JP2018504378A - 免疫修飾因子 - Google Patents

Abstract

本明細書は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０タンパク質／タンパク質の相互作用を阻害し、このことにより癌および感染症を含めた様々な疾患を緩和するために有用である新規大環状ペプチドを提供する。

Description

(関連出願に対する相互参照)
本出願は、２０１４年１２月１９日に提出した米国仮出願番号第６２／０９４,２８１号に対する優先権を主張するものであって、その全てを参照により本明細書に組み込むものである。

本発明は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ８０／ＰＤ−Ｌ１タンパク質／タンパク質相互作用を阻害し、それゆえに、癌および感染症を含む種々の疾患の改善に有用である新規大環状ペプチドを提供する。

タンパク質プログラム細胞死１(ＰＤ−１)は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーである。ＰＤ−１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄球性細胞上に発現される(Agata et al., supra；Okazaki et al., Curr. Opin. Immunol., 14：779-782(2002)；Bennett et al., J. Immunol., 170：711-718(2003))。

ＰＤ−１タンパク質は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部である５５ｋＤａ Ｉ型膜貫通型タンパク質である(Agata et al., Int. Immunol., 8：765-772(1996))。ＰＤ−１は、膜近位免疫受容体チロシン阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)および膜遠位チロシンベーススイッチモチーフ(ＩＴＳＭ)(Thomas, M.L., J. Exp. Med., 181：1953-1956(1995)；Vivier, E. et al., Immunol. Today, 18：286-291(1997))を含む。ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ−４と構造は類似するが、ＣＤ８０ ＣＤ８６(Ｂ７−２)結合に重要なＭＹＰＰＹモチーフを欠く。ＰＤ−１に対する２個のリガンドであるＰＤ−Ｌ１(Ｂ７−Ｈ１)およびＰＤ−Ｌ２(ｂ７−ＤＣ)が同定されている。ＰＤ−１を発現するＴ細胞の活性化は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との相互作用により下方制御されることが示されている(Freeman et al., J. Exp. Med., 192：1027-1034(2000)；Latchman et al., Nat. Immunol., 2：261-268(2001)；Carter et al., Eur. J. Immunol., 32：634-643(2002))。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のいずれも、ＰＤ−１に結合するＢ７タンパク質ファミリーメンバーであるが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーとは結合しない。ＰＤ−Ｌ１リガンドは多様なヒトの癌で豊富である(Dong et al., Nat. Med., 8：787-789(2002))。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用は、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体仲介増殖の減少および癌細胞による免疫回避をもたらす(Dong et al., J. Mol. Med., 81：281-287(2003)；Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54：307-314(2005)；Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10：5094-5100(2004))。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転でき、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用が同様に遮断されたとき、この効果は相加的である(Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99：12293-12297(2002)；Brown et al., J. Immunol., 170：1257-1266(2003))。

ＰＤ−Ｌ１はＣＤ８０と相互作用することも示されている(Butte, MJ. et al., Immunity, 27：111-122(2007))。発現する免疫細胞上でのＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０相互作用は、阻害的であることが示されている。この相互作用の遮断は、この阻害相互作用を抑止することが示されている(Paterson, AM. et al., J. Immunol., 187：1097-1105(2011)；Yang, J. et al., J. Immunol.,Aug 1；187(3)：1113-9(2011))。

ＰＤ−１発現Ｔ細胞が、そのリガンドを発現する細胞と接触したとき、増殖、サイトカイン分泌および細胞毒性を含む抗原性刺激に対する応答における機能活性が低下する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２相互作用は、感染または腫瘍の回復期または自己耐容性の発達期の免疫応答を下方制御する(Keir, M.E. et al., Annu. Rev. Immunol., 26：Epub(2008))。腫瘍疾患または慢性感染の期間に起こるような慢性抗原刺激は、高レベルのＰＤ−１を発現し、慢性抗原に対する活性に関して機能障害性のＴ細胞を生じる(Kim et al., Curr. Opin. Imm.(2010)を参照されたい)。これは、“Ｔ細胞消耗”と呼ばれる。Ｂ細胞もＰＤ−１／ＰＤ−リガンド抑制および“消耗”を示す。

ＰＤ−Ｌ１に対する抗体を使用したＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ライゲーションの遮断は、多くの系におけるＴ細胞活性化を回復させ、増強させることが示されている。進行型の癌を有する患者は、ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体での処置により利益を得る(Brahmer et al., New Engl. J. Med.(2012))。腫瘍および慢性感染の前臨床的動物モデルは、モノクローナル抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断により、免疫応答を増強し、腫瘍拒絶または感染の制御をもたらし得ることを示している。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断による抗腫瘍免疫治療は、多くの組織学的に異なる腫瘍に対する治療的免疫応答を増強することができる(Dong, H. et al., “B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity”, J. Mol. Med., 81(5)：281-287(2003)；Dong, H. et al., “Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis：a potential mechanism of immune evasion”, Nat. Med., 8(8)：793-800(2002))。

ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の妨害は、慢性感染を有する系におけるＴ細胞活性を増強できる。ＰＤ−Ｌ１の遮断は、慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス感染マウスにおけるウイルスクリアランスの改善および免疫回復をもたらす(Barber, D.L. et al., “Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection”, Nature, 439(7077)：682-687(2006))。ＨＩＶ−１に感染したヒト化マウスは、ウイルス血症に対する保護の増強およびＣＤ４＋Ｔ細胞のウイルス枯渇を示す(Palmer et al., J. Immunol.(2013))。ＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体によるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断は、ＨＩＶ患者(Day, Nature(2006)；Petrovas, J. Exp. Med.(2006)；Trautman, Nature Med.(2006)；D'Souza, J. Immunol.(2007)；Zhang, Blood(2007)；Kaufmann, Nature Imm.(2007)；Kasu, J. Immunol.(2010)；Porichis, Blood(2011))、ＨＣＶ患者(Golden-Mason, J. Virol.(2007)；Jeung, J. Leuk. Biol.(2007)；Urbani, J. Hepatol.(2008)；Nakamoto, PLoS Path.(2009)；Nakamoto, Gastroenterology(2008))およびＨＢＶ患者(Boni, J. Virol.(2007)；Fisicaro, Gastro.(2010)；Fisicaro et al., Gastroenterology(2012)；Boni et al., Gastro.(2012)；Penna et al., J. Hep.(2012)；Raziorrough, Hepatology(2009)；Liang, World J. Gastro.(2010)；Zhang, Gastro.(2008))からのＴ細胞に対するインビトロ抗原特異的機能性を回復できる。

ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０相互作用の遮断は、免疫を刺激することも示されている(Yang, J. et al., J. Immunol., Aug 1；187(3)：1113-9(2011))。ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０相互作用の遮断により生じる免疫刺激は、さらなるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２相互作用の遮断との組み合わせにより増強することが示されている。

免疫細胞表現型の変化は、敗血症性ショックにおける重要な因子であるとの仮説がある(Hotchkiss et al., Nat. Rev. Immunol.(2013))。これらは、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１のレベル増加を含む(Guignant, et al., Crit. Care(2011))。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１レベルが上昇した敗血症性ショック患者からの細胞は、Ｔ細胞アポトーシスのレベル増加を示す。ＰＤ−Ｌ１に対する抗体は免疫細胞アポトーシスのレベルを低減できる(Zhang et al., Crit. Care(2011))。さらに、ＰＤ−１の発現欠失マウスは、野生型マウスよりも敗血症性ショック症状に対して抵抗性である(Yang, J. et al., J. Immunol., Aug 1；187(3)：1113-1119(2011))。抗体を使用したＰＤ−Ｌ１の相互作用の遮断が、不適切な免疫応答を抑制できること、および疾患徴候を回復できることが研究により示されている。

慢性抗原に対して増強した免疫学的応答に加えて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断は、慢性感染の症状における治療的ワクチン接種を含むワクチン接種に対する応答の増強も示す(Ha, S.J. et al., “Enhancing therapeutic vaccination by blocking PD-1-mediated inhibitory signals during chronic infection”, J. Exp. Med., 205(3)：543-555(2008)；Finnefrock, A.C. et al., “PD-1 blockade in rhesus macaques：impact on chronic infection and prophylactic vaccination”, J. Immunol., 182(2)：980-987(2009)；Song, M.-Y. et al., “Enhancement of vaccine-induced primary and memory CD8+ t-cell responses by soluble PD-1”, J. Immunother., 34(3)：297-306(2011))。

本明細書に記戴する分子は、生化学的実験系および細胞実験系の両系において、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用を遮断する能力を示す。これらの結果は、治療用ワクチンを含む、癌または慢性感染における免疫を増強するための治療的投与の可能性と一致する。

本明細書に記戴する大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１との相互作用およびＣＤ８０との相互作用を阻害できる。これらの化合物は、高度に効果的なＰＤ−Ｌ１への結合、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１またはＣＤ８０のいずれかとの相互作用の遮断を示し、強化されたＴ細胞機能的活性の促進が可能であり、それゆえ、これらは非経腸製剤、経口製剤、肺製剤、経鼻製剤、バッカル製剤および徐放製剤の候補となる。

一局面において、本開示は、式(Ｉ)：

［式中、
Ａは、結合、

から選択され；

は、カルボニル基との結合点を表し、

は、窒素原子との結合点を表し；
ｚは、０、１、または２である；
ｗは、１または２であり；
ｎは、０または１であり；
ｍは、１または２であり；
ｍ’は、０または１であり；
ｐは、０、１または２であり；
Ｒ^ｘは、水素、アミノ、ヒドロキシおよびメチルから選択され；
Ｒ^１４およびＲ^１５は、水素およびメチルから独立して選択され；および
Ｒ^ｚは、水素および−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ^１６から選択され；ここでＲ^１６は、水素、−ＣＨＲ^１７Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２、−ＣＨＲ^１７Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨＲ^１８Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２および−ＣＨＲ^１７Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨＲ^１８Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨ_２Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２から選択され；ここでＲ^１７は、水素および−ＣＨ_２ＯＨから選択され、ここでＲ^１８は、水素およびメチルから選択され；
Ｒ^ｖは、水素または天然のアミノ酸側鎖であり；
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｆ、Ｒ^ｈ、Ｒ^ｉおよびＲ^ｍは、水素であり；
Ｒ^ｎは、水素またはメチルであるか、あるいはＲ^ｖおよびＲ^ｎは、ピロリジン環を形成しており；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｊおよびＲ^ｋは、水素およびメチルから各々独立して選択され；
各Ｒ^２０は、水素およびＣ_１−Ｃ_６アルキルから独立して選択され；
各Ｒ^２１は、水素およびＣ_１−Ｃ_６アルキルから独立して選択され；
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、天然のアミノ酸側鎖および非天然のアミノ酸側鎖から独立して選択されるか、あるいは３〜６員炭素環式環あるいは対応するジェミナルＲ^２０基と共に酸素または窒素原子を含有する６員環を各々独立して形成することができ、ここで該環は、Ｃ_１−Ｃ_３アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_２−Ｃ_４アルケニル、ハロ、ヒドロキシおよびアミノから独立して選択される１、２または３つの置換基で所望により置換されていてもよく、ここで該５および６員環は、フェニル環と所望により縮合されていてもよく；あるいは
Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、各々独立して、以下に記載した通りの対応するビシナルＲ基と共に環を形成していてもよい；
Ｒ^ｅおよびＲ^ｋは、対応するビシナルＲ基およびそれらに結合している原子と共に、
アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびテトラヒドロチアゾールから選択される環を各々形成する；ここで各環は、所望により、アミノ、シアノ、メチル、ハロおよびヒドロキシから独立して選択される１〜４つの基で置換されていてもよく；
Ｒ^ｂはメチルであるか、あるいはＲ^ｂおよびＲ^２は、それらに結合している原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成しており；ここで各環は、所望により、アミノ、シアノ、メチル、ハロおよびヒドロキシから独立して選択される１〜４つの基で置換されていてもよく；または、Ｒ^２およびジェミナルＲ^２０が双方水素以外である場合、Ｒ^ｂは水素である；
Ｒ^ｄは、水素またはメチルであるか、あるいはＲ^ｄおよびＲ^４は、それらに結合している原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで各環は、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、ヒドロキシおよびフェニルから独立して選択される１〜４つの基で所望により置換されていてもよく；
Ｒ^ｇは、水素またはメチルであるか、あるいはＲ^ｇおよびＲ^７は、それらに結合している原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで各環は、アミノ、ハロ基で所望により置換されていてもよいベンジル、ベンジルオキシ、シアノ、シクロヘキシル、メチル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ基で所望により置換されていてもよいイソキノリニルオキシ、ハロ基で所望により置換されていてもよいキノリニルオキシおよびテトラゾリルから独立して選択される１〜４つの基で置換されていてもよく；ここで該ピロリジンおよび該ピペリジン環は、シクロヘキシル、フェニルまたはインドール基と所望により縮合していてもよく；および
Ｒ^ｌは、メチルであるか、あるいはＲ^ｌおよびＲ^１２は、それらに結合している原子と一緒になって、アゼチジンおよびピロリジンから選択される環を形成しており、ここで各環は、所望により、アミノ、シアノ、メチル、ハロおよびヒドロキシから独立して選択される１〜４つの基で置換されていてもよい；
但し、式(Ｉ)の化合物は、水素以外の４つの置換基を有しており、かつα−メチル置換された環ではない環の骨格上に少なくとも１つの炭素を含有する］
の化合物、またはその医薬的に許容される塩を提供する。

第一局面の第一実施形態において、本開示は、
Ａが、

である、請求項１記載の化合物またはその医薬的に許容される塩が提供される。

第二の実施形態において、ｚおよびｗは、各々１であり；Ｒ^１４およびＲ^１５は水素であり；およびＲ^ｚは−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ^１６であり；ここでＲ^１６は−ＣＨＲ^１７Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２である。第三実施形態において、Ｒ^１は、ヒドロキシで置換されていてもよいベンジルであり；Ｒ^２はメチルであるか、あるいはジェミナルＲ^２０と一緒になって、シクロプロピル環を形成しており；Ｒ^８は、−(ＣＨ_２)インドリルであり；Ｒ^１０は、−(ＣＨ_２)インドリルおよび−(ＣＨ_２)ベンゾチエニルから選択され、各々所望により−ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈで置換されていてもよい；Ｒ^１１はブチルであり；Ｒ^１２はブチルであり；Ｒ^ａは水素であり；Ｒ^ｅは水素であり；Ｒ^ｊはメチルであり；Ｒ^ｋはメチルであり；およびＲ^ｌは水素である。

別の実施形態において、本開示は、その必要な対象において免疫応答を、増強、刺激および／または増加する方法を提供するものであり、前記方法は、治療上有効な量の式(Ｉ)の化合物またはその治療上許容し得る塩を前記対象に投与することを特徴とする。別の実施形態において、この方法は、別の剤を、式(Ｉ)の化合物あるいはその治療上許容し得る塩を投与する前、後または同時に投与することをさらに特徴とする。別の実施形態において、別の薬剤は、殺菌剤、抗ウイルス剤、細胞毒性剤および／または免疫応答修飾剤である。別の実施形態において、別の薬剤は、ＨＤＡＣ阻害剤である。別の実施形態において、別の薬剤は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストである。

別の実施形態において、本開示は、その必要がある対象において、癌細胞の成長、細胞増殖または転移を阻害する方法を提供するものであり、前記方法は、治療上有効な量の式(Ｉ)の化合物あるいはその治療上許容し得る塩を対象に投与することを特徴とする。前記阻害は直接的または間接的であってもよいことは理解されるべきである。別の実施形態において、該癌は、メラノーマ、腎臓細胞癌、扁平上皮非小細胞癌(ＮＳＣＬＣ)、非扁平上皮ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、性腺摘除耐性前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肝細胞癌、膵臓癌、頭頸部の扁平上皮癌、食道、胃腸管および乳房の癌および造血器腫瘍から選択される。

別の実施形態において、本開示は、その必要のある患者における感染症を治療する方法を提供するものであって、前記方法は、治療上有効な量の式(Ｉ)の化合物またはその治療上許容し得る塩を対象に投与することを特徴とする。別の実施形態において、感染症は、ウイルスを原因とする。別の実施形態において、前記ウイルスは、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、B型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルスおよびインフルエンザから選択される。

別の実施形態において、本開示は、その必要がある対象における敗血症ショックの治療方法を提供するものであり、前記方法は、治療上有効な量の本明細書に記載した１以上の大環状ペプチドを投与することを特徴とする。

別の実施形態において、本開示は、対象におけるＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１および／またはＣＤ８０との相互作用を遮断する方法を提供するものであって、前記方法は、治療上有効な量の本明細書に記載の少なくとも１つの大環状ペプチドを対象に投与することを特徴とする。

式(Ｉ)の化合物において、式中のＲ側鎖は、メチルで置換されている環の一部であって、前記メチル基は、大環状親構造の一部である炭素を含めた環内の置換可能なあらゆる炭素原子上に存在していてもよいと理解される。本開示の化合物において、水素以外の４つの置換基を有しており、かつ式(ＩＩ)：

(式中、Ａは、特許請求の範囲に記載したような環であって、かつ

は、大環状構造の残余基との結合点を示す)
のα−メチル置換された環ではない環の骨格上に少なくとも１つの炭素が存在する。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^１側鎖は、次の通りである：フェニルアラニン、チロシン、３−チエン−２−イル、４−メチルフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、３−メトキシフェニルアラニン、イソトリプトファン、３−メチルフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、３,４−ジフルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、３,４−ジメトキシフェニルアラニン、３,４−ジクロロフェニルアラニン、４−ジフルオロメチルフェニルアラニン、２−メチルフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、トリプトファン、４−ピリジニル、４−ブロモフェニルアラニン、３−ピリジニル、４−トリフルオロメチルフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、４−メトキシフェニルアラニン、ビフェニルアラニンおよび３−クロロフェニルアラニン；および２,４−ジアミノブタンである。

式(Ｉ)の化合物において、式中のＲ^２が環の一部ではない場合、好ましいＲ²側鎖は次の通りである：アラニン、セリンおよびグリシン。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^３側鎖は次の通りである：アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、セリン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、スレオニン、ロイシン、アラニン、２,３−ジアミノプロパンおよび２,４−ジアミノブタン。

式(Ｉ)の化合物において、式中のＲ^４は環の一部ではない、好ましいＲ⁴側鎖は次の通りである：バリン、アラニン、イソロイシンおよびグリシン。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^５側鎖は次の通りである：アミノメタン、ヒスチジン、アスパラギン、２,３−ジアミノプロパン、セリン、グリシン、２,４−ジアミノブタン、スレオニン、アラニン、リシン、アスパラギン酸、アラニンおよび３−チアゾリルアラニン。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^６側鎖は次の通りである：ロイシン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、リシン、３−シクロヘキサン、スレオニン、オルニチン、２,４−ジアミノブタン、アラニン、アルギニンおよびオルニチン(ＣＯＣＨ_３)。

式(Ｉ)の化合物において、式中のＲ^７が環の一部ではない場合、好ましいＲ⁷側鎖は次の通りである：グリシン、２,４−ジアミノブタン、セリン、リシン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、アラニンおよび２,４−ジアミノブタン(Ｃ(Ｏ)シクロブタン)。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^８側鎖は、トリプトファンおよび１,２−ベンゾイソチアゾリニルアラニンである。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^９側鎖は次の通りである：セリン、ヒスチジン、リシン、オルニチン、２,４−ジブチルアミン、スレオニン、リシン、グリシン、グルタミン酸、バリン、２,３−ジアミノプロパン、アルギニン、アスパラギン酸およびチロシン。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^１０側鎖は次の通りである：所望により置換されていてもよいトリプトファン、ベンゾイソチアゾリルアラニン、１−ナフチル(napththyl)アラニンおよびメチオニン。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^１１側鎖は次の通りである：ノルロイシン、ロイシン、アスパラギン、フェニルアラニン、メチオニン、エトキシメタン、アラニン、トリプトファン、イソロイシン、フェニルプロパン、グルタミン酸、ヘキサンおよびヘプタン。

式(Ｉ)の化合物において、式中のＲ^１２が環の一部ではない場合、好ましいＲ^１２側鎖は次の通りである：ノルロイシン、アラニン、エトキシメタン、メチオニン、セリン、フェニルアラニン、メトキシエタン、ロイシン、トリプトファン、イソロイシン、グルタミン酸、ヘキサン、ヘプタンおよびグリシン。

式(Ｉ)の化合物において、好ましいＲ^１３側鎖は次の通りである：アルギニン、オルニチン、アラニン、２,４−ジアミノブタン、２,３−ジアミノプロパン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、リシン、スレオニン、シクロプロピルメタン、グリシン、バリン、イソロイシン、ヒスチジンおよび２−アミノブタンである。

本開示に従い、我々は、ＰＤ−Ｌ１と特異的に結合して、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用、およびＰＤ−Ｌ１とＣＤ８０との相互作用を阻害できるペプチドを発見した。これらの大環状ペプチドは、インビトロ免疫調節効力を示し、癌および感染症を含む種々の疾患の治療のための治療剤候補となる。

用語“特異的結合”または“特異的な結合”は、タンパク質と、化合物またはリガンドのような結合分子の間の相互作用をいう。相互作用は、結合分子により認識されるタンパク質の特定の構造(すなわち、酵素結合部位、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存する。例えば、化合物がタンパク質結合部位“Ａ”に特異的結合を示すならば、結合部位Ａを含むタンパク質およびタンパク質結合部位Ａに特異的に結合する標識ペプチドを含む反応中のその化合物の存在により、標識ペプチドがタンパク質に結合する量が減少する。対照的に、化合物のタンパク質への非特異的結合は、標識ペプチドのタンパク質からの濃度依存的置換をもたらさない。

本発明は、本化合物に存在する原子の全ての同位体を含むことを意図する。同位体は、同じ原子番号を有するが、質量数が異なる原子を含む。一般的な例として、限定する意図はなく、水素の同位体は重水素およびトリチウムを含む。炭素の同位体は^１３Ｃおよび^１４Ｃを含む。同位体標識した本発明の化合物は、一般に当業者に知られる慣用の技術によるか、または本明細書に記戴するものに順ずる方法により、他に用いた非標識反応材に代えて、適当な同位体標識した反応材を用いることにより製造できる。このような化合物は、例えば標準的および生物学的活性を測定するための試薬として、多様な用途の可能性を有し得る。安定な同位体の場合、このような化合物は、生物学的、薬理学的または薬物動態特性を好ましく修飾する可能性を有し得る。

本明細書に記戴する主題の他の面は、リガンド結合アッセイの開発のための、またはインビボ吸着、代謝、分布、受容体結合または占有または化合物の体内動態のモニタリングのための放射性標識リガンドとして開示したペプチドの使用である。例えば、本明細書に記戴する大環状ペプチドを、放射性同位体^１２５Ｉを使用して製造することができ、得られる放射性標識ペプチドを結合アッセイの開発または代謝試験に使用してよい。別の目的および同じ目的で、本明細書に記戴する大環状ペプチドを、当業者に知られる方法を使用した触媒的トリチウム標識により放射性標識形態に変換し得る。

本発明の大環状ペプチドは、当業者に知られる方法を使用した放射性トレーサーの付加によりＰＥＴ造影剤としても使用できる。

好ましいペプチドは、本明細書において提供する大環状ペプチドの少なくとも１個を含み、これらのペプチドは医薬組成物および組み合わせに包含され得る。

本明細書において提供される定義は、限定しないが、他に具体的な状況で限定がない限り、本明細書を通して使用される通りにその用語に適用される。

アミノ酸およびペプチド化学分野の当業者は、アミノ酸が、次の一般構造により表される化合物が含まれることを認識している。

(式中、ＲおよびＲ'は本明細書に記戴するとおりである)。

別段の記載が無ければ、単独で、または他の基の一部として、本明細書で使用する用語“アミノ酸”は、“α”炭素と呼ばれる同じ炭素に結合したアミノ基およびカルボキシル基を含むが、これらに限定されず、式中、Ｒおよび／またはＲ'は、水素を含めた天然または非天然の側鎖であり得る。“α”炭素における絶対“Ｓ”配置は、一般に“Ｌ”または“天然”配置と呼ばれる。“Ｒ”および“Ｒ'”双方の(主要)置換基が水素であるとき、アミノ酸はグリシンであり、キラルではない。

本明細書で使用する用語“天然のアミノ酸側鎖”および“天然型アミノ酸側鎖”は、通常Ｓ配置(すなわち、Ｌ−アミノ酸)である天然型アミノ酸(すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン)のいずれかの側鎖をいう。

本明細書で使用する用語“非天然のアミノ酸側鎖”および“非天然型アミノ酸側鎖”は、通常Ｒ配置(すなわち、Ｄ−アミノ酸)の天然型アミノ酸のいずれかの側鎖または次のものから選択されるＲまたはＳ配置(すなわち、それぞれＤ−またはＬ−アミノ酸)の天然型アミノ酸側鎖以外の基を意味する：
Ｃ_２−Ｃ_７アルケニル、Ｃ_１−Ｃ_３アルコキシＣ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシカルボニルＣ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_１−Ｃ_７アルキル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルスルファニルＣ_１−Ｃ_３アルキル、アミドＣ_１−Ｃ_３アルキル、アミノＣ_１−Ｃ_３アルキル、アザインドリルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ベンゾチアゾリルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ベンゾチエニルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ベンジルオキシＣ_１−Ｃ_３アルキル、カルボキシＣ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_３−Ｃ_１４シクロアルキルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ジフェニルメチル、フラニルＣ_１−Ｃ_３アルキル、イミダゾリルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ナフチルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ピリジニルＣ_１−Ｃ_３アルキル、チアゾリルＣ_１−Ｃ_３アルキル、チエニルＣ_１−Ｃ_３アルキル；
ビフェニルＣ_１−Ｃ_３アルキル：前記ビフェニルは、メチル基で所望により置換されていてもよい；
ヘテロサイクリル：これは、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノＣ_１−Ｃ_３アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロＣ_１−Ｃ_３アルキル、ヒドロキシ、−ＮＣ(ＮＨ_２)_２、ニトロおよび−ＯＰ(Ｏ)(ＯＨ)_２から独立して選択される１、２、３、４または５つの基で所望により置換されていてもよい;
インドリルＣ_１−Ｃ_３アルキル：前記インドリル部分は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル、カルボキシＣ_１−Ｃ_３アルキル、ハロ、ヒドロキシおよびフェニルから選択される１つの基で所望により置換されていてもよい、ここで前記フェニルは、Ｃ_１−Ｃ_３アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルおよびハロから独立して選択される１、２または３つの基により所望により更に置換されていてもよく；
ＮＲ^ｙＲ^ｙ’(Ｃ_１−Ｃ_７アルキル)、ここでＲ^ｙおよびＲ^ｙ’は、水素、Ｃ_２−Ｃ_４アルケニルオキシカルボニル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルカルボニル、Ｃ_３−Ｃ_１４シクロアルキルカルボニル、フラニルカルボニルおよびフェニルカルボニルから独立して選択される。アルキルリンカーが１以上の炭素を含有する場合、追加のＮＲ^ｙＲ^ｙ’基は、鎖上に存在し得る；
ＮＲ^ｑＲ^ｔカルボニルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ここでＲ^ｑおよびＲ^ｔは、水素、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルおよびトリフェニルメチルから独立して選択される；
フェニル：Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノＣ_１−Ｃ_３アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロＣ_１−Ｃ_３アルキル、ヒドロキシ、−ＮＣ(ＮＨ_２)_２、ニトロおよび−ＯＰ(Ｏ)(ＯＨ)_２から独立して選択される１、２、３、４または５つの基で所望により置換されていてもよく；
ＮＲ^ａ’Ｒ^ｂ’(Ｃ_１−Ｃ_７アルキル)、ここでＲ^ａ’およびＲ^ｂ’は、水素、Ｃ_２−Ｃ_４アルケニルオキシカルボニル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルカルボニル、Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキルカルボニル、フラニルカルボニルおよびフェニルカルボニルから独立して選択される。アルキルリンカーが１以上の炭素を含有する場合、追加のＮＲ^ａ’Ｒ^ｂ’基 は、鎖上に存在し得る；
ＮＲ^ｃ’Ｒ^ｄ’カルボニルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ここでＲ^ｃ’およびＲ^ｄ’は、水素、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルおよびトリフェニルメチルから独立して選択される；
フェニルＣ_１−Ｃ_３アルキル、ここで前記フェニル部分は、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルスルホニルアミノ、アミド、アミノ、アミノＣ_１−Ｃ_３アルキル、アミノスルホニル、カルボキシ、シアノ、ハロ、ハロＣ_１−Ｃ_３アルキル、ヒドロキシ、−ＮＣ(ＮＨ_２)_２、ニトロおよび−ＯＰ(Ｏ)(ＯＨ)_２から独立して選択される１、２、３、４または５つの基で所望により置換されていてもよい；および
フェノキシＣ_１−Ｃ_３アルキル：ここで前記フェニルは、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基で所望により置換されていてもよい。

本明細書で使用する用語“Ｃ_２−Ｃ_４アルケニル”は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む、２〜４個の炭素原子の直鎖または分枝鎖の基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_２−Ｃ_７アルケニル”は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む、２〜７個の炭素原子の直鎖または分枝鎖の基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_２−Ｃ_４アルケニルオキシ”は、酸素原子を介して親分子部分に結合するＣ_２−Ｃ_４アルケニル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_３アルコキシ”は、酸素原子を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_３アルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ”は、酸素原子を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_４アルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ”は、酸素原子を介して親分子部分に結合する、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_３アルコキシＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_３アルコキシ基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシカルボニル”は、カルボニル基を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_６アルコキシ基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシカルボニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_６アルコキシカルボニル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_３アルキル”は、１〜３個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖飽和炭化水素から得られる基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_４アルキル”は、１〜４個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖飽和炭化水素から得られる基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_６アルキル”は、１〜６個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖飽和炭化水素から得られる基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_３アルキルカルボニル”は、カルボニル基を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_３アルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_３アルキルスルファニル”は、硫黄原子を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_３アルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_３アルキルスルファニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_３アルキルスルファニル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_３アルキルスルホニル”は、スルホニル基を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_３アルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_１−Ｃ_３アルキルスルホニルアミノ”は、アミノ基を介して親分子部分に結合するＣ_１−Ｃ_３アルキルスルホニル基をいう。

本明細書で使用する用語“アミド”は、−Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２をいう。

本明細書で使用する用語“アミドＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するアミド基をいう。
本明細書で使用する用語“アミノ”は、−ＮＨ_２をいう。

本明細書で使用する用語“アミノＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するアミノ基をいう。

本明細書で使用する用語“アミノスルホニル”は、スルホニル基を介して親分子部分に結合するアミノ基をいう。

本明細書で使用する用語“アザインドリルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するアザインドリル基をいう。アザインドリル基は、該基の任意の置換可能な原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“ベンゾチアゾリルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するベンゾチアゾリル基をいう。ベンゾチアゾリル基は、該基の任意の置換可能な原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“ベンゾチエニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するベンゾチエニル基をいう。ベンゾチエニル基は、該基の任意の置換可能な原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“ベンジルオキシ”は、酸素原子を介して親分子部分に結合する、ベンジル基をいう。

本明細書で使用する用語“ベンジルオキシＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するベンジルオキシ基をいう。

本明細書で使用する用語“ビフェニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するビフェニル基をいう。ビフェニル基は、前記基の置換可能なあらゆる原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“カルボニル”は、−Ｃ(Ｏ)−をいう。
本明細書で使用する用語“カルボキシ”は、−ＣＯ_２Ｈをいう。

本明細書で使用する用語“カルボキシＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するカルボキシ基をいう。
本明細書で使用する用語“シアノ”は、−ＣＮをいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_３−Ｃ_１４シクロアルキル”は、３〜１４個の炭素原子および０個のヘテロ原子を有する飽和単環式、二環式または三環式の炭化水素環系をさす。二環式および三環式環は、縮合環、スピロ環または架橋環であってもよい。シクロアルキル基の代表的な例には、シクロプロピル、シクロペンチル、ビシクロ[３.１.１]ヘプチルおよびアダマンチルが含まれるが、これに限定するものではない。

本明細書で使用する用語“Ｃ_３−Ｃ_１４シクロアルキルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合されたＣ_３−Ｃ_１４シクロアルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“Ｃ_３−Ｃ_１４シクロアルキルカルボニル”は、カルボニル基を介して親分子部分に結合されたＣ_３−Ｃ_１４シクロアルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“フラニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するフラニル基をいう。フラニル基は、前記基の置換可能なあらゆる原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“フラニルカルボニル”は、カルボニル基を介して親分子部分に結合するフラニル基をいう。

本明細書で使用する用語“ハロ”および“ハロゲン”は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩをいう。

本明細書で使用する用語“ハロＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、１個、２個または３個のハロゲン原子で置換されたＣ_１−Ｃ_３アルキル基をいう。

本明細書で使用する用語“ハロメチル”は、１個、２個または３個のハロゲン原子で置換されたメチル基をいう。

本明細書で使用する用語“複素環”は、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１、２または３つのヘテロ原子を含有する５、６または７員環をいう。５員環は、０〜２つの二重結合を有しており、かつ６員および７員環が、０〜３つの二重結合を有する。用語“複素環”は、二環式基も包含するものであって、前記複素環式環は、４〜６員芳香族性または非芳香族炭素環式環または別の単環式複素環式基と縮合される。本開示の複素環基は、その基内の炭素原子を介して親分子部分に結合している。複素環基の例示には、ベンゾチエニル、フリル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、モルホリニル、オキサゾリル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピロリジニル、ピロロピリジニル、ピロリル、チアゾリル、チエニルおよびチオモルホリニルが挙げられるが、これに限定するものではない。

本明細書で使用する用語“ヒドロキシ”は、−ＯＨをいう。

本明細書で使用する用語“イミダゾリルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するイミダゾリル基をいう。イミダゾリル基は、前記基の置換可能なあらゆる原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“インドリルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するインドリル基をいう。インドリル基は、前記基の置換可能なあらゆる原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“ナフチルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するナフチル基をいう。ナフチル基は、前記基の置換可能なあらゆる原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“ニトロ”は、−ＮＯ_２をいう。

本明細書で使用する用語“ＮＲ^ａ’Ｒ^ｂ’”は、窒素原子を介して親分子部分に結合されている２つの基Ｒ^ａ’およびＲ^ｂ’をいう。Ｒ^ａ’およびＲ^ｂ’は、水素、Ｃ_２−Ｃ_４アルケニルオキシカルボニル、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルカルボニル、Ｃ_３−Ｃ_６シクロアルキルカルボニル、フラニルカルボニルおよびフェニルカルボニルから独立して選択される。

本明細書で使用する用語“ＮＲ^ａ’Ｒ^ｂ’(Ｃ_１−Ｃ_３)アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するＮＲ^ａ’Ｒ^ｂ’基をいう。

本明細書で使用する用語“ＮＲ^ｃ’Ｒ^ｄ’”は、窒素原子を介して親分子部分と結合されている２つの基であるＲ^ｃ’およびＲ^ｄ’をいう。Ｒ^ｃ’およびＲ^ｄ’は、水素、Ｃ_１−Ｃ_３アルキルおよびトリフェニルメチルから独立して選択される。

本明細書で使用する用語“ＮＲ^ｃ’Ｒ^ｄ’カルボニル”は、カルボニル基を介して親分子部分に結合しているＮＲ^ｃ’Ｒ^ｄ’基をいう。

本明細書で使用する用語“ＮＲ^ｃ’Ｒ^ｄ’カルボニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合しているＮＲ^ｃ’Ｒ^ｄ’カルボニル基をいう。

本明細書で使用する用語“フェノキシ”は、酸素原子を介して親分子部分に結合する、フェニル基をいう。

本明細書で使用する用語“フェノキシＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するフェノキシ基をいう。

本明細書で使用する用語“フェニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するフェニル基をいう。

本明細書で使用する用語“フェニルカルボニル”は、カルボニル基を介して親分子部分に結合するフェニル基をいう。

本明細書で使用する用語“ピリジニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合するピリジニル基をいう。ピリジニル基は、前記基のあらゆる置換可能な原子を介してアルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“スルファニル”は、−Ｓ−をいう。

本明細書で使用する用語“スルホニル”は、−ＳＯ_２−をいう。

本明細書で使用する用語“チアゾリルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合しているチアゾリル基をいう。チアゾリル基は、前記基内の置換可能なあらゆる原子を介して、アルキル部分に結合できる。

本明細書で使用する用語“チエニルＣ_１−Ｃ_３アルキル”は、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル基を介して親分子部分に結合する、チエニル基をいう。チエニル基は、前記内の置換可能なあらゆる原子を介してアルキル部分に結合できる。

用語“処置”は、(ｉ)疾患、障害および／または症状の素因があるが、まだそれを有していると診断されていない患者における該疾患、障害または症状の発症を予防すること；(ii)疾患、障害または症状を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること；および(iii)疾患、障害または症状を軽減すること、すなわち、疾患、障害および／または症状および／または疾患、障害および／または症状を伴う症候を回復させることを含む。

大環状ペプチドのＰＤ−Ｌ１への結合は、例えば、均一時間分解蛍光測定(ＨＴＲＦ)、表面プラズモン共鳴法(ＳＰＲ)、等温滴定熱量測定(ＩＴＣ)、核磁気共鳴スペクトロスコピー(ＮＭＲ)などの方法により測定できる。さらに、大環状ペプチドの細胞表面上に発現するＰＤ−Ｌ１への結合は、本明細書に記戴するとおり細胞結合アッセイで測定できる。

本明細書に記戴する治療剤の投与は、治療上有効な量の治療剤の投与を含むが、これに限定されない。本明細書で使用する用語“治療上有効な量”とは、本明細書に記戴するＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合阻害剤の組成物の投与により処置可能な症状を処置または予防するための治療剤の量をいうが、これに限定されない。この量は、検出可能な治療的または予防的または寛解的効果を示すのに十分な量である。効果は、例として、これに限定しないが、本明細書に挙げた症状の処置または予防を含み得る。対象に対する厳密な有効量は、対象の体格および健康症状、処置すべき状態の性質および程度、処置医の推奨および投与のために選択した治療剤または治療剤の組み合わせによる。それゆえに、正確な有効量を前もって特定するのは有用ではない。

別の局面において、本発明は、本発明の大環状ペプチドを使用する対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法にも関する。本明細書に示されるとおり、本発明の大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１と結合すること、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用を妨害すること、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用を阻止することが知られる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体との結合と競合すること、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌を増強させること、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌を増強することができる。その結果、本発明の大環状ペプチドは、免疫応答の修飾、癌または感染性疾患のような疾患の処置、保護的自己免疫応答の刺激または抗原特異的免疫応答の刺激(例えば、ＰＤ−Ｌ１遮断ペプチドと目的の抗原の共投与による)に有用である。

本発明がより容易に理解され得るために、ある用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な記戴をとおして示される。

用語“プログラム死リガンド１”、“プログラム細胞死リガンド１”、“タンパク質ＰＤ−Ｌ１”、“ＰＤ−Ｌ１”、“ＰＤＬ１”、“ＰＤＣＤＬ１”、“ｈＰＤ−Ｌ１”、“ｈＰＤ−ＬＩ”、“ＣＤ２７４”および“Ｂ７−Ｈ１”は、相互交換可能的に使用し、ＰＤ−Ｌ１と少なくとも１個の共通するエピトープを有する異型、アイソフォーム、ヒトＰＤ−Ｌ１の種ホモログおよびアナログを含む。完全ＰＤ−Ｌ１配列は、GENBANK(登録商標)Accession No. NP_054862に見ることができる。

用語“プログラム死１”、“プログラム細胞死１”、“タンパク質ＰＤ−１”、“ＰＤ−１”、“ＰＤ１”、“ＰＤＣＤ１”、“ｈＰＤ−１”および“ｈＰＤ−Ｉ”は、相互交換可能に使用し、ＰＤ−１と少なくとも１個の共通するエピトープを有する異型、アイソフォーム、ヒトＰＤ−１の種ホモログおよびアナログを含む。完全ＰＤ−１配列は、
GENBANK(登録商標)Accession No. U64863として存在し得る。

用語“細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原−４”、“ＣＴＬＡ−４”、“ＣＴＬＡ４”、“ＣＴＬＡ−４抗原”および“ＣＤ１５２”(例えば、Murata, Am. J. Pathol., 155：453−460(1999)参照)は、相互交換可能なように使用され、ＣＴＬＡ−４と少なくとも１個の共通するエピトープを有する異型、アイソフォーム、ヒトＣＴＬＡ−４の種ホモログおよびアナログを含む(例えば、Balzano, Int. J. Cancer Suppl., 7：28−32(1992)参照)。完全ＣＴＬＡ−４核酸配列はGENBANK(登録商標)Accession No. L15006に見ることができる。

用語“免疫応答”は、例えば、侵入した病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌細胞の、あるいは自己免疫的または病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞または組織の選択的損傷、破壊または体内からの除去をもたらすリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および上記細胞または肝臓で産生される可溶性巨大分子(例えば、大環状ペプチド、サイトカインおよび補体)の作用をいう。

本明細書で使用する“有害事象”(ＡＥ)は、医学的処置の使用に関係し、いずれも好ましくなく、一般に意図されない、さらに望ましくない、徴候(検査所見の異常を含む)、症状または疾患である。例えば、有害事象は、処置に応答した免疫系の活性化または免疫系細胞(例えば、Ｔ細胞)の増大と関係し得る。医学的処置は、一つ以上のＡＥと関連していてもよく、また各ＡＥの重症度は同一でも異なっていてもよい。“有害事象を変える”ことができる方法なる言及は、異なる処置レジメンの使用と関係する、１つ以上のＡＥの発生率および／または重症度を減少する処置レジメンを意味する。

本明細書で使用する“過増殖性疾患”は、細胞増殖が正常レベルを超えて増加した状態をいう。例えば、過増殖性疾患または障害は、悪性疾患(例えば、食道癌、結腸癌、胆道癌)および非悪性疾患(例えば、アテローム性動脈硬化症、良性過形成および良性前立腺肥大)を含む。

本明細書で使用する“約”または“を本質的に含む”なる用語は、当業者により測定される特定の値に対する許容される誤差範囲内を意味するもので、いかにして値を測定または決定したかに幾分依存する、すなわち、測定系の限度に依存する。例えば、“約”または“を本質的に含む”は、当分野の経験に従い、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、“約”または“を本質的に含む”は、２０％までの範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的系または過程に関して、本用語は１桁までの振幅または５倍までの値を意味し得る。特定の値を本明細書および特許請求の範囲に記戴するとき、別段の記載が無ければ、その特定の値についての許容される誤差範囲内であるとして、“約”または“を本質的に含む”の意味を考慮すべきである。

本明細書に記戴する、あらゆる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲または整数範囲は、別段の記載が無ければ、列挙した範囲内のあらゆる整数の値と、適当な場合には、その分数(例えば整数の１／１０および１／１００)を含むと理解すべきである。

競合アッセイ
本発明はまた、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％および少なくとも約１００％まで、参照抗ＰＤ−Ｌ１抗体(ＭＤＸ−１１０５)の結合と競合できる大環状ペプチドに関する。このような大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１と特異的に結合する限り、変異体、保存的置換、機能的置換および欠失形態を含む１個以上の本明細書に開示する大環状ペプチドと構造相同性を共有し得る。例えば、大環状ペプチドがＰＤ−Ｌ１の参照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同じ領域に実質的に結合するならば、大環状ペプチドは、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体が結合するＰＤ−Ｌ１エピトープと少なくとも部分的に一致(重複)するＰＤ−Ｌ１のエピトープと結合するはずである。重複領域は、アミノ酸残基から数百アミノ酸残基の範囲であり得る。そうであれば、大環状ペプチドは、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のＰＤ−Ｌ１への結合と競合および／または遮断し、それにより抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のＰＤ−Ｌ１への結合を、競合アッセイにおいて好ましくは少なくとも約５０％減少させるはずである。

競合アッセイのための参照抗体として使用し得る抗ＰＤ−Ｌ１抗体は当分野で知られている。例えば、次の代表的抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用し得る：ＭＤＸ−１１０５(BMS); Ｌ０１Ｘ−Ｃ(Serono)、Ｌ１Ｘ３(Serono)、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ(Serono)およびＰＤ−Ｌ１ Ｐｒｏｂｏｄｙ(CytomX)および共用ＷＯ２００７／００５８７４に開示のＰＤ−Ｌ１抗体。

競合アッセイのための参照抗体として使用し得る抗ＰＤ−１抗体は当分野で知られる。例えば、次の代表的な抗ＰＤ−１抗体を使用し得る：ニボルマブ(BMS)；各々共用米国特許番号８,００８,４４９(BMS)に開示する１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４、ＭＫ−３４７５(Merck、米国特許番号８,１６８,７５７に開示)および米国特許番号７,４８８,８０２に開示の抗体。

医薬組成物
別の局面において、本発明は、本発明の大環状ペプチドを１個または組み合わせて含み、医薬的に許容される担体と共に製剤された組成物、例えば、医薬組成物を提供する。このような組成物は、本発明の１個または複数の(２以上の異なる)大環状ペプチドまたは免疫コンジュゲートまたは二重特異性分子を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する大環状ペプチド(または免疫コンジュゲートまたは二重特異性物質)の組み合わせを含み得る。

本発明の医薬組成物は、治療と組み合わせて、すなわち、他剤と組み合わせても投与し得る。例えば、組み合わせ治療は、少なくとも１種の他の抗炎症剤または免疫抑制剤と組み合わせた大環状ペプチドを含み得る。組み合わせ治療で使用できる治療剤の例は、本発明の大環状ペプチドの使用についての章にさらに詳述する。

本明細書で使用する“医薬的に許容される担体”は、生理学的に適合性である任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与に適する(例えば、注射または点滴による)。投与経路によって、活性化合物、すなわち、大環状ペプチド、免疫コンジュゲートまたは二重特異性分子を、化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護するための物質でコーティングし得る。

本発明の医薬化合物は、１個以上の医薬的に許容される塩を含み得る。“医薬的に許容される塩”または“治療上許容される塩”は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まない中毒学的効果に関与しない塩をいう(例えば、Berge, S.M. et al., J. Pharm. Sci., 66：1−19(1977)参照)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、非毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸など、ならびに非毒性有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸など由来のものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに非毒性有機アミン、例えばＮ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなど由来のものを含む。

本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される抗酸化剤も含み得る。医薬的に許容される抗酸化剤の例は、(１)水可溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；(２)油可溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および(３)金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを含む。

本発明の医薬組成物で用い得る適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびこれらの適当な混合物、植物油、例えばオリーブ油および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散の場合には、必要な粒子径の維持および界面活性剤の使用により維持できる。

これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含み得る。微生物の存在の予防は、上記滅菌工程および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの導入の両者により確実にし得る。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に導入することも望ましい。さらに、注射可能医薬形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を入れることにより達成し得る。

医薬的に許容される担体は、無菌水溶液または分散および無菌注射可能溶液または分散の即時調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当分野では知られている。何らかの慣用の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合でない限り、本発明の医薬組成物におけるその使用が意図される。補足の活性化合物も組成物に包含させ得る。

治療的組成物は、典型的に無菌であり、製造および保存条件下で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは抗薬物濃度に適する他の整然とした構造として製剤できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびこれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング物質の使用により、分散剤の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持できる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物に添加するのが好ましい。注射可能組成物の長期吸収は、モノステアリン酸塩およびゼラチンのような吸収を遅延させる薬剤を導入することにより達成し得る。

無菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を、上に列挙した成分の１個または組み合わせを有する適当な溶媒に取り込み、必要に応じて、その後殺菌微量濾過することにより製造できる。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本的な分散媒体および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌媒体に取り込むことにより製造できる。無菌注射可能溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、先に無菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分を加えた活性成分の粉末を得る、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。

単回投与量形態を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置対象および特定の投与方法により変わる。単回投与量形態を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療的効果を生じる組成物の量である。一般に、１００パーセントの内で、この量は、医薬的に許容される担体と組み合わせて、活性成分が約０.０１パーセント〜約９９パーセントの範囲であり、好ましくは約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分である。

投与レジメンは、最適な所望の応答(例えば、治療的応答)をもたらすよう調節する。例えば、単回ボーラスを投与するか、数回分割量を経時的に投与するか、または投与量を治療的状況の緊急事態に適応するよう、比例的に減少または増加してもよい。投与の容易性および投与量の均一性のために、投与量単位で非経腸組成物を製剤することが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置対象への単位投与に適する物理的に分離した単位をいい、各単位は、必要な医薬担体と共に、所望の治療的効果を生じるよう計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投与量単位形態の仕様は、(ａ)活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療的効果、および(ｂ)個々の感受性の処置のためのこのような活性化合物の配合の分野において内在する制限により決定されるか、または直接依存する。

大環状ペプチドの投与のために、投与量は、宿主体重あたり約０.０００１〜１００mg／kg、より一般的には０.０１〜５mg／kgの範囲である。例えば、投与量は０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重であるか、または１〜１０mg／kgの範囲である。処置レジメンの例は、１日１回、１日２回、週に２回、週に３回、毎週、２週毎、３週毎、４週毎、月１回、３ヶ月に１回または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。本発明の大環状ペプチドのための好ましい投与レジメンは、静脈内投与による１mg／kg体重または３mg／kg体重を含み、大環状ペプチドは、次の投与スケジュールのいずれか一つを使用して投与される：(ｉ)４週毎に６回投与、その後３ヶ月毎；(ii)３週毎；(iii)３mg／kg体重を１回、その後３週間毎に１mg／kg体重。

ある方法において、異なる結合特異性を有する２個以上の大環状ペプチドを同時に投与し、この場合投与する各化合物の投与量は記戴した範囲内に入る。化合物は、通常複数の機会に投与する。一回投与の間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３ヶ月毎または毎年であり得る。間隔は、患者における標的抗原に対する大環状ペプチドの血中濃度の測定により示されるとおり、不規則でもあり得る。ある方法において、投与量を調節して、約１〜１０００μg／ml、ある方法において約２５〜３００μg／mlの血漿抗体濃度を達成する。

あるいは、大環状ペプチドを、投与頻度の減少が求められる場合には徐放製剤として投与できる。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかにより変わり得る。予防的適用において、長期間にわたり、比較的低投与量を、比較的頻度の少ない間隔で投与する。患者は死ぬまで処置を受けることがある。治療的適用において、相対的に短い間隔での相対的に高投与量が、疾患の進行が減少するか、または終わるまで、好ましくは患者が疾患症状の部分的または完全改善を示すまで、必要な場合がある。その後、患者に予防レジメンで投与することができる。

本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投与量は、患者に対して毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方法について所望の治療的応答を達成するのに有効である活性成分を得るために変更され得る。選択した投与量は、用いる特定の本発明の組成物またはそのエステル、塩またはアミドの活性、投与経路、投与の時間、用いる特定の化合物の排出率、処置期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態および先の病歴および医学分野で周知の同等な因子を含む、多様な薬物動態因子による。

本発明の大環状ペプチドの“治療上有効な用量”は、好ましくは疾患症状の重症度低下、無疾患症状期間の頻度および期間の延長または疾患苦痛による機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍の処置のために、“治療上有効な用量”は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を、非処置対象に対して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、なお好ましくは少なくとも約８０％阻害する。化合物が腫瘍増殖および／またはＨＩＶを阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性またはウイルス有効性の予測である動物モデル系で評価できる。あるいは、組成物のこの特性を、当業者に知られるインビトロ阻止アッセイにより、化合物の阻止能力を試験することにより評価できる。治療用化合物の治療上有効な用量は、対象における腫瘍サイズの縮小、ウイルス負荷の低下、その他諸症状の改善をもたらす。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および選択した特定の組成物または投与経路のような因子により、このような量を決定できる。

他の面において、本発明は、本明細書に記戴する大環状ペプチドおよび別の免疫修飾剤を含む、医薬用キット・オブ・パーツを提供する。キットは、過増殖性疾患(例えば、本明細書に記戴する癌)および／または抗ウイルス疾患の処置における使用のための指示書もさらに含み得る。

本発明の組成物は、当分野で知られる多様な方法の一つ以上を使用して、一つ以上の経路により投与できる。当業者には認識されるとおり、投与経路および／または方法は所望の結果により変わる。本発明の大環状ペプチドのための好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路、例えば注射または点滴を含む。本明細書で使用する用語“非経腸投与”は、経腸および局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。

あるいは、本発明の大環状ペプチドは、非経腸経路より、例えば局所に、上皮または粘膜投与経路により、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的に投与できる。

活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤のような、急速な放出から化合物を保護する担体と製剤できる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性、生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤を製造するための多くの方法が、特許となっており、または一般に当業者に知られている。例えば、Robinson, J.R., ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York(1978)を参照のこと。

治療的組成物を、当分野で知られる医療機器で投与し得る。例えば、好ましい態様において、本発明の治療的組成物を、無針皮下注射器、例えば、米国特許番号５,３９９,１６３、５,３８３,８５１、５,３１２,３３５、５,０６４,４１３、４,９４１,８８０、４,７９０,８２４または４,５９６,５５６に開示されているデバイスで投与できる。本発明に有用な周知のインプラントおよびモジュールは、制御された速度で薬剤を分配するためのインプラント可能微量注入ポンプを開示する米国特許番号４,４８７,６０３；皮膚を介する薬物の投与のための治療的デバイスを開示する米国特許番号４,４８６,１９４；正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許番号４,４４７,２３３；連続薬物送達のための可変流速インプラント可能注入装置を開示する米国特許番号４,４４７,２２４；複数のチャンバー部分を有する浸透性薬物送達系を開示する米国特許番号４,４３９,１９６；および浸透性薬物送達系を開示する米国特許番号４,４７５,１９６を含む。これらの特許は、引用により本明細書に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールは当業者に知られる。

ある態様において、本発明の大環状ペプチドは、インビボでの適切な分布を確実にするために製剤できる。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。本発明の治療的化合物が、ＢＢＢを通過することを確実にするために(必要に応じて)、例えば、リポソームに製剤できる。リポソームの製造方法に関しては、例えば、米国特許番号４,５２２,８１１、５,３７４,５４８および５,３９９,３３１を参照のこと。リポソームは、特異的細胞または臓器へ選択的に輸送される１個以上の部分を含むことができ、それにより標的化薬物送達を増強する(例えば、Ranade, V.V., J. Clin. Pharmacol., 29：685(1989)参照)。標的化部分の例は、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許番号５,４１６,０１６参照)；マンノシド(Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153：1038(1988))；大環状ペプチド(Bloeman, P.G. et al., FEBS Lett., 357：140(1995); Owais, M. et al., Antimicrob. Agents Chemother., 39：180(1995))；界面活性剤タンパク質Ａ受容体(Briscoe et al., Am. J. Physiol., 1233：134(1995))；ｐ１２０(Schreier et al., J. Biol. Chem., 269：9090(1994))を含み、Keinanen, K. et al., FEBS Lett., 346：123(1994); Killion, J.J. et al., Immunomethods 4：273(1994)も参照のこと。

本発明の使用および方法
本発明の大環状ペプチド、組成物および方法は、例えば、ＰＤ−Ｌ１検出またはＰＤ−Ｌ１遮断による免疫応答を含む、多くのインビトロおよびインビボ有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養細胞に、インビトロまたはエクスビボで、またはヒト対象に、例えば、インビボで投与し、様々な状況での免疫を増強する。したがって、一つの面において、本発明は、本発明の大環状ペプチドを、対象における免疫応答が修飾されるように対象に投与することを特徴とする、対象における免疫応答を修飾する方法を提供する。好ましくは、応答は、増強、刺激または上方制御される。他の点では、大環状ペプチドは、抗カニクイザル、抗マウスおよび／または抗マーモット(woodchuck)結合活性および治療活性を有し得る。

本明細書で使用する用語“対象”は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、マーモット、両生類および爬虫類を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシおよびウマのような哺乳動物が好ましい。好ましい対象は、免疫応答の増強が必要であるヒト患者を含む。本方法は特にＴ細胞仲介免疫応答の増強により処置できる障害を有するヒト患者の処置に特に適する。具体的態様において、本方法は、特にインビボでの癌細胞の処置に適する。免疫の抗原特異的増強を達成するために、大環状ペプチドを目的の抗原と共に投与できる。ＰＤ−Ｌ１に対する大環状ペプチドを他の薬剤と共に投与するとき、２剤をいずれの順序で投与しても、同時に投与してもよい。

本発明は、さらに、サンプルおよび対照サンプルと、ヒト、マーモット、カニクイザルおよび／またはマウスＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する参照大環状ペプチドを、大環状ペプチドと、ヒト、マーモット、カニクイザルおよび／またはマウスＰＤ−Ｌ１の複合体を形成させる条件下で接触させることを含む、サンプルにおけるヒト、マーモット、カニクイザルおよび／またはマウスＰＤ−Ｌ１抗原の存在を検出するか、あるいはヒト、マーモット、カニクイザルおよび／またはマウスＰＤ−Ｌ１抗原の量を測定する方法を提供する。複合体の形成を、その後測定するが、ここで対照サンプルと比較して異なるサンプルの複合体形成は、サンプルにおけるヒト、マーモット、カニクイザルおよび／またはマウスＰＤ−Ｌ１抗原の指標である。

ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ−４と比較した本発明の大環状ペプチドのＰＤ−Ｌ１への特異的結合を考慮すると、本発明の大環状ペプチドは、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１発現の特異的検出に使用でき、さらに免疫親和性精製によるＰＤ−Ｌ１の精製に使用できる。

癌
大環状ペプチドによるＰＤ−１の遮断は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強できる。ＰＤ−１に対するリガンドであるＰＤ−Ｌ１は、正常なヒトの細胞では発現されないが、多様なヒトの癌において多く存在する(Dong et al., Nat. Med., 8：787−789(2002))。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用は、腫瘍浸潤性リンパ球減少、Ｔ細胞受容体仲介増殖減少および癌細胞の免疫回避をもたらす(Dong et al., J. Mol. Med., 81：281−287(2003); Blank et al., Cancer Immunol. Immunother., 54：307−314(2005); Konishi et al., Clin. Cancer Res., 10：5094−5100(2004))。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転され得て、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用が同様に遮断されたとき、この効果は相加的である(Iwai et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99：12293−12297(2002); Brown et al., J. Immunol., 170：1257−1266(2003))。先の研究では、Ｔ細胞増殖が、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への相互作用の阻害により回復できることが示されているが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断によるインビボ癌腫瘍増殖に対する直接の効果についての報告はない。一つの面において、本発明は、癌性腫瘍の増殖が阻害されるように大環状ペプチドを使用するインビボでの対象の処置に関する。大環状ペプチドを、癌性腫瘍増殖阻害のために単独で使用してもよい。あるいは、大環状ペプチドを、下に記戴するとおり、他の免疫原性剤、標準的癌処置または他の大環状ペプチドと組み合わせて使用してもよい。

したがって、一つの態様において、本発明は、対象に治療上有効な量の大環状ペプチドを投与することを特徴とする、対象における腫瘍細胞増殖の阻害方法を提供する。

本発明の大環状ペプチドを使用して癌の増殖を阻害し得る好ましい癌は、典型的には免疫治療に応答性の癌を含む。処置のための好ましい癌の非限定的例は、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫)、腎細胞癌(例えば、明細胞癌)、前立腺癌(例えば、ホルモン難治性前立腺腺癌および去勢抵抗性前立腺癌)、乳癌、結腸直腸癌および肺癌(例えば、扁平上皮および非扁平上皮非小細胞性肺癌)を含む。さらに、本発明は、本発明の大環状ペプチドを使用して増殖を阻害し得る難治性または反復性悪性腫瘍を含む。

本発明の方法を使用して処置し得る他の癌の例は、骨の癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門部の癌、胃／胃体癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣の癌、外陰の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性または急性白血病、例えば急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病および慢性リンパ球性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)の新生物、一次ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発される疾患を含めた環境誘発性の癌および該癌の組み合わせを含む。本発明は、転移癌、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移癌の処置にも有用である(Iwai et al., Int. Immunol., 17：133−144(2005))。

所望により、ＰＤ−Ｌ１に対して大環状ペプチドを、免疫原性剤、例えば、癌細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞と組み合わせて投与し得る(He et al., J. Immunol., 173：4919−4928(2004))。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、黒色腫抗原のペプチド、例えばｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞(さらに下に開示)を含む。

ヒトにおいて、黒色腫のような幾つかの腫瘍は、免疫原性であることが示されている。ＰＤ−Ｌ１の遮断によりＴ細胞活性化の閾値を上げることにより、宿主における腫瘍応答が期待できると仮説が立てられる。

ＰＤ−Ｌ１の遮断は、ワクチン接種プロトコルと組み合わせたとき、最も有効である可能性がある。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring：60−62(2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring：300−302(2000);Khayat, D., ASCO Educational Book Spring：414−428(2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring：730−738(2000);see also Restifo, N. et al., Cancer Vaccines, Chapter 61, pp. 3023−3043, in DeVita, V. et al., eds., Cancer：Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition(1997)参照)。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して製造される。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入されたとき、最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクティベーターであることが示されている(Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：3539−3543(1993))。

種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義が導かれている(Rosenberg, S.A., Immunity, 10：281−287(1999))。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が生じた細胞に発現される分化抗原、例えばメラニン形成細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。更に重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であり得ることが示されている。ＰＤ−Ｌ１遮断を、これらのタンパク質に対する免疫応答を発生させるために、腫瘍において発現されている組み換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと共に使用し得る。これらのタンパク質は、通常自己抗原として免疫系により監視され、それゆえに、それらに耐容性である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要であるタンパク質テロメラーゼも含んでもよく、テロメラーゼはヒトの癌では８５％を超えて発現されており、体性組織ではわずかな限られた数である(Kim, N. et al., Science, 266：2011−2013(1994))(これらの体性組織は、種々の手段により免疫攻撃から保護され得る)。腫瘍抗原は、タンパク質の配列を変異させるか、または２個の非関連配列の融合タンパク質を創製する(すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ)、体性変異のために癌細胞で発現される“新抗原”であるか、あるいはＢ細胞腫瘍由来のイディオタイプであってもよい。

他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒトの癌と関係するウイルスからのタンパク質を含み得る。ＰＤ−Ｌ１遮断と共に使用し得る腫瘍特異的抗原の他の形態は、腫瘍組織それ自体から単離した精製熱ショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質フラグメントを含んでおり、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を賦活させるための抗原提示細胞への送達効率が高い(Suot et al., Science, 269：1585−1588(1995); Tamura et al., Science, 278：117−120(1997))。

樹状細胞(ＤＣ)は、主要抗原特異的応答に使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、エクスビボで産生でき、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を積載できる(Nestle, F. et al., Nat. Med., 4：328−332(1998))。ＤＣは、これらの腫瘍抗原を同様に発現するために遺伝的手段によっても形質導入され得る。ＤＣは、免疫化を目的として、腫瘍細胞と直接融合されてもいる(Kugler, A. et al., Nat. Med., 6：332−336(2000))。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化は、より強力な抗腫瘍応答を活性化するために、ＰＤ−Ｌ１遮断と効果的に組み合わせ得る。

ＰＤ−Ｌ１の遮断は、標準的癌処置とも組み合わせてもよい。ＰＤ−Ｌ１の遮断は、化学療法レジメと効果的に組み合わせ得る。これらの場合、投与する化学療法剤の量を減らすことが可能であり得る(Mokyr, M. et al., Cancer Res., 58：5301−5304(1998))。このような組み合わせの例は、黒色腫の処置のためのダカルバジンと大環状ペプチドとの組み合わせである。このような組み合わせの他の例は、黒色腫の処置のためのインターロイキン−２(ＩＬ−２)と大環状ペプチドとの組み合わせである。ＰＤ−Ｌ１遮断および化学療法を組み合わせて使用する背景にある科学的原理は、殆どの化学療法化合物の細胞毒性活性の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルを増加させるためである。細胞死によるＰＤ−Ｌ１遮断と相乗作用し得る他の組み合わせ治療には、放射線、手術およびホルモン欠乏がある。これらのプロトコルのいずれも、宿主における腫瘍抗原の供給源を創製する。血管形成阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせてもよい。血管形成の阻害により、宿主抗原提示経路中に腫瘍抗原を供給し得る腫瘍細胞死をもたらす。

ＰＤ−Ｌ１遮断大環状ペプチドは、ＦｃアルファまたはＦｃガンマ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞への標的とする二重特異性大環状ペプチドと組み合わせても使用できる(例えば、米国特許番号５,９２２,８４５および５,８３７,２４３を参照)。二重特異性大環状ペプチドを使用して、２つの別々の抗原を標的とし得る。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二重特異性大環状ペプチドは、マクロファージを腫瘍の部位に標的化させるのに使用されている。このターゲティングは、腫瘍特異的応答をさらに効果的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、ＰＤ−Ｌ１遮断物質の使用により増強される。あるいは、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性大環状ペプチドの使用により、ＤＣに直接送達させ得る。

腫瘍は、多種多様な機構により宿主免疫監視を逃れる。これらの機構の多くは、腫瘍により発現され、かつ免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、特にＴＧＦ−ベータ(Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163：1037−1050(1986))、ＩＬ−１０(Howard, M. et al., Immunology Today, 13：198−200(1992))およびＦａｓリガンド(Hahne, M. et al., Science, 274：1363−1365(1996))を含む。これらの各々に対する大環状ペプチドを、抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせて使用して、免疫抑制性因子の効果を抑制して、宿主による腫瘍免疫応答を促進できる。

宿主免疫応答性を活性化するために使用し得る他の大環状ペプチドを、抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０大環状ペプチドは、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代理でき(Ridge, J. et al., Nature, 393：474−478(1998))、ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用できる(Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5)：527−540(2000))。ＣＴＬＡ−４(例えば、米国特許番号５,８１１,０９７)、ＯＸ−４０(Weinberg, A. et al., Immunol., 164：2160−2169(2000))、４−１ＢＢ(Melero, I. et al., Nat. Med., 3：682−685(1997)およびＩＣＯＳ(Hutloff, A. et al., Nature, 397：262−266(1999))のようなＴ細胞同時刺激分子に対する大環状ペプチドの活性化は、Ｔ細胞活性化のレベル増加のためにも提供され得る。

骨髄移植は、造血起源の多様な腫瘍の処置のために現在使用されている。移植片対宿主病は、この処置の結果ではあるが、治療的利点を、移植片対腫瘍応答から得ることができる。ＰＤ−Ｌ１遮断は、ドナー生着腫瘍特異的Ｔ細胞の効果を増加させるために使用できる。

抗原特異的Ｔ細胞を腫瘍に向けさせるために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化および増大ならびにレシピエントへのこれらの細胞の養子移植を含めたいくつかの実験的治療プロトコルがある(Greenberg, R. et al., Science, 285：546−551(1999))。これらの方法は、ＣＭＶのような感染因子に対するＴ細胞応答の活性化にも使用し得る。大環状ペプチド存在下のエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度および活性を高めることが期待され得る。

感染症
本発明の他の方法は、特定の毒素または病原体に曝されている患者の処置に使用される。したがって、本発明の他の面は、対象の感染性疾患が処置されるように、対象に本発明の大環状ペプチドを投与することを特徴とする、対象における感染性疾患の処置方法を提供する。

上記した腫瘍への適用と同様にして、ＰＤ−Ｌ１遮断を、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、単独で、またはアジュバントとしてワクチンと組み合わせて使用できる。この治療手段が特に有用であり得る病原体の例には、現在有効なワクチンがない病原体または慣用のワクチンが完全に効果的とはいえない病原体が挙げられる。これらは、ＨＩＶ、肝炎(Ａ型、Ｂ型およびＣ型)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア(Butler, N.S. et al., Nature Immunology, 13：188−195(2012); Hafalla, J.C.R., et al., PLOS Pathogens(February 2, 2012))、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＰＤ−Ｌ１遮断は、感染中に変化した抗原を提示する、ＨＩＶのような因子による確立された感染に対して特に有効である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＰＤ−Ｌ１投与の投与時に外来物として認識され、それゆえＰＤ−Ｌ１を介する負のシグナルにより削がれない強いＴ細胞応答を誘起する。

本発明の方法により処置可能な感染の原因となる病原性ウイルスのいくつかの例は、ＨＩＶ、肝炎(Ａ、ＢまたはＣ)、ヘルペスウイルス(例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルスを含む。

本発明の方法により処置可能な感染の原因となる病原性細菌のいくつかの例は、クラミジア、リケッチア性細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、テタヌス、ボツリヌス、炭疽、ペスト、レプトスピラ症およびライム病細菌を含む。

本発明の方法により処置可能な感染の原因となる病原性真菌の例は、カンジダ属(アルビカンズ、クルゼイ、グラブラタ、トロピカリシスなど)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、アスペルギルス属(フミガーツス、ニガーなど)、ケカビ目(無コール属、アブシディア属、クモノスカビ属)、スポロトリックス・シェンキイ、ブラストミセス・デルマチチジス、南アメリカ分芽菌、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムを含む。

本発明の方法により処置可能な感染の原因となる病原性寄生虫の例は、赤痢アメーバ、大腸バランチジウム、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ属、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム属、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、ブルセイトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、トキソプラズマ原虫およびブラジル鉤虫を含む。

上記方法の全てにおいて、ＰＤ−Ｌ１遮断を、腫瘍抗原の強化された提示を提供するサイトカイン処置(例えば、インターフェロン、ＶＥＧＦ活性またはＶＥＧＦ−受容体を標的とする薬剤、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２) のような免疫治療または二重特異性抗体治療の他の形態と組み合わせ得る(例えば、Holliger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：6444−6448(1993);Poljak, Structure, 2：1121−1123(1994)参照)。

自己免疫性反応
大環状ペプチドは自己免疫応答を誘発および増幅する。実際、腫瘍細胞およびペプチドワクチンを使用した抗腫瘍応答の誘発は、多くの抗腫瘍応答が抗自己反応性を含むことを示す(van Elsas et al., supraにおける抗ＣＴＬＡ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ修飾Ｂ１６黒色腫で観察される色素脱失；Ｔｒｐ−２ワクチン接種マウスにおける色素脱失(Overwijk, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96：2982−2987(1999))；ＴＲＡＭＰ腫瘍細胞ワクチンにより誘発される自己免疫性前立腺炎(Hurwitz, A., supra(2000))、ヒト臨床試験において見られる黒色腫ペプチド抗原ワクチン接種および白斑症(Rosenberg, S.A. et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19(1)：81−84(1996))。

それゆえに、疾患処置のために、種々の自己タンパク質を、これらの自己タンパク質に対する免疫応答を効果的に生じさせるためのワクチン接種プロトコルを考案するために、抗ＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせて使用することを検討することが可能である。例えば、アルツハイマー病は、脳内のアミロイド沈着物へのＡβペプチドの不適切な蓄積が原因であり、アミロイドに対する抗体応答は、これらのアミロイド沈着物を排除できる(Schenk et al., Nature, 400：173−177(1999))。

他の自己タンパク質は、アレルギーおよび喘息の処置のためのＩｇＥおよびリウマチ性関節炎のためのＴＮＦアルファのように標的としても使用し得る。つまり、種々のホルモンに対する抗体応答は、本明細書に開示する大環状分子の使用により誘発され得る。生殖性ホルモンの中和抗体応答を避妊のために使用し得る。ホルモンおよび特定の腫瘍の増殖に必要である他の可溶性因子に対する中和抗体応答は、可能性のあるワクチン接種標的としても検討し得る。

抗ＰＤ−Ｌ１大環状分子の使用について上記したものと類似する方法を、アルツハイマー病におけるＡβを含むアミロイド沈着物、ＴＮＦアルファおよびＩｇＥのようなサイトカインのような他の自己抗原の不適切な沈着を有する患者の治療的自己免疫応答誘発のために使用できる。

ワクチン
大環状ペプチドを、抗ＰＤ−１大環状分子と目的の抗原(例えば、ワクチン)の共投与により抗原特異的免疫応答を刺激するために使用し得る。従って、他の面において、本発明は、対象における抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象に(ｉ)抗原；および(ii)対象における抗原に対する免疫応答が増強されるような抗ＰＤ−１大環状分子を投与することを特徴とする方法が提供される。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原または病原体からの抗原であり得る。このような抗原の非限定的例は、上記の腫瘍抗原(または腫瘍ワクチン)または上記のウイルス、細菌または他の病原体からの抗原を含む。

インビボおよびインビトロで本発明の組成物(例えば、大環状ペプチド、多重特異性および二重特異性分子およびイムノコンジュゲート)を投与するための適切な経路は、当分野で周知であり、当業者が選択できる。例えば、組成物は注射(例えば、静脈内または皮下)により投与できる。使用する分子の適切な投与量は、対象の年齢および体重および組成物の濃度および／または製剤に依拠する。

先に記戴するとおり本発明の大環状ペプチドを１種以上の他の治療剤、例えば、細胞毒性剤、放射性毒性薬物または免疫抑制剤と共投与し得る。ペプチドは、薬剤に連結して投与され得るか(免疫複合体として)、または薬剤と別々に投与され得る。後者の場合(別々に投与する場合)、ペプチドを他の既知治療、例えば、抗癌治療、例えば、放射線の前に、後にまたは同時に投与してもよく、または共投与してよい。このような治療剤は、とりわけ、抗新生物剤、例えばドキソルビシン(アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、ダカルバジンおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素などを含み、これらは、それら自体、患者に毒性であるか、または準毒性である濃度でしか有効ではない。シスプラチンは、４週毎に１００mg／投与で静脈内投与し、アドリアマイシンは２１日毎に６０〜７５mg／ml投与量で静脈内投与する。本発明の大環状ペプチドと化学療法剤の共投与は、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を生じる異なる作用機序で働く２種の抗癌剤を提供する。このような共投与は、ペプチドに対して非反応性とし得る薬剤に対する耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性の変化による問題を解決し得る。

また本発明の範囲内に包含されるのは、本発明の組成物(例えば、大環状ペプチド、二重特異性または多重特異性分子または免疫コンジュゲート)および使用のための指示書を含むキットである。キットは、さらに少なくとも１種のさらなる薬または１以上のさらなる本発明の大環状ペプチド(例えば、大環状分子と異なるＰＤ−Ｌ１抗原におけるエピトープと結合する相補的活性を有するヒト抗体)を含み得る。キットは、キットの中身の意図される使用を示すラベルを一般的には含む。ラベルなる用語は、キット上にまたはキットと共に提供されるか、または他の方法でキットに付属するあらゆる書面または記録媒体を含む。

組み合わせ治療
本発明の大環状ペプチドと他のＰＤ−Ｌ１アンタゴニストおよび／または別の免疫修飾剤の組み合わせは、過増殖性疾患に対する免疫応答の増強に有用である。例えば、これらの分子を、インビトロまたはエクスビボで培養中の細胞またはヒト対象に、例えばインビボで投与して、多様な状況における免疫を増強する。したがって、一つの面において、本発明は、本発明の大環状ペプチドを、対象における免疫応答が修飾されるように対象に投与することを特徴とする、対象における免疫応答を修飾する方法を提供する。好ましくは、応答は、増強、刺激または上方制御される。他の態様において、本発明は、対象に本発明の大環状ペプチドおよび別の免疫修飾剤の治療以下の投与量を投与することを特徴とする、免疫刺激性治療剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を変える方法を提供する。

大環状ペプチドによるＰＤ−Ｌ１の遮断は、患者における癌細胞に対する免疫応答を増強できる。本発明の大環状ペプチドを使用して増殖を阻害し得る癌は、典型的に免疫治療に応答性の癌を含む。本発明の組み合わせ治療での処置のための癌の代表例は、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫)、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌を含む。本発明の方法で処置し得る他の癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、一次ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発される疾患を含む環境誘発性の癌およびこれらの癌の組み合わせを含む。本発明は転移癌の処置にも有用である。

ある態様において、本明細書に開示する大環状ペプチドの少なくとも１個を含む治療剤の組み合わせを、医薬的に許容される担体中の単一組成物として同時に、または各薬剤を連続的に投与する別々の組成物として一緒に投与し得る。例えば、第二の免疫修飾剤および本発明の大環状ペプチドを、第二の免疫修飾剤を最初に投与し、大環状ペプチドを２番目に投与するか、または大環状ペプチドを最初に投与し、第二の免疫修飾剤を２番目に投与するように、逐次的に投与できる。さらに、１投与量を超える組み合わせ治療を逐次的に投与するならば、逐次投与の順番は各投与時に逆転しても同じ順番でもよく、逐次投与を同時投与またはその任意の組み合わせと組み合わせてもよい。例えば、第二の免疫修飾剤および大環状ペプチドの最初の投与は同時であってよく、２回目の投与は第二の免疫修飾剤が最初で大環状ペプチドが２番目の逐次であってよく、３回目の投与は大環状ペプチドが最初で第二の免疫修飾剤が２回目などであってよい。他の代表的な投与スキームは、大環状ペプチドが最初で第二の免疫修飾剤が２番目である最初の投与を含んでよく、その後の投与は同時であってもよい。

所望により、大環状ペプチドと第二の免疫修飾剤の組み合わせを、さらに免疫原性剤、例えば、癌細胞、精製腫瘍抗原(組み換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む)、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトした細胞と組み合わせて投与し得る(He et al., J. Immunol., 173：4919−4928(2004))。使用できる腫瘍ワクチンの非限定的例は、黒色腫抗原のペプチド、例えばｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１および／またはチロシナーゼのペプチドまたはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞(さらに下に開示)を含む。

組み合わせたＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドと第二の免疫修飾剤は、さらにワクチン接種プロトコルと組み合わせ得る。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている(Rosenberg, S., Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring：60−62(2000); Logothetis, C., ASCO Educational Book Spring：300−302(2000); Khayat, D., ASCO Educational Book Spring：414−428(2000); Foon, K., ASCO Educational Book Spring：730−738(2000); see also Restifo et al., Cancer Vaccines, Chapter 61, pp. 3023−3043 in DeVita et al., eds., Cancer：Principles and Practice of Oncology, Fifth Edition(1997)参照)。これらの戦略の一つにおいて、ワクチンを、自己または同種腫瘍細胞を使用して製造する。これらの細胞性ワクチンは、腫瘍細胞がＧＭ−ＣＳＦを発現するように形質導入された時に、最も有効であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提示の強力なアクティベーターであることが示されている(Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：3539−3543(1993))。

種々の腫瘍における遺伝子発現および大規模遺伝子発現パターンの研究により、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義が導かれている(Rosenberg, Immunity, 10：281−287(1999))。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍および腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えばメラニン形成細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原およびＴｒｐ−２である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主に見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であり得ることが示されている。ある態様において、本明細書に記戴する抗体組成物を使用する組み合わせたＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドと第二の免疫修飾剤を、これらのタンパク質に対する免疫応答を誘起させるために、腫瘍において発現されている組み換えタンパク質および／またはペプチドのコレクションと共に使用し得る。これらのタンパク質は、通常自己抗原として免疫系により監視されているため、それらに耐容性である。腫瘍抗原は、染色体のテロメアの合成に必要とされるタンパク質テロメラーゼも含んでいてもよく、これは８５％を超えるヒトの癌で発現され、体性組織ではわずかな限られた数である(Kim et al., Science, 266：2011−2013(1994))(これらの体性組織は、種々の手段により免疫攻撃から保護され得る)。腫瘍抗原は、タンパク質配列を変異させるか、または２個の非関連配列の融合タンパク質を創製する(すなわち、フィラデルフィア染色体におけるｂｃｒ−ａｂｌ)体性変異を理由に癌細胞で発現される“新抗原”であるか、あるいはＢ細胞腫瘍由来のイディオタイプであってもよい。

他の腫瘍ワクチンは、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、肝炎ウイルス(ＨＢＶおよびＨＣＶ)およびカポジヘルペス肉腫ウイルス(ＫＨＳＶ)のようなヒトの癌と関係するウイルスからのタンパク質を含み得る。ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチド遮断と組み合わせて使用し得る腫瘍特異的抗原の他の形態は、腫瘍組織それ自体から単離した精製熱ショックタンパク質(ＨＳＰ)である。これらの熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質フラグメントを含んでおり、これらのＨＳＰは、腫瘍免疫を賦活させために抗原提示細胞への送達効率が高い(Suot et al., Science, 269：1585−1588(1995); Tamura et al., Science, 278：117−120(1997))。

樹状細胞(ＤＣ)は、主要抗原特異的応答に使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣはエクスビボで産生でき、種々のタンパク質およびペプチド抗原ならびに腫瘍細胞抽出物を積載できる(Nestle et al., Nat. Med., 4：328−332(1998))。ＤＣは、これらの腫瘍抗原を、同じように発現するために遺伝的手段によっても形質導入され得る。またＤＣは、免疫化の目的で腫瘍細胞と直接融合されている(Kugler et al., Nat. Med., 6：332−336(2000))。ワクチン接種の方法として、ＤＣ免疫化は、強力な抗腫瘍応答を活性化するために、組み合わせた抗ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドと第二の免疫修飾剤とを効果的に組み合わせ得る。

抗ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドと別の免疫修飾剤の組み合わせは、さらに標準的な癌の治療とも組み合わせ得る。例えば、大環状ペプチドおよび第二の免疫修飾剤の組み合わせは、化学療法レジメンと効果的に組み合わせ得る。これらの場合、大環状ペプチドおよび第二の免疫修飾剤の組み合わせを用いて見られるとおり、本発明の組み合わせと共に投与する他の化学療法剤の量を減らすことが可能であり得る(Mokyr et al., Cancer Res., 58：5301−5304(1998))。このような組み合わせの例は、黒色腫の処置のためにダカルバジンとさらに組み合わせた大環状ペプチドと第二の免疫修飾剤の組み合わせである。他の例は、黒色腫の処置のためにインターロイキン−２(ＩＬ−２)とさらに組み合わせた大環状ペプチドと第二の免疫修飾剤の組み合わせである。ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドおよび別の免疫調節剤と化学療法の組み合わせ使用の背景にある科学的原理は、殆どの化学療法化合物の細胞毒性活性の結果である細胞死が、抗原提示経路における腫瘍抗原のレベルの増加をもたらすことが理由である。細胞死により抗ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドと別の免疫修飾剤との組み合わせが相乗作用をもたらし得る別の組み合わせ治療は、放射線、手術およびホルモン枯渇療法である。これらのプロトコルのいずれも、宿主における腫瘍抗原の供給源を創製する。血管形成阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１と第二の免疫修飾剤の組み合わせと併用されてもよい。血管形成阻害は、宿主抗原提示経路中に腫瘍抗原を供給し得る腫瘍細胞死を生じる。

ＰＤ−Ｌ１と別の免疫修飾剤の組み合わせは、ＦｃアルファまたはＦｃガンマ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞への標的とする二重特異性大環状ペプチドと組み合わせても使用できる(例えば、米国特許番号５,９２２,８４５および５,８３７,２４３参照)。二重特異性大環状ペプチドを使用して、２つの別々の抗原を標的とし得る。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原(例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ)二重特異性大環状ペプチドは、マクロファージを腫瘍の部位に標的化させるのに使用されている。このターゲティングは、腫瘍特異的応答をさらに効果的に活性化し得る。これらの応答のＴ細胞アームは、組み合わせたＰＤ−１と第二の免疫修飾剤の使用により増強される。あるいは、抗原を、腫瘍抗原および樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性大環状ペプチドの使用により、ＤＣに直接送達してもよい。

他の例において、大環状ペプチドと第二の免疫修飾剤の組み合わせを、抗新生物大環状剤、例えばリツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、リンホシド(Lymphocide)(エプラツズマブ)、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)などと組み合わせ得る。例として、理論に縛られることを望まないが、抗癌抗体または毒素とコンジュゲートした抗癌抗体を用いる処置により、第二の免疫修飾剤または大環状ペプチドが介在する免疫応答を増強させる癌細胞死(例えば、腫瘍細胞)へと至り得る。例示的態様において、過増殖性疾患(例えば、癌性腫瘍)の処置は、大環状ペプチドおよび第二の免疫修飾剤と同時または逐次的またはその任意の組み合わせにて組み合わせた抗癌抗体を含み、宿主による抗腫瘍免疫応答を増強し得る。

腫瘍は、多種多様な機構により宿主免疫監視を逃れる。これらの機構の多くは、腫瘍により発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化により克服され得る。これらは、特にＴＧＦ−ベータ(Kehrl, J. et al., J. Exp. Med., 163：1037−1050(1986))、ＩＬ−１０(Howard, M. et al., Immunology Today, 13：198−200(1992))およびＦａｓリガンド(Hahne, M. et al., Science, 274：1363−1365(1996))を含む。別の例において、これらの各々に対する抗体を、大環状ペプチドおよび別の免疫修飾剤とさらに組み合わせて、免疫抑制剤の効果に対抗して、宿主による腫瘍免疫応答を促進することができる。

宿主免疫応答性を活性化するために使用し得る他の薬剤を、本発明の大環状ペプチドとさらに組み合わせて使用できる。これらは、ＤＣ機能および抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子を含む。抗ＣＤ４０大環状ペプチドは、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代理でき(Ridge, J. et al., Nature, 393：474−478(1998))、本発明の大環状ペプチドと併せて、単独で、または抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせて使用できる(Ito, N. et al., Immunobiology, 201(5)：527−540(2000))。ＯＸ−４０(Weinberg, A. et al., Immunol., 164：2160−2169(2000))、４−１ＢＢ(Melero, I. et al., Nat. Med., 3：682−685(1997)およびＩＣＯＳ(Hutloff, A. et al., Nature, 397：262−266(1999))のようなＴ細胞同時刺激分子に対する大環状ペプチドの活性化は、Ｔ細胞活性化のレベル増加のために提供され得る。

骨髄移植は、造血起源の多様な腫瘍の処置のために現在使用されている。移植片対宿主病は、この処置の結果ではあるが、治療的利点を、移植片対腫瘍応答から得ることができる。本発明の大環状ペプチドは、単独で、または別の免疫修飾剤と組み合わせて、ドナー生着腫瘍特異的Ｔ細胞の効果を増加させるために使用できる。

抗原特異的Ｔ細胞を腫瘍に向けさせるために、抗原特異的Ｔ細胞のエクスビボ活性化および増大ならびにこれらの細胞のレシピエントへの養子移植が関与するいくつかの実験的処置プロトコルがある(Greenberg, R. et al., Science, 285：546−551(1999))。これらの方法は、ＣＭＶのような感染因子に対するＴ細胞応答の活性化にも使用し得る。本発明の大環状ペプチド単独または別の免疫調節剤との組み合わせの存在下でのエクスビボ活性化は、養子移入されたＴ細胞の頻度および活性を高めることが期待され得る。

ある態様において、本発明は、対象に本発明の大環状ペプチドを別の免疫調節剤の治療以下の投与量と組み合わせて投与することを特徴とする、免疫刺激剤での過増殖性疾患の処置と関係する有害事象を変更する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することにより、免疫刺激性の治療抗体誘発性大腸炎または下痢の発生率を減少させる方法を提供する。免疫刺激性の治療抗体を受けているあらゆる患者が、このような処置により誘発される大腸炎または下痢のリスクがあるため、この全患者集団が、本発明の方法に従う治療に適する。ステロイド類は炎症性腸疾患(ＩＢＤ)の処置およびＩＢＤの悪化を予防するために投与されているが、ＩＢＤと診断されていない患者におけるＩＢＤの予防(発生率の減少)には使用されていない。非吸収性ステロイド類でさえ、ステロイド類が関与する相当な副作用により、予防的使用が阻まれてきた。

さらなる態様において、本発明の大環状ペプチドは、単独または別の免疫調節剤と組み合わせて、非吸収性ステロイドのいずれかの使用とさらに組み合わせ得る。本明細書において使用する“非吸収性ステロイド”は、肝臓での代謝後のステロイドのバイオアベイラビリティが低い(すなわち、約２０％未満)相当な初回通過代謝を示すグルココルチコイドである。本発明の一つの態様において、非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは局所作用性グルココルチコステロイドであり、経口投与後、主に肝臓により殆ど代謝される。エントコート(登録商標)ＥＣ(Astra−Zeneca)は、回腸および結腸全体への薬物送達を最適化するよう開発されたブデソニドのｐＨおよび時間依存型経口製剤である。エントコート(登録商標)ＥＣは、回腸および／または上行結腸が関与する軽度から中程度のクローン病の処置について米国で承認されている。クローン病処置のためのエントコート(登録商標)ＥＣの通常の経口投与量は６〜９mg／日である。エントコート(登録商標)ＥＣは吸収される前に腸で吸収され、腸粘膜に保持される。腸粘膜標的組織を通過したら、エントコート(登録商標)ＥＣは、肝臓のチトクロムＰ４５０系で、無視できるグルココルチコイド活性を有する代謝物にまで殆ど代謝される。それゆえに、バイオアベイラビリティは低い(約１０％)。ブデソニドの低いバイオアベイラビリティは、初回通過代謝の程度が低い他のグルココルチコイドと比較して治療指数が改善されている。ブデソニドは、その結果全身作用性コルチコステロイドよりも少ない視床下部−下垂体抑制を含み、副作用が少ない。しかしながら、エントコート(登録商標)ＥＣの慢性投与は、副腎皮質ホルモン過剰症および副腎抑制のような全身性グルココルチコイド効果を生じ得る。Physicians' Desk Reference Supplement, 58th Edition, 608−610(2004)を参照されたい。

さらなる態様において、組み合わせたＰＤ−Ｌ１と別の免疫調節剤と非吸収性ステロイドの組み合わせを、さらにサリチレートと組み合わせ得る。サリチレートは、５−ＡＳＡ剤、例えばスルファサラジン(アザルフィジン(登録商標), Pharmacia & Upjohn)；オルサラジン(DIPENTUM(登録商標)、Pharmacia & Upjohn)；バルサラジド(COLAZAL(登録商標) , Salix Pharmaceuticals, Inc.)；およびメサラミン(アサコール(登録商標), Procter & Gamble Pharmaceuticals；ペンタサ(登録商標), Shire US；CANASA(登録商標), Axcan Scandipharm, Inc.；ROWASA(登録商標), Solvay)を含む。

投与量および製剤
適切な式Ｉのペプチドまたはより具体的には本明細書に記戴する大環状ペプチドを、化合物の単独および/または許容される担体との混合物で医薬製剤の形態で糖尿病および他の関連疾患の処置のために患者に投与できる。糖尿病処置の分野における当業者は、このような処置を必要とするヒトを含む哺乳動物への化合物の投与量および投与経路を容易に決定できる。投与経路は、経口、口腔内、直腸、経皮、バッカル、鼻腔内、肺、皮下、筋肉内、皮内、舌下、結腸内、眼内、静脈内または腸管投与を含むが、これらに限定されない。化合物を、認可された調剤実務に基づき、投与経路に従って製剤する(Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, Chapter 1, p.1(1975); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co., Easton, PA(1990))。

本明細書に記戴する医薬的に許容されるペプチド組成物を、錠剤、カプセル剤(この各々は徐放性または持効性製剤を含む)、丸剤、粉末剤、顆粒剤、エリキシル剤、インサイチュゲル剤、マイクロスフェア剤、結晶複合体、リポソーム剤、マイクロエマルジョン剤、チンキ剤、懸濁液剤、シロップ剤、エアロゾルスプレー剤およびエマルジョン剤のような多種の投与形態で投与できる。本明細書に記戴する組成物は、経口、静脈内(ボーラスまたは点滴)、腹腔内、皮下、経皮または筋肉内形態でも投与でき、全て医薬分野で当業者に周知の投与形態を使用する。組成物は単独で投与してよいが、一般に選択した投与経路および標準的薬務に基づき選択した医薬担体と共に投与する。

本明細書に記戴する組成物の投与レジメンは、当然、特定の薬剤の薬力学的特徴およびその投与方法および投与経路；受け手の種、年齢、性別、健康状態、医学的状態および体重；症状の性質および程度；同時処置の種類；処置頻度；投与経路、患者の腎臓および肝臓機能および望む効果により変わる。医師または獣医師は、疾患状態の予防、対抗または進行停止に必要な薬物の有効量を決定し、処方できる。

一般的な指標として、活性成分の１日経口投与量は、目的とする効果のために使用するとき、１日あたり約０.００１〜１０００mg／kg体重、好ましくは約０.０１〜１００mg／kg体重、最も好ましくは約０.６〜２０mg／kg／日の範囲である。静脈内で、活性成分の１日投与量は、目的とする効果のために使用するとき、一定速度の点滴の間で０.００１ng〜１００.０ng／分／Kg体重の範囲である。このような定速静脈内点滴は、好ましくは０.０１ng〜５０ng／分／Kg体重で、最も好ましくは０.０１ng〜１０.０mg／分／Kg体重で投与できる。本明細書に記戴する組成物を、１日に単回にて投与してよく、または総１日投与量を１日に２回、３回または４回に分けて投与してよい。本明細書に記戴する組成物は、所望により日／週／月の期間にわたり薬物の徐放が可能なデポー製剤でも投与できる。

本明細書に記戴する組成物は、適切な鼻腔内媒体を使用する局所使用で鼻腔内形態または経皮皮膚パッチを使用して経皮経路で投与できる。経皮送達系の形で投与するとき、この投与量の投与は、当然、投与レジメンの期間中は、間欠性ではなくむしろ連続的である。

組成物は、典型的に、意図する投与形態、即ち経口錠剤、カプセル、エリキシル、噴射剤を用いてまたは用いずに製造したエアロゾルスプレーおよびシロップに対して適切に選択され、かつ慣用の薬務に合致する適切な医薬希釈剤、添加物または担体(ここでは集合的に医薬担体と呼ぶ)との混合物において投与する。

例えば、錠剤またはカプセルの形態での経口投与において、活性薬物成分を、経口の、非毒性の医薬的に許容される不活性担体、例えば、これらに限定されないがラクトース、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトールおよびソルビトールと組み合わせることができる；液体形態での経口投与のためには、経口薬物成分を、エタノール、グリセロールおよび水のような、あらゆる経口の非毒性、医薬的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望の場合または必要な場合には、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤を混合物に組み込んでもよい。適切な結合剤は、例えばデンプン、ゼラチン、グルコースまたはベータ−ラクトースなどの天然糖、トウモロコシ甘味剤、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよび蝋を含むが、これらに限定されない。これらの投与形態で使用される滑沢剤は、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含む。崩壊剤は、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイトおよびキサンタンゴムを含むが、これらに限定されない。

本明細書に記戴する組成物は、混合ミセルまたはリポソーム送達系、例えば小分子単層リポソーム、大分子単層リポソームおよび多層リポソームの形でも投与できる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンのような様々なリン脂質から製造できる。浸透エンハンサーを、薬物吸収を増強するために添加してよい。

プロドラッグが、医薬組成物の多くの所望の品質を高めることが知られているため(すなわち、溶解度、バイオアベイラビリティ、製造など)、本明細書に記戴する化合物をプロドラッグ形態で送達されてもよい。それゆえに、本明細書に記戴する主題は、本願請求項の化合物のプロドラッグ、その送達方法およびそれを含む組成物を包含することを意図する。

本明細書に記戴する組成物は、標的化可能薬物担体として可溶性ポリマーと結合されてもよい。このようなポリマーは、ポリビニル−ピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノールまたはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド−ポリリシンを含み得る。さらに、本明細書に記戴する組成物を、薬物の制御放出を達成するために有用な生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸のコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアシレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーと組み合わせてもよい。

投与に適する投与形態(医薬組成物)は、投与量単位あたり約０.０１mg〜約５００mgの活性成分を含む。これらの医薬組成物において、活性成分は、通常、組成物の総重量に基づき約０.５〜９５重量％の量で存在し得る。

ゼラチンカプセルは、活性成分および粉末担体、例えばラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸を含み得る。類似の希釈剤を使用して圧縮錠剤を製造できる。錠剤およびカプセルのいずれも、長期間にわたる薬剤の連続的放出を提供するために徐放製品として製造できる。圧縮錠剤を、何らかの不快な味をマスクして、大気から錠剤を保護するために糖コーティングまたはフィルムコーティングまたは消化管での選択的崩壊のために腸溶性コーティングしてもよい。

経口投与用の液体投与形態は、患者による許容性を高めるために着色剤および風味剤を含み得る。

一般に、水、適切な油、食塩水、水性デキストロース(グルコース)および関連糖溶液およびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールは、非経腸溶液のための適切な担体である。非経腸投与のための溶液は、好ましくは活性成分の水可溶性塩、適切な安定化剤および必要であれば、緩衝物質を含む。重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤は、単独でまたは組み合わせのいずれかで、適切な安定化剤となる。また、クエン酸およびその塩およびナトリウムＥＤＴＡも使用される。さらに、非経腸溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールのような防腐剤を含み得る。

適切な医薬担体は、この分野の標準的参考書であるRemington：The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Edition, Mack Publishing Company(1995)に記戴されている。

本明細書に記戴する化合物の投与のための代表的な有用な医薬投与形態は、次のとおりに説明できる。

カプセル
多くの単位カプセルを、１００mgの粉末活性成分、１５０mgのラクトース、５０mgのセルロースおよび６mgのステアリン酸マグネシウムを、標準的な２ピースの硬ゼラチンカプセルに注入することにより製造できる。

軟ゼラチンカプセル
ダイズ油、綿実油またはオリーブ油のような消化可能油中の活性成分の混合物を製造し、ゼラチンに陽圧式排出ポンプにより注入して、１００mgの活性成分を含む軟ゼラチンカプセルを製造する。カプセルは、洗浄および乾燥されるべきである。

錠剤
錠剤を、投与量単位が、例えば１００mgの活性成分、０.２mgのコロイド状二酸化ケイ素、５mgのステアリン酸マグネシウム、２７５mgの微結晶セルロース、１１mgのデンプンおよび９８.８mgのラクトースであるように、慣用の方法で製し得る。嗜好性を高めるため、または吸収を遅延するために適当なコーティングを施してよい。

注射剤
本明細書に記戴するペプチド組成物の注射可能製剤は、規制機関により承認されているような添加物の使用を必要としても、または必要としない可能性がある。これらの添加物は、溶媒および共溶媒、可溶化、乳化または濃化剤、キレート剤、抗酸化剤および還元剤、抗微生物防腐剤、緩衝液およびｐＨ調節剤、充填剤、保護剤および張性調節剤および特殊な添加物を含むが、これらに限定されない。注射可能製剤は、無菌、無発熱物質、溶液の場合、無粒状物質でなければならない。

注射による投与に適する非経腸組成物は、例えば、１.５重量％の活性成分を、医薬的に許容される緩衝液(共溶媒または他の添加物を含んでいても、含まなくてもよい)と撹拌することにより製造し得る。溶液は、塩化ナトリウムを用いて等張化し、滅菌されなければならない。

懸濁液
水性懸濁液を、例えば、各々５mLが１００mgの微粉化活性成分、２０mgのナトリウムカルボキシメチルセルロース、５mgの安息香酸ナトリウム、１.０gのソルビトール溶液、Ｕ.Ｓ.Ｐ.および０.０２５mLのバニリンまたは別の味の良い風味剤を含む、経口および／または非経腸投与用として製造できる。

生分解性微粒子
注射による投与に適する徐放性非経腸組成物は、例えば、適切な生分解性ポリマーを溶媒に溶解し、活性剤をポリマー溶液に添加して導入し、溶媒をマトリクスから除去し、それによりマトリクス中に活性剤が分散したポリマーのマトリクスを形成させることにより製造され得る。

ペプチド合成
本明細書の記述は、化学結合の法則および原理に即して解釈されるべきである。本開示に含まれる化合物は、医薬剤として使用するために適切で安定なものであると理解されるべきである。当業者は、化学結合および安定性についての一般原理に基づいて、化合物が安定であるもの、および安定でないものを知っている。

本発明の大環状ペプチドの化学合成は、段階的固相合成、配座的に支援される再ライゲーションを経るペプチドフラグメントの半合成、クローン化または合成ペプチドセグメントの酵素ライゲーションおよび化学ライゲーションを含めた様々な当該技術分野において承認されている方法を使用して合成できる。本明細書に記戴する大環状ペプチドおよびそのアナログの好ましい合成方法は、Chan, W.C. et al., eds., Fmoc Solid Phase Synthesis, Oxford University Press, Oxford(2000); Barany, G. et al., The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2：“Special Methods in Peptide Synthesis, Part A”, pp. 3−284, Gross, E. et al., eds., Academic Press, New York(1980)；およびStewart, J.M. et al., Solid−Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, Pierce Chemical Co., Rockford, IL(1984)に記戴されているような、種々の固相技術を使用する化学合成である。好ましいストラテジーは、α−アミノ基を一時的に保護するためのＦｍｏｃ(９−フルオレニルメチルメチル−オキシカルボニル)基と、アミノ酸側鎖を一時的に保護するためのｔｅｒｔ−ブチル基の組み合わせである(例えば、Atherton, E. et al., “The Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Protecting Group”, in The Peptides：Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 9："Special Methods in Peptide Synthesis, Part C", pp. 1−38, Undenfriend, S. et al., eds., Academic Press, San Diego(1987))。

ペプチドは、不溶性ポリマー支持体(“樹脂”とも呼ぶ)上で段階的方法において、ペプチドのＣ末端から開始して合成できる。合成は、ペプチドのＣ末端アミノ酸を、アミドまたはエステル結合の形成を介して樹脂に付加することから開始する。これは、得られるペプチドをＣ末端のアミドまたはカルボン酸として、最終段階で遊離させ得る。

Ｃ末端アミノ酸および合成に使用する全ての他のアミノ酸は、α−アミノ保護基が合成中に選択的に除去され得るように、特異的に保護されたα−アミノ基および側鎖官能基(存在するならば)を有することを必要とする。アミノ酸のカップリングを、活性エステルとしてそのカルボキシル基の活性化および樹脂に結合したＮ末端アミノ酸の非遮断α−アミノ基との反応により実施する。一連のα−アミノ基の脱保護およびカップリングを、全ペプチド配列が組立てられるまで繰り返す。次いで、通常、副反応を制限するための適当なスカベンジャーの存在下で、ペプチドを樹脂から遊離し、同時に側鎖官能性の脱保護を行う。得られたペプチドを最終的に逆相ＨＰＬＣで精製する。

最終ペプチドの前駆体として必要なペプチジル−樹脂の合成は、市販の架橋ポリスチレンポリマー樹脂(Novabiochem, San Diego, CA; Applied Biosystems, Foster City, CA)を利用する。好ましい固体支持体は、Ｃ末端カルボキサミドのための４−(２',４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル)−フェノキシアセチル−ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂(ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂)；９−Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂(Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂)；４−(９−Ｆｍｏｃ)アミノメチル−３,５−ジメトキシフェノキシ)バレリル−アミノメチル−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂(ＰＡＬ樹脂)である。第一および後続するアミノ酸のカップリングは、夫々、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰから、あるいはＤＩＣ／６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ、ＨＣＴＵ、ＤＩＣ／ＨＯＡｔまたはＨＡＴＵから製造されたＨＯＢｔ、６−Ｃｌ−ＨＯＢｔまたはＨＯＡｔ活性エステルを使用して達成できる。好ましい固体支持体は、保護ペプチドフラグメントの２−クロロトリチルクロライド樹脂および９−Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂(Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂)である。第一のアミノ酸の２−クロロトリチルクロライド樹脂への付加は、ジクロロメタンおよびＤＩＥＡにおけるＦｍｏｃ保護アミノ酸と樹脂との反応により最も良好に達成される。必要であれば、アミノ酸の溶解を促進するために少量のＤＭＦを添加してよい。

本明細書に記戴するペプチドアナログの合成は、単または多チャネルペプチド合成器、例えばＣＥＭ Liberty Microwave合成器あるいはＰｒｅｌｕｄｅ(６チャネル)またはＳｙｍｐｈｏｎｙ(１２チャンネル)合成器(Protein Technologies, Inc.)を使用して実施できる。

各ペプチドのためのペプチジル−樹脂前駆体を、任意の標準法を使用して、開裂および脱保護し得る(例えば、King, D.S. et al., Int. J. Peptide Protein Res., 36：255−266(1990)参照)。所望の方法は、水およびスカベンジャーとしてのＴＩＳ存在下のＴＦＡの使用である。典型的には、ペプチジル−樹脂をＴＦＡ／水／ＴＩＳ(９４：３：３、ｖ：ｖ：ｖ；１mL／１００mgのペプチジル樹脂)中、２〜６時間、室温で撹拌する。使用した樹脂を濾取し、ＴＦＡ溶液を濃縮または減圧下に乾燥する。得られた粗製ペプチドを、沈殿させて、Ｅｔ_２Ｏで洗浄するか、または直接分取ＨＰＬＣで精製するためにＤＭＳＯまたは５０％酢酸水溶液に再溶解する。

所望の純度のペプチドを、例えば、Watersモデル4000またはShimadzuモデルLC−8A液体クロマトグラフで分取ＨＰＬＣを使用して精製により得ることができる。粗製ペプチドの溶液を、YMC S5 ODS(２０×１００mm)カラムに入れ、いずれも０.１％ＴＦＡで緩衝化したＭｅＣＮの水溶液の直線グラジエントで１４〜２０mL／分の流速を使用して、２２０nmでのＵＶ吸光度により溶離液をモニタリングしながら溶出する。精製ペプチドの構造をエレクトロスプレーＭＳ分析で確認できる。

本明細書において、特に下記の代表的なスキームおよび実施例に使用される略語は、当業者には周知である。使用された幾つかの略語は、次の通りである：１−ヒドロキシベンゾトリアゾールとしてＨＯＢｔ；Ｏ−(ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩としてＨＢＴＵ；ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩としてＢＯＰ；(ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩)としてＰｙＢＯＰ；Ｏ−(６−Ｃｌ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩としてＨＣＴＵ；トリフルオロ酢酸としてＴＦＡ；トリイソプロピルシランとしてＴＩＳ；ジメチルスルホキシドとしてＤＭＳＯ；アセトニトリルとしてＭｅＣＮまたはＡＣＮ；１,１−ジクロロメタンとしてＤＣＭ；ジイソプロピルエチルアミンとしてＤＩＥＡまたはＤＩＰＥＡ；９−フルオレニルメチルオキシカルボニルとしてＦｍｏｃ；Ｎ−メチルモルホリンとしてＮＭＭ；Ｎ−メチルピロリドンとしてＮＭＰ；アセチルとしてＡｃ；およびエチルとしてＥｔ。

分析データ：
質量スペクトル分析法：“ＥＳＩ−ＭＳ(＋)”とは、ポジティブイオンモードで実施したエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を示す；“ＥＳＩ−ＭＳ(−)”とは、ネガティブイオンモードで実施したエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を示す；“ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)”とは、ポジティブイオンモードで実施された高分解エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を示す；“ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(−)”とは、ネガティブイオンモードで実施した高分解エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を示す。検出された質量は、“ｍ／ｚ”単位表記に従って報告された。１０００より大きい精密質量を有する化合物は、しばしば二重電荷イオンまたは三重電荷イオンとして検出された。

分析ＬＣＭＳ条件Ａ：
カラム：BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：水(０.０５％ＴＦＡを含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.０５％ＴＦＡを含む)；温度：５０℃；グラジエント：２分かけて２％Ｂ〜９８％Ｂ、次いで０.５分間９８％Ｂで保持；流量：０.８ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＬＣＭＳ条件Ｂ：
カラム：BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(０.０５％ＴＦＡを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(０.０５％ＴＦＡを含む)；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０〜１００％Ｂ、次いで０.７５分間１００％Ｂで保持；流量：１.１１ｍＬ／分.

分析ＬＣＭＳ条件Ｃ：
カラム：BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：水(０.２％ギ酸および０.０１％ＴＦＡ)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.２％ギ酸および０.０１％ＴＦＡを含む)；温度：５０℃；グラジエント：２分かけて２％Ｂ〜８０％Ｂ、０.１分かけて８０％Ｂ〜９８％Ｂ、次いで０.５分間９８％Ｂで保持；流量：０.８ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＬＣＭＳ条件Ｄ：
カラム：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０〜１００％Ｂ、次いで０.７５分間１００％Ｂで保持；流量：１.１１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＬＣＭＳ条件Ｅ：
カラム：Waters Acquity UPLC BEH C18，2.1 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０〜１００％Ｂ、次いで０.７５分間１００％Ｂで保持；流量：１.１１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＬＣＭＳ条件Ｆ：
カラム：Waters Xbridge C18，2.1 x 50 mm；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；温度：３５℃；グラジエント：４分かけて０〜１００％Ｂ、次いで、１分間１００％Ｂで保持；流量：４ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＬＣＭＳ条件Ｇ：
Finnigan LTQ Mass Spectrometer；カラム：Phenomenex Jupiter C4, 1 x 50 mm；移動相Ａ：１％ギ酸／水；移動相Ｂ：０.１％ギ酸／アセトニトリル；温度：３０℃；グラジエント：１％Ｂ、１分間保持；３分かけて１〜９５％Ｂ、次いで３分間、９５％Ｂで保持；流量：０.１５ｍＬ／分.

分析ＬＣＭＳ条件Ｈ：
カラム：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０.５分保持；流量：１.０ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＬＣＭＳ条件Ｉ：
カラム：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；温度：５０℃；グラジエント：３分かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０.５分保持；流量：０.５ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ａ：
カラム：YMC Pack ODS-AQ 3um 150 x 4.6mm；移動相Ａ：水(０.１％ＴＦＡを含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.１％ＴＦＡを含む)；温度：６０℃；グラジエント：２５分かけて３５％Ｂ〜８０％Ｂ；流量：１ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ｂ：
カラム：YMC Pack ODS-AQ 3um 150 x 4.6mm；移動相Ａ：水(０.１％ＴＦＡを含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.１％ＴＦＡを含む)；温度：６０℃；グラジエント：２５分かけて２５％Ｂ〜７５％Ｂ；流量：１ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ｃ：
カラム：YMC Pack ODS-AQ 3um 150 x 4.6mm；移動相Ａ：水(０.１％ＴＦＡを含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.１％ＴＦＡを含む)；温度：６０℃；グラジエント：２５分かけて２０％Ｂ〜７０％Ｂ；流量：１ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ｄ：
カラム：YMC Pack ODS-AQ 3um 150 x 4.6mm；移動相Ａ：水(０.１％ＴＦＡを含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.１％ＴＦＡを含む)；温度：６０℃；グラジエント：２５分かけて１５％Ｂ〜６５％Ｂ；流量：１ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ｅ：
カラム：YMC Pack ODS-AQ 3um 150 x 4.6mm；移動相Ａ：水(０.１％ＴＦＡを含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.１％ＴＦＡを含む)；温度：６０℃；グラジエント：２０分かけて２５％Ｂ〜６０％Ｂ；流量：１.２５ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ｆ：
カラム：YMC Pack ODS-AQ 3um 150 x 4.6mm；移動相Ａ：水(０.１％ＴＦＡを含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.１％ＴＦＡを含む)；温度：６０℃；グラジエント：２０分かけて２５％Ｂ〜６５％Ｂ；流量：１.２５ｍＬ／分；検出：２１７ｎｍのＵＶ

分析ＨＰＬＣ条件Ｇ
カラム：Sunfire C18 3.5um, 3.0 x 150mm；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(０.０５％トリフルオロ酢酸を含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(０.０５％トリフルオロ酢酸を含む)；温度：５０℃；グラジエント：１２分かけて１０〜１００％Ｂ、次いで３分間１００％Ｂで保持；流量：１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ｈ
カラム：Xbridge Phenyl 3.5 x 150um，移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(０.０５％トリフルオロ酢酸を含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(０.０５％トリフルオロ酢酸を含む)；温度：５０℃；グラジエント：１２分かけて１０〜１００％Ｂ、次いで３分間１００％Ｂで保持；流量：１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ｉ：
カラム：Phenomenex Luna 5u C18(2)150 x 4.6 mm；移動相Ａ：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；グラジエント：２０分かけて５〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

分析ＨＰＬＣ条件Ｊ：
カラム：Phenomenex Luna 5u C18(2)150 x 4.6 mm；移動相Ａ：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；移動相Ｂ：アセトニトリル(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；グラジエント：２０分かけて１０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量１ｍＬ／分，検出：２２０ｎｍのＵＶ.

一般的な方法：
Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：
全ての操作を、Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成器(Protein Technologies)上でのオートメーション下で行った。全ての方法を、別段の記載が無ければ、底部フリットを取り付けた１０または４５ｍＬポリプロピレンチューブ内で行なった。このチューブは、チューブの底部と上部の双方を介してＰｒｅｌｕｄｅペプチド合成器に連結している。ＤＭＦおよびＤＣＭを、チューブの上部から加えて、チューブの側面を均等に洗い流すことができる。残存試薬を、チューブ底部から加えて、フリットを通過させて、樹脂と接触させる。全ての溶液を、チューブの底部から除去した。“周期的攪拌”とは、底部フリットからのＮ_２ガスの短いパルスを意味する；このパルスは、おおよそ５秒間継続させ、３０秒毎におこる。アミノ酸溶液を、通常は、調整してから３週間を過ぎて使用しない。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＤＩＣ＝Ｎ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド；ＨＯＡｔ＝１−ヒドロキシ ７−アザベンゾトリアゾール；Ｓｉｅｂｅｒ＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、ここで“３−イルオキシ”は、ポリスチレン樹脂への結合性に関する位置およびタイプを示す。使用した樹脂は、Ｓｉｅｂｅｒリンカーを有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリマー(ポリスチレン)である(窒素にてＦｍｏｃ保護)；１００〜２００メッシュ，１％ＤＶＢ，０.７１ｍｍｏｌ／ｇローディング。使用した一般的なアミノ酸は、下記に列挙した(側鎖保護基は括弧内に示した)：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ.

“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌのスケールで実施した実験を述べたもので、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、上記した約１４０ｍｇのＳｉｅｂｅｒ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂に対応している。全ての方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、“樹脂膨潤方法”として下記に記載した樹脂膨潤方法により開始した。アミノ酸と第一級アミンＮ末端のカップリングには、下記に記載した“単カップリング方法”を用いた。Ｆｍｏｃ−Ｎ−アミノ酸とのカップリングと第二級アミンＮ末端とのカップリングには、以下に記述した“第二級アミンカップリング方法”を使用した。クロロアセチル基とペプチドのＮ末端とのカップリングは、下記の“クロロアセチルクロライドカップリング方法”または“クロロ酢酸カップリング方法”により説明される。

樹脂膨潤化方法：
４０ｍＬのポリプロピレン固相反応容器に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂(１４０ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ)を加えた。樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(５.０ｍＬ)およびＤＣＭ(５.０ｍＬ)を加えて、この混合物に、１０分間反応容器の底部からＮ_２バブリングにより周期的に攪拌して、溶媒を排出した。

単カップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、周期的に６０秒間撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸およびＨＯＡｔ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)の溶液、次いでＤＩＣ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、６０分間周期的に撹拌して、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

第二級アミンカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、周期的に６０秒間撹拌して、その後この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸およびＨＯＡｔ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，５等量)の溶液、次いでＤＩＣ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，５等量)を加えた。混合物を、３００分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、その後この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、その後この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

クロロアセチルクロリドカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ(４.０ｍｍｏｌ，０.６９９ｍＬ，４０等量)およびクロロアセチルクロリド(２.０ｍｍｏｌ，０.１６０ｍＬ，２０等量)溶液(３.０ｍＬ)を加えた。混合物を、周期的に１２〜１８時間撹拌して、次いで溶液を排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、溶液を排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＣＭ(４.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、その後溶液を排出した。

Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ｂ：
全ての操作を、Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成器(Protein Technologies)でオートメーションの下で行った。全ての方法を、底部フリットを備え付けた１０または４５ｍＬ ポリプロピレンチューブ内で行った。ＤＭＦおよびＤＣＭを、チューブの上部から加えて、チューブの側面を均等に洗い流すことができる。残存する試薬を、チューブ底部から加えて、フリットを通過させて、樹脂と接触させる。全ての溶液を、チューブの底部から除去した。“周期的攪拌”とは、底部フリットからのＮ_２ガスの短いパルスを意味する；このパルスは、おおよそ５秒続き、３０秒毎におこる。アミノ酸溶液を、通常は、調整してから３週間を過ぎて使用しない。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−(６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；Ｓｉｅｂｅｒ＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、この場合“３−イルオキシ”とは、ポリスチレン樹脂との結合の位置およびタイプを示す。使用した樹脂は、Ｓｉｅｂｅｒリンカーを有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリマー(ポリスチレン)である(窒素にてＦｍｏｃ保護)；１００〜２００メッシュ，１％ＤＶＢ，０.７１ｍｍｏｌ／ｇローディング。使用した一般的なアミノ酸を以下に挙げた(側鎖保護基は括弧内に示した)。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。

“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ｂ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、上記したおおよそ１４０ｍｇのＳｉｅｂｅｒ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂に対応している。全ての方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、“樹脂膨潤方法”として下記に述べた樹脂膨潤方法を用いて開始する。アミノ酸と第一級アミンＮ末端のカップリングには、下記に記載した“単カップリング方法”を用いた。アミノ酸の第二級アミンＮ末端へのカップリングは、下記の“第二級アミンカップリング方法”を使用した。ペプチドのＮ−末端へのクロロアセチル基のカップリングは、下記の“クロロアセチルクロリドカップリング方法”または“クロロ酢酸カップリング方法”により詳述される。

樹脂膨潤化方法：
４０ｍＬのポリプロピレン固相反応容器に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂(１４０ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ)を加えた。樹脂を、下記の通りに３回洗った(膨潤させた)：反応容器に、ＤＭＦ(５.０ｍＬ)およびＤＣＭ(５.０ｍＬ)を加えて、この混合物を、１０分間、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。

単カップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、周期的に６０秒間撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)、次いでＨＣＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，２.５ｍＬ，２０等量)を加えた。混合物を、３０分周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

ダブルカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、周期的に６０秒間撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)、次いでＨＣＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，２.５ｍＬ，２０等量)を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、容器の上部から連続して３回ＤＭＦ(４.０ｍＬ)で洗い、得られる混合物を、周期的に６０秒間撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)、次いでＨＣＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，２.５ｍＬ，２０等量)を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

第二級アミンカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，１０等量)、次いでＨＣＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，１０等量)、最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.５ｍＬ，１２等量)を加えた。混合物を、周期的に１２時間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

クロロアセチルクロリドカップリング方法Ａ：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ(４.０ｍｍｏｌ，０.６９９ｍＬ，４０等量)およびクロロアセチルクロリド(２.０ｍｍｏｌ，０.１６０ｍＬ，２０等量)の溶液(３.０ｍＬ)を加えた。混合物を、周期的に１２〜１８時間撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＣＨ_２Ｃｌ_２(２.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。

クロロ酢酸カップリング方法Ｂ：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)、クロロ酢酸(１.２ｍｍｏｌ，１１３ｍｇ，１２等量)およびＮ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(１.２ｍｍｏｌ，０.１８７ｍＬ，１２等量)を加えた。混合物を、周期的に１２〜１８時間撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＣＨ_２Ｃｌ_２(２.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。

Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ｃ：
全ての操作を、Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成器(Protein Technologies)でオートメーションの下で行った。全ての方法を、底部フリットを取り付けた１０または４５ｍＬ ポリプロピレンチューブ内で行った。このチューブは、チューブの底部と上部の双方を介してＰｒｅｌｕｄｅペプチド合成器に連結している。ＤＭＦおよびＤＣＭを、チューブの上部から加えて、チューブの側面を均等に洗い流すことができる。残存する試薬を、チューブの底部から添加して、フリットを通して樹脂と接触させる。全ての溶液を、チューブの底部から除去する。“周期的攪拌”とは、底部フリットからのＮ_２ガスの短時間のパルスを意味する；このパルスは、おおよそ５秒続き、３０秒毎におこる。アミノ酸溶液を、一般的には、調整してから３週間を超えて使用しない。ＨＡＴＵ溶液を、調製５日以内で使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−(６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス(ジメチルアミノ)メチレン］−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロリン酸塩；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；Ｓｉｅｂｅｒ＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、この場合“３−イルオキシ”とは、ポリスチレン樹脂との結合の位置およびタイプを示す。使用した樹脂は、Ｓｉｅｂｅｒリンカーを有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリマー(ポリスチレン)である(窒素にてＦｍｏｃ保護)；１００〜２００メッシュ，１％ＤＶＢ，０.７１ｍｍｏｌ／ｇ ローディング。使用した一般的なアミノ酸を以下に挙げた(側鎖保護基は括弧内に示した)。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。

“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ｃ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、上記したおおよそ１４０ｍｇのＳｉｅｂｅｒ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂に対応している。全ての方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、“樹脂膨潤方法”として下記に述べた樹脂膨潤方法を用いて開始する。アミノ酸と第一級アミンＮ末端のカップリングには、下記に記載した“単カップリング方法”を用いた。アミノ酸と第二級アミンＮ末端とのカップリングは、下記“第二級カップリング方法”を使用した。使用した樹脂の最終洗浄は、下記に記載した“最終洗浄方法”を使用した。

樹脂膨潤化方法：
４０ｍＬのポリプロピレン固相反応容器に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂(１４０ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ)を加えた。樹脂を、下記の通りに３回洗った(膨潤させた)：反応容器に、ＤＭＦ(５.０ｍＬ)およびＤＣＭ(５.０ｍＬ)を加えて、この混合物を、１０分間、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。

単カップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、周期的に６０秒間撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，５.０ｍＬ，１０等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，２.５ｍＬ，２０等量)を加えた。混合物を、６０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

第二級アミンカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.５ｍＬ，１２等量)を加えた。混合物を、３００分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記のとおりに２回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.５ｍＬ，１２等量)を加えた。混合物を、３００分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記のとおりに２回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

カスタムアミノ酸カップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，０.５〜２.５ｍＬ，１〜５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，０.５〜２.５ｍＬ，１〜５等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，０.５〜１.５ｍＬ，４〜１２等量)を加えた。混合物を、６０分〜６００分間周期的に撹拌して、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記のとおりに２回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

最終洗浄方法：
樹脂を、下記の通りに２回連続的に洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＣＭ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

クロロ酢酸カップリング方法：
Ｎｏｔｅマニュアル工程。先の工程からの樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、室温で５分間振盪して、次いで、この溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)、クロロ酢酸(１.２ｍｍｏｌ，１１３ｍｇ，１２等量)およびＮ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(１.２ｍｍｏｌ，０.１８７ｍＬ，１２等量)を加えた。混合物を、室温で１２〜１８時間振盪して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を９０秒間撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＣＨ_２Ｃｌ_２(４.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。

Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ｄ：
全ての操作を、Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成器(Protein Technologies)でオートメーションの下で行った。全ての方法を、底部フリットを取り付けた１０または４５ｍＬポリプロピレンチューブ内で行った。このチューブは、チューブの底部と上部の双方を介してＰｒｅｌｕｄｅペプチド合成器に連結している。ＤＭＦおよびＤＣＭを、チューブの上部から加えて、チューブの側面を均等に洗い流すことができる。残存する試薬を、チューブの底部から添加して、フリットを通して樹脂と接触させる。全ての溶液を、チューブの底部から除去する。“周期的攪拌”とは、底部フリットからのＮ_２ガスの短時間のパルスを意味する；このパルスは、おおよそ５秒続き、３０秒毎におこる。アミノ酸溶液を、一般的には、調整してから３週間を超えて使用しない。ＨＡＴＵ溶液を、調製５日以内で使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−(６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス(ジメチルアミノ)メチレン］−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロリン酸塩；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；Ｓｉｅｂｅｒ＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、この場合“３−イルオキシ”とは、ポリスチレン樹脂との結合の位置およびタイプを示す。使用した樹脂は、Ｓｉｅｂｅｒリンカーを有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリマー(ポリスチレン)である(窒素にてＦｍｏｃ保護)；１００〜２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０.７１ｍｍｏｌ／ｇ ローディング。使用した一般的なアミノ酸を以下に挙げた(側鎖保護基は括弧内に示した)。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ.

“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ｄ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、上記したおおよそ１４０ｍｇのＳｉｅｂｅｒ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂に対応している。全ての方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、“樹脂膨潤方法”として下記に述べた樹脂膨潤方法を用いて開始する。アミノ酸と第一級アミンＮ末端のカップリングには、下記に記載した“単カップリング方法”を用いた。アミノ酸と第二級アミンＮ末端とのカップリングには、下記“第二級アミンカップリング方法”を使用した。樹脂の最終洗浄は、下記“最終洗浄方法”を使用した。

樹脂膨潤化方法：
４０ｍＬのポリプロピレン固相反応容器に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂(１４０ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ)を加えた。樹脂を、下記の通りに３回洗った(膨潤させた)：反応容器に、ＤＭＦ(５.０ｍＬ)およびＤＣＭ(５.０ｍＬ)を加えて、この混合物を、１０分間、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。

単カップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、周期的に６０秒間撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，２.５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，２.５等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，０.７５ｍＬ，５等量)を加えた。混合物を、３０分周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

第二級アミンカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，２.５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，２.５等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，０.７５ｍＬ，５等量)を加えた。混合物を、３０分周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記のとおりに２回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，２.５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，２.５等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，０.７５ｍＬ，５等量)を加えた。混合物を、３０分周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記のとおりに２回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記のとおりに２回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、周期的に３０秒間撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

最終洗浄方法：
樹脂を、下記の通りに２回連続的に洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＣＭ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

クロロ酢酸カップリング方法：
Ｎｏｔｅマニュアル工程。先の工程からの樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、室温で５分間振盪して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)、クロロ酢酸(１.２ｍｍｏｌ，１１３ｍｇ，１２等量)およびＮ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(１.２ｍｍｏｌ，０.１８７ｍＬ，１２等量)を加えた。混合物を、室温で１２〜１８時間撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を９０秒間撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＣＨ_２Ｃｌ_２(４.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、その後この溶液をフリットから排出した。

ＣＥＭ方法Ａ：
全ての操作を、ＣＥＭライブラリー・マイクロウェーブ・ペプチド合成器(CEM Corporation)でオートメーションの下に行った。全ての方法を、別段の記載が無ければ、ＣＥＭディスカバリーマイクロウェーブユニットに底部フリットを取り付けた３０または１２５ｍＬポリプロピレンチューブ内で行った。このチューブは、チューブの底部と上部の双方を介してＣＥＭリバティー合成器と連結している。ＤＭＦおよびＤＣＭは、チューブの上部および底部から加えられ、チューブの側面を均等に洗い流すことができる。全ての溶液を、上部から樹脂を移すことを除いて、チューブの底部から除去した。“周期的バブリング”とは、底部フリットからのＮ_２ガスの短時間のバブリングをいう。アミノ酸溶液を、一般的には、調整してから３週間を超えて使用しない。ＨＡＴＵ溶液を、調製５日以内で使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−(６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス(ジメチルアミノ)メチレン］−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロリン酸塩；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；Ｓｉｅｂｅｒ＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、この場合“３−イルオキシ”とは、ポリスチレン樹脂との結合の位置およびタイプを示す。使用した樹脂は、Ｓｉｅｂｅｒリンカーを有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリマー(ポリスチレン)である(窒素にてＦｍｏｃ保護)。；１００〜２００メッシュ，１％ＤＶＢ，０.７１ｍｍｏｌ／ｇローディング。その他の一般的な樹脂、例えば、Ｒｉｎｋ、クロロトリチルまたは他の酸感受性リンカーを、合成に用いることができ、Ｓｅｉｂｅｒアミド樹脂を、別段の記載が無ければ、特定の実施形態に使用した。使用した一般的なアミノ酸を以下に挙げた(側鎖保護基は括弧内に示した)。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。

“ＣＥＭ方法Ａ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、上記したおおよそ１４０ｍｇのＳｉｅｂｅｒ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂に対応している。全ての方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、“樹脂膨潤方法”として下記に述べた樹脂膨潤方法を用いて開始する。“単カップリング方法”を使用したアミノ酸の第一級アミンのＮ−末端へのカップリングは以下に記述した。アミノ酸の第二級アミンＮ末端へのカップリングは、下記の“第二級アミンカップリング方法”を使用した。ペプチドのＮ−末端へのクロロアセチル基のカップリングは、上記に詳述した“クロロアセチルクロリドカップリング方法”または“クロロ酢酸カップリング方法”により記述されている。

樹脂膨潤化方法：
５０ｍＬ ポリプロピレンコニカルチューブに、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂(１４０ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ)を加えた。次いで、ＤＭＦ(７ｍＬ)を、このチューブに入れて、次いでＤＣＭ(７ｍＬ)を入れた。次いで、樹脂を、容器の上部から反応容器に移した。この方法を、さらに２回繰り返した。ＤＭＦ(７ｍＬ)を加えて、続いてＤＣＭ(７ｍＬ)を加えた。樹脂を、１５分間、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより膨潤させて、この溶媒をフリットから排出した。

標準カップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、ＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.５Ｍ，１.０ｍＬ，５等量)およびＤＩＰＥＡ(ＮＭＰ中で２Ｍ，０.５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、５０℃でカップリングされるＦｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨを除く全てのアミノ酸については、５分間７５℃でＮ_２バブリングにより混合して、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、２分間６５℃で周期的なバブリングを行い、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

ダブルカップルカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、ＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.５Ｍ，１.０ｍＬ，５等量)およびＤＩＰＥＡ(ＮＭＰ中で２Ｍ，０.５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、５０℃でカップリングされるＦｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨを除いた全てのアミノ酸について５分間７５℃でＮ_２バブリングにより混合して、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、ＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.５Ｍ，１.０ｍＬ，５等量)およびＤＩＰＥＡ(ＮＭＰ中で２Ｍ，０.５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、５０℃でカップリングされるＦｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨを除いた全てのアミノ酸について５分間７５℃でＮ_２バブリングにより混合して、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、２分間６５℃で周期的なバブリングを行い、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

第二級アミンカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ＤＭＦ(７ｍＬ)中の５％ピペラジンおよび０.１Ｍ ＨＯＢｔ溶液を加えた。混合物を、７５℃で３分間周期的に撹拌して、次いで溶液を排出した。この方法を、１回以上繰り返した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、ＨＣＴＵ(ＤＭＦ中で０.５Ｍ，１.０ｍＬ，５等量)およびＤＩＰＥＡ(ＮＭＰ中で２Ｍ，０.５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、全てのアミノ酸(Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨについては５０℃)について、５分間７５℃で、その後加熱せずに６時間、Ｎ_２バブリングにより混合した。排出後に、樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、２分間６５℃で周期的なバブリングを行い、次いでこの溶液を排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

カスタムアミノ酸カップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、ＨＡＴＵ(２.５等量〜１０等量)を含有するアミノ酸溶液(１.２５ｍＬ〜５ｍＬ，２.５等量〜１０等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＮＭＰ中で２Ｍ，０.５ｍＬ〜１ｍＬ，２０等量)を加えた。混合物を、２５℃〜７５℃で、５分〜２時間、Ｎ_２バブリングにより混合して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。反応容器に、無水酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)の溶液を加えた。混合物を、２分間６５℃で周期的なバブリングを行い、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：ＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流して、次いでＤＭＦ(７ｍＬ)を底部から流して、最終的にＤＭＦ(７ｍＬ)を、上部から流した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ａ：
全ての操作を、Ｓｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成器(Protein Technologies)でオートメーションの下で行った。全ての方法を、底部フリットを取り付けたＳｙｍｐｈｏｎｙポリプロピレンチューブ内で実施した。チューブは、チューブの底部と上部の双方を介してＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成器に連結している。全ての溶媒、ＤＭＦ、ＤＣＭ、アミノ酸および試薬を、チューブの底から加えて、フリットを通して樹脂と接触させる。全ての溶液を、チューブの底部から除去する。“周期的攪拌”とは、底部フリットからのＮ_２ガスの短時間のパルスを意味する；このパルスは、おおよそ５秒続き、１５秒毎に起こる。アミノ酸溶液を、一般的には、調整してから３週間を超えて使用しない。ＨＡＴＵ溶液を、調製５日以内で使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−(６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス(ジメチルアミノ)メチレン］−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロリン酸塩；ＮＭＭ＝ｎ−メチルモルホリン；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；Ｓｉｅｂｅｒ＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、この場合“３−イルオキシ”とは、ポリスチレン樹脂との結合の位置およびタイプを示す。使用した樹脂は、Ｓｉｅｂｅｒリンカーを有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリマー(ポリスチレン)である(窒素にてＦｍｏｃ保護)；１００〜２００メッシュ、１％ＤＶＢ、０.７１ｍｍｏｌ／ｇ ローディング。他の一般的な酸感受性樹脂を、合成に使用し得る、例えばＲｉｎｋまたは官能化クロロトリチル樹脂。使用した一般的なアミノ酸を以下に挙げた(側鎖保護基は括弧内に示した)。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。

“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ａ”の方法は、０.０５０ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、約７０ｍｇの上記Ｓｉｅｂｅｒ−メリフィールド樹脂に対応する。全ての方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.０５０ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、“樹脂膨潤方法”として下記に述べた樹脂膨潤方法を用いて開始する。アミノ酸と第一級アミンＮ末端のカップリングには、下記の“標準カップリング方法”を用いた。アミノ酸の第二級アミンＮ末端へのカップリングは、下記の“ダブルカップリング”を使用し、カスタムアミノ酸は、下記に述べたアミノ酸“ブランクカップリング”のマニュアルブランク付加によりカップリングした。

膨潤方法：
Ｓｙｍｐｈｏｎｙポリプロピレン固相反応容器に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂(７０ｍｇ，０.０５０ｍｍｏｌ)を加えた。樹脂を、下記の通りに３回洗った(膨潤させた)：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、１０分間、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、連続的に下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、ＤＭＦ(６.２５ｍＬ)で洗い、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

標準カップリング方法：
樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、ＤＭＦ(６.２５ｍＬ)で洗い、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

第二級アミンカップリング方法：
樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、３００分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、ＤＭＦ(６.２５ｍＬ)で洗い、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、３００分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

カスタムアミノ酸カップリング方法：
樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。この合成を、反応容器に手作業でカスタムアミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)を加えるために、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ ｓｏｆｔｗａｒｅにより中断して、その後オートメーションを、ＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えるために再度開始する。混合物を、３００分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を用いて容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ(ｖ／ｖ／ｖ １：１：３, ２.５ｍＬ)を加えて、混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：
全ての操作を、Ｓｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成器(Protein Technologies)でオートメーションの下で行った。全ての方法を、別段の記載が無ければ、底部フリットを取り付けたＳｙｍｐｈｏｎｙポリプロピレンチューブ内で実施した。チューブは、チューブの底部と上部の双方を介してＳｙｍｐｈｏｎｙペプチド合成器に連結している。全ての溶媒、ＤＭＦ、ＤＣＭ、アミノ酸および試薬を、チューブの底から加えて、フリットを通して樹脂と接触させる。全ての溶液を、チューブの底部から除去する。“周期的攪拌”とは、底部フリットからのＮ_２ガスの短時間のパルスを意味する；このパルスは、おおよそ５秒続き、１５秒毎に起こる。アミノ酸溶液を、一般的には、調整してから３週間を超えて使用しない。ＨＡＴＵ溶液を、調製５日以内で使用した。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＣＴＵ＝２−(６−クロロ−１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル)−１,１,３,３−テトラメチルウロニウム；ＨＡＴＵ＝１−［ビス(ジメチルアミノ)メチレン］−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロリン酸塩；ＮＭＭ＝ｎ−メチルモルホリン；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；Ｓｉｅｂｅｒ＝Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ、この場合“３−イルオキシ”とは、ポリスチレン樹脂との結合の位置およびタイプを示す。使用した樹脂は、Ｓｉｅｂｅｒリンカーを有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリマー(ポリスチレン)である(窒素にてＦｍｏｃ保護)；１００〜２００メッシュ，１％ＤＶＢ，０.７１ｍｍｏｌ／ｇ ローディング。他の一般的な酸感受性樹脂を、合成に使用し得る（例えば、Ｒｉｎｋまたは官能化クロロトリチル樹脂など）。使用した一般的なアミノ酸を以下に挙げた(側鎖保護基は括弧内に示した)。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ。

“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ”の方法は、０.０５０ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、約７０ｍｇの上記Ｓｉｅｂｅｒ−メリフィールド樹脂に対応する。全ての方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.０５０ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、“樹脂膨潤方法”として下記に述べた樹脂膨潤方法を用いて開始する。アミノ酸と第一級アミンＮ末端のカップリングには、下記の“標準カップリング方法”を用いた。アミノ酸と第二級アミンＮ末端とのカップリングには、“第二級アミンカップリング方法Ｂ”を使用して、カスタムアミノ酸を、下記アミノ酸“カスタムアミノ酸カップリング方法”のマニュアルブランク添加によりカップリングして、クロロアセチル無水物を、下記“最終カップリング方法”を用いて、配列の最後の位置に付加した。

膨潤方法：
Ｓｙｍｐｈｏｎｙポリプロピレン固相反応容器に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ：Ｓｉｅｂｅｒ樹脂(７０ｍｇ，０.０５０ｍｍｏｌ)を加えた。樹脂を、下記の通りに３回洗った(膨潤させた)：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、１０分間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、連続的に下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、ＤＭＦ(６.２５ｍＬ)で洗い、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

標準カップリング方法：
樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ(ｖ／ｖ／ｖ １：１：３, ２.５ｍＬ)を加えて、混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、連続的に下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

第二級アミンカップリング方法：
樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸を加えて(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的に ＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、ＤＭＦ(６.２５ｍＬ)で洗い、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)および最終的にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して３回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、Ａｃ２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ(ｖ／ｖ／ｖ １：１：３, ２.５ｍＬ)を加えて、混合物を、１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、連続的に下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

カスタムアミノ酸カップリング方法：
樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。この系を、反応容器にカスタムアミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)を手動で加えるためのシステムにより中断して、その後反応容器に、ＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.２５ｍＬ，５等量)、最後にＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えるためにオートメーションを再度開始した。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ(ｖ／ｖ／ｖ １：１：３, ２.５ｍＬ)を加えて、混合物を１０分間周期的に撹拌して、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を、連続的に下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

最終カップリング方法：
樹脂を下記の通りに３回洗った：反応容器に、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、反応容器の底部からのＮ_２バブリングにより、３０秒間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.５ｍＬ)を加えた。混合物を、２.５分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)、続いて、クロロ無水酢酸(ＤＭＦ中で０.４Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、ＤＭＦ(６.２５ｍＬ)で洗い、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＮＭＭ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)、続いてクロロ無水酢酸(ＤＭＦ中で０.４Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに６回洗った：ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ(ｖ／ｖ／ｖ １：１：３, ２.５ｍＬ)を加えて、混合物を１０分間周期的に撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、連続的に下記の通りに６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＣＭ(２.５ｍＬ)を、容器の底部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次いで窒素流で１０分間乾燥させた。

包括的脱保護方法Ａ：
全ての操作を、別段の記載が無ければ手動により行った。“包括的脱保護方法Ａ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。“脱保護溶液”を、トリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール(９２.５：２.５：２.５：２.５ ｖ：ｖ：ｖ：ｗ)を用いて調製した。樹脂を、反応容器から除去して、フリットを備えた２５ｍＬシリンジに移した。シリンジに、“脱保護溶液”(５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、８５分間シェーカー内で混合した。この溶液を、濾過して、濃縮して、ジエチルエーテル(３０ｍＬ)で希釈した。沈殿した固体を、３分間遠心分離した。上清溶液を傾捨して、固体をジエチルエーテル(２５ｍＬ)に再懸濁した。懸濁液を、３分間遠心分離した。上清を傾捨して、残留固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に再懸濁させた。懸濁液を、３分間遠心分離した。上清を傾捨して、残存固体を高真空下にて乾燥させた。粗製ペプチドを、白色からオフホワイトの固体として得た。

包括的脱保護方法Ｂ：
全ての操作を、別段の記載が無ければ手動により行った。“包括的脱保護方法Ｂ”の方法は、０.０４ｍｍｏｌスケールで行った実験を記述したものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.０４ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。“脱保護溶液”を、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン(９６：４；ｖ：ｖ)用いて調製した。樹脂を、反応容器から除去して、フリットを備えた１０ｍＬのシリンジに移した。シリンジに、“脱保護溶液”(２.０〜３.０ｍＬ)を加えた。混合物を、１時間または１.５時間シェーカー内で混合した。溶液を、濾過して、脱保護溶液(０.５ｍＬ)で洗い、濃縮して、ジエチルエーテル(３０ｍＬ)に希釈した。沈殿した固体を、３分間遠心分離した。上清溶液を傾捨して、固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に再懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を高真空下にて乾燥させた。粗製ペプチドを、白色からオフホワイトの固体として得た。

包括的脱保護方法Ｃ：
全ての操作を、記載が無ければ手動により行った。“包括的脱保護方法Ｃ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を記述したものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。“脱保護溶液”を、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール(９５：２.５：２.５ ｖ：ｖ：ｗ)を用いて調製した。樹脂を、反応容器から取り出して、Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに移した。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに、“脱保護溶液”(４.０ｍＬ)を加えた。

混合物を、シェーカー内で６０分間混合した。溶液を、濾過して、ジエチルエーテル(３０ｍＬ)に希釈した。沈殿した固体を、３分間遠心分離した。上清溶液を傾捨して、固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に再懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を高真空下にて乾燥させた。粗製ペプチドを、白色からオフホワイトの固体として得た。

包括的脱保護方法Ｄ：
全ての操作を、別段の記載が無ければ手動により行った。“包括的脱保護方法Ｂ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を記述したものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。“脱保護溶液”を、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール(９４：３：３ ｖ：ｖ：ｗ)を用いて調製した。樹脂を、反応容器から除去して、フリットを備えた２５ｍＬシリンジに移した。シリンジに、“脱保護溶液”(５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、シェーカー内で５分間混合した。溶液を、濾過して、ジエチルエーテル(３０ｍＬ)に希釈した。沈殿した固体を、３分間遠心分離した。上清溶液を傾捨して、固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に再懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を高真空下にて乾燥させた。粗製ペプチドを、白色からオフホワイトの固体として得た。

包括的脱保護方法Ｅ：
全ての操作を、記載が無ければ手動により行った。“包括的脱保護方法Ｅ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌのスケールで行った実験を述べたもので、この場合のスケールは、樹脂に結合したＦｍｏｃ Ｇｌｙ−ＣｌＴｒｔリンカーの量により決定される。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。“脱保護溶液”を、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール(９５：２.５：２.５ ｖ：ｖ：ｗ)を用いて調製した。樹脂を、反応容器から取り出して、Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに移した。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに、“脱保護溶液”(２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間シェーカー内で混合した。溶液を、濾過して、遠心分離チューブに集めた。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに、“脱保護溶液”(２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間シェーカー内で混合した。溶液を、濾過して、遠心分離チューブに集めた。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに、“脱保護溶液”(２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間シェーカー内で混合した。溶液を、濾過して、遠心分離チューブに集めた。遠心分離用チューブ内の溶液を、６０分間静置させた。次いで、集めた溶液をジエチルエーテル(３０ｍＬ)で希釈して、沈殿が形成した。沈殿した固体を、３分間遠心分離した。上清溶液を傾捨して、固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に再懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を高真空下にて乾燥させた。粗製ペプチドを、白色からオフホワイトの固体として得た。

包括的脱保護方法Ｆ：
全ての操作を、記載が無ければ手動により行った。“包括的脱保護方法Ｆ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＲｉｎｋリンカーの量により決定される。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。“脱保護溶液”を、トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ジチオスレイトール(９５：２.５：２.５ ｖ：ｖ：ｗ)を用いて調製した。樹脂を、反応容器から取り出して、６ｍｌのＢｉｏ−Ｒａｄチューブに移した。Ｂｉｏ−Ｒａｄチューブに、“脱保護溶液”(４.０ｍＬ)を加えた。混合物を、シェーカー内で９０分間混合した。溶液を、濾過して、ジエチルエーテル(３０ｍＬ)に希釈した。沈殿した固体を、３分間遠心分離した。上清溶液を傾捨して、固体をジエチルエーテル(２５ｍＬ)に再懸濁した。懸濁液を、３分間懸濁した。上清を傾捨して、残存固体を、ジエチルエーテル(２５ｍＬ)に懸濁した。懸濁液を、３分間遠心分離した。上清を傾捨して、残存固体を高真空下にて乾燥させた。粗製ペプチドを、白色からオフホワイトの固体として得た。

環化方法Ａ
全ての操作を、別段の記載が無ければ、手動により行った。“環化方法Ａ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌのスケールで行った実験を述べたもので、この場合のスケールは、ペプチドを生成するために使用した樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、この方法で使用したペプチドの量の直接的な測定に基づくものではない。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。粗製ペプチド固体を、アセトニトリル：８Ｍグアニジン水溶液／５０ｍＭ ＴＲＩＳ(１：３)(ｐＨ８.６)(７ｍＬ：１８ｍＬまたは同様の割合)に溶解して、次いで該溶液を、必要であれば、ＮａＯＨ水溶液(１.０Ｍ)を用いて、ｐＨ＝８.５〜９.０に調整した。次いで、この溶液を、シェーカーを用いて１２〜１８時間混合した。反応溶液を濃縮して、次いで残留物を、アセトニトリル：水に溶解した。この溶液を、逆相ＨＰＬＣ精製に供して、目的とする環状ペプチドを得た。

環化方法Ｃ：
全ての操作を、記載が無ければ手動により行った。“環化方法Ｃ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌのスケールで行った実験を述べたもので、この場合のスケールは、ペプチドを生成するために使用した樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、この方法で使用したペプチドの量の直接的な決定に基づくものではない。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。粗製ペプチド固体を、アセトニトリル：０.１Ｍ 炭酸水素アンモニウム緩衝水溶液(１１ｍＬ：２４ｍＬまたは同様の割合)の溶液に溶解して、次いでこの溶液を、ＮａＯＨ(１.０Ｍ)水溶液を用いてｐＨ＝８.５〜９.０に注意深く調整した。次いで、溶液を、シェーカーを用いて１２〜１８時間混合した。反応溶液を濃縮して、次いで残留物を、アセトニトリル：水に溶解した。この溶液を、逆相ＨＰＬＣ精製に供して、目的とする環状ペプチドを得た。

環化方法Ｄ：
全ての操作を、別段の記載が無ければ手動により行った。“環化方法Ｄ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌのスケールで行った実験を述べたもので、この場合のスケールは、ペプチドを生成するために使用した樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、この方法で使用したペプチドの量の直接的な測定に基づくものではない。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。粗製ペプチド固体を、アセトニトリル：０.１Ｍ 炭酸水素アンモニウム緩衝水溶液(１１ｍＬ：２４ｍＬ)の溶液に溶解して、次いでこの溶液を、ＮａＯＨ(１.０Ｍ)水溶液を用いてｐＨ＝８.５〜９.０に注意深く調整した。次いで、溶液を、１２〜１８時間撹拌しながら混合した。反応溶液を濃縮して、次いで残留物を、アセトニトリル：水に溶解した。この溶液を、逆相ＨＰＬＣ精製に供して、目的とする環状ペプチドを得た。

環化方法Ｅ：
全ての操作を、別段の記載が無ければ手動により行った。“環化方法Ｅ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、ペプチドを生成するために使用した樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、この方法で使用したペプチドの量の直接的な決定に基づくものではない。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。粗製ペプチド固体を、６ＭグアニジンＨＣｌ緩衝水溶液(１５ｍＬ)に溶解して、次いで溶液を１２〜１８時間間撹拌しながら混合した。反応溶液を濃縮して、ＤＭＳＯ(１５ｍＬ)を、その残留物に加えて、濾過されたスラリーを得た。濾液を、逆相ＨＰＬＣ精製に付して、目的とする環状ペプチドを得た。

マニュアルカップリング方法Ａ：
先の工程から得た樹脂を含有するＢｉｏ−Ｒａｄ反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、５分間周期的に振盪して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して５回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、６０秒間振盪して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(１.２〜１０当量)通常(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、次いでＨＡＴＵ(１.２１０当量)通常(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，２.５ｍＬ，５等量)、最後にＤＩＰＥＡ(２.４〜２０当量)通常(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.２５ｍＬ，１０等量)を加えた。混合物を、６０分間〜１８時間振盪した。反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続して４回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、６０秒間振盪して、この溶液をフリットから排出した。

樹脂上でのＮ−メチル化方法Ａ(Turner, R. A.; Hauksson, N. E.; Gipe, J. H.; Lokey, R. S. Org. Lett. 2013, 15(19), 5012-5015)：
全ての操作を、別段の記載が無ければ手動により実施した。“樹脂上でのＮ−メチル化”の方法は、０.１００ｍｍｏｌのスケールで実施した実験を述べたもので、この場合のスケールは、ペプチドを生成するために使用した樹脂に結合したＳｉｅｂｅｒリンカーの量により決定される。このスケールは、この方法で使用したペプチドの量の直接的な測定に基づくものではない。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。

樹脂を、２５ｍＬのフリットシリンジに移した。樹脂に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，５.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間振盪して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を用いて３回洗った。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，４.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間振盪して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)で３回、そしてＤＣＭ(４.０ｍＬ)で３回連続して洗った。樹脂を、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)およびエチルトリフルオロ酢酸(０.１１９ｍｌ，１.００ｍｍｏｌ)、１,８−ジアザビシクロ［５.４.０］ウンデク−７−エン(０.１８１ｍｌ，１.２０ｍｍｏｌ)に懸濁した。混合物を、６０分間振盪機に置いた。溶液を、フリットを通して排出した。樹脂を、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)で３回、そしてＤＣＭ(４.０ｍＬ)で３回洗った。

樹脂を、乾燥ＴＨＦ(２.０ｍＬ)で３回洗い、全ての残留水を除いた。オーブン内で乾燥させた４.０ｍＬバイアルにおいて、乾燥４Åモレキュラ・シーブス(２０ｍｇ)上でＴＨＦ(１.０ｍＬ)およびトリフェニルホスフィン(１３１ｍｇ，０.５００ｍｍｏｌ)を加えた。溶液を、樹脂に移し入れて、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(０.０９７ｍＬ，０.５ｍｍｏｌ)をゆっくりと加えた。樹脂を、１５分間撹拌した。溶液を、フリットから排出して、樹脂を、乾燥ＴＨＦ(２.０ｍＬ)を用いて３回洗い、全ての残留水を除去した。オーブン内で乾燥させた４.０ｍＬのバイアルにおいて、乾燥４Åモレキュラ・シーブス(２０ｍｇ)上でＴＨＦ(１.０ｍＬ)、トリフェニルホスフィン(１３１ｍｇ，０.５００ｍｍｏｌ)を加えた。溶液を樹脂に移し入れて、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(０.０９７ｍＬ，０.５ｍｍｏｌ)をゆっくりと加えた。樹脂を、１５分間撹拌した。溶液を、フリットを通して排出した。樹脂を、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)で３回、そしてＤＣＭ(４.０ｍＬ)で３回連続して洗った。樹脂を、エタノール(１.０ｍＬ)およびＴＨＦ(１.０ｍＬ)に懸濁して、水素化ホウ素ナトリウム(３７.８ｍｇ，１.０００ｍｍｏｌ)を加えた。混合物を、３０分間撹拌して、排出した。樹脂を、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)で３回、そしてＤＣＭ(４.０ｍＬ)で３回連続して洗った。

マイクロ開裂Ａ：
少量の＜１０ｍｇ樹脂の試料に、ＴＩＳの２滴およびｔ−トリフルオロ酢酸(１ｍＬ)を加えて、室温で振盪した。１時間後に、少量のアリコートを取り出して、アセトニトリル(０.５ｍＬ)を用いて希釈して、濾過して、ＬＣ−ＭＳにより分析した。

実施例１００１の製造

実施例１００１を、Ｒｉｎｋ樹脂で下記の一般的な合成方法に従い製造した：
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：樹脂膨潤化方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−ｎメチル−Ｎｌｅ−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−ｎメチル−Ｎｌｅ−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：第二級アミンカップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：第二級アミンカップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ“マニュアルカップリング方法Ａ”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：第二級アミンカップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：第二級アミンカップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−ｎメチル−Ａｌａ−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”を行った。
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：第二級アミンカップリング方法”を行った。
“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：最終カップリング方法”を行った。
“包括的脱保護方法Ｆ”を行った。
“環化方法Ｄ”を行った。

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：Waters XBridge C18, 19 x 250 mm, 5μｍ粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；グラジエント：２５分かけて１５〜６５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、６.４ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件Ｄ：保持時間＝１.６７分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９４７.２(Ｍ＋２Ｈ).
分析ＬＣＭＳ条件Ｅ：保持時間＝１.５７分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９４６.７(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１００２の製造

実施例１００２を、以下の一般的な方法から構成される実施例１００１の製造のために記述した一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂上で製造した：“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：樹脂膨潤化方法”、“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”、“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：第二級アミンカップリング方法”、“マニュアルカップリング方法Ａ”、“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：最終カップリング方法”、“包括的脱保護方法Ｆ”および“環化方法Ｄ”。
粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：Waters XBridge C18，19 x 200 mm, 5μｍ粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：２５分かけて１５〜６５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は６.０ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件Ｄ：保持時間＝１.６０分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９３４.０(Ｍ＋２Ｈ).
分析ＬＣＭＳ条件Ｅ：保持時間＝１.５２分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９３３.９(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１００３の製造

実施例１００３を、以下の一般的な方法から構成される実施例１００１の製造のために記述された一般的な合成手順に従って、Ｒｉｎｋ樹脂上で製造した：“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：樹脂膨潤化方法”、“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：標準カップリング方法”、“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：第二級アミンカップリング方法”、“マニュアルカップリング方法Ａ”、“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ｂ：最終カップリング方法”、“包括的脱保護方法Ｆ”および“環化方法Ｄ”。
粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：Waters XBridge C18，19 x 200 mm, 5μｍ粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：２５分かけて１５〜６５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は２.２ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は１００％であった。
分析ＬＣＭＳ条件Ｄ：保持時間＝１.５８分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９２６.７(Ｍ＋２Ｈ).
分析ＬＣＭＳ条件Ｅ：保持時間＝１.５１分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９２６.２(Ｍ＋２Ｈ).

化合物５００１分析データ：
質量スペクトル分析法：“ＥＳＩ−ＭＳ(＋)”は、ポジティブイオンモードにおいて行なったエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を意味する；“ＥＳＩ−ＭＳ(−)”は、ネガティブイオンモードで行なったエレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を意味する；“ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)”は、ポジティブイオンモードで行なった高分解エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を意味する；“ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(−)”ネガティブイオンモードで行なった高分解エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル分析法を意味する。検出された質量は、“ｍ／ｚ”単位表示に従って報告された。１０００より大きい精密質量を有する化合物は、二重電荷イオンまたは三重電荷イオンとして高頻度で検出された。

化合物５００１分析条件Ａ：
カラム：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；温度：５０℃；グラジエント：０％Ｂ、３分かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０.５分保持；流量：１ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

化合物５００１分析条件Ｂ：
カラム：Waters BEH C18，2.0 x 50 mm，1.7μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；温度：５０℃；グラジエント：０％Ｂ、３分かけて０〜１００％Ｂ、次いで１００％Ｂで０.５分保持；流量：０.５ｍＬ／分；検出：２２０ｎｍのＵＶ.

実施例５００１の製造

実施例５００１を、下記の通りに製造した。１０ｍＬのポリプロピレン固相反応容器に、Ｒｉｎｋ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂(１７８ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ)を加えて、反応容器を、Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成器上に置いた。“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：樹脂膨潤化方法”を行った。次いで、一連のアミノ酸カップリングを、樹脂結合ペプチドのＮ−末端が第一級アミンであるならば“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：単カップリング方法”に従って、または樹脂結合ペプチドのＮ−末端が第二級アミンであるならば“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：ダブルカップリング方法”に従ってＰｒｅｌｕｄｅ上で実施した。“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：クロロアセチルクロリドカップリング方法”を行い；次いで、“包括的脱保護方法Ａ”を行い；次いで、“環化方法Ａ”を行った。記載した通り、１−((((９Ｈ−フルオレン−９−イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)シクロプロパンカルボン酸(Ｆｍｏｃ−ＡｃＰｃ−ＯＨ)を、合成に使用した。粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて１０〜５０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１４.１ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９５％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝２.１０分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ８８８.３(Ｍ−２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.８５分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ８９０.５(Ｍ＋２Ｈ).

以下に例示した全ての実施例を、上記“一般的な合成手順Ａ”に従って製造した。
一般的な合成手順Ａ：
“一般的な合成手順Ａ”は、本明細書に記述した環化ぺプチドを得るために使用した方法の一般的な手順を述べる。この一般的な手順の目的のためには、“Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ａ”の方法は、“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ”の方法と相互に置き換えられる。１０ｍＬのポリプロピレン固相反応容器に、Ｒｉｎｋ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂(１７８ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ)を加えて、反応容器をＰｒｅｌｕｄｅペプチド合成器に置いた。“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：樹脂膨潤化方法”を行った。次いで、一連のアミノ酸カップリングを、樹脂結合ペプチドのＮ−末端が第一級アミンであるならば“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：単カップリング方法”に従って、または樹脂結合ペプチドのＮ−末端が第二級アミンであるならば“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：ダブルカップリング方法”に従ってＰｒｅｌｕｄｅ上で行った。“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：クロロアセチルクロリドカップリング方法”を行い；次いで、“包括的脱保護方法Ａ”を行い；次いで、“環化方法Ａ”を行った。

一般的な方法：
Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：
全ての操作を、Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成器(Protein Technologies)でオートメーションの下で行った。全ての方法を、底部フリットを取り付けた１０ｍＬポリプロピレンチューブ内で実施した；反応の規模が０.１００ｍｍｏｌを超える場合は、底部フリットを取り付けた４０ｍＬポリプロピレンを使用した。このチューブは、チューブの底部と上部の双方を介してＰｒｅｌｕｄｅペプチド合成器に連結している。ＤＭＦおよびＤＣＭを、チューブの上部から加えて、チューブの側面を均等に洗い流すことができる。残存する試薬を、チューブの底部から添加して、フリットを通して樹脂と接触させる。全ての溶液を、チューブの底部から除去する。“周期的攪拌”とは、底部フリットからのＮ_２ガスの短時間のパルスを意味する；このパルスは、おおよそ５秒続き、３０秒毎におこる。クロロアセチルクロリド／ＤＭＦ溶液を、調整２４時間以内で使用した。アミノ酸溶液を、一般的には、調整してから３週間を超えては使用しない。ＨＡＴＵ溶液を、調製５日以内で使用する。ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド；ＨＡＴＵ＝１−［ビス(ジメチルアミノ)メチレン］−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロリン酸塩；ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；Ｒｉｎｋ＝(２,４−ジメトキシフェニル)(４−アルコキシフェニル)メタンアミン、この“４−アルコキシ”の場所は、ポリスチレン樹脂との結合の位置およびタイプを示す。使用した樹脂は、Ｒｉｎｋリンカー(窒素にてＦｍｏｃ保護)を有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄポリマー(ポリスチレン)である；１００〜２００メッシュ，１％ＤＶＢ，０.５６ｍｍｏｌ／ｇ ローディング。使用した一般的なアミノ酸を以下に挙げた(側鎖保護基は括弧内に示した)。Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｂｚｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ａｌａ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−［Ｎ−Ｍｅ］Ｎｌｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ(Ｂｏｃ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ(ｔＢｕ)−ＯＨ；Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ.

“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケール上で行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＲｉｎｋリンカーの量により決定される。このスケールは、約１７８ｍｇの上記Ｒｉｎｋ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂に対応する。全ての方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。アミノ酸カップリングの前に、全てのペプチド合成手順は、“樹脂膨潤方法”として下記に述べた樹脂膨潤方法を用いて開始する。アミノ酸と第一級アミンＮ末端のカップリングには、下記に記載した“単カップリング方法”を用いた。アミノ酸の第二級アミンＮ末端へのカップリングは、下記の“ダブルカップリング方法”を使用した。クロロアセチルクロライドのペプチドのＮ末端へのカップリングは、下記の“クロロアセチルクロライドカップリング方法”により詳述される。

樹脂膨潤化方法：
１０ｍＬのポリプロピレン固相反応容器に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ：Ｒｉｎｋ樹脂(１７８ｍｇ，０.１００ｍｍｏｌ)を加えた。樹脂を、下記の通りに洗った(膨潤した)：反応容器に、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を加えて、この混合物を、１０分間周期的に撹拌して、この溶媒をフリットから排出した。

単カップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続的に洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸を加えて(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.０ｍＬ，２等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.０ｍＬ，２等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，０.５ｍＬ，４等量)。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記の通りに４回連続的に洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸(２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに４回連続的に洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

ダブルカップリング方法：
先の工程から得た樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続的に６回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.０ｍＬ，２等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.０ｍＬ，２等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，０.５ｍＬ，４等量)を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記のとおりに２回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、アミノ酸(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.０ｍＬ，２等量)、次いでＨＡＴＵ(ＤＭＦ中で０.２Ｍ，１.０ｍＬ，２等量)、最後にＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，０.５ｍＬ，４等量)を加えた。混合物を、周期的に１５分間撹拌して、反応溶液を、フリットから排出した。樹脂を、下記のとおりに２回洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、無水酢酸(２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、１０分間周期的に撹拌して、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに４回連続的に洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、次の工程に直接使用した。

クロロアセチルクロリドカップリング方法：
先の工程からの樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ，２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、３分間周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに連続的に洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部から加えて、得られる混合物を、３０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。反応容器に、ＤＩＰＥＡ(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，３.０ｍＬ，２４等量)、次いでクロロアセチルクロリド(ＤＭＦ中で０.８Ｍ，１.６５ｍＬ，１３.２等量)を加えた。混合物を、３０分周期的に撹拌して、次いでこの溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに３回連続的に洗った：各洗いのために、ＤＭＦ(２.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。樹脂を、下記の通りに４回連続的に洗った：各洗いのために、ＣＨ_２Ｃｌ_２(２.０ｍＬ)を、容器の上部に加えて、得られる混合物を、９０秒間周期的に撹拌して、この溶液をフリットから排出した。得られる樹脂を、１５分間、Ｎ_２ストリーム下に置いた。

Ｓｙｍｐｈｏｎｙ方法Ａ：
この方法のコレクションは、注記を除いて“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ”と同一の方法である。全ての方法について、ＳｙｍｐｈｏｎｙＸペプチド合成器(Protein Technologies)を、Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成器の代わりに使用して、全ての試薬を、反応容器の上部から加えた。
樹脂膨潤化方法：
この方法は、“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：樹脂膨潤化方法”と同一である。
単カップリング方法：
この方法は、ＤＩＰＥＡ溶液の濃度が０.４Ｍであり、この溶液の１.０ｍＬがこの反応に移されたことを除いて、“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：単カップリング方法”と同一である。
ダブルカップリング方法：
この方法は、ＤＩＰＥＡ溶液の濃度が０.４Ｍであり、この溶液の１.０ｍＬがこの反応に移されたことを除いて、“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：ダブルカップリング方法”と同一である。

クロロアセチルクロリドカップリング方法：
この方法は、“Ｐｒｅｌｕｄｅ方法Ａ：クロロアセチルクロリドカップリング方法”と同一である。

包括的脱保護方法Ａ：
全ての操作を、別段の記載が無ければ手動により行った。“包括的脱保護方法Ａ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、樹脂に結合したＲｉｎｋリンカーの量により決定される。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。“脱保護溶液”を、４０ｍＬ ガラスバイアル中で、トリフルオロ酢酸(２２ｍＬ)、フェノール(１.３２５ｇ)、水(１.２５ｍＬ)およびトリイソプロピルシラン(０.５ｍＬ)を合わせて調製した。樹脂を、反応容器から取り出して、４ｍＬ ガラスバイアルに移した。バイアルに、“脱保護溶液”(２.０ｍＬ)を加えた。混合物を、シェーカー内で激しく混合した(１０００ＲＰＭで１分間、次いで５００ＲＰＭで１〜２時間)。混合物を、０.２ミクロンシリンジフィルターにより濾過して、固体を、“脱保護溶液”(１.０ｍＬ)またはＴＦＡ(１.０ｍＬ)で抽出した。合わせた濾液を入れた２４ｍＬ試験管に、Ｅｔ_２Ｏ(１５ｍＬ)を加えた。混合物を、激しく混合して、これに有意な量の白色固体が沈殿した。混合物を、５分間遠心分離して、次いで溶液を傾斜して、固体と分けて、廃棄した。固体を、Ｅｔ_２Ｏ(２０ｍＬ)中に懸濁した；次いで、混合物を、５分間遠心分離して；溶液を傾斜して、固体と分けて、廃棄した。最後に、固体を、Ｅｔ_２Ｏ(２０ｍＬ)に懸濁した；混合物を、５分間遠心分離した；および溶液を傾斜して、固体と分けて、廃棄して、粗製ペプチドを、白色からオフホワイトの固体として得た。

環化方法Ａ：
全ての操作を、記載が無ければ手動により行った。“環化方法Ａ”の方法は、０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、ペプチドを生成するために使用した樹脂に結合したＲｉｎｋリンカーの量により決定される。このスケールは、この方法で使用したペプチドの量の直接的な測定に基づくものではない。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。粗製ペプチド固体を、ＭｅＣＮ：０.１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液(３０ｍＬ：３０ｍＬ)に溶解して、次いでこの溶液を、ＮａＯＨ(１.０Ｍ)水溶液を用いて注意深くｐＨ＝８.５〜９.０に調整した。次いで溶液を、１２〜１８時間撹拌せずに静置させた。反応溶液を濃縮して、次いで、残留物を、ＤＭＳＯ：ＭｅＯＨに溶解した。この溶液を、逆相ＨＰＬＣ精製に付して、目的とする環状ペプチドを得た。

環化方法Ｂ：
全ての操作を、記載が無ければ手動により行った。“環化方法Ｂ”の方法０.１００ｍｍｏｌスケールで行った実験を述べたものであり、この場合のスケールは、ペプチドを生成するために使用した樹脂に結合したＲｉｎｋリンカーの量により決定される。このスケールは、この方法で使用したペプチドの量の直接的な測定に基づくものではない。この方法は、記戴した体積をスケールの倍数で調整することにより、０.１００ｍｍｏｌのスケールを超えて拡大できる。粗製ペプチド固体を、全容量１８〜２２ｍＬまでＭｅＣＮ：０.１Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ水溶液(１：１)に溶解して、次いでこの溶液を、ＮａＯＨ(１.０Ｍ)水溶液を用いて注意深くｐＨ＝８.５〜９.０に調整した。次いで、溶液を、１２〜１８時間撹拌せずに静置させた。反応溶液を濃縮して、次いで、残留物を、ＤＭＳＯ：ＭｅＯＨに溶解した。この溶液を、逆相ＨＰＬＣ精製に供して、目的とする環状ペプチドを得た。

実施例９００１の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、１９.４ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.６２分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６３.４(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.８４分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６３.８(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９００２の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４０〜８０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、２４.０ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.６３分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５４.７５(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝３.１１分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５４.２５(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９００３の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて１５〜５５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、３５.５ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９７％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.６１分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６４.３(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.８４分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６４.１(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９００４の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４５〜８５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、２３.９ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９９％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.４８分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５６.０(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.６７分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５５.７(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９００５の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４０〜８０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、１８.８ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９９％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.６４分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９０１.６(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９００６の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて５０〜９０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、４０.５ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.５９分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９００.３(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９００７の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４５〜９０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。この物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより更に精製した：カラム：Waters CSH C18，19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて５〜４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、１９.３ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.９５分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９０７.８(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９００８の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４５〜８５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、１４.１ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９８％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.９０分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９０６.６(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９００９の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４０〜８０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。この物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより更に精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて５〜４５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は２.２ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９１％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.７３分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９０１.４(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９０１１の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４０〜８５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、２９.２ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９８％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.８１分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９１４.８(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９０１２の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４０〜８５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。この物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより更に精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて１５〜５５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は、１６.４ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９６％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.９７分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９１４.３(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９０１３の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４５〜８５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は２１.９ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、９７％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.７８分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９０１.４(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９０１４の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて５０〜９０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は３５.３ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９７％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.７６分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９００.２(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９０１５の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて１５〜５５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１５.８ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９９％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.５６分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９１４.３(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９０１６の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：Waters CSH c-18，19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；グラジエント：３０分かけて１５〜５５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１７.１ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９４％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.６５分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９３８.１(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９０１７の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。この物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより更に精製した：カラム：Waters CSH C18，19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２５〜６５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は２０.３ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９７％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.７６分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９２７.９(Ｍ＋２Ｈ).

実施例９０１８の製造

粗製物質を、以下の条件を用いて、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：Waters CSH c-18，19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(０.１％トリフルオロ酢酸を含む)；グラジエント：３０分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は４.８ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９６％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１８４分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５１.９(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００１の製造

実施例１０００１の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１６.５ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９５％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.８２分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６２.８(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.９８分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６２.８(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００２の製造

実施例１０００２の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は３.９ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.８１分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９７０.９(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.９８分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９７０.８(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００３の製造

実施例１０００３の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は３３.４ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９７％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.７６分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５７.０(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.９７分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５６.８(Ｍ＋２Ｈ).
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９５５.９６３３(Ｍ＋２Ｈ)；実測値：９５５.９６１０(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００４の製造

実施例１０００４の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１７.２ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.７２分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６４.８(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.９７分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６４.７(Ｍ＋２Ｈ).
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９６３.９６０７(Ｍ＋２Ｈ)；実測値：９６３.９５８１(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００５の製造

実施例１０００５の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１０.０ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は、１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.６５分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５６.６(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.８７分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５６.７(Ｍ＋２Ｈ).
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９５５.９６３３(Ｍ＋２Ｈ)；実測値：９５５.９６０１(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００６の製造

実施例１０００６の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１２.１ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.６１分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６５.１(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.８５分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６５.０(Ｍ＋２Ｈ).
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９６３.９５８０(Ｍ＋２Ｈ)；実測値：９６３.９６０７(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００７の製造

実施例１０００７の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１３.３ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.５１分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５６.７(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.６６分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５６.３(Ｍ＋２Ｈ).
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９５５.４８０１(Ｍ＋２Ｈ)；実測値：９５５.４７６６(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００８の製造

実施例１０００８の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は１６.１ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は１００％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.７３分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９７１.８(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.９６分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９７１.７(Ｍ＋２Ｈ).
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９７０.９６８６(Ｍ＋２Ｈ)；実測値：９７０.９６６７(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１０００９の製造

実施例１０００９の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は４４.３ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９７％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.６７分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６３.２(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.８６分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９６３.３(Ｍ＋２Ｈ).
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９６２.４８８０(Ｍ＋２Ｈ)；実測値：９６２.４８５７(Ｍ＋２Ｈ).

実施例１００１０の製造

実施例１００１０の粗製物質を、以下の条件を用いてプレパラティブＬＣ／ＭＳにより精製した：カラム：XBridge C18, 19 x 200 mm, 5 μm粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：１５分かけて２０〜６０％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／分。目的とする生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーションにより乾燥させた。生成物の収量は３１.１ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９９％であった。
分析条件Ａ：保持時間＝１.７１分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５５.２(Ｍ＋２Ｈ).
分析条件Ｂ：保持時間＝２.８９分；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ ９５５.４(Ｍ＋２Ｈ).
ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９５４.４９０５(Ｍ＋２Ｈ)；実測値：９５４.４８８１(Ｍ＋２Ｈ).

均一時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)結合アッセイを使用するＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合に対して競合する大環状ペプチドの能力を試験する方法
本発明の大環状ペプチドがＰＤ−Ｌ１に結合する能力をＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１均一時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)結合アッセイを使用して試験した。

方法
可溶性ＰＤ−１の可溶性ＰＤ−Ｌ１への結合に関する均一時間分解蛍光(ＨＴＲＦ)アッセイ。可溶性ＰＤ−１および可溶性ＰＤ−Ｌ１は、膜貫通領域を排除するカルボキシル末端切除型のタンパク質であって、かつ異種性配列、特にヒト免疫グロブリンＧ配列(Ｉｇ)のＦｃ部分またはヘキサヒスチジンエピトープタグ(Ｈｉｓ)と融合されているものを指す。全ての結合研究を、０.１％(ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミンおよび０.０５％(ｖ／ｖ)Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したｄＰＢＳからなるＨＴＲＦアッセイ緩衝液中で行った。ＰＤ−１−Ｉｇ／ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ結合アッセイについて、阻害剤をＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ(１０ｎＭ最終)と、１５分、４μlのアッセイ緩衝液と共にプレインキュベートし、続いて１μlのアッセイ緩衝液中のＰＤ−１−Ｉｇ(２０ｎＭ最終)を添加し、さらに１５分インキュベートした。ヒト、カニクイザル、マウスまたはその他の種のいずれかからのＰＤ−Ｌ１融合タンパク質を使用した。ＨＴＲＦ検出を、ユウロピウムクリプテート標識抗Ｉｇモノクローナル抗体(１ｎＭ最終)およびアロフィコシアニン(ＡＰＣ)標識抗Ｈｉｓモノクローナル抗体(２０ｎＭ最終)を使用して達成した。抗体を、ＨＴＲＦ検出緩衝液で希釈し、５μｌを分配して、結合反応に加えた。反応を３０分間平衡化させて、ＥｎＶｉｓｉｏｎ蛍光光度計を使用してシグナル(６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比)を得た。さらなる結合アッセイをＰＤ−１−Ｉｇ／ＰＤ−Ｌ２−Ｈｉｓ(それぞれ２０ｎＭおよび５ｎＭ)、ＣＤ８０−Ｈｉｓ／ＰＤ−Ｌ１−Ｉｇ(各々１００ｎＭおよび１０ｎＭ)およびＣＤ８０−Ｈｉｓ／ＣＴＬＡ４−Ｉｇ(各々１０ｎＭおよび５ｎＭ)で確立した。ビオチニル化化合物番号７１とヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓの間の結合／競合研究を次のとおり行った。大環状ペプチド阻害剤をＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ(１０ｎＭ最終)と、４μｌのアッセイ緩衝液中で６０分間プレインキュベートし、１μｌのアッセイ緩衝液中のビオチニル化化合物番号７１(０.５ｎＭ最終)を添加した。結合を３０分間平衡化して、５μｌのＨＴＲＦ緩衝液中のユウロピウムクリプテート標識ストレプトアビジン(２.５ｐＭ最終)およびＡＰＣ標識抗Ｈｉｓ(２０ｎＭ最終)を添加した。反応を３０分平衡化させて、シグナル(６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比)を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ蛍光光度計を使用して得た。

組み換えタンパク質。Ｃ末端ヒトＩｇエピトープタグを有するカルボキシル切断型ヒトＰＤ−１(アミノ酸２５〜１６７)[ｈＰＤ−１(２５−１６７)−３Ｓ−ＩＧ]およびＣ末端Ｈｉｓエピトープタグを有するヒトＰＤ−Ｌ１(アミノ酸１８−２３９)[ｈＰＤ−Ｌ１(１９−２３９)−タバコ葉脈斑紋ウイルスプロテアーゼ開裂部位(ＴＶＭＶ)−Ｈｉｓ]をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させ、組み換えタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーで連続的に精製した。ヒトＰＤ−Ｌ２−Ｈｉｓ(Sino Biologicals)、ＣＤ８０−Ｈｉｓ(Sino Biologicals)、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ(RnD Systems)を全て商業的供給源から得た。

組換えヒトＰＤ−１−Ｉｇの配列

組換えヒトＰＤ−Ｌ１−ＴＶＭＶ−Ｈｉｓ(ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ)の配列

この結果を表１に示した。表に示した通り、本発明の大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１−ＴＶＭＶ−Ｈｉｓ(ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ)へのＰＤ−１−Ｉｇ結合活性の強力な阻害を示した。範囲は以下のとおりである：Ａ＝０.１０〜１０μＭ；Ｂ＝０.０１〜０.０９９μＭ；Ｃ＝０.００４−０.００９９μＭ。

当業者には、本願発明が前述に例示した実施例に限定されず、その本質的特性から逸脱することなく他の特定の形に具現化できることは明らかである。それゆえに、実施例は、あらゆる点で制限的ではなく説明的と見なすことが望まれ、前記実施例ではなく添付する特許請求の範囲を参照すべきであり、請求の範囲と等価の意味および範囲に入る全ての変化は包含されると意図される。

Claims (17)

1. 式(Ｉ)：
   

   

   ［式中、
   Ａは、結合、
   

   

   
   から選択され；
   

   

   は、カルボニル基との結合点を表し、
   

   

   は、窒素原子との結合点を表し；
   ｚは、０、１または２であり；
   ｗは、１または２であり；
   ｎは０または１であり；
   ｍは１または２であり；
   ｍ’は、０または１であり；
   ｐは、０、１または２であり；
   Ｒ^ｘは、水素、アミノ、ヒドロキシおよびメチルから選択され；
   Ｒ^１４およびＲ^１５は、水素およびメチルから独立して選択され；ならびに
   Ｒ^ｚは、水素および−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ^１６から選択され；ここでＲ^１６は、水素、−ＣＨＲ^１７Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２、−ＣＨＲ^１７Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨＲ^１８Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２および−ＣＨＲ^１７Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨＲ^１８Ｃ(Ｏ)ＮＨＣＨ_２Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２から選択され；ここでＲ^１７は、水素および−ＣＨ_２ＯＨから選択され、ここでＲ^１８は、水素およびメチルから選択され；
   Ｒ^ｖは、水素または天然のアミノ酸側鎖であり；
   Ｒ^ｃ、Ｒ^ｆ、Ｒ^ｈ、Ｒ^ｉおよびＲ^ｍは、水素であり；
   Ｒ^ｎは、水素またはメチルであるか、あるいはＲ^ｖおよびＲ^ｎは、ピロリジン環を形成しており；
   Ｒ^ａ、Ｒ^ｅ、Ｒ^ｊおよびＲ^ｋは、水素およびメチルから各独立して選択され；
   各Ｒ^２０は、水素およびＣ_１−Ｃ_６アルキルから独立して選択され；
   各Ｒ^２１は、水素およびＣ_１−Ｃ_６アルキルから独立して選択され；
   Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、天然アミノ酸側鎖および非天然アミノ酸側鎖から独立して選択されるか、あるいは、各々独立して、対応するジェミナルＲ^２０基と共に、３〜６員炭素環式環、または酸素または窒素原子を含有する６員環を形成できる、ここで該環は、Ｃ_１−Ｃ_３アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_３アルキル、Ｃ_２−Ｃ_４アルケニル、ハロ、ヒドロキシおよびアミノから独立して選択される１、２または３つの置換基で所望により置換されていてもよく、およびここで該５および６員環は、フェニル環と所望により縮合されていてもよく；あるいは
   Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、Ｒ^１２およびＲ^１３は、各々独立して、以下に記載した通りの対応するビシナルＲ基と共に環を形成することができ；
   Ｒ^ｅおよびＲ^ｋは、対応するビシナルＲ基およびそれらに結合している原子と共に、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびテトラヒドロチアゾールから選択される環を各々形成でき；ここで各環は、所望により、アミノ、シアノ、メチル、ハロおよびヒドロキシから独立して選択される１〜４つの基で置換されていてもよい；
   Ｒ^ｂは、メチルであるか、あるいはＲ^ｂおよびＲ^２が、それらに結合している原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成しており；ここで各環は、アミノ、シアノ、メチル、ハロおよびヒドロキシから独立して選択される１〜４つの基で所望により置換されていてもよいか；あるいは、Ｒ^２およびジェミナルＲ^２０が、両方水素以外である場合、Ｒ^ｂは水素である；
   Ｒ^ｄは、水素またはメチルであるか、あるいはＲ^ｄおよびＲ^４は、それらに結合している原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで各環は、所望により、アミノ、シアノ、メチル、ハロ、ヒドロキシおよびフェニルから独立して選択される１〜４つの基で置換されていてもよく；
   Ｒ^ｇは、水素またはメチルであるか、あるいはＲ^ｇおよびＲ^７は、それらに結合している原子と一緒になって、アゼチジン、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジンおよびテトラヒドロチアゾールから選択される環を形成することができ；ここで各環は、アミノ、ハロ基で所望により置換されていてもよいベンジル、ベンジルオキシ、シアノ、シクロヘキシル、メチル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ基で所望により置換されていてもよいイソキノリニルオキシ、ハロ基で所望により置換されていてもよいキノリニルオキシおよびテトラゾリルから独立して選択される１〜４つの基で所望により置換されていてもよく；ここで該ピロリジンおよび該ピペリジン環は、シクロヘキシル、フェニルまたはインドール基と所望により縮合していてもよく；および
   Ｒ^ｌは、メチルであるか、あるいはＲ^ｌおよびＲ^１２は、それらに結合している原子と一緒になって、アゼチジンおよびピロリジンから選択される環を形成しており、ここで各環は、アミノ、シアノ、メチル、ハロおよびヒドロキシから独立して選択される１〜４つの基で所望により置換されていてもよい；
   但し、式(Ｉ)の化合物は、水素以外の４つの置換基を有しており、かつα−メチル置換された環ではない環の骨格上に少なくとも１つの炭素を含有する］
   の化合物、あるいはその医薬的に許容される塩。
2. Ａが、
   

   

   である、請求項１記載の化合物、あるいはその医薬的に許容される塩。
3. ｚおよびｗが各々１であり；
   Ｒ^１４およびＲ^１５が水素であり；および
   Ｒ^ｚが、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ^１６であり；ここでＲ^１６が−ＣＨＲ^１７Ｃ(Ｏ)ＮＨ_２である、
   請求項２記載の化合物、あるいはその医薬的に許容される塩。
4. Ｒ^１が、ヒドロキシで所望により置換されていてもよいベンジルであり；
   Ｒ^２が、メチルであるか、またはジェミナルＲ^２０と共に、シクロプロピル環を形成しており；
   Ｒ^８が、−(ＣＨ_２)インドリルであり；
   Ｒ^１０が、−(ＣＨ_２)インドリルおよび−(ＣＨ_２)ベンゾチエニルから選択され、これらは各々所望により−ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈで置換されていてもよい；
   Ｒ^１１が、ブチルであり；
   Ｒ^１２が、ブチルであり；
   Ｒ^ａが、水素であり；
   Ｒ^ｅが、水素であり；
   Ｒ^ｊが、メチルであり；
   Ｒ^ｋが、メチルであり；および
   Ｒ^ｌが、水素である、請求項３記載の化合物。
5. 実施例１００１、実施例１００２、実施例１００３、実施例５００１、実施例９００１、実施例９００２、実施例９００３、実施例９００４、実施例９００５、実施例９００６、実施例９００７、実施例９００８、実施例９００９、実施例９０１１、実施例９０１２、実施例９０１３、実施例９０１４、実施例９０１５、実施例９０１６、実施例９０１７、実施例９０１８、実施例１０００１、実施例１０００２、実施例１０００３、実施例１０００４、実施例１０００５、実施例１０００６、実施例１０００７、実施例１０００８、実施例１０００９および実施例１００１０から選択される化合物；またはその医薬的に許容される塩。
6. 治療上有効な量の請求項１記載の化合物またはその治療上許容し得る塩を対象に投与することを特徴とする、その必要のある対象において免疫応答を増強、刺激および／または増加させる方法。
7. 請求項１に記載の化合物またはその治療上許容し得る塩を、別の薬剤の投与前、後または同時に投与することを更に特徴とする、請求項６記載の方法。
8. 別の薬剤が、殺菌剤、抗ウイルス剤、細胞毒性剤および／または免疫応答修飾剤である、請求項７記載の方法。
9. 別の薬剤が、ＨＤＡＣ阻害剤である、請求項７記載の方法。
10. 別の薬剤が、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８アゴニストである、請求項７記載の方法。
11. 治療上有効な量の請求項１記載の化合物またはその治療上許容し得る塩を対象に投与することを特徴とする、その必要のある対象における癌細胞の成長、増殖または転移を阻害する方法。
12. 癌が、黒色腫、腎細胞癌、扁平非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、去勢抵抗性前立腺癌、卵巣癌、胃癌、肝細胞癌、膵臓癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道、消化管および乳房の癌ならびに造血器腫瘍から選択される、請求項１１記載の方法。
13. 治療上有効な量の請求項１記載の化合物またはその治療上許容し得る塩を対象に投与することを特徴とする、その必要のある対象における感染性疾患の治療方法。
14. 感染性疾患がウイルスを原因とする、請求項１３記載の方法。
15. ウイルスがＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルスおよびインフルエンザから選択される、請求項１４記載の方法。
16. 治療上有効な量の請求項１記載の化合物またはその治療上許容し得る塩を対象に投与することを特徴とする、その必要のある対象における敗血症性ショックの治療方法。
17. 治療上有効な量の請求項１記載の化合物またはその治療上許容し得る塩を対象に投与することを特徴とする、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１および／またはＣＤ８０の相互作用を遮断する方法。