JP2018514759A - 粒子の分析方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、サンプルに向かって伝播する入射光波を生み出す光源を用いてサンプルに光を照射する工程と、マトリクスアレイ光検出器を用いて、マトリクスアレイ光検出器が入射光波と個々の粒子によって生み出された回折波との間の干渉を含む光波を受けるように光源とマトリクスアレイ光検出器との間に置かれたサンプルの画像を取得する工程とを含む、サンプル中に含まれる粒子を同定する方法である。この方法は、光検出器から複数の距離において、光検出器に到達する光波の特徴量を評価するために、光検出器によって取得された画像に対して数的再構成アルゴリズムを適用することを特徴とする。距離の関数としての特徴量の変化は粒子の同定を可能とする。【選択図】図１

Description

本発明は、液体、特に体液、例えば血液中に存在する粒子を数え同定する分野に関する。

体液、特に血液は、粒子、例えば細胞を含むことができ、その種類および数を知ることは有用である。

例えば、全血球数または全血球検査は、医学研究室で一般的に行われる血液の検査である。この種の検査では、血液の主成分（特に、赤血球、白血球、または血小板）とそれらの数を同定することが可能である。これらの検査は一般的に高性能な自動装置を用いて行われるが、より低コストで同等レベルの性能が得られるよりシンプルな方法が研究されている。

この目的のための研究における１つの手段は、レンズレス撮像等のシンプルな光学方法の利用である。レンズレス撮像による生物学的粒子の観察は、２０００年末以来、ある程度の進展が見られている。この技術では、光源とマトリクスアレイ光検出器または画像センサとの間にサンプルを配置する。光検出器でとらえられる画像は、光源から生み出された入射光波とサンプルを構成する粒子によって回折された光波との間の干渉によって形成される。この画像は一般的に「ホログラム」と呼ばれる。したがって、個々の粒子に対して、センサにそれ特有の回折パターンを記録することが可能である。この技術の生物学的サンプルへの適用は、国際公開第２００８／０９０３３０号（特許文献１）に記載されている。そして、生成された回折パターンと事前に公知の粒子に対応させて確立された回折パターンとを比較することによって、個々の粒子のシンプルな分析を行うことが可能である。しかしながら、この方法は、粒子濃度が増加すると、限界に到達する可能性がある。

特に、画像センサによって検出される回折パターンに基づいて粒子単独を数え同定することは、サンプル中の粒子濃度が増加すると、限界に到達する。特に、Seo Sungjyu, “High-throughput lensfree bloodanalysis on a chip”, Anal Chem, 2010, June 1（非特許文献１）に報告されているように、サンプルが血液であり、粒子が、100000粒子/μl超の濃度の赤血球であるとき、数のカウントはもはや信頼性がない。サンプル中に存在する個々の粒子のいわゆる複素画像を作成するために、デジタルホログラフィック再構成技術と呼ばれる数学的技術を適用することができる。この種の技術では、粒子が配置され、撮像素子から既知の距離に位置する対象面に対して光波を後方伝播する。上記文献は、ホログラフィック再構成等が、サンプル中に高濃度で存在する赤血球の数を数えることを可能とすることを実証している。この文献は、再構成された個々の粒子の複素画像において、白血球は赤血球とは異なる識別特性を持つ標識が事前に付与されていることを報告している。

また、米国特許出願公開第２０１４／０３２７９４４号明細書（特許文献２）には、画像センサによって取得されたホログラムを模擬実験により得られたホログラムと比較することによって、ホログラムに基づいて、粒子、例えば血液粒子を分類する方法について、記載されている。しかしながら、この方法は、粒子密度が高いときには実行が困難となるという共通の限界を有する。

また、米国特許出願公開第２０１２／０１４８１４１号明細書（特許文献３）および国際公開第２０１４／０１２０３１号（特許文献４）には、細胞（この場合には精子）の複素画像を再構成することを可能な方法が記載されている。これらの方法では、再構成された複素画像から上記細胞の特性とそれらの軌道を評価することができる。同様に、米国特許出願公開第２００９／０２９０１５６号明細書（特許文献５）には、上記粒子の複素画像に基づく、粒子と粒子の軌道の追跡の分類について、記載されている。サンプルの複素画像は、粒子の同定には不充分である可能性がある。

国際公開第２００８／０９０３３０号 米国特許出願公開第２０１４／０３２７９４４号明細書 米国特許出願公開第２０１２／０１４８１４１号明細書 国際公開第２０１４／０１２０３１号 米国特許出願公開第２００９／０２９０１５６号明細書

Seo Sungjyu, "High-throughput lensfree bloodanalysis on a chip", Anal Chem, 2010, June 1

粒子濃度が高いサンプルに適用可能な、粒子、特に血球の同定方法が求められている。この方法はまた、観測できる分野が広く、シンプルに、特に事前に粒子に標識を付与する必要なく、実施できる必要がある。さらに、この方法は、体液に見られる粒子、特に、赤血球、白血球、および血小板を信頼性良く識別する必要がある。

さらに、粒子と光検出器との間の距離を正確に知る必要のない方法が求められている。

上記課題を解決するために、本発明は以下の方法を提供する。
本発明の方法は、
サンプル、例えば血液等の生物学的液体のサンプルに含まれる粒子を同定する方法において、
伝播軸に沿って前記サンプルに向かって伝播する入射光波を生み出す光源を用いて前記サンプルに光を照射する工程と、
マトリクスアレイ光検出器を用いて、前記マトリクスアレイ光検出器が前記入射光波と個々の前記粒子によって生み出された回折波との間の干渉を含む光波を受けるように前記光源と前記マトリクスアレイ光検出器との間に置かれた前記サンプルの画像を取得する工程とを含み、
さらに、
前記マトリクスアレイ光検出器が存在する面に対して平行な面(x, y)における前記粒子の位置を特定する工程と、
前記取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、前記マトリクスアレイ光検出器から複数の再構成距離で前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の少なくとも１つの特徴量を評価する工程と、
前記特徴量の変化を前記伝播軸に対して平行な軸に沿って前記位置を通る前記再構成距離の関数として表すプロファイルを特定する工程と、
前記プロファイルに応じて前記粒子を同定する工程とを含むことを特徴とする。

デジタル再構成アルゴリズムの適用は、画像に対する伝播演算子の適用、一般的に畳み込み積の形成を意味する。

前記特徴量は、個々の前記再構成距離において、前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の複素式を評価することによって得ることができる。

前記特徴量は、前記複素式の係数から特定することができる。この場合、複素式は、マトリクスアレイ光検出器が受ける光波の振幅を表す。

前記特徴量は、前記複素式の独立変数から特定することができる。この場合、複素式は、マトリクスアレイ光検出器が受ける光波の位相を表す。

一態様において、本発明の方法は、
前記マトリクスアレイ光検出器によって取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、基準複素画像と呼ばれる複素画像を特定する工程と、
前記基準複素画像から、前記マトリクスアレイ光検出器から複数の前記再構成距離における前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の少なくとも１つの前記特徴量を評価する工程とを含むことができる。

本発明の方法はまた、
前記基準複素画像に対して伝播演算子を適用して、前記再構成面または前記マトリクスアレイ光検出器が存在する面から複数の前記再構成距離における第２の複素画像と呼ばれる基準複素画像を計算する工程と、
個々の前記第２の複素画像から複数の前記再構成距離のそれぞれにおける前記特徴量を特定する工程とを含むことができる。

前記基準複素画像は、サンプルの面から離れた再構成面で作成された複素画像であることができる。それはまた、検出面で作成された複素画像であってもよい。

前記同定は、前記特徴量の変化を学習段階で特定された基準プロファイルと比較することによって行うことができる。

前記マトリクスアレイ光検出器の面に対して平行な面における個々の前記粒子の位置は、前記マトリクスアレイ光検出器によって取得された画像または前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の複素式を用いて特定することができる。

前記光源は、好ましくは空間的コヒーレンス光源、例えば発光ダイオードである。この場合、好ましくは、光源とサンプルとの間に空間フィルタが配置される。前記光源は、時間的コヒーレンス光源、例えばレーザダイオードであってもよい。

前記光検出器は、光検出器が受ける光波を捕集することが可能な複数の画素のマトリクスアレイを含む。画素とサンプルとの間の距離は、50μm〜2cm、好ましくは100μm〜5mmの間で変化することができる。好ましくは、サンプルは、光検出器の画素に直接接する位置に配置されない。

好ましくは、前記サンプルと前記マトリクスアレイ光検出器との間に拡大光学部品が配置されない。

前記サンプルは特に、血球を含むことができる。この場合、前記粒子は、白血球、赤血球、または血小板の細胞系の間で同定することができる。

本発明の他の主題である装置は、
サンプル中に含まれる粒子を同定する装置において、
前記サンプルの方向に伝播軸に沿って入射光波を生み出すように配置された光源と、
前記光源とマトリクスアレイ光検出器との間で前記サンプルを保持するホルダと、
前記入射光波と前記粒子によって形成された回折波との間の干渉から生じる光波を受け、前記サンプルの画像を取得するように配置された前記マトリクスアレイ光検出器とを有し、
さらに、
前記マトリクスアレイ光検出器が存在する面に対して平行な面における前記粒子の位置を特定する工程と、
前記取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、前記マトリクスアレイ光検出器から複数の前記再構成距離における前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の少なくとも１つの前記特徴量を評価する工程と、
前記特徴量の変化を前記伝播軸に対して平行な軸に沿って前記位置を通る前記再構成距離の関数として表すプロファイルを特定する工程と、
前記プロファイルに応じて前記粒子を同定する工程とを、
実行するように構成された、マイクロプロセッサまたは電算機等のプロセッサを有することを特徴とする。

好ましくは、本発明の装置は、前記マトリクスアレイ光検出器と分析される前記サンプルとの間に拡大光学部品を有さない。

前記プロセッサは、上記複数の工程を実行させる指令のシークエンスを含むプログラム化可能なメモリを含むまたは当該メモリに接続されることができる。

前記プロセッサは特に、
個々の前記再構成距離における前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の複素式を特定し、
個々の前記再構成距離における前記複素式の係数または独立変数を特定することによって、前記特徴量を評価するように構成することができる。

本発明の一態様に係る装置を示す図である。

マトリクスアレイ光検出器によって取得された画像を示す図である。

第１の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を、光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。

第１の例において、種々の白血球について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を、光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。

第１の例において、種々の赤血球について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を、光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。

第１の例において、血小板凝集体の中央である、光検出器によって取得された画像の対象領域を示す図である。

図４Ａに示す凝集体を構成する種々の血小板について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量のプロファイルを示す図である。

第２の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。

第２の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の位相を光検出器に関する距離zの関数として表すプロファイルを示す図である。

第３の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。

第３の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の位相を光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。

第１の例において、光検出器が受ける光波の複合的な特徴量を距離の関数として表すプロファイルを示す図である。 第２の例において、光検出器が受ける光波の複合的な特徴量を距離の関数として表すプロファイルを示す図である。 第３の例において、光検出器が受ける光波の複合特徴量を距離の関数として表すプロファイルを示す図である。

図８Ａは、再構成面において、サンプルの基準複素画像と呼ばれる複素画像を計算することを可能とする方法を示す図である。図８Ｂは、マトリクスアレイ光検出器によって取得されたホログラムを示す図である。図８Ｃは、図８Ａに示す方法を複数回繰り返した後に再構成された基準複素画像と呼ばれる画像の代表例を示す図である。図８Ｄは、基準複素画像から作成された第２の複素画像に基づいて得られたプロファイルを示す図である。

図９Ａは、画像センサによって取得された水溶液中に分散された赤血球を含むサンプルのホログラムである。図９Ｂ、図９Ｃはそれぞれ、再構成で作成された、基準画像と呼ばれる複素画像の係数と位相を示す図である。図９Ｄ、図９Ｅはそれぞれ、伝播軸に沿って赤血球を通って画像センサが受ける光波の係数と位相の変化を表すプロファイルを示す図である。

図1は、本発明の１つの主題である装置の例を示す。光源11は、伝播軸Zに沿ってサンプル14の方向に入射光波と呼ばれる光波を生み出すことができる。サンプル14は、所定の種類の粒子の間で同定したい粒子1, 2, 3, 4, 5, .., 9を含む媒体10、例えば生物学的液体を含む。

粒子は、細胞であることができる。特に、媒体１０が血液または血液を含む溶液であるとき、粒子は、赤血球、白血球、または血小板であることができる。

粒子はまた、有機または無機のマイクロビーズ、例えば、金属のマイクロビーズ、あるいは、ポリマーまたはガラスのマイクロビーズであることができ、この種のマイクロビーズは生物学的実験を行うときに一般的に使用される。粒子はまた、媒体10に浸された小滴、例えば脂肪滴であることができる。それはまた、微生物、例えば、バクテリア、イースト、またはエキソソームであることができる。一般的に、粒子のサイズは、有利には1mm未満、さらには500μｍ未満、好ましくは0.5〜500μｍである。したがって、用語「粒子」は、検査されるサンプルにはじめから存在する内因粒子と、分析前にサンプルに添加される外因粒子の双方を言う。

媒体10は一般的に液体媒体、特に体液であるが、それはまた、寒天、空気、または液体の乾燥残留物であることができる。

本発明の１つの主題である方法は、個々の観察される粒子を同定することを可能とする。同定とは、粒子の所定の種類に粒子を分類することを意味する。それは、所定の特性の間での粒子の特性の特定、または、所定の特性の間での粒子サイズの特定であるかもしれない。

光源とサンプルとの間の距離Δは、好ましくは1cm超である。それは好ましくは2〜30cmである。光源は、サンプルから見て、点状であると見なせることが好ましいかもしれない。このことは、その直径（またはその対角線）は好ましくは、サンプルと光源との間の距離の1/10未満、より好ましくは1/100未満であることを意味する。この場合、光は平面波またはそのように見なせる波の形態でサンプルに到達する。

光源11は、点光源であってもよいし、点状となるように絞りまたは空間フィルタ（図1では示さず）を伴うものであってもよい。絞りの開口径は、一般的に5μｍ〜1mm、好ましくは50〜500μｍである。

絞りは、第１の端が光源と対向配置され、第２の端がサンプルと対向配置された光ファイバに置き換えてもよい。この場合、第２の端は、点光源11のようになり得る。

サンプル14は、基部15とカバー13とを含むチャンバに収容される。チャンバの側壁は、示されていない。考えられる例において、チャンバは、ノイバウアＣ−チップ流体チャンバである。基部15とカバー13との間の距離は、100μｍである。伝播軸Zに沿ったチャンバの厚みは、一般的に数cm未満、例えば1cm未満、さらには1mm未満、例えば50〜500μｍである。

光源11は、時間的コヒーレンスであることができるが、これは必須ではない。

この第１の例において、光源は、波長450nmを出射するレーザダイオードである。それは、サンプルから15cmの距離に配置される。

サンプル14は、光源11とマトリクスアレイ光検出器または画像センサ16との間に配置される。後者は、好ましくはサンプルを収容するチャンバの基部15に対して、平行または実質的に平行に延びる。

用語「実質的に平行」は、２つの要素が厳密に平行ではなく、10°未満、好ましくは数°の角度の誤差が許容されることを意味する。

光源のスペクトル幅は小さいことが好ましく、例えば100nm未満、さらには20nm未満、好ましくは5nm未満である。用語「スペクトル幅」は、光源の発光ピークの半値幅を示す。

光検出器16は、CCDまたはCMOSの画素のマトリスクアレイを含むマトリクスアレイ光検出器であることができる。画素のサイズがより小さく、取得される画像の空間分解能がより良好となることから、CMOS光検出器が好ましい。この例において、光検出器は、12ビットAPTINAセンサ、リファレンス番号MT9P031である。それは、RGB CMOSセンサであり、その画素間ピッチは2.2μｍである。光検出器の有効面積は、５．７×４．３ｍｍ^２である。

光検出器は、好ましくは入射光波12の伝播軸Zに対して垂直な検出面Pに置かれる。

好ましくは、光検出器は、アレイの上に透明な保護窓が置かれた画素のマトリスクアレイを含む。画素のマトリクスアレイと保護窓との間の距離は、一般的に数10μｍ〜150または200μｍである。画像の空間分解能を向上するために、光検出器の画素間ピッチは3μｍ未満であることが好ましい。

この例において、粒子1, 2,...9と光検出器16の画素のマトリクスアレイとの間の距離dは、1.5mmである。ただし、使用される流体チャンバの厚みに応じて、変動することができる。.一般的に態様に関係なく、粒子と光検出器の画素との間の距離dは、好ましくは50μｍ〜2cm、より好ましくは100μｍ〜2mmである。

なお、マトリクスアレイ光検出器16とサンプル14との間には拡大光学部品は配置されない。このことは、光検出器16の個々の画素と同じレベルに任意で存在するマイクロレンズをフォーカスすることを妨げない。

この第１の例において、サンプルは、6%のデキストラン（Sigma Aldrich、リファレンス番号D4876）を含むアルセバー液中で赤血球を血沈させた後、血小板と白血球リッチプラズマとを回収する従来のプロトコルによって得られた白血球リッチプラズマである。得られたプラズマは、生理的pHのリン酸緩衝食塩液（PBS）で希釈される。赤血球の除去は完全ではなく、得られるリッチプラズマは残留赤血球を含む。

粒子は、いくつかの粒子の種類、特に赤血球、白血球、または血小板の間で分類することができる。好ましくは、粒子は、事前に標識の付与を受けない。

図2Aは、光検出器16で得られた画像を示す。この画像は、全体的な回折パターンを示し、その素回折パターンには、個々の粒子に関連する素回折パターンを見ることができる。個々の素回折パターンは、中央の円盤状領域を含み、その周囲には暗と明の同心円状の輪が交互に延びている。そのような素パターンは、選択された粒子を同定し、検出面Pにおける粒子の動径座標(x, y)を特定することを可能とする。これらの座標は例えば、粒子に応じた素回折パターンの中央である。

個々の素回折パターンは、サンプルの上流にある光源11から生み出された入射光波12と粒子による入射光波の回折から生じる光波との間の干渉によって形成される。したがって、光検出器16は、サンプル14の上流で光源11から出射された光波12と、個々の粒子またはサンプル14に存在する他の回折要素によって回折された光波との重畳によって形成される光波22を受ける。

プロセッサ20、例えばマイクロプロセッサは、マトリクスアレイ光検出器16の画像を受け取り、伝播軸Zに沿ってマトリクスアレイ光検出器が受ける光波22の特徴量の再構成を行う。マイクロプロセッサ20は、本明細書で述べる計算工程を実行するための指令を記録可能なメモリ23に接続される。それは、スクリーン25に接続することができる。再構成は特に、マトリクスアレイ光検出器と観察されるサンプルとの間で作成される。

プロセッサ20は、同定方法の工程を実行するために、メモリに記録された指令のシークエンスを実行することができる。プロセッサは、マイクロプロセッサ、または、本明細書で述べる1つ以上の工程を実行するために、マトリクスアレイ光検出器から受け取った画像を処理可能な他の電算機であることができる。

図2Aに示されるマトリクスアレイ光検出器によって取得された画像Iは、光波22の強度I(x, y)の空間的な分布を表す。なお、xとyは、光検出器の平面Pにおける座標である。

非特許文献Ryle et al, “Digital in-line holography of biological specimens”, Proc. of SPIE Vol. 6311 (2006)に記載されている公知のデジタルホログラフィック再構成の原理によれば、光検出器によって測定された強度I(x, y)の畳み込み積と伝播演算子h(x, y, z)とを特定することによって、空間座標(x, y, z)、特に光検出器から距離|z|に位置する面の任意の点における、光波22の複素式U(x, y, z)を再構成することが可能である。

伝播演算子h(x, y, z)の関数は、光検出器16と座標(x, y, z)の点との間の光の伝播を表す。そして、再構成距離と呼ばれる距離|z|におけるこの光波の以下に示す振幅u(x, y, z)と位相φ(x, y, z)を特定することが可能である。
u(x, y, z) = abs [U(x, y, z)]
φ(x, y, z) = arg [U(x, y, z)]
演算子abs、argはそれぞれ係数および独立変数を表す。

伝播演算子の適用は特に、光検出器から上流側の距離|z|における複素式を評価することを可能とする。したがって、光波22が光検出器に到達する前に光波22の複素式の値が再構成される。ここで、後方伝播について説明する。検出面Pの座標をz=0とするとき、この後方伝播は、伝播演算子h(x, y, −|z|)を適用することによって実行される。用語「上流」と「下流」は、入射光波12の伝播方向に関することは理解されよう。

I(x,y) = I(x, y, z = 0)が、光検出器によって測定された信号の強度に対応するとき、検出面Pにおける測定された強度I(x,y)と光波の複素式U(x, y)との間の関係は、下記式で表される。
I(x,y) = |U(x, y)|²

座標(x, y, z)における光波(22)の複素式は、下記式で表される。
ここで、符号*は、畳み込み演算子を表す。
検出面Pを境界としサンプル14を含む半空間ではz<0であり、
検出面Pを境界としサンプル14を含まない半空間ではz>0である。

検出面Pを境界としサンプル14を含む半空間において、光波の複素式は下記式で表すことができる。

好ましくは、ホログラフィック再構成の前に、あらかじめ、測定された強度I(x,y)に対して、数学的前処理が適用される。このことは、特に伝播演算子が適用されるときに作成されるアーチファクトの数を減少することによって、結果の質を向上することを可能とする。

したがって、正規化強度と呼ばれる強度
は、以下のように特定される。
ここで、
I(x,y) = 座標(x, y)において、光検出器によって測定された強度、
Average (I) = 座標(x, y)を含む画像Iの対象領域において測定された強度の平均である。
この対象領域は、光検出器によって作成された全画像に対応する。

この前処理は、入射光波(12)の強度による測定された強度の正規化に相当し、入射光波(12)の強度は演算子Average (I)によって評価される。

次に、上記したように、
正規化強度
から、光波(22)の複素式が下記式を用いて特定される。

デジタル再構成は特に、フレネル回折モデルに基づくことができる。この例において、伝播演算子は、以下に示すフレネル−ヘルムホルツ関数である。
ここで、λは波長である。
したがって、下記式が得られる。
ここで、
x′とy′は光検出器の面における座標、
xとyは光検出器から距離|z|に位置する再構成面における座標である。
zは、入射光波(12)の伝播軸Zに沿って再構成された画像の座標である。

複素式U(x, y, z)の値から、光源11から出射された入射光波12の粒子(1,2..9)による回折から生じる光波22の特徴量を得ることが可能である。上記したように、振幅u(x, y, z)または位相φ(x, y, z)を評価することが可能であるが、振幅または位相の関数を評価することも可能である。

例えば、以下に示す相補的な振幅
と呼ばれる特徴量を評価することが可能である。

個々の再構成された複素式U(x, y, z)から、
光検出器から距離|z|において、光検出器の面に対して平行な面における、式u_z(x, y) = abs [U(x, y, z)]で表される光波22の振幅の画像u_z、
光検出器から距離|z|において、光検出器の面に対して平行な面における、式φ_z(x, y) = arg [U(x, y, z)]で表される光波22の位相の画像φ_z、
光検出器から距離|z|において、光検出器の面に対して平行な面における、
で表される上記したような相補的な振幅の画像
を作成することが可能である。

この第１の例において、
伝播軸Zに沿った複数の座標z₁…z_Mにおいて、相補的な振幅の画像
が再構成される。ここで、Mは21である。
個々の画像
（ここで、1≦m≦M）から、値
が得られる。ここで、(x_n, y_n)は、光検出器16の面に対して平行な面における粒子nの座標を表す。
事前に特定された２つの量
と
との間の補間によって、種々の
の値（ここで、z_m < z < z_{m =+1}）が得られる。

取得された画像I(x, y)または再構成距離zで得られた画像
を用いて、
個々の検査される粒子nについて、光検出器16の面に対して平行な面における座標(x_n, y_n)が特定される。

図2Bは、以下の9つの種々の種類の異なる粒子について、上記したような相補的な振幅
の変化を、再構成距離|z|の関数として示す。
粒子1〜4：白血球、頭字語WBCで示す。
粒子5〜6：赤血球、頭字語RBCで示す。
粒子7〜9：血小板、頭字語PLTで示す。

再構成距離|z|は、z_min = 1000μｍとz_max = 1500μｍとの間で変化する。これらの演算と平行して、個々の粒子(1,…,9)は顕微鏡を用いて観察された。この顕微鏡観察は確実な同定を得ることを可能とする基準測定として用いられる。

この例で測定されたサンプルでは、以下のことが示唆される。
白血球WBCである粒子1〜4では、相補的な振幅の変化を再構成距離の関数として表す曲線
は、振幅の閾値
よりも低い最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加し、この増加は顕著な変動を含む。
赤血球RBCである粒子5、6では、曲線
は、ベースラインBLと振幅の閾値
との間の最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて単調に増加する。
血小板PLTである粒子7〜9では、曲線
は、ベースラインBLに従い、２つの値BL ± εの間にとどまる。

したがって、光検出器の面に対して平行な面における位置が(x_n, y_n)である個々の検出される粒子nについて、複数の再構成距離zにおける相補的な振幅の変化を表すプロファイル
を確立し、このプロファイルを用いて、粒子が、赤血球、白血球、または血小板のいずれかであることを同定することが可能である。

このプロファイルは特に、既知の粒子を用いて学習段階で作成されたプロファイルのライブラリと比較することができる。換言すれば、伝播軸Z(座標zの軸)に沿った相補的な振幅の変化を表すプロファイル
は、観察される粒子の種類の識別特性を形成する。

従来技術とは対照的に、サンプルから所定の距離におけるホログラフィック再構成を行うことによって粒子の複素画像を作成するのではなく、光検出器から複数の距離において、入射光波の伝播方向に沿って、入射光波12の粒子による回折から生じる光波22の特性が再構成される。得られる情報は、より豊富で、種々の種類の粒子間の明確な分類を可能とする。

図3A、3Bはそれぞれ、50個の白血球WBCと240個の赤血球RBCについて得られた、光検出器が受ける光波22の相補的な振幅プロファイル
を示す。プロファイルは繰り返し再現性が良く、それに基づいて粒子の堅牢な分類が可能である。これらのプロファイルは、上記例と同様の実験条件で得られた。

図3Aに示す測定を得るために使用されたサンプルは、図2A、2Bを参照して述べたサンプルと同様、リッチプラズマであった。
図3Bに示す測定を得るために使用されたサンプルは、上記したようなリン酸緩衝食塩液（PBS）を用いて、希釈比1/400で希釈した全血液を含む。

図4Bは、上記種類のリッチプラズマのサンプル中の4個の血小板101、102、103、104について得られた、軸Zに沿った相補的な振幅プロファイル
を示す。顕微鏡観察は、血小板101、102、103、104が凝集体であることを示した。

図4Aは、光検出器16によって取得された画像Iの対象領域を示す。これは、凝集体をなす個々の血小板の座標(x₁₀₁,y₁₀₁), (x₁₀₂,y₁₀₂), (x₁₀₃,y₁₀₃), (x₁₀₄,y₁₀₄)の同定を可能とする。

これらのプロファイルは、第１の例のプロファイルと同様の実験条件で得られたものである。
プロファイル
は、血小板が凝集体であるかに関係なく同様であり、BL ± εの間隔内でベースラインBL付近にとどまることが示唆される。したがって、本発明の１つの主題である同定方法を用いることで、凝集体であっても血小板を正確に同定することが可能である。

第２の例において、光源11は、中心波長がλ = 485 nmであり、半値幅が22nmである485-DF-22 オメガ光学フィルタを結合した白色発光ダイオードである。光源と光検出器との間の距離Δは8cmである。サンプルは、上記したようなリッチプラズマである。

この例において、光検出器からの複数の距離zで光波22の複素式U(x, y, z)が再構成され、次いで、粒子の座標(x, y)において、光波の相補的な振幅と位相が特定された。そして、相補的な振幅と位相をzの関数として表すプロファイル
およびφ(z)が確立された。

上記例と同様に、観察される粒子の特性は、顕微鏡観察によって確認された。

図5A、5Bはそれぞれ、種々の粒子について、相補的な振幅
と位相φ(x, y, z)を距離zの関数として示す。図5Aは、以下のことを示す。
白血球WBCである粒子では、相補的な振幅の変化を再構成距離の関数として表す曲線
は、振幅の閾値
よりも低い際立った最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加し、この増加は顕著な変動を含む。
赤血球RBCである粒子では、曲線
は、ベースラインBLと振幅の閾値
との間の最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて単調に増加する。
血小板PLTである粒子では、曲線
は、ベースラインBLに従い、２つの値BL ± εの間にとどまる。

したがって、光検出器の面に対して平行な面における位置が(x_n, y_n)である個々の検出される粒子nについて、複数の再構成距離zにおける光検出器が受ける光波22の上記したような相補的な振幅の変化を表すプロファイル
を確立し、
このプロファイルを用いて、粒子が、赤血球RBC、白血球WBC、または血小板PLTのいずれかであることを分類することが可能である。
したがって、分類は、レーザ光源以外の光源を用いても可能である。

図5Bは、以下のことを示す。
白血球WBCである粒子では、位相φの変化を再構成距離zの関数として表す曲線φ(z)は、第１の位相の閾値φ_threshold ¹よりも高い最大値を有し、次いで、第２の位相の閾値φ_threshold ²よりも低い最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加する。
赤血球RBCである粒子では、曲線φ(z)は、前記第１の位相の閾値φ_threshold ¹よりも高い最大値を有し、次いで、前記第２の位相の閾値φ_threshold ²よりも高い最小値を有し、そこから曲線はベースラインBLに向けて単調増加する。
血小板PLTである粒子では、位相φの変化を再構成距離の関数として表す曲線φ(z)は、２つの値φ_threshold ¹とφ_threshold ²の間にとどまる。測定される値は、前記第１、第２の位相の閾値の間にとどまる。

したがって、光検出器の面に対して平行な面における位置が(_n, _n)である個々の検出される粒子nについて、複数の再構成距離zにおける光検出器が受ける光波の位相の変化を表すプロファイルφ(x_n, y_n, z)を確立し、このプロファイルを用いて、粒子が、赤血球、白血球、または血小板のいずれかであることを分類することが可能である。

第３の例において、光源11は、中心波長がλ = 610 nmであり、半値幅が20nmである610-DF-20 オメガ光学フィルタを結合した白色発光ダイオードである。光源はサンプルからの距離Δが8cmのところに配置される。操作方法とサンプルは、上記例と同様である。

図6A、6Bはそれぞれ、種々の粒子について、相補的な振幅
と位相φ(x, y, z)を距離zの関数として示す。図6Aは、以下のことを示す。
白血球WBCである粒子では、振幅uの変化を再構成距離zの関数として表す曲線
は、相補的な振幅の閾値
よりも低い際立った最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加し、この増加は顕著な変動を含む。
赤血球RBCである粒子では、曲線
は、ベースラインBLと振幅の閾値
との間の最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて単調に増加する。
血小板PLTである粒子では、曲線
は、ベースラインBLに従い、２つの値BL ± εの間にとどまる。

したがって、光検出器の面に対して平行な面における位置が(x_n, y_n)である個々の検出される粒子nについて、複数の再構成距離zにおける光検出器が受ける光波22の上記したような相補的な振幅の変化を表すプロファイル
を確立し、このプロファイルを用いて、粒子が、赤血球RBC、白血球WBC、または血小板PLTのいずれかであることを分類することが可能である。

図6Bは、以下のことを示す。
白血球WBCである粒子では、位相φの変化を再構成距離zの関数として表す曲線φ(z)は、第１の位相の閾値φ_threshold ¹よりも高い最大値を有し、次いで、第２の位相の閾値φ_threshold ²よりも低い最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加する。
赤血球RBCである粒子では、曲線φ(z)は、前記第１の位相の閾値φ_threshold ¹よりも高い最大値を有し、次いで、前記第２の位相の閾値φ_threshold ²よりも高い最小値を有し、そこから曲線はベースラインBLに向けて単調増加する。
血小板PLTである粒子では、位相φの変化を再構成距離zの関数として表す曲線φ(z)は、２つの値φ_threshold ¹とφ_threshold ²の間にとどまる。測定される値は、前記第１、第２の位相の閾値の間にとどまる。
上記２つの例は、相補的な振幅のプロファイル
または位相のプロファイルφ(z)によって粒子の特性を明らかにすることが可能であることを示す。
また、相補的な振幅と位相とを組み合わせた複合光学パラメータ、例えば下記式の比で表される符号kを使用することが可能である。
図7A、7B、および7Cはそれぞれ、第１の例（405nmレーザ光源）、第２の例（中心波長がλ = 485 nmであるフィルタと組み合わされた白色LED光源）、および第３の例（中心波長がλ = 610 nmであるフィルタと組み合わされた白色LED光源）の構成において、伝播軸Zに沿った前記複合光学パラメータの変化を示す。各構成において、観察されるサンプルは、上記したようなリッチプラズマである。

各グラフにおいて、分析された粒子は、３つの白血球（WBC）と１つの赤血球（RBC）である。

光源によらず、プロファイルk(z)における変動は、赤血球よりも白血球の方が大きくなることが示唆される。

特に、第１の複合の閾値k_threshold ¹と第２の複合の閾値k_threshold ²から同定することが可能である。プロファイルk(z)が第１の複合の閾値k_threshold ¹未満と第２の複合の閾値k_threshold ²超との間にとどまるとき、分析される粒子は赤血球であると同定される。プロファイルがこれらの閾値の一方を外れるとき、検査される粒子は白血球であると同定される。

マトリクスアレイ光検出器16によって取得された画像Iまたはホログラムに対するデジタル伝播演算子hの適用は、取得された画像が位相に関する情報を含まないことから、ある限界を有するかもしれない。したがって、プロファイルが確立される前に、光検出器16が受ける光波22の位相に関する情報を得ることが好ましい。
この位相に関する情報は、従来技術に記載の方法を用いて、サンプル14の複素画像U_zを再構成し、マトリクスアレイ光検出器16の面Pまたは光検出器から距離|z|に位置する再構成面P_zにおける光波22の振幅と位相の評価を得ることができる。本発明者らは、基準複素画像の計算に基づく方法を開発した。図8Aを参照して、この方法について述べる。この方法は、以下の工程を含む。
マトリクスアレイ光検出器16を用いてサンプル14の画像Iを取得する。この画像は、ホログラムを形成する（工程100）。
再構成面P_zまたは検出面Pにおけるサンプル14の基準画像U_refと呼ばれる複素画像を計算する。この基準複素画像は、マトリクスアレイ光検出器16が受ける光波22の位相と振幅に関する情報を含む。この工程は、取得された画像Iに対して、上記伝播演算子hを適用することによって実行される。この複素画像は、粒子の特性を明らかにするプロファイルがその画像に基づいて作成されるため、基準画像と呼ばれる（工程110〜170）。
基準複素画像U_refまたは光検出器によって取得された画像を用いて、検出面または検出面に対して平行な面における粒子の動径位置(x,y)を選択する（工程180）。
基準複素画像U_refに対して伝播演算子hを適用することによって、伝播軸Zに沿った第２の画像と呼ばれる複素画像U_ref,zを計算する（工程185）。
再構成面P_z（または検出面P）から複数の距離において、あらかじめ選択された粒子の動径座標(x,y)で、個々の第２の複素画像U_ref,zから、光波22の特徴量を評価し、伝播軸Zに沿った上記特徴量の変化を表すプロファイルを作成する（工程190）。
上記プロファイルに応じて粒子を特徴付ける。上記したように、この特徴付けは、得られたプロファイルを、標準サンプルを用いて位相を測定して得られた標準プロファイルと比較することによって行うことができる（工程200）。

図8Aに示すアルゴリズムについて、以下に詳述する。あるいくつかの工程で得られた結果を図8B〜8Dに示す。工程110〜170は、U_refで示す基準複素画像を得る好ましい方法であり、この画像は、再構成面P_zにおける光波22の複素式の空間的な分布を表す。当業者であれば、他のアルゴリズムを用いてもそのような複素画像の再構成を行うことが可能であることは理解されよう。例えば、従来技術を参照して述べたアルゴリズムを用いることを想到できるであろう。
工程100：画像の取得

この工程において、画像センサ16は、サンプル14の画像I、より正確にはサンプルから送られて画像センサが受ける光波22の画像を取得する。そのような画像またはホログラムを、図8Bに示す。

この画像は、緩衝食塩液に浸された赤血球を含み、上記装置のように、CMOSセンサから1500μｍの距離dに配置された100μｍ厚の流体チャンバに入れられたサンプル14を用いて得られたものである。
工程110：初期化

この工程において、画像センサ16によって取得された画像Iからサンプル14の初期画像U₀ ^k=0が特定される。この工程は、以下に工程120〜180を参照して述べる反復アルゴリズムの初期化であり、指数kは、個々の繰り返しが何番目であるかを示す。初期画像U₀ ^k=0の係数u₀ ^k=0は、画像センサによって取得された画像Iに対して平方根演算子を適用することによって得ることができ、この場合、
である。
この例において、画像Iは、サンプル14に入射する光波12の強度で代表されるものによって正規化される。サンプル14に入射する光波12の強度は例えば、画像Iの平均
の平方根であり、
この場合、取得された画像Iの個々の画素I(x, y)が以下に示すように上記平均で除される。

初期画像U₀ ^k=0の位相φ₀ ^k=0は、個々の画素(x,y)においてゼロまたは所定の任意の値に決められた所定値とすることができる。特に、初期画像U₀ ^k=0は、マトリクスアレイ光検出器16によって取得された画像Iから直接得られる。しかしながら、マトリクスアレイ光検出器16によって取得された画像Iは、サンプル14から送られた光波22の位相に関する情報を含まず、画像センサ16は、この光波の強度に対してのみ反応する。
工程120：伝播

この工程において、上記したような伝播演算子を適用することによって、サンプルの面で得られた画像U₀ ^k-1が再構成面P_zに伝播され、再構成面P_zにおいてサンプル14を表す複素画像U_z ^kが得られる。伝播は、以下に示す伝播演算子h_−zを用いて、画像U₀ ^k-1を重畳することによって実行される。
ここで、符号＊は、畳み込み演算子を表す。符号「−z」は、伝播軸Zの方向に対して反対方向に伝播が実行されることを表す。後方伝播とも言う。

１回目の繰り返し(k=1)において、U₀ ^k=0は、工程110で特定された初期画像である。それ以降の繰り返しにおいて、U₀ ^k-1は、各繰り返しにおいてアップデートされた検出面Pにおける複素画像である。

再構成面P_zは、検出面から離れた、好ましくは検出面Pに対して平行な面である。好ましくは、再構成面P_zは、サンプル14が存在する面P₁₄である。特に、この面で再構成された画像では、一般的に高い空間分解能を得ることができる。それはまた、検出面からゼロ以外の距離に位置する、好ましくは検出面に対して平行な面、例えば、マトリクスアレイ光検出器16とサンプル14との間に存在する面であってもよい。
工程130：複数の画素におけるインジケータの計算

この工程において、複素画像U_z ^kの複数の画素(x,y)、好ましくはこれらの画素のそれぞれについて、個々の画素に関連した量ε^k(x,y)が計算される。この量は、計算が行われる画素(x,y)の画像U_z ^kまたはその係数の値U_z ^k(x,y)に依存する。それはまた、この画素の画像の導関数、例えばこの画像の導関数の係数に依存することができる。

この例において、個々の画素に関連した量ε^k(x,y)は、個々の画素の画像U_z ^kと値1との間の差の係数である。そのような量は、下記式を用いて得ることができる。
工程140：画像U_z ^kに関連したノイズインジケータの確立

工程130において、複素画像U_z ^kの複数の画素において、量ε^k(x,y)が計算された。これらの量は、ベクトルE^kから得ることができる、個々の画素(x,y)に関連した量ε^k(x,y)である。この工程において、ベクトルE^kのノルムから、ノイズインジケータと呼ばれるインジケータが計算される。一般的に、オーダーはノルムと関連し、ディメンジョンnの座標(x₁, x₂,…x_n)で表されるベクトルxのオーダーpのノルム
は、下記式で表される。
ここで、p≦0である。

この例では、オーダー1、換言すればp=1のノルムが用いられる。以下に述べるように、本発明者らは、オーダー1またはオーダー1以下のノルムが、そのようなサンプルに対して特に適することを見出している。

この工程において、複素画像U_z ^kの個々の画素(x,y)について計算された量ε^k(x,y)が合計され、複素画像U_z ^kに関連した、下記式で表されるノイズインジケータε^kが求められる。

オーダー1またはオーダー1以下のノルムが用いられることで、ノイズインジケータε^kの値が減少し、複素画像U_z ^kはサンプルをより精度良く表すものとなる。特に、１回目の繰り返しにおいて、画像U₀ ^kの個々の画素(x,y)における位相φ₀ ^k(x, y)の値の評価は良くない。また、従来技術を参照して述べたように、検出面Pから再構成面P_zへのサンプル画像の伝播は、実質的な再構成ノイズを伴う。この再構成ノイズは、再構成された画像における変動の形となって現れる。これらの変動の故に、再構成された画像における再構成ノイズの寄与が増加すると、上記したようなノイズインジケータε^kの値が増加する。特に、再構成ノイズに由来する変動は、このインジケータの値が増加させる傾向がある。

この工程の重要な点は、検出面Pにおいて、サンプルの画像U₀ ^kの個々の画素に対する位相値φ₀ ^k(x, y)を特定することであり、このことは、次の繰り返しにおいて、インジケータε^kより低いインジケータε^k＋1の再構成画像U_z ^k＋1が得られることを可能とする。

上記したように、１回目の繰り返しにおいて、関連する情報は、光波22の位相ではなく強度のみから得られる。したがって、検出面Pにおける光波22の位相に関連する情報がないことから、再構成面P_zにおいて再構成される最初の画像U_z ^k=1は、再構成ノイズの実質的な量の影響を受ける。したがって、インジケータε^k=1の値は高いものとなる。以降の繰り返しにおいて、アルゴリズムは、検出面Pにおける位相φ₀ ^k(x, y)を徐々に調整し、インジケータε^kを徐々に最小化する。

検出面における画像U₀ ^kは、強度と位相の両方の観点から、検出面Pにおける光波22を表す。工程120〜160は、画像U₀ ^kの個々の画素に対して、繰り返し、画像U₀ ^k−1を再構成面P_zに伝播することによって得られる画像U_z ^kから得られるインジケータε^kを最小化する位相φ₀ ^k(x, y)の値を確立することを目的としている。

最小化アルゴリズムは、勾配降下法または共役勾配降下法であることができる。後者について以下に述べる。
工程150：検出面における位相の値の調整

工程150は、次の繰り返しk+1において、複素画像U₀ ^kの再構成面P_zへの伝播から生じるインジケータε^k＋1を最小化するように、複素画像U₀ ^kの個々の画素の位相φ₀ ^k(x, y)の値を特定することを目的としている。これを行うことで、複素画像U₀ ^kの画素の位相φ₀ ^k(x, y)である位相ベクトルφ₀ ^kが確立される。このベクトルのディメンジョンは(N_pix, 1)である。ここで、N_pixは、画素数である。このベクトルは、個々の繰り返しにおいて、下記のアップデータ式を用いてアップデータされる。
φ₀ ^k(x, y)= φ₀ ^k−1(x, y) + α^kp^k(x, y)
ここで、
α^kは、距離を表す、「ステップサイズ」と呼ばれる数である。
p^kは、ディメンジョン(N_pix, 1)の方向ベクトルである。
個々のp(x, y)はインジケータε^kの勾配
の方向を表す。
この式は、以下のようにベクトル形式で表すことができる。
φ₀ ^k=φ₀ ^k−1 +α^kp^k
それは、以下のように表すことができる。
ここで、
は、ディメンジョン(N_pix, 1)の勾配ベクトルであり、インジケータε^kの変化を未知の値、例えばベクトルφ₀ ^kの自由度の関数として表す。
p^k−1は、上記繰り返しにおいて確立された方向ベクトルである。
β^kは、方向ベクトルp^k−1に適用されるスケールファクタである。
勾配ベクトル
の個々の
は、下記式で表される。
ここで、Imは演算項の虚数部を戻す演算子であり、r′は検出面における座標(x, y)である。

スケールファクタβ^kは、下記式で表すことができる。

ステップサイズα^kは、繰り返しの回に応じて、例えば、１回目の繰り返しにおける0.03と最後の繰り返しにおける0.0005との間で、変化することができる。

アップデータ式はベクトルφ₀ ^kの調整を可能とし、これによって複素画像U₀ ^kの個々の画素における位相φ₀ ^k(x, y)の繰り返しアップデータが可能となる。そして、検出面におけるこの複素画像U₀ ^kは、個々の画素に関連した位相のこれらの新しい値を用いてアップデータされる。なお、複素画像U₀ ^kの係数は変更されず、これは、マトリクスアレイ光検出器16によって取得された画像から特定され、下記式で表される。
u₀ ^k(x, y)= u₀ ^k=0(x, y)
工程160：アルゴリズムの繰り返しまたは終了

収束基準に到達しない限り、工程160では、工程150においてアップデータされた複素画像U₀ ^kに基づいて、工程120〜160の新しい繰り返しを含むアルゴリズムの繰り返しを行う。収束基準は、所定の繰り返し回数K、インジケータの勾配
の最小値、
または２つの連続する位相ベクトルφ₀ ^k−1、φ₀ ^kの間の無視可能な差であることができる。収束基準に到達したとき、評価は、検出面Pまたは再構成面P_zにおけるサンプルの複素画像の正確な評価であると見なせる。
工程170： 基準複素画像の取得

この方法では、最後の繰り返しの終わりに、再構成面P_zに対して最後の繰り返しから生じる複素画像U₀ ^kが伝播され、基準複素画像U_ref＝U_z ^kを得ることができる。代替的に、基準複素画像U_refは、検出面Pにおける最後の繰り返しから生じる複素画像U₀ ^kであってもよい。ただし、粒子の密度が高いときには、この代替は不利である。これは、特に再構成面P_zがサンプル14が存在する面P₁₄に対応するとき、検出面Pにおける空間分解能は再構成面P_zにおけるそれよりも小さいためである。

図8Cは、8回の繰り返しの後に再構成面P_zで得られた基準複素画像U_z ^k=8の個々の画素の係数u_z ^k=8を示す。この画像の空間分解能では、個々の粒子の動径座標(x, y)を良好に同定することが可能である。
工程180：粒子の動径座標の選択

この工程において、粒子の動径座標(x, y)は、基準画像U_ref＝U_z ^k=30から、例えば係数u_ref＝u_z ^k=30の画像または位相φ_ref=φ_z ^k=30の画像から、選択される。上記したように、用語「動径座標」は、検出面または再構成面の座標を示す。また、最後の繰り返しに続いて検出面で得られたホログラムI₀または複素画像U₀ ^kに基づいて、この選択を実行することを想到することができる。ただし、粒子数が多いときには、特に再構成面P_zがサンプルP₁₄の面に対応するときに、より良い空間分解能が得られることから、再構成面で作成された画像の選択を実行することが好ましい。図8Cにおいて、点線で囲まれた粒子の選択が示されている。
工程185：伝播演算子の適用

この工程185において、上記したような伝播演算子hを用いて、基準複素画像U_refが複数の再構成距離に伝播され、検出面Pまたは再構成面P_zからの種々の距離で再構成された第２の複素画像U_ref,zと呼ばれる複数の画像が得られる。このように、この工程は、下記式で表される複数の複素画像U_ref,zの特定を含む。
ここで、z_min ≦ z ≦ z_max である。

値z_minとz_maxは、基準複素画像が伝播される軸Zに沿った最小と最大の座標である。好ましくは、サンプル14と画像センサ16との間の複数の座標zで複素画像が再構成される。複素画像は、サンプル14の一方の側で作成することができる。

これらの第２の複素画像は、ホログラフィック再構成演算子hを基準画像U_refに適用することによって確立される。基準画像は、工程120〜160の繰り返しに続いて画像センサが受ける光波22、特にその位相を正確に表す複素画像である。したがって、第２の画像U_ref,zは、伝播軸Zに沿った光波22の伝播の良い記述子となる。
工程190：プロファイルの作成

この工程において、個々の第２の複素画像U_ref,zから上記したような光波22の特徴量が特定され、伝播軸Zに沿った特徴量の変化を表すプロファイルが特定される。特徴量は例えば、係数、位相、またはこれらの組合せであることができる。図8Dは、伝播軸Zに沿った光波22の位相φ(z)の変化を示す。
工程200：特徴付け

そして、上記工程で作成されるプロファイルから粒子の特性を明らかにすることができる。好ましくは、既知の標準サンプルを用いて学習段階で作成された標準プロファイルのデータベースを利用することができる。そして、特徴付けは、標準プロファイルに基づいて、作成されたプロファイルを比較または分類することによって、実行される。

この態様では、赤血球を含むサンプルについて試験を行った。図9A〜9Eに他の例を示す。これらの例において、サンプルは、リン酸緩衝食塩液（PBS）を含む水溶液を用いて、希釈比1/400で希釈した赤血球を含む。サンプル14は、100μｍ厚の流体チャンバ15内に入れられ、このチャンバは、スペクトルバンドの中心波長が450nmである上記発光ダイオードから8cmの距離に配置された。サンプルは、上記CMOS画像センサから1.5mmの距離に配置された。空間フィルタ18の開口径は、150μｍであった。

図9Aは、画像センサによって取得された画像Iを示す。図9B、9Cにそれぞれ、サンプルの面P₁₀において再構成された複素画像U_z ^k=8の係数と位相の画像を示す。これらの画像は、8回の繰り返しで得られたものである。

画像U_z ^k=8は基準画像U_refを形成し、それに対して上記したような伝播演算子hが適用され、伝播軸Zに沿った複数の第２の複素画像A_ref,zが得られた。さらに、基準画像の係数または位相の画像において、赤血球が同定された。この赤血球は、これらの画像のそれぞれにおいて、点線で囲まれている。この赤血球の動径座標(x, y)が得られた。第２の複素画像A_ref,zから係数を表すプロファイルu(z)と画像センサ16に到達する光波22の位相を表すプロファイルφ(z)が作成された。プロファイルの個々の点の値は、上記動径座標において各第２の画像の係数と位相を特定することによって得られる。図9D、9Eはそれぞれ、このようにして選択された赤血球の係数と位相のプロファイルを示す。プロファイルは、座標 z_min = 1000μｍ〜z_max = 2000μｍ、ステップサイズ5μｍの条件で特定された。再構成面は、検出面から1380μｍに位置し、これは図9Dおよび9Eにおける横軸76に対応する。

上記方法は血液粒子に限定されず、他の体液、例えば、尿、脳脊髄液、骨髄等に適用することができる。さらに、この方法は、特に、水または他の水溶液中の汚染物質または毒素の分析用の非体液にも適用することができる。

この方法はまた、寒天等の非液体媒体、または、スライド上に広く付着した乾燥血液を得る血液塗抹等の体液の乾燥残留物内の粒子の検出と同定に適用することができる。後者の場合、粒子は、乾燥残留物または空気によって互いに隔てられている。

さらに、上記したように、粒子は、内因粒子（例えば血液粒子）であっても外因粒子（マイクロビーズ、小滴）であってもよい。

上記の例は、特徴量を再構成距離の関数として表すプロファイルにおける変化と所定の閾値を用いた比較に基づく、シンプルな同定のクライテリアを提供する。クライテリアの妥当性は、粒子が置かれる媒体とサンプル準備のプロトコルに関係する。他のクライテリアは、異なる準備のプロトコルを受けた粒子に適用することができる。したがって、同定のクライテリアは、与えられたサンプルの種類に対して、既知の粒子を含む標準サンプルについて実行された学習段階で特定することができる。

また、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、より複雑でより堅牢な他の分類方法を実行することができる。

Claims (15)

1. サンプル(14)中に含まれる粒子(1, 2,…9, 101…104)を同定する方法において、
   伝播軸(Z)に沿って前記サンプル(14)に向かって伝播する入射光波(12)を生み出す光源(11)を用いて前記サンプルに光を照射する工程a)と、
   マトリクスアレイ光検出器(16)を用いて、前記マトリクスアレイ光検出器が前記入射光波(12)と個々の前記粒子によって生み出された回折波との間の干渉を含む光波(22)を受けるように前記光源と前記マトリクスアレイ光検出器との間に置かれた前記サンプルの画像を取得する工程b)とを含み、
   さらに、
   前記マトリクスアレイ光検出器(16)が存在する面(P)に対して平行な面(x, y)における前記粒子の位置を特定する工程c)と、
   前記取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、前記マトリクスアレイ光検出器(16)から複数の再構成距離(|z|)で前記マトリクスアレイ光検出器(16)が受ける前記光波(22)の少なくとも１つの特徴量
   を評価する工程d)と、
   前記特徴量の変化
   を前記伝播軸(Z)に対して平行な軸に沿って前記位置(x, y)を通る前記再構成距離の関数として表すプロファイルを特定する工程e)と、
   前記プロファイルに応じて前記粒子を同定する工程f)とを含むことを特徴とする方法。
2. 前記特徴量は、個々の前記再構成距離において、前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波(22)の複素式(U(x, y, z))を評価することによって得られる、請求項１に記載の方法。
3. 前記特徴量は、前記複素式(U(x, y, z))の係数または独立変数から特定される、請求項２に記載の方法。
4. 前記同定は、前記特徴量の変化を学習段階で特定された基準プロファイルと比較することによって行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記マトリクスアレイ光検出器の面に対して平行な面における個々の前記粒子の位置は、前記マトリクスアレイ光検出器によって取得された画像または前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波(22)の複素式(U(x, y, z))を用いて特定される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記マトリクスアレイ光検出器(16)によって取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、再構成面または検出面における基準複素画像(U_ref)を特定する工程と、
   前記基準複素画像から、前記マトリクスアレイ光検出器(16)から複数の前記再構成距離(|z|)における前記マトリクスアレイ光検出器(16)が受ける前記光波(22)の少なくとも１つの前記特徴量
   を評価する工程とを含む、
   請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記基準複素画像(U_ref)に対して伝播演算子(h)を適用して、前記再構成面または前記マトリクスアレイ光検出器が存在する面から複数の前記再構成距離における第２の複素画像(U_ref,z)を計算する工程と、
   個々の前記第２の複素画像(U_ref,z)から複数の前記再構成距離のそれぞれにおける前記特徴量を特定する工程とを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記光源は空間的コヒーレンス光源である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記光源は発光ダイオードまたはレーザダイオードである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記サンプルと前記マトリクスアレイ光検出器との間に拡大光学部品が配置されない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記サンプルが血球を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記粒子は、白血球、赤血球、または血小板の細胞系の中で同定される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. サンプル(14)中に含まれる粒子を同定する装置において、
    前記サンプル(14)の方向に伝播軸(Z)に沿って入射光波(12)を生み出すように配置された光源(11)と、
    前記光源(11)とマトリクスアレイ光検出器(16)との間で前記サンプル(14)を保持するホルダと、
    前記入射光波(12)と前記粒子によって形成された回折波との間の干渉から生じる光波(22)を受け、前記サンプルの画像を取得するように配置された前記マトリクスアレイ光検出器(16)とを有し、
    さらに、
    前記マトリクスアレイ光検出器(16)が存在する面（P)に対して平行な面(x, y)における前記粒子の位置を特定する工程と、
    前記取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、前記マトリクスアレイ光検出器(16)から複数の再構成距離(|z|)における前記マトリクスアレイ光検出器(16)が受ける前記光波(22)の少なくとも１つの特徴量
    を評価する工程と、
    前記特徴量の変化
    を前記伝播軸(Z)に対して平行な軸に沿って前記位置(x, y)を通る前記再構成距離の関数として表すプロファイルを特定する工程と、
    前記プロファイルに応じて前記粒子を同定する工程とを、
    実行するように構成されたプロセッサ(20)、特にマイクロプロセッサを有することを特徴とする装置。
14. 前記マトリクスアレイ光検出器と分析される前記サンプルとの間に拡大光学部品を有さない、請求項１３に記載の装置。
15. 前記プロセッサは、
    個々の前記再構成距離における前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の複素式(U(x, y, z))を特定し、
    個々の前記再構成距離における前記複素式(U(x, y, z))の係数または独立変数を特定することによって、前記特徴量を評価するように構成された、請求項１３または１４に記載の装置。