが、第２の溶液リザーバから第２の溶液を受容し、第２の溶液を複数のミキサーの第２の入口に分配するように構成される。

一つの実施形態において、システムが、第３のマニホールドをさらに含み、この第３のマニホールドが、複数のミキサーのチップ出口からナノ粒子溶液を受容し組み合わせて、ナノ粒子溶液をシステム出口へ向かう単一チャネルに導くように構成される。

一つの実施形態において、システムが、
第１の溶液リザーバから第１の溶液を受容し、第１の溶液を複数のミキサーの第１の入口に分配するように構成される、第１のマニホールド；
第２の溶液リザーバから第２の溶液を受容し、第２の溶液を複数のミキサーの第２の入口に分配するように構成される、第２のマニホールド；及び
複数のミキサーのチップ出口からナノ粒子溶液を受容し組み合わせて、ナノ粒子溶液をシステム出口へ向かう単一チャネルに導くように構成される、第３のマニホールド
をさらに含む。

一つの実施形態において、複数のミキサーが、マイクロ流体チップ内にある。

代表的なマニホールド材料が、ＰＥＥＫ、ステンレス鋼、ＣＯＣ／ＣＯＰ、ポリカーボネート、及びＵｌｔｅｍを含む。

一つの実施形態において、マニホールドデバイスが、０．０６２５インチ外径管と接合された９−ポートを含むが、これに限定されない。別の実施形態において、０．０６２５インチ外径管とマニホールドのポートとの間の接合は、単一ピースの形態の１０−２４のねじ式継手を使用してなされる。別の実施形態において、０．０６２５インチ外径管とマニホールドのポートとの間の接合は、ナット及びフェルールである１０−２４のねじ式継手を使用してなされる。別の実施形態において、９−ポート０．０６２５インチ外径管マニホールドを使用して、独立した連続フローポンピングシステムによって駆動される流体流れを８つの別個の流体ストリームに分割する。この８つの別個の流体ストリームは、単一マイクロ流体ミキサーを含む８つの並列化されたマイクロ流体ミキサーデバイスに流れ込む。マニホールドによって発生する複数のアウトプットストリームの相対的流量は、各アウトプットストリームの相対的流体抵抗によって支配される。並列化されたマイクロ流体ミキサーアレイにおいて、マイクロ流体ミキサーは、流体経路における流体抵抗の９５％超を提供する。したがって、流れの均等な分配は、マイクロ流体ミキサーデバイスのマイクロチャネルの特徴に起因し、マニホールドからマイクロ流体ミキサーデバイスまでの管長さにおける相対的な差は重要ではない。

＜流体駆動装置システム＞

一つの実施形態において、流体駆動装置がポンプである。一つの実施形態において、システムが、２以上の、独立した連続フロー流体駆動装置を含む。

図２に示される実施形態において、溶媒計量ポンプ２０６及び水溶液計量ポンプ２０８は、装置において流体流れを提供する独立した連続フローポンピングシステムである。

一つの実施形態において、第１の連続フロー流体駆動装置及び第２の連続フロー流体駆動装置が、容積式流体駆動装置（例えば、往復ピストン、蠕動、ギヤ、ダイヤフラム、ねじ、プログレッシブキャビティなど）；渦巻ポンプ；及び圧駆動ポンプからなる群より独立して選択される。

一つの実施形態において、連続フローポンピングシステムが容積式ポンプである。容積式ポンプの例としては、蠕動ポンプ、ギヤポンプ、ねじポンプ、及びプログレッシブキャビティポンプが含まれるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態において、独立した連続フローポンプが、デュアルヘッド往復容積式ポンプである。

別の実施形態において、デュアルヘッド往復容積式ポンプが、前方に取り付けられた交換可能ポンプヘッドを有する。さらなる実施形態において、前方に取り付けられた交換可能ポンプヘッドは、１０ｍＬ／ｍｉｎ〜１０００ｍＬ／ｍｉｎの独立した流量を可能にする。

別の実施形態において、デュアルヘッド往復容積式ポンプが、Ｋｎａｕｅｒ Ａｚｕｒａ Ｐ２．２Ｌポンプである。さらなる実施形態において、Ｋｎａｕｅｒ Ａｚｕｒａ Ｐ ２．１Ｌポンプを改変して、圧力センサーをポンプ本体の外部に取り付ける。これにより、ポンプの圧力センサーの交換が容易になる。

交換可能ポンプヘッドは、連続フロー製造システムの単純で迅速な規模調整を可能にする。ある実施形態において、前方に取り付けられた交換可能ポンプヘッドは、水溶液リザーバ２０４からの流体流量と溶媒リザーバ２０２からの流体流量との比を制御する。ある実施形態において、水溶液リザーバ２０４からの流量と溶媒リザーバ２０２からの流量との比は、１：１超（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、中間の比を含む）である。他の実施態様において、溶媒リザーバ１０２からの流量と水溶液リザーバ２０４からの流量との比は、１：１超（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、中間の比を含む）である。図１０は、３：１（ポンプ＃２：ポンプ＃１）の比で動作するシステムを示している。

一つの実施形態において、デュアルヘッド往復ポンプヘッドは、低い脈動流れを提供する。さらなる実施形態において、脈動は、１０−５００ＰＳＩ背圧の追加によってさらに減衰される。背圧システムの好ましい実施形態としては、ポンピングシステムの出口に追加された、長さが延長された管、又は背圧レギュレータが含まれるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、背圧は、内径が０．０２インチの、２４インチの管を追加することによって達成される。

別の実施形態において、独立した連続フローポンピングシステムは、渦巻ポンプ、及び圧駆動ポンプから選択される。独立した連続フローポンピングシステムは、部品の交換を容易にし、単回使用流体接触部品の交換に必要な時間を短縮する。

＜希釈＞

一つの実施形態において、本システムは希釈要素をさらに含み、この希釈要素は、第３の連続フロー流体駆動装置を含み、この第３の連続フロー流体駆動装置は、チップ出口とシステム出口との間で、希釈チャネルを介して、希釈溶液リザーバから希釈溶液をシステム内に連続して駆動するように構成される。

さらなる実施形態において、図２を参照すると、本開示は、マイクロ流体ミキサーアレイから出てくるナノ粒子を、バッファー２１６、又は他の適切な媒体で希釈するための、１又は複数の追加のポンプ２１８を含む。ある実施形態において、希釈プロセスは、マイクロ流体ミキサーアレイから出てくるアウトプットストリーム内に１又は複数のバッファーを連続してポンピングすることによって達成される。一つの実施形態において、希釈ポンピングシステムが容積式ポンプである。さらなる実施形態において、容積式ポンプが、蠕動ポンプ、ギヤポンプ、ねじポンプ及びプログレッシブキャビティポンプから選択される。ある実施形態において、希釈ポンピングシステムが蠕動ポンプである。ある実施形態において、希釈ポンピングシステムが、デュアルポンプヘッドを備える蠕動ポンプである。好ましい一実施形態において、希釈ポンピングシステムが、デュアルポンプヘッドを備えるＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ蠕動ポンプである。別の実施形態において、ポンピングシステムが、渦巻ポンプ及び圧駆動ポンプから選択される。ここに列挙されたポンプの選択肢は代表的なものであり、本開示の範囲を限定するものではない。当業者であれば、本開示で使用することのできる他の代替ポンピングシステムを認識するだろう。

ある実施形態において、希釈媒体が、コネクタによってナノ粒子ストリームに導入される。一つの実施形態においてコネクタがＴ字コネクタである。別の実施形態において、コネクタがＹ字コネクタである。ある実施形態において、希釈媒体が、０．１°〜１７９．９°の範囲の角度でナノ粒子ストリームに接触する。接触の角度は、希釈プロセスにおいてナノ粒子上で誘導される撹拌のレベルを穏やかにする。好ましい一実施形態において、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ蠕動ポンプのデュアルポンプヘッドは、３０°だけオフセットされたローラープロファイルを有し、これによりポンプのアウトプット流れ脈動レベルを８０−９５％低減する。

ある実施形態において、希釈媒体が、第２の、インラインマイクロ流体ミキサーに導入される。一つの実施形態において、第２のマイクロ流体ミキサーが、第２の、インラインデバイス上にある。別の実施形態において、第２のマイクロ流体ミキサーが、同一のマイクロ流体デバイス上にある。

ナノ粒子溶液を希釈することにより、溶液中に存在する溶媒のパーセンテージが低減される。ある特定のナノ粒子について、溶媒を５０％より低く希釈すると、粒子安定性が増加する。他の実施態様において、溶媒を２５％より低く希釈することにより、ナノ粒子安定性が促進される。さらなる実施形態において、ナノ粒子が、１０％より低い溶媒含量で安定性である。

装置２００（図２）において、２つのリザーバ、溶媒リザーバ２０２及び水溶液リザーバ２０４が存在する。一つの実施形態において、リザーバが使い捨てのバッグである。さらなる実施形態において、リザーバが容器であり、容器としてはステンレス鋼リザーバが含まれるが、これに限定されない。一つの実施形態において、溶媒が水混和性溶媒であり、水混和性溶媒としては、１又は複数の脂質を含有するエタノールなどがあるが、これに限定されない。そして水溶液が低ｐＨバッファーであり、低ｐＨバッファーとしては、クエン酸バッファーｐＨ４．０などがあるが、これに限定されない。さらなる実施形態において、低ｐＨバッファー（クエン酸バッファーｐＨ４．０などがあるが、これに限定されない）が、１又は複数の核酸を含有する。さらなる実施形態において、溶媒が水混和性溶媒であり、水混和性溶媒としては、１又は複数のポリマー、又はポリマー−薬物コンジュゲートを含有するアセトニトリルなどがあるが、これらに限定されない。そして水溶液がバッファーであり、バッファーとしては、クエン酸バッファーｐＨ４．０などがあるが、これに限定されない。ポリマーナノ粒子の形成のための、代表的なバッファーは生理食塩水である。

一つの実施形態において、管２２６が、マイクロ流体チップ上のマイクロ流体チャネルである。一つの実施形態において、管２２６が、マイクロ流体チップの外部の金属管である。一実施形態において、管がプラスチック管である。別の実施形態において、管の内径が、０．０１インチ〜０．２５インチの範囲である。別の実施形態において、継手２２０、２２２としては、竹の子継手、圧縮継手、衛生継手及びねじ式継手が含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、継手が金属又はプラスチックである。好ましい一実施形態において、継手がプラスチックである。

一つの実施形態において、製造装置が、マイクロ流体ミキサーアレイから出てくるナノ粒子流体ストリームを希釈するためのメカニズムを有する。一つの実施形態において、希釈がインライン希釈によって達成され、インライン希釈では、水性バッファーがアウトプットストリームと直接接触する。

一つの実施形態において、流体駆動装置２１８が、リザーバ２１６から希釈試薬を流し、希釈試薬ストリームがナノ粒子流体ストリームと合流点で合流し、ここで、希釈試薬ストリームの流れがＴ字コネクタ２２０によって制御される。別の実施形態において、流体駆動装置２１８が、リザーバ２１６から希釈試薬を流し、希釈試薬ストリームが１つの入口を通ってマイクロ流体ミキサーデバイスに入り、ナノ粒子流体ストリームが第２の入口を通ってマイクロ流体ミキサーデバイスに入り、２つのストリームがマイクロ流体ミキサー領域に流れ、ここで、希釈試薬流体ストリームとの混合によって、ナノ粒子流体ストリームが希釈される。さらなる実施形態において、流体駆動装置２１８が、リザーバ２１６から希釈試薬を流し、希釈試薬流体ストリームがマニホールドに入り、ここで、希釈試薬流体ストリームが複数の希釈試薬流体ストリームに分割され、ナノ粒子流体ストリームが、マニホールドに入り、ここで、ナノ粒子流体ストリームが複数のナノ粒子流体ストリームに分割される。複数の希釈試薬流体ストリーム及び複数のナノ粒子流体ストリームは、並列に配列された複数のマイクロ流体ミキサーデバイスに入り、ここで、希釈試薬流体ストリームとの混合によって、ナノ粒子流体ストリームが希釈される。一つの実施形態において、ナノ粒子流体ストリームの流量と希釈試薬流体ストリームの流量との比は、１：１超（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、中間の比を含む）である。他の実施態様において、希釈試薬流体ストリームの流量とナノ粒子流体ストリームの流量との比は、１：１超（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、中間の比を含む）である。

一つの実施形態において、システムが、マイクロ流体デバイスの存在しない希釈インラインである。

＜廃棄物バルブ＞

本開示のさらなる実施形態において、ナノ粒子の規模調整可能生成のためのマイクロ流体系連続フロー製造装置が、図２に示されるように、サンプル回収部２２８から廃棄物回収部２２４を分離するためのメカニズムを含む。一つの実施形態において、バルブシステムが、アウトプットストリームを廃棄物回収部又はサンプル回収部に導く。一つの実施形態において、製造システムからのアウトプットストリームを２つに分割すること、及び独立したライン上のバルブを開閉して所望の容器に回収することによって、２容器回収（廃棄物及びサンプル）が達成される。一つの実施形態において、バルブシステムが手動システムである。又は、軟質管を挟むための自動化システムが使用される。さらなる実施形態において、手動バルブシステムがチューブクランプである。さらなる実施形態において、自動化システムがソレノイドピンチバルブである。

一つの実施形態において、システムが、廃棄物出口をさらに含み、この廃棄物出口が、チップ出口とシステム出口との間の廃棄物バルブと流体連通しており、この廃棄物バルブが、流体を廃棄物出口の方へ制御可能に導くように構成される。廃棄物バルブは、システムのプライミング又は他の非生成運転からの廃棄物を取り除くために使用される。図２に示されるように、廃棄物バルブ２２２が、サンプル容器２２８とは別個の廃棄物容器２２４に流れを導く。

＜完全に使い捨ての流体経路＞

本開示の一つの実施形態において、システムが、完全に使い捨ての流体経路を組み込んでいる。本明細書で使用される用語「使い捨ての流体経路」は、液体に接触する全ての要素が「使い捨て」であるシステムを指す。システムのある特定の生成物（例えば、ナノメディシン）の貴重な性質、及びそのような生成物の関連する価値を考えると、本明細書で使用される用語「使い捨て」は、生成された生成物に関して比較的低いコストを有する部品を指す。典型的な使い捨ての部品は、プラスチックで作られ得る管、マニホールド、及びリザーバを含む。しかしながら、本開示において、使い捨てはまた、ポンプヘッド及びマイクロ流体チップなどの部品を指す。それ故に、使い捨ての部品は、金属から作られているもの（例えば、ポンプヘッド）及び／又は精密に製造されるもの（例えば、マイクロ流体デバイス）を含む。

図２に示される実施形態において、完全に使い捨ての流体経路が、試薬バッグ２０２、２０４、２１６、管２２６、交換可能ポンプヘッド２０６、２０８、継手２２０、２２２、マニホールド２１０、２１１、２１４、及びマイクロ流体デバイス２１２を含む。

一つの実施形態において、使い捨ての流体経路が、使い捨てのマイクロ流体チップ、第１の連続フローポンプの使い捨ての第１のポンプヘッド、第２の連続フローポンプの使い捨ての第２のポンプヘッド、及び使い捨てのシステム出口を含む。

一つの実施形態において、使い捨ての第１のポンプヘッド及び使い捨ての第２のポンプヘッドが、ステンレス鋼、ポリマー（例えば、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ））、チタン、及びセラミックからなる群より独立して選択される材料で作られる。一つの実施形態において、使い捨ての第１のポンプヘッド又は使い捨ての第２のポンプヘッドのうち少なくとも１つが、金属を含む。

一つの実施形態において、第１の溶液、第２の溶液、及びナノ粒子溶液が接触する全ての表面が使い捨てである。

ある実施形態において、装置の流体経路が完全に使い捨てである。ある実施形態において、装置がＧＭＰに準拠している。これらの実施形態における全ての流体接触材料は、再使用することができ、又は単回使用使い捨てであることができる。

＜滅菌システム部品＞

一つの実施形態において、マイクロ流体チップが滅菌である。滅菌は、ある特定の生成プロセスに不可欠である。さらなる実施形態において、マイクロ流体チップは、システムと一体化される前に滅菌される。別の実施形態において、マイクロ流体チップは、システム内でその場で滅菌される。

代表的な滅菌方法としては、蒸気オートクレーブ、乾熱、化学的滅菌（すなわち、水酸化ナトリウム又はエチレンオキシド）、ガンマ線照射、ガス、及びそれらの組み合わせが含まれる。特定の実施形態において、マイクロ流体チップはガンマ線照射で滅菌される。

ある特定の用途における滅菌の重要性に起因して、ある実施形態において、マイクロ流体チップが、特定の用途に好ましいある特定のタイプの滅菌に適合する材料から形成される。

一つの実施形態において、マイクロ流体チップが、ガンマ線照射に適合する材料から形成される。ガンマ線照射に適合する材料は、照射可能な材料である。例えば、ポリカーボネート、環状オレフィンポリマー、環状オレフィンコポリマー、及び高密度ポリエチレン及び低密度ポリエチレンがある。照射することができない材料としては、ポリアミド、ポリテトラフルオロエチレン、及び任意の金属が含まれる。

システム部品の滅菌を容易にする実施形態を提供することに加えて、さらなる実施形態は、滅菌システム及び／又はシステム部分を含む滅菌パッケージを含む。これらの滅菌パッケージにより、ユーザは、その場での滅菌手順を回避することによって、時間とコストを低減することができる。

加えて、開示されるシステムを使用して合成することのできるある特定の粒子は、最終滅菌に適合しておらず、それ故に下流で滅菌することができない。それ故に、滅菌製造経路が必要とされる。一般に、滅菌ろ過が最終滅菌に使用される技術であり、約２００ｎｍ超の寸法（例えば、直径）を有する粒子は、最終滅菌に適合しない。したがって、一つの実施形態において、システム及び方法が、２００ｎｍ以上の寸法を有する粒子の滅菌合成を提供するように構成される。したがって、一つの実施形態において、システム及び方法が、最終滅菌のない粒子の滅菌合成を提供するように構成される。

最終滅菌（例えば、滅菌ろ過）に適合しない代表的な粒子としては、ＤＮＡ／ＲＮＡリポプレックスが含まれ、このＤＮＡ／ＲＮＡリポプレックスは、ＤＮＡ／ＲＮＡを予め形成されたリポソームと混合すること（これは最終滅菌することのできない２００ｎｍより大きい粒子構造をもたらす可能性がある）によって製造される。高い多分散性を備えるある特定の薬物コンジュゲートポリマーナノ粒子もまた、最終滅菌の実行を難しくするほど十分に大きい。

開示される実施形態によれば、生成環境において滅菌パッケージを開封し、パッケージの内容物をシステムに実装し、予備滅菌ステップなしでシステムを運転することができる。したがって、一つの実施形態において、滅菌パッケージが提供される。一つの実施形態において、滅菌パッケージが、滅菌パッケージ内に封止された本開示に係る滅菌マイクロ流体チップを含む。さらなる実施形態において、滅菌パッケージが、滅菌パッケージ内に封止された、ポンプヘッドを含む、滅菌使い捨て流体経路全体を含む。

滅菌システム部分は、当業者に知られ、本明細書中に開示される任意の方法によって滅菌することができる。例えば、ある実施形態において、ガンマ線照射を使用してシステム部分を滅菌する。

滅菌後、滅菌システム部分は、滅菌環境下に維持され、使用まで無菌性を維持するために、密閉された状態でパッケージングされる。

ある実施形態において、ナノ粒子製造は、滅菌生成物を保証するためのろ過の必要性を排除する特殊なバリア施設において実施される。

＜ソフトウェア制御＞

本システムはソフトウェア（例えば、図１の部分１０２）によって制御される。さらなる実施形態において、全体の製造システムがソフトウェア制御される。このようなソフトウェア制御は、当業者に一般に知られている。一つの実施形態において、図２を参照すると、ソフトウェアは、第１の流体駆動装置２０２及び第２の流体駆動装置２０４を制御する。さらなる実施形態において、ソフトウェアは、システム１００又は２００の全ての流体駆動装置を制御する。

＜ナノ粒子を作製するための方法＞

一つの実施形態において、本開示は、本開示のマイクロ流体系連続フロー製造装置を使用する、ナノ粒子の規模調整可能生成のための方法を提供する。

一つの態様において、ナノ粒子を形成する方法が提供される。一つの実施形態において、本方法が、開示される任意の実施形態に係るシステムを通して第１の溶液及び第２の溶液を流すステップ及びマイクロ流体チップの第１のミキサーにおいてナノ粒子溶液を形成するステップを含む。

一つの実施形態において、本システムが複数のミキサーを含み、本方法が、複数のミキサーを通して第１の溶液及び第２の溶液を流して、ナノ粒子溶液を形成するステップをさらに含み、ここで複数のミキサーが第１のミキサーを含む。

一つの実施形態において、複数のミキサーが、複数のマイクロ流体チップ内に含まれる。

一つの実施形態において、複数のミキサーが、単一マイクロ流体チップ内に含まれる。

一つの実施形態において、本装置が、治療的材料を含有する脂質ナノ粒子の製造のためのシステム及びプロセスを提供する。

別の実施形態において、本装置が、治療的材料を含有するポリマーナノ粒子の製造のためのシステム及びプロセスを提供する。

一つの実施形態において、装置が、２つのリザーバ：溶媒リザーバ及び水溶液リザーバを有する。一つの態様において、溶媒リザーバが水混和性溶媒を含み、水混和性溶媒としては、１又は複数の脂質を含有するエタノールなどがあるが、これに限定されない。別の態様において、溶媒リザーバが水混和性溶媒を含み、水混和性溶媒としては、１又は複数のポリマー、又はポリマー−薬物コンジュゲートを含有するアセトニトリルなどがあるが、これらに限定されない。一つの態様において、水溶液リザーバがバッファーを含み、バッファーとしては、クエン酸バッファーｐＨ４．０などがあるが、これに限定されない。さらなる態様において、水溶液リザーバがバッファーを含み、バッファーとしては、１又は複数の治療的材料を含有するクエン酸バッファーｐＨ４．０などがあるが、これに限定されない。

一つの実施形態において、リザーバの内容物は、独立した連続フローポンピングシステムによって、本開示の装置の流体経路に引き込まれる。一つの態様において、各独立した連続フロー製造ポンプが、０．１Ｌ／ｍｉｎ−１．０Ｌ／ｍｉｎの流量で動作する。一つの態様において、本開示がマニホールドシステムを含み、このマニホールドシステムが、２以上の独立した連続フローポンピングシステムからの流体ストリームを複数の流体ストリームに分割し、その結果以下の（ａ）〜（ｄ）のとおりになる。
（ａ）第１の溶媒（例えば、水性バッファー）を含む第１のストリームが、各独立したマイクロ流体ミキサーの第１のチャネルに、第１の流量で導入される。
（ｂ）第２の溶媒（例えば、水混和性溶媒）を含む第２のストリームが、各独立したマイクロ流体ミキサーの第２のチャネルに、第２の流量で導入されて、第１の及び第２の隣接するストリームを提供する。ここで、第１の溶媒及び第２の溶媒が同一ではなく、第１の流量と第２の流量との比が１．０より大きい。
（ｃ）第１のストリーム及び第２のストリームが、第１の領域から第２の領域へ流れる。
（ｄ）第１のストリーム及び第２のストリームが、装置の第２の領域において混合されて、脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供する。

一つの実施形態において、本装置がマイクロ流体装置である。ある実施形態において、流れの予備混合が層流である。ある実施形態において、第１のストリーム及び第２のストリームの混合が、カオス的移流を含む。他の実施態様において、第１のストリーム及び第２のストリームの混合が、マイクロミキサーでの混合を含む。

一つの態様において、マイクロ流体ミキサーアレイが、並列に配列された１−１２８のマイクロ流体ミキサーを組み込んで、製造システムのスループットを増加させる。ある特定の態様において、単一マイクロ流体ミキサーは１つのデバイス上に含まれる。別の態様において、単一デバイスは複数のマイクロ流体ミキサーを含む。一つの実施形態において、単一デバイスは、４つのマイクロ流体ミキサーを含む（図３）。

一つの実施形態において、第１のストリーム及び第２のストリームの流量が、１マイクロ流体ミキサーあたり１ｍＬ／ｍｉｎ〜５０ｍＬ／ｍｉｎである。

ある実施形態において、第１の流量と第２の流量との比が、１：１超（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、中間の比を含む）である。

ある実施形態において、最終ナノ粒子生成物が、滅菌バイアルに分注される。

＜ディーン渦分岐ミキサー（「ＤＶＢＭ」）＞

上述したように、ＤＶＢＭは、開示される連続フローシステムにおけるミキサーとして有用である。本明細書中に開示されるタイプのＤＶＢＭは、効率的なミキサーとして機能し、その射出成形工具は、半径がＲ（例えば３００μｍ）のエンドミルによって生成することができる。提供されるＤＶＢＭミキサーは、複数のトロイダル混合要素（本明細書では「トロイダルミキサー」とも呼ばれる）を含む。本明細書で使用される「トロイド」は、トロイダルミキサーの入口と出口との間でトロイドの外周を画定する、２つの「脚部」チャネルを有するほぼ円形の構造を指す。ある実施形態において、トロイダルミキサーは円形である。他の実施態様において、トロイダルミキサーは完全に円形ではなく、代わりに卵形又は非規則的形状を有してよい。

図１２Ａは、開示される実施形態に係る一対のトロイダルＤＶＢＭミキサーを示す。図１２Ｂは、開示される実施形態に係る例示的なトロイダルＤＶＢＭミキサーの写真である。

一つの実施形態において、ＤＶＢＭミキサーは、少なくとも第１の液体及び第２の液体を混合するように構成される。このミキサーは、直列に配置された複数のトロイダル混合要素に通じる入口チャネルを含む。複数のトロイダル混合要素は、入口チャネルの下流にある第１のトロイダル混合要素、及び第１のネック領域を介して第１のトロイダル混合要素と流体連通する第２のトロイダル混合要素を含む。第１のトロイダル混合要素は、入口チャネルと第１のネック領域との間の第１のネック角度を画定する。

一つの実施形態において、第１のネック角度が０〜１８０度である。

一つの実施形態において、第１のネック領域が、０．２ｍｍ以上の長さを有する。

一つの実施形態において、複数の混合要素が、約２０マイクロメートル〜約２ｍｍの流体力学直径を有するチャネルを含む。

一つの実施形態において、ミキサーが、１０００未満のレイノルズ数で第１の液体及び第２の液体を混合するような大きさ及び構成である。

一つの実施形態において、ミキサーが、２以上のミキサーを並列に含み、各ミキサーが複数のトロイダル混合要素を有する。

一つの実施形態において、第１のトロイダル混合要素及び第２のトロイダル混合要素が混合対を画定し、ミキサーが複数の混合対を含み、各混合対が、ネック領域によって、あるネック角度で合流される。

一つの実施形態において、第１のトロイダル混合要素が、第１の長さの第１の脚部及び第２の長さの第２の脚部を有し、第２のトロイダル混合要素が、第３の長さの第１の脚部及び第４の長さの第２の脚部を有する。

一つの実施形態において、第１の長さが第２の長さより大きい。

一つの実施形態において、第３の長さが第４の長さより大きい。

一つの実施形態において、第１の長さと第２の長さとの比が、第３の長さと第４の長さとの比とほぼ等しい。

一つの実施形態において、第１のトロイダル混合要素が、第１のインピーダンスの第１の脚部及び第２のインピーダンスの第２の脚部を有し、第２のトロイダル混合要素が、第３のインピーダンスの第１の脚部及び第４のインピーダンスの第２の脚部を有する。

一つの実施形態において、第１のインピーダンスが第２のインピーダンスより大きい。

一つの実施形態において、第３のインピーダンスが第４のインピーダンスより大きい。

一つの実施形態において、第１のインピーダンスと第２のインピーダンスとの比が、第３のインピーダンスと第４のインピーダンスとの比とほぼ等しい。

一つの実施形態において、ミキサーが、２〜２０のトロイダル混合要素を直列に含む。

一つの実施形態において、ミキサーが、１〜１０対のトロイダル混合要素を直列に含む。

一つの実施形態において、トロイダル混合要素が、約０．１ｍｍ〜約２ｍｍの内径を有する。

開示される実施形態に係るＤＶＢＭミキサーを通して、第１の液体及び第２の液体を流すステップを含む、第１の液体を第２の液体と混合する方法も提供される。

＜定義＞

＜マイクロ流体＞

本明細書で使用される用語「マイクロ流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）」は、マイクロメートルスケールの寸法（すなわち、１ｍｍ未満の寸法）を有する少なくとも１つのチャネルを含む、流体サンプルを操作する（例えば、流す、混合する、など）ためのシステム又はデバイスを指す。

＜治療的材料＞

本明細書で使用される用語「治療的材料」は、疾患の診断、治癒、緩和、理解、治療又は予防において、薬理的活性を与えること又は他の方法で直接的な効果を有すること、又は生理学的機能の回復、矯正又は改変に直接的な効果を有することが意図される物質として定義される。治療的材料としては、小分子薬物、核酸、タンパク質、ペプチド、多糖、無機イオン及び放射性核種が含まれるが、これらに限定されない。

＜ナノ粒子＞

本明細書で使用される用語「ナノ粒子」は、治療的材料をカプセル化するために使用され、２５０ナノメートル未満の最小寸法を有する成分材料（例えば脂質、ポリマーなど）を１つより多く含む、均一な粒子として定義される。ナノ粒子としては、脂質ナノ粒子及びポリマーナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。

＜脂質ナノ粒子＞

一つの実施形態において、脂質ナノ粒子が、
（ａ）コア；及び
（ｂ）コアを取り囲むシェル、
を含み、シェルがリン脂質を含む。

一つの実施形態において、コアが脂質（例えば、脂肪酸トリグリセリド）を含み、コアが固体である。別の実施形態において、コアが液体（例えば、水溶液）であり、粒子がリポソームなどのベシクルである。一つの実施形態において、コアを取り囲むシェルが単分子層である。

上述したように、一つの実施形態において、脂質コアが脂肪酸トリグリセリドを含む。適切な脂肪酸トリグリセリドとしては、Ｃ８−Ｃ２０脂肪酸トリグリセリドが含まれる。一つの実施形態において、脂肪酸トリグリセリドがオレイン酸トリグリセリドである。

脂質ナノ粒子はシェルを含み、このシェルは、コアを取り囲むリン脂質を含む。適切なリン脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが含まれる。一つの実施形態において、リン脂質が、Ｃ８−Ｃ２０脂肪酸ジアシルホスファチジルコリンである。代表的なリン脂質は、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である。

ある実施形態において、リン脂質と脂肪酸トリグリセリドとの比が、２０：８０（ｍｏｌ：ｍｏｌ）〜６０：４０（ｍｏｌ：ｍｏｌ）である。好ましくは、トリグリセリドが、４０％超且つ８０％未満の割合で存在する。

ある実施形態において、ナノ粒子がステロールをさらに含む。代表的なステロールはコレステロールを含む。一つの実施形態において、リン脂質とコレステロールとの比が５５：４５（ｍｏｌ：ｍｏｌ）である。代表的な実施形態において、ナノ粒子が、５５−１００％のＰＯＰＣ及び１０ｍｏｌ％までのＰＥＧ−脂質を含む。

他の実施態様において、本開示の脂質ナノ粒子は、ホスホグリセリドを含む１又は複数の他の脂質を含んでよい。ホスホグリセリドの代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。リンを含まない他の化合物、例えばスフィンゴ脂質及びスフィンゴ糖脂質族などが有用である。トリアシルグリセロールもまた有用である。

本開示の代表的なナノ粒子は、約１０〜約１００ｎｍの直径を有する。直径の下限は約１０〜約１５ｎｍである。

本開示の限界寸法の脂質ナノ粒子は、１又は複数の治療的及び／又は診断的薬剤を含むことができる。これらの薬剤は典型的には、粒子コア内に含まれる。本開示のナノ粒子は、多種多様な治療的及び／又は診断的薬剤を含むことができる。

適切な治療的薬剤としては、化学療法剤（すなわち、抗新生物剤）、麻酔剤、ベータ−アドレナリン遮断剤、抗高血圧剤、抗うつ剤、抗痙攣剤、制吐剤、抗ヒスタミン剤、抗不整脈剤、及び抗マラリア剤が含まれる。

代表的な抗新生物剤としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ストレプトゾシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、メクロレタミン、塩酸塩、メルファラン、シクロホスファミド、トリエチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、チオグアニン、シタラビン、フロクスウリジン、ダカルバジン、シスプラチン、プロカルバジン、ビノレルビン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、ベキサロテン、テニポシド、トレチノイン、イソトレチノイン、シロリムス、フルベストラント、バルルビシン、ビンデシン、ロイコボリン、イリノテカン、カペシタビン、ゲムシタビン、ミトキサントロン塩酸塩、オキサリプラチン、アドリアマイシン、メトトレキセート、カルボプラチン、エストラムスチン、及びそれらの医薬的に許容される塩が含まれる。

別の実施形態において、脂質ナノ粒子は、核酸脂質ナノ粒子である。

用語「核酸−脂質ナノ粒子」は、核酸を含有する脂質ナノ粒子を指す。脂質ナノ粒子は、１又は複数のカチオン性脂質、１又は複数の第２の脂質、及び１又は複数の核酸を含む。

カチオン性脂質。脂質ナノ粒子はカチオン性脂質を含む。本明細書で使用される用語「カチオン性脂質」は、カチオン性であるか、又はｐＨが脂質のイオン化可能基のｐＫより低いときにカチオン性になり（プロトン化され）、しかしより高いｐＨ値では次第により中性となる、脂質を指す。ｐＫより低いｐＨ値では、脂質は次いで、負に荷電した核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と会合することができる。本明細書で使用される用語「カチオン性脂質」は、ｐＨが低下すると正電荷を帯びる両性イオン性脂質を含む。

用語「カチオン性脂質」は、選択的なｐＨ、例えば生理学的ｐＨなどで、正味の正電荷を有する多数の脂質種のうち任意のものを指す。このような脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３−（Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）及びＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が含まれるが、これらに限定されない。加えて、本開示において使用することのできる多数のカチオン性脂質の市販製剤が利用可能である。これらには、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの、ＤＯＴＭＡ及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）及び（ＤＯＰＥ）を含む市販のカチオン性リポソーム）；及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩからの、エタノール中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販のカチオン性脂質）が含まれる。以下の脂質はカチオン性であり、生理学的ｐＨより低いｐＨで正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。

一つの実施形態において、カチオン性脂質がアミノ脂質である。本開示において有用な適切なアミノ脂質は、ＷＯ２００９／０９６５５８において説明されるものを含み、このＷＯ２００９／０９６５５８は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。代表的なアミノ脂質としては、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ・Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ・Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、及び２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）が含まれる。

適切なアミノ脂質としては、以下の式を有するものが含まれる。

式中、Ｒ_１及びＲ_２が、同一であるか又は異なっており、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１０−Ｃ_２４アルキル、任意選択的に置換されたＣ_１０−Ｃ_２４アルケニル、任意選択的に置換されたＣ_１０−Ｃ_２４アルキニル、又は任意選択的に置換されたＣ_１０−Ｃ_２４アシルであり；
Ｒ_３及びＲ_４が、同一であるか又は異なっており、独立して、任意選択的に置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキル、任意選択的に置換されたＣ_２−Ｃ_６アルケニル、又は任意選択的に置換されたＣ_２−Ｃ_６アルキニルであるか、又はＲ_３及びＲ_４が、結合して、４〜６の炭素原子及び窒素及び酸素から選択される１又は２のヘテロ原子の、任意選択的に置換された複素環を形成してよく；
Ｒ_５が存在しないか又は存在し、存在する場合には水素又はＣ_１−Ｃ_６アルキルであり；
ｍ、ｎ、及びｐが、同一であるか又は異なっており、独立して、０又は１であり、但しｍ、ｎ、及びｐが同時に０ではなく；
ｑが０、１、２、３、又は４であり；
Ｙ及びＺが、同一であるか又は異なっており、独立して、Ｏ、Ｓ、又はＮＨである。

一つの実施形態において、Ｒ_１及びＲ_２がそれぞれリノレイルであり、アミノ脂質がジリノレイルアミノ脂質である。一つの実施形態において、アミノ脂質がジリノレイルアミノ脂質である。

代表的な有用なジリノレイルアミノ脂質は、以下の式を有する。

式中、ｎが０、１、２、３、又は４である。

一つの実施形態において、カチオン性脂質がＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡである。一つの実施形態において、カチオン性脂質がＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（上記のＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡであって、ｎが２である）である。

他の適切なカチオン性脂質としては、生理学的ｐＨ付近で正味の正電荷を有するカチオン性脂質であって、具体的に上述したものに加えて、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ）；３β−（Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、及びＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が含まれる。加えて、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥ含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬより入手可能）、及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬより入手可能）などの、多数のカチオン性脂質の市販製剤を使用することができる。

カチオン性脂質は約３０〜約９５モルパーセントの量で脂質粒子中に存在する。一つの実施形態において、カチオン性脂質が約３０〜約７０モルパーセントの量で脂質粒子中に存在する。一つの実施形態において、カチオン性脂質が約４０〜約６０モルパーセントの量で脂質粒子中に存在する。

一つの実施形態において、脂質粒子が、１又は複数のカチオン性脂質及び１又は複数の核酸のみを含む（「から成る」）。

第２の脂質。ある実施形態において、脂質ナノ粒子が、１又は複数の第２の脂質を含む。適切な第２の脂質が、ナノ粒子の形成中に、ナノ粒子の形成を安定化する。

用語「脂質」は、脂肪酸のエステルであり、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることによって特徴付けられる、有機化合物の群を指す。脂質は通常、少なくとも３クラスに分割される：（１）脂肪及び油並びにワックスを含む、「単純脂質」；（２）リン脂質及び糖脂質を含む、「複合脂質」；及び（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。

適切な安定化脂質としては、中性脂質及びアニオン性脂質が含まれる。

中性脂質。用語「中性脂質」は、生理学的ｐＨで非電荷の形態又は中性の両性イオンの形態で存在する多数の脂質種のうち任意の１つを指す。代表的な中性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、及びセレブロシドが含まれる。

例示的な脂質としては、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、及び１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）が含まれる。

一つの実施形態において、中性脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。

アニオン性脂質。用語「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨで負に荷電した任意の脂質を指す。これらの脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が含まれる。

他の適切な脂質としては、糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ_１）が含まれる。他の適切な第２の脂質としては、コレステロールなどのステロールが含まれる。

ポリエチレングリコール−脂質。ある実施形態において、第２の脂質がポリエチレングリコール−脂質である。適切なポリエチレングリコール−脂質としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが含まれる。代表的なポリエチレングリコール−脂質としては、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、及びＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧが含まれる。一つの実施形態において、ポリエチレングリコール−脂質が、Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）_２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。一つの実施形態において、ポリエチレングリコール−脂質が、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧである。

ある実施形態において、第２の脂質が、約０．５〜約１０モルパーセントの量で脂質粒子中に存在する。一つの実施形態において、第２の脂質が、約１〜約５モルパーセントの量で脂質粒子中に存在する。一つの実施形態において、第２の脂質が、約１モルパーセントで脂質粒子中に存在する。

核酸。本開示の脂質ナノ粒子は、核酸の全身的な又は局所的な送達に有用である。本明細書に記載されるように、核酸は、脂質粒子の形成中に、脂質粒子に組み込まれる。

本明細書で使用される用語「核酸」は、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことが意図される。５０個までのヌクレオチドを含む断片は一般に、オリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。具体的な実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは、２０−５０ヌクレオチド長である。本開示の文脈において、用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）結合から成る、ヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのポリマー又はオリゴマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」はまた、同様に機能する、天然に存在しないモノマーを含むポリマー又はオリゴマー、又はそれらの一部、を含む。このような修飾又は置換されたオリゴヌクレオチドはしばしば、例えば、細胞内取込が強化されている、及びヌクレアーゼの存在下での安定性が増加しているなどの特性のために、天然型よりも好ましい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチド又はリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースと呼ばれる５炭素糖から成り、このデオキシリボースは、この糖の５'及び３'炭素でリン酸に共有結合して、交互の、非分岐ポリマーを形成している。リボオリゴヌクレオチドは、５炭素糖がリボースである同様の繰り返し構造から成る。本開示に係る脂質粒子中に存在する核酸は、既知の任意の形態の核酸を含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが可能である。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、制御領域及び終止領域を含む遺伝子、及びウイルス又はプラスミドＤＮＡなどの自己複製システムが含まれる。二本鎖ＲＮＡの例としては、ｓｉＲＮＡ及び他のＲＮＡ干渉試薬が含まれる。一本鎖核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、及び三本鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。

一つの実施形態において、ポリ核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある実施形態において、核酸が、アンチセンス核酸、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、予備縮合ＤＮＡ、又はアプタマーである。

用語「核酸」はまた、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リン酸−糖−骨格オリゴヌクレオチド、他のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及びそれらの組み合わせを指し、且つ必要に応じて、一本鎖であるか、二本鎖であるか、又は二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。

本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、一般的に、以下の用語を包含し、これらの用語は以降で定義される：ヌクレオチド塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体、及びユニバーサルヌクレオチド。

本明細書で使用される用語「ヌクレオチド塩基」は、置換又は非置換の１又は複数の親芳香環を指す。いくつかの実施形態において、この１又は複数の又は複数の芳香環は、少なくとも１つの窒素原子を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド塩基は、適切な相補性ヌクレオチド塩基と、ワトソン・クリック及び／又はフーグスティーン水素結合を形成することができる。例示的なヌクレオチド塩基及びそれらの類似体としては、プリン、例えば２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、アデニン（Ａ）、エテノアデニン、Ｎ６−２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ６−メチルアデニン、グアニン（Ｇ）、イソグアニン、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、２−チオピリミジン、６−チオグアニン（６ｓＧ）ヒポキサンチン及びＯ６−メチルグアニン；７−デアザ−プリン、例えば７−デアザアデニン（７−デアザ−Ａ）及び７−デアザグアニン（７−デアザ−Ｇ）；ピリミジン、例えばシトシン（Ｃ）、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、チミン（Ｔ）、４−チオチミン（４ｓＴ）、５，６−ジヒドロチミン、Ｏ４−メチルチミン、ウラシル（Ｕ）、４−チオウラシル（４ｓＵ）及び５，６−ジヒドロウラシル（ジヒドロウラシル；Ｄ）；インドール、例えばニトロインドール及び４−メチルインドール；ピロール、例えばニトロピロール；ネブラリン；塩基（Ｙ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド塩基はユニバーサルヌクレオチド塩基である。追加の例示的なヌクレオチド塩基は、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｐ． ３８５−３９４、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．及びそこに引用されている参考文献に見出すことができる。ユニバーサル塩基のさらなる例は、例えば、Ｌｏａｋｅｓ， Ｎ． Ａ． Ｒ． ２００１、ｖｏｌ ２９：２４３７−２４４７及びＳｅｅｌａ Ｎ． Ａ． Ｒ． ２０００、ｖｏｌ ２８：３２２４−３２３２に見出すことができる。

本明細書で使用される用語「ヌクレオシド」は、ペントース糖のＣ−１'炭素に共有結合したヌクレオチド塩基を有する化合物を指す。いくつかの実施形態において、結合はヘテロ芳香環窒素を介する。典型的なペントース糖としては、炭素原子のうち１又は複数がそれぞれ独立して、同一の又は異なる−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲ又はハロゲン基（ここで、各Ｒが独立して水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル又は（Ｃ５−Ｃ１４）アリールである）のうち１又は複数で置換されているペントースが含まれるが、これに限定されない。このペントース糖は、飽和又は不飽和であってよい。例示的なペントース糖及びその類似体としては、リボース、２'−デオキシリボース、２'−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース、２'−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボース、２'，３'−ジデオキシリボース、２'，３'−ジデヒドロリボース、２'−デオキシ−３'−ハロリボース、２'−デオキシ−３'−フルオロリボース、２'−デオキシ−３'−クロロリボース、２'−デオキシ−３'−アミノリボース、２'−デオキシ−３'−（Ｃ１−Ｃ６）アルキルリボース、２'−デオキシ−３'−（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシリボース及び２'−デオキシ−３'−（Ｃ５−Ｃ１４）アリールオキシリボースが含まれるが、これらに限定されない。例えば、２'−Ｏ−メチル，４'−．アルファ．−アノマーヌクレオチド、１'−．アルファ．−アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅ （１９９１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：４０６７−７４）、２'−４'−及び３'−４'−結合した及び他の「ロックされた（ロックド）」又は「ＬＮＡ」、二環式糖修飾（ＷＯ９８／２２４８９；ＷＯ９８／３９３５２；ＷＯ９９／１４２２６）もまた参照されたい。「ＬＮＡ」又は「ロックド核酸」は、リボース環が、２'−酸素と３'−又は４'−炭素との間のメチレン結合によって束縛されるように、立体配座的にロックされたＤＮＡ類似体である。結合によって課せられた立体配座の制限はしばしば、相補性配列に対する結合親和性を増加させ、そのような二本鎖の熱安定性を増加させる。

糖は、２'又は３'位に、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ及びブロモなどの修飾を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドは、天然Ｄ型立体配置異性体（Ｄ体）、及びＬ型立体配置異性体（Ｌ体）を含む（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ、米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ、米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ、ＥＰ０５４０７４２；Ｇａｒｂｅｓｉ （１９９３） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ （１９９０） Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１２：７４３５；Ｕｒａｔａ、（１９９３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ． Ｎｏ． ２９：６９−７０）。核酸塩基がプリン、例えば、Ａ又はＧである場合、リボース糖が核酸塩基のＮ９位に結合する。核酸塩基がピリミジン、例えば、Ｃ、Ｔ又はＵである場合、ペントース糖が核酸塩基のＮ１位に結合する（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ及びＢａｋｅｒ、（１９９２） ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、２．ｓｕｐ．ｎｄ Ｅｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）。

ヌクレオシドのペントース炭素のうち１又は複数が、リン酸エステルで置換されてよい。いくつかの実施形態において、リン酸エステルがペントースの３'−又は５'−炭素に結合する。いくつかの実施形態において、ヌクレオシドは、ヌクレオチド塩基が、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、ユニバーサルヌクレオチド塩基、特定のヌクレオチド塩基、又はそれらの類似体であるヌクレオシドである。

本明細書で使用される用語「ヌクレオチド類似体」は、ペントース糖及び／又はヌクレオチド塩基及び／又はヌクレオシドのリン酸エステルのうち１又は複数が、そのそれぞれの類似体で置き換えられ得る実施形態を指す。いくつかの実施形態において、例示的なペントース糖類似体は、上記のものである。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド類似体は、上述のヌクレオチド塩基類似体を有する。いくつかの実施形態において、例示的なリン酸エステル類似体としては、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホロアミデート、ボロノホスフェート（ｂｏｒｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が含まれるがこれらに限定されず、例示的なリン酸エステル類似体は、会合した対イオンを含んでよい。他の核酸類似体及び塩基としては、例えばインターカレーション核酸（ＩＮＡｓ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ及びＰｅｄｅｒｓｅｎ、２００２に説明されるような）、及びＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ、米国特許第５，４３２，２７２号）が含まれる。様々な核酸類似体の追加の説明は、例えば、（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５ （１９９３）及びその参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ３５：３８００ （１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８１：５７９ （１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：３４８７ （１９８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ８０５ （１９８４）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：４４７０ （１９８８）；及びＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：１４３７ （１９９１）；及び米国特許第５，６４４，０４８号にも見出される。他の核酸類似体としては、以下のものが含まれる：ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１１：２３２１ （１９８９）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照）、陽性の骨格を有する類似体（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６０９７ （１９９５）；非イオン性の骨格を有する類似体（米国特許第５，３８６，０２３号、５，３８６，０２３号、５，６３７，６８４号、５，６０２，２４０号、５，２１６，１４１号、及び４，４６９，８６３号、Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３ （１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：４４７０ （１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７ （１９４）： Ｃｈａｐｔｅｒｓ ２ ａｎｄ ３、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ． Ｙ． Ｓ． Ｓａｎｇｈｕｉ及びＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ４：３９５ （１９９４）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７ （１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３７：７４３ （１９９６））及び非リボース骨格を有する類似体（これは、米国特許第５，２３５，０３３号及び５，０３４，５０６号、及びＣｈａｐｔｅｒｓ ６ ａｎｄ ７、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｅｄ． Ｙ． Ｓ． Ｓａｎｇｈｕｉ及びＰ． Ｄａｎ Ｃｏｏｋにおいて説明されるものを含む）。１又は複数の炭素環糖を含む核酸もまた、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ． （１９９５） ｐｐ１６９−１７６参照）。いくつかの核酸類似体は、Ｒａｗｌｓ、Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ Ｊｕｎｅ ２、１９９７ ｐａｇｅ ３５においても説明される。

本明細書で使用される用語「ユニバーサルヌクレオチド塩基」又は「ユニバーサル塩基」は、芳香環部分を指し、窒素原子を含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基をペントース糖のＣ−１'炭素に共有結合させて、ユニバーサルヌクレオチドを作製してよい。いくつかの実施形態において、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、別のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合しない。いくつかの実施形態において、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、最大で、特定の標的ポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチド塩基を含む、ヌクレオチド塩基と水素結合する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド塩基は、疎水性のスタッキングによって、同一の核酸鎖上の隣接するヌクレオチド塩基と相互作用し得る。ユニバーサルヌクレオチドとしては、デオキシ−７−アザインドール三リン酸（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリル三リン酸（ｄＩＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリル三リン酸（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル−７−アザインドール三リン酸（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、デオキシＩｍＰｙ三リン酸（ｄＩｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰ三リン酸（ｄＰＰＴＰ）、又はデオキシプロピニル−７−アザインドール三リン酸（ｄＰ７ＡＩＴＰ）が含まれるが、これらに限定されない。このようなユニバーサル塩基のさらなる例は、なかでも、公開された米国特許出願第１０／２９０６７２号、及び米国特許第６，４３３，１３４号に見出すことができる。

本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、ヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマー及び二本鎖ポリマーを意味し、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合、例えば、３'−５'及び２'−５'、反転結合、例えば、３'−３'及び５'−５'、分岐構造、又はヌクレオチド間類似体によって結合された、２'−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）及びリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、会合した対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋などを有する。ポリヌクレオチドは、完全にデオキシリボヌクレオチドから、完全にリボヌクレオチドから、又はそれらのキメラ混合物から構成されてよい。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間類似体、核酸塩基類似体及び／又は糖類似体から構成されてよい。ポリヌクレオチドのサイズは典型的には、数個のモノマー単位、例えば、３−４０（この場合、本技術分野においてポリヌクレオチドは、より一般に頻繁にオリゴヌクレオチドと呼ばれる）から、数千個のモノマーヌクレオチド単位までの範囲にある。他に示されない限り、ポリヌクレオチド配列が表されるときは常に、ヌクレオチドは、左から右に５'から３'の順にあること、及び他に記載のない限り、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシトシンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示す、ということが理解されるだろう。

本明細書で使用される「核酸塩基」は、天然に存在する及び天然に存在しない複素環式部分を意味し、これは核酸技術を利用又はペプチド核酸技術を利用して、これにより、核酸に特異的に結合することができる配列のポリマーを作製する者に一般に知られている。適切な核酸塩基の非限定的な例としては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシル及び２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）及びＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）が含まれる。適切な核酸塩基の他の非限定的な例としては、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（ＷＯ９２／２０７０２又はＷＯ９２／２０７０３）の図２（Ａ）及び２（Ｂ）に示される核酸塩基が含まれる。

本明細書で使用される「核酸塩基配列」は、核酸塩基含有サブユニットを含むポリマーの任意のセグメント、又は２以上のセグメントの集合体（例えば、２以上のオリゴマーブロックの集合体核酸塩基配列）を意味する。適切なポリマー又はポリマーセグメントの非限定的な例としては、オリゴデオキシヌクレオチド（例えばＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えばＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡ組み合わせオリゴマー、核酸類似体及び／又は核酸模倣物が含まれる。

本明細書で使用される「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基サブユニットを含む完全な単一ポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸の単一核酸鎖が、ポリ核酸塩基鎖である。

本明細書で使用される「核酸」は、ヌクレオチド、又はその類似体から形成される骨格を有する、核酸塩基配列含有ポリマー、又はポリマーセグメントである。

好ましい核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡである。

本明細書で使用されるように、核酸は、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」を指してもよく、この「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」は、２以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含むが、核酸サブユニット（又はその類似体）を含まない、任意のオリゴマー又はポリマーセグメント（例えばブロックオリゴマー）を意味する。これには、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，５２７，６７５号、第５，６２３，０４９号、第５，７１４，３３１号、第５，７１８，２６２号、第５，７３６，３３６号、第５，７７３，５７１号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号、第５，８３７，４５９号、第５，８９１，６２５号、第５，９７２，６１０号、第５，９８６，０５３及び第６，１０７，４７０号（これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）において、ペプチド核酸として、言及される又は特許請求の範囲に記載されるオリゴマー又はポリマーセグメントのうち任意のものが含まれるが、これらに限定されない。用語「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」は、以下の刊行物において説明される核酸模倣物の２以上のサブユニットを含む任意のオリゴマー又はポリマーセグメントにも適用されるべきものである：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４： １０８１−１０８２ （１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、６： ７９３−７９６ （１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ． Ｌｅｔｔ． ３７： ４７５−４７８ （１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ７： ６３７−６２７ （１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ７： ６８７−６９０ （１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ． Ｌｅｔｔ． ３６： ６９４１−６９４４ （１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ４： １０８１−１０８２ （１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ， Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、７： １７４３−１７４６ （１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １、（１９９７） １： ５３９−５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １１： ５４７−５５４ （１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １１：５５５−５６０ （１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６２： ５４４１−５４５０ （１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ、Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、７： １１１９−１１２２ （１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ， Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．、８： １６５−１６８ （１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ．、３７： ３０２−３０５ （１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ． Ｌｅｔｔ．、３８： ４２１１−４２１４ （１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５３： １１６７−１１７６ （１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ． Ｅｕｒ． Ｊ．、３： ９１２−９１９ （１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３（９）： １２６９−１２７２ （２００１）；及びＷＯ９６／０４０００に開示されるようなＳｈａｈらのペプチド系核酸模倣物（ＰＥＮＡＭＳ）。

＜ポリマーナノ粒子＞

用語「ポリマーナノ粒子」は、治療的材料を含有するポリマーナノ粒子を指す。ポリマーナノ粒子は、幅広い材料を使用して開発されてきた。この幅広い材料としては、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：合成ホモポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コグリコリド）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリリシン、ポリエチレンイミン；合成コポリマー、例えばポリ（ラクチド−コグリコリド）、ポリ（ラクチド）−ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−ポリ（エチレングリコール）、ポリ（カプロラクトン）−ポリ（エチレングリコール）；天然ポリマー、例えばセルロース、キチン、及びアルジネート、並びにポリマー−治療的材料コンジュゲート。

本明細書で使用される用語「ポリマー」は、共に結合された多数の類似の単位から、主として又は完全に構築された、通常高分子量の化合物を指す。このようなポリマーとしては、多数の天然ポリマー、合成ポリマー及び半合成ポリマーのうち任意のものが含まれる。

用語「天然ポリマー」は、天然由来の任意の数のポリマー種を指す。このようなポリマーとしては、多糖、セルロース、キチン、及びアルジネートが含まれるが、これらに限定されない。

用語「合成ポリマー」は、天然には見出されない任意の数の合成ポリマー種を指す。このような合成ポリマーとしては、合成ホモポリマー及び合成コポリマーが含まれるが、これらに限定されない。

合成ホモポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリリシン、及びポリエチレンイミンが含まれるが、これらに限定されない。

「合成コポリマー」は、２以上の合成ホモポリマーサブユニットで作製された任意の数の合成ポリマー種を指す。このような合成コポリマーとしては、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（ラクチド）−ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−ポリ（エチレングリコール）、及びポリ（カプロラクトン）−ポリ（エチレングリコール）が含まれるが、これらに限定されない。

用語「半合成ポリマー」は、天然ポリマーの化学的又は酵素的処理によって得られた任意の数のポリマーを指す。このようなポリマーとしては、カルボキシメチルセルロース、アセチル化カルボキシメチルセルロース、シクロデキストリン、キトサン及びゼラチンが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される用語「ポリマーコンジュゲート」は、共有結合的に、又は非共有結合的に、１又は複数の分子種をポリマーにコンジュゲートさせることによって調製された化合物を指す。このようなポリマーコンジュゲートとしては、ポリマー−治療的材料コンジュゲートが含まれるが、これに限定されない

ポリマー−治療的材料コンジュゲートは、コンジュゲートされた分子種のうち１又は複数が治療的材料であるポリマーコンジュゲートを指す。このようなポリマー−治療的材料コンジュゲートとしては、ポリマー−薬物コンジュゲートが含まれるが、これらに限定されない。

「ポリマー−薬物コンジュゲート」は、任意の数の薬物種にコンジュゲートされた任意の数のポリマー種を指す。このようなポリマー薬物コンジュゲートとしては、アセチルメチルセルロース−ポリエチレングリコール−ドセタキソール（ｄｏｃｅｔａｘｏｌ）が含まれるが、これに限定されない。

本明細書で使用される用語「約」は、関連する値が、特に指示のない限り、プラス又はマイナス５パーセント（＋／−５％）で修正されることができ、開示される実施形態の範囲内にとどまることを示す。

以下の実施例は、説明された実施形態を例示するためのものであって、限定するためのものではない。

＜例１：マニホールドを使用する、並列に配列された４つの単一マイクロ流体ミキサーデバイス、又は単一デバイスに並列に配列された４つのマイクロ流体ミキサーを使用して製造される、ｓｉＲＮＡ−脂質ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ）＞

この例において、マニホールドを使用する、並列の４つの単一マイクロ流体ミキサーデバイスを使用して生成されたｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを、単一デバイスに並列に配列された４つのマイクロ流体ミキサー（図３）を使用して生成されたｓｉＲＮＡ−ＬＮＰと比較する。この例の目的は、マイクロ流体ミキサーを配列するオンデバイス方法及びオフデバイス方法が存在することを実証することである。同一のプロセス条件下で、同一のナノ粒子形成材料を用いて、流体駆動ポンプを運転し、配列の各方法について試験を行った。図４の結果は、配列の２つの方法を使用して生成されたｓｉＲＮＡ−ＬＮＰが類似していることを示しており、ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは配列の方法に影響されない。この例は、配列のオンデバイス方法及びオフデバイス方法のいずれか又は両方を使用して、単一システムにおけるミキサーの数を大いに増加させる可能性を、大いに実証する。配列のオンデバイス方法及びオフデバイス方法の両方を使用することによって、マイクロ流体ミキサーを配列する２次元の方法が得られる。

図４は、マニホールドを使用する、並列に配列された４つの単一マイクロ流体ミキサーデバイス、又は図３に示される、代表的な単一デバイスに並列に配列された４つのマイクロ流体ミキサーに対する、代表的なｓｉＲＮＡ−脂質ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ）の粒子直径（ｎｍ）及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、モル比が５０：１０：３８．５：１．５の１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成され、ｓｉＲＮＡ−総脂質の比は０．０６ｗｔ／ｗｔであった。そして、マニホールドを使用する、並列に配列された４つの単一マイクロ流体ミキサーデバイス（４Ｘマニホールド）、又は図３に示される、単一デバイスに並列に配列された４つのマイクロ流体ミキサー（４Ｘオンチップ）のいずれかを備える、図２に示される例示的な連続フローシステムを使用して、ナノ粒子を生成した。マイクロ流体デバイスを通る全流量は凡例に示されている。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。

この例において、別個のシリンジに入った、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）中０．２３１ｍｇ／ｍＬ ｓｉＲＮＡ、及び脂質混合物（モル比が５０：１０：３８．５：１．５の、エタノール中、１２．５ｍＭ １，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）を、独立したＨａｒｖａｒｄ ＰＨＤウルトラシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）にロードした。ｓｉＲＮＡ−総脂質の比は０．０６ｗｔ／ｗｔであった。ｓｉＲＮＡと脂質混合物との混合容量比は３：１であり、１ミキサーあたりに処理される総容量は５ｍＬであった（すなわち、総製剤化容量：１Ｘ＝５ｍＬ、２Ｘ＝１０ｍＬ、４Ｘ＝２０ｍＬ）。１ミキサーあたりの流量は１２ｍＬ／ｍｉｎであり、ｓｉＲＮＡと脂質混合物との流量比は３：１であった（すなわち、１Ｘでは９ｍＬ／ｍｉｎ ｓｉＲＮＡ及び３ｍＬ／ｍｉｎ 脂質混合物）。各製剤化実行の開始時にミキサー出口から回収された最初の２ｍＬの容量を廃棄物として廃棄し、残りの容量をサンプルとして回収した。回収したサンプルのうち１ｍＬを、粒子径測定の前に、３ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（カルシウム及びマグネシウムを含まない）中にさらに希釈した。

粒子径測定を以下のとおりに実施した。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で適切な濃度に希釈し、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ ２角度粒子径分析計（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して、動的光散乱（ＤＬＳ）によって、平均粒子径（強度重み付け）を決定した。

＜例２：マニホールドを使用する、並列に配列された８つの単一マイクロ流体ミキサーデバイスを使用して製造される、ｓｉＲＮＡ−脂質ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ）＞

この例において、外部マニホールドを使用する、並列に配列された８つの単一マイクロ流体ミキサーデバイスを使用して、５２０ｍＬ容量のｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを生成した。アレイ中の各ミキサーは同一であった。したがって、各ミキサーにおけるｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを形成するためのプロセス条件は同一であった。この実験の目的は、ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰのサイズ及び品質に与える多数の平行のミキサーの効果を実証することであった。この例は、本明細書中に開示される例示的なシステムを使用して、同一のシステムにおいて並列に使用される多数のマイクロ流体ミキサーを利用して、大容量バッチのｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを生成できることを大いに実証する。

図５は、製造容量に対する、代表的なｓｉＲＮＡ−脂質ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ）の粒子直径（ｎｍ）及び多分散性指数（ＰＤＩ）を示す。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、モル比が５０：１０：３８．５：１．５の１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成され、ｓｉＲＮＡ−総脂質の比は０．０６ｗｔ／ｗｔであった。そして、マニホールドを使用する、並列に配列された８つの単一マイクロ流体ミキサーデバイスを備える、図２に示される例示的な連続フローシステムを使用して、ナノ粒子を生成した。ナノ粒子を０ｍＬから５００ｍＬまで１００ｍＬごとにサンプリングし、結果を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して調製した同一のｓｉＲＮＡ−ＬＮＰの２ｍＬ調製物と比較した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔは、マイクロ流体を使用して、固定容量バッチのナノ粒子を製造する、市販の実験室装置である。エラーバーは、平均値の標準偏差を表す。

この例において、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）中０．２３１ｍｇ／ｍＬ ｓｉＲＮＡ、及び脂質混合物（モル比が５０：１０：３８．５：１．５の、エタノール中、１２．５ｍＭ １，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）を、別個のＦｌａｓｈ １００計量ポンプ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、Ｓｔａｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）にロードした。ｓｉＲＮＡ−総脂質の比は０．０６ｗｔ／ｗｔであった。ｓｉＲＮＡと脂質混合物との混合容量比は３：１であり、１ミキサーあたりに処理される総容量は６５ｍＬであった（すなわち、８Ｘでの総製剤化容量＝５２０ｍＬ）。１ミキサーあたりの流量は１２ｍＬ／ｍｉｎであり、ｓｉＲＮＡと脂質混合物との流量比は３：１であった（全流量＝９６ｍｌ／ｍｉｎ、したがって、ｓｉＲＮＡ及び脂質混合物の流量は、それぞれ７２ｍＬ／ｍｉｎ及び２４ｍＬ／ｍｉｎであった）。製剤化実行の開始時にミキサー出口から回収された最初の２０ｍＬの容量を廃棄物として廃棄し、残りの容量をサンプルとして回収した。最初の２０ｍＬのプライミング廃棄物を回収した後、粒子製剤化物を、インラインで、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で、粒子溶液１部対ＤＰＢＳ３部で、デュアルＥａｓｙ−ｌｏａｄ ＩＩポンプヘッド（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ、Ｃａｎａｄａ）を備えるＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ蠕動ポンプにより駆動して、希釈した。結果として得られる粒子製剤化物をアリコートに回収し、粒子径測定した。

例示的な実施形態を示し説明してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるだろう。

Claims (36)

1. マイクロ流体チップの連続フロー運転のためのシステムであって、前記システムが以下の（１）〜（４）を含む、システム。
   （１）以下の（ａ）〜（ｄ）を含むマイクロ流体チップ
   （ａ）第１の溶液を受容するように構成される、第１の入口
   （ｂ）第２の溶液を受容するように構成される、第２の入口
   （ｃ）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む第１のミキサー
   （ｉ）前記第１の入口から前記第１の溶液を受容するように構成される、第１の入口マイクロチャネル
   （ｉｉ）前記第２の入口から前記第２の溶液を受容するように構成される、第２の入口マイクロチャネル
   （ｉｉｉ）前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、ミキサー出口でナノ粒子溶液を提供するように構成される、混合マイクロチャネル
   （ｄ）ナノ粒子溶液マイクロチャネルを通して前記ミキサー出口と流体連通する、チップ出口
   （２）前記第１の溶液を、第１の溶液リザーバから、前記マイクロ流体チップの前記第１の入口内へ、連続して駆動するように構成される、第１の連続フロー流体駆動装置
   （３）前記第２の溶液を、第２の溶液リザーバから、前記マイクロ流体チップの前記第２の入口内へ、連続して駆動するように構成される、第２の連続フロー流体駆動装置
   （４）前記チップ出口と流体連通し、前記ナノ粒子溶液をアウトプットするように構成される、システム出口
2. 前記第１の溶液が活性医薬成分を含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記第２の溶液が、第２の溶媒中に粒子形成材料を含む、請求項１に記載のシステム。
4. 前記第１の溶液が、第１の溶媒中に核酸を含み、前記第２の溶液が、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む、請求項１に記載のシステム。
5. 前記第１のミキサーが、マイクロ流体ミキサーを含む混合領域を含み、前記マイクロ流体ミキサーが、前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合して、前記第１の溶液及び前記第２の溶液の混合から形成される前記ナノ粒子溶液を提供するように構成される、請求項１に記載のシステム。
6. 前記第１のミキサーがカオス的移流ミキサーである、請求項５に記載のシステム。
7. 前記混合領域がヘリンボンミキサーを含む、請求項５に記載のシステム。
8. 前記混合領域が、約２０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルの流体力学直径を有する、請求項４に記載のシステム。
9. 前記第１のミキサーが、１０００未満のレイノルズ数で前記第１の溶液及び前記第２の溶液を混合するような大きさ及び構成である、請求項１に記載のシステム。
10. 前記マイクロ流体チップが滅菌である、請求項１に記載のシステム。
11. 前記システムが、複数のミキサーをさらに含み、前記複数のミキサーのそれぞれが、第１の入口、第１の入口マイクロチャネル、第２の入口、第２の入口マイクロチャネル、混合マイクロチャネル、ミキサー出口、及びチップ出口を含み、前記複数のミキサーが前記第１のミキサーを含む、請求項１に記載のシステム。
12. 前記複数のミキサーが、複数のマイクロ流体チップ内にある、請求項１１に記載のシステム。
13. 前記システムが、第１のマニホールドをさらに含み、前記第１のマニホールドが、前記第１の溶液リザーバから前記第１の溶液を受容し、前記第１の溶液を前記複数のミキサーの前記第１の入口に分配するように構成される、請求項１１に記載のシステム。
14. 前記システムが、第２のマニホールドをさらに含み、前記第２のマニホールドが、前記第２の溶液リザーバから前記第２の溶液を受容し、前記第２の溶液を前記複数のミキサーの前記第２の入口に分配するように構成される、請求項１１に記載のシステム。
15. 前記システムが、第３のマニホールドをさらに含み、前記第３のマニホールドが、前記複数のミキサーの前記チップ出口から前記ナノ粒子溶液を受容し組み合わせて、前記ナノ粒子溶液を前記システム出口へ向かう単一チャネルに導くように構成される、請求項１１に記載のシステム。
16. 前記システムが、
    前記第１の溶液リザーバから前記第１の溶液を受容し、前記第１の溶液を前記複数のミキサーの前記第１の入口に分配するように構成される、第１のマニホールド；
    前記第２の溶液リザーバから前記第２の溶液を受容し、前記第２の溶液を前記複数のミキサーの前記第２の入口に分配するように構成される、第２のマニホールド；及び
    前記複数のミキサーの前記チップ出口から前記ナノ粒子溶液を受容し組み合わせて、前記ナノ粒子溶液を前記システム出口へ向かう単一チャネルに導くように構成される、第３のマニホールド
    をさらに含む、請求項１１に記載のシステム。
17. 前記複数のミキサーが、前記マイクロ流体チップ内にある、請求項１１に記載のシステム。
18. 前記複数のミキサーの少なくとも一部が、並列に配置された並列化されたミキサーであり、前記複数のミキサーの一部のそれぞれが、前記システム出口と流体連通するミキサー出口を有する、請求項１１に記載のシステム。
19. 前記並列化されたミキサーが、前記マイクロ流体チップ上に積み重ねられた構成で配置される、請求項１８に記載のシステム。
20. 前記並列化されたミキサーが、前記マイクロ流体チップ上に、実質的に同一の面内に、水平構成で配置される、請求項１８に記載のシステム。
21. 前記並列化されたミキサーが、前記マイクロ流体チップ上に、水平構成及び積み重ねられた構成の両方で配置される、請求項１８に記載のシステム。
22. 前記システムが希釈要素をさらに含み、前記希釈要素が、第３の連続フロー流体駆動装置を含み、前記第３の連続フロー流体駆動装置が、前記チップ出口と前記システム出口との間で、希釈チャネルを介して、希釈溶液リザーバから希釈溶液を前記システム内に連続して駆動するように構成される、請求項１に記載のシステム。
23. 前記システムが、廃棄物出口をさらに含み、前記廃棄物出口が前記チップ出口と前記システム出口との間の廃棄物バルブと流体連通し、前記廃棄物バルブが、流体を前記廃棄物出口の方へ制御可能に導くように構成される、請求項１に記載のシステム。
24. 前記第１の連続フロー流体駆動装置及び前記第２の連続フロー流体駆動装置が、容積式ポンプ、渦巻ポンプ、及び圧駆動ポンプからなる群より独立して選択される、請求項１に記載のシステム。
25. 前記システムが使い捨ての流体経路を含む、請求項１に記載のシステム。
26. 前記使い捨ての流体経路が、使い捨てのマイクロ流体チップ、前記第１の連続フローポンプの使い捨ての第１のポンプヘッド、前記第２の連続フローポンプの使い捨ての第２のポンプヘッド、及び使い捨てのシステム出口を含む、請求項２５に記載のシステム。
27. 前記使い捨ての第１のポンプヘッド及び前記使い捨ての第２のポンプヘッドが、ステンレス鋼、ポリマー、チタン、及びセラミックからなる群より独立して選択される材料で作られる、請求項２６に記載のシステム。
28. 前記第１の溶液、前記第２の溶液、及び前記ナノ粒子溶液が接触する全ての表面が使い捨てである、請求項２５に記載のシステム。
29. 前記システムが、１ｍ^２以下のフットプリント面積を有する、請求項１に記載のシステム。
30. 前記システムが、１時間あたり少なくとも０．７６Ｌのナノ粒子溶液の生成量を有する、請求項２９に記載のシステム。
31. 前記システムが、パルス減衰メカニズムをさらに含み、前記パルス減衰メカニズムが、前記第１の連続フロー流体駆動装置、前記第２の連続フロー流体駆動装置、又はそれらの両方からの流れ脈動を最小限にするように構成される、請求項１に記載のシステム。
32. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載の滅菌マイクロ流体チップを含む滅菌パッケージであって、前記滅菌マイクロ流体チップが前記滅菌パッケージ内に封止されている、滅菌パッケージ。
33. 請求項１〜３１のいずれか一項に記載のシステムを通して第１の溶液及び第２の溶液を流すステップ及び前記マイクロ流体チップの前記第１のミキサーにおいてナノ粒子溶液を形成するステップを含む、ナノ粒子を形成する方法。
34. 前記システムが複数のミキサーを含み、前記方法が、前記複数のミキサーを通して前記第１の溶液及び前記第２の溶液を流して、前記ナノ粒子溶液を形成するステップをさらに含み、前記複数のミキサーが前記第１のミキサーを含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記複数のミキサーが、複数のマイクロ流体チップ内に含まれる、請求項３４に記載の方法。
36. 前記複数のミキサーが、単一マイクロ流体チップ内に含まれる、請求項３４に記載の方法。